DE69735760T2

DE69735760T2 - Antikörper gegen menschliches lect2, zellen die diesen produzieren und verfahren und kit zu dessen bestimmung

Info

Publication number: DE69735760T2
Application number: DE69735760T
Authority: DE
Inventors: Science University of Tokyo Takao Noda-shi ARAI
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 1996-05-27
Filing date: 1997-05-26
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2017-05-27
Also published as: DE69735760D1; EP0908466B1; AU725682B2; EP0908466A1; EP0908466A4; WO1997045451A1; AU2793297A; US6306608B1; JP3888695B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Kit für die Messung des humanen LECT2.
FACHLICHER HINTERGRUND
In letzter Zeit ist für Neutrophile bekannt geworden, daß sie sich an der Zerstörung von Krebszellen beteiligen. Da bei einigen Krebsgeweben beobachtet worden ist, daß sie mit Neutrophilen infiltriert worden sind, wird davon ausgegangen, daß Neutrophile auf chemotaktische Faktoren, welche von Krebszellen abgesondert werden, reagieren.
LECT2 (Leukocyte-derived chemotaxin 2) ist während der Suche nach solchen chemotaktischen Faktoren, welche von Krebszellen abgesondert werden, entdeckt worden und dieser scheint ein chemotaktischer Faktor zu sein, welcher aus einem Kulturüberstand von T-Zell Leukämiezelle SKW-3 erhalten worden ist.
Das humane LECT2 ist als ein Protein neu entdeckt worden, welches gleich oder mehr als 90% Homologie zum Rinder LECT2 aufweist, basierend auf humanen cDNA-Bibliotheken, unter Verwendung von DNA, die für LECT2 kodiert, in Rinderserum, welches in einem Kulturüberstand von T-Zell Leukämiezell SKW-3 enthalten ist. Aus der folgenden Tabelle 1 kann die Aminosäuresequenz des humanen LECT2 mit der von Rinder LECT2 verglichen werden.
Tabelle 1
Da das humane LECT2 als ein chemotaktischer Faktor ähnlich dem Rinder LECT2 gewähnt wird und seine Einsatzmöglichkeiten zum Erfassen von Erkrankungszuständen und der Behandlung von Krebs erwartet werden, ist die Etablierung eines Verfahrens für die Messung des humanen LECT2 gewünscht worden.
Zunächst sind das Rinder LECT2 und das humane LECT2 jeweils als LECT2a und LECT2b benannt worden. Jedoch sind diese Namen für unangebracht erachtet worden und daher geändert worden.
Die Erfindung ist im Bezug auf den vorgenannten Hintergrund dargelegt, darauf abzielend, ein Verfahren und ein Kit zur Messung des humanen LECT2 zur Verfügung zu stellen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung offenbart Antikörper, die spezifisch mit dem humanen LECT2 reagieren (ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz hat, wie in Sequenz ID NO. 1 in der Sequenztabelle dargelegt). Solche Antikörper umfassen zum Beispiel einen Antikörper, hergestellt durch den Syncytium Klon G2A5D7 (Accession Nr. FERM P-15638), einen Antikörper, hergestellt durch den Syncytium Klon A1G1C6 (Accession Nr. FERM P-15639), einen Antikörper, hergestellt durch den Syncytium Klon 5C5 (Accession Nr. FERM P-15640), einen Antikörper, hergestellt durch den Syncytium Klon H12D10D6 (Accession Nr. FERM P-15641) und einen Antikörper, hergestellt durch den Syncytium Klon 89F2 (Accession Nr. FERM P-16229).
Die in der Erfindung offenbarten Syncytien sind durch ihre Herstellung der Antikörper charakterisiert, welche spezifisch mit dem humanen LECT2 reagieren. Solche Syncytien umfassen zum Beispiel den Syncytium Klon G2A5D7(Accession Nr. FERM P-15638), A1G1C6 (Accession Nr. FERM P-15639), 5C5 (Accession Nr. FERM P-15640), H12D10D6 (Accession Nr. FERM P-15641) und 89F2 (Accession Nr. FERM P-16229).
Eine in vitro Meßmethode des humanen LECT2 gemäß dieser Erfindung umfaßt charakteristisch die folgenden Verfahrenschritte von a) bis c) und d) bis f):

a) Das humane LECT2 wird als Standardmaterial mit einem befestigten Antikörper reagiert, welcher durch die Kombination eines ersten Antikörpers, der spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert, mit einem unlöslichen Trägermedium erhalten wurde;
b) dann wird das Produkt mit einem markierten Antikörper regiert, der durch Markierung eines zweiten Antikörpers, der spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert, mit einer Markierungssubstanz erhalten wurde;
c) und eine Eichgerade wird durch eine Messung der Menge der Markierungssubstanz in dem Reaktionsprodukt erzeugt; und
d) der besagte befestigte Antikörper wird mit einer Probe reagiert;
e) dann mit dem besagten markierten Antikörper reagiert;
f) die Menge der Markierungssubstanz in diesem Reaktionsprodukt wird gemessen und die Menge des humanen LECT2, die in der Probe enthalten ist, wird aus der besagten Eichgerade gemessen.

