DE69133492T2

DE69133492T2 - Rekombinanter menschlicher Hepatozytwachstumsfaktor und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE69133492T2
Application number: DE1991633492
Authority: DE
Inventors: Toshikazu Fukuoka-shi Nakamura; Michio Ohtsu-shi Hagiya; Tatsuya Ohtsu-shi Seki; Manabu Ohtsu-shi Shimonishi; Shin Ohtsu-shi Shimizu; Izumi Ohtsu-shi Ihara; Mariko Ohtsu-shi Sakaguchi; Osamu Ohtsu-shi Asami
Original assignee: Nakamura, Toshikazu
Current assignee: NAKAMURA, TOSHIKAZU, KYOTO, JP
Priority date: 1990-06-11
Filing date: 1991-06-07
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2011-06-08
Also published as: EP0859009B1; EP0461560A1; EP0859009A3; EP0461560B1; JP2000300282A; DE69133492D1; DE69130494D1; EP0859009A2; DE69130494T2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf rekombinante Expressionsvektoren, die eine Basensequenz exprimieren können, die für einen Hepatocytenwachstumsfaktor (im folgenden HGF) codiert, auf Transformanten davon und auf ein Verfahren zur Herstellung von HGF.
Es wird erwartet, dass HGF gute Dienste leistet für Hepatocytenkultivierungsreagentien, Leberregenerationspromotoren, die Grundlagenforschung der Leberfunktion, die Erforschung der Wirkung verschiedener Hormone und Medikamente auf Hepatocyten, die Erforschung des Carcinogenese-Mechanismus von Hepatomen, klinische Diagnostika, die einen Antikörper gegen das Polypeptid verwenden, sowie therapeutische Medikamente für Leberkrankheiten.
Hintergrund der Erfindung
Traditionellerweise ist bekannt, dass Epithelzellen-Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Nervenzellen-Wachstumsfaktor (NGF), Thrombocyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Endothelzellen-Wachstumsfaktor (ECGF) und weitere Polypeptide eine Zellwachstumsaktivität besitzen. Neben diesen Zell-Wachstumsfaktoren wurde 1984 von Nakamura et al. ein Polypeptid, das in vitro Hepatocyten-Wachstumsaktivität zeigt, aus dem Serum von Ratten mit regenerierter Leber partiell gereinigt und Hepatocytenwachstumsfaktor (im folgenden als HGF abgekürzt) genannt.
Bis zur Entdeckung von HGF war es unmöglich, Hepatocyten in vitro zu kultivieren; sie zeigten auch in Gegenwart von Säugerserum, das ein kräftiges Wachs tum von verschiedenen Linien etablierter Zellen erlaubt, kein Wachstum, und sie fielen gewöhnlich in etwa 1 Woche von der Wand des Kultivierungsgefäßes herab. In Gegenwart von HGF zeigten Hepatocyten ein sehr gutes Wachstum, und ihre Kultivierung wurde möglich [Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1450 (1984)]. Weitere Forscher bestätigten, dass diese HGF-Aktivität auch im Blut nach partieller Hepatektomie sowie im Blut von Patienten mit fulminanter Hepatitis vorhanden ist.
Mit diesem Hintergrund führten die Erfinder eine Reihe von Untersuchungen an HGF durch, das aus Ratten-Thrombocyten abgetrennt und gereinigt worden war, und fanden, dass dieses von Ratten-Thrombocyten abgeleitete HGF zwei Arten von Untereinheiten umfasst, und es gelang, 27 Aminosäurereste einer partiellen Aminosäuresequenz von HGF zu identifizieren (Japanische Patentanmeldung Nr. 311866/1988).
Außerdem offenbaren EP-A-0 412 557 und EP-A-0 462 277 (beides Dokumente, die unter Art. 54(3)(4) EPÜ relevant sind) die Verwendung von Tierzellen für die Expression des aus Placenta abgeleiteten hHGF-Gens bzw. eine cDNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für das Peptid von 3 codiert.
Das native HGF ist ein Polypeptid, das nur in Spuren aus Lebergeweben und Blutplättchen sezerniert wird, und Schwierigkeiten bei der Gewinnung entsprechender Gewebe machen einen stabilen Nachschub an HGF fast unmöglich. Insbesondere die Aktivität von Human-HGF wurde bisher nur in Seren von Patienten mit fulminanter Hepatitis bestätigt. Um dieses HGF für die Hepatocytenkultivierung, die Erforschung von Hepatocyten sowie als Mittel für Leberkrankheiten zu verwenden, ist also die Massenproduktion von HGF oder eines Polypeptids, das eine ähnliche Aktivität besitzt, durch Gen-Rekombinationstechnik wünschenswert.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Mit dem Ziel, die oben beschriebenen Probleme zu lösen, führten die Erfinder intensive Untersuchungen durch und fanden, dass eine cDNA, die die Basensequenz enthält, die für Ratten-HGF-Polypeptid codiert, aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden kann, die aus Rattenleber-mRNA hergestellt wurde, indem man als Sonde ein Oligonucleotid verwendet, das auf der Basis der Aminosäuresequenz des von Ratten-Thrombocyten abgeleiteten HGF synthetisiert wurde. Weiterhin wurde gefunden, dass cDNA, die eine Basensequenz enthält, die für Human-HGF-Polypeptid codiert, aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden kann, die aus mRNA aus menschlicher Leber hergestellt wurde, indem man diese von Ratten abgeleitete cDNA (Nature, 342, 440, 1989) als Sonde verwendet.
Die Erfinder führten weiterhin eine Northern-Hybridisierung mit mRNA durch, die von verschiedenen anderen menschlichen Geweben als Leber stammt, wobei sie einen Teil oder die gesamte der von menschlicher Leber abgeleiteten cDNA als Sonde verwendeten, und fanden, dass man ein HGF-artiges Transkript in Placenta- und Leucocyten-mRNA finden kann. Die Erfinder isolierten cDNA, die eine Basensequenz enthält, die für Human-HGF codiert, aus einer cDNA-Bibliothek, die von aus Leucocyten stammender mRNA hergestellt wurde, um die Basensequenz aufzuklären. Weiterhin erhielten die Erfinder eine Transformante, indem sie einen rekombinanten Expressionsvektor herstellten, der diese cDNA enthielt, und mit diesem rekombinanten Expressionsvektor eine Transformation durchführten, und fanden, dass von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF-Gen exprimiert wird, wenn man diese Transformante kultiviert, und dies führte zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung.
Das heißt, diese Erfindung bezieht sich auf

(1) ein Verfahren zur Herstellung eines Hepatocytenwachstumsfaktors (HGF), umfassend:
1) Transformieren von Säugerzellen mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der einen Promotor, ein Gen, das für eine in 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, und das DHFR-Gen enthält;
2) Kultivieren der transformierten Zellen in Gegenwart von sukzessive erhöhten Konzentrationen an Methotrexat; und
3) Ernten des HGF aus konditionierten Medien der in 2) erhaltenen Zellen;
(2) eine Transformante, erhältlich durch Transformieren von Säugerzellen mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der einen Promotor, ein Gen, das für eine in 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, und das DHFR-Gen enthält; sowie
(3) einen rekombinanten Expressionsvektor, der einen Promotor, ein Gen, das für eine in 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, und das DHFR-Gen enthält.

Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 zeigt eine Restriktionsenzymkarte von HLC3.
2 zeigt einen Teil der Basensequenz von HLC3 und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz.
3 zeigt einen Teil der Basensequenz von HLC2 und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz.
4 zeigt ein Konstruktionsschema eines Expressionsvektors für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF für COS-Zellen.
5 zeigt ein Konstruktionsschema eines Expressionsvektors für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF für Maus-C127-Zellen.
6 zeigt ein Konstruktionsschema eines Expressionsvektors für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF für Eierstockzellen Chinesischer Hamster (CHO-Zellen).
