DE69233079T2

DE69233079T2 - Immunoassay zum nachweis des mutanten p53 polypeptids in biologischen flüssigkeiten

Info

Publication number: DE69233079T2
Application number: DE69233079T
Authority: DE
Inventors: H. Frederick REYNOLDS; Ron Zeheb; R. John STEPHENSON; M. John SORVILLO
Original assignee: OSI Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1991-02-01
Filing date: 1992-01-31
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2012-02-01
Also published as: WO1992013970A1; EP1006364A1; DE69233079D1; AU1370592A; EP0576476A4; EP0576476A1; EP0576476B1; ATE241807T1

Description

Hintergrund der Endung
In dieser Anmeldung werden verschiedene Veröffentlichungen mittels arabischer Zahlen in Klammern zitiert. Vollständige Referenzen dieser Veröffentlichungen können am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Patentansprüchen gefunden werden. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen beschreiben den Stand der Technik, den diese Erfindung betrifft.
Zelluläre Onkogene sind normale Gene, die während der Evolution erhalten blieben und von denen angenommen wird, dass sie normale funktionelle Rollen in der Zelle besitzen. In ihrem nicht-aktivierten (Wildtyp) Zustand werden solche zellulären Onkogene manchmal als Proto-Onkogene bezeichnet. Proto-Onkogene sind nicht onkogen oder tumorverursachend, bis sie auf irgendeine Weise aktiviert werden. Eine Reihe verschiedener genetischer Mechanismen kann die somatische Mutation von Onkogenen verursachen, die zu den aktivierten Onkogenen führt, die in Tumorzellen gefunden werden. Diese schließen Punktmutationen, Translokationen, Genumordnungen und Genamplifikation ein, von denen alle durch chemische oder physikalische karzinogene Mittel oder durch die Integration eines viralen Genoms neben die Proto-Onkogen-Sequenzen in der DNA des Wirts induziert werden können. Bestimmte Onkogene, wie ras und Wildtyp-p53-Onkogene, codieren mutierte Proteine, wenn sie „aktiviert" sind, während andere, wie myc, erhöhte Mengen an normalem Protein exprimieren können.
Das Wildtyp-p53-Onkogen codiert Wildtyp-p53-Polypeptid, das als ein negativer Regulator der Zellteilung fungiert. Das Wildtyp-p53-Polypeptid wurde intrazellulär in normalen Zellen und Geweben in geringen Mengen gefunden. Mutierte p53-Polypeptide, codiert von aktivierten p53-Onkogenen, liegen intrazellulär in hohen Konzentrationen in Säugertumoren und Tumorzelllinien vor.
Das Wildtyp-p53-Onkogen ist über eine breite Vielzahl von Arten, einschließlich Mensch, Maus, Ratte und Frosch (1) konserviert. cDNA-Sequenzanalyse hat gezeigt, dass es fünf Blöcke sehr hoch konservierter Sequenzen gibt (2, 3). Diese konservierten Reste wurden in Blöcke gruppiert, beginnend bei Aminosäure 117 und endend bei Aminosäure 286 (4). Punktmutationen, die im wesentlichen in diesen fünf Blöcken sehr hoch konservierter Sequenzen und auch in hoch konservierten Bereichen des Wildtyp-p53-Onkogens vorkommen, die außerhalb dieser Blöcke liegen, liefern ein aktiviertes p53-Onkogen (SEQ ID Nr. 2 - SEQ ID Nr. 7). Veränderungen in diesen konservierten Bereichen haben eine signifikante Auswirkung auf die Funktion des mutierten p53-Polypeptids. Veränderungen in diesen Bereichen des Wildtyp-p53-Onkogens erzeugen ein aktiviertes p53-Onkogen, das ein Protein mit einer zur großen Mehrheit der so exprimierten mutierten p53-Polypeptide identischen Konformationsänderung codiert.
Das Produkt des aktivierten p53-Onkogens, d. h. mutiertes p53-Polypeptid, kommt in hohen Mengen in einem hohen Prozentsatz fast aller Klassen menschlicher Tumoren vor, einschließlich Tumoren des Dickdarms, der Lunge und der Brust (2). Biochemische Analysen mutierer p53-Polypeptide zeigen, dass aktivierende Mutationen die Struktur des Polypeptids auf ähnliche Weise beeinflussen. Mutierte p53-Polypeptide besitzen eine viel längere Halbwertszeit, verglichen mit normalem p53-Polypeptid. Darüber hinaus können mutierte p53-Polypeptide mit der Hitzeschockprotein 70-Familie von Proteinen komplexieren, aber nicht mit dem SV40-Large-T-Antigen (5–8). Schließlich konnten in histologischen oder Zellbasierten Assays mutierte und Wildtyp-p53-Polypeptide auf der Basis differentieller Reaktivität mit monoclonalen Antikörpern unterschieden werden. Der Antikörper, der von dem Clon PAb246 sekretiert wird, reagiert mit Wildtyp-p53-Polypeptiden, aber mit keinem der bisher getesteten mutierten p53-Polypeptide, während der Antikörper, der von dem Clon PAb240 sekretiert wird, mit allen bisher getesteten mutierten p53-Polypeptiden reagiert, aber nicht mit einem Wildtyp-p53-Polypeptid (5–21).
Das menschliche, Wildtyp-p53-Polypeptid liegt auf Chromosom 17p. Allelischer Verlust in 17p kommt sehr häufig in menschlichem Brustkrebs (22), Dickdarmkrebs (23), Astrocytomas (24) und Kleinem Zell-Lungencarcinom (25) vor. Die Frage allelischen Verlusts des Wildtyp-p53-Onkogens wurde durch cytogenetische Analyse einer Reihe von Dickdarmkrebsproben mit spezifischen DNA-Sonden angegangen. Die Ergebnisse einer solchen Analyse zeigten an, dass mindestens ein Teil, wenn nicht alles, von einem der beiden Allele des Wildtyp-p53-Onkogens verloren war. Es gab jedoch keine großen Deletionen oder Umordnungen im p53-Onkogen des anderen Allels. In den meisten Fällen zeigte Sequenzanalyse der cDNA aus den Tumoren, dass das p53-Onkogen, das von dem zweiten Allel codiert wird, aktivierende Punkt- oder Missensemutationen in den Bereichen enthielt, die die konservierten Aminosäuresequenzboxen codieren (26).
Mutierte p53-Polypeptide besitzen eine verlängerte Halbwertszeit von etwa 24 Stunden im Vergleich zu Wildtyp-p53-Polypeptiden, die eine Halbwertszeit von etwa 20 Minuten besitzen. Die verlängerte Halbwertszeit mutierter p53-Polypeptide erlaubt eine Akkumulation nachweisbarer Mengen in den Tumoren, die mit einem aktivierten p53-Onkogen assoziiert sind. Im Gegensatz dazu akkumuliert Wildtyp-p53-Polypeptid nicht und kann nicht leicht nachgewiesen werden. Da das Wildtyp-p53-Polypeptid in normalen Zellen aufgrund seiner extrem kurzen Halbwertszeit kaum nachweisbar ist, beweist die Anwesenheit wesentlicher Mengen an p53-Polypeptid, dass das Protein sowohl eine Mutation, die zu einer verlängerten Halbwertszeit führt, als auch den folgenden Phänotyp eines dominanten onkogenen Proteins enthält. Stabilisierung des mutierten p53-Polypeptids kann aus seiner Fähigkeit resultieren, Komplexe mit anderen Molekülen, wie Hitzeschockproteinen, zu bilden. In einer anderen Ausführungsform kann Stabilisierung des mutierten p53-Polypeptids aus Mutationen der Primärsequenz der Polypeptide resultieren, die sie intrinsisch stabiler machen. In einer weiteren Ausführungsform kann Stabilisierung des mutieren p53-Polypeptids aus posttranslationalen Modifikationen, wie Hyperphosphorylierung resultieren (5–8, 27).
Wie vorstehend diskutiert ist das Wildtyp-p53-Onkogen sehr häufig in der Mehrheit menschlicher Krebsarten mutiert. Einer der ersten Hinweise, dass p53-Polypeptidexpression mit einigen Formen menschlichen Krebs verbunden sein könnte, war die Beobachtung, dass etwa 9% der Patienten mit Brustcarcinoma (14 von 155 getesteten Proben) Auto-Antikörper gegen p53-Polypeptide besaßen (28). Das Vorkommen autologer Antikörper gegen p53-Polypeptide in Patienten mit Tumoren deutete an, dass das mit dem Tumor assoziierte p53-Polypeptid ausreichend verändert war, so dass es immunogen wurde. Es ist wichtig festzustellen, dass zu der Zeit dieser Entdeckungen es nicht möglich war zu unterscheiden, ob die so beobachteten Auto-Antikörper gegen Wildtyp- oder mutierte p53-Polypeptide gerichtet waren (28). Tatsächlich war die wirkliche Existenz mutierter p53-Polypeptide zu der Zeit, als solche Auto-Antikörper gegen p53-Polypeptide beobachtet wurden, noch nicht bekannt (28).
Eine frühe Studie fand, dass Tumoren von 24% der Brustkrebspatienten erhöhte Mengen an p53-Polypeptid zeigten (17). Eine zusätzliche Studie zeigte, dass 40% der menschlichen Brustkrebsbiopsien erhöhte Mengen an p53-Polypeptiden zeigten (18). Ähnlich zeigten bis zu 55% an Tumorproben von Dickdarmkrebs eine Überexpression an p53-Polypeptid, basierend auf immunhistochemischen Daten (19). Keiner dieser Tests unterschied zwischen Wildtyp- und mutierten p53-Polypeptiden.
US-A-4798787 offenbart Peptidantikörper und ihre Verwendung zum Nachweis von Onkogen-Produkten. US-A-4798787 lehrt oder legt keine Proben oder Assays für p53 nahe und lehrt oder legt nicht die quantitative Bestimmung eines p21-Expressionsprodukts oder p53-Expressionsprodukts nahe.
Benchimol et al., EMBO J. 1 (1982), 1055–1062, beschreiben einen Radioimmunassay zellulären p53-Proteins in Zelllinien der Maus und des Menschen, aber lehren nicht, dass p53 oder mutiertes p53 in Blutserum, geschweige denn anderen biologischen Flüssigkeiten vorhanden sein könnte und dass auf diese Weise solche Flüssigkeiten als Proben zur Bestimmung verwendet werden könnten, ob ein Individuum einen neoplastischen Zustand aufweist.
Banks et al., Eur. J. Biochem. 159 (1986), 529–534, beschreiben die Isolierung menschlicher p53-spezifischer monoclonater Antikörper und ihre Verwendung in Studien menschlicher p53-Expression. Banks et al. offenbaren jedoch nicht, dass p53 in einer biologischen Flüssigkeit, wie Serum, nachgewiesen werden kann und zeigen keine Korrelation zwischen der Konzentration an p53 in einer biologischen Flüssigkeit und der Wahrscheinlichkeit eines neoplastischen Zustands in einem Individuum auf.
EP-A2 0 214 520 offenbart einen Immunassay zum Nachweis von ras-codierten Proteinen. Dieser Assay basiert auf der Bestimmung der Anwesenheit eines aktivierten Onkogens in einer biologischen Flüssigkeit für ein Individuum. In den Beispielen wird die Bestimmung der Anwesenheit von ras 21 mittels eines geeigneten Antikörpers in Serum von Krebspatienten beschrieben. EP-A2 0 214 520 offenbart nicht einen Assay zur Bestimmung eines neoplastischen Zustands, der auf der Bestimmung der Konzentration von mutiertem p53 in Körperflüssigkeiten basiert.
Im Jahr 1990 wurde eine intensivere Studie mit dem monoclonalen Antikörper PAb240 durchgeführt, der selektiv mit mutierten p53-Polypeptiden reagiert. Diese Studie fand, dass mutierte p53-Polypeptide in 50% Dickdarmkrebs, 30% Brustkrebs und 70% Lungenkrebstumorschnitten nachgewiesen werden konnten (4). Mutierte p53-Polypeptide konnten jedoch nicht in jedem normalen oder prämalignem Gewebe dieser Patienten nachgewiesen werden. Andere Untersuchungen fanden eine Überexpression mutierten p53-Polypeptids in Patienten mit Leukämie oder Lymphom (20, 21, 29). Es wird zunehmend offensichtlich, dass bei geeigneter Vorsicht zum Erhalt der Probe gefunden wird, dass ein hoher Prozentsatz an untersuchten Krebsbiopsien erhöhte Mengen an mutiertem p53-Polypeptid exprimiert.
Vor der Erfindung der Anmelder war Histopathologie die einzige Technik, die die Korrelation zwischen mutierten p53-Polypeptiden und Neoplasie zeigte. Die Literatur beschrieb monoclonale Antikörper, die mutierte p53-Polypeptide spezifisch erkennen und binden, diese Antikörper