Ein Kit für die in vitro Messung des humanen LECT2 gemäß dieser Erfindung ist charakterisiert durch das Umfassen eines befestigten Antikörpers, der durch Kombination eines unlöslichen Trägermediums mit einem ersten Antikörper erhalten wurde, der spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert, und einem markierten Antikörper, welcher erhalten wird, wenn eine Markierungssubstanz an einen zweiten Antikörper markiert wird, der spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert.
Der erste Antikörper ist der Antikörper, er durch den Syncytium Klon G2A5D7 (Accession Nr. FERM P-15638) hergestellt wurde, der Antikörper, hergestellt durch den Syncytium Klon A1G1C6 (Accession Nr. FERM P-15639), der Antikörper, hergestellt durch den Syncytium Klon 5C5 (Accession Nr. FERM P-15640), der Antikörper, hergestellt durch den Syncytium Klon H12D10D6 (Accession Nr. FERM P-15641), oder den Antikörper, hergestellt durch den Syncytium Klon 89F2 (Accession Nr. FERM P-16229). Der zweite Antikörper ist einer von den besagten fünf Antikörpern, aber bevorzugt unterschiedlich von dem ersten. Auch die Markierungssubstanz kann zum Beispiel ausgewählt werden aus einer Gruppe von Peroxidase, Biotin, β-D-Galaktosidase, alkalischen Phosphatase und Mikroperoxidase.
Durch die Mittel der Verfahren und dem Kit für die Messung des humanen LECT2 gemäß der vorliegenden Erfindungen kann ein chemotaktischer Faktor, humanes LECT2, welches in einer Probe enthalten ist, gemessen werden. Daher werden das Verfahren und das Kit für die Diagnose von Lebererkrankungen verwendet, welche mit Hepatitis B und C Infektionen assoziiert sind.
Das Verfahren und das Kit gemäß der Erfindung kann die Diagnose bei akuten und Remissionsphasen der Lebererkrankungen umfassen, die mit Hepatitis B und C Infektionen assoziiert sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER GRAPHIKFIGUREN
1 ist eine graphische Darstellung, die die Detektionsergebnisse von humanem LECT2 durch die ELISA Methode zeigt; 2 ist eine beispielhafte Darstellung, welche eine Reaktionsspezifität eines monoklonalen Antikörpers eines jeden Klons durch Western Blot zeigt; 3 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Konzentration von humanem LECT2 und dem optischen Absorptionsvermögen zeigt; 4 ist eine graphische Darstellung, die die gemessenen humanen LECT2 Werte von Proben aus Patienten mit akuter Hepatitis in einer akuten Phase und in einer Remissionsphase zeigt; 5 sind photographische Aufnahmen von gefärbten Geweben einer Person bei guter Gesundheit, wobei (A) 100-fach vergrößert ist und (B) 200-fach vergrößert ist; und 6 sind photographische Aufnahmen von gefärbten Geweben eines Patienten mit Zirrhose, wobei (A) 100-fach vergrößert ist und (B) 200-fach vergrößert ist.
DIE BESTE ART UND WEISE DER AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
[Ein Antikörper, welcher spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert, und ein Syncytium, welches den Antikörper herstellt] – Vergleichsbeispiel –
Verfahren für die Herstellung eines Antikörpers, welcher spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert, werden wie folgt beschrieben.
A. Antigen
Das humane LECT2 (ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz in der Folge, wie in Sequenz ID No. 1 gezeigt, hat) ist kloniert worden und als Antigen verwendet worden.
B. Immunität des oben genannten Antigens
Als Immuntiere können Säugetiere wie zum Beispiel Mäuse, Ratten und Hamster verwendet werden. Im Allgemeinen werden Mäuse am häufigsten verwendet, und BALB/c-Mäuse und Mäuse anderer Stämme können verwendet werden. In diesem Fall sollte der Immunisierungsplan und die Konzentration des Antigens so gewählt werden, so daß lymphatische Korpuskel gebildet werden, welche eine genügende Antigenstimulation erhalten haben. Zum Beispiel wird das Antigen (jedes Mal 25 μg) für die Immunisierung dreimal in die Bauchhöhle einer Maus injiziert, hin und wieder in zwei Wochen, und dann in die Vene. Einige Tage nach der letzten Immunisierung werden Zellen aus der Milz für die Fusion entnommen.
C. Zellfusion
Die Milz wird in einer keimfreien Art und Weise aus dem einzelnen Säugetier entnommen, welches auf diese Weise immunisiert worden ist. Daraus wird eine einzellige Suspension hergestellt. Die Zellfusion zwischen den Milzzellen (Zellen für die Herstellung von Antikörper) und geeigneten Myelomzellen wird durchgeführt, indem ein geeigneter Zellfusionsbeschleuniger verwendet wird. Die Myelomzellen eines Säugetiers, welches zu der gleichen Art gehört, wie das immunisierte Tier, sind bevorzugt, jedoch können die Milzzellen einer Ratte, eines Hamsters oder ähnlicher auch mit den Myelomazellen einer Maus fusioniert werden. Das bevorzugte Verhältnis von Milzzellen zu Myelomazellen ist in dem Bereich zwischen ca. 20:1 und ca. 2:1. Es ist zweckdienlich, 0,5 bis 1,5 ml Fusionsmedium für ca. 10⁸ Milzzellen zu verwenden. Als bevorzugter Fusionsbeschleuniger kann zum Beispiel Polyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1000 bis 4000 zweckmäßigerweise verwendet werden. Andere Fusionsbeschleuniger, welche auf diesem Gebiet bekannt sind (zum Beispiel Sendai-Virus (sogenannter HVJ)) können auch verwendet werden. Die Zellfusion kann auch durchgeführt werden, indem ein Elektroschockverfahren verwendet wird, neben der Methode, die solche Fusionsbeschleuniger verwendet.
D. Auswahl der Syncytien, welche die erstrebten Antikörper herstellen
Ein Gemisch nicht-fusionierter Milzzellen, nicht-fusionierten Myelomzellen und fusionierten Syncytien wird in einem separaten Gefäß (z. B. einer Mikrotiterplatte) mit einem Selektionsmedium verdünnt, welche die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht ernährt, und für eine Zeit kultiviert, welche ausreichend ist, die nicht-fusionierten Zellen zu zerstören (für ca. 1 Stunde). Ein Arzneimittel resistentes Kulturmedium (z. B. 8-Azaguaniniresistent), welches die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht ernährt (z. B. HAT Kulturmedium), wird verwendet. In diesem Kulturmedium sterben die nicht-fusionierten Myelomzellen. Die nicht-fusionierten Milzzellen sind nicht neoplastisch und daher sterben sie nach einer bestimmten Dauer (1 Woche später). Im Gegensatz dazu können die fusionierten Zellen in dem Selektionsmedium überleben, da sie sowohl neoplastische Eigenschaften der Elternzellen der Myeolma als auch die Eigenschaften der Elternmilzzellen haben.