7 ist eine Kurve, die Fraktionsnummern von S-Sepharose-Eluat sowie die Extinktion der eluierten Komponente und ihre Beziehung zur DNA-Synthese-Aktivität zeigt.
8 ist eine Kurve, die Fraktionsnummern von Heparineluat sowie die Extinktion der eluierten Komponente und ihre Beziehung zur DNA-Synthese-Aktivität zeigt.
9 ist eine Kurve, die Beziehungen zwischen den durch Umkehrphasen-HPLC geleiteten Acetonitrilkonzentrationen und der Extinktion der eluierten Komponente zeigt.
10 zeigt ein SDS-Polyacrylamid-Elektrophoresemuster des gereinigten rekombinanten Human-HGF unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen.
11 ist eine Kurve, die das Chromatographiemuster des S-Sepharose-Eluats zeigt.
12 ist eine Kurve, die Fraktionsnummern des Heparineluats sowie die Extinktion der eluierten Komponente und ihre Beziehung zur DNA-Synthese-Aktivität zeigt.
13 ist eine Kurve, die Fraktionsnummern des Phenyl-5PW-Säulenchromatographie-Eluats sowie die Extinktion der eluierten Komponente und ihre Beziehung zur DNA-Synthese-Aktivität zeigt.
14 zeigt ein SDS-Polyacrylamid-Elektrophoresemuster des gereinigten rekombinanten Human-HGF unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen.
15 zeigt ein SDS-Polyacrylamid-Elektrophoresemuster des gereinigten einkettigen rekombinanten Human-HGF unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der rekombinante DNA enthaltende Expressionsvektor, der für Human-Hepatocytenwachstumsfaktor codiert, und die Transformante der Erfindung können zum Beispiel in folgender Weise hergestellt werden.

(1) mRNA wird aus Human-Leucocyten isoliert, und daraus wird nach einem bekannten Verfahren eine cDNA-Bibliothek hergestellt;
(2) unter Verwendung eines Teils oder der gesamten von menschlicher Leber abgeleiteten HGF-cDNA, die bereits isoliert wurde, als Sonde wird die oben genannte, von Human-Leucocyten abgeleitete cDNA-Bibliothek einer Durchmusterung unterzogen, und die gewünschte cDNA wird aus dem isolierten Klon extrahiert;
(3) ein cDNA-Fragment, das für das Human-HGF codiert, wird aus dieser von Human-Leucocyten abgeleiteten cDNA herausgeschnitten und in einen Expressionsvektor eingefügt;
(4) der erhaltene rekombinante Expressionsvektor wird verwendet, um eine Wirtszelle zu transformieren, so dass man eine Transformante erhält; und
(5) diese Transformante wird kultiviert, und aus dem resultierenden Kulturüberstand kann Human-Leucocyten-HGF geerntet und erzeugt werden.

Die entsprechenden Verfahren sind unten im einzelnen beschrieben.
(1) Isolierung von mRNA und Northern-Hybridisierung
mRNA von Human-Leucocyten kann nach einem herkömmlichen Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel kann die mRNA gemäß dem Verfahren von J. M. Chirgvin et al., das in Biochemistry, 18, 5294 (1979), beschrieben ist, erhalten werden, indem man aus dem Guanidinthiocyanat-Lysat von Human-Leucocyten erhaltene RNA einer Flüssigchromatographie auf einer Oligo-(dT)-Cellulosesäule oder Oligo-(dT)-Latex unterzieht. Außerdem sind auf dem Markt Human-Leucocyten-mRNAs erhältlich, wobei die Produkte von Clontech Lab. verwendet werden können. Eine Northern-Hybridisierung der so erhaltenen mRNA und der cDNA, die für von Human-Leber abgeleitetes HGF codiert, kann zum Beispiel nach dem Verfahren von Maniatis et al. durchgeführt werden, wie es beschrieben ist in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 202 (1982). Nach Markierung mit ³²P kann ein Teil oder die gesamte aus Human-Leber abgeleitete HGF-cDNA als Sonde verwendet werden.
(2) Herstellung von cDNA
cDNA-Bibliotheken können aufgebaut werden, indem man unter Verwendung von Reverser Transcriptase cDNAs aus der Human-Leucocyten-mRNA synthetisiert, wobei das HGF-Transcript als Matrize zum Beispiel nach dem Verfahren von H. Okayama et al. (Mol. Cell. Biol., 2, 161, 1982, und Mol. Cell. Biol., 3, 280, 1983) oder dem Verfahren von U. Gubler et al. (Gene, 25, 263, 1983) bestätigt wird und man diese cDNAs in Plasmide oder Phagen-DNAs einsetzt. Beispiele für die Plasmidvektoren, in die die cDNAs eingesetzt werden, sind die von Escherichia coli abgeleiteten pBR322, pUC18 und pUC19 (Toyobo) sowie das von Bacillus subtilis abgeleitete pUB110 (Sigma). Die oben genannten Beispiele für die zu verwendenden Vektoren sind nicht eingeschränkt, und es kann jeder Vektor verwendet werden, solange er zur Replikation und Amplifikation in Wirtszellen befähigt ist. Als Verfahren, bei denen die aus mRNA als Matrize synthetisierten cDNAs in Plasmide oder Phagen-DNAs eingesetzt werden, um die cDNA-Bibliotheken herzustellen, seien zum Beispiel erwähnt das Verfahren von T. Maniatis (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, S. 239) oder das Verfahren von T. V. Hyunh et al. (DNA Cloning: A Practical Approach, 1, 49, 1985). Außerdem sind auf dem Markt Human-Leucocyten-cDNA-Bibliotheken ebenso wie mRNAs erhältlich und können von Clontech Corp. bezogen werden.
(3) Durchmusterung der cDNA-Bibliothek
Die als cDNA-Bibliothek erhaltenen rekombinanten Expressionsvektoren in Form von Plasmiden oder Phagen-DNAs sind in einer geeigneten Wirtszelle untergebracht, wie Escherichia coli. Beispiele für Escherichia coli als Wirtszelle sind Escherichia coli NM514, C600 (Stratagene), NM522 und JM101 (Pharmacia). Unter Verwendung des Calciumchloridverfahrens, des Calciumchlorid/Rubidiumchlorid-Verfahrens oder eines anderen Verfahrens in dem Falle, dass Plasmide als cDNA-Vektor verwendet werden, und unter Verwendung des in-vitro-Verpackungsverfahrens in dem Falle, dass Phagen-DNAs als cDNA-Vektor verwendet werden, können die rekombinanten Expressionsvektoren in einer zuvor gezüchteten Wirtszelle untergebracht werden (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, S. 249). Aus der so erhaltenen Transformanten können cDNA-Klone unter Verwendung von ³²P-markierter, von menschlicher Leber abgeleiteter HGF-cDNA als Sonde nach dem Kolonie-Hybridisierungsverfahren (Gene, 10, 63, 1980) oder dem Plaque-Hybridisierungsverfahren (Science, 196, 180, 1977) herausgefischt werden. Das Klonieren kann auch nach dem Enzym-Antikörper-Verfahren (DNA Cloning, A Laboratory Manual: A Practical Approach, 1, 49, 1985) mit einem Antikörper gegen das Ziel-Polypeptid durchgeführt werden, um die cDNA-Klone zu erhalten.
Die rekombinante DNA, wie Plasmid- oder Phagen-DNA, wird gemäß dem herkömmlichen Verfahren (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) aus der Transformanten isoliert, und dann wird die Nucleotidsequenz der cDNA direkt und so, wie sie ist, oder nach Abbau mit einem Restriktionsenzym bestimmt. Die Basensequenz wird nach dem chemischen Verfahren von Maxam und Gilbert [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)] oder dem Didesoxy-Verfahren nach Sanger [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] bestimmt. Weiterhin wird eine andere cDNA nach dem Primerverlängerungsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 731 (1979)] aus der oben genannten mRNA frisch synthetisiert, wobei als Primer ein Teil der cDNA, deren Sequenz bestimmt wird, oder eine synthetisierte DNA, die einen Teil der cDNA darstellt, verwendet wird, und das Klonieren der rekombinanten DNA des Plasmids oder Phagen, das bzw. der die cDNA enthält, die mit einer ersten cDNA ligasiert werden kann, die bereits aus der cDNA-Bibliothek erhalten wurde, kann in derselben Weise wie oben durchgeführt werden. Diese Schritte der Primerverlängerung und Klonierung können mehrmals wiederholt werden, falls notwendig.