(1) wiesen jedoch nicht mutierte p53-Polypeptide in biologischen Flüssigkeiten nach oder
(2) implizierten jedoch nicht, dass der Nachweis mutierten p53-Polypeptids in biologischen Flüssigkeiten die Diagnose neoplastischer Zustände beeinflussen könnte oder neoplastische Zustände überwachen könnte. Darüber hinaus würde, da mutierte p53-Polypeptide im Inneren der Zelle lokalisiert sind, ein Fachmann nicht erwarten, mutierte p53-Polypeptide in im wesentlichen zellfreien biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen. Folglich basiert diese Erfindung auf der Entdeckung, dass normalerweise intrazelluläre, mutierte p53-Polypeptide in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, nachgewiesen werden können, und dass ein solcher Nachweis verwendet werden kann, um neoplastische Bedingungen oder Zustände zu diagnostizieren oder zu überwachen. Entsprechend hätte die Herstellung eines Serumbasierten diagnostischen Markers für menschlichen Krebs bedeutende kommerzielle Anwendungen. Unter Verwendung von Assaykits könnte Blut, das Patienten entnommen wurde, routinemäßig und leicht auf die Konzentration an mutiertem p53-Polypeptid getestet werden. Die Korrelation zwischen der gemessenen mutierten p53-Polypeptidkonzentration und der Anwesenheit einer neoplastischen Krankheit im Patienten liefert ein Mittel zum frühen Nachweis von Krebs. Zusätzlich kann aufgrund der Einfachheit der Durchführung der hier beschriebenen Erfindung ein viel größerer Teil der Bevölkerung getestet werden. Darüber hinaus sollte die Erfindung eine weite Anwendung in grundlegenden und klinischen Forschungsanwendungen haben.

Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung, wie in den Patentansprüchen 1 bis 25 beansprucht, liefert ein Verfahren zur Diagnose eines neoplastischen Zustands in einem Individuum.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Eine Standardkurve, hergestellt unter Verwendung von gereinigtem menschlichem rekombinantem mutiertem p53-Polypeptid. Der Assay weist den gereinigten Standard mit einer Sensivität von etwa 30 pg/ml nach.
2: Liniengraph einer Standardkurve, hergestellt unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem mutiertem p53-Polypeptid (Hup53HIS273), das mittels des T7-Expressionssystems exprimiert wurde.
3:

A. Ein Foto eines Gels. E. coli Stamm BL21(DE3)LysS, transformiert mit mutierter menschlicher p53-cDNA im T7-Expressionsplasmid pT7-7, wurde für 3 h in Anwesenheit (I) oder Abwesenheit (U) von 0.4 mM Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid (IPTG) inkubiert. Gewaschene Bakterien wurden lysiert, verdünnt mit Probenverdünnungspuffer und auf mutiertes p53 im ELISA-Assay analysiert.
B. Ein Liniengraph von mutiertem p53 aus Bakterienlysaten. 2 μl lysierter bakterieller Pellets wurden auf 10% Acrylamidgels aufgelöst, auf Nitrocellulose elektrogeblottet und mit polyclonalen Kaninchen-anti-mutiertem p53-Antikörpern inkubiert.

4: Fotos von drei Gelen. Extrakte von Säugerzellen (Spuren II–IV, 1 mg Protein/Spur), gereinigtes p53 (Spuren V, 5 μg/Spur) und Molekulargewichtsstandards (Spuren 1) wurden durch Elektrophorese auf einem 10% Acrylamidgel aufgetrennt. Das Gel wurde in drei identische Abschnitte geschnitten und entweder mit Coomassie Brilliant Blue G-250^® gefärbt (A) oder auf Nitrocellulose geblottet und mit entweder polyclonalen Kaninchen-anti-mutiertes p53 (HIS175)-Antikörpern (B) oder einem Kontroll-Kaninchen-polyclonalem Antikörper irgendeiner Spezifität inkubiert (C). Spuren II, K-NRK Zelllysate; Spuren III, HL60 Zelllysate, Spuren IV, A431 Zelllysate.
5: Ein Säulendiagramm, das das Wiederfinden von zugegebenem p53 in Serum und Urin zeigt. Gereinigtes rekombinantes mutiertes p53 wurde zu unverdünntem normalem Serum und verdünntem (1 : 5 mit Probenverdünnungspuffer) normalem menschlichem Serum in einer Endkonzentration von 4 ng/ml zugegeben. Gereinigtes p53 wurde zu verdünntem menschlichem Urin in einer Endkonzentration von 2 ng/ml zugegeben. Die zugegebenen p53-Proben wurden im p53-ELISA-Assay analysiert. Die Menge an nachgewiesenem mutiertem p53 wird als Prozentsatz der tatsächlich der Probe zugegebenen Menge ausgedrückt.
6: Ein Säulendiagramm, das zeigt, dass ein monoclonaler Antikörper spezifisch für p53-Polypeptid (p53(Ab-2)) spezifisch die Reaktivität einer mutiertes p53 enthaltenden Serumprobe von menschlichem Krebs hemmen wird, während ein Antikörper gegen ein unverwandtes Protein (trpE(Ab-1)) keine Wirkung besitzt. Kein Antikörper besitzt irgendeine Wirkung auf eine normale Serumprobe, die kein nachweisbares mutiertes p53 enthält. Keine Reaktivität wird als eine Säule mit einer zu 0.05 ng/ml gleichen Höhe dargestellt, was die Sensitivitätsgrenze dieses Assays ist.
7: Ein Säulendiagramm, das zeigt, dass Immunpräzipitation mit einem monoclonalen Antikörper spezifisch für p53-Polypeptid (p53(Ab-2)) verwendet werden kann, um jedes mutierte p53 aus einer Serumprobe (Colon Ca), enthaltend mutiertes p53, wirksam zu entfernen. Unter den gleichen Bedingungen entfernt ein Antikörper gegen ein unverwandtes Protein (trpE(Ab-1)) das mutierte p53-Polypeptid aus der Probe nicht. Normales Serum, das kein nachweisbares mutiertes p53-Polypeptid enthält, ist von jeder Behandlung unbeeinflusst. Keine Reaktivität ist als eine Säule mit einer zu 0.05 ng/ml gleichen Höhe dargestellt, was die Sensitivitätsgrenze dieses Assays ist.
8:

