JP3637087B2 - 新規な白血球活性化因子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な構造を有するヒト由来白血球活性化タンパク質因子およびそれをコードする遺伝子ＤＮＡに関する。本発明は、上記遺伝子ＤＮＡを有する組換えプラスミド、およびそれを用いて形質転換した形質転換体にも関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
好中球が、マクロファージ、リンパ球などに加えて癌細胞破壊反応へ関与することが示唆されている。また、多くの癌組織の病理標本で好中球の癌細胞周辺への浸潤像が観察されている。これらのことは、好中球が癌細胞の分泌する走化性因子に応答した結果であると考えられる。
【０００３】
したがって、好中球、マクロファージ、リンパ球などを活性化することによって、癌細胞破壊反応の亢進やインターロイキン類の分泌の促進等が誘導され、自然免疫能が高められるので、白血球活性化因子を簡便に大量に安定的に調製することができれば、腫瘍免疫としての治療、診断、予後の判定などはもちろん、好中球、リンパ球、マクロファージの基礎研究分野での活性化機構解明の研究にも利用することができる。
【０００４】
これまでに我々は、白血球浸潤が認められる組織像を示すヒト肺巨細胞癌より樹立した細胞を用いて、この細胞が放出する好中球走化性因子インターロイキン８（ＬＵＣＴ／ＩＬ−８）を発見、精製分離し、その遺伝子をクローニングしてきた。ＩＬ−８は、分子量約８kDa の単純タンパク質で等電点は１０．３と高く、７７アミノ酸残基のものと７２アミノ酸残基からなるものの２種類が主なＩＬ−８で、双方とも同等の活性がある。ＩＬ−８は炎症性のサイトカインであることから、慢性炎症において血中に放出されることも知られている。
【０００５】
しかしながら、ＩＬ−８とは異なる好中球走化性因子が好中球と癌細胞との相互作用のメディエーターとして関与している可能性が考えられたので、新しい走化性因子を検索することが必要であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
今回、我々は、新規な白血球走化性因子を検索するに際し、白血球走化活性を指標にして各種ヒト造血器系腫瘍細胞株９７種の細胞培養液をスクリーニングした結果、Ｔ細胞白血病細胞ＳＫＷ−３の培養液中に走化性をもつタンパク質性因子を検出した。この因子を精製分離したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は約１６kDa とＩＬ−８の２倍の大きさであった。そこでアミノ酸配列を決定した結果、新しい走化性因子であることが判明し、ＬＥＣＴ２（Leukocyte-derived chemotaxin 2) 、特にＬＥＣＴ２ａと命名した。
さらにＬＥＣＴ２ａのｃＤＮＡのクローニングを試みた。部分アミノ酸配列をもとに合成したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりＬＥＣＴ２ａのｃＤＮＡの一部と考えられるｃＤＮＡ断片を増幅し、ほぼ完全長と考えられるｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列を決定したところ、完全にＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列とは一致せず高ホモロジーを示すタンパク（ＬＥＣＴ２ｂと命名）をコードすることがわかった。
【０００７】
その結果、本発明の白血球活性化因子ＬＥＣＴ２には、生物学的活性が白血球の活性化の点で共通しており、アミノ酸配列が異なる少なくとも２種類のタンパク質、すなわち、ＬＥＣＴ２ａおよびＬＥＣＴ２ｂが存在することがわかった。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列と、ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列との比較から、これらのタンパク質のアミノ酸レベルでの相同性は約９０％であることがわかっている。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列は、Ｎ末端に近い方から順に配列表の配列番号１〜５に示されている。ＬＥＣＴ２ｂの推定アミノ酸配列は配列番号６に示されている。配列番号７には、ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。配列番号６および７において、アミノ酸番号５８のＶａｌは、場合によりＩｌｅであることもあり、これは個体の遺伝的バックグラウンドによる多型と思われる。また、配列番号８は、ＬＥＣＴ２ａとＬＥＣＴ２ｂのアミノ酸配列を並記して比較するものである。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列の空白部分は、分子量がＬＥＣＴ２ａ、ＬＥＣＴ２ｂ共約１６kDa であること、アミノ酸組成が両者で非常に似ていることから、ＬＥＣＴ２ｂと高ホモロジーを示すと考えられる。
【０００８】
すなわち、本発明の白血球活性化因子は、配列表の配列番号１〜５の配列、または配列番号６の配列を有するヒトＬＥＣＴ２ポリペプチドである。さらに詳しくは、配列表の配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列をその順番で有する、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含有しないヒトＬＥＣＴ２ａポリペプチド、および配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含有しないヒトＬＥＣＴ２ｂポリペプチドである。
【０００９】
本発明は、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡにも関し、特に、ヌクレオチド配列が、配列表の配列番号７に示される配列であるヒトＬＥＣＴ２ｂ遺伝子ＤＮＡにも関する。
【００１０】
本発明はさらに、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドにも関する。さらに詳しくは、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下にマルトース結合タンパク質との融合タンパク質の形態で、マルトース結合タンパク質とＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＴＥＶプロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることができるプラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂに関する。プラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂは、E.coliＪＭ１０９株から得ることができる。また、本発明は、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡが、ＳＲαプロモーターの制御下にある、ＬＥＣＴ２ｂを高発現することが可能な組換えプラスミドにも関する。本発明は、ベクターとしてｐＧＥＸ−３Ｘを用いて得られる、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質の形態で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＸａプロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることができるプラスミドｐＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣＴ２ｂにも関する。
【００１１】
本発明は、さらに、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞、特にチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＶＩ細胞、サルＣＶＩ／２９３細胞、マウス線維芽細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ−９２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞およびヒトＳＫＷ−３細胞にも関する。
