DD224770A1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen karzinoembryonales antigen (cea) - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen verschiedene Antigendeterminanten des karzinoembryonalen Antigens (CEA). Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Antikoerpern hoher Spezifitaet und starker Bindungsfaehigkeit in guten Ausbeuten. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit gereinigtem CEA immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikoerperproduzierenden Hybridome selektiert, ihre Spezifitaet mit Antikoerperinhibitions-, Kompetitions- und immunhistologischen Tests bestimmt und die spezifischen Hybridome auswaehlt und in bekannter Weise weitervermehrt. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Description
Dr. FIEBACH, Helmar Dr. KARSTEH, Uwe Dr. MICHEEL, Burkhard Dr. ZOTTER, Stefan Dr. GROSSMAMr, Heinz Dr. L0SS1TITZER, Arndt
Verfahren zur Herstellung von inonoklonalen Antikörpern gegen karzinoembryonales Antigen
(CEA)
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Antigendeterminanten des karzinoembryonalen Antigens (CEA). Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen CEA ist ein Glykoprotein, das in der Embryonalentwicklung auftritt und im adulten Stadium auf maligne Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes hinweisen kann (z.B. Kolonkarzinome). Seit 1980 sind monoklonale Antikörper gegen CEA bekannt (u.a. ACOLLA et al*, in Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas, Eds. I.J. Hämmerling, U. Hämmerling u. J.P. Kearney, Elsevier, Amsterdam, 1981; GRUUERT et al., Oncodev.Biol.Med. 1982, 3jl 1^1» HEDHT et al·, Mol.Immunol. 1982, IjJ, 1641).
Die Herstellung dieser Antikörper erfolgte durch die bekannten Techniken der Zellfusion und Selektion antikörperproduzierender Hybridome. Die Antikörper wurden u.a. zum Nachweis des CEA im Serum von Tumorkranken mit Hilfe von Immuntests eingesetzt (BUCHEGGER et al., Immunol.lett. 1982, 5, 85; HEDIlT et al., Proc.lTat.Acad.Sci. 1983, 80_, 3470). Von der amerikanischen Firma Hybritech wird ein monok^onaler Anti-CEA-Antikörper kommerziell vertrieben.
Dieser Antikörper zeigt jedoch noch eine beträchtliche Reaktion mit sogenannten kreuzreagierenden Antigenen, die z.B. in Lunge und Milz vorkommen,und ist deshalb nicht absolut CEA-spezifisch.
Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper hoher Spezifität und starker Bindungsfähigkeit in guten Ausbeuten herzustellen. Diese Antikörper sollen zum Aufbau eines Testsystems geeignet sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Antigendeterminanten des GEA ist dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Balb/c Mäusen, die mit gereinigtem CEA immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotestplatten aussät. Die antikörperproduzierenden Hybridome werden mit einem Pestphasenradi οimmuntest nachgewiesen, der folgendermaßen durchgeführt wird: Anti-Maus-Immunglobulin wird an PVC gebunden, danach erfolgt die Inkubation mit dem Kulturüberstand der Hy-
125
bridome und anschließend mit J-markiertem CEA. Die reaktiven Hybridome werden kloniert, ihre Antigenspezifität wird erfindungsgemäß mit einem Antikörperinhibitionstest und einem Kompetitions-Radioimmuntest bestimmt. Die spezifischen Hybridome werden ausgewählt, weiter vermehrt, in flüssigem Stickstoff gelagert und ggf. für die Produktion Von monoklonalen Antikörpern auf Mäusen in der Aszitesform transplantiert. Wesentliche Voraussetzung zur Durchführung der Erfindung ist der Antikörperinhibitionstest zur Selektion der Hybridome, die Antikörper gegen bestimmte Antigendeterminanten des CEA produzieren. Er wird folgendermaßen durchgeführt: Anti-Maus-Immunglobulin wird an die feste Phase gebunden, danach erfolgt eine Inkubation mit monoklonalem Antikörper, der mit einer bestimmten Antigendeterminante reagiert. Anschließend wird mit normalem Mausserum behandelt und danach mit "\T-markiertem CEA im Gemisch mit Hybridomkulturüberstand inkubiert. Y/ird keine Radioaktivität an der festen
Phase gebunden, reagiert der monoklonale Antikörper im Gemisch gegen die gleiche Determinante wie der Antikörper an der festen Phase.
Eine weitere wesentliche Voraussetzung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Ermittlung der Spezifität der monoklonalen Antikörper durch Kompetitionstest und durch immunhistologische Untersuchungen. Bei dem Kompetitions-
125 test wird der monoklonale Antikörper zusammen mit J-markiertem CEÄund Gewebsextrakten, die CEA bzw. CEA-ähnliche Glykoproteine enthalten, inkubiert. Anschließend wird der Antikörper (mit dem gebundenen Antigen) durch Zugabe von Kaninchen-Anti-Maus-Ig-bedeckten fixierten Staphylokokken (Stamm Cowan I) ausgefällt. Der Anteil der gebundenen Radioaktivität in den verschiedenen Proben gibt Hinweise auf die CEA-Spezifität des Antikörpers bzw. seine Kreuzreaktivität mit CEA-ähnlichen Substanzen.