A. Ein Liniengraph, der mutiertes p53 aus verdünnten Lysaten von Säugerzellen zeigt. Ganze Zellextrakte werden aus mehreren Säugerzelllinien hergestellt. Die Zellextrakte wurden im p53-ELISA-Assay in mehreren verschiedenen Verdünnungen analysiert.
B. Ein Säulendiagramm, das mutiertes p53 in Lysaten von Säugerzellen zeigt. Die Menge an mutiertem p53 in jeder der verschiedenen Zelllinien wurde aus Proben berechnet, die 1 : 5 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt worden waren, und relativ zur Menge des gesamten extrahierten Proteins ausgedrückt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung, wie in den Patentansprüchen 1 bis 25 beansprucht, liefert ein Verfahren zur Diagnose eines neoplastischen Zustands in einem Individuum, zum Beispiel einem Menschen. In diesem Verfahren zeigt die Anwesenheit des mutierten p53-Polypeptids in der Probe an, dass das Individuum den neoplastischen Zustand aufweist.
Wie in dieser Anmeldung verwendet, meint ein „neoplastischer Zustand" einen Zustand, charakterisiert durch Tumorbildung und Tumorwachstum. Beispiele neoplastischer Zustände, die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung diagnostiziert werden können, schließen die folgenden Formen von menschlichem Krebs ein: Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Lungenkrebs, Lymphom, Hepatom und Leukämie, Astrocytome und Kleine Zell-Lungencarcinome.
Zusätzlich, wie hier verwendet, ist eine biologische Flüssigkeit irgendeine Körperflüssigkeit oder irgendeine Flüssigkeit, die von einer biologischen Probe stammt. Beispiele von Körperflüssigkeiten schließen Urin, Blut, Sputum, amniotische Flüssigkeiten, Speichel, irgendeine schleimartige Körpersekretion oder cerebrospinale Flüssigkeiten ein. Beispiele von Flüssigkeiten, die von biologischen Proben stammen, schließen Serum, Plasma, Zellextrakte, Lungenspülung oder Aszitesflüssigkeit ein. Serum ist bevorzugt.
Zellextrakte können aus Tumorzellen oder -geweben, normalen Geweben oder Zelllinien, die kontinuierlich in Kultur wachsen, stammen. Es wäre dem Fachmann klar, dass solche Zellen von jedem Säuger stammen können, wie Ratten, Maulwürfe, Spitzmäuse, Affen, Fledermäuse, Hasen, Kaninchen, Hunde, Katzen, Wale, Delphine, Elefanten, Pferde, Kühe, Hirsche und Mensch.
Wie in dieser Anmeldung verwendet, meint „Nachweis der Anwesenheit" den Nachweis auf irgendeine Art. Weiter meint, wie hier verwendet, „mutiertes p53-Polypeptid" jedes Polypeptid, das von einem aktivierten p53-Onkogen codiert wird. Wie hier verwendet, meint „Onkogen" ein Gen, das das Potential besitzt, Krebs zu verursachen. Zusätzlich meint der Begriff „aktiviert", im Fall eines p53-Onkogens, einen Zustand, der den Ausbruch von Krebs, Neoplasie oder allgemeiner Onkogenese auslöst. Genauer wird der Zustand durch eine Mutation, wie eine Punktmutation, in einem p53-Onkogen verursacht.
In einem Beispiel dieser Erfindung umfasst der Nachweis in Schritt (b): (i) Inkontaktbringen der Probe aus Schritt (a) mit einem Protein, das einen Komplex mit dem mutiertem p53-Polypeptid unter Bedingungen bilden kann, die die Komplexbildung erlauben; und (ii) Bestimmen, ob irgendein Komplex so gebildet wird, wobei die Anwesenheit des Komplexes anzeigt, dass das Individuum den neoplastischen Zustand aufweist.
In Übereinstimmung mit der Durchführung der Endung kann das Protein aus Schritt (i) ein Antikörper sein. In einem Beispiel der Erfindung ist der Antikörper ein polyclonaler Antikörper. In einem anderen Beispiel ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper.
Wie hier verwendet, meint der Begriff „Antikörper" irgendein immunologisch reaktives Molekül (d. h. ein Protein, Polypeptid oder Fragment davon), das natürlicherweise vorkommt oder mittels gentechnologischer Verfahren oder anders hergestellt wird. Darüber hinaus kann der Antikörper einen Isotyp besitzen, ausgewählt aus einer Gruppe, umfassend IgG-, IgA-, IgD-, IgE- oder IgM-Isotyp oder irgendeine Kombination davon. Der Antikörper kann durch Fusion von Fragmenten ausgewählter Isotypen hergestellt, in einem rekombinanten System exprimiert oder durch Hybridomtechnologie erzeugt sein.
In einem anderen Beispiel des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist das Protein ein Hitzeschockprotein. Das Hitzeschockprotein kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus HSC 70-72 und HSP 70-72.
In einem Beispiel der vorstehend beschriebenen Erfindung bildet das Protein spezifisch einen Komplex mit dem mutierten p53-Polypeptid. Wie hier verwendet, meint der Ausdruck „spezifisch formt einen Komplex", dass das vorstehend erwähnte Protein nur mutiertes p53-Polypeptid erkennt und bindet. Ein Beispiel des Proteins ist ein Antikörper, z. B. der PAb240 monoclonale Antikörper.
Weiter kann das Protein an einen festen Träger gebunden werden. Beispiele eines festen Trägers schließen eine Nylonmembran, eine Nitrocellulosemembran, eine Celluloseacetatmembran, eine Epoxy-aktivierte synthetische Copolymermembran, Agarose, Sepharose^®, ein Plastik- oder Glasröhrchen oder irgendeinen Teil davon, eine Plastik- oder Glasplatte oder -kügelchen oder irgendeinen Teil davon ein.
In einem anderen Beispiel des vorstehend erwähnten Verfahrens umfasst die Bestimmung, ob irgendein Komplex gebildet ist, in Schritt (ii): a) das Inkontaktbringen der Probe aus Schritt (i) mit einem zweiten Protein, das einen zweiten Komplex mit jedem in Schritt (i) gebildeten Komplex unter Bedingungen bilden kann, die die Bildung des zweiten Komplexes erlauben; und b) Bestimmung der Anwesenheit irgendeines so gebildeten Komplexes, wobei die Anwesenheit irgendeines solchen zweiten Komplexes anzeigt, dass das Individuum den neoplastischen Zustand aufweist.
In dem vorstehend erwähnten Verfahren kann das zweite Protein ein Hitzeschockprotein sein. Das Hitzeschockprotein kann aus der Gruppe, bestehend aus HSC 70-72 und HSP 70-72, ausgewählt sein.
Gegebenenfalls kann das zweite Protein ein Antikörper sein, wie ein polyclonaler Antikörper oder ein monoclonaler Antikörper. In einem Beispiel bildet das zweite Protein spezifisch einen Komplex mit dem mutierten p53-Polypeptid.
Gegebenenfalls kann das Protein an einen festen Träger gebunden sein. Weiter kann das Protein mit einem nachweisbaren Marker markiert sein.
Auch kann das zweite Protein mit einem nachweisbaren Marker markiert sein. Beispiele nachweisbarer Marker schließen Enzyme, Biotine, Fluorophore, Chromophore, Schwermetalle, paramagnetische Isotope oder Radioisotope ein.
Die vorliegende Endung liefert ein Verfahren zur Diagnose eines neoplastischen Zustands in einem Individuum, umfassend das quantitative Bestimmen der Konzentration an mutiertem p53-Polypeptid, codiert von einem aktivierten p53-Onkogen, in einer Probe einer im wesentlichen zellfreien biologischen Flüssigkeit des Individuums, wobei eine erhöhte Konzentration an mutiertem p53-Polypeptid in der Probe anzeigt, dass das Individuum einen neoplastischen Zustand aufweist. Bevorzugt ist eine erhöhte Konzentration eine, die gleich oder größer als zwei Standardabweichungen über der Konzentration liegt, die in Proben normaler Individuuen gefunden wird.
In einem Beispiel des vorstehend beschriebenen Verfahrens umfasst das quantitative Bestimmen in Schritt (b): (i) das Inkontaktbringen der Probe aus Schritt (a) mit einem Protein, das einen Komplex mit dem mutiertem p53-Polypeptid unter Bedingungen bilden kann, die die Bildung des Komplexes erlauben; und (ii) das Bestimmen der Menge jedes so gebildeten Komplexes, wobei die Anwesenheit des Komplexes anzeigt, dass das Individuum den neoplastischen Zustand aufweist.
In einem Beispiel des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist das Protein ein Hitzeschockprotein. Das Hitzeschockprotein kann aus der Gruppe, bestehend aus HSC 70-72 und HSP 70-72, ausgewählt sein.
In Übereinstimmung mit der Durchführung dieses Verfahrens kann das Protein ein Antikörper, wie ein polyclonaler Antikörper oder ein monoclonaler Antikörper, sein. Weiter kann das Protein an einen festen Träger gebunden sein. Zusätzlich kann das Protein spezifisch einen Komplex mit den mutierten p53-Polypeptiden bilden. Ein Beispiel eines solchen Proteins ist der PAb240 monoclonale Antikörper.
Weiter umfasst in einer Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens das quantitative Bestimmen, ob irgendein Komplex in Schritt (ii) gebildet wird: a) das Inkontaktbringen der Probe aus Schritt (i) mit einem zweiten Protein, das einen zweiten Komplex mit jedem in Schritt (i) gebildeten Komplex unter Bedingungen bilden kann, die die Bildung des zweiten Komplexes erlauben; und b) das Bestimmung der Menge jedes so gebildeten zweiten Komplexes und Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge in einer Probe eines normalen Individuums, wobei die Anwesenheit einer wesentlich unterschiedlichen Menge anzeigt, dass das Individuum einen neoplastischen Zustand aufweist.
In einem Beispiel des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist das zweite Protein ein Hitzeschockprotein. Das Hitzeschockprotein kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus HSC 70-72 und HSP 70-72.
In Übereinstimmung mit der Durchführung dieses Verfahrens kann das zweite Protein ein Antikörper sein, z. B. ein polyclonaler oder monoclonaler Antikörper. Gegebenenfalls kann das Protein spezifisch einen Komplex mit dem mutiertem p53-Polypeptid bilden.
Weiter kann das zweite Protein an einen festen Träger gebunden sein. In Übereinstimmung mit der Durchführung dieses Verfahrens kann das zweite Protein mit einem nachweisbaren Marker markiert sein.
Der nachweisbare Marker kann ein Enzym, Biotin, ein Fluorophor, ein Chromophor, ein Schwermetall, ein paramagnetisches Isotop oder ein Radioisotop sein.
Diese Endung liefert weiter ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Konzentration an p53 in einer biologischen Flüssigkeitsprobe, das umfasst (a) das Inkontaktbringen eines festen Trägers mit einem Überschuss an erstem Antikörper unter Bedingungen, die die Anheftung des Antikörpers an die Oberfläche des festen Trägers erlauben; (b) das Inkontaktbringen des resultierenden festen Trägers, an den der erste Antikörper gebunden ist, mit einer biologischen Flüssigkeitsprobe unter Bedingungen, so dass jedes p53-Polypeptid in der biologischen Flüssigkeit an den Antikörper bindet und einen Komplex damit bildet; (c) das Inkontaktbringen des in Schritt (b) gebildeten Komplexes mit einer vorbestimmten Menge eines zweiten Antikörpers gegen ein Epitop von p53, das sich von dem Epitop unterscheidet, gegen das der erste Antikörper von Schritt (a) gerichtet ist, um einen Komplex zu bilden, der p53, den ersten Antikörper und den zweiten Antikörper einschließt; (d) das quantitative Bestimmen der Menge des in Schritt (c) gebildeten Komplexes; und (e) dadurch das Bestimmen der Konzentration an p53 in der biologischen Flüssigkeitsprobe.
Auch ist in einem Beispiel des Verfahrens der an den festen Träger gebundene erste Antikörper ein monoclonaler Antikörper und der zweite Antikörper ist ein polyclonaler Antikörper. Zusätzlich ist in einem anderen Beispiel der Erfindung der an den festen Träger gebundene erste Antikörper ein polyclonaler Antikörper und der zweite Antikörper ist ein monoclonaler Antikörper. Gegebenenfalls ist der an den festen Träger gebundene erste Antikörper ein polyclonaler Antikörper und der zweite Antikörper ist ein polyclonaler Antikörper. In einer anderen Ausführungsform ist der an den festen Träger gebundene erste Antikörper ein monoclonaler Antikörper und der zweite Antikörper ist ein monoclonaler Antikörper.
In Übereinstimmung mit der Durchführung dieses Verfahrens kann der erste Antikörper mit einem nachweisbaren Marker markiert sein. Gegebenenfalls kann der zweite Antikörper mit einem nachweisbaren Marker markiert sein, getrennt oder zusätzlich zum ersten Antikörper. Beispiele geeigneter nachweisbarer Marker schließen ein Enzym, Biotin, ein Fluorophor, ein Chromophor, ein Schwermetall, ein paramagnetisches Isotop oder ein Radioisotop ein.
Diese Erindung liefert ein Verfahren zur Überwachung des Verlaufs eines neoplastischen Zustands in einem Individuum, das die quantitative Bestimmung in einer ersten Probe einer biologischen Flüssigkeit aus dem Individuum der Anwesenheit eines mutierten p53-Polypeptids gemäß irgendeines der vorstehend beschriebenen Verfahren und den Vergleich der so bestimmten Menge mit der in folgenden Proben des Individuums vorhandenen Menge umfasst, wobei die Proben zu verschiedenen Zeitpunkten genommen wurden, d. h. eine Probe wird nach einem ausreichenden Zeitraum nach der anderen Probe genommen, um Tumorwachstum oder -regression zu erlauben. Ein Unterschied in den bestimmten Mengen zeigt dabei den Verlauf des neoplastischen Zustands, d. h. Wachstum oder Regression. Im Zusammenhang dieser Endung schließt ein neoplastischer Zustand Carcinoma der Lunge, der Blase, der Brust, des Uterus, der Prostata, des Dickdarms, Adenocarcinoma der Lunge, Neuroblastoma, Melanoma, Rhabdomyosarcoma, Lyphoma oder Leukämien ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
In Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck der Patentierung wurden die nachstehend aufgelisteten Hybridomas bei der American Type Culture Collection („ATCC"), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A. hinterlegt:

1. ein Hybridom mit der Bezeichnung PAb 1801, hinterlegt unter der ATCC Hinterlegungsnr. HB 10642;
2. ein Hybridom mit der Bezeichnung PAb 421, hinterlegt unter der ATCC Hinterlegungsnr. HB 10643;
3. ein Hybridom mit der Bezeichung PAb 240, hinterlegt unter der ATCC Hinterlegungsnr. HB 10614.