【００１２】
白血球活性化とは、好中球、単球（マクロファージ）、リンパ球の機能の活性化をいう。具体的には、好中球および単球（マクロファージ）においては、粘着能、遊走能（走化性）、貪食能、活性酸素産生能、ライソゾーム酵素放出（脱顆粒）能、細胞障害作用（がん細胞破壊作用を含む）および各種サイトカイン産生・分泌、また、リンパ球においては、抗体産生、各種サイトカイン産生・分泌、レセプターの発現である。
【００１３】
本発明の白血球活性化因子は、白血病細胞のような細胞の培養上清からタンパク質をＣＭ−セファロースで濃縮し、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ−セファロース、ＨＰＬＣによるハイドロキシアパタイト、逆相クロマトグラフィにかけることにより単品として精製することができる。
例えば、培養したＳＫＷ−３などの白血病細胞をＰＨＡ−Ｐにより刺激して培養上清中に本発明の白血球活性化因子を放出させ、この上清から、カラムクロマトグラフィなどの手法を用いて本発明の白血球活性化因子を精製することができる。
【００１４】
また、本発明の白血球活性化因子は、本発明の組換えプラスミドを用いて作製した形質転換体に産生させてもよい。本発明の組換えプラスミドは、例えばｐＭＡＬTM−Ｃ（Biolab Inc.)、またはｐＧＥＸ−３Ｘ（Pharmacia Inc.) をベクターとして用いて作製することができる。宿主細胞としては、従来公知の細菌（大腸菌など）、酵母および動物細胞を用いることができる。例えば、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＶＩ細胞、サルＣＶＩ／２９３細胞、マウス線維芽細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ−９２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞およびヒトＳＫＷ−３細胞などが挙げられる。細胞の培養、培養上清からの本発明のタンパク質の精製、組換えプラスミドの作製、形質転換の方法、さらに形質転換体からの本発明のタンパク質の採取は、当業者に公知の標準的手法を用いて実施することができる。
【００１５】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明する。
【００１６】
【実施例】
１．ＬＥＣＴ２ａの精製
試薬として、以下のものを用いた。
１）１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＤＷ
２）×５Ｒ緩衝液（２５０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４）
Ｒ緩衝液は、５０mM ＮａＰＢ、pH７．４である。
３）Ｒ５緩衝液（０．００５％ＢＳＡを含む５０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４）
Ｒ１緩衝液（０．００１％ＢＳＡを含む５０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４）
４）ＣＭ溶出緩衝液（０．７M ＮａＣｌを含むＲ１緩衝液）
【００１７】
方法
１）ＳＫＷ−３細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液に刺激剤としてＰＨＡ−Ｐ（DIFCO 社製）５μg/mlになるよう加えた中で、３７℃で２４時間、５％ＣＯ2 を含む大気中でインキュベートした。この培養上清７L を遠心により採取し、−２０℃にて凍結した。
２）上記で得られた凍結サンプル７L を、２０L の蒸留水にいれ、解凍した。
これを用いて以下の手順により本発明の白血球活性化因子を精製した。
【００１８】
部分精製
１）解凍サンプルに２００mlのＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ（Ｒ緩衝液に懸濁したもの）を加えた。
２）４℃で４時間撹拌した。
３）キリヤマロートで（フィルター５Ｂ ３シート）濾過した。
４）冷蒸留水５００mlで洗浄した。
５）さらに、１００mlのＲ５緩衝液で２回洗浄した。
６）次に、３００mlの溶出緩衝液で溶出した。
７）３L のＲ緩衝液に対して２回透析を行った。
８）２５mlのＤＥＡＥ−セファロース懸濁液を加えた。
９）４℃で２時間撹拌した。
１０）キリヤマロートで（フィルター５Ｂ ３シート）濾過した。
１１）２５mlのＲ５緩衝液で２回洗浄した。
１２）ＣＭーセファロースカラム（３mlパック）にかけた。
１３）Ｒ１緩衝液３mlで２回洗浄した。
１４）１０mlのＲ１緩衝液と１０mlの０．７M ＮａＣｌ／Ｒ１緩衝液を用いる直線グラジエントで溶出した。
１５）フラクション８〜１１を部分精製品として採取した。
【００１９】
ＨＰＬＣによる完全精製
１）部分精製２回分をまとめた。
２）サンプル２．５ml（１．２ O.D. ）をＨＰＬＣのＲＰカラム５ＴＭＳ−３００（Ｆ３９００１）（４．６×２５０mm）にかけた。
３）グラジエント：３０〜８０％Ｂ／６０分で溶出させた。〔Ａ液：０．１％テトラフロロ酢酸（ＴＦＡ）；Ｂ液：０．１％ＴＦＡを含む７５％アセトニトリル〕
４）フラクション２〜７（１６．５ml）を集めた。
５）サンプルをＶｙｄａｃ Ｃ４カラム ３０４−２１５１（６×１５０mm）にかけた。
６）グラジエント：３０〜８０％Ｂ／６０分で溶出させた。
７）４L の２５mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４で２回透析した。
８）サンプルは−８０℃に保存した。
以上の手順により精製した際のＬＥＣＴ２ａの精製を表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
分子量の決定
上記のようにして得たサンプル中のＬＥＣＴ２ａの分子量を、トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（１６．５％モノアクリルアミド／ビスアクリルアミド；３％ビス／モノアクリルアミド＋ビス）により決定した。結果を図１に示す。この結果から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したＬＥＣＴ２ａの分子量は約１６kDa であることがわかる。
【００２２】
活性の検定
１．好中球活性化
以下において、ＨＢＳＳとは、ハンクス溶液（１L 中、０．４g ＫＣｌ、８g ＮａＣｌ、０．１５g ＫＨ2 ＰＯ4 、０．２９g Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１．１g Ｄ−グルコース）である。
１）好中球走化活性
好中球走化活性測定のためのサンプルを１％ＢＳＡ、０．４％重炭酸ナトリウムを含むＨＢＳＳに溶かし、３μm のポアサイズのミリポアフィルターで仕切ったボイデンチャンバーの下室に２００μl 入れ、次いで、ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中球（２００μl ）を上室に入れ、５％ＣＯ2 インキュベーター中で、３７℃、３５分間培養し、エタノールで固定後、ヘマトキシリン溶液で染色し、好中球の移動距離を顕微鏡で測定した。その結果、５０％活性を示す濃度は４０nMであった。
【００２３】
２）好中球ライソゾーム酵素放出活性
ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中球（３７．５μl ）にサンプル１０μl を加え、場合によってサイトカラシンＢ（５μg/ml）、fMet-Leu-Phe（１０-5〜１０-11M）を加え、総量７５μl とし、３７℃で、１０分間インキュベートした。遠心（１，５００rpm 、５min ）により細胞外液と細胞に分け、細胞は０．１％トリトンＸ−１００／ＨＢＳＳを加えて混合し、破砕した。細胞外液と細胞破砕液中のライソゾーム酵素ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、β−グルクロニダーゼ（ＢＧＬ）、ラクトフェリンを以下のように測定した。
【００２４】
