-
Hintergrund der Erfindung
-
1. Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Strukturen von neuen humane Leukozyten
aktivierenden Proteinen und das Protein codierende DNA. Die Erfindung
betrifft ebenfalls rekombinante Plasmide und die Transformanten.
-
2. Stand der
Technik
-
Neutrophile
wandern in Antwort auf zunehmende Konzentrationen von chemotaktischen
Faktoren, die von entzündlichen
Stellen freigesetzt werden. Aktivierte Neutrophile werden aus dem
Blut durch die Gefäßwand zu
der infizierten Stelle gelockt und phagozytieren eindringende Bakterien
oder Viren. Die Phagosomen verschmelzen mit Lysosomen, und die lysosomalen
Enzyme und aktiven Sauerstoffradikale töten die Eindringlinge ab. Somit
spielen die aus entzündlichen
Stellen freigesetzten chemotaktischen Faktoren eine wichtige Rolle
bei der Aktivierung von Neutrophilen-Funktionen. Nach der Reaktion
durch Neutrophile bei einer akuten Entzündung sind Monozyten und Lymphozyten
an der Immunreaktion beteiligt. Zusätzlich zu anderen Immunzellen
einschließlich
von zytotoxischen Lymphozyten, NK-Zellen und Makrophagen zeigen
Neutrophile eine zytotoxische Aktivität gegenüber Tumorzellen in vitro. In
ihrer tumoriziden Wirkungsweise wandern Immunzellen auch zu Tumor-Wachstums-Stellen,
was nahe legt, dass Tumorzellen auch einen chemotaktischen Faktor für die Immunzellen
bilden. In dieser Hinsicht wurde nachgewiesen, dass neoplastische,
aus der Maus und dem Menschen stammende Zellen chemotaktische Faktoren
bilden, welche die Makrophagen-Infiltration in Tumorgeweben vermitteln.
Dann identifizierten wir auch LUCT/IL-8, das konstitutiv von der
Karzinom-Zelllinie LU65C sezerniert wurde (K. Suzuki et al., J.
Exp. Med., 169, 1895-1901, 1989). Die Zellen wurden aus humanem
Lungenkarzinomgewebe, das von zahlreichen Neutrophilen infiltriert
war, gewonnen. Die Myeloid-Leukämie-Zelllinie
ML-1 und Gliom-Zellen bilden ebenfalls konstitutiv LUCT/IL-8 (K.
Suzuki et al., Immunol. Lett. 36, 71-82, 1993). Die Kulturflüssigkeiten
von 97 humanen Leukämie-Zelllinien
wurden gescreent, um nach einem neuen chemotaktischen Protein zu
suchen. Danach wurde diese Erfindung bewerkstelligt.
-
Neutrophile
scheinen, zusätzlich
zu Makrophagen und Lymphozyten, Krebszellen zu schädigen. Darüber hinaus
werden einige histologische Gewebe von Krebsgeweben mit Neutrophilen
infiltriert. Von diesen wird angenommen, dass Neutrophile auf chemotaktische
Faktoren, die von Zellen in diesen Geweben sezerniert werden, reagieren.
-
Die
Sekretion von Interleukinen und die Beschädigung von Tumorzellen werden
durch die Aktivierung von Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten
induziert. Mithin werden sowohl natürliche als auch erworbene Immunitäten verstärkt. Wenn
die Leukozyten-aktivierenden Faktoren mit großtechnischen und einfachen Verfahrensweisen
gereinigt werden, werden jene für
Diagnose, Therapie und Bestimmung nach einer Behandlung verwendet.
Weiterhin sind diese auch nützlich
für die
Grundlagenforschung bei Aktivierungsmechanismen von Neutrophilen,
Makrophagen und Lymphozyten.
-
Wir
fanden einen Neutrophilen-chemotaktischen Faktor, Interleukin 8
(LUCT/IL-8), aus einer Kulturflüssigkeit
von Zellen, die aus humanen Riesenkarzinomzellen gewonnen worden
waren. Danach reinigten wir den Faktor (Protein) und klonierten
das Gen. IL-8 ist ein etwa 8 kDa großes pures Protein mit einem
pl von 10,3. Zwei Arten von Protein, 77-Aminosäure-Protein und 72-Aminosäure-Protein,
werden in IL-8 klassifiziert und besitzen die chemotaktischen Aktivitäten mit
der gleichen spezifischen Aktivität. Darüber hinaus ist IL-8 ein Entzündungs-Cytokin
und wird im Serum von Patienten mit chronischer Entzündung nachgewiesen.
-
Jedoch
dachte man, dass von IL-8 verschiedener Neutrophilen-chemotaktischer
Faktor mit der Wechselwirkung zwischen Neutrophilen und Krebszellen
zusammenhängt.
-
Die
Erfinder berichteten zuvor von der Reinigung eines Chemotaxins (T)
aus humaner Leukämie-Zellkulturflüssigkeit
(YAMAGOE ET AL, September 1993, Journal of Interferon Research,
Bd. 13, Suppl. Nr. 1).