(4) Konstruktion eines rekombinanten Expressionsvektors für Human-HGF
Ein rekombinanter Expressionsvektor kann hergestellt werden, indem man cDNA unter Verwendung eines Restriktionsenzyms aus mehreren Arten von Plasmiden, Phagen oder einem anderen rekombinanten Vektor, der die klonierte chromosomale DNA enthält, die für die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz von Human-Leucocyten-HGF codiert, herausschneidet und sie stromabwärts eines Vektorpromotors, der für die Expression von aus Human-Leucocyten abgeleitetem HGF geeignet ist, unter Verwendung von Restriktionsenzym und DNA-Ligase wieder einligasiert.
Insbesondere wird der rekombinante Expressionsvektor für eine erhöhte Expressionseffizienz des von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF so konstruiert, dass 1) ein Promotor, 2) eine Ribosomenbindungsstelle, 3) ein Initiationscodon, 4) eine DNA, die die Basensequenz enthält, die für das von Human-Leucocyten abgeleitete HGF codiert, 5) ein Terminationscodon und 6) ein Terminator in dieser Reihenfolge in der Stromabwärtsrichtung der Transcription darin vorhanden sind. Als in der vorliegenden Erfindung zu verwendende DNA-Vektoren seien zum Beispiel genannt die von Escherichia coli abgeleiteten Plasmide pBR322, pUC18 (Toyobo), das von Bacillus subtilis abgeleitete Plasmid pUB110 (Sigma), das von Hefe abgeleitete Plasmid pRB15 (ATCC 37062), die Bakteriophagen λgt10, λgt11 (Stratagene), die Viren SV40 (BRL Corp.), BPV (ATCC VR-703), von Retrovirusgenen abgeleitete Vektoren usw. Für die vorlie gende Erfindung kann jeder DNA-Vektor verwendet werden, solange er sich im Wirt replizieren und amplifizieren lässt. Insbesondere wird für eine bequeme Expression des von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF vorzugsweise ein Vektor verwendet, der vom Gen eines Virus wie SV40 abgeleitet ist. Zum Beispiel kann der rekombinante Expressionsvektor, in dem die oben genannte klonierte DNA, die für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF codiert, mit dem späten Bereich eines SV40-Vektors ligasiert ist, exprimiert werden, indem man ihn in eine Affenzellinie einbaut, die als COS-Zellen bekannt ist [Cell, 23, 175 (1981)]. Für Promotoren und Terminatoren gibt es keine Einschränkung, solange sie zu dem Wirt passen, der verwendet wird, um die gewünschte Basensequenz, die für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF codiert, zu exprimieren. Zum Beispiel seien erwähnt der von Viren abgeleitete SV40-Promotor und der HSV1-TK-Promotor für Wirte in Form von tierischen Zellen, wie Maus-Fibroblasten und Eierstockzellen Chinesischer Hamster (CHO-Zellen). Als Terminator seien zum Beispiel erwähnt der SV40-Terminator sowie der HSV1-TK-Terminator für Wirte in Form von tierischen Zellen. Diese Promotoren und Terminatoren werden in geeigneter Kombination gemäß dem verwendeten Wirt verwendet. Die DNA, die eine Basensequenz enthält, die für das von Human-Leucocyten abgeleitete HGF codiert, unterliegt keiner Einschränkung, solange diese DNA für das Polypeptid codiert, das Hepatocyten-Wachstumsaktivität besitzt, und die in der später zu erwähnenden 2 gezeigte Sequenz aufweist. Die DNA, die die Basensequenz enthält, die für das von Human-Leucocyten abgeleitete HGF codiert, kann das Translations-Startcodon ATG sowie ein Translations-Stopcodon TAA, TGA oder TAG enthalten. Außerdem kann, falls notwendig, auch mehr als ein Startcodon oder Stopcodon in Kombination verwendet werden oder mit einem anderen Codon kombiniert werden, und diese Kombinationen unterliegen keiner Einschränkung. Außerdem enthält der Vektor an einer geeigneten Stelle das DHFR-Gen, das als Selektionsmarker für den mit diesem rekombinanten Expressionsvektor transformierten Wirt dienen kann.
(5) Transformation und Kultivierung der Wirtszellen
Der so aufgebaute rekombinante Expressionsvektor für Human-Leucocyten-HGF wird nach dem Verfahren der kompetenten Zellen [J. Mol. Biol., 53, 154 (1970)], dem Protoplastenverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], dem Calciumphosphatverfahren [Science, 221, 551 (1983)], dem DEAE-Dextran-Verfahren [Science, 215, 166 (1983)], dem Verfahren des elektrischen Pulses [Proc. Natl. Acad. USA, 81, 7161 (1984)], dem in-vitro-Verpackungsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581 (1975)], dem Virusvektorverfahren [Cell, 37, 1053 (1984)] oder dem Mikroinjektionsverfahren [Exp. Cell. Res., 153, 347 (1984)] in den Wirt eingeschleust.
Bevorzugte Säuger-Wirtszellen sind Maus-Fibroblasten C127 [J. Viol., 26, 291 (1978)] und Eierstockzellen Chinesischer Hamster (CHO-Zellen) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1929 (1978)].
Die erhaltene Transformante wird in einem Kulturmedium kultiviert, das geeignet ist, dass der Wirt das gewünschte rekombinante Human-Leucocyten-HGF erzeugt. Das Medium wird mit Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralstoffen, Vitaminen, Serum, Chemikalien und anderen Additiven, die für das Wachstum der Transformanten notwendig sind, versetzt. Beispiele für das Kulturmedium sind MEM-Medium, DMEM-Medium, RPMI1640-Medium (Nissui Pharmaceutical) usw., die Rinderfetusserum in einem Anteil von nicht mehr als 20% enthalten.
Die Kultivierung der Transformante wird normalerweise bei einer Temperatur von 20 bis 45°C und einem pH von 5 bis 8 durchgeführt, wobei je nach Bedarf belüftet und/oder gerührt wird. Wenn der Wirt eine adhäsive Tierzelle ist, werden Glaskügelchen, Collagenkügelchen, Acetylcellulose-Hohlfasern oder ein anderer Träger verwendet. Andere Mediumzusammensetzungen oder Kulturbedingungen als diese können ebenfalls verwendet werden, solange sie ein Wachstum der Transformante ermöglichen.
(6) Reinigung von Human-HGF
Das in dieser Weise in der Transformanten oder ihrem Kulturüberstand erzeugte rekombinante Human-Leucocyten-HGF kann durch eine Kombination von bekannten Techniken, wie Aussalzen, Lösungsmittelfällung, Dialyse, Ultrafiltration, Gelelektrophorese, Gelfiltrations-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Affinitätschromatographie, abgetrennt und gereinigt werden. Besonders bevorzugte effiziente Verfahren sind die Kombination von Aussalzen mit Ammoniumsulfat, S-Sepharose-Ionenchromatographie, Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie und Phenyl-Sepharose-Umkehrphasenchromatographie sowie die Kombination von Aussalzen mit Ammoniumsulfat, S-Sepharose-Ionenchromatographie und Anti-HGF-Antikörper-Sepharose-Affinitätschromatographie.
Das so erhaltene rekombinante, von Human-Leucocyten abgeleitete HGF zeigte eine merkliche, das Wachstum von Ratten-Hepatocyten fördernde Aktivität, wie von Rattenleber abgeleitetes HGF, von Ratten-Thrombocyten abgeleitetes HGF und rekombinantes, von menschlicher Leber abgeleitetes HGF.