ａ）ＭＰＯ活性測定
基質として３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンを用い、マルチウエル用オートマチックアナライザーで６５５nmにおける吸光度の増加率より定量した。１unitは６５５nmの吸光度が１mlあたり１．０とした。
ｂ）ＢＧＬ活性測定
４−メチルウンベリフェリルβ−グルクロニドを基質としてマルチウエル用オートマチックアナライザーで３６０nm励起（excitation）、４５０nm発光（emission）の蛍光の増加率より定量した。１unitは１mlあたり１分間に１pmolの４−メチルウンベリフェロン遊離とした。
ｃ）ラクトフェリン測定
抗ヒトラクトフェリンヤギＩｇＧ（ＮＯＲ社、ＧＡＨｕ／Ｌｆｒ）を１，０００倍希釈したもの１００μl を９６ウエルプレートにまき、洗浄後、好中球からの放出外液と細胞破砕液１００μl を入れ、１時間室温でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＣＰＬ ３６１２−００８１）を１，０００倍希釈したもの１００μl を９６ウエルプレートにまき、１時間室温でインキュベートした。ペルオキシダーゼ基質と反応させ、４９２nmの吸光度を測定し、標準品より、ラクトフェリンを定量した。
以上のａ）〜ｃ）の結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
３）好中球活性酸素産生活性
ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中球（１００μl ）にフェリシトクロームｃ（１．３２mM）を１０μl 、サンプルの１０μl を加え、場合によってサイトカラシンＢ（５μg/ml）、fMet-Leu-Phe（１０-5〜１０-11M）を加え、総量２００μl とし、３７℃でインキュベートし、５５０nmの吸光度の時間あたりの変化量より活性酸素産生量を算出した。結果を表２に示す。
【００２７】
４）好中球粘着活性
ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中球（１００μl ）をスライドチャンバーにいれ、サンプルの１０μl を加え、場合によってfMet-Leu-Phe（１０-5〜１０-11M）を加え、総量１５０μl とし、５％ＣＯ2 インキュベーター中で、３７℃、１５分間培養し、粘着しなかった細胞を吸い取り、細胞数を測定した。また、スライドチャンバーはエタノールで固定後、サフラニン染色し、細胞の粘着を測定した。結果を表２に示す。
【００２８】
５）好中球膜流動性
蛍光色素ＦＩＴＣ標識のコンカナバリンＡ（ＦＳ−ＣｏｎＡ）と好中球を予め０℃で１０分間静置後、ＨＢＳＳを加えて遠心し、ＨＢＳＳ中に２×１０6 cell/ml の濃度に調製したＦＳ−ＣｏｎＡ標識ヒト好中球（１００μl ）をスライドチャンバーにいれ、サンプルの１０μl を加え、場合によってfMet-Leu-Phe（１０-8M ）を加え、総量１５０μl とし、３７℃でインキュベートしながら、細胞上の蛍光の運動をニコン倒立顕微鏡に接続した画像解析装置（ＩＭＲＡＳ）にて撮像および解析した。
【００２９】
２）単球、リンパ球の走化活性
１）の好中球走化活性とほぼ同様に行った。ただし、ミリポアフィルターは５μm のポアサイズのものを用い、７５分間インキュベートした。５０％活性を示す濃度は、単球については２２０nMで、リンパ球については４３０nMであった。
【００３０】
２．精製されたタンパク質ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列
上記のように精製したタンパク質ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列は、エドマン法でアプライドバイオシステムズ社製モデルＡＢＩにより決定した。得られた配列を配列表の配列番号１〜５に示す。
【００３１】
３．ＬＥＣＴ２ｂのクローニングおよびクローニングされたＬＥＣＴ２ｂのヌクレオチド配列の決定
ＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡのクローニングは次のようにして行った。５０μg/mlのＰＨＡ−ＰでＳＫＷ−３を処理しｐｏｌｙＡ+ ＲＮＡを調製した。５μg のｐｏｌｙＡ+ ＲＮＡを用い、ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーにしてファーストストランドｃＤＮＡ（１ｓｔ ｃＤＮＡ）を合成した。次に、決定したＬＥＣＴ２ａの部分アミノ酸配列を基にＰＣＲのプライマーを合成した。アミノ酸配列ＷＡＩＩＣＡより６種類のオリゴヌクレオチドを演繹して５´のプライマーとし、ＨＩＥＮＣＤより４種類のオリゴヌクレオチドを演繹して３´のプライマーとした。ＰＣＲ法により、１ｓｔ ｃＤＮＡを鋳型とし上記プライマーの組み合わせである２４種類の反応にてＤＮＡ断片の増幅を行った。アミノ酸配列ＤＶＬＣＳＤＧＳＴＶＹＡＰＦを基にＤＮＡプローブ（GATGTC/GCTA/GTGCTCT/CGATGGC/GTCT/CACT/AGTC/GTATGCT/CCCT/CTT ）を使い、増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離し、サザンブロットにより解析した。その結果、約３７０bpのＤＮＡ断片が検出され、それをｐＵＣ１９にクローニングした。
【００３２】
デオキシ法にて塩基配列を決定したところ、ＬＥＣＴ２ａに約９０％のホモロジーを持つペプチドをコードすることが判明した。ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、クローニングされたｃＤＮＡ断片をプローブとしてスクリーニングした。１３０万個のクローン中１２クローンの陽性クローンを得た。それぞれのクローンはすべて、制限酵素の解析により２種類に分けられることがわかり、それぞれのグループの一番長いｃＤＮＡ断片のクローンの塩基配列の決定をした。その結果、２種類のｃＤＮＡは同一の遺伝子由来で３´側に存在する２種類のｐｏｌｙＡシグナルにより生じることが推定された。また、コードされたタンパク質のアミノ酸配列よりＬＥＣＴ２ａの決定されたアミノ酸配列に約９０％のホモロジーを有することが判明し、このコードされると考えられるタンパク質をＬＥＣＴ２ｂと命名した。
【００３３】
４．ＬＥＣＴ２ｂ遺伝子を含む組換えプラスミドの構築
クローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡをもとに、５′側のプライマーとしてGGCGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAGGGGCCCTGGGCTAATATATG 、３′側のプライマートしてCGCAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAGをそれぞれ用い、熱変性：９４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長反応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にてＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させた。ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII での処理後、この断片をｐＭＡＬTM−Ｃ (Biolab Inc.) のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、ｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂと命名した。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ存在下で、ｔａｃプロモーターの制御下マルトース結合タンパク質（maltose-binding-protein ）とＬＥＣＴ２ｂの融合タンパク質を産生させることができ、その連結部分にＴＥＶプロテアーゼ（Tabacco Etch Virus由来）の切断部位が入っているので特異的な切断ができることが特徴である。
【００３４】