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
Kulturflüssigkeiten
von 97 humanen Leukämie-Zelllinien
wurden gescreent, um nach einem neuen chemotaktischen Protein zu
suchen. Das Neutrophilen-chemotaktische Protein wurde in einer Kulturflüssigkeit der
PHA-aktivierten humanen T-Zell-Leukämiezelllinie
SKW-3 nachgewiesen. Das Protein wurde gereinigt, und seine Molekülgröße wurde
mit Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PA-GE) als 16 kDa bestimmt,
was die doppelte Größe im Vergleich
mit derjenigen von IL-8 ist. Die Aminosäuresquenz-Analyse ergab, dass
das chemotaktische Protein ein neues Protein ist, welches als LECT2a
bezeichnet wird (von Leukozytenzellen abgeleitetes Chemotaxin 2a).
Außerdem
wurde das Klonieren von LECT2a-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) auf Basis der teilweisen Aminosäuresequenzen durchgeführt. Danach
wurde die cDNA, codierend ein Protein, welches eine höhere Homologie
mit LECT2a hatte, isoliert. Das codierte Protein wurde als LECT2b
bezeichnet.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass der Neutrophilen-aktivierende Faktor LECT2
zwei Arten von Proteinen, LECT2a und LECT2b, beinhaltet, welche
bezüglich
der Leukozytenaktivierung identisch sind, aber eine untereinander
unterschiedliche Aminosäuresequenz
aufweisen. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von LECT2a mit derjenigen,
die von LECT2b codierender cDNA abgeleitet wurde, zeigt eine 86
% homologe Sequenz. Die Aminosäuresequenzen
von LECT2a sind in der Sequenz ID Nr. 1 bis 5 in der Orientierung
vom N-Terminus ausgehend gezeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz
von LECT2b wird in der Sequenz ID Nr. 6 in der Orientierung vom
N-Terminus aus gezeigt. Die Sequenz ID Nr. 7 zeigt sowohl die cDNA-Nukleotidsequenz
als auch die abgeleitete Aminosäuresequenz
von LECT2b. Aminosäure
Nummer 58 Val in den Sequenz ID Nrn. 6 und 7 kann durch Ile ersetzt
sein. Dann ist CTC in der Nukleotidsequenz ID Nr. 372-374 ATC. Dies scheint
auf einen Polymorphismus zwischen Individuen zurückzuführen zu sein. Beim Vergleich
von Aminosäuresequenzen
von LECT2a und LECT2b miteinander gibt es signifikante Überlappungen
zwischen diesen. Es wird angenommen, dass die reine Sequenz von
LECT2a eine höhere
Homologie mit jener von LECT2b aufweist, weil die Molekülgröße von 16
kDa und die Aminosäurekomponente
nahezu identisch sind.
-
Die
Erfindung betrifft humanes LECT2b-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz,
wie sie als Sequenz ID Nr. 6 im Sequenzprotokoll gezeigt ist.
-
Diese
Erfindung betrifft auch genomische DNA, welche humanes LECT2b mit
der Aminosäuresequenz
in der Sequenz ID Nr. 6 in dem Sequenzprotokoll codiert. Es wird
auch eine Nukleotidsequenz der Erfindung beschrieben, wobei die
genomische DNA-Sequenz
in der Sequenz ID Nr. 7 im Sequenzprotokoll gezeigt wird.
-
Diese
Erfindung betrifft auch das rekombinante Plasmid, das humanes LECT2b
mit der Aminosäuresequenz
in der Sequenz ID Nr. 6 im Sequenzprotokoll codiert. Die Erfindung
betrifft auch das Plasmid pMAL-TEV-LECT2b, das Fusionsprotein produziert.
Die für
das LECT2b-Protein codierende Nukleotidsequenz wurde stromabwärts der
Maltose-Bindungs-Protein-Region im pMAL-c-Vektor ligiert. Danach
kann das fusionierte Protein durch Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)
induziert werden.
-
Dieses
Konstrukt weist eine TEV-Protease-Erkennungsstelle auf, welche sich
zwischen Maltose-bindendem Protein und LECT2b befindet. Das Plasmid
pMAL-TEV-LECT2b kann von dem E. coli Mal-LECT2b-Stamm erhalten werden
(hinterlegt am NATIONAL INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND HUMAN-TECHNOLOGY,
Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, unter FERM P-14669, und übertragen
zur internationalen Hinterlegung unter FERM BP-5302 am 24. November 1995 gemäß des Budapester
Abkommens). Die für
das LECT2b-Protein codierende Nukleotidsequenz wurde stromabwärts einer
Glutathion-S-Transferase-Region
im pGEX-3X-Vektor ligiert. Die Bildung des Fusionsproteins kann
durch IPTG-Behandlung induziert werden. Dieses Konstrukt weist eine Xa-Protease-Erkennungsstelle
auf, welche sich zwischen Glutathion-S-transferase und LECT2b befindet.
Des Weiteren betrifft die Erfindung auch rekombinante Plasmid-DNA,
die mit dem SRalpha-Promotor reguliertes humanes LECT2b codiert,
welcher LECT2b stark exprimieren kann.