Experimentelle Details Material und Methoden
Probenbehandlungsprotokolle: Serum- oder Plasmaproben, gesammelt unter Verwendung von Heparin, EDTA oder Oxalat, können gefroren bei –70°C vor der Analyse aufbewahrt werden, oder in einer anderen Ausführungsform können die Proben sofort getestet werden. Serum- und/oder Plasmaproben können in reiner Form (d. h. unverdünnt) analysiert werden, oder in einer anderen Ausführungsform können die Proben mit Probenverdünnungspuffer verdünnt werden (PBS, pH 7.4, enthaltend 50 mM NaCl, 0.1% BSA, 0.5% Tween –20°, 0.02% Thimerosal und 1% (v/v) normales Mauserum). Das Verdünnungsverhältnis ist von dem mutierten p53-Polypeptidgehalt der Probe abhängig und muss empirisch bestimmt werden. Die Proben werden in Duplikaten, 100 μl pro Vertiefung, analysiert. In einigen Fällen können autologe Antikörper gegen mutiertes p53-Polypeptid in den Patientenserum- und/oder – plasmaproben vorhanden sein. Die Anwesenheit dieser Antikörper kann in einigen Fällen mit der Sensitivität, mit der das mutierte p53-Polypeptid in diesen Proben nachgewiesen werden kann, interferieren und/oder sie verringern. Unter diesen Bedingungen sollten die folgenden zusätzlichen Vorgehensweisen angewendet werden. Zu 500 Microliter an Probe wird ein gleiches Volumen an Ansäuerungspuffer (200 mM Glycin-HCl, pH 2.0) zugegeben und für 5 Minuten auf Eis (4°C) inkubiert. Ein zehntel Volumen (d. h. 100 Microliter zugegeben zu 1 ml Probe) an Neutralisationspuffer (2 M Tris-HCl, pH 8) wird zu der angesäuerten Probe zugegeben und sofort wird mit dem Assay weitergemacht. Die angesäuerte und neutralisierte Probe kann direkt oder nach weiterer Verdünnung mit Probenverdünnungspuffer analysiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann die angesäuerte Probe auf eine Säule von Sephadex G-100 superfein^® (Pharmacia, Katalognr. 17-0061-01) gegeben werden. Das Säuleneluat wird mittels eines Spektrophotometers, eingestellt auf 280 nm, überwacht. Der erste Peak von 280 nm-absorbierendem Material (enthaltend Proteine eines Molekulargewichts größer als 100 kDa, einschließlich aller autologer Antikörper) wird verworfen. Die verbleibenden Peaks, die nach dem ersten eluieren, werden vereinigt und auf mutiertes p53-Polypeptid analysiert. Die eluierte, vereinigte Probe kann gefroren bei –20°C aufbewahrt werden und/oder durch Lyophilisierung vor der Analyse auf mutierte p53-Polypeptide konzentriert werden.
Urin: Frisch gesammelter Urin wird durch die Zugabe von 1/10 Volumen an Urinpuffer (1 M Tris-HCl, pH 8.0, enthaltend 0.2% Thimerosal) pH-gepuffert. Gepufferte Proben können gefroren aufbewahrt oder sofort, wie vorstehend beschrieben, analysiert werden.
Zellextrakte: Um die Konzentration an mutiertem p53 in Zellen zu messen muss zuerst ein Flüssigextrakt hergestellt werden. Zahlreiche Extraktionsprotokolle können verwendet werden. Das folgende bereitgestellte Protokoll ist ein Beispiel eines Extraktionsverfahrens ganzer Zellen und sollte nicht als die absolute Methode der Wahl betrachtet werden. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert (1000 Xg, für 10 min bei 4°C), dann 3mal mit 20 bis 30 Volumina des Zellpellets an eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen werden pelletiert und die PBS-Waschlösung verworfen. 5 Volumina des Zellpellets an eiskaltem Schwellungspuffer (20 mM Tris/HCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 8) werden zugegeben und auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen werden alle 10 Minuten sanft resuspendiert. Nicht-ionisches Detergens (z. B. Tween-20^®) wird in einer Endkonzentration von 1% (v/v) zugegeben und die Inkubation auf Eis wird für zusätzliche 30 Minuten fortgesetzt. Die Zellen werden alle 10 Minuten resuspendiert. NaCl wird in einer Endkonzentration von 0.5 M zugegeben. Es wird 15 Minuten auf Eis inkubiert. Alle 5 Minuten wird resuspendiert. Es wird bei etwa 70,000 Xg für 30 Minuten bei 4°C (z. B. 70.1 Ti bei 30,000 (UpM) pelletiert. Der Membran-freie Überstand wird vorsichtig gesammelt. Der Überstand (Gesamtzellextrakt) kann sofort auf die Konzentration an mutiertem p53 analysiert werden oder gefroren bei – 70°C zur späteren Analyse aufbewahrt werden.
Antikörper- und Reagensherstellung. Die Antikörper können an einen festen Träger gebunden werden und verwendet werden, um mutiertes p53-Polypeptid zu fangen. Affinitätsgereinigte polyclonale Antikörper gegen mutiertes p53 Polypeptid können als das Reporterreagens verwendet werden.
Platten, beschichtet mit monoclonalem Antikörper. Gereinigter monoclonaler Antikörper des Clons PAb421 oder alternativ des Clons PAb 1801 oder des Clons PAb240 wird 5 μg/ml in 100 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9, verdünnt. 100 μl der verdünnten Antikörperlösung wird zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Immulon 1^®) zugegeben. Die Platte wird dann mit Plastikfolie bedeckt und für 16 Stunden bei 4°C inkubieren lassen oder in einer anderen Ausführungsform für 3 h bei 37°C. Die Vertiefungen werden entleert und einmal mit 200 μl Waschpuffer (PBS, enthaltend 0.05% Tween-20^® und 0.02% Thimerosal) gewaschen. Nach dem Waschen werden die Vertiefungen entleert und für 4 h bei Raumtemperatur mit 200 μl Blockierungspuffer (PBS, enthaltend 1% BSA, pH 7.4) blockiert. Nach Blockieren werden die Vertiefungen entleert und 3mal mit 200 μl Waschpuffer pro Vertiefung pro Waschvorgang gewaschen. Beschichtete und blockierte Vertiefungen werden bei 4°C mit 200 μl PBS, enthaltend 0.02% Thimerosal, pro Vertiefung aufbewahrt. In einer anderen Ausführungsform werden die Vertiefungen für 4 bis 16 h bei 4°C lyophilisiert, dann in versiegelten Behältern unter Vakuum aufbewahrt.
PAb421 ist ein IgG_2a, der Säuger-Wildtyp- und mutierte p53-Polypeptide nahe der carboxyterminalen Domäne bindet (30). PAb1801 ist ein IgG₁, das in der aminoterminalen Domäne von menschlichem Wildtyp- und mutiertem p53-Polypeptid bindet. PAb240 ist ein IgG₁-Isotop, das nur die mutierte Form von nativem (d. h. nicht-denaturiertem) menschlichem p53-Polypeptid bindet. Dieser Clon jedoch wird Säuger-Wildtyp-p53-Polypeptid binden, wenn das Protein denaturiert worden ist (wie in einem Western Blot). Dieser Antikörper erkennt ein Konformationssensitives Epitop nahe der Mitte des mutierten p53-Polypeptids (Reste 156–214 von denaturiertem mutierten p53-Polypeptid der Maus).
Platten, beschichtet mit polyclonalem Antikörper. In einer möglichen Vorgehensweise können Affinitäts-gereinigte polyclonale Antikörper gegen mutiertes oder Wildtyp-p53-Polypeptid auf Platten gemäß eines Verfahrens beschichtet werden, das in jeder Hinsicht mit dem vorstehend für Platten, beschichtet mit monoclonalem Antikörper, beschriebenen identisch ist.
Gereinigtes, menschliches rekombinantes mutiertes p53-Polypeptid. Eine Standardkurve für mutiertes p53-Polypeptid (siehe 1) wird unter Verwendung von rekombinantem menschlichem p53-Polypeptid hergestellt, derart mutiert, einen Histidinrest an Position 273 (Hup53HIS2273) zu enthalten (30). Zur Durchführung dieser Erfindung wäre jede Reihe von Mutationen, die in hoch konservierten Sequenzen des menschlichen p53-Onkogens vorkommen und in der Bildung von mutiertem Protein mit den vorstehend offenbarten Charakteristika resultieren, funktionell äquivalent. Die Clonierung und Expression mutierten p53-Polypeptids folgt etablierten Techniken der Molekularbiologie. Eine cDNA-Genbank wird hergestellt (z. B. in pUC8- oder pUC9-Plasmiden) mittels mRNA, extrahiert aus A431-Zellen (exprimieren Hup53HIS273), wie von Harlow et al. (30) beschrieben (SEQ ID Nr. 1). Die cDNA-Genbank, so hergestellt, wird auf die Anwesenheit von p53-Onkogensequenzen durch Hybridisierung mit einer komplementären cDNA-Sonde, wie beschrieben, abgesucht (30). Kolonien, die aktivierte p53-Onkogensequenzen tragen, werden isoliert, und die Plasmide werden, wie beschrieben, gereinigt (31) und sequenziert (30, 32). Die das mutierte p53-Polypeptid codierende Sequenz wird dann in einen Plasmidexpressionsvektor, wie pUR291, subcloniert (33). Dieses Konstrukt, codierend ein β-Galactosidase-mutiertes p53-Polypeptidfusionsprotein, wird in E. coli (Stamm LE392)-Kulturen für 16–18 h bei 37°C in Anwesenheit von 100 μg/ml Isopropyl-β-thiogalactosid wachsen gelassen. Die Zellen werden gesammelt, mit PBS gewaschen und lysiert (31). Das mutierte p53-Polypeptidfusionsprotein wird aus dem Zelllysat durch Immunaffinitätschromatographie mittels einer PAb421-Agarosesäule gereinigt.
In einer anderen Ausführungsform kann eine PAb240-Agarosesäule verwendet werden, um das mutierte p53-Polypeptidfusionsprotein zu reinigen. Das gereinigte rekombinante Protein ist in einer Zwischenkonzentration von 8 μg/ml in PBS, enthaltend 0.1% BSA, verdünnt. Diese ist weiter in Probenverdünnungspuffer (PBS, enthaltend 50 mM NaCl, 0.5% Tween-20^®, 0.1% BSA und 0.02% Thimerosal, pH 7.4) verdünnt, um Lösungen herzustellen, die mutiertes p53-Polypeptid in Konzentrationen von 0, 0.125, 0.500, 1.0, 2.0, 4.0 und 8.0 ng/ml oder jeder anderen, für den dynamischen Rahmen des Assays geeignete Konzentration enthalten.
Anschließend wurde eine zweite Standardkurve (2) unter Verwendung von rekombinantem menschlichem p53-Polypeptid (Hup53HIS273), exprimiert unter Verwendung eines anderen bakteriellen Expressionssystems, aufgestellt. Genau wurde E. coli Stamm BL21 (DE3)LysS mit mutierter menschlicher p53-cDNA, cloniert in das T7-Expressionsplasmid pT7-7, transformiert. Die transformierten Bakterien wurden für 3 Stunden in Anwesenheit von 0.4 mM IPTG inkubiert. Die gewaschenen Bakterien wurden lysiert und gereinigt, wie vorstehend beschrieben, verdünnt mit Probenverdünnungspuffer und verwendet, um eine Standardkurve für mutiertes p53 im ELISA-Assay herzustellen (3 und Tabelle 1).