また、クローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡをもとに、５´側のプライマーとして GCGGGATCCCCGGGCCATGGGCTAATAT 、３´側のプライマーとして CGCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG をそれぞれ用い、熱変性：９４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長反応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にてＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させた。ＢａｍＨＩで処理後、この断片をｐＧＥＸ−３Ｘ（Pharmacia Inc.) のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、ｐＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣＴ２ｂと命名した。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ存在下で、ｔａｃプロモーターの制御下グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＬＥＣＴ２ｂの融合タンパク質を産生させることができ、その連結部分にＸａプロテアーゼの切断部位が入っているので特異的な切断ができることが特徴である。
【００３５】
５．ＬＥＣＴ２ｂ遺伝子を含む組換えプラスミドによる大腸菌の形質転換
上記のようにして得られた組換えプラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換後、得られた大腸菌クローンを、デオキシ法により期待された塩基配列を有するものに関してスクリーニングし、期待されるＤＮＡ断片を持つ大腸菌クローンＭａｌ−ＬＥＣＴ２ｂ（寄託番号ＦＥＲＭＰ−１４６６９）を得た。
【００３６】
６．動物細胞によるＬＥＣＴ２ｂの産生
ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位にＨｉｎｄIII からＥｃｏＲＩの方向でクローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡの５′側をエキソヌクレアーゼIII により−１４の塩基配列まで欠失させ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした後、ＰｓｔＩリンカーをライゲーションし、ＰｓｔＩとＢｇｌIIで切断し、発現ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９４のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この組換え発現ベクターをチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、ＬＥＣＴ２ｂを高発現する株１株（Ｃ１Ｄ８−１）（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４６６８）を得た。
分子量の決定
リコンビナントＬＥＣＴ２ｂ（動物細胞発現）は、35Ｓ−メチオニンによってメタボリックラベルし、ＣＨＯ細胞の培養上清をＳＤＳゲル電気泳動にかけることにより検出した。その結果、分子量が約１４kDa と１６kDa の２本のバンド（１６kDa が主要であり、２つのバンドはプロセッシングの違いにより生じると考えられる）が得られ、リコンビナントＬＥＣＴ２ｂの分子量はほぼＬＥＣＴ２ａの分子量約１６kDa と一致した。
活性の検定
ＬＥＣＴ２ａについて既に記載したのと同様にして、リコンビナントＬＥＣＴ２ｂの白血球活性化活性を評価した。その結果の一部を表３に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】
【発明の効果】
本発明の物質は、免疫細胞に関与する新しいサイトカイン／インターロイキンであるところから、腫瘍免疫としての治療、診断はもちろん、癌予知および癌予後の免疫反応の検出などに利用できる。また、腫瘍の治療への応用の可能性も充分考えられる。さらに、好中球をはじめとする炎症細胞に関与することから、慢性炎症にも深くかかわっていることが推定されるので、これら疾病の診断、治療をはじめ、サイトカインネットワーク機能異常、免疫不全を検出する新しい基礎研究に道を開くことができる。
【００３９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：５４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：Ｎ−末端フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
【００４０】
配列番号：２
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
【００４１】
配列番号：３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
【００４２】
配列番号：４
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
【００４３】
配列番号：５
配列の長さ：２０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
【００４４】
配列番号：６
配列の長さ：１５１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
備考：アミノ酸番号５８のVal*はIle であってもよい。
【００４５】
配列番号：７
配列の長さ：１０９２
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源：ヒト
組織の種類：肝臓
配列の特徴
特徴を表す記号：５’ＵＴＲ
存在位置：１…２００
特徴を決定した方法：Ｐ
特徴を表す記号：３’ＵＴＲ
存在位置：６５７…１０９２
特徴を決定した方法：Ｐ
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：２０１…６５６
特徴を決定した方法：Ｐ
特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ
特徴を決定した方法：Ｅ
特徴を表す記号：ｐｏｌｙＡ ｓｉｇｎａｌ
特徴を決定した方法：Ｅ
備考：アミノ酸番号５８のVal*はIle の場合もあり、その場合、ヌクレオチド番号３７２〜３７４のGTC はATC である。
【００４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＥＣＴ２ａのＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す図である。
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な構造を有するヒト由来白血球活性化タンパク質因子およびそれをコードする遺伝子ＤＮＡに関する。本発明は、上記遺伝子ＤＮＡを有する組換えプラスミド、およびそれを用いて形質転換した形質転換体にも関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
好中球が、マクロファージ、リンパ球などに加えて癌細胞破壊反応へ関与することが示唆されている。また、多くの癌組織の病理標本で好中球の癌細胞周辺への浸潤像が観察されている。これらのことは、好中球が癌細胞の分泌する走化性因子に応答した結果であると考えられる。
【０００３】
したがって、好中球、マクロファージ、リンパ球などを活性化することによって、癌細胞破壊反応の亢進やインターロイキン類の分泌の促進等が誘導され、自然免疫能が高められるので、白血球活性化因子を簡便に大量に安定的に調製することができれば、腫瘍免疫としての治療、診断、予後の判定などはもちろん、好中球、リンパ球、マクロファージの基礎研究分野での活性化機構解明の研究にも利用することができる。
【０００４】
