KR20020097319A - 사람 간세포 성장인자 코딩 벡터, 형질전환 균주 및이로부터 발현된 재조합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 간세포 성장인자 코딩 벡터, 형질전환 균주 및 이로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사람의 간세포 성장인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 pMC/hHGF 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 포유동물 세포주 및 이로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것이다. 따라서, 이러한 본 발명에 따른 형질전환 CHO 세포주는 약 5ug/ 106cell/day의 재조합 단백질 발현율을 나타내어 간세포 성장인자 재조합 단백질을 안정적이면서도 고수율로 수득할 수 있는 효과가 있다.

Description

사람 간세포 성장인자 코딩 벡터, 형질전환 균주 및 이로부터 발현된 재조합 단백질{HUMAN HEPATOCYTE GROWTH FACTOR CODING VECTOR, TRANSFORMANT AND RECOMBINANT PROTEIN THEREFROM}
본 발명은 사람 간세포 성장인자 코딩 벡터, 형질전환 균주 및 이로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사람의 간세포 성장인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 pMC/hHGF 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 포유동물 세포주 및 이로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것이다.
일반적으로, 간세포 성장인자는 간세포의 분열을 유도하는 물질로서 최초에 알려졌으며(Michalopouloset al., Cancer Res. 1984. 44, 4414-4419; Nakamuraet al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1984. 122, 1450-1459), 나까무라(Nakamura)등에 의하여 부분 간절제 시술을 받은 쥐의 혈장으로부터 분리정제되었으며, 고다(Gohda) 등은 사람의 혈장에서 간세포 성장인자의 분리를 시도하였다(J. Clin. Invest. 1988. 81, 414-419). 이러한 사람의 간세포 성장인자는 분비 단백질로서 혈장에 존재하는 형태는 S-S 결합에 의하여 연결된 두 개의 단위체, α와 β로 구성된다. 이들은 728 아미노산 잔기로 이루어진 하나의 전구체 단백질(pro-HGF)로 합성되어 분비된 후, R494와 V495 잔기 사이의 아미노 결합이 단백질 분해 효소에 의하여 절단되어 α(441 아미노산 잔기, 65 kDa)와 β(234 아미노산 잔기, 34 kDa) 단위체로 나뉘어진다. 전구체 단백질은 수용체에 대한 높은 친화도를 보이지만, 두 개의 단위체로 구성된 형태만이 생리적 활성을 나타낸다(Lokkeret al., EMBO J. 1992. 11, 2503-2510). 또한, 간세포 성장인자는 당단백질로서 α와 β 단위체에 각각 두 개의 당쇄가 첨가된다.
그리고, 간세포 성장인자의 기능은 간기능 저하, 또는 간조직 손상시 혈장내 농도가 빠른 속도로 증가되는 것으로 보아 간 재생의 초기 반응에서 중요한 작용을 담당하는 것으로 보인다. 또한, 간세포 성장인자는 간세포뿐 아니라 다양한 표피 세포 및 진피 세포, 조형 세포, 케라틴 세포, 멜라닌 세포의 분열을 촉진하는 것이 잇따라 규명되었으며(Matsumotoet al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991. 176, 45-51; Rubinet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991. 88, 415-419), 특히, 표피, 진피 세포의 배양시에는 분열과는 독립적으로 세포의 이동 및 분산을 유도하는 인자(scatter factor)로도 알려져 있다(Stokeret al.,Nature 1987. 327, 239-242). 간세포 성장인자는 표피세포의 형태 분화에도 관여함이 보고되어있으며(Montesanoet al., Cell 1991. 67, 901-908), 일부 악성종양의 경우에는 간세포 성장인자 수용체가 항상 활성화 형태로 존재하는 것이 관찰되는 것으로 보아 세포의 종양발현기작에도 관여하는 것으로 보인다(Cooperet al., EMBO J. 1986. 5, 2623-2328).
그런데, 간세포 성장인자를 얻는 방법으로는 쥐의 혈소판(Nakamuraet al., Nature 1989. 342, 440-443)이나, 토끼 또는 사람의 혈장(Zarneger and Michalopoulos, Cancer Res. 1989. 49, 3314-3320), 사람의 태반 (Hernandezet al., J. Cell Phys. 1992. 150, 116-121) 등으로부터의 분리정제가 보고된 바 있다. 또한, COS(Miyazawaet al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989. 163, 967-973), MRC-5 (Rubinet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991. 88, 415-419) 세포 등을 대상으로 한 재조합 DNA방법도 시도되었으나, 대량 생산에 적합한 높은 생산효율을 얻지는 못하였다. 현재에는 간세포 성장인자의 생산에는 곤충세포가 가장 널리 사용되고 있는데, 이러한 방법은 발현율이 약 1 내지 5 ㎍/㎖ 수준으로 그리 높지 않을 뿐만 아니라(Yeeet al., Biochemistry 1993. 32, 7922-7931), 간세포 성장인자가 생리적 활성을 가지기 위해서는 반드시 단백질의 절단과정을 거쳐야 하는데, 대부분의 곤충세포는 이 과정에서 배양배지에 첨가된 혈청이 필수적으로 요구되는 문제점이 있어 왔다(Wanget al., Biotechnol. Prog. 2000. 16, 146-151).