(7) Bestimmung der HGF-Aktivität
Die HGF-Aktivität wurde im Einklang mit dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7229 (1983), beschriebenen Verfahren wie folgt bestimmt: Hepatocyten wurden nach dem Collagenase-Rückflussverfahren aus Wistar-Ratten abgetrennt und gereinigt. Die erhaltenen Ratten-Hepatocyten wurden in William-E-Medium (Flow Laboratory), dem 5% Rinderserum, 2 × 10^–9 M Insulin und 2 × 10^–9 M Dexamethason zugesetzt war, suspendiert und in einer Dichte von 1,25 × 10⁵ Zellen/Napf über 24-Napf-Multiplatten verteilt. Nach der Kultivierung in Gegenwart von 5% CO₂, 30% O₂ und 65% N₂ bei 37°C während 20 Stunden wurde das Medium gegen William-E-Medium ausgetauscht, dem 0,1 μg/ml Aprotinin zugesetzt war, wobei gleichzeitig eine gegebene Menge der jeweiligen Probe hinzugefügt wurde. Fünfzehn Stunden später wurden 15 μCi/ml ¹²⁵I-Desoxyuridin in einer Menge von 10 μl/Napf hinzugefügt. Für die Kontrollgruppe wurden 15 Minuten vor der Zugabe von ¹²⁵I-Desoxyuridin 5 μg/ml Aphidicolin hinzugefügt. Die Kultivierung wurde für die Markierung mit ¹²⁵I noch 4 Stunden lang fortgesetzt. Nach dem Waschen mit zwei Portionen PBS, pH 7,4, wurden die Zellen in einer kalten 10%igen wässrigen Lösung von Trichloressigsäure (TCA) fixiert. Die Zellen wurden mit 0,5 ml/Napf einer 1 N Natronlauge in Lösung gebracht, und ihre Radioaktivität wurde mit einem Gammazähler bestimmt. Außerdem wurde ein Teil der Probe, deren Radioaktivität bestimmt worden war, entnommen und einer Bestimmung des Proteingehalts nach dem Lowry-Verfahren unterzogen [J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)]. Die Menge des nach Zugabe der jeweiligen Probe in Hepatocyten aufgenommenen ¹²⁵I wurde als Differenz zwischen dem Zählergebnis und dem der Kontrolle berechnet, und der erhaltene Wert wurde auf einen Wert pro mg Ratten-Hepatocytenprotein umgerechnet, um die DNA-Synthese-Aktivität (dpm/mg Protein) zu erhalten. Die HGF-Aktivität der entsprechenden Probe, die 50% der DNA-Synthese-Aktivität von Hepatocyten entspricht, die man in demselben Test mit 10 ng/ml Epithelzellen-Wachstumsfaktor erhält, wurde als 1 Einheit definiert.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Zufuhr eines neuen physiologisch aktiven Peptids, das das Züchten von Hepatocyten in vitro ermöglicht, in großen Mengen. Das rekombinante, von Human-Leucocyten abgeleitete HGF eignet sich als klinisches Diagnostikum und als Therapeutikum für Leberkrankheiten. Außerdem sind Hepatocyten, die durch die Einwirkung des rekombinanten, von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF der Erfindung gezüchtet und gehalten wurden, äußerst nützlich als Wirtszellen für Grundlagenforschung der Leberfunktionen, die Erforschung der Wirkung verschiedener Hormone und Medikamente auf Hepatocyten, die Erforschung der Carcinogenese von Hepatomen oder das Züchten von Hepatocyten in vitro.
Die vorliegende Erfindung wird unten im einzelnen anhand von erläuternden Arbeitsbeispielen beschrieben, auf die die Erfindung nicht beschränkt ist.
Beispiel 1
1) Northern-Hybridisierung von Human-Gewebe-mRNA und aus menschlicher Leber abgeleiteter HGF-cDNA
Menschliche Hirn-, Placenta-, Leucocyten-, Lungen- und Leber-mRNA (jeweils 2 μg, Clontech Lab.) wurde einer Elektrophorese auf einem 0,66 M Formaldehyd enthaltenden Agarose-Gel nach dem Verfahren von Maniatis et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 202 (1982)] und anschließend einer Immobilisierung auf einem Nylonfilter des Typs Gene Screen Plus (DuPont) unterzogen. Die Nylonfilter wurden in eine Hybridisierungslösung eingetaucht, die eine Sonde enthielt, die durch Isolierung und Reinigung eines BamHI-KpnI-2,2-kb-Fragments von aus menschlicher Leber abgeleiteter HGF-cDNA durch Agarose-Gelelektrophorese und Markierung mit [α³²P]dCTP unter Verwendung des Multi-Prime-DNA-Markierungssystems (Amersham Corp.), 5 × SSPE-Puffer (1 × SSPE: 180 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH 6,8), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat, 40% Formaldehyd, 0,1% SDS und 0,1 mg/ml Escherichia-coli-DNA hergestellt worden war, und 16 Stunden lang einer Hybridisierungsreaktion bei 42°C unterzogen. Nach der Reaktion wurden die Nylonfilter dreimal bei 60°C mit 1 × SSC-Puffer, der 0,1% SDS enthielt, gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Nylonfilter wurden auf Verstärkerfolie Lightning Plus (DuPont) und Röntgenfilme RX (Fuji Photo Film) geheftet, und man ließ sie 16 Stunden bei –80°C darauf einwirken. Nach der Entwicklung wurden in Placenta- und Leucocyten-mRNA sowie in Leber-mRNA HGF-artige Transcripte bestätigt.
2) Herstellung einer von Human-Leucocyten abgeleiteten cDNA-Bibliothek
cDNA wurde nach dem Verfahren von Gubler et al. (Gene, 25, 263, 1983) unter Verwendung des cDNA Synthesis System Plus (Amersham Corp.) synthetisiert, wobei Human-Leucocyten-mRNA (3 μg) als Matrize verwendet wurde und ein Oligonucleotid mit der Basensequenz ^5'ACATTCTCTGAAATCTTCAT^3' (SEQ ID NO: 1), das im 3'-nichttranslationalen Bereich der von menschlicher Leber abgeleiteten HGF-cDNA vorhanden war, als Primer verwendet wurde. Nachdem die cDNA mit Phenol/Chloroform (1:1, v/v) extrahiert und durch Ethanolfällung gereinigt worden war, wurde sie in 10 mM Tris-HCl-Puffer gelöst, der 0,5 M NaCl und 1 mM EDTA enthielt (abgekürzt als STE-Puffer), und die Konzentration der Lösung wurde auf 0,7 μg/20 μl eingestellt. Die cDNA wurde in der folgenden Weise gemäß dem Verfahren von Huynh et al. (DNA Cloning I, A Practical Approach, 1, 49, 1982) mit dem cDNA-Klonierungssystem λgt10 (Amersham Corp.) an der EcoRI-Stelle von λgt10 einligasiert. Mit Hilfe von T4-DNA-Lipase wurde ein EcoRI-Adapter an beiden Termini mit der cDNA ligasiert. Das Reaktionsgemisch wurde für die cDNA-Reinigung auf eine Gelfiltrationssäule aufgetragen, die mit STE-Puffer äquilibriert worden war. Nach der Elution mit STE-Puffer wurden 500 μl der cDNA-Fraktionen aufgefangen. Nachdem die Ethanolfällung zweimal nach einem herkömmlichen Verfahren wiederholt worden war, wurde die an den Linker gebundene cDNA durch Trocknen unter reduziertem Druck erhalten. Die cDNA wurde mit einer Konzentration von 50 ng/μl wiederum in STE-Puffer gelöst, und 0,1 μg der an den Adapter gebundenen cDNA wurden in 1 μg λgt10-Vektor eingesetzt, der im voraus unter Verwendung von T4-DNA-Ligase hergestellt worden war. Nachdem das Reaktionsgemisch mit kaltem Ethanol behandelt worden war, wurde es leicht getrocknet, und die gesamte Menge der erhaltenen rekombinanten DNA wurde in 5 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer gelöst, der 1 mM EDTA enthielt, pH 7,5 (abgekürzt als TE-Puffer). Diese rekombinante DNA wurde einer in-vitro-Verpackungsreaktion unterzogen, was rekombinanten λgt10-Phagen ergab. Die durch Titration mit Escherichia coli auf Phagenplattierung gemessene Zahl der aus 1 μg cDNA erhaltenen rekombinanten Phagen betrug 5,0 × 10⁶. Die so erhaltene cDNA-Bibliothek wurde bis zur Verwendung bei 4°C in SE-Puffer mit einer kleinen Menge zugesetzten Chloroforms konserviert (100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄ und 20 mM Tris-HCl-Puffer mit 0,01% Gelatine, pH 7,5).