TABELLE 1: Inter- und Intra-Assay-Genauigkeit, bestimmt bei 3 Punkten entlang der vorstehend gezeigten Standardkurve.
I. Inter-Assay-Genauigkeit
Proben, enthaltend drei verschiedene Konzentrationen an mutiertem p53, verdünnt in Probenverdünnungspuffer, wurden in 8 getrennten Assays analysiert.
Tabelle 1 (Fortsetzung): Inter- und Intra-Assay-Genauigkeit, bestimmt bei 3 Punkten entlang der vorstehend gezeigten Standardkurve.
II. Intra-Assay-Genauigkeit
Proben, enthaltend drei verschiedene Konzentrationen an mutiertem p53, verdünnt in Probenverdünnungspuffer, wurden jede 8mal während des Verlaufs eines einzelnen Assays analysiert.
Polyclonale Antikörper des Kaninchens gegen mutiertes p53-Polypeptid. Weibliche Weiße
Neuseelandkaninchen wurden mit gereinigtem rekombinantem mutiertem p53-Polypeptid nach einem Standardprotokoll immunisiert. Genau wird das mutierte p53-Polypeptid (0.1 mg) mit RIBI^TM-Adjuvans emulgiert und den Perilymphknoten verabreicht. Drei Wochen später wurde den Kaninchen ein intramuskulärer Boost (0.05 mg Antigen/Tier) gegeben. Die Boosts wurden in 21 Tageintervallen fortgesetzt. Serum wurde gesammelt, und der Antikörpertiter mittels ELISA 10 Tage nach jedem Boost bestimmt. Wenn einmal ein hoher Titer erreicht ist, wird das Serum gesammelt, und der gereinigte Antikörper, wie nachstehend beschrieben, gereinigt.
Antiseren, gesammelt wie vorstehend beschrieben, werden mittels ELISA titriert. Gereinigtes rekombinantes mutiertes p53-Polypeptid wird auf Mikrotitervertiefungen absorbiert (1 μg/ml in 0.1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9.0; 50 μl/Vertiefung) für 16 bis 20 Stunden bei 4°C. Die Antigenlösung wird verworfen, und nicht besetzte Proteinbindungsstellen werden mittels 200 μl PBS, enthaltend 1% BSA (pH 7.3, für 2 h bei Raumtemperatur) blockiert. Duplikat-Vertiefungen werden für 3 Stunden bei 37°C mit Antiseren, verdünnt in Puffer (serielle 5-fache Verdünnungen, beginnend bei 1 : 500 und endend bei 1 : 312, 500; plus eine Kontrolle ohne Antiserum) inkubiert. Gebundener Antikörper wird durch Inkubation mit Peroxidasekonjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (2–3 h bei 37°C) nachgewiesen, gefolgt von der Zugabe eines Peroxidase-Substrats. Die Absorption wird mittels eines Dualstrahls, Lesegerät für Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Bio-Tek® Instruments, Modell EL320) gemessen. Der Antiserumtiter wird als die Verdünnung definiert, die eine Absorption ergibt, die zweimal die Hintergrundabsorption ist.
Antikörper aus Kaninchen, die einen hohen Serumtiter ergeben, werden, wie nachstehend beschrieben, gereinigt und weiter auf ihre Eignung als ein Reporterreagens in einem Zwei-Seiten-Sandwich-ELISA-Assay für mutiertes p53-Polypeptid beurteilt.
Antikörperreinigung. Antikörper (Ig), der mit menschlichem mutiertem p53-Polypeptid reagiert, wird aus hyperimmunen Kaninchenseren mittels Immunaffinitätschromatographie gereinigt. Gereinigtes rekombinantes mutiertes p53-Polypeptid wird an CNBR-aktivierte Sepharose 4B^® (Pharmacia) gekoppelt. Rohantiserum wird durch Zentrifugation bei 10,000 × g für 30 min geklärt, und Rohantikörper wird erhalten durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat. Die Ig-angereicherte Präparation wird auf mutierter p53-Polypeptid-Sepharose^® aufgegeben, und der gebundene Antikörper mittels 100 mM Glycin-HCl, pH 2.5 eluiert und mit 2.0 M Tris-HCl, pH 8.0 neutralisiert. In einem zweiten Beispiel wird IgG, das mit menschlichem mutiertem p53-Polypeptid reagiert, aus hyperimmunen Kaninchenseren durch Affinitätschromatographie mit Protein-A-Sepharose^® gemäß eines zu dem vorstehend beschriebenen identischen Protokolls gereinigt.
Polyclonaler Antikörper erkennt vielfache Epitope, die sowohl mutierten und Wildtyp-p53-Polypeptiden gemeinsam sind. In einem Fall wird polyclonaler Antikörper gegen ein p53-Polypeptid mit einem monoclonalen Bindungs-Antikörper kombiniert, der sowohl Wildtypals auch mutiertes p53-Polypeptid (d. h. Clon PAb421) bindet. In einem anderen Fall wird polyclonaler Antikörper gegen ein p53-Polypeptid mit einem monoclonalen Bindungs-Antikörper kombiniert, der mutiertes p53-Polypeptid (d. h. Clon PAb240) spezifisch erkennt und bindet. In einem anderen Fall konnte der polyclonale Antikörper spezifisch für mutierte menschliche p53-Polypeptide durch Absorption gegen gereinigtes Wildtyp menschliches p53-Polypeptid, das an einen festen Träger, wie CNBr-Sepharose^® oder Polystyrolröhrchen gebunden wurde, gemacht werden.
Natives, Wildtyp-p53-Polypeptid kann für die Adsorption von polyclonalen Antikörpern des Kaninchens verwendet werden, um ein mutiertes p53-Polypeptid-spezifisches Reagens zu ergeben und als eine negative Kontrolle für den Assay.
Monoclonale Antikörper der Maus gegen p53-Polypeptide. p53-β-Galactosidasefusionsproteine (siehe vorstehend) werden mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Die Bande, die dem Fusionsprotein entspricht, wird aus dem Gel ausgeschnitten und in einer Lösung von 1% SDS, 0.2 M Tris/Acetat pH 8.0, 0.1% DTT gewaschen. Das Protein wird dann elektroeluiert, gegen 20 mM Ammoniumbicarbonat, 0.02% SDS dialysiert und in BALB/c Mäuse injiziert. Die Mäuse werden intraperitoneal mit 5 μg an den Tagen 0, 7 und 14 immunisiert. An Tag 28 werden die Seren gegen mutiertes p53-Polypeptid-β-Galactosidasefusionsprotein mittels ELISA getestet. Die Mäuse werden mit 5 μg des gleichen Antigens geboosted, und die Milzzellen werden mit NS 1-Myelomfusionspartnern mittels etablierter Verfahren fusioniert (37). Die Hybridomen werden mittels ELISA gegen mutiertes p53-Polypeptid-β-Galactosidasefusionsprotein abgesucht. Zusätzlich werden Clone, die mit mutiertem p53-Polypeptidfusionsprotein reagieren, aber nicht mit reiner β-Galactosidase zweimal durch begrenzte Verdünnung subcloniert. Hybridoma werden als Aszites-Tumoren in Mäusen wachsen gelassen, und Antikörper wird wie früher beschrieben gereinigt (39).
Kovalente Koppung monoclonaler Antikörper an Affi-Gel-10^TM. Gereinigte monoclonale Antikörper gegen mutiertes p53-Polypeptid werden gegen PBS bei 4°C dialysiert, und das Affi-Gel-10^® (Bio-Rad^®) wird zu der gereinigten monoclonalen Antikörperlösung in einer Konzentration von 7.0 mg Protein pro ml Affi-Gel-10^® zugegeben. Allgemein werden 70 mg Antikörperligand zu 10 ml Affi-Gel-10^® zugegeben. Die Lösung wird sanft auf einem Labquake-Rotator (Labindustries #400-10) für vier Stunden bei 4°C geschüttelt, gefolgt von der Zugabe von Ethanolamin (Eastman Kodak) in einer Endkonzentration von 0.1 M, um unreagierte Estergruppen zu blockieren. Nach einer Stunde wird die Gelmatrix intensiv mit PBS durch Zentrifugation bei 2,500 UpM für 10 Minuten gewaschen, bis das Gel frei von Reaktanten ist, wie durch Erhalt von null Absorbtion bei 280 nm (OD₂₈₀) beurteilt. Um sicherzustellen, dass die Antikörperfunktion nach der Kopplungsprozedur aufrechterhalten wird, wird die Bindungs-Gelmatrix mit Seren inkubiert, die mutiertes p53-Polypeptid enthalten, und gebundenes Protein wird mit Probenpuffer zur Analyse mittels SDS-PAGE eluiert.
Biotiniylierung von ereinigtem Antikörper zur Verwendung in der Antigen-Bindungsurozedur. Monoclonale oder polyclonale Antikörper werden gemäß einem von LKB Laboratories veröffentlichten Protokoll biotinyliert. Zweihundert Microliter von Act BIOTIN-Lösung, hergestellt durch Zugabe von 2.0 mg von Act BIOTIN zu 0.5 ml anhydriertem Dimethylformamid (Pierce), werden zu 10 mg Antikörper, gelöst in 10 ml 0.2 M Natriumbicarbonat pH 8.8, enthaltend 0.15 M NaCl, zugegeben. Die Reaktion wird für 15 Minuten bei Raumtemperatur laufen gelassen, gefolgt von der Beendigung der Reaktion mit 0.1 ml 1.0 M Ammoniumchlorid pH 6.0. Der biotinylierte Antikörper wird gegen PBS dialysiert, um andere Salze zu entfernen, und 1.0 ml Aliquots werden bei –20°C gelagert. Um sicherzustellen, dass die biologische Aktivität des Antikörpers nach der Biotinylierung aufrechterhalten wird, werden die Antikörper mittels Immunpräzipitation von ³⁵S-Methionin markierten Zellextrakten, enthaltend mutierte p53-Polypeptide, getestet. Der monoclonale Antikörper (0.5 mg), der mutiertes p53-Polypeptid erkennt, wird mit abnehmenden Volumina an Probe reagieren gelassen und mit 0.05 ml einer Streptavidin-Agarose-Suspension bei 0.24 mg/ml immunpräzipitiert.
Iodierung von ereinigtem Antikörper zur Verwendung im Antigenbindungsprozess. Aliquots von 20 μl von Iodo-Gert (Pierce), die zuvor in Chloroform in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst, lyophilisiert und gefroren aufbewahrt worden waren, werden auf Raumtemperatur aufgewärmt. Folgendes wird zu dem Röhrchen, enthaltend Iodo-Gen^®, in der angegebenen Reihenfolge, zugegeben; 0.025 ml Puffer II (0.4 M Tris-HCl, 0.4 mM EDTA, pH 7.4), monoclonaler Antikörper in einer Konzentration von 1.0 mg/0.1 ml und 3.7 × 10⁷ Bq (1.0 mCi) Na¹²⁵I (Amersham#IMS.40). Die Iodierungsreaktion wird für eine Minute unter sanftem Schütteln laufen gelassen, und das Gemisch wird der Gelfiltrationschromatographie mittels einer G-25 Sephadex^TM PD10-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, pH 7.8 unterzogen, um unreagiertes freies ¹²⁵I zu entfernen. Einen halben ml Fraktionen werden gesammelt, und 10% Trichloressigsäure (TCA) präzipitierbare Einheiten werden bestimmt, bevor die Proben vereinigt werden.