-
Die
Erfindung betrifft auch transformierte Zellen, die insbesondere
durch Transformation in E. coli, Hefe, Insektenzellen, Tierzellen,
wie Chinesischer-Hamster-CHO-Zellen, Affen-CVI-Zellen, Affen-CVI/293-Zellen, Mausfibroblasten-Zellen,
Maus-C127-Zellen, Maus-3T3-Zellen, Maus-L-929-Zellen, humane HeLa-Zellen
und humane SKW-3-Zellen erhalten wurden, welche das rekombinante
Plasmid exprimieren können,
welches humanes LECT2b mit der Aminosäuresequenz in der Sequenz ID
Nr. 6 im Sequenzprotokoll codiert.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnung
-
Die 1 zeigt
die Bestimmung der Molekülgröße von LECT2a,
und die Molekülgröße von LECT2a wurde
durch Tricin-SDS-PAGE mit 16,5 % Monoacrylamid-Bisacrylamid 3 %
Bis-/Bis-haltiges Monoacrylamid bestimmt.
-
Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsform
-
Die
Leukozytenaktivierung zeigt die Funktionen von Neutrophilen, Monozyten
(Makrophagen), Lymphozyten wie folgt an. Die Funktionen von Neutrophilen
und Monozyten (Makrophagen) sind wie folgt: Adhäsion, Migration (Chemotaxis),
Phagozytose, Superoxidbildung, Freisetzung von lysosomalen Proteinen/Enzymen
(Degranulation), Zellabtötung
verbunden mit tumorizider Aktivität und Erzeugung verschiedener
Zytokine. Die Funktionen von Lymphozyten sind wie folgt: Sekretion
von Immunoglobulinen, verschiedenen Cytokinen und Expression verschiedener
Rezeptoren.
-
Das
Neutrophilen-aktivierende Protein kann aus einer Kulturflüssigkeit
von Leukämiezellen
durch Konzentrierung mit CM-Sepharose (Handelsname, erhältlich von
Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) und DEAE-Sepharose (Handelsname,
erhältlich
von Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), CM-Sepharose-Säulenchromatographie,
Hydroxylapatitchromatographie auf Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)
und Umkehrphasen-Säulenchromatographie
auf HPLC gereinigt werden. Zum Beispiel wurden SKW-3-Zellen in RPMI-1640-Medium
(Handelsname, erhältlich
von GIBCO BRL, Grand Island, NY), ergänzt mit 10 % fötalem Kalbserum
(FCS) (erhältlich
von GIBCO BRL), gehalten. SKW-3-Zellen und andere Leukämiezellen
wurden mit PHA-P (Handelsname, erhältlich von DIFCO Laboratories,
Detroit, MI) stimuliert und der in der Erfindung beschriebene Leukozyten
aktivierende Faktor kann aus dieser Kulturflüssigkeit mit Hilfe von Säulenchromatographie
etc. gereinigt werden.
-
Außerdem kann
der Neutrophilen-aktivierende Faktor durch die Transformante mit
dem rekombinanten Plasmid des Faktors hergestellt werden. Das rekombinante
Plasmid kann mit einem Vektor, zum Beispiel pMAL-c (Handelsname,
erhältlich
von Biolab Inc.) oder pGEX-3X (Handelsname, erhältlich von Pharmacia Inc.)
konstruiert werden. Tierzellen, Hefe und Bakterien können als
transformierte Zellen verwendet werden, zum Beispiel Chinesischer-Hamster-CHO-Zellen,
Affen-CVI-Zellen, Affen-CVI/293-Zellen, Mausfibroblasten-Zellen,
Maus-C127-Zellen, Maus-3T3-Zellen, Maus-L-929-Zellen, humane HeLa-Zellen
und humane SKW-3-Zellen. Die Zellkultur, Reinigung dieser aktivierenden
Proteine, Konstruktion rekombinanter Plasmide, Transformation und
die Reinigung des Proteins aus der Transformante werden durch gebräuchliche
Verfahrensweisen durchgeführt.
-
Beispiele
-
Eine
Erläuterung
praktischer Beispiele wird nachstehend gezeigt:
-
1. Verfahrensweisen zur
Reinigung von LECT2a
-
Materialien
wurden wie folgt vennrendet:
- 1) 1 % Rinderserumalbumin
(BSA, erhältlich
von Diagnostics, Kankakee, IL) in entionisiertem und destilliertem
Wasser (DDW).
- 2) R-Puffer: 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4
- 3) R5-Puffer: R-Puffer, enthaltend 0,005 % BSA. R1-Puffer: R-Puffer,
enthaltend 0,001 % BSA.
- 4) CM-Elutionspuffer: R1-Puffer, enthaltend 0,7 M NaCl
-
- 1) SKW-3-Zellen wurden 24 Stunden lang bei
37°C in
einem 5%-CO2-Inkubator in einer 500-ml-Glas-Rollkulturflasche
(erhältlich
von GIBCO BRL) in Gegenwart von PHA-P in einer Konzentration von
5 μg/ml
kultiviert. Die Kulturflüssigkeit
wurde durch Zentrifugieren bei 400 x g während 15 min bei 4°C gewonnen.