3) Isolierung von aus Human-Leucocyten abgeleiteter HGF-cDNA und Bestimmung der Nucleotidsequenz
Eine Klonierung des von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF-Gens aus der oben genannten cDNA-Bibliothek wurde durchgeführt, wobei ein 0,2-kb-EcoRI-Fragment von HAC 69 als Sonde verwendet wurde; es handelt sich dabei um einen Teil der von menschlicher Leber abgeleiteten HGF-cDNA, die durch das Multi-Prime-DNA-Markierungssystem (Amersham Corp.) mit [α³²P]dCTP markiert wurde. Die Durchmusterung wurde bei einer Hybridisierungstemperatur und einer Waschtemperatur von 60°C unter Verwendung von 2 × SSC-Puffer, der 0,1% SDS enthielt, durchgeführt, was die positiven Klone HLC2 und HLC3 ergab. HLC2- und HLC3-cDNA, die von jedem Phagen nach einem herkömmlichen Verfahren isoliert und gereinigt worden war, wurden einer Restriktionsenzym-Spaltungsanalyse und einer Bestimmung der Nucleotidsequenz unterzogen. In 1 ist die Restriktionsenzymkarte von HLC3 gezeigt, und in 2 sind ein Teil der Nucleotidsequenz sowie die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz gezeigt (SEQ ID NO: 2). Der von Human-Leucocyten abgeleitete HGF-Klon HLC3 zeigt ähnliche Merkmale wie das früher identifizierte, von menschlicher Leber abgeleitete HGF (Nature, 342, 440, 1989). Dennoch gibt es im codierenden Bereich 38 unterschiedliche Teile in der Nucleotidsequenz, was zu 14 Unterschieden in der abgeleiteten Aminosäuresequenz führt. HLC2-cDNA weist fast dieselbe Nucleotidsequenz auf wie die HLC3-cDNA, abgesehen von der Nucleotidsequenz vom 483. bis zum 497. Nucleotid, die deletiert wurde (3) (SEQ ID NO: 3).
4) Konstruktion eines Expressionsvektors für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF für Affen-COS-Zellen:
Die Konstruktionsschemata der Human-HGF-Expressionsvektoren CDM[dLeHGF] und CDM[LeHGF] für Affen-COS-Zellen sind in 4 gezeigt. Die in 3) oben erhaltenen HLC2- und HLC3-Phagen-DNAs wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI abgebaut, und das 2,2-kb-DNA-Fragment wurde isoliert und gereinigt. Die Oligonucleotide
die aus der KpnI-Spaltstelle von HLC2 und HLC3, einem Teil der in seinem 3'-Bereich enthaltenen Sequenz sowie HpaI-, SmaI- und SalI-Spaltstellen bestehen, wurden synthetisiert und dann als KpnI-SalI-Adapter verwendet. Die beschriebenen BamHI-KpnI-DNA-Fragmente von HLC2 und HLC3, der KpnI-SalI-Adapter und Blue Script KSM13+ (Stratagene), das zuvor mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten worden war, wurden miteinander gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligasiert, so dass man zwei Plasmide erhielt, pBS[dLeHGF] und pBS[LeHGF]. Die so erhaltenen Plasmide pBS[dLeHGF] und pBS[LeHGF] wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten, und mit T4-DNA-Polymerase wurden glatte Enden erzeugt; danach wurden sie mit dem Expressionsvektor CDM8 für COS-Zellen (Nature, 329, 840, 1987) gemischt, der zuvor mit dem Restriktionsenzym BstX1 gespalten worden war, mit T4-DNA-Polymerase wurden glatte Enden erzeugt, und mit T4-DNA-Ligase wurde ligasiert, was die Expressionsvektoren für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF CDM[dLeHGF] bzw. CDM[LeHGF] ergab.
5) Transformation von Affen-COS-Zellen und Expression des von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF-Gens:
Die erhaltenen Plasmide CDM[dLeHGF] und CDM[LeHGF] wurden einer Ethanolfällung unterzogen und danach in 10 mM PBS-Puffer gelöst, und die Konzentration wurde auf 2 μg/ml eingestellt. Die COS-1-Zellen (ATCC CRL-1650), die in DMEM-Medium (Nissui Pharmaceutical), das 10% Rinderfetusserum (Gibco) enthielt, bis zur gesättigten Zelldichte kultiviert worden waren, wurden zweimal mit 10 mM PBS-Puffer gewaschen und dann einer Behandlung mit Trypsin unterzogen. Nachdem die Zellen dreimal mit dem Puffer gewaschen worden waren, wurden sie mit einer Dichte von 2 × 10⁷ Zellen/ml in dem Puffer suspendiert. Die Plasmidlösung (250 μl) und die Zellsuspension (250 μl), die zuvor hergestellt worden waren, wurden miteinander gemischt, und man ließ das Gemisch 10 Minuten lang auf Eis stehen. Das eisgekühlte Gemisch des Plasmids und der Zellen erhielt einen Hochspannungspuls bei einer angelegten Spannung von 4 kV/cm während einer Pulszeit von 20 ms mit einem Hochspannungspuls-Geneinschleusungsapparat ZA-1200 (PDS Corp.). Die erhaltenen Zellen wurden in dem obigen Medium verdünnt und 3 Tage lang bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ kultiviert. Die HGF-Aktivität im Kulturüberstand nach 3 Tagen Kultur wurde bestimmt, und es wurden 20 Einheiten/ml bzw. 5 Einheiten/ml gefunden. Dagegen wurde der Expressionsvektor CDM8, in den die HGF-cDNA nicht eingefügt worden war, in derselben Weise in COS-1-Zellen eingeführt und kultiviert, aber im Kulturüberstand wurde keine HGF-Aktivität nachgewiesen.
Beispiel 2
1) Konstruktion eines Expressionsvektors für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF für Maus-C127-Zellen:
Die Konstruktionsschemata der Expressionsvektoren für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF pBPMT[LeHGF] (FERM BP-2897, hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan) und pBPMT[dLeHGF] (FERM BP-2898) für Maus-C127-Zellen sind in 5 gezeigt. Die in Beispiel 1 erhaltenen Plasmide pBS[LeHGF] und pBS[dLeHGF] wurden mit den Restriktionsenzymen XbaI und SalI gespalten, und mit T4-DNA-Polymerase wurden glatte Enden erzeugt; danach wurden sie mit dem Expressionsvektor pBPMT für C127-Zellen gemischt, der zuvor mit dem Restriktionsenzym EcoRV gespalten worden war, und mit T4-DNA-Ligase wurde ligasiert, was die Human-HGF-Expressionsvektoren pBPMT[LeHGF] (FERM BP-2897) bzw. pBPMT[dLeHGF] (FERM BP-2898) ergab. Die so erhaltenen Expressionsvektoren für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF weisen ein von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF-Gen zwischen einem MT-1-Promotor und dem Poly(A)-Zusatzsignal des frühen SV40-Gens auf, und mit diesen Expressionsvektoren transfizierte Maus-C127-Zellen werden durch das Rinder-Papillomvirus (BPV) transformiert. Die Selektion der transformierten Zellen kann durch ein neo-Chimärengen erfolgen, wobei das neo-Gen des Transposons Tn5 (Gene, 19, 329, 1982) zwischen die Promotorsequenz und das Poly(A)-Zusatzsignal des vom Herpes-simplex-Virus Typ I abgeleiteten Thymidin-Kinase-Gens (HSV1-TK) eingesetzt wurde.