Dann, nachdem die Syncytien detektiert sind, werden die Antikörper gegen das oben genannten humane LECT2 durch Enzyme Linked Immunosorbent Assay untersucht, und nur Syncytien, welche monoklonale Antikörper herstellen, welche spezifisch mit dem humanen LECT2 kombinieren, werden ausgewählt. Solche Syncytien umfassen zum Beispiel den Syncytien Klon G2A5D7 (Accession Nr. FERM P-15638), Syncytium Klon A1G1C6 (Accession Nr. FERM P-15639), Syncytium Klon 5C5 (Accession Nr. FERM P-15640), Syncytium Klon H12D10D6 (Accession Nr. FERM P-15641), Syncytium Klon 89F2 (Accession Nr. FERM P-16229).
F. Herstellung der angestrebten Antikörper
Nach der Klonierung der Syncytien, welche die anvisierten Antikörper herstellen, nach einem geeigneten Verfahren (zum Beispiel Limiting Dilution Analyse), können die Antikörper durch zwei verschiedene Methoden herstellt werden. Gemäß der ersten Methode werden die Syncytien in einem geeigneten Kulturmedium für eine vorbestimmte Dauer kultiviert und dann können die monoklonalen Antikörper, welche durch die Syncytien produziert werden, aus dem Kulturüberstand erhalten werden. Gemäß der zweiten Methoden können die Syncytien in die Bauchhöhle eines immunen Tieres injiziert werden, das isogene oder semiisogene Gene hat. Die durch die Syncytien hergestellten monoklonalen Antikörper können aus dem Blut und dem abdominalen Bauchwasser des Wirtstieres erhalten werden.
[Methoden der Messung des humanen LECT2]
A. Befestigte Antikörper
Um die befestigten Antikörper zu erhalten, die durch die Kombination von Antikörpern, welche spezifisch mit dem humanen LECT2 reagieren, mit einem unlöslichen Trägermedium, werden die Antikörper und die unlöslichen Trägermedien miteinander in Kontakt gebracht, wodurch die Antikörper auf den Oberflächen der unlöslichen Trägermedien adsorbiert werden. Ein chemisches Verfahren, wie zum Beispiel die kovalente Bindung, ist für ihre Verknüpfung auch nützlich.
Als unlösliche Trägermedien können zum Beispiel hoch-Polymere, wie zum Beispiel Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polyester, Polyacrylonitril, Fluorpolymer, kreuzvernetztes Dextran und Polysaccharide gezeigt werden, als auch Papier, Glas, Metall, Agarose und Kombinationen dieser Materialien. Als Form der unlöslichen Trägermedien sind verschiedene Formen geeignet wie eine Mulde, eine Kugel, ein Stab, ein Faden, eine Platte, ein Gefäß, eine Cuvette, ein Reagenzglas usw.
B. Markierte Antikörper
Der Antikörper, welcher spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert, kann entweder ein IgG sein, oder ein Fragment von Fab, F(ab)'₂ oder ähnliches.
Die Markierungssubstanz ist nicht eingeschränkt, wenn sie für übliche immunologische Meßmethoden verwendet werden kann, dennoch werden Enzyme, Avidine, fluoreszente Substanzen, lumineszente Substanzen, radioaktive Substanzen und ähnliche bevorzugt verwendet. Als Enzyme können Peroxidase, β-D-Galaktosidase, alkalische Phosphatase, Mikroperoxidase verwendet werden, als fluoreszente Substanzen können fluoreszierendes Isothiocyanat, Phicobiliprotein, Phicoerythrin und ähnliches verwendet werden, als lumineszente Substanzen können Isolucinol, Lucingenin und ähnliches verwendet werden und als radioaktive Substanzen können ¹²³I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H und ähnliches verwendet werden. Wenn Biotin als Markierungssubstanz verwendet wird weiter, mit Avidin markiert mit einem Enzym, kann eine hohe Sensitivität bevorzugt erhalten werden. In diesem Fall kann ein Enzym, ähnlich zu der Markierung an dem Antikörper, als Markierungsenzym verwendet werden, Peroxidase ist besonders bevorzugt.
Wenn ein Enzym als Markierungssubstanz verwendet wird, wird ein Substrat, und wenn ein erforderlicher Farbstoff eine Färbungssubstanz verwendet, um die Aktivität davon zu messen. Wenn Peroxidase als Enzym verwendet wird, wird H₂O₂ als Substrat verwendet, und es können ein Ammoniumsalz von 2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzylthiazolinsulphonsäure] (ABTS), 5-Aminosalicylsäure, o-Phenylendiamin (OPD), 4-Aminoantipyrin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin oder ähnliches als Färbungssubstanzen verwendet werden. Wenn alkaline Phosphatase als ein Enzym verwendet wird, wird o-Nitrophenylphosphat oder ähnliches als Substrat verwendet. Wenn β-D-Galaktosidase als ein Enzym verwendet wird, kann fluoreszierendes di-(β-D-Galaktopyranose), 4-Methylunberypheryl-β-D-Galaktopyranose oder ähnliches als Substrat verwendet werden.
C. Herstellung einer Eichkurve
Das humane LECT2, als eine Standardsubstanz, wird mit einem befestigten Antikörper reagiert, und dann wird das humane LECT2, welches spezifisch mit dem befestigten Antikörper reagiert hat, mit einem markierten Antikörper reagiert. Anschließend wird die Menge der Markierungssubstanz des markierten Antikörpers gemessen. Durch dieses Verfahren wird eine Relation zwischen der Menge des humanen LECT2 und der Markierungssubstanz, oder einer Eichkuve, erhalten.
Als Reaktionsmedium werden in dieser immunologischen Meßmethode Flüssigkeiten mit einem pH von 6,0 bis pH 6,8 verwendet, einschließlich, zum Beispiel, Pufferlösungen von Phosphorsäure, von Tris-Chlorwasserstoffsäure und von Essigsäuren und ähnlichen sind gezeigt.
D. Messung von humanem LECT2, das in Proben enthalten ist
Eine Probe wird mit dem befestigten Antikörper reagiert, und dann mit dem markierten Antikörper reagiert. In diesem Stadium reagiert der markierte Antikörper in Abhängigkeit von der Konzentration des humanen LECT2, das in der Probe enthalten ist. Anschließend wird die Menge der Markierungssubstanz des markierten Antikörper gemessen. Der Meßwert wird auf die Eichkurve bezogen und als Ergebnis wird die Konzentration des humanen LECT2 in der Probe gemessen. In Bezug auf das Reaktionsmedium sind bereits Erläuterungen in dem oben genannten Absatz C) gegeben.
[Kit für die Messung des humanen LECT2]
Das Kit für die Messung des humanen LECT2 umfaßt zumindest:

(1) einen befestigten Antikörper, der durch die Kombination eines ersten Antikörpers, der spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert, mit einem unlöslichen Trägermedium erhalten wurde; und
(2) einem markierten Antikörper, der durch Markierung eines zweiten Antikörpers, der spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert, mit einer Markierungssubstanz erhalten wurde. Das Kit kann ein anderes Reaktionsmedium und/oder eine andere Standardstubstanz (humanes LECT2) umfassen. Darüber hinaus sind üblicherweise, wenn die Markierungssubstanz des markierten Antikörpers ein Enzym ist, eine Lösung zur Beendigung der Reaktion und ein Substrat für die Messung der Aktivität des Enzyms umfaßt. Erläuterungen zum unlöslichen Trägermedium und der Markierungssubstanz sind bereits zuvor gegeben worden und werden daher hier ausgelassen. Die oben genannte Meßmethode kann durchgeführt werden, in dem das Meßkit verwendet wird.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nun mit Bezug auf die Graphikfiguren beschrieben. Jedoch ist die Ausführungsform dieser Erfindung nicht auf die folgenden Ausführungsformen beschränkt und kann verschiedenartig innerhalb des Umfangs der Erfindung modifiziert werden.
[Ausführungsform 1] Herstellung eines Immunogens (Humanes LECTS2) – Vergleichende Ausführungsform
[1-1] Klonierung des humanen LECT2 und Bestimmung der Nukleotidsequenz des klonierten humanen LECT2.
Die Klonierung der humanen LECT2 cDNA ist wie folgt ausgeführt worden.
Poly A⁺ RNA ist durch Behandlung der T-Zell-Typ Leukämia Zelle SKW-3 mit PHA-P (50 μg/ml) (hergestellt durch DIFCO Inc.) hergestellt worden. Der erste Strang der cDNA (1st cDNA) ist unter Verwendung von Poly A⁺ RNA (5 μg) und Oligo-dT als Primer synthetisiert worden.
Dann ist ein PCR Primer synthetisiert worden, der auf der partiellen Aminosäuresequenz des Rinder LECT2 (seine Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 9 gezeigt) basiert. Und zwar sind 6 Arten von Oligonukleotiden von der Aminosäuresequenz WAIICA abgeleitet worden, um den 5' Primer zu bilden und 4 Arten von Oligonukleotiden sind von der Aminosäuresequenz HIENCD abgeleitet worden, um den 3' Primer zu bilden. Das DNA Fragment ist in 24 Reaktionen amplifiziert worden, welche die Kombinationen der besagten Primern sind, indem die 1st cDNA als Template gemäß der PCR-Methode verwendet wird. Die amplifizierte DNA ist in einem Agarosegel getrennt worden, unter Verwendung der DNA Sonde
(GATGTC/GCTA/GTGCTCT/CGATGGC/GTCT/CACT/AGTC/GTATGCT/CCCT/CTT:
mit Bezugnahme auf Sequenz ID NO: 4), basierend auf der Aminosäuresequenz DVLCSDGSTVYAPF, und durch eine Southern Blotting Methode analysiert worden. Als Ergebnis sind ca. 370 bp eines DNA Fragments detektiert worden, welches in pUC19 kloniert worden ist.
Als Ergebnis des Screenings der cDNA Bibliothek einer humanen Leber unter Verwendung des klonierten cDNA Fragments als Probe, sind 12 positive Klone unter 1,3 Millionen Klonen erhalten worden. All diese Klone erwiesen sich durch den Analyse durch Restriktionsenzyme als in zwei Typen klassifizierbar, und die Basensequenz des Klons mit dem längsten cDNA Fragment jeder Gruppe ist bestimmt worden. Die Sequenzanalyse des längsten Klons von jedem Typ weist daraufhin, daß die zwei Arten der cDNA aus einem identischen Gen erlangt werden würden, welches zwei Poly A Signale auf der 3' Seite hat. Die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins offenbart, daß die Aminosäuresequenzen 90% homolog zu der bestimmten Rinder LECT2 Aminosäuresequenz sind. Dann ist dieses Protein, welches als kodiert betrachtet wird, humanes LECT2 genannt worden. Die Aminosäuresequenz und die Basensequenz des humanen LECT2 sind jeweils in Sequenz ID No. 1 und 2 gezeigt.
[1-2] Anordnung des rekombinanten Plasmids, welches das humane LECT2 Gen enthält.
Die Sequenz, die auf der klonierten humanen LECT2 cDNA basiert, GGCGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAGGGGCCCTGGGCTAATATATG (unter Bezugnahme auf Sequenz ID NO. 5) ist als 5' Primer verwendet worden und CGCAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAG (mit Bezugnahme auf Sequenz ID NO. 6) als 3' Primer verwendet worden. Die DNA Fragmente, einschließlich der humanen LECT2 cDNA sind mit diesen Primern durch die PCR Methode amplifiziert worden, welche 25 Zyklen Denaturierung bei 94°C für eine Minute, ein Annealing bei 55°C für 2 Minuten und eine Elongation bei 72°C für 3 Minuten hat. Nach dem Verdau mit EcoRI und HindIII sind die Fragmente, einschließlich der humanen LECT2 cDNA in die EcoRI/HindIII Stellen von pMAL^TM-C (Biolab Inc.) ligiert worden. Das so rekombinierte Plasmid ist pMAL-TEV-humanes LECT2 genannt worden. Dieser Manifestationsvektor kann ein fusioniertes Protein des Maltose-Bindungsprotein und des humanen LECT2 in der Gegenwart von IPTG unter der Kontrolle eines tac-Promoters herstellen. Ein Fragment der TEV-Protease (hervorgebracht aus dem Tabacco Etch Virus) ist in seiner Kopplungsstelle vorhanden, was eine spezifische Fragmentierung ermöglicht.