これまでに我々は、白血球浸潤が認められる組織像を示すヒト肺巨細胞癌より樹立した細胞を用いて、この細胞が放出する好中球走化性因子インターロイキン８（ＬＵＣＴ／ＩＬ−８）を発見、精製分離し、その遺伝子をクローニングしてきた。ＩＬ−８は、分子量約８kDa の単純タンパク質で等電点は１０．３と高く、７７アミノ酸残基のものと７２アミノ酸残基からなるものの２種類が主なＩＬ−８で、双方とも同等の活性がある。ＩＬ−８は炎症性のサイトカインであることから、慢性炎症において血中に放出されることも知られている。
【０００５】
しかしながら、ＩＬ−８とは異なる好中球走化性因子が好中球と癌細胞との相互作用のメディエーターとして関与している可能性が考えられたので、新しい走化性因子を検索することが必要であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
今回、我々は、新規な白血球走化性因子を検索するに際し、白血球走化活性を指標にして各種ヒト造血器系腫瘍細胞株９７種の細胞培養液をスクリーニングした結果、Ｔ細胞白血病細胞ＳＫＷ−３の培養液中に走化性をもつタンパク質性因子を検出した。この因子を精製分離したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は約１６kDa とＩＬ−８の２倍の大きさであった。そこでアミノ酸配列を決定した結果、新しい走化性因子であることが判明し、ＬＥＣＴ２（Leukocyte-derived chemotaxin 2) 、特にＬＥＣＴ２ａと命名した。
さらにＬＥＣＴ２ａのｃＤＮＡのクローニングを試みた。部分アミノ酸配列をもとに合成したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりＬＥＣＴ２ａのｃＤＮＡの一部と考えられるｃＤＮＡ断片を増幅し、ほぼ完全長と考えられるｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列を決定したところ、完全にＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列とは一致せず高ホモロジーを示すタンパク（ＬＥＣＴ２ｂと命名）をコードすることがわかった。
【０００７】
その結果、本発明の白血球活性化因子ＬＥＣＴ２には、生物学的活性が白血球の活性化の点で共通しており、アミノ酸配列が異なる少なくとも２種類のタンパク質、すなわち、ＬＥＣＴ２ａおよびＬＥＣＴ２ｂが存在することがわかった。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列と、ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列との比較から、これらのタンパク質のアミノ酸レベルでの相同性は約９０％であることがわかっている。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列は、Ｎ末端に近い方から順に配列表の配列番号１〜５に示されている。ＬＥＣＴ２ｂの推定アミノ酸配列は配列番号６に示されている。配列番号７には、ＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。配列番号６および７において、アミノ酸番号５８のＶａｌは、場合によりＩｌｅであることもあり、これは個体の遺伝的バックグラウンドによる多型と思われる。また、配列番号８は、ＬＥＣＴ２ａとＬＥＣＴ２ｂのアミノ酸配列を並記して比較するものである。ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列の空白部分は、分子量がＬＥＣＴ２ａ、ＬＥＣＴ２ｂ共約１６kDa であること、アミノ酸組成が両者で非常に似ていることから、ＬＥＣＴ２ｂと高ホモロジーを示すと考えられる。
【０００８】
すなわち、本発明の白血球活性化因子は、配列表の配列番号１〜５の配列、または配列番号６の配列を有するヒトＬＥＣＴ２ポリペプチドである。さらに詳しくは、配列表の配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列をその順番で有する、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含有しないヒトＬＥＣＴ２ａポリペプチド、および配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含有しないヒトＬＥＣＴ２ｂポリペプチドである。
【０００９】
本発明は、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡにも関し、特に、ヌクレオチド配列が、配列表の配列番号７に示される配列であるヒトＬＥＣＴ２ｂ遺伝子ＤＮＡにも関する。
【００１０】
本発明はさらに、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡを含む組換えプラスミドにも関する。さらに詳しくは、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下にマルトース結合タンパク質との融合タンパク質の形態で、マルトース結合タンパク質とＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＴＥＶプロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることができるプラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂに関する。プラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂは、E.coliＪＭ１０９株から得ることができる。また、本発明は、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡが、ＳＲαプロモーターの制御下にある、ＬＥＣＴ２ｂを高発現することが可能な組換えプラスミドにも関する。本発明は、ベクターとしてｐＧＥＸ−３Ｘを用いて得られる、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードする遺伝子ＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質の形態で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＸａプロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることができるプラスミドｐＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣＴ２ｂにも関する。
【００１１】
本発明は、さらに、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞、特にチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＶＩ細胞、サルＣＶＩ／２９３細胞、マウス線維芽細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ−９２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞およびヒトＳＫＷ−３細胞にも関する。
【００１２】
白血球活性化とは、好中球、単球（マクロファージ）、リンパ球の機能の活性化をいう。具体的には、好中球および単球（マクロファージ）においては、粘着能、遊走能（走化性）、貪食能、活性酸素産生能、ライソゾーム酵素放出（脱顆粒）能、細胞障害作用（がん細胞破壊作用を含む）および各種サイトカイン産生・分泌、また、リンパ球においては、抗体産生、各種サイトカイン産生・分泌、レセプターの発現である。
【００１３】
本発明の白血球活性化因子は、白血病細胞のような細胞の培養上清からタンパク質をＣＭ−セファロースで濃縮し、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ−セファロース、ＨＰＬＣによるハイドロキシアパタイト、逆相クロマトグラフィにかけることにより単品として精製することができる。
例えば、培養したＳＫＷ−３などの白血病細胞をＰＨＡ−Ｐにより刺激して培養上清中に本発明の白血球活性化因子を放出させ、この上清から、カラムクロマトグラフィなどの手法を用いて本発明の白血球活性化因子を精製することができる。