Der Überstand
(7 Liter) der Kulturflüssigkeit
wurde in 500-ml-Aliquots aufgeteilt und bei –80°C gelagert.
- 2) Kaltes DDW (20 Liter) wurde in den gefrorenen Überstand
(7 Liter) zum Auftauen der Probe gegeben. Die Probe wurde zur Reinigung
des in der Erfindung beschriebenen, Leukozyten-aktivierenden Faktors
verwendet.
-
Teilweise Reinigung von
LECT2a
-
- 1) Nachdem die Kulturflüssigkeit aufgetaut war, wurde
sie mit 200 ml CM-Sepharose CL-6B (erhältlich von Pharmacia Biotech,
Uppsala, Schweden), welche mit R1 äquilibriert worden war, (100
ml Füllvolumen)
vermischt.
- 2) Die Mischung wurde 4 Stunden lang bei 4°C gerührt.
- 3) Diese wurde durch einen "KIRIYAMAROHTO
SU-95"-Trichter
(Handelsname, erhältlich
von Kiriyama, Tokyo, Japan) mit 3 Blättern Filterpapier Nr. 5B (95
mm Durchmesser; erhältlich
von Kiriyama) filtriert.
- 4) CM-Sepharose-Gel wurde aufeinanderfolgend mit 500 ml kaltem
DDW gewaschen.
- 5) Danach wurde es zweimal mit 100 ml R5 gewaschen.
- 6) Das Gel wurde langsam mit 50 ml R5, ergänzt mit 0,7 M NaCl, eluiert.
- 7) Diese Elution wurde 6 Mal wiederholt.
- 8) Das vereinigte Eluat wurde dialysiert gegen R unter Verwendung
von Spectra/Por 3 (Handelsname, erhältlich von Spectrum, Houston,
TX), das mit R5 gespült
worden war.
- 9) Eine DEAE-Sepharose (Handelsname, erhältlich von Pharmacia Biotech)-Suspension (12 ml
Füllvolumen), äquilibriert
mit R5, wurde dem Dialysat zugegeben. 10) Die Mischung wurde 2 Stunden
lang bei 4°C gerührt.
- 11) Und anschließend
wurde diese durch einen "KIRIYAMAROHTO
SU-95"-Trichter
mit 3 Blättern
R5-gespültem
Filterpapier Nr. 5B (95 mm Durchmesser) filtriert.
- 12) Das Gel wurde mit 25 ml kaltem R5 gewaschen.
- 13) Die Durchlauf-Fraktion der DEAE-Sepharose wurde erneut auf
die zweite CM-Sepharose-Säule, äquilibriert
mit R5, aufgetragen (3 ml Füllvolumen
in einer Econo-Säule, Handelsname,
erhältlich
von Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan).
- 14) Die Säule
wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 ml R1-Puffer
und 10 ml R1-Puffer, enthaltend 0,7 M NaCl bei 4°C bei einer Fließrate von
10 ml/Stunde, eluiert.
- 15) Fraktionen, die chemotaktische Aktivität enthielten, (Nrn. 8-11) wurden
als der teilweise gereinigte Hauptbestandteil verwendet.
-
Vollständige Reinigung mit Säulenchromatographie
auf HPLC
-
- 1) Die gereinigten Proben, die zweimal wiederholt
wurden, wurden vereinigt.
- 2) Die vereinigte Probe (2,5 ml, 1,2 O.D.), die Neutrophilen-chemotaktische
Aktivität
enthielt, wurde auf eine Umkehrphasensäule (Handelsname, erhältlich von
Vydac, C4-Säule 304-2151,
4,5 × 250
mm) auf HPLC aufgebracht.
- 3) Die Säule
wurde mit 22,5 % bis 60 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % Tetrafluoressigsäure (TFA),
mit einer Strömungsrate
von 0,5 ml/min eluiert.
- 4) Schließlich
wurden die aktiven Fraktionen erneut mit der gleichen Umkehrphasensäule in dem
gleichen Acetonitril-Gradienten, welcher 0,05 % Hexafluorbuttersäure an Stelle
von 0,1 % TFA enthielt, chromatographiert.
- 5) Das Eluat wurde vereinigt und zweimal gegen 25 mM Natriumphosphatpuffer,
pH-Wert 7,4, dialysiert.
- 6) Das Eluat wurde bei –80°C aufbewahrt.
-
Die
Reinigung von LECT2a ist in der Tabelle 1 gezeigt.
-
Tabelle
1. Reinigung von LECT2a aus SKW-3
-
- * Dieser Schritt repräsentiert
die Resultate von zwei Chromatografien unter verschiedenen Bedingungen.
-
Bestimmung der Molekülgröße von LECT2a
-
Die
Molekülgröße von LECT2a
wurde durch Tricin-SDS-PAGE mit 16,5 % Monoacrylamid-Bisacrylamid
: 3 % Bis-/Bis-haltiges Monoacrylamid bestimmt. Das Ergebnis ist
in 1 gezeigt. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Molekülgröße von LECT2a
etwa 16 kDa beträgt.