2) Transformation von Maus-C127-Zellen und Expression des Human-HGF-Gens:
Die Expressionsvektoren für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF pBPMT[LeHGF] (FERM BP-2897) und pBPMT[dLeHGF] (FERM BP-2898) wurden nach dem Verfahren von Wigler et al. (Cell, 11, 223, 1977) in Maus-C127-Zellen eingeschleust.
Die in 1) erhaltenen Plasmide pBPMT[LeHGF] (FERM BP-2897) und pBPMT[dLeHGF] (FERM BP-2898) (29 μg) wurden jeweils in 240 μl 0,5 M Calciumchlorid gelöst, und unter Rühren wurden 240 μl 2 × HEPES-Puffer, pH 7,1, der 20 mM HEPES enthielt, 280 mM NaCl und 1,5 mM Natriumphosphat hinzugefügt. Es wurde noch 30 Minuten bei Raumtemperatur weitergerührt, um eine gemeinsame Fällung des Plasmids und von Calciumphosphat zu bewirken. C127-Zellen (5 × 10⁵) wurden im voraus 24 Stunden bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ in DMEM-Medium (Nissui Pharmaceutical), dem 10% Rinderfetusserum (Gibco) und 10 mM Glutamin zugesetzt worden war, kultiviert. Nach dem Ersetzen des Kulturmediums wurden das gemeinsam ausgefällte Plasmid und Calciumphosphat hinzugefügt, und man ließ das Gemisch 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Nach einer weiteren Inkubation bei 37°C während 4 Stunden wurde das Medium entfernt, und 1 × HEPES-Puffer mit 15% zugesetztem Glycerin wurde hinzugefügt, und man ließ das Gemisch 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Nachdem die Zellen mit dem Medium gewaschen worden waren, wurde das Medium ersetzt, und eine weitere Inkubation bei 37°C während 2 Tagen wurde durchgeführt. Die Zellen wurden auf das Zehnfache verdünnt, und unter Verwendung desselben Mediums, das G418 (Sigma Corp.) in einer Konzentration von 1 mg/ml enthielt, wurde eine Kultivierung bei 37°C während 7 Tagen in Gegenwart von 5% CO₂ durchgeführt, wobei man transformierte Zellen erhielt. Die Zellen mit hoher HGF-Aktivität im Kultur überstand der erhaltenen Zellstämme wurden einer Durchmusterung nach dem Grenzverdünnungsverfahren unterzogen, wobei man die von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF erzeugenden Zellstämme BPI-14 (pBPMT[LeHGF] (FERM BP-2897)) und BPD-27 (pBPMT[dLeHGF] (FERM BP-2898)) erhielt. Die HGF-erzeugende Aktivität der Zellen betrug 120 000 Einheiten/l/Tag bzw. 150 000 Einheiten/l/Tag.
Beispiel 3
1) Konstruktion eines Expressionsvektors für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF für Eierstockzellen Chinesischer Hamster (CHO-Zellen):
Die Konstruktionsschemata der Expressionsvektoren für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF pEVSSV[LeHGF] (FERM BP-2899) und pEVSSV[dLeHGF] (FERM BP-2900) für CHO-Zellen sind in 6 gezeigt. Nachdem die in Beispiel 1 erhaltenen Plasmide pBS[LeHGF] und pBS[dLeHGF] mit den Restriktionsenzymen XbaI bzw. SalI gespalten und mit T4-DNA-Polymerase glatte Enden erzeugt worden waren, wurden sie mit dem Expressionsvektor pEVSSV für CHO-Zellen gemischt, der zuvor mit dem Restriktionsenzym EcoRV gespalten worden war, und mit T4-DNA-Lipase wurde ligasiert, was die Expressionsvektoren für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF pEVSSV[LeHGF] (FERM BP-2899) und pEVSSV[dLeHGF] (FERM BP-2900) ergab. Die so erhaltenen Expressionsvektoren für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF weisen ein von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF-Gen zwischen dem frühen SV40-Promotor und dem Poly(A)-Zusatzsignal auf. Die Selektion der transformierten Zellen kann durch ein DHFR-Chimärengen erfolgen, wobei das Maus-Dihydrofolat-Reductase-(DHFR)-Gen mit dem frühen SV40-Promotor und dem Poly(A)-Zusatzsignal ligasiert wurde.
2) Transformation von CHO-Zellen und Expression des von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF-Gens:
Die Expressionsvektoren für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF pEVSSV[LeHGF] (FERM BP-2899) und pEVSSV[dLeHGF] (FERM BP-2900) wurden in derselben Weise wie in Beispiel 2 in CHO-DUKX-Zellen eingeschleust, d.h. CHO-Zellen, die kein DHFR erzeugen können. Die Zellen mit hoher HGF-Aktivität im Kulturüberstand der erhaltenen Zellstämme wurden einer Durchmusterung nach dem Grenzverdünnungsverfahren unterzogen, so dass man Zellen im Kulturüberstand erhielt, wobei man α-MEM-Medium (Flow-Laboratory) verwendete, das frei von Ribonucleosiden und Desoxyribonucleosiden war, aber 10% Rinderfetusserum (Gibco), 1% Glutamin und 50 nM Methotrexat enthielt. Die erhaltene Kolonie wurde bis zur neunten Überimpfung in derselben Kultur kultiviert, wobei man Stämme erhielt, die in stabiler Weise eine große Menge von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF erzeugten. Die Zellstämme wurden in demselben Medium gezüchtet, während die Konzentration von Methotrexat nacheinander auf 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM und 1000 nM erhöht wurde, wobei man die Stämme EVI-65 (pEVSSV[LeHGF] (FERM BP-2899)) und EVD-104 (pEVSSV[dLeHGF] (FERM BP-2900)) erhielt, die in stabiler Weise eine große Menge von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF erzeugten. Die von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF erzeugende Aktivität dieser Zellen betrug 90 000 Einheiten/l/Tag bzw. 130 000 Einheiten/l/Tag.
Beispiel 4
Reinigung von rekombinantem, von Human-Leucocyten abgeleitetem HGF aus dem Kulturüberstand transformierter C127-Zellen:
Rekombinantes, von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF wurde aus dem Kulturüberstand des in Beispiel 2 erhaltenen, von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF erzeugenden rekombinanten Maus-C127-Zellstammes BPD-27 (HGF mit einer Deletion von 15 Nucleotiden erzeugender Stamm) gereinigt.
1) Kationenaustauschchromatographie
Tween 80 wurde zu einer Kulturlösung (500 ml) des BPD-27-Stammes gegeben, so dass die endgültige Konzentration 0,01% betrug, und das Gemisch wurde durch ein Sterivex-HV-Filter (Japan Millipore Limited) filtriert. Zu dem Filtrat wurde 1/20 Volumen 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) gegeben, und dann wurde es auf S-Sepharose FF (Pharmacia, Säulengröße: Innendurchmesser 1,6 cm, Höhe 5 cm) gegossen, die mit Puffer A (50 mM Tris-HCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 0,01% Tween 80, pH 8,5) äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der adsorbierten Substanz mit Puffer A wurde die nicht adsorbierte Substanz mit einem linearen NaCl-Gradienten (Gesamtmenge 100 ml) von 0,15 M bis 1,0 M eluiert. 7 zeigt das erhaltene chromatographische Muster.
Die Fraktionen mit HGF-Aktivität wurden aufgefangen und als S-Sepharose-Eluat verwendet.