Auch ist, basierend auf der klonierten humanen LECT2 cDNA, GCGGGATCCCCGGGCCATGGGCTAATAT (mit Bezug auf Sequenz ID No. 7) als 5'-Primer verwendet worden und CGCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG (mit Bezugnahme auf Sequenz ID No. 8) als 3' Primer verwendet worden. Die DNA Fragmente, einschließlich der humanen LECT2-cDNA, sind mit diesen Primern durch eine PCR Methode amplifiziert worden, welche 25 Zyklen der Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, ein Annealing bei 55°C für 2 Minuten und eine Elongation bei 72°C für 3 Minuten hat. Nach dem Verdau mit BamHI sind die Fragmente, einschließlich der humanen LECT2 cDNA, in die BamHI Stelle von pGEX-3X (Pharmacia Inc.) ligiert worden. Das so rekombinierte Plasmid ist pGEX-Xa-humanes LECT2 genannt worden. Dieser Manifestationsvektor kann ein fusioniertes Protein von Glutathion-S-Transphelase und des humanen LECT2 in der Gegenwart von IPTG unter der Kontrolle eines tac-Promoters herstellen. Ein Fragment der Xa-Protease ist in seiner Kopplungsstelle vorhanden, was eine spezifische Fragmentierung ermöglicht.
[1-3] Transformation von E. coli mit einem rekombinanten Plasmid, welches das humane LECT2 Gen enthält.
E. coli JM109 ist mit dem oben erhaltenen rekombinanten Plasmid pMAL-TEV-humanes LECT2 transformiert worden. Von den so erhaltenen E. coli Klonen sind jene, die die erwartete Basensequenz haben, durch die Deoxymethode gescreent worden und der E. coli Klon MAL-human LECT2 (Accession Nr. FERM P-14669: Er ist der internationalen Aufbewahrung unter der Accession Nr. FERM BP-5302 überführt worden), welcher das erwartete DNA Fragment aufweist, ist erhalten worden.
[1-4] Herstellung des humanen LECT2 durch tierische Zellen
Die 5' Seite der humanen LECT2 cDNA, welche in die BamHI Stelle von pUC19 von HindIII bis EcoRI ligiert war, ist durch die Exonuklease III bis zur -14 Basensequenz entfernt worden, mit der T4 DNA Polymerase behandelt worden, um eine glatte Endungsgruppe zu bilden, mit Pst1 Linkern ligiert worden, mit Pst1 und Bg1II fragmentiert worden und in die Pst1/BamHI Stelle des Manifestationsvektor pcDL-SR α 294 ligiert worden. Dieser rekombinate Manifestationsvektor ist in CHO Zellen eines Chinese Hamsters transfiziert worden, und ein Stamm, welcher das humane LECT2 hoch manifestiert (C1D8-1) (Accession Nr. FERM P-14668: Er wurde der internationalen Aufbewahrung unter der Accession Nr. FERM BP-5301 überführt) ist erhalten worden.
(Bestimmung der molekularen Größe)
Das rekombinante humane LECT2 (Expression von tierischen Zellen) ist durch metabolische Markierung mit ³⁵S-Methionin detektiert worden und der Kulturüberstand der CHO-Zellen ist einer SDS-Gelelektrophoräse unterworfen worden, welche zwei Banden der molekularen Größe von ca. 14 kDa und 16 kDa ergab. (Die 16 kDa Bande ist die wichtigste. Die zwei Banden sind scheinbar aufgetaucht aufgrund von Unterschieden in dem Processing.)
[Ausführungsform 2] Immunität – Vergleichende Ausführungsform –
Das Immunogen, das humane LECT2, hergestellt in der oben genannten Ausführungsform 1, (100 μl) ist ausreichend mit Freund's vollständige Adjuvan (100 μl) gemischt worden, um eine Suspension zu ergeben, welche in die Bauchhöhle von zwei Mäusen (männliche BALB/c) als das Immunogen injiziert worden war, 25 μl in jede. Ferner ist das Immunogen in der gleichen Menge 5 mal, jede zweite Woche injiziert worden. Dann ist drei Tage später die Milz entnommen worden und einem Fusionsexperiment unterworfen worden.
Getrennt sind auch zwei Kaninchen in der gleichen Art und Weise immunisiert worden. Nachdem das Serum von dem Blut getrennt worden ist, dass den Kaninchen entnommen worden ist, wurde ein Absorptionsvorgang ausgeführt, indem eine übliche Methode verwendet wird und die IgG-Fraktion wurde getrennt, um einen polyklonalen Antikörper hervorzubringen.
[Ausführungsform 3] Zellfusion und Selektion und Akquisition von Syncytien, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper herstellen – Vergleichende Ausführungsform
Die Milzzellen, die aus Mäusen entnommen worden sind (10 Stück) und die Myelomzellen (SP-2/O-Ag-14) aus Mäusen des gleichen Stammes (1 Stück) sind gemischt worden, und die Zellfusion ist unter Verwendung von 50% Polyethylenglycol 4000 als Fusionsbeschleuniger durchgeführt worden. Die fusionierten Zellen sind in dem HAT Kulturmedium (Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält) suspendiert worden, welches 10% Rinderserum enthält, so daß eine Zellkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml erhalten wird und in eine 96 Well-Mikrotiterplatte (Maxisoap, hergestellt durch Nunk Inc.: Die gleichen werden hiernach benutzt) gegeben worden, 100 μl in jeden Well.
Die Syncytien sind in einem CO₂ Inkubator (5% CO₂, 37°C) kultiviert worden, in HAT-Kulturmedium überführt worden, in dem HAT Kulturmedium konditioniert worden und weiter in 10% FCS-RPMI 1640 Kulturmedium konditioniert worden.
Die Antikörper in dem Kulturüberstand der fusionierten und kultivierten Zellen sind durch die ELISA Methode detektiert worden, indem eine Mikrotiterplatte verwendet wurde, auf welcher das humane LECT2 Protein befestigt war. Eine Klonierung ist zweimal für jeden Well durchgeführt worden, welches als positiv bestätigt worden ist, indem die Limiting Dilution Analyse verwendet wurde. Dann sind 5 Arten von Klonen ausgewählt worden, welche eine Reaktivität gegenüber dem humanen LECT2 gezeigt haben und die sind G2A5D7, A1G1C6, 5C5, H12D10D6 und 89F2 jeweils benannt worden (jeweilige Accession Numern FERM P-15638, FERM P-15639, FERM P-15640, FERM P-15641 und FERM P-16229).
Jeder erhaltene Klon ist in 90% Rinderserum suspendiert worden, umfassend 10% DMSO und in flüssigem Stickstoff gehalten worden. Der monoklonale Antikörper, welcher durch jeden Klon hergestellt wird, ist in der Bauchhöhle einer Maus amplifiziert worden. Jeder Antikörper aus dem Bauchwasser ist mit einer Protein-A Cephalosesäule gereinigt worden.