-
1. Neutrophilen-Aktivierung
-
- Hank's balancierte
Salzlösung
(HBSS) enthielt 0,4 g KCl, 8 g NaCl, 0,15 g KH2PO4, 0,29 g Na2HPO4-7H2O und 1 g Glucose
in 1 Liter DDW.
-
1) Chemotaktische Aktivität für Neutrophile
-
Die
Probe für
den Assay wurde in das untere Abteil einer Boyden-Kammer eingebracht
und es wurde ein 3,0-μm-Filter
(Millipore, Handelsname, erhältlich
von Bedford, MA) darauf gelegt. Dann wurden humane Neutrophile,
die in Medium suspendiert waren (2 × 106 Zellen/ml),
für den
Chemotaxis-Assay auf den Filter im oberen Abteil gegeben. Die Kammern
wurden dann 35 min lang bei 37°C
in einer befeuchteten 5%igen CO2-Atmosphäre inkubiert.
Der Vorderkantenabstand der Zellen von der Oberfläche des
Filters war der Mittelwert der fünf
mikroskopischen Felder. Die chemotaktische Einheit (CTU) wurde durch
drei Parameter berechnet; die fMet-Leu-Phe (FMLP, 10 nM)stimulierte
maximale Migration (FM), die minimale Migration ohne den chemotaktischen
Faktor, bezeichnet als Zufallsmigration (RM), und die durch die
Probe induzierte Migration (SM). CTU wurde als 100 × (SM-RM)/(FM-RM)
definiert. Bei der Proteinreinigung von LECT2a wurde die Gesamt-CTU
in jedem Reinigungsschritt durch Multiplizieren der Verdünnung der
Probe für
50 CTU in der Verdünnung-Aktivität-Kurve
berechnet. Der Wert von ED50 steht für die Konzentration
des chemotaktischen Proteins bei der Halb-Maximum-Aktivität in der Dosis-Antwort-Kurve.
-
2) Freisetzung von lysosomalen
Proteinen (Enzymen)
-
Nach
einer Vorinkubierung bei einer Konzentration von 2 × 106 Neutrophilen/ml HBSS während 10 min bei 37°C wurden
Neutrophile mit einer Lösung
gemischt, die LECT2a mit 0,005 % BSA in Gegenwart oder Abwesenheit
von Cytochalasin B (5 μg/ml)
und FMLP (100 nM) enthielt.
-
a) Messung der MPO-Aktivität
-
Die
MPO-Aktivität
wurde wie folgt analysiert. Die Reaktionsmischung bestand aus einem
Neutrophilen-Überstand
oder Zellhomogenat, 1,7 mM Tetramethylbenzidin (TMB), 0,39 mM Wasserstoffperoxid,
84,2 mM Natriumcitratpuffer (pH-Wert 5,4), 7,2 % N,N'-Dimethylformamid, Phosphat-gepufterter
Salzlösung
ohne Calcium und Magnesium (PBS(-)) und HBSS in einem Gesamtvolumen
von 200 μl
pro Vertiefung einer 96-Vertiefungs-F-Platte
(#2-69620, erhältlich
von Nunc, Dänemark).
Die Zunahme der Absorption bei 650 nm in der Reaktionsmischung bei
37°C wurde
mit einem automatischen Analysengerät LFA-096 (Handelsname, erhältlich von
Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan) im 30-Sekunden-Intervall
gemessen. Eine Einheit wurde als die Aktivität definiert, die eine Zunahme
von 1,0 in der Absorption bei 650 nm/min/ml ursprüngliches
MPO-Präparat
erzeugt.
-
b) Messung der β-Glucuronidase-(BGL-)Aktivität
-
Die
BGL-Aktivität
im Überstand
und Zellhomogenat wurde wie folgt geassayt. Die Reaktionsmischung bestand
aus einem Neutrophilen-Überstand
oder -Zellhomogenat, 1 mM 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid, 0,05 % Triton
X-100 und 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 3,5) in einem Gesamtvolumen
von 40 μl
in einer 96-Vertiefungs-F-Platte und wurde 30 min lang bei 37°C inkubiert.
Ein Abbruchpuffer (50 mM Natriumglycinpuffer (pH-Wert 10,4), welcher
5 mM EDTA-Dinatrium enthielt) wurde zugegeben. Die Fluoreszenzstärke wurde
durch ein automatisches Fluoreszenz-Analysengerät LFA-96F (Handelsname, erhältlich von
Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan) mit Wellenlängen bei
365 nm für
die Anregung und 405 nm für
die Emission gemessen. Eine Einheit der BGL-Aktivität wurde
als die Aktivität
definiert, welche 1 pmol 4-Methylumbelliferon/min/ml des ursprünglichen
BGL-Präparats
freisetzt.