또한, 상기와 같이 당쇄화나 절단 등의 변형을 거쳐 합성되는 단백질 생산에 가장 이상적인 발현시스템으로 포유동물 세포에 대한 연구가 진행되고 있다.이러한 동물 세포발현시스템은 미생물 발현 시스템과 달리 외래유전자를 숙주세포의 염색체로 삽입시켜 외래단백질을 발현하는 시스템이기 때문에 동물 발현시스템에서의 외래유전자 발현은 외래유전자가 삽입된 주변의 염기서열, 증폭된 외래유전자의 수, mRNA 전사기작, mRNA의 안정성 등에 의하여 결정되어 조작과정이 어렵고, 생산단가가 높을 뿐만 아니라, 여러 가지 변수들에 의하여 고효율의 발현시스템으로 확립되기가 매우 어려워 쉽게 활용되지 못하고 있는 것이 현실이다.
따라서, 이러한 동물세포 발현시스템에 대한 개선의 필요성이 절실히 요구되는 실정이었다.
이에, 본 발명의 별명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 사람의 간세포성장인자를 코딩하는 유전자를 동물세포용 벡터에 클로닝시켜 pMC/hHGF 벡터를 제조한 다음, 이 벡터를 이용해 포유동물 세포주 중 CHO 세포주에 형질전환시키고, 이 형질전환체로부터 목적 단백질을 고수율로 발현시켜 분리할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 동물세포에서 사람의 간세포 성장인자를 코딩하는 유전자를 포함한 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 사람의 간세포 성장인자 단백질을 발현, 분비하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
그리고, 본 발명의 또다른 목적은 상기 형질전환체로부터 발현되는 서열번호 2의 간세포 성장인자 재조합 단백질을 제공하는 데에 있다.
도 1은 본 발명의 pMC/hHGF 벡터의 모식도를 도시한 것이고,
도 2는 선별된 형질전환주에서 발현되는 HGF 재조합 단백질을 웨스턴블롯으로 확인한 것이고,
도 3은 재조합 HGF에 의한 MDCK 세포의 분산 효과를 관찰한 것이다.
이하, 본 발명의 사람 간세포 성장인자 코딩 벡터, 형질전환 균주 및 이로부터 발현된 재조합 단백질에 대해 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
우선, 본 발명은 사람의 간세포 성장인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터는 동물세포용 발현벡터에 서열번호 1의 cDNA 염기서열을 갖는 사람의 HGF 유전자를 클로닝시킨 것으로, pMC/hHGF 벡터가 바람직하다(참조: 도 1). 도 1은 본 발명의 pMC/hHGF 벡터 모식도를 나타낸 것으로, HGF cDNA는 다수클로닝 부위에 존재하는NheI 및SalI 제한효소 위치에 삽입되어 있다.
또한, 본 발명은 상기의 pMC/hHGF 재조합 벡터를 이용해 형질전환시킨 HGF 재조합 단백질을 발현, 분비하는 형질전환체, 바람직하게는 포유동물 세포주이다. 여기서, 포유동물 세포주는 삽입된 외래유전자 수에 비례하여 재조합 단백질을 발현하는 안정된 발현양상을 나타내는 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 가장 바람직한 포유동물 세포주의 예로 형질전환 세포주 CHO DG44(KCLRF-BP-00038)를 사용한다. 상기 세포주는 pMC/hHGF 벡터로 형질전환하여 선별된 세포주로, 염색체내에 다수의 HGF 유전자를 포함하고 있으며, 증폭된 HGF 유전자를 안정하게 발현하여 약 2 ∼ 5 ㎍/106cell/day의 효율을 보인다.