SDS-Polyacrylamid-Plattengelelektrophorese. Die Proben werden in 20 Microliter Probenpuffer, enthaltend 6.0 M Harnstoff (Ultrapure, BRL), 0.1 M Tris-HCl (Sigma; T-1503), pH 6.8, 15% Glycerol (Kodak; 114-9939), 2% Natriumdodecylsulfat (Bio-Rad^®; #167-07-10), verdünnt und auf einem 5 bis 20% Acrylamidgradienten aufgetrennt, im wesentlichen wie von Laemmli beschrieben (35). Die Proben werden für 2 Minuten gekocht, vor dem Auftragen auf ein 1–1.5 mm dickes Plattengel in einem Bio-Rad^® Modell 155 Vertikale Elektrophoresezelle (Bio-Rad^® 165–1420) unter konstanter Spannung bei 45 Volt pro Gel für 15 Stunden (Hoeffer Spannungsquelle; PS 1200 DC). Verwendete Molekulargewichtsmarker sind Myosin, 200,000; Beta-Galactosidase, 130,000; Phosphorylase B, 92,000; Rinderserumalbumin, 68,000; Ovalbumin, 45,000; Carbonanhydrase, 29,000; Sojabohnentrypsininhibitor, 21,000; Lysozym, 14,400; und Cytochrom C, 12,000. Die Gele werden mit 0.1% Coomassie Blau R-250° (Bio-Rad^® #16-0400) in 7.0% Essigsäure und 10% Methanol für 5 Minuten gefärbt und in der gleichen Lösung ohne Coomassie^® entfärbt ( 4). Einige Gele werden mittels Silbertechnik gefärbt, wie von Merril (36) beschrieben (Bio-Rad Silberfärbungskit; #161-0443). Die Gele, die radioaktiv markierte Proben enthalten, werden der Autoradiographie, wie von Bonner und Laskey (37) beschrieben, unter Verwendung von Enhance^® (New England Nuclear) und Typ XR-2 Röntgenfilm (Kodak) unterzogen. In Gelen mit markierten Proben verwendete Molekulargewichtsmarker werden mit ¹⁴C vormarkiert (New England Nuclear).
Quantifizierung von mutiertem p53-Polypeptid in einer biologischen Flüssikeitsbrobe. Quantifizierung wird durch Herstellung einer Standardkurve mittels bekannter Konzentrationen von gereinigtem, rekombinantem menschlichem mutiertem p53 erreicht. Durch Vergleich der Absorption, die aus einer Probe, enthaltend eine unbekannte Menge von mutiertem p53, erhalten wird, mit der, die aus den Standards erhalten wird, kann die Konzentration an mutiertem p53 in der Probe bestimmt werden (1 und 2).
BEISPIEL 1
Zwei-Seiten-Sandwich-ELISA-Assay. In einem ersten Beispiel wird gereinigter monoclonaler Antikörper aus Clon PAb1801 (5 μg/ml in 0.1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9.0, 100 μl/Vertiefung), der sowohl an Wildtyp- als auch an mutiertes p53-Polypeptid bindet, auf Microtitervertiefungen für 16 bis 20 Stunden bei 4°C adsorbiert. Die Antikörperlösung wird aus den Vertiefungen entfernt, und alle verbleibenden Proteinbindungsstellen werden durch Inkubation der Vertiefungen mit PBS, enthaltend 1% BSA bei pH 7.2, für 2 Stunden bei Raumtemperatur (etwa 23°C) blockiert. Nach der Blockierung werden die Vertiefungen 4mal mit 200 μl Waschpuffer (PBS, enthaltend 1% BSA und 0.05% Tween-20^®, pH 7.3) gewaschen, dann werden richtig markierte Vertiefungen mit wechselnden Mengen an p53-Polypeptid-β-Galactosidasefusionsprotein (Standard) oder der zu testenden biologischen Probe für 16–18 Stunden bei 4°C (alternativ für 3 Stunden bei 37°C) inkubiert. Die Platten werden durch Umdrehen auf Papiertücher entleert, und die Vertiefung 4mal, wie vorstehend beschrieben, gewaschen.
Biotin-gekoppelter monoclonaler Antikörper aus Clon PAb421 (Reporter-Antikörper) wird in Probenverdünnungspuffer (PBS, enthaltend 50 mM NaCl, 1% normales Mauserum, 0.1% BSA, 0.5% Tween-20^® und 0.02% Thimerosal) in einer Konzentration von 10 μg/ml gelöst und (100 μl/Vertiefung) für 2–3 Stunden bei 37°C inkubiert. Der Reporter-Antikörper dagegen wird durch Inkubation (1 Stunde bei Raumtemperatur) mit Streptavidin, konjugiert an Meerrettichperoxidase (0.4 μg/ml in Probenverdünnungspuffer) gebunden. Die Vertiefungen werden 4mal gewaschen, wie vorstehend beschrieben, und eine Peroxidase-Substratlösung (z. B. ABTS, 100 μl/Vertiefung) wird zugegeben. Nach einem geeigneten Zeitraum der Inkubation (etwa 60–100 Minuten bei Raumtemperatur) wird die Absorption bei 405 nm gemessen.
Die Seren aus 6 normalen und 6 Krebspatienten-Donoren werden auf mutiertes p53-Polypeptid nach dem vorstehend beschriebenen Protokoll analysiert.
Die mittlere Absorption (A₄₀ ₅) aus Duplikatvertiefungen für jede Probe wurde in die Regressionsgleichung der Standardkurve eingegeben, um die Menge an mutiertem p53-Polypeptid in jeder der Proben zu berechnen. Die maximale Sensitivität des Assays ist 100 pg/ml. Daher werden Proben, die kein nachweisbares mutiertes p53-Polypeptid enthalten, als weniger als (<) 100 pg/ml enthaltend bezeichnet.
Tabelle 2 liefert eine Liste der p53-Polypeptidkonzentrationen in Seren von 6 normalen und b Krebspatienten:
Tabelle 2
Wie vorstehend beschrieben, unterscheidet die Auswahl an Antikörpern, die in diesem ersten Beispiel verwendet werden, nicht zwischen mutierten und Wildtyp-p53-Polypeptiden und liefert daher ein Maß der gesamten (Wildtyp und mutiertes) p53-Polypeptidkonzentration in der Probe. Wildtyp p53-Polypeptid jedoch, wie früher diskutiert, akkumuliert nicht in nachweisbaren Mengen; daher sind die in diesen Proben nachgewiesenen und gemessenen Polypeptide folglich mutierte p53-Polypeptide. Es sollte auch bemerkt werden, dass der Gehalt der Probe an mutiertem p53-Polypeptid durch den Gesundheitszustand des Probendonors, d. h. der Tumorbelastung des Patienten, beeinflusst sein kann. Diese Belastung wird durch den Status des Fortschreitens der zugrundeliegenden Krankheit sowie jede verbessernde Therapie, wie Chirurgie, Chemotherapie oder Bestrahlung, die vor Serumprobenentnahme unternommen worden sein können, beeinflusst.
In einem zweiten Beispiel wird gereinigter PAb240 auf Mikrotitervertiefungen adsorbiert, da dieser Antikörper für das mutierte p53-Polypeptid spezifisch ist. Der Antikörper (5 μg/ml in 0.1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9.0; 100 μl/Vertiefung) wird für 16 bis 20 h bei 4°C adsorbieren gelassen. Die Antikörperlösung wird dann aus den Vertiefungen entfernt, und alle unbesetzten Proteinbindungsstellen werden durch Inkubation der Vertiefungen mit PBS, enthaltend 1% BSA bei pH 7.2, für zwei Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Nach dem Blockieren werden die Vertiefungen 4mal mit 200 μl Waschpuffer (PBS, enthaltend 0.1% BSA und 0.05% Tween-20^®, pH 7.3) gewaschen, dann werden richtig markierte Vertiefungen mit wechselnden Mengen an gereinigtem, rekombinantem mutiertem p53-Polypeptid (Standard) oder der zu testenden biologischen Probe für 16–18 h bei 4°C oder alternativ für 3 h bei 37°C inkubiert. Die Platten werden durch Umdrehen über Papiertüchern entleert, und die Vertiefungen werden 4mal, wie vorstehend beschrieben, gewaschen.
Polyclonaler Antikörper aus Kaninchen, der mutiertes p53-Polypeptid erkennt und bindet, wird in Probenverdünnungspuffer (PBS, enthaltend 50 mM NaCl, 1% normales Mauserum, 0.1% BSA, 0.5% Tween-20^® und 0.02% Thimerosal) in einer Konzentration von 5 μg/ml gelöst und (100 μl/Vertiefung) für 2–3 h bei 37°C inkubiert. Gebundener Reporter-Antikörper dagegen wird durch Inkubation (1–2 Stunden bei Raumtemperatur) mit Peroxidasekonjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin nachgewiesen. Nach Waschen der Vertiefungen wird ein Peroxidase-Substrat, wie ABTS (2,2'-Azino-di-[3-ethyl benzthiazolinsulfonat] zugegeben, und nach einem geeigneten Zeitraum der Inkubation (etwa 30–60 Minuten bei Raumtemperatur) wird die Absorption bei 405 nm gelesen.
Seren von 21 gesunden Donoren und von 67 Krebspatienten werden auf mutierte p53-Polypeptide mittels des vorstehend beschriebenen Mutanten-spezifischen Protokolls analysiert. 1 zeigt die Standardkurve, erhalten durch genaue Konzentrationen an gereinigtem, rekombinantem menschlichem mutiertem p53-Polypeptid. Die Kurve ist linear von 0 bis 8 ng/ml (linearer Regressionskoeffizient = 0.999).
Zugabe und Wiedergewinnen von p53 in normalem Serum zeigte, dass das Wiedergewinnen besser war, wenn das Serum verdünnt wurde (5). Zum Beispiel wurde gereinigtes, rekombinantes mutiertes p53 zu unverdünntem normalem menschlichem Serum und zu verdünntem (1 : 5 mit Probenverdünnungspuffer) normalem menschlichem Serum in einer Endkonzentration von 4 ng/ml zugegeben. Gereinigtes p53 wurde zu verdünntem menschlichem Urin in einer Endkonzentration von 2 ng/ml zugegeben. Die Proben, denen p53 zugegeben wurde, wurden im p53-ELISA-Assay analysiert. Die Menge an nachgewiesenem mutiertem p53 wird als ein Prozentsatz der tatsächlich zu der Probe zugegebenen Menge ausgedrückt.
Die Serumproben werden 1 : 5 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt, und 100 μl des verdünnten Serums werden zu Duplikatvertiefungen für jeden der 21 normalen und 67 Krebspatienten-Proben zugegeben.
Die mittlere Absorption (A₄₀ ₅) aus den Duplikatvertiefungen für jede Probe wurde in die Regressionsgleichung der Standardkurve eingegeben, um die Menge an mutiertem p53-Polypeptid in jedem der verdünnten Proben zu berechnen. Diese Menge wurde dann mit dem Verdünnungsfaktor (d. h. 5) multipliziert, um die Menge an in den ursprünglichen, unverdünnten Seren vorhandenem mutiertem p53-Polypeptid zu erhalten. Die Menge an mutiertem p53-Polypeptid in den Proben wird in Picogramm (pg) pro Milliliter (ml) unverdünntem Serum ausgedrückt. Die maximale Sensitivität des Assays beträgt 30 pg/ml. Das heißt, die Proben mit weniger als 30 pg/ml an mutiertem p53-Polypeptid können in diesem Assay nicht nachgewiesen werden und können nicht voneinander oder sogar von Proben, die kein mutiertes p53-Polypeptid enthalten, unterschieden werden. Da die Proben 1 : 5 verdünnt wurden, wird diese Sensitivitätsgrenze 150 pg/ml (30 × 5). Daher werden im Bericht der Ergebnisse dieser Studie Serenproben ohne nachweisbare p53-Polypeptide als weniger als (<) 150 pg/ml enthaltend bezeichnet.