-
c) Bestimmung von Lactoferrin
(LF)
-
LF-Protein
im Überstand
und Zellhomogenat wurde wie nachstehend gemessen. 100 μl an 0,05
% Ziegen-Antiserum gegen humanen LF-Antikörper, verdünnt mit Reagens-Verdünnungspufter,
0,1 % BSA in PBS(-) (pH-Wert 7,4), wurden in eine 96-Vertiefungs- F-Platte über Nacht
bei 4°C übertragen.
Nachdem die Platte dreimal mit PBS(-), das 0,05 % Tween-20-Waschpuffer
enthielt, gewaschen wurde, wurden 100 μl verdünnter Überstand oder Zellhomogenat
der Platte zugegeben. Nachdem die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur
gehalten wurde, wurde sie mit dem Waschpuffer dreimal gewaschen,
danach wurden 100 μl 0,1%iges
Kaninchen-Antiserum gegen humanes LF der Platte zugegeben. Nachdem
die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten worden war,
wurde sie dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen und mit 100 μl eines 0,025
% Peroxidase-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG behandelt. Die
Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, dreimal mit
dem Waschpuffer gewaschen und mit 200 μl Enzymsubstrat in 0,05 M Citratpufter
(pH-Wert 5,0), der 0,025 Wasserstoffperoxid und 0,04 % o-Phenylendiamiddihydrochlorid
enthielt, etwa 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunklen behandelt.
Dann wurden 50 μl
2,5 N Schwefelsäure
der Platte zugegeben, um die Reaktion abzubrechen, anschließend wurde
die Absorption bei 490 nm mit einem automatischen Analysengerät LFA-096
gemessen, und es wurde der LF-Gehalt im Überstand oder Zellhomogenat
ermittelt.
-
3) Superoxidbildung von
Neutrophilen
-
Die
Superoxidbildung wurde wie folgt gemessen. Neutrophilen-Suspension
(2 × 106 Zellen/ml, 100 μl) und 0,066 mM Ferricytochrom
c wurden in einer 96-Vertiefungs-F-Platte gemischt und ungefähr 2 Minuten
lang dort behalten. Eine Probe, Cytochalasin B (5 μg/ml) und
FMLP (1000 nM) wurden anschließend
der Suspension zugegeben und ungefähr 30 Sekunden lang bei 37°C stehen
gelassen. Die Superoxidbildung wurde durch Messen der Zunahme der
Absorption bei 546 nm im 0,269-min-Intervall mit Hilfe eines automatischen
Analysengeräts
LFA-096 bestimmt.
-
4) Adhäsion von Neutrophilen
-
Die
Neutrophilen-Adhäsion
wurde wie folgt gemessen. Eine Neutrophilen-Suspension (2 × 106 Zellen/ml, 100 μl) wurde in eine Glas-Gummi-Kammer
angeimpft. Die LECT2a enthaltende Probe (10 μl) und FMLP (10–11 bis
10–5)
wurden in die Kammer in einem Gesamtvolumen von 150 μl gegeben.
Die Kammer wurde 15 min lang bei 37°C in einem CO2-Inkubator
inkubiert. Nach der Inkubation wurden nicht anhaftende Zellen ab gesaugt,
und die Zellkonzentration wurde ausgezählt. Anschließend wurde
die Objektträgerkammer
mit Ethanol fixiert und mit Safulanin angefärbt.
-
5) Membran-Fluidität von Neutrophilen
-
Nachdem
Neutrophile und FITC-markiertes Succinyl-Concanavalin-A (FS-ConA)
10 min lang bei 37°C inkubiert
worden waren, wurde PBS(-) der Mischung zugegeben. Die FS-ConA-markierten Neutrophilen
wurden mit HBSS in einer Konzentration von 106 Zellen/ml
präpariert
und danach in eine Objektträgerkammer
plattiert. Eine Lösung
des Leukozyten aktivierenden Faktors (10 μl) und von FMLP (10 nM) wurde
der Zellsuspension in einem Gesamtvolumen von 150 μl zugegeben.
Die Zellsuspension wurde durch einen mit einem Nikon-Umkehrmikroskop
verbundenen Bild-Analysator (IMRAS) beobachtet. Die Membran-Fluidität wurde
mit einem IMRAS-Prozessor analysiert.
-
Fünf Aktivitäten von
Neutrophilen, die in den obigen Prozeduren ermittelt wurden, sind
in der Tabelle 2 zusammengefasst.
-
Tabelle
2 Zusammenfassung der Neutrophilen-Aktivierung mit LECT2a
-
- * % Freisetzung = 100 × S/(S +
H).
- S
- = extrazelluläre Enzymaktivität (oder
Proteingehalt).
- H
- = intrazelluläre verbliebene
Enzymaktivität
(oder Proteingehalt).
-
2. Chemotaktische
Aktivität
von Monozyten und Lymphozyten
-
Die
Verfahrensweisen waren nahezu identisch mit jenen für Neutrophile,
mit Ausnahme eines 5-μm-Millipore-Filters,
an Stelle von 3 μm,
und mit Ausnahme einer 75-min-Inkubation
an Stelle einer 35-min-Inkubation. Die Konzentration von LECT2a,
angegeben als ED50, betrug 220 nM in Monozyten
bzw. 430 nM in Lymphozyten.