【００１４】
また、本発明の白血球活性化因子は、本発明の組換えプラスミドを用いて作製した形質転換体に産生させてもよい。本発明の組換えプラスミドは、例えばｐＭＡＬTM−Ｃ（Biolab Inc.)、またはｐＧＥＸ−３Ｘ（Pharmacia Inc.) をベクターとして用いて作製することができる。宿主細胞としては、従来公知の細菌（大腸菌など）、酵母および動物細胞を用いることができる。例えば、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＶＩ細胞、サルＣＶＩ／２９３細胞、マウス線維芽細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ−９２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞およびヒトＳＫＷ−３細胞などが挙げられる。細胞の培養、培養上清からの本発明のタンパク質の精製、組換えプラスミドの作製、形質転換の方法、さらに形質転換体からの本発明のタンパク質の採取は、当業者に公知の標準的手法を用いて実施することができる。
【００１５】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明する。
【００１６】
【実施例】
１．ＬＥＣＴ２ａの精製
試薬として、以下のものを用いた。
１）１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＤＷ
２）×５Ｒ緩衝液（２５０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４）
Ｒ緩衝液は、５０mM ＮａＰＢ、pH７．４である。
３）Ｒ５緩衝液（０．００５％ＢＳＡを含む５０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４）
Ｒ１緩衝液（０．００１％ＢＳＡを含む５０mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４）
４）ＣＭ溶出緩衝液（０．７M ＮａＣｌを含むＲ１緩衝液）
【００１７】
方法
１）ＳＫＷ−３細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液に刺激剤としてＰＨＡ−Ｐ（DIFCO 社製）５μg/mlになるよう加えた中で、３７℃で２４時間、５％ＣＯ2 を含む大気中でインキュベートした。この培養上清７L を遠心により採取し、−２０℃にて凍結した。
２）上記で得られた凍結サンプル７L を、２０L の蒸留水にいれ、解凍した。
これを用いて以下の手順により本発明の白血球活性化因子を精製した。
【００１８】
部分精製
１）解凍サンプルに２００mlのＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ（Ｒ緩衝液に懸濁したもの）を加えた。
２）４℃で４時間撹拌した。
３）キリヤマロートで（フィルター５Ｂ ３シート）濾過した。
４）冷蒸留水５００mlで洗浄した。
５）さらに、１００mlのＲ５緩衝液で２回洗浄した。
６）次に、３００mlの溶出緩衝液で溶出した。
７）３L のＲ緩衝液に対して２回透析を行った。
８）２５mlのＤＥＡＥ−セファロース懸濁液を加えた。
９）４℃で２時間撹拌した。
１０）キリヤマロートで（フィルター５Ｂ ３シート）濾過した。
１１）２５mlのＲ５緩衝液で２回洗浄した。
１２）ＣＭーセファロースカラム（３mlパック）にかけた。
１３）Ｒ１緩衝液３mlで２回洗浄した。
１４）１０mlのＲ１緩衝液と１０mlの０．７M ＮａＣｌ／Ｒ１緩衝液を用いる直線グラジエントで溶出した。
１５）フラクション８〜１１を部分精製品として採取した。
【００１９】
ＨＰＬＣによる完全精製
１）部分精製２回分をまとめた。
２）サンプル２．５ml（１．２ O.D. ）をＨＰＬＣのＲＰカラム５ＴＭＳ−３００（Ｆ３９００１）（４．６×２５０mm）にかけた。
３）グラジエント：３０〜８０％Ｂ／６０分で溶出させた。〔Ａ液：０．１％テトラフロロ酢酸（ＴＦＡ）；Ｂ液：０．１％ＴＦＡを含む７５％アセトニトリル〕
４）フラクション２〜７（１６．５ml）を集めた。
５）サンプルをＶｙｄａｃ Ｃ４カラム ３０４−２１５１（６×１５０mm）にかけた。
６）グラジエント：３０〜８０％Ｂ／６０分で溶出させた。
７）４L の２５mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４で２回透析した。
８）サンプルは−８０℃に保存した。
以上の手順により精製した際のＬＥＣＴ２ａの精製を表１に示す。
【００２０】
【表１】
分子量の決定
上記のようにして得たサンプル中のＬＥＣＴ２ａの分子量を、トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（１６．５％モノアクリルアミド／ビスアクリルアミド；３％ビス／モノアクリルアミド＋ビス）により決定した。結果を図１に示す。この結果から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したＬＥＣＴ２ａの分子量は約１６kDa であることがわかる。
【００２２】
活性の検定
１．好中球活性化
以下において、ＨＢＳＳとは、ハンクス溶液（１L 中、０．４g ＫＣｌ、８g ＮａＣｌ、０．１５g ＫＨ2 ＰＯ4 、０．２９g Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、１．１g Ｄ−グルコース）である。
１）好中球走化活性
好中球走化活性測定のためのサンプルを１％ＢＳＡ、０．４％重炭酸ナトリウムを含むＨＢＳＳに溶かし、３μm のポアサイズのミリポアフィルターで仕切ったボイデンチャンバーの下室に２００μl 入れ、次いで、ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中球（２００μl ）を上室に入れ、５％ＣＯ2 インキュベーター中で、３７℃、３５分間培養し、エタノールで固定後、ヘマトキシリン溶液で染色し、好中球の移動距離を顕微鏡で測定した。その結果、５０％活性を示す濃度は４０nMであった。
【００２３】
２）好中球ライソゾーム酵素放出活性
ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中球（３７．５μl ）にサンプル１０μl を加え、場合によってサイトカラシンＢ（５μg/ml）、fMet-Leu-Phe（１０-5〜１０-11M）を加え、総量７５μl とし、３７℃で、１０分間インキュベートした。遠心（１，５００rpm 、５min ）により細胞外液と細胞に分け、細胞は０．１％トリトンＸ−１００／ＨＢＳＳを加えて混合し、破砕した。細胞外液と細胞破砕液中のライソゾーム酵素ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、β−グルクロニダーゼ（ＢＧＬ）、ラクトフェリンを以下のように測定した。
【００２４】
ａ）ＭＰＯ活性測定
基質として３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンを用い、マルチウエル用オートマチックアナライザーで６５５nmにおける吸光度の増加率より定量した。１unitは６５５nmの吸光度が１mlあたり１．０とした。
ｂ）ＢＧＬ活性測定
４−メチルウンベリフェリルβ−グルクロニドを基質としてマルチウエル用オートマチックアナライザーで３６０nm励起（excitation）、４５０nm発光（emission）の蛍光の増加率より定量した。１unitは１mlあたり１分間に１pmolの４−メチルウンベリフェロン遊離とした。
ｃ）ラクトフェリン測定
抗ヒトラクトフェリンヤギＩｇＧ（ＮＯＲ社、ＧＡＨｕ／Ｌｆｒ）を１，０００倍希釈したもの１００μl を９６ウエルプレートにまき、洗浄後、好中球からの放出外液と細胞破砕液１００μl を入れ、１時間室温でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＣＰＬ ３６１２−００８１）を１，０００倍希釈したもの１００μl を９６ウエルプレートにまき、１時間室温でインキュベートした。ペルオキシダーゼ基質と反応させ、４９２nmの吸光度を測定し、標準品より、ラクトフェリンを定量した。