[Ausführungsform 4] Nachweis der Spezifität der monoklonalen Antikörper – Vergleichende Ausführungsform –
1. Nachweis der Spezifität durch die ELISA Methode
Einer PBS-Lösung des humanen LECT2 (1–1000 ng/ml) ist hergestellt worden. Das humane LECT2 ist unter Verwendung der Lösung auf einer Mikrotiterplatte befestigt worden, mit der Antikörperlösung von jedem Klon reagiert worden und dann mit dem Anti-Maus-Immunoglobulin reagiert worden, das mit Peroxidase markiert war (hergestellt durch Cappel Inc.). Das optische Absorptionsvermögen ist bei einer Wellenlänge von 492 nm für jedes Produkt in einer Lösung von Orthophenyldiamin und Wasserstoffperoxid als ein Substrat gemessen worden. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Es ist bestätigt worden, daß jeder Klon spezifisch mit dem humanen LECT2 reagiert, aus der Tatsache, daß die Werte des optischen Absorptionsvermögens mit der Konzentration des befestigten humanen LECT2 sich erhöhten und über einer Konzentration konstant wurden.
2. Nachweis der Spezifität durch einen Western Blot
Ein Gemisch des humanen LECT2 und des Maltose Bindungsproteins (MBP) als ein Antigen ist einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) (16,5% Monoacrylamid/bis-Acrylamid; 3% bis-/Mono-Acrylamid + bis) unterworfen worden. Nach der Elektrophorese ist die Spezifität der Reaktion durch Western Blotting nachgewiesen worden. Der monoklonale Antikörper von jedem Klon zeigte eine Reaktivität bei ungefähr 16 kD und reagierte nicht mit dem MBP. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
In 2 ist CBB die Abkürzung für Cummarcy Brilliantblau und zeigt die Proteinfärbung. In der ersten Spur ist ein Molekulargewichtsmarker und in den anderen sind die Ergebnisse der Elektrophorese des humanen LECT2 + MBP als ein Antigen. Die erste und zweite Spur zeigt die Proteinfärbung und die anderen zeigen den Western Blot für jeden monoklonalen Antikörper.
[Ausführungsform 5] Nachweis einer Subklasse durch das ELISA Verfahren – Vergleichbare Ausführungsform
Für jeden in der oben genannten Ausführungsform 3 erhaltenen monoklonalen Antikörper ist die Subklasse unter Verwendung eines monoklonalen Subklassen Isotyping Kits, hergestellt durch American Corlex Inc., nachgewiesen worden. Das Ergebnis war, daß die Klone A1G1C6 und G2A5 IgG2b waren und Klon H12D10D6 IgM war. Jedoch sind die Klone 5C5 und 89F2 nicht bestätigt worden.
[Ausführungsform 6] Befestigung der Antikörper – Vergleichende Ausführungsform –
Die Lösung des monoklonalen Antikörperklons G5A5, erhalten in der oben genannten Ausführungsform 3, ist in einer Konzentration von 5 μl/ml hergestellt worden, indem 0,1 M Karbonatpuffer (pH 9,0) verwendet wurde, in eine 96 Loch Mikrotiterplatte in 100 μl in jedes Loch geschüttet worden und stationär bei 4°C für 20 Stunden reagiert worden. Die Antikörperlösung ist aus den Löchern entfernt worden, 200 μl PBS, welches 1% BSA in 5% Succharose enthält, sind jedem Loch hinzugefügt worden und die Blockierung ist bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) für 2 Stunden in der stationären Phase ausgeführt worden. Die Blockierungslösung ist verworfen worden und die Platte ist luftgetrocknet worden, um befestigte Antikörper zu ergeben. Die befestigten Antikörper sind unter einem abgedichteten Zustand mit einem Trockenmittel gehalten worden.
[Ausführungsform 7] Herstellung von markierten Antikörpern – Vergleichende Ausführungsform
Gereinigtes IgG des polyklonalen Antikörper, der in der oben genannten Ausführung 2 erhalten wurde, wurde Ficin in 0,056 U für 1 mg gereinigtes IgG hinzugefügt, 8 Stunden bei 37°C reagiert, und dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Ultrogel ACA44 unterworfen, und eine Fab Fraktion ist somit erhalten worden. Diese Fab Fraktion ist mit Peroxidase durch die Maleimidmethode markiert worden, um Peroxidase-markierte Antikörper zu ergeben. Im speziellen, diese Markierung ist in Anlehnung an „Measuring Method of Enzyme Immunity, Dritte Ausgabe", veröffentlicht durch Igakushoin und geschrieben durch Eiji Ishikawa, ausgeführt worden.
[Ausführungsform 8] Messung des humanen LECT2
Das humane LECT2 Protein ist mit PBS verdünnt worden, um 0,001–20 ng/ml Lösungen zu ergeben. 200 μl jeder Lösung ist jedem Loch der Platte mit den befestigten Antikörpern, erhalten in der oben genannten Ausführungsform 6, hinzugefügt worden, und bei Raumtemperatur für eine Stunde reagiert worden. Nachdem jedes Loch mit 300 μl PBS viermal gewaschen worden ist, ist überschüssiges PBS entfernt worden. Dann ist jedem Loch Peroxidase-markierte Antikörper (100 μl), welche in der oben genannten Ausführungsform 7 erhalten worden sind, hinzugefügt worden und bei Raumtemperatur für eine Stunde reagiert worden, wiederum mit PBS gewaschen worden und mit einer Lösung von Tetramethylbenzidin und Hydrogenperoxid (100 μl) versetzt und reagiert worden und die Reaktion ist durch die Hinzugabe von 100 μl von 1,5 normaler Phosphorsäure beendet worden. Dann ist das optische Absorptionsvermögen bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen worden. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 2 und 3 gezeigt.
Tabelle 2
Aus den Ergebnissen erhält man die Relation der Menge der markierten Substanz zu der des humanen LECT2, das heißt, eine Eichkurve wird hergestellt. Durch Verwendung der Eichkurve ist die Relation der Menge der markierten Substanz zu der des humanen LECT2 in einer Probe zu erhalten, das heißt eine Eichkurve wird hergestellt, die verwendet wird um die Menge des humanen LECT2, welches in den Proben enthalten ist, zu wissen.