-
2. Aminosäure-Sequenzierung
von gereinigtem LECT2a
-
Zehn
Mikrogramm Pyridyl-ethyliertes LECT2a wurden mit TPCK-Trypsin (Handelsname,
erhältlich
von Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) (E/S = 1:50, w/w) in
1,5 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, enthaltend 1 mM CaCl2, bei 37°C
8 Stunden lang verdaut. Peptide aus dem proteolytischen Verdau wurden
durch Umkehrphasen-HPLC auf einer weitporigen ODS-Säule (0,46 × 25 cm)
(Handelsname, erhältlich
von J.T. Baker Research Products, Phillipsburg, NJ) mit einem Acetonitril-Gradienten
in 0,1 % TFA getrennt. Eine automatische Aminosäuresequenz-Analyse wurde mit
einem Gasphasen-Aminosäuren-Sequenzierer,
Modell 477A (Handelsname, erhältlich
von Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt.
-
3. Klonieren von LECT2b
und Bestimmen der Nukleotidsequenz des klonierten LECT2b
-
Polyadenylierte
[Poly(A)+]-RNA wurde hergestellt. Für die Klonierung
wurde Poly(A)+-RNA (5 μg) aus SKW-3, welche mit PHA-P
(50 μg/ml)
behandelt worden waren, als Matrize für die Synthese von einzelsträngiger cDNA
unter Verwendung von SuperScriptTM-Reverser-Transkriptase
(Handelsname, erhältlich
von BRL, Grand Island, NY) verwendet. Sechs 17-Mer-Oligonukleotide
für die
Aminosäuresequenzen
WAIICA (5'-Oligonukleotid) wurden
synthetisiert, und es wurden vier für HIENCD (3'-Oligonukleotid) synthetisiert. Die
5'- und 3'-Oligonukleotid-Sätze wurden
jeweils zum Primen der Amplifikation von 45 ng SKW-3-cDNA durch
PCR verwendet, die für
40 Zyklen bei 94°C
1 min lang, bei 55°C
2 min lang und bei 72°C
1 min in einem 50-μl-Reaktionspuffer
durchgeführt
wurde. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel
getrennt, auf eine Hybond-N+-Nylonmembran
(Handelsname, erhältlich
von Amersham, Buckinghamshire, England) geblottet und einer Hybridisierung
mit einer internen Nukle otid-Sonde GATGTC/GCTA/GTGCTCT/CGATGGC/GTCT/CACT/AGC/GTATGCT/CTT
unterzogen, was der Aminosäuresequenz
DVLCSDGSTVYAP entspricht. Das durch Southern-Hybridisierung nachgewiesene
PCR-Produkt wurde in pUC19 kloniert.
-
Das
PCR-Produkt wurde einer Nukleotidsequenz-Analyse durch das Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren
(erhältlich
von United States Biochemicals, Cleveland, OH) unterzogen. Eine λgt10-Bibliothek wurde
aus Leber-mRNA erstellt und 1,3 × 106 unabhängige Klone
wurden gescreent. Zwölf
positive Klone wurden isoliert und in zwei Typen durch Restriktionsendonuklease-Analyse
klassifiziert. Die Sequenzanalyse der längsten Klone jedes Typs legte
nahe, dass die zwei Klon-Typen von einem identischen Gen abgeleitet
werden, welches zwei Poly(A)+-Signale aufweist.
Die Nukleotidsequenz-Analyse
ergab, dass die abgeleiteten Aminosäuresequenzen zu 86 % zu der
LECT2a-Aminosäuresequenz
homolog waren.
-
4. Konstruktion des ein
LECT2b-Fusionsprotein exprimierenden Plasmids
-
Die
cDNA-Fragmente von LECT2b, die eine EcoRI-Stelle am 5'-Ende und eine Hindlll-Stelle am 3'-Ende enthielten,
wurden durch PCR mit dem 5'-Primer
GGCGAATTCGA-AAACCTGTATTTTCAGGGGCCCTGGGCTAATATATG
und dem 3'-Primer
CGCAAGCTTTTACAGGTATGCAGTAG für
25 Zyklen bei 94°C
1 min lang, bei 55°C
2 min lang und bei 72°C
3 min lang amplifiziert. Die mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI
und Hindlll verdauten LECT2b-cDNAs wurden in die EcoRI/Hindlll-Stelle
des Expressionsvektors pMALTM-c (Handelsname,
erhältlich
von Biolab Inc.) ligiert. Dieses Plasmid wurde als pMAL-TEV-LECT2b
bezeichnet. Wichtige Merkmale dieses Plasmids sind, dass das rekombinante
Fusionsprotein durch IPTG-Behandlung induzierbar ist und die Erkennungsstelle
von TEV-Protease (abgeleitet von Tabak-"Etch"-Virus)
zwischen Maltose-bindendem Protein und LECT2b-Protein aufweist.