Gleiche Hinweise können aus der Immunhistologie gezogen werden, wobei Gewebsschnitte verschiedener Herkunft mit den monoklonalen Antikörpern und anschließend mit Pluoreszein- bzw. Peroxidase-markiertem Anti-Maus-Ig inkubiert werden.
Die Erfindung ermöglicht die Herstellung spezifischer Antikörper gegen CEA und damit die Entwicklung von effektiven Testkits für die Tumordiagnostik.
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden:
1) Herstellung der Hybridome aus Milzzellen von Balb/c-Mäusen und X63-Ag8.653 Myelomzellen.
Die Fusion von Milz- und Plasmozytomzellen wurde gemäß üblichen Techniken durchgeführt (KÖHLER u. MILSTEIN: Nature 256, 495, 1975; HUDSOlT u. HERY: Practical Immunology, 2.Aufl., Oxford 1930).
Die Myelomlinie X63-Ag8.653 wurde von KEARNEY et al., J.Immunol.1979, 123, 1548, hergestellt. Klonierung und weitere Bearbeitung der Hybridome erfolgte nach modifizierten Techniken (KARSTEN et al., in Vorbereitung).
2) Die Selektion antikörperproduzierender Hybridome erfolgte mit einem Pestphasen-Radioimmuntest nach MICHBEL et al., J.Immunol.Meth. 1981, J^S, 41.
3) Antikörper-Inhibitions-Test, !Competitionstest und Immunhistologe wurden mit den Kulturüberständen der verschiedenen Hybridome mit Anti-CEA-Spezifität durchgeführt.
Erhaltene monoklonale Antikörper gegen· verschiedene Antigendeterminanten des CEA
| Antigen- | Standard- | Affinität | Ig- | sonstige |
| deter- | Antikörper | (1/mol) | klasse | Eigen |
| minante · | schaften | |||
| a | ZIK-A42-B/B11a | 4 x 108 | IgG 1 | verschiedene |
| ZIK-A42-A/C1 | 2 χ 108 | IgG 1 | Antigenspezi- fitäten,teil | |
| ZIK-A42-B/B11C ' | 1. x 1010 | 211 CJlT holranyi"}* | weise geringe | |
| ZIK-A42-A/G5a | nicht getestet | U ti Ja. ctill 1 υ IgG1 | Kreuzreaktion mit KTormal- | |
| ZIK-A42-B/B11b | I! | IgG2b | g ewe be (B/B11a, | |
| B/B11C, | ||||
| A/C1) | ||||
| b | ZIK-A42-B/A2a | 2 χ 109 | IgG2b | mittelstarke |
| ZIK-A42-A/G5b | nicht | IgG2b | Kreuzreak tivität mit | |
| getestet | 17ormalgev;ebe | |||
| (aber schwa | ||||
| cher als der | ||||
| Hybritech- | ||||
| Antikörper) | ||||
| C | ZIK-A42-A/G6 | nicht | IgG1 | Kreuzreak |
| getestet | tion mit | |||
| nicht-CEl- | ||||
| verwandten | ||||
| Molekülen | ||||
| d | ZIK-A42-B/A2b | 3 x 109 | IgG2b' | ähnlich wie |
| Antikörper | ||||
| mit b-Spezi- | ||||
| fität |
4) Herstellung der Antikörper
Die Gewinnung der Antikörper erfolgte aus der Kulturflüssigkeit der kultivierten bzw· aus der Aszitesflüssigkeit der transplantierten Hybridome entsprechend üblicher Methoden (KEMETT, McKEAElT u. BECHTOL: Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses· Plenum Press, Hew York u. London, 1981).
Claims (1)
- ErfindungsanspruchVerfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern
gegen karzinoembryonales Antigen (CEA),dadurch gekennzeichnet,daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit
gereinigtem CSA immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzeilen in der Zellkultur fusioniert, die antikörperproduzierenden Hybridome selektiert, ihre
Spezifität mit Antikörperinhibitions-, Kompetitions- und immunhistologischen Tests ermittelt, die spezfischen Hybridome gegen diagnostisch relevante Deter_ minanten auswählt und in bekannter V/eise kultiviert oder auf Mäusen in Aszitesform transplantiert.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD26222884A DD224770A1 (de) | 1984-04-24 | 1984-04-24 | Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen karzinoembryonales antigen (cea) |
Applications Claiming Priority (1)
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| DD26222884A DD224770A1 (de) | 1984-04-24 | 1984-04-24 | Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen karzinoembryonales antigen (cea) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD224770A1 true DD224770A1 (de) | 1985-07-17 |
Family
ID=5556380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD26222884A DD224770A1 (de) | 1984-04-24 | 1984-04-24 | Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen karzinoembryonales antigen (cea) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD224770A1 (de) |
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1984
- 1984-04-24 DD DD26222884A patent/DD224770A1/de not_active IP Right Cessation
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