Für die Proben aus Patienten mit akuter Hepatitis sind Daten eines Vergleichs von gemessenen Werten in akuten Phasen und Remissionsphasen in Tabelle 3 und 4 gezeigt. Tabelle 3
Als Ergebnis der vorausgehenden Studie über die gemessenen Reihen ist bewiesen worden, daß das humane LECT2 in Proben seine Antigenizität in einer vergleichsweise frühen Phase verloren hat, insbesondere verschwindet die Antigenizität im Serum sofort. Daher ist Plasma als eine Probe verwendet worden. Plasma ist durch schnelle Trennung des Bluts nach der Blutentnahme erhalten worden und in einem gefrorenen Zustand bei –20°C, oder weniger, bis zur Messung gelagert worden. Wenn die Probe nicht mehr als 5 Mal verdünnt wird, besteht die Möglichkeit, daß Meßwerte beeinflußt werden. Daher sind die Proben nach einer 10-fachen Verdünnung gemessen worden.
Der Vergleich der gemessenen Werte einer jeden Probe in einer akuten Phase und einer Remissionsphase zeigt einen unterschiedlichen Abfall der Daten der Remissionsphase im Vergleich zu der der akuten Phase. Von diesen Daten ausgehend wird geglaubt, daß die Konzentration des humanen LECT2 in Proben die Erkrankungszustände der Patienten reflektiert.
Da der Gehalt des humanen LECT2, ein chemotaktischer Faktor, in einer Probe auf diese Art und Weise gemessen werden kann, kann das Ergebnis der Messung verwendet werden, um den Erkrankungszustand zu erfassen und die Erkrankung zu heilen.
[Ausführungsform 9] Färbung von immunem Gewebe
Lebergewebe ist einer gesunden Person und einem Hepatitispatienten entnommen worden, einer Formalinfixierung unter Verwendung einer gewöhnlichen Methode unterworfen worden und in Paraffin eingebettet worden. Das in Paraffin eingebettete Gewebe ist mit einem Mikrotom in Gewebeschnitte geschnitten worden. Die Deparaffinisierung der Gewebeschnitte ist durch eine gewöhnliche Methode durchgeführt worden. Ungefähr 100 μl einer PBS Lösung einer IgG Fraktion (5 μg/ml), erhalten durch Reinigung des in der Ausführungsform 3 erhaltenen monoklonalen Antikörperklons 89F2, sind auf die Gewebeschnitte gegeben worden, bei 37°C für 30 Minuten reagiert worden und die Gewebeschnitte sind mit PBS gewaschen worden. Die Schnitte sind dann mit einem Anti-Maus-IgG, markiert mit Peroxidase (hergestellt durch Daco Inc.) bei 37°C für 30 Minuten reagiert worden, wiederum mit PBS gewaschen worden und anschließend durch Reaktion mit einer Lösung von 3,3', 5,5'-Diaminbenzidin und Wasserstoffperoxid gefärbt worden. Die Kerne sind mit Hämatoxilin gefärbt worden.
5 sind Photographien, welche die gefärbten Aufnahmen der Gewebe, welche aus der gesunden Person entnommen worden sind, zeigen; (A) ist eine Photographie, 100-fach vergrößert und (B) ist eine Photographie, 200-fach vergrößert. 6 sind Photographien, welche die gefärbten Aufnahmen der Gewebe, welche dem Hepatitispatienten entnommen worden sind, zeigen; (A) ist eine Photographie, 100-fach vergrößert und (B) ist eine Photographie, 200-fach vergrößert.
Eine diffuse Färbung ist in dem Cytoplasma von Leberzellen sowohl in den Gewebeschnitten der gesunden Person als auch des Hepatitspatienten beobachtet. Im speziellen ist sowohl für die gesunde Person als auch dem Hepatitspatienten eine granulare Färbung (braun gefärbt) durch Diaminobenzidin in den Parenchymzellen der Lebern beobachtet worden, aber bei dem Hepatitispatienten ist ein Gemisch von positiven und negativen Zellen bestätigt worden und das Färbungsmuster war unterschiedlich gegenüber der Person bei guter Gesundheit (bei der gesunden Person waren die Parenchymzellen der Leber alle positiv). Eine Färbung der Bindegewebe ist nicht beobachtet worden. Partikel, welche blau in den Photographien der 5 und 6 gefärbt sind, sind Kerne. Diese Tatsache weist daraufhin, daß das LECT2 eine Beziehung zu dem Zellzyklus hat.
MÖGLICHKEIT DER GEWERBLICHEN NUTZUNG
Der in dieser Erfindung beschriebene Antikörper gegen das humane LECT2 ist für die immunologische medizinische Behandlung und Diagnose nützlich und in den gewerblichen Gebieten, welche damit in Beziehung stehen. Das in dieser Erfindung beschriebene Syncytium ist auch für den Erhalt von einem Antikörper gegen das humane LECT2 nützlich. Des Weiteren kann der in dieser Erfindung beschriebene Antikörper gegen das humane LECT2 in einem Verfahren und in einem Kit für die Messung des humanen LECT2 verwendet werden. Das humane LECT2 (gedacht als chemotaktischer Faktor), welches in einer Probe enthalten ist, kann gemessen werden, indem das Verfahren und das Kit für die Messung verwendet werden, es wird gewissermaßen möglich, das Ergebnis der Messung für die Diagnose von Lebererkrankungen, die mit Hepatitis B und C Infektionen assoziiert sind, zu verwenden und anzuwenden.
Noch weiter im Detail, zum Beispiel, wird der in dieser Erfindung beschriebene Antikörper mit Geweben, welche aus Patienten verschiedener Erkrankungen (zum Beispiel Hepatitis und Zirrhose) entnommen worden sind, reagiert und die Stellen in den Geweben, wo die Zellen, welche das humane LECT2 offenbaren, lokalisiert sind, können untersucht werden. Demgemäß kann das Verfahren und das Kit der Erfindung auf die Diagnose von Lebererkrankungen, die mit Hepatitis B und C Infektionen assoziiert sind, ausgeweitet werden.
HINTERLEGUNGSINSTITUTION