마지막으로, 본 발명은 상기에서 제조되는 서열번호 2의 사람의 간세포 성장인자(HGF) 재조합 단백질을 포함한다. 상기 재조합 단백질은 pMS/hHGF 벡터에서제조되는 것으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 당쇄화된 형태의 재조합 단백질로서, HGF의 생리학적 활성을 유지하여 폭넓은 잠재적 유용성을 지닌다. 특히, 본 발명에 따른 사람의 간세포 성장인자(HGF) 재조합 단백질은 간경화, 간염등의 질환과 간절제 시술후 처치를 위한 의약적 용도로 사용될 수 있으며, 상기 간질환을 진단하는 면역학적 방법에도 적용될 수 있다. 아울러, 간세포의 배양을 촉진함으로써 이를 사용한 기초 의과학 연구와 호르몬 및 약물의 효과 분석 등에 널리 사용될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명에 대해 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:hHGF의 재조합 발현벡터 제조
사람의 HGF 유전자를 얻기 위하여 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. 상기 역전사 중합효소 연쇄반응에는 간세포로부터 추출한 mRNA와 서열번호 3과 4의 프라이머(서열번호 3; 5'-CGT CCA GCA GCA CCA TGT GGG TGA CCA AAC-3', 서열번
호 4; 5'-CAC TTA CTT CAG CTA TGA CTG TGG TAC C-3'), TitanTMOne-Tube RT-PCR Kit(Boehringer Mannheim)이 사용되었다. PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터 (Promega)에 클로닝하였다. 25oC에서 1 시간동안 반응시켜 PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터에 삽입한 다음 대장균 JM109에 형질전환시켰다. 형질전환체는 X-gal이 포함된 배지에 평판배양하여 흰색을 띠는 콜로니를 선별한 다음, pGEM-T 이지 벡터에삽입된 PCR 산물을 분리하고 약 2.2 kb의 DNA 절편의 염기서열을 확인하였다 (서열번호 1).
상기 hHGF cDNA를 동물세포용 발현벡터에 삽입하기 위하여NheI 및SalI 제한효소 인식서열을 포함하도록 통상의 방법을 이용하여 변형하였다. 서열번호 5과 6의 프라이머(서열번호 5; 5'-CGT CGC TAG CCA CCA TGT GGG TGA CCA AAC TC-3' 밑줄부분은NheI 인식 서열임, 서열번호 6; 5'-TTA CGT CGA CTA TGA CTG TGG TAC CTT ATA TG-3' 밑줄친 부위는SalI 인식 서열임) 쌍을 이용하여 다시 PCR하였다. 그 결과, 발현벡터에 의하여 제조되는 재조합 HGF 단백질은 728 아미노산 잔기로 구성된 전구체 단백질(pro-HGF)로서, N 말단의 신호펩타이드(아미노산 1 ∼ 53)가 제거된 후에는 약 85kDa의 분자량을 갖으며, 4개의 잔기(α단위체: 294와 402; β단위체: 566와 653)에 당쇄가 첨가된 형태로, 두 단위체의 분자량은 각각 65와 34kDa이다.
실시예 2:CHO 세포주의 형질전환
pMC/hHGF 플라스미드를 제한효소ScaI으로 처리한 다음 CHROMA SPINTM(Clontech)을 사용하여 정제하였다. 형질도입 하루 전에 2 × 106개의 CHO DG44 세포를 6웰 플레이트에 접종하고, 10% qualified FBS (fetal bovine serum)와 리보뉴클레오사이드 및 디옥시리보뉴클레오사이드가 포함된 MEM-α(Minimum Essential Medium Alpha, GIBCO BRL) 배지에서 배양하였다. pMC/hHGF(2㎍)와 pDCH1P(17ng)를 100:1 비율로 도스퍼(Dosper: Boehringer Mannheim사)와 함께 배지에 혼합하여 상온에서 40분 동안 반응시켰다. 상기 pDCH1P는 인간 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자가 선별표지로 삽입되어 있어 형질전환체를 쉽게 선별할 수 있게 한다. 세포를 세척하고 혈청이 포함되지 않은 MEM-α배지로 교환한 다음 상기 혼합물을 배지에 첨가하여 6시간 반응시켰다. 다시 10 % FBS MEM-α배지로 교환하고, 2일 후 리보뉴클레오사이드 및 디옥시리보뉴클레오사이드가 포함되지 않은 MEM-α배지로 다시 교환하여 DHFR 유전자 발현에 대한 선별을 시작하였다. 약 2주간의 1차 선별을 거친 후 DHFR의 저해제인 MTX (methotrexate)를 배지에 첨가하였다. 점차적으로 MTX 농도를 높이면서 DHFR 발현 수준이 높은 세포주를 선별하였다. 이 가운데 발현 효율이 높은 것으로 나타난 형질전환주를 취하여 한국세포주 은행(Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁하였으며, 기탁번호 KCLRF-BP-00038를 부여받았다.