Tabelle 3 liefert eine Liste gemessener mutierer p53-Polypeptidkonzentration der Seren von 21 normalen menschlichen Donoren. Tabelle 3 Konzentration an mutiertem p53-Polypentid in normalen menschlichen Seren

Probe	Konzentration an mutiertem p53-Polypeptid (pg/ml)
1	<150
2	<150
3	<150
4	<150
5	<150
6	<150
7	<150
8	<150
9	<150
10	645
11	<150
12	<150
13	<150
14	<150
15	<150
16	<250
17	515
18	<150
19	390
20	<150
21	<150

18 der 21 Proben (86%) besaßen kein nachweisbares mutieres p53-Polypeptid (d. h. <150 pg/ml). Die drei verbleibenden Proben (14%) besaßen alle Konzentrationen an mutiertem p53-Polypeptid, die sehr nahe an der Sensitivitätsgrenze lagen, und keine Probe besaß mehr als 1000 pg/ml mutieres p53-Polypeptid.
Tabelle 4 liefert eine Liste der gemessenen mutierten p53-Polypeptidkonzentration aus den Seren von 67 Krebspatienten. Die Krebsarten waren verschiedener Natur, wie in Tabelle 4 angezeigt.
Tabelle 4: Konzentrationen an mutiertem p53 in Krebspatientenseren
Tabelle 4: Konzentrationen an mutierem p53 in Krebspatientenseren -Fortsetzung
Im Gegensatz zu was in normalen Proben gesehen wurde, besaßen 41 von 67 getesteten Proben (61%) nachweisbares mutiertes p53-Polypeptid; 9 Proben (13%) besaßen mehr als 1000 pg/ml p53-Polypeptid.
Die hier vorgestellten Daten zeigen einen klaren Unterschied in den Konzentrationen an mutiertem p53-Polypeptid im Serum, das von diesen zwei Probenpopulationen (d. h. normale versus Krebspatientensera) erhalten wird. Es sollte nochmals betont werden, dass aufgrund der nach dem ersten Beispiel diskutierten Gründe die Werte an mutiertem p53-Polypeptid der Probe des Krebspatienten wahrscheinlich die Werte unterschätzen, die in ansonsten unbehandelten (d. h. neu diagnostizierten) Krebspatienten mit wesentlicher Tumorbelastung erhalten werden würden.
Eine Antikörper-Kompetitionsstudie wurde durchgeführt, um zu überprüfen, dass der Faktor, der in Serum von menschlichen Krebspatienten nachgewiesen wird, mutiertes p53-Polypeptid war. Für diese Untersuchung wurden zwei menschliche Serumproben ausgewählt. Eine Probe war von einem Patient mit Dickdarmkrebs (Nr. 86-37-76). Für diese Probe war früher gezeigt worden, dass sie mutiertes p53-Polypeptid enthält, wenn sie mit dem Zwei-Seiten-Sandwich-ELISA analysiert wurde (Mittelwert von 8 getrennten Analysen = 1.9 ng/ml). Die zweite Probe war von einem gesunden normalen Donor (OSI #15), von dem früher gezeigt wurde, dass er kein mutiertes p53-Polypeptid enthält. Jedes dieser zwei Seren wurde 1 : 2 mit Assay-Puffer verdünnt, dann weiter in zwei gleiche Teile mit der Markierung „experimentell" und „Kontrolle" geteilt. Zu jedem der experimentellen Röhrchen wurden 7.5 μg gereinigter monoclonaler Antikörper p53(Ab-2) Clon PAb1801 (ATCC Hinterlegungsnr. HB 10642) gegeben. Das ist ein sehr gut charakterisierter Antikörper, der spezifisch an p53-Polypeptid bindet, aber selbst keinen Bestandteil des Zwei-Seiten-Sandwich-ELISAs darstellt. Jedes der Kontrollröhrchen erhielt 7.5 μg des gereinigten monoclonalen Antikörpers trpE(Ab-1). Dieser Antikörper dient als eine Kontrolle, da er den gleichen Isotyp (IgG₁) besitzt wie der PAb1801-Antikörper, aber spezifisch an bakterielle Anthranilatsynthetase bindet, ein Protein, das in menschlichem Serum nicht vorkommt. Jeder IgGl-Antikörper jedoch, der mit einem irrelevanten Antigen reagiert und der auch nicht mit p53 kreuzreagiert, kann als eine geeignete Kontrolle dienen. Zum Beispiel sind zwei andere Antikörper, die gleich gut als Kontrollen funktionieren würden, ATTC CRL 1640, ein Anti-DNA-Polymerase-alpha-IgGl-Clon oder ATTC CRL 1713, ein Anti-E. coli-DNA-Polymerase-IgGl-Clon.
Jede der Proben wurde dann in dem Zwei-Seiten-Sandwich-ELISA analysiert. Die Ergebnisse zeigen (siehe 6), dass die Zugabe von p53(Ab-2)-Antikörper zur Krebsserumprobe ausreichend war, um das Signal auf nicht-nachweisbare Mengen zu reduzieren, während der trpE(Ab-1)-Antikörper keine Wirkung hatte. Zugabe jedes Antikörpers zur normalen Serumprobe veränderte die Tatsache nicht, dass kein p53 in der normalen Probe gefunden wurde. Diese Ergebnisse sind genau, was man erwarten würde, wenn der nachgewiesene Faktor in der Krebsserumprobe p53-Polypeptid wäre.
In einer weiteren Verbesserung dieser Untersuchung wurde das Experiment, wie vorstehend beschrieben, wiederholt, mit der Ausnahme, dass 35 μl des bakteriellen Protein A/G (Oncogen Science, Inc., Uniondale, N.Y.) zu jeder der Proben zugegeben wurde. Protein A/G bindet an den Fc-Teil der Antikörper. Durch Zentrifugieren der Proben (10 min bei 4°C, Eppendorf^® Microfuge) wird das Protein A/G zusammen mit dem gebundenen Antikörper und allen anderen Proteinen pelletiert, an die Antikörper ihrerseits gebunden haben. Der p53(Ab-2)-Antikörper Clon PAb1801 würde auf diese Weise alles p53 entfernen, das in der Probe vorhanden sein hätte können, während der trpE(Ab-1) alles p53 in der Probe unberührt lassen würde. Das wurde gemacht, und die Überstände wurden im Zwei-Seiten-Sandwich-ELISA analysiert. Die Ergebnisse (siehe 7) bestätigen die vorstehenden Befunde.
Während die Verwendung des Clons PAb240 als ein Bindungs-Antikörper die bevorzugte Konfiguration darstellt, da nur mutiertes p53-Polypeptid gebunden worden wäre, wäre eine annehmbare Alternative, entweder Clon PAb421 oder Clon PAb1801 als Bindungs-Antikörper zu haben. Für diese Alternativen wäre das Assay-Format identisch zu dem vorstehend beschriebenen. In einer anderen Ausführungsform kann der polyclonale Antikörper als der Bindungs-Antikörper mit PAb240 als Reporter verwendet werden. In dieser Konfiguration wird Peroxidase-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin durch Peroxidase-konjugiertes Ziege-anti-Maus-Immunglobulin im vorstehend beschriebenen Assay-Format ersetzt.
BEISPIEL 2
Immunoblot-Analyse. Zu analysierende Serenproben oder Zellextrakte werden zuerst der SDS-PAGE, wie hier vorstehend beschrieben, auf einem 5–20% Acrylamidgradientengel unterzogen. Nach der Elektrophorese wird der Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose (Schleicher & Schuell, BA 85, 0.45 μm) durchgeführt. Die Proteine werden bei 70 Volt für 2– 3 Stunden bei 4°C übertragen. Die Nitrocellulose wird in 0.5% Magermilchpulver (Carnation^®) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7.4 (PBS), enthaltend 0.02% Natriumazid, für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Filter wird dann mit PBS, enthaltend 0.1% Tween-20^® (Bio-Rad^® Lab), gewaschen und mit ¹²⁵[I] markiertem PAb240 monoclonalem Antikörper (2.0 × 10⁶ CPM/ml), verdünnt in dem gleichen Puffer, für 1.5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Filter werden dreimal mit PBS-Tween-20^® gewaschen, getrocknet und auf Kodak XR-2-Film bei –70°C mit Verstärkungsfolien exponiert. In einer anderen Ausführungsform wird der Filter mit PAb240 monoclonalem Antikörper inkubiert, dann mit PBS gewaschen und mit Alkalischer Phosphatase-konjugiertem Ziege-anti-Maus- IgG inkubiert. Der Filter wird mit PBS gewaschen und mit einem geeigneten Alkalische Phosphatase-Substrat (z. B. 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat) inkubiert, bis sich gefärbte Banden entwickeln. Weiter wird der Filter in einer anderen Ausführungsform mit polyclonalem Kaninchen-anti-p53-Antikörper inkubiert, mit PBS gewaschen und mit Alkalische Phosphatase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG inkubiert. Der Filter wird gewaschen und, wie vorstehend beschrieben, entwickelt.
BEISPIEL 3
Immunpräzipitation von mutiertem p53-Polypeptid mit Immunglogbulin. 1 ml der Seren wird für 15 Stunden bei 4°C mit 1 Microgramm monoclonalen Antikörpers PAb240 und 50 μl einer 10% (v/v) Suspension von Protein-A-Agarose (BRL), enthaltend 0.175 mg Protein-A, reagieren gelassen. Die Immunkomplexe werden dreimal in PBS TDS gewaschen und durch Zentrifugation bei 1000 UpM für 10 Minuten gesammelt. Die Immunpräzipitate werden durch Elektrophorese mittels 5–20% Acrylamid-SDS-PAGE aufgelöst. Die aufgelösten Proteine werden elektrophoretisch auf Nylon, Nitrocellulose oder andere geeignete Membranträger übertragen (geblottet). Geblottete Membranen werden für 1 h in einer Lösung, enthaltend PBS und 1% bis 10% BSA oder Casein, blockiert, um nicht-spezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren. Die blockierten Membranen werden mit radiomarkierten Antikörpern gegen mutierte p53-Polypeptide (entweder monoclonal oder polyclonal) inkubiert, dann der Autoradiographie unterzogen. In einer anderen Ausführungsform können die Antikörper gegen mutierte p53-Polypeptide enzymatisch markiert sein, und der Nachweis durch die Verwendung einer geeigneten Substratlösung ausgeführt werden. Zum Beispiel könnte ein Peroxidase-markierter Antikörper mit 0.03% 4-Chloro-1-naphthol inkubiert werden.
In einem alternativen Immunpräzipitationsprotokoll wird PAb240 monoclonaler Antikörper nach einem von LKB Laboratories veröffentlichten Protokoll biotinyliert. 200 Mikroliter Act BIOTIN-Lösung, hergestellt durch Zugabe von 2.0 mg von Act BIOTIN zu 0.5 ml wasserfreiem Dimethylformamid (Pierce), werden zu 10 mg PAb240, gelöst in 10 ml 0.2 M Natriumbicarbonat pH 8.8, enthaltend 0.15 M NaCl, gegeben. Die Reaktion wird für 15 Minuten bei Raumtemperatur laufen gelassen, gefolgt von einer Terminationsreaktion mit 0.1 ml 0.1 M Ammoniumchlorid pH 6.0. Der biotinylierte Antikörper wird gegen PBS dialysiert, um andere Salze zu entfernen, und 1.0 ml Aliquots bei –20°C gelagert. Um sicherzustellen, dass die biologische Aktivität des Antikörpers nach der Biotinylierung aufrechterhalten wird, werden die Antikörper durch Immunpräzipitation von gereinigten, rekombinanten mutierten p53-Polypeptiden getestet. PAb240 MoAb (0.5 g) wird mit abnehmenden Volumina von Patientenseren, enthaltend das mutierte p53-Polypeptid, reagieren gelassen und mit 0.05 ml Streptavidinagarosesuspension bei 0.24 mg/ml immunpräzipitiert, was in einem PAb240-mutiertes p53-Polypeptid-Streptavidinagarose-Komplex resultiert, der nachweisbar ist.
BEISPIEL 4
Festphasen-Antigenbindungsverfahren mittels biotinyliertem monoclonalem Antikörper als Reporter. Für jeden Assay-Punkt wird ein Aliquot der Affinitätsbindungsmatrix, umfassend eine PAb240-Affi-Gel-10^TM-Suspension, zu einem Röhrchen, enthaltend 4 ml PBS mit 4% BSA, zugegeben, für eine halbe bis zu drei Stunden blockiert, pelletiert durch Zentrifugation bei 2,800 UpM, dann einmal in PBS gewaschen. Die blockierte, gewaschene Bindungsmatrix wird verwendet, um die Anwesenheit von mutierten p53-Polypeptiden in Seren von Krebspatienten zu testen. Patientenserum wird zu jedem Röhrchen, enthaltend ein Pellet von Affinitätsmatrix, zugegeben und für ein oder zwei Stunden reagieren gelassen. Die Matrix wird pelletiert und einmal in 4.0 ml PBS, enthaltend 0.05% Tween-20^®, gewaschen. 1 ml PBS und biotinylierter PAb240 werden zu jedem Röhrchen zugegeben, bei 37°C für 1 Stunde inkubiert, pelletiert, dann einmal in PBS-0.5% Tween-20^® gewaschen. Ein Avidin-Biotin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex wird durch Mischen von zwei Tropfen der Lösung A (Vectastain, Avidin Biotin Komplex (ABC) Kit, #PK4004, Vector Laboratories) und 2 Tropfen der Lösung B in 10.0 ml PBS, enthaltend 0.05% Tween-20^® hergestellt. Nach 30 Minuten wird 1 ml ABC-Lösung zum Matrix-Pellet zugegeben, gemischt und bei 37°C für 30 bis 60 Minuten inkubiert. Dann wird die Matrix pelletiert und einmal mit 4.0 ml PBS-0.5% Tween-20^® gewaschen. Entwicklungslösung wird wie folgt hergestellt: Lösung I wird durch Zugabe von 0.06 ml 30% Wasserstoffperoxid zu 100 ml PBS hergestellt. Lösung II wird durch Zugabe von 60 mg Meerrettichperoxidase-Entwickler (BioRad) zu 20.0 ml eiskaltem Methanol hergestellt. Unmittelbar vor Verwendung werden 5 Teile Lösung I mit 1 Teil Lösung II gemischt und 1.0 ml zu der Matrix zugegeben. Die Matrix entwickelt eine blaue Farbe in Proben, die das mutierte p53-Polypeptid enthalten.
Festphasen-Antigenbindungsverfahren mittels iodierten Antikörpern als Reporter-Antikörper. 1 ml PAb240 Bindungsaffinitätsmatrix wird zweimal mit 4.0 ml PBS TDS und einmal mit 4.0 ml PBS, enthaltend 0.1% BSA (PBS-BSA) gewaschen. Bindungsmatrizes können entweder mit Zellextrakten oder menschlichen biologischen Flüssigkeiten verwendet werden und werden in Polypropylenröhrchen mit rundem Boden (12 × 75 mm, Enkay) oder konischen (12 × 75 mm, Enkay) inkubiert.