Das C1D8-1 und Mal-humane LECT2 sind bei den folgenden internationalen Hinterlegungsinstitutionen hinterlegt worden, unter den jeweiligen folgenden Zugangsnummern und Hinterlegungsdaten.

Name der Institution:	National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry
Adresse:	1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan (Zip Code 305)

Zugangsnummer und Hinterlegungsdatum:

(1) C1D8-1 FERM BP-5301: 25. November 1994
(2) Mal-humanes LECT2 FERM BP-5302: 25. November 1994

Die Syncytiumklone G2A5D7, A1G1C6, 5C5, H12D10D6 und 89F2 sind bei den folgenden inländischen Hinterlegungsinstitutionen unter den jeweils folgenden Zugangsnummern und Hinterlegungsdaten hinterlegt worden.

Zugangsnummer und Hinterlegungsdatum:

(1) Syncytiumklon G2A5D7 FERM P-15638: 21. Mai 1996
(2) Syncytiumklon A1G1C6 FERM P-15639: 21. Mai 1996
(3) Syncytiumklon 5C5 FERM P-15640: 21. Mai 1996
(4) Syncytiumklon H12D10D6 FERM P-15641: 21. Mai 1996
(5) Syncytiumklon 89F2 FERM P-16229: 19. Mai 1997

Sequenzprotokoll

Claims

In vitro Messverfahren von menschlichem LECT2 für die Diagnose von Lebererkrankungen, die mit Hepatitis B und C Infektionen assoziiert sind, gekennzeichnet durch das Einschließen der folgenden Verfahrensschritte von a) bis c) und von d) bis f): a) das menschliche LECT2 als ein Standardmaterial wird mit einem befestigten Antikörper reagiert, der durch Kombinieren eines ersten Antikörpers, der spezifisch mit dem menschlichen LECT2 reagiert, mit einem unlöslichen Trägermedium erhalten wurde; b) dann wird das Produkt mit einem markierten Antikörper reagiert, der durch Markieren eines zweiten Antikörpers, der spezifisch mit dem menschlichen LECT2 reagiert, mit einer Markierungssubstanz erhalten wurde; c) und eine Eichlinie wird durch Messen der Menge der Markierungssubstanz in dem Reaktionsprodukt erzeugt; und d) der befestigte Antikörper wird mit einer Probe reagiert; e) dann mit dem markierten Antikörper reagiert; f) und die Menge der Markierungssubstanz in dem Reaktionsprodukt wird gemessen und die Menge des menschlichen LECT2, die in der Probe enthalten ist, wird von der Eichlinie gemessen.
Kit für die in vitro Messung von menschlichem LECT2 für die Diagnose von Lebererkrankungen, die mit Hepatitis B und C Infektionen assoziiert sind, gekennzeichnet durch Umfassen von: einem befestigten Antikörper, der durch Kombinieren eines ersten Antikörpers, der spezifisch mit dem menschlichen LECT2 reagiert, mit einem unlöslichen Trägermedium erhalten wurde; einem markierten Antikörper, der durch Markieren eines zweiten Antikörpers, der spezifisch mit dem menschlichen LECT2 reagiert, mit einer Markierungssubstanz erhalten wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Diagnose bei akuten und Remissionsphasen der Lebererkrankungen die mit Hepatitis B und C Infektionen assoziiert sind.
Kit nach Anspruch 2, umfassend die Diagnose bei akuten und Remissionsphasen der Lebererkrankungen die mit Hepatitis B und C Infektionen assoziiert sind.