2) Affinitätschromatographie
Das S-Sepharose-Eluat wurde mit 1 N Essigsäure auf pH 7,5 eingestellt, mit destilliertem Wasser, das ein doppeltes Volumen von 0,01% Tween 80 enthielt, verdünnt und mit Puffer B (10 mM Tris-HCl, 0,3 M NaCl, 0,01% Tween 80, pH 7,5) äquilibriert, und dann wurde es auf Heparin-Sepharose CL-6B gegossen (Pharmacia, Säulengröße: Innendurchmesser 1 cm, Höhe 3 cm). Nach dem Waschen der Säule mit Puffer B wurde eine Elution mit einem linearen NaCl-Gradienten (Gesamtmenge 30 ml) von 0,3 M bis 2,0 M durchgeführt. 8 zeigt das erhaltene chromatographische Muster. Die Fraktionen mit HGF-Aktivität wurden aufgefangen und als Heparin-Eluat verwendet.
3) Umkehrphasen-HPLC
Das Heparin-Eluat wurde auf eine Phenyl-5PW-Umkehrphasensäule (Toso Corp., Innendurchmesser 0,75 cm, Höhe 7,5 cm) gegossen, die mit destilliertem Wasser, das 0,1% TFA (Trifluoracetat, v/v) enthielt, äquilibriert worden war, und eine Elution wurde mit einem Gradienten von 0,1% TFA enthaltendem Acetonitril von 0% bis 90% durchgeführt. Das rekombinante, von Human-Leucocyten abgeleitete HGF wurde bei einer Acetonitrilkonzentration von etwa 40% eluiert. 9 zeigt das chromatographische Muster. Die Ausbeute des gereinigten rekombinanten Human-HGF betrug etwa 20 μg, und die Ausbeute der Aktivitätsgewinnung aus dem Kulturüberstand betrug 18%.
4) SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Das rekombinante, von Human-Leucocyten abgeleitete HGF des Typs mit einer Deletion von 15 Nucleotiden, das durch die drei oben genannten Chromatographieschritte gereinigt worden war, wurde einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter reduzierenden (mit 2-Mercaptoethanol) und nichtreduzierenden Bedingungen unterzogen. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Das gereinigte rekombinante HGF zeigte unter nichtreduzierenden Bedingungen (2-ME(–)) eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 70 000 bis 90 000 und unter reduzierenden Bedingungen (2-ME(+)) eine α-Kette mit einem Molekulargewicht von 60 000 bis 75 000 und eine β-Kette mit einem Molekulargewicht von 30 000 bis 40 000. Das heißt, das rekombinante HGF ist ein Heterodimer, das α- und β-Ketten umfasst.
5) Hepatocytenwachstumsaktivität des rekombinanten, von Human- Leucocyten abgeleiteten HGF (Typ mit einer Deletion von 15 Nucleotiden)
Von den zur Zeit bekannten in-vitro-Assaysystemen haben Ratten-Hepatocyten in Primärkultur Leberfunktionen, die denen in vivo am ähnlichsten sind. Die Zugabe des gereinigten rekombinanten, von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF des Typs mit einer Deletion von 15 Nucleotiden zu Ratten-Hepatocyten, wie man sie gemäß dem unter "Bestimmung der HGF-Aktivität" beschriebenen Verfahren erhält, induzierte bei einer Konzentration von 1–20 ng/ml eine starke Zellproliferation. Als weitere Faktoren, die bei diesem Kulturstamm eine Wachstumsaktivität zeigten, sind Insulin und EGF bekannt. Das rekombinante HGF zeigt für sich allein eine stärkere Aktivität als diese beiden, und in Gegenwart aller drei Faktoren wurde eine additive Wirkung beobachtet.
Beispiel 5
Transformation von Eierstockzellen Chinesischer Hamster (CHO-Zellen) durch von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF-Gen und Expression desselben:
Der Expressionsvektor für von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF pEVSSV[dLeHGF] (FERM BP-2900) wurde nach dem Verfahren von Wigler et al. (Cell, 11, 223, 1977) in CHO-Zellen, die kein DHFR erzeugen können, eingeschleust. Plasmid pEVSSV[dLeHGF] (etwa 30 μg) wurde in 0,5 M Calciumchlorid (240 μl) gelöst, und unter Rühren wurden 2 × HEPES-Puffer (240 μl, pH 7,1), der 20 mM HEPES enthielt, 280 mM Natriumchlorid und 1,5 mM Natriumphosphat hinzugefügt. Es wurde noch 30 Minuten bei Raumtemperatur weitergerührt, um eine gemeinsame Fällung des Plasmids und von Calciumphosphat zu bewirken. CHO-Zellen (5 × 10⁵) wurden 24 Stunden bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ in α-MEM-Kulturmedium (Flow-Laboratory Corp.), das 10% Rinderfetusserum (Gibco) und 1% Glutamin enthielt, kultiviert. Nach dem Austausch des Mediums wurden das gemeinsam ausgefällte Plasmid und Calciumphosphat hinzugefügt, und dann ließ man das Gemisch 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Die Inkubation wurde 4 Stunden lang bei 37°C fortgesetzt, dann wurde das Medium entfernt, 1 × HEPES-Puffer mit 15% zugesetztem Glycerin wurde hinzugefügt, und man ließ das Gemisch 5 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Die Zellen wurden mit dem Medium gewaschen, das Medium wurde ausgetauscht, und dann erfolgte eine 7tägige Kultur bei 37°C, was transformierte Zellen ergab. Die erhaltenen Zellstämme wurden wiederholt kultiviert, wobei man α-MEM-Kulturmedium (Flow-Laboratory Corp.) verwendete, das 10% Rinderfetusserum (Gibco) und 1% Glutamin enthielt, aber kein Ribonucleosid und kein Desoxyribonucleosid enthielt; dabei wurde die Konzentration von Methotrexat nacheinander auf 100 nM, 250 nM, 500 nM, 750 nM, 1 μM und 2 μM erhöht, wobei man Stämme mit stabiler hoher HGF-Produktion erhielt. Mit den erhaltenen rekombinanten Zellen, die von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF in großer Menge erzeugten, wurde eine Klonierungsselektion durchgeführt, wobei man den Zellstamm 515C erhielt, der in stabiler Weise von Human- Leucocyten abgeleitetes HGF erzeugte. Die HGF-erzeugende Aktivität der Zellen betrug etwa 800 000 Einheiten/l/Tag.
Beispiel 6
Reinigung von rekombinantem, von Human-Leucocyten abgeleitetem HGF aus dem Kulturüberstand transformierter CHO-Zellen:
Der in Beispiel 5 erhaltene, von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF erzeugende rekombinante CHO-Zellstamm 515C (HGF des Typs mit einer Deletion von 15 Nucleotiden erzeugender Stamm) wurde in α-MEM-Medium (Flow-Laboratory Corp.) kultiviert, das frei von Ribonucleosiden und Desoxyribonucleosiden war, aber 10% Rinderfetusserum (Gibco), 1% Glutamin und 2 μM Methotrexat enthielt; aus dem betreffenden Kulturüberstand wurde rekombinantes, von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF gereinigt.
1) Kationenaustauschchromatographie
Tween 80 wurde zu der Kultur (500 ml) des 515C-Stammes gegeben, so dass die endgültige Konzentration 0,01% betrug, und das Gemisch wurde durch ein Sterivex-HV-Filter (Japan Millipore Limited) filtriert. Zu dem Filtrat wurde 1/20 Volumen 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) gegeben, und dann wurde es auf S-Sepharose FF (Pharmacia, Säulengröße: Innendurchmesser 1,6 cm, Höhe 5 cm) gegossen, die mit Puffer C (50 mM Tris-HCl, 0,01% Tween 80, pH 8,5), der 150 mM NaCl enthielt, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Puffer-C-Säule mit Puffer C, der 150 mM NaCl enthielt, und Puffer C, der 400 mM NaCl enthielt (in 11 durch Pfeil A markiert), wurde mit Puffer C, der 1 M NaCl enthielt (in 11 durch Pfeil B markiert), eluiert. 11 zeigt das erhaltene chromatographische Muster. Die Fraktionen mit maximaler Aktivität, die mit Puffer C, der 1 M NaCl enthielt, eluiert wurden (in 11 durch ↔ markiert), wurden aufgefangen und als S-Sepharose-Eluat verwendet.