以上のａ）〜ｃ）の結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
３）好中球活性酸素産生活性
ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中球（１００μl ）にフェリシトクロームｃ（１．３２mM）を１０μl 、サンプルの１０μl を加え、場合によってサイトカラシンＢ（５μg/ml）、fMet-Leu-Phe（１０-5〜１０-11M）を加え、総量２００μl とし、３７℃でインキュベートし、５５０nmの吸光度の時間あたりの変化量より活性酸素産生量を算出した。結果を表２に示す。
【００２７】
４）好中球粘着活性
ＨＢＳＳ中に２×１０6 cells/mlの濃度に調製したヒト好中球（１００μl ）をスライドチャンバーにいれ、サンプルの１０μl を加え、場合によってfMet-Leu-Phe（１０-5〜１０-11M）を加え、総量１５０μl とし、５％ＣＯ2 インキュベーター中で、３７℃、１５分間培養し、粘着しなかった細胞を吸い取り、細胞数を測定した。また、スライドチャンバーはエタノールで固定後、サフラニン染色し、細胞の粘着を測定した。結果を表２に示す。
【００２８】
５）好中球膜流動性
蛍光色素ＦＩＴＣ標識のコンカナバリンＡ（ＦＳ−ＣｏｎＡ）と好中球を予め０℃で１０分間静置後、ＨＢＳＳを加えて遠心し、ＨＢＳＳ中に２×１０6 cell/ml の濃度に調製したＦＳ−ＣｏｎＡ標識ヒト好中球（１００μl ）をスライドチャンバーにいれ、サンプルの１０μl を加え、場合によってfMet-Leu-Phe（１０-8M ）を加え、総量１５０μl とし、３７℃でインキュベートしながら、細胞上の蛍光の運動をニコン倒立顕微鏡に接続した画像解析装置（ＩＭＲＡＳ）にて撮像および解析した。
【００２９】
２）単球、リンパ球の走化活性
１）の好中球走化活性とほぼ同様に行った。ただし、ミリポアフィルターは５μm のポアサイズのものを用い、７５分間インキュベートした。５０％活性を示す濃度は、単球については２２０nMで、リンパ球については４３０nMであった。
【００３０】
２．精製されたタンパク質ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列
上記のように精製したタンパク質ＬＥＣＴ２ａのアミノ酸配列は、エドマン法でアプライドバイオシステムズ社製モデルＡＢＩにより決定した。得られた配列を配列表の配列番号１〜５に示す。
【００３１】
３．ＬＥＣＴ２ｂのクローニングおよびクローニングされたＬＥＣＴ２ｂのヌクレオチド配列の決定
ＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡのクローニングは次のようにして行った。５０μg/mlのＰＨＡ−ＰでＳＫＷ−３を処理しｐｏｌｙＡ+ ＲＮＡを調製した。５μg のｐｏｌｙＡ+ ＲＮＡを用い、ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーにしてファーストストランドｃＤＮＡ（１ｓｔ ｃＤＮＡ）を合成した。次に、決定したＬＥＣＴ２ａの部分アミノ酸配列を基にＰＣＲのプライマーを合成した。アミノ酸配列ＷＡＩＩＣＡより６種類のオリゴヌクレオチドを演繹して５´のプライマーとし、ＨＩＥＮＣＤより４種類のオリゴヌクレオチドを演繹して３´のプライマーとした。ＰＣＲ法により、１ｓｔ ｃＤＮＡを鋳型とし上記プライマーの組み合わせである２４種類の反応にてＤＮＡ断片の増幅を行った。アミノ酸配列ＤＶＬＣＳＤＧＳＴＶＹＡＰＦを基にＤＮＡプローブ（GATGTC/GCTA/GTGCTCT/CGATGGC/GTCT/CACT/AGTC/GTATGCT/CCCT/CTT ）を使い、増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離し、サザンブロットにより解析した。その結果、約３７０bpのＤＮＡ断片が検出され、それをｐＵＣ１９にクローニングした。
【００３２】
デオキシ法にて塩基配列を決定したところ、ＬＥＣＴ２ａに約９０％のホモロジーを持つペプチドをコードすることが判明した。ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、クローニングされたｃＤＮＡ断片をプローブとしてスクリーニングした。１３０万個のクローン中１２クローンの陽性クローンを得た。それぞれのクローンはすべて、制限酵素の解析により２種類に分けられることがわかり、それぞれのグループの一番長いｃＤＮＡ断片のクローンの塩基配列の決定をした。その結果、２種類のｃＤＮＡは同一の遺伝子由来で３´側に存在する２種類のｐｏｌｙＡシグナルにより生じることが推定された。また、コードされたタンパク質のアミノ酸配列よりＬＥＣＴ２ａの決定されたアミノ酸配列に約９０％のホモロジーを有することが判明し、このコードされると考えられるタンパク質をＬＥＣＴ２ｂと命名した。
【００３３】
４．ＬＥＣＴ２ｂ遺伝子を含む組換えプラスミドの構築
クローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡをもとに、５′側のプライマーとしてGGCGAATTCGAAAACCTGTATTTTCAGGGGCCCTGGGCTAATATATG 、３′側のプライマートしてCGCAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAGをそれぞれ用い、熱変性：９４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長反応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にてＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させた。ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII での処理後、この断片をｐＭＡＬTM−Ｃ (Biolab Inc.) のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、ｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂと命名した。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ存在下で、ｔａｃプロモーターの制御下マルトース結合タンパク質（maltose-binding-protein ）とＬＥＣＴ２ｂの融合タンパク質を産生させることができ、その連結部分にＴＥＶプロテアーゼ（Tabacco Etch Virus由来）の切断部位が入っているので特異的な切断ができることが特徴である。
【００３４】
また、クローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡをもとに、５´側のプライマーとして GCGGGATCCCCGGGCCATGGGCTAATAT 、３´側のプライマーとして CGCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG をそれぞれ用い、熱変性：９４℃、１分間、アニーリング：５５℃、２分間、伸長反応：７２℃、３分間、の２５サイクルのＰＣＲ法にてＬＥＣＴ２ｂのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅させた。ＢａｍＨＩで処理後、この断片をｐＧＥＸ−３Ｘ（Pharmacia Inc.) のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この組換えプラスミドを、ｐＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣＴ２ｂと命名した。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ存在下で、ｔａｃプロモーターの制御下グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＬＥＣＴ２ｂの融合タンパク質を産生させることができ、その連結部分にＸａプロテアーゼの切断部位が入っているので特異的な切断ができることが特徴である。
【００３５】