Das Gelmatrixpellet wird in seinem zweifachen Volumen an PBS, enthaltend 0.1% Natriumazid, suspendiert, und 0.01 ml werden in ein Röhrchen mit rundem Boden (12 × 75 mm, Enkay) überführt, enthaltend eine bakterielle Wachstums- und Proteaseinhibitorlösung (BGIPI, 0.05 ml) einer Endkonzentration von 0.005% TPCK (Sigma), 0.01% Sojabohnentrypsininhibitor (Sigma), 0.01% Natriumazid und 0.01% Natriumfluorid und 2.75 μl (0.054 TIU) Aprotinin (Sigma) (19.8 TIU/ml). Ein halber ml von Patienten- oder normaler menschlicher Seren (NHS) oder Zellextrakt wird zu jedem Röhrchen zugegeben, und die Probe wird über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Gelmatrix wird zweimal mit 3.0 ml PBS gewaschen, und etwa 0.1 ml Volumen Flüssigkeit wird mit dem Gelmatrixpellet zurückgehalten. Das Pellet wird für 2 Stunden bei 37°C mit 0.1 ml ¹²⁵I-markiertem Antikörper gegen mutierte p53-Polypeptide [monoclonal oder polyclonal - etwa 60,000 CPM, 1.0 μCi ¹²⁵I Iod pro 1.0 Mikrogramm Protein] geschüttelt, einmal mit 3.0 ml PBS TDS, zweimal mit 3.0 ml PBS gewaschen und zuletzt in einem Gammazähler gezählt.
BEISPIEL 5
Doppeldiffusion in Agar. Geschmolzener Agar wird auf Glassplättchen oder in Petrischalen gegossen und aushärten gelassen. Kleine Vertiefungen werden aus dem Agar einige Millimeter voneinander ausgestanzt. 50 μl des affinitätsgereinigten polyclonalen Antikörpers aus Kaninchen gegen mutierte p53-Polypeptide werden in eine der ausgestanzten Vertiefungen gegeben, und 100 μl Patientenseren werden in eine andere der ausgestanzten Vertiefungen gegenüber der den Antikörper enthaltenden Vertiefung gegeben. Diese Proben werden gegeneinander in einer feuchten Kammer für 18–24 Stunden diffundieren gelassen. Die resultierenden Präzipitationslinien repräsentieren mutierte p53-Polypeptidkomplexe, die visuell in indirektem Licht mit Hilfe von Vergrößerungslinsen analysiert werden. Der Antikörper und das mutierte p53-Polypeptid diffundieren auf radiale Weise, wobei sie einen Bogen erzeugen, der sich einer geraden Linie an den Führungsecken des diffundierenden Antikörper-mutieres p53-Polypeptidkomplexes annähert.
BEISPIEL 6
Lösungsphasen-Antigenbindungstest. Ein Lösungsphasentest zur Bindung von mutiertem p53-Polypeptid, der eine alternative Ausführungsform der Erfindung darstellt, wurde entworfen. Dieser Test erfordert 0.1 ml Patientenserum, und die anderen Testkomponenten bestehen aus Streptavidin-Agarose (Bethesda Research Laboratories, Rockville, MD, Katalognr. 5942SA, Labornr. 52101), biotinyliertem Bindungs-Antikörper PAb240 und ¹²⁵Iod-markierten PAb1801 als Reporter-Antikörper.
Die Bedingungen für optimierte Durchführungen wurden bestimmt. Serenproben (0.1 ml), 3 Mikrogramm biotinylierter Bindungs-Antikörper und 100,000 CPM ¹²⁵Iod-markierter Reporter-Antikörper werden vereinigt, eine Stunde bei 25°C inkubiert, und 16 Mikrogramm kovalent an Agarose gekoppeltes Streptavidin werden zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei 25°C unter Schütteln werden die Immunkomplexe durch Zentrifugation bei 2,800 UpM für 3 min in einer Beckman^®-Kühlzentrifuge (Modell TJ-6) gesammelt, der Überstand, enthaltend ungebundenen Reporter-Antikörper, wird abgesaugt, und 3 ml PBS 0.1% Triton X-100^® werden zugegeben. Die Zentrifugation, Aspiration und Waschschritte werden dreimal wiederholt, und die gebundenen ¹²⁵Iod-Zähleinheiten werden in einem LKB-Gammazähler (Modell 1274) gemessen.
BEISPIEL 7
Radioimmunassay (RIA). Iodierung des rekombinanten mutierten p53-Polypeptids wird wie beschrieben durchgeführt. Der Radioimmunassay verwendet ¹²⁵I-mutiertes p53-Polypeptid, unmarkiertes mutiertes p53-Polypeptid, PAb240, Ziege-anti-Maus-IgG und Protein A-Agarose und wird wie folgt durchgeführt. Fünfzig Mikroliter ¹²⁵I-mutiertes p53-Polypeptid (2 × 10⁴ CPM) werden in der biologischen Flüssigkeitsprobe oder in steigenden Konzentrationen unmarkierten mutierten p53-Polypeptidstandards in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 1% BSA 0.02% NaN₃ (PBS-BSA), verdünnt und mit 5 μg/ml PAb240 bei 4°C über Nacht inkubiert. Fünfzig Mikroliter Ziege-anti-Maus-IgG werden zugegeben (1 : 1000 in PBS) und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert, wonach Protein A-Agarose (50 μl 10% (v/v)) -Suspension zugegeben und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert wird. Die Röhrchen werden zentrifugiert, dreimal in PBS-1% BSA-0.5% Triton X-100^® gewaschen und auf Radioaktivität gezählt. Die Menge an mutiertem p53-Polypeptid in der Probe wird aus der Standardkurve, hergestellt mit gereinigtem unmarkiertem mutiertem p53-Polypeptid, quantifiziert.
ERGEBNISSE
Ein quantitativer Zwei-Seiten-ELISA für mutierte p53-Proteine wurde entwickelt. Der p53-ELISA-Assay verwendet monoclonalen Antikörper, Clon PAb240, um selektiv solche mutierten p53-Proteine zu binden, die das PAb240-Epitop exprimieren. Hohe Titer polyclonaler Antikörper im Kaninchen, hergestellt gegen rekombinantes mutiertes p53 (HIS 175), werden in der Reporter-Kaskade verwendet, und immunaffintitätsgereinigtes menschliches rekombinantes mutiertes p53 (HIS273) wird als Standard im Assay verwendet. Eine Sensitivität von 50 pg mutiertes p53 pro ml Probenpuffer wird routinemäßig erreicht, während eine Sensitivität besser als 20 pg/ml unter optimalen Bedingungen erreicht werden kann. Infra- und Inter-Assay CVs sind besser als 5% im Mittelbereich der Standardkurve (2). Keine Kreuzreaktivität wurde gegen Insulin, Transferrin und eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Interleukinen gefunden, gemessen in Konzentrationen größer als 2,000 mal die Sensitivitätsgrenzen des Assays (Tabelle 5). Unspezifische Kreuzreaktivität wurde auch mit Extrakten aus Zelllinien ohne mutiertes p53 als Testproben gezeigt. Wenig oder kein mutiertes p53 wurde in Gesamtzellextrakten von K562- und KNRK-Zellen (K-ras transformierte NRK-Zellen) gefunden, während eine hohe Menge an Expression in der menschlichen epidermoiden Carcinomalinie A431 (7.1 ng/ml) gefunden wurde (8). HL60-Zellen zeigten auch bedeutende Mengen an mutiertem p53 (3.1 ng/ml). Expression von mutiertem p53 in dieser Zelllinie kann unterschiedlich sein, abhängig von der speziellen untersuchten Variante. Geringe bis mäßige Expression von mutiertem p53 wurde in viral transformierten Maus- (k-balb), Nerz- (64 Jiki) und Hund- (DoCl)-Zellen nachgewiesen. Der p53-Assay kann verwendet werden, um mutiertes p53 in menschlichen Proben aus Krebspatienten zu messen. Tabelle 5 Spezifität des p53-ELISA-Assays
Die angezeigten Proben wurden in Probenverdünnungspuffer in einer Konzentration von 100 ng/ml gelöst und im p53-ELISA-Assay getestet. Keine meßbare Kreuzreaktivität wurde für jede der getesteten Proben beobachtet.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Bestimmen in einem Individuum, ob das Individuum zu einem neoplastischen Zustand neigt, umfassend das quantitative Bestimmen der Konzentration an in der Probe vorhandenem, mutiertem p53-Polypeptid in einer Probe einer im Wesentlichen zellfreien, biologischen Flüssigkeit des Individuums, wobei eine Konzentration an mutiertem p53-Polypeptid in der Probe von mehr als 50 pg/ml die Wahrscheinlichkeit zeigt, dass das Individuum einen solchen neoplastischen Zustand aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das quantitative Bestimmen umfasst: (i) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, der in der Lage ist, unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes erlauben, einen Komplex mit dem mutierten p53-Polypeptid zu bilden; und (ii) Bestimmen der Menge jedes in der Weise gebildeten Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Antikörper in der Lage ist, mit dem mutierten p53, aber nicht mit dem p53-Wildtyp einen Komplex zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Antikörper ein polyclonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei der Antikörper an einen festen Träger gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei das quantitative Bestimmen, ob irgendein Komplex in Schritt (ii) gebildet wird, umfasst: (a) Inkontaktbringen der Probe aus Schritt (i) mit einem zweiten Antikörper, der in der Lage ist, einen zweiten Komplex mit einem in Schritt (i) gebildeten Komplex zu bilden, und zwar unter Bedingungen, die die Bildung eines zweiten Komplexes erlauben; und (b) Bestimmen der Menge jedes so gebildeten zweiten Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Menge jedes gebildeten zweiten Komplexes mit der Menge eines gesunden Individuums in einer Probe verglichen wird, wobei das Vorliegen einer erheblich unterschiedlichen Menge zeigt, dass das Individuum den neoplastischen Zustand aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der zweite Antikörper ein polyclonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der zweite Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei der zweite Antikörper an einen festen Träger gebunden ist.
Verfahren zum Bestimmen bei einem Individuum, ob das Individuum zu einem neoplastischen Zustand neigt, durch das quantitative Bestimmen der Konzentration des mutierten p53-Polypeptids in einer im Wesentlichen zellfreien biologischen Flüssigkeitsprobe, umfassend: (a) Inkontaktbringen eines festen Trägers mit dem Überschuss eines ersten Antikörpers, der in der Lage ist, unter Bedingungen, die es ermöglichen, dass der Antikörper an die Oberfläche des festen Trägers bindet, mit dem mutierten p53-Polypeptid ein Komplex zu bilden; (b) Inkontaktbringen des resultierenden festen Trägers, an den der erste Antikörper gebunden ist, mit einer im Wesentlichen zellfreien biologischen Flüssigkeitsprobe, unter Bedingungen, so dass jedes mutierte p53 in der biologischen Flüssigkeit an den Antikörper bindet und mit ihm einen Komplex bildet; (c) Inkontaktbringen des in Schritt (b) gebildeten Komplexes mit einer vorher festgelegten Menge eines zweiten Antikörpers, der auf ein Epitop des mutierten p53 gerichtet ist, das nicht mit dem Epitop übereinstimmt, auf das der erste Antikörper aus Schritt (a) gerichtet ist, um einen Komplex zu bilden, der das mutierte p53, den ersten Antikörper und den zweiten Antikörper umfasst; (d) quantitatives Bestimmen der Menge des in Schritt (c) gebildeten Komplexes; und (e) dadurch Bestimmen der Konzentration des mutierten p53 in der biologischen Flüssigkeitsprobe, wobei das Vorhandensein des mutierten p53-Polypeptids in der Probe in einer Konzentration von mehr als 150 pg/ml zeigt, dass es wahrscheinlich ist, dass das Individuum den neoplastischen Zustand aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der erste oder zweite Antikörper in der Lage ist, mit dem mutierten p53, aber nicht mit dem p53-Wildtyp einen Komplex zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei der an den festen Träger gebundene erste Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist, und der zweite Antikörper ein polyclonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der erste an den festen Träger gebundene Antikörper ein polyclonaler Antikörper ist, und der zweite Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der erste an den festen Träger gebundene Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist, und der zweite Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei der erste an den festen Träger gebundene Antikörper ein polyclonaler Antikörper ist, und der zweite Antikörper ein polyclonaler Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei der erste Antikörper mit einem nachweisbaren Macker gekennzeichnet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 17, wobei der zweite Antikörper mit einem nachweisbaren Marken gekennzeichnet ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der nachweisbare Marker ein Enzym, Biotin, ein Fluorophor, ein Chromophor, ein Schwermetall, ein paramagnetisches Isotop oder ein Radioisotop ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die biologische Flüssigkeit Urin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die biologische Flüssigkeit Serum ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die biologische Flüssigkeit ein Zellextrakt ist.
Verfahren zur Überwachung des Verlaufs eines neoplastischen Zustands bei einem Individuum, umfassend das quantitative Bestimmen der Konzentration des mutierten p53-Polypeptids in einer ersten Probe einer im Wesentlichen zellfreien biologischen Flüssigkeit des Individuums nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, und Vergleichen der so bestimmten Konzentration mit der Konzentration in einer darauffolgenden Probe der biologischen Flüssigkeit des Individuums, wobei die Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen wurden, und wobei ein Unterschied bei den bestimmten Konzentrationen den Verlauf des neoplastischen Zustands zeigt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei eine deutlich unterschiedliche Menge eine Menge ist, die gleich oder größer als zwei Standardabweichungen über der Konzentration von p53 ist, die bei Proben von normalen Individuen festgestellt wurde.