2) Affinitätschromatographie
Das S-Sepharose-Eluat wurde mit 1 N Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt, mit destilliertem Wasser, das ein doppeltes Volumen von 0,01% Tween 80 enthielt, verdünnt und dann auf Heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia, Säulengröße: Innendurchmesser 1 cm, Höhe 5 cm) gegossen, die mit Puffer B (10 mM Tris-HCl, 0,3 M NaCl, 0,01% Tween 80, pH 7,5) äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer B wurde eine Elution mit einem linearen NaCl-Gradienten (Gesamtmenge 40 ml) von 0,3 M bis 2,0 M durchgeführt. 12 zeigt das erhaltene chromatographische Muster. Die Fraktionen mit NGF-Aktivität wurden aufgefangen und als Heparin-Eluat verwendet.
3) Hydrophobe Chromatographie
Das Heparin-Eluat wurde auf eine Phenyl-5PW-Säule (Toso Corp., Innendurchmesser 0,75 cm, Höhe 7,5 cm) gegossen, die mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, der 4 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war, und eine Elution wurde mit einem Gradienten von Lösungsmittel A, d.h. 20 mM Phosphatpuffer, der 4 M NaCl enthielt (pH 7,0), zu Lösungsmittel B, d.h. 20 mM Phosphatpuffer, der 50% Ethylenglycol enthielt (pH 7,0), durchgeführt. Die HGF-Aktivität wurde bei etwa 2 M NaCl, 25% Ethylenglycol eluiert. 13 zeigt ihr Chromatogramm. Die Ausbeute des gereinigten rekombinanten, von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF betrug etwa 500 μg, und die Ausbeute der Aktivitätsgewinnung aus dem Kulturüberstand betrug 25%.
4) Eigenschaften des gereinigten rekombinanten, von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF
Die biologischen, chemischen und physikochemischen Eigenschaften des in 3) oben erhaltenen rekombinanten, von Human-Leucocyten abgeleiteten HGF wurden gemessen.
➀ SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Das rekombinante HGF wurde einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter reduzierenden (mit 2-Mercaptoethanol) und nichtreduzierenden Bedingungen unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel nach dem Silberfärbungsverfahren angefärbt. Die Ergebnisse sind in 14 zusammengefasst. Das rekombinante HGF zeigte unter nichtreduzierenden Bedingungen eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 70 000 bis 90 000 und unter reduzierenden Bedingungen eine α-Kette mit einem Molekulargewicht von 60 000 bis 75 000 und eine β-Kette mit einem Molekulargewicht von 30 000 bis 40 000. Die β-Kette zeigte weiterhin zwei Banden, was auf eine unterschiedliche Zahl der gebundenen Zuckerketten hinweist.
➁ Zuckerzusammensetzungsanalyse (neutraler Zucker und Aminozucker)
Nach dem Eindampfen des gereinigten rekombinanten HGF zur Trockne wurde es 6 Stunden lang bei 110°C einer Hydrolyse in Gegenwart von 2,5 N Trifluoracetat unterzogen. Das Hydrolysat wurde zur Trockne eingedampft und in Wasser wieder aufgelöst, so dass man eine Probe erhielt. Die Probe wurde einer Zuckerzusammensetzungsanalyse durch HPLC unter Verwendung eines Anionenaustauscherharzes unterzogen. Als Ergebnis wurden Fucose, Galactose, Mannose und N-Acetylglucosamin nachgewiesen; dies bestätigte, dass das rekombinante HGF ein Glycoprotein war.
➂ Biologische Wirkung
Die Hepatocytenwachstumsaktivität des gereinigten rekombinanten HGF wurde im Einklang mit dem unter "Bestimmung der HGF-Aktivität" beschriebenen Verfahren bestimmt. Als Ergebnis wurde eine relative Aktivität des gereinigten rekombinanten HGF von 200–500 Tausend Einheiten/mg gefunden.
Beispiel 7
Herstellung von rekombinantem einkettigem, von Human-Leucocyten abgeleitetem HGF (HGF des Typs mit einer Deletion von 15 Nucleotiden)
Der in Beispiel 5 erhaltene rekombinante, von Human-Leucocyten abgeleitetes HGF erzeugende CHO-Stamm 515C (HGF des Typs mit einer Deletion von 15 Nucleotiden) wurde bei 37°C in α-MEM-Kulturmedium (Flow-Laboratory Corp.), das frei von Ribonucleosiden und Desoxyribonucleosiden war, aber 10% Rinderfetusserum (Gibco), 1% Glutamin und 2 μM Methotrexat enthielt, in 5% CO₂ kultiviert, bis die Zellen konfluent wurden. Nach der Kultivierung wurde die Kulturlösung entfernt, und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Dazu wurde α-MEM-Kulturmedium gegeben, das frei von Ribonucleosiden und Desoxyribonucleosiden war, dem aber 1% Glutamin, 500 μM Methotrexat und 400 Einheiten/ml Aprotinin, ein Protease-Inhibitor, zugesetzt worden waren, und die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert. Nach der Kultivierung während etwa 1 Tages wurde der Kulturüberstand geerntet, und rekombinantes HGF wurde in derselben Weise wie in Beispiel 6 durch ein Chromatographieverfahren gereinigt. Die Ausbeute der Aktivitätsgewinnung aus dem Kulturüberstand betrug etwa 15%.
Das gereinigte rekombinante, von Human-Leucocyten abgeleitete HGF des Typs mit einer Deletion von 15 Nucleotiden wurde einer SDS-Acrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Die Ergebnisse sind in 15 zusammengefasst. Das gereinigte rekombinante HGF zeigte unter nichtreduzierenden Bedingungen eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 70 000 bis 90 000 und unter reduzierenden Bedingungen mit 2-Mercaptoethanol eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 80 000 bis 95 000, was darauf hinweist, dass das erhaltene rekombinante HGF einkettig war. Weiterhin wurde die biologische Aktivität des rekombinanten einkettigen HGF gemessen; dies beinhaltete die Messung der Wachstumsaktivität bei einer Primärkultur von Ratten-Hepatocyten, wie es unter "Bestimmung der HGF-Aktivität" beschrieben ist. Als Ergebnis zeigte das rekombinante einkettige HGF eine Hepatocytenwachstumsaktivität, und seine relative Aktivität war fast die gleiche wie die in Beispiel 6, 4) erhaltene; sie betrug 200–500 Tausend Einheiten/mg.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Hepatocytenwachstumsfaktors (HGF), umfassend 1) Transformieren von Säugerzellen mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der einen Promotor, ein Gen, das für eine in 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, und das DHFR-Gen enthält; 2) Kultivieren der transformierten Zellen in Gegenwart von sukzessive erhöhten Konzentrationen an Methotrexat; und 3) Ernten des HGF aus konditionierten Medien der in 2) erhaltenen Zellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Säugerzellen CHO-Zellen sind und der Promotor der frühe SV40-Promotor ist.
Transformanter Stamm mit hoher HGF-Produktion, erhältlich durch das Verfahren, das Folgendes umfasst: 1) Transformieren von Säugerzellen mit einem rekombinanten Expressionsvektor, der einen Promotor, ein Gen, das für eine in 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, und das DHFR-Gen enthält; 2) Kultivieren der transformierten Zellen in Gegenwart von sukzessive erhöhten Konzentrationen an Methotrexat; und 3) Etablieren eines Stammes mit hoher HGF-Produktion.
Transformanter Stamm mit hoher HGF-Produktion gemäß Anspruch 3, wobei die Säugerzellen CHO-Zellen sind.
Verfahren zur Herstellung von HGF durch Ernten des HGF aus dem konditionierten Medium des Stammes gemäß Anspruch 3 oder 4.