５．ＬＥＣＴ２ｂ遺伝子を含む組換えプラスミドによる大腸菌の形質転換
上記のようにして得られた組換えプラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換後、得られた大腸菌クローンを、デオキシ法により期待された塩基配列を有するものに関してスクリーニングし、期待されるＤＮＡ断片を持つ大腸菌クローンＭａｌ−ＬＥＣＴ２ｂ（寄託番号ＦＥＲＭＰ−１４６６９）を得た。
【００３６】
６．動物細胞によるＬＥＣＴ２ｂの産生
ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位にＨｉｎｄIII からＥｃｏＲＩの方向でクローニングされたＬＥＣＴ２ｂ ｃＤＮＡの５′側をエキソヌクレアーゼIII により−１４の塩基配列まで欠失させ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした後、ＰｓｔＩリンカーをライゲーションし、ＰｓｔＩとＢｇｌIIで切断し、発現ベクターｐｃＤＬ−ＳＲα２９４のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この組換え発現ベクターをチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、ＬＥＣＴ２ｂを高発現する株１株（Ｃ１Ｄ８−１）（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４６６８）を得た。
分子量の決定
リコンビナントＬＥＣＴ２ｂ（動物細胞発現）は、35Ｓ−メチオニンによってメタボリックラベルし、ＣＨＯ細胞の培養上清をＳＤＳゲル電気泳動にかけることにより検出した。その結果、分子量が約１４kDa と１６kDa の２本のバンド（１６kDa が主要であり、２つのバンドはプロセッシングの違いにより生じると考えられる）が得られ、リコンビナントＬＥＣＴ２ｂの分子量はほぼＬＥＣＴ２ａの分子量約１６kDa と一致した。
活性の検定
ＬＥＣＴ２ａについて既に記載したのと同様にして、リコンビナントＬＥＣＴ２ｂの白血球活性化活性を評価した。その結果の一部を表３に示す。
【００３７】
【表３】
【発明の効果】
本発明の物質は、免疫細胞に関与する新しいサイトカイン／インターロイキンであるところから、腫瘍免疫としての治療、診断はもちろん、癌予知および癌予後の免疫反応の検出などに利用できる。また、腫瘍の治療への応用の可能性も充分考えられる。さらに、好中球をはじめとする炎症細胞に関与することから、慢性炎症にも深くかかわっていることが推定されるので、これら疾病の診断、治療をはじめ、サイトカインネットワーク機能異常、免疫不全を検出する新しい基礎研究に道を開くことができる。
【００３９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：５４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：Ｎ−末端フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
配列番号：２
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
配列番号：３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
配列番号：４
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
配列番号：５
配列の長さ：２０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
フラグメント型：中間部フラグメント
起源：ヒト
細胞の種類：Ｔ細胞系白血病癌細胞
セルライン：ＳＫＷ−３
配列番号：６
配列の長さ：１５１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
【００４５】
配列番号：７
配列の長さ：１０９２
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
起源：ヒト
組織の種類：肝臓
配列の特徴
特徴を表す記号：５’ＵＴＲ
存在位置：１…２００
特徴を決定した方法：Ｐ
特徴を表す記号：３’ＵＴＲ
存在位置：６５７…１０９２
特徴を決定した方法：Ｐ
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：２０１…６５６
特徴を決定した方法：Ｐ
特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ
特徴を表す記号：ｐｏｌｙＡ ｓｉｇｎａｌ
【００４６】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＥＣＴ２ａのＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す図である。
Claims (10)
- 白血球活性化作用を有し、約１６ｋＤａの分子量を有し、かつ配列表の配列番号８の１９〜７２位、７４〜８３位、９３〜１０１位、１１０〜１１４位および１２９〜１４８位のアミノ酸配列が、それぞれ配列表の配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列である、単離されたヒトＬＥＣＴ２ａポリペプチド。
- 配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる、ヒトＬＥＣＴ２ｂポリペプチド。
- 請求項２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
- ヌクレオチド配列が、配列表の配列番号７に示される配列である、請求項３記載のＤＮＡ。
- 配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド。
- 組換えプラスミドが、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下にマルトース結合タンパク質との融合タンパク質の形態で、マルトース結合タンパク質とＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＴＥＶプロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることができるプラスミドｐＭＡＬ−ＴＥＶ−ＬＥＣＴ２ｂである、請求項５記載の組換えプラスミド。
- ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡが、ＳＲαプロモーターの制御下にある、請求項５記載の組換えプラスミド。
- 組換えプラスミドが、ヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡを、ｔａｃプロモーターの制御下にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質の形態で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとＬＥＣＴ２ｂとの連結部位にＸａプロテアーゼの切断部位を入れた形で発現させることができるプラスミドｐＧＥＸ−Ｘａ−ＬＥＣＴ２ｂである、請求項５記載の組換えプラスミド。
- 配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するヒトＬＥＣＴ２ｂをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドにより形質転換された宿主細胞。
- 宿主細胞が、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、サルＣＶＩ細胞、サルＣＶＩ／２９３細胞、マウス線維芽細胞、マウスＣ１２７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ−９２９細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、またはヒトＳＫＷ−３細胞である、請求項９記載の宿主細胞。
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