-
Induktion von pGEX-Xa-LECT2b
-
Die
cDNA-Fragmente von LECT2b, die eine BamHl-Stelle am 5'-Ende und am 3'-Ende enthielten,
wurden durch PCR mit dem 5'-Primer
GCGGGATCCCCGGGCCATGGGC-TAATAT
und dem 3'-Primer
CGCGGATCCTTACAGGTATGCAGTAG für
25 Zyklen bei 94°C
1 min lang, bei 55°C
2 min lang und bei 72°C
3 min lang amplifiziert. Die mit BamHl-Restriktionsendonukleasen
verdauten LECT2b-cDNAs wurden in die BamHl-Stelle des Expressionsvektors pGEX-3X
(Handelsname, erhältlich
von Pharmacia Inc.) ligiert. Dieses Plasmid wurde als pGEX-Xa-LECT2b
bezeichnet. Wichtige Merkmale dieses Plasmids sind, dass das rekombinante
Fusionsprotein durch IPTG-Behandlung induzierbar ist und die Erkennungsstelle
von Xa-Protease zwischen Glutathion-S-transferase und LECT2b-Protein aufweist.
-
5. Transformation von
E. coli durch den rekombinantes LECT2b exprimierenden Vektor
-
E.
coli JM109 wurden durch pMAL-TEV-LECT2b transformiert, und die erhaltenen
Transformanten wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Der
Mal-LECT2b-Stamm (hinterlegt am NATIONAL INSTITUTE OF BIOSCIENCE
AND HUMAN-TECHNOLOGY, Agency of Industrial Science and Technology,
1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, unter
FERM P-14669, und übertragen
zur internationalen Hinterlegung unter FERM BP-5302 am 24. November
1995 gemäß dem Budapester
Abkommen), welcher das Expressionsplasmid aufwies, welches die präzise LECT2b-Proteinsequenz codiert,
wurde ausgewählt.
-
Expression von LECT2b-Protein
in tierischen Zellen
-
Das
pOLECT2b-Plasmid wurde mit Bglll verdaut und durch Selbstligation
ausgetragen. Die 5'-Seite der
cDNA im resultierenden Plasmid wurde bis zu 5 by von dem vorhergesagten
ATG durch Exonuklease III deletiert. Die deletierte DNA wurde mit
Klenow-Fragment
behandelt und wurde mit PstI-Linkern ligiert. Dieses deletierte
Plasmid wurde mit PstI und Bglll verdaut und das PstI-BgIII-Fragment
von LECT2b wurde in die PstI/BamHl-Stelle von pcDSRα296 kloniert.
Dieser Expressionsvektor (pSRαLECT2b)
wurde in CHO-Zellen, die bis zu etwa 50 % Konfluenz gezüchtet worden
waren, transfiziert. Dann wurden stabile Transformantenzellen (C1D8-1)
(hinterlegt am NATIONAL INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND HUMAN-TECHNOLOGY,
Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan, unter FERM P-14668, und übertragen
zur internationalen Hinterlegung unter FERM BP-5301 am 24. November 1995 gemäß dem Budapester
Abkommen), die in hohem Maße
LECT2b erzeugen, erhalten.
-
Bestimmung der Molekülgröße von LECT2b
-
Das
in CHO-Zellen exprimierte rekombinante LECT2b-Protein wurde metabolisch
mit 35S-Methionin markiert und die Proteine
wurden durch SDS-PAGE nachgewiesen. Die Banden von LECT2b wurden
an der Position von etwa 16 kDa nachgewiesen. Diese Resultate zeigen
an, dass die Molekülgröße von LECT2b
mit derjenigen von LECT2a identisch war.
-
Bestimmung der Aktivität
-
Die
Aktivität
des Leukozyten-aktivierenden Faktors LECT2b wurde durch die gleichen
Verfahrensweisen wie jenen, die für LECT2a beschrieben wurden,
bestimmt. Einige Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
-
Tabelle
3 Zusammenfassung der Neutrophilen-Aktivierung mit LECT2b
- * % Freisetzung
= 100 × S/(S
+ H).
- S
- = extrazelluläre MPO-Aktivität.
- H
- = intrazelluläre verbliebene
MPO-Aktivität.
-
Die
Proteine LECT2a und LECT2b werden als neues Zytokin/Interleukin
klassifiziert, welches Immunzellen aktiviert. Dies zeigt, dass diese
Proteine für
die Diagnose, Thera pie und Vorhersage von Krebs durch ihre Immunreaktion
nützlich
sind. Weiterhin werden diese Proteine für die Krebstherapie verwendet
werden. Andererseits steht die Aktivierung von Neutrophilen und
anderen Entzündungszellen
durch diese Proteine in Zusammenhang mit chronischen Erkrankungen,
was nahe legt, dass diese Proteine in breitem Umfang für die Diagnose,
Therapie und den Nachweis von Störungen
des Cytokin-Netzwerks eingesetzt werden.
-
ROHSEQUENZ-AUFLISTUNG
PATENTANMELDUNG
-
-
-
-
-
-
-
-