실시예 3:형질전환주의 HGF 재조합 단백질 발현 확인
선별한 세포 1 x 105개를 48 웰 플레이트에 접종하여 100 ㎕의 무혈청 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 배지 가운데 일정량을 취하여 SDS-PAGE한 다음 니트로셀룰로우즈 막에 젤상의 단백질들을 이동시켰다. 일차 항체는 HGF에 대한 토끼의 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 1:1000 비율로 희석하여 사용하였고, 이차 항체로는 염소의 항-토끼 IgG 항체(goat anti-rabbit IgG, Zymed Laboratories Inc.)를 1:5000 비율로 사용하였다. 또한 형질전환 세포주의 HGF 발현량을 결정하기 위하여 곤충세포에서 발현시킨 재조합 HGF(Sigma사)를 대조군으로사용하여 비교하였다. 웨스턴 블롯의 결과는 ECLTM(Enhanced ChemiLuminescent Detection System: Amersham Pharmacia Biotech Inc.)을 사용하여 분석하였다. 여기서, 도 2는 MTX 농도에 따라 선별된 형질전환주에서 발현되는 HGF를 웨스턴 블롯으로 확인한 것으로, 각 레인은 여러 MTX 농도에서 선별된 형질전환주를 48 시간 배양한 다음 10 ㎕의 배양액을 전기영동한 것이다. 그 결과, 5 μM MTX를 포함하는 배지(2번 레인)에서 가장 높은 발현율을 나타내었으며, 대조군 단백질과 비교하였을 때 발현율은 약 5 ㎍/106cell/day으로 측정되었다.
실험예 1:HGF 발현율 측정
최종적으로 선별된 콜로니를 2일 배양하여 ELISA 분석하여 발현 단백질 양을 결정하였다. 마이크로플레이트의 각 웰에 대조군과 적정 비율로 희석된 HGF 시료를 넣고 20 ∼ 30℃ 마이크로플레이트 믹서(microplate mixer)에서 1시간 반응시켰다. 5회 반복 세척한 후, 검출 항체와 1시간 반응시키고 다시 세척하였다. 그런 다음, 발색 반응의 기질로서 TMB (tetramethylbenzidine)을 첨가하여 빛을 차단한 상태로 20 ∼ 30℃에서 30분간 반응시킨 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, HGF 발현율은 약 2 ㎍/106cell/day인 것으로 측정되었다.
실험예 2:간세포 성장인자의 생리적 활성 분석
3x105개의 MDCK 세포를 6 웰 플레이트에 넣고 48 시간 배양하였다. 새로운 배지로 교환하면서 적당량 (5 ∼ 50 ng/㎖)의 HGF 시료를 배지에 첨가하고 다시 24시간 배양하였다. HGF를 처리하지 않은 대조군(도 3(b))과 비교하여 MDCK 세포의 분산 효과를 관찰하였다. 그 결과, 도 3에서 보이는 바와 같이 간세포 성장인자는 MDCK 세포의 이동을 유도하며, 인접한 세포 사이의 부착을 감소시켜 분산 현상을 나타냄을 알 수 있었다(Wanget al., Biotechnol. Prog. 2000. 16, 146-151).
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 사람 간세포 성장인자 코딩 벡터, 형질전환 균주 및 이로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 따르면, pMC/hHGF로 형질전환된 CHO 세포주는 사람의 간세포 성장인자 재조합 단백질을 약 2 ∼ 5 ㎍/106cell/day 의 고수율로 발현, 분비한다. 그 결과, 발현분비된 본 발명의 재조합 단백질은 HGF의 생리적 활성을 유지하여 폭넓은 잠재적 유용성을 지닐 뿐만 아니라, 간경화, 간염 등의 질환과 간절제 시술 후 처치를 위한 의약적 용도로 사용될 수 있으며, 상기 간질환을 진단하는 면역학적 방법에도 적용될 수 있다. 아울러, 간세포의 배양을 촉진함으로써 이를 사용한 기초 의과학 연구와 호르몬 및 약물의 효과 분석 등에 널리 사용될 것으로 기대된다.

Claims (5)

  1. 사람의 간세포 성장인자(Human Hepatocyte Growth Factor)-코딩 유전자를 포함하는 pMC/hHGF 재조합 발현벡터.
  2. 상기 제 1항의 pMC/hHGF 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 형질전환체는 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 형질전환체는 pMC/hHGF 재조합 벡터로 형질전환된 CHO DG44 (KCLRF-BP-00038)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  5. 상기 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 형질전환체로부터 제조되는 서열번호 2의 사람 간세포 성장인자 재조합 단백질.
KR1020010034971A 2001-06-20 2001-06-20 사람 간세포 성장인자 코딩 벡터, 형질전환 균주 및이로부터 발현된 재조합 단백질 KR20020097319A (ko)

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