KR100882560B1

KR100882560B1 - 배지 첨가제 및 동물 세포 배양용 배지

Info

Publication number: KR100882560B1
Application number: KR1020027017220A
Authority: KR
Inventors: 사사키마사히로; 야마다히데유키; 오사다가츠에; 데라다사토시
Original assignee: 세이렌가부시끼가이샤
Priority date: 2001-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2009-02-12
Also published as: US20070020760A1; US7157273B2; JP4047176B2; EP1302544A1; EP1302544B1; ATE422216T1; WO2002086133A1; EP1302544A4; DE60231074D1; US7803616B2; KR20030032968A; JPWO2002086133A1; US20030134388A1

Abstract

본 발명의 목적은 동물 세포 배양 및 동물 세포 배양용 배지를 위한 배지 첨가제를 제공하는 것이다. 본 발명은 세리신 또는 그 유도체를 포함하는 동물 세포 배양을 위한 배지 첨가제 및 적어도 상기 배지 첨가제 및 기초 배지 조성물을 포함하는 동물 세포 배양용 배지에 관한 것이다.

동물 세포 배양, 세리신, 세리신 유도체

Description

배지 첨가제 및 동물 세포 배양용 배지{MEDIUM ADDITIVES AND MEDIA FOR CULTURING ANIMAL CELLS}

본 발명은 동물 세포 배양을 위한 배지 첨가제 및 이를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에 관한 것이다.

최근 생명과학 분야에서는, 세포 배양 기술 또는 조직 배양 기술을 사용하여, 목적 물질을 생성하는 동물 세포의 대규모 배양에 의해, 산업적 규모로 유용한 물질을 생성하는 것이 중요해지고 있다. 통상 이와 같이 하여 목적으로 하는 동물세포를 배양하는 경우, 아미노산, 비타민, 무기염 및 당류 등으로 이루어지는 기초배지에, 동물 세포 증식 인자를 첨가한 배양 배지를 사용한다. 동물 세포 증식 인자로서는 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청과 같은 혈청 성분이 일반적으로 사용된다. 일반적으로, 소 태아 혈청 또는 소 새끼 혈청은 약 5 내지 20 부피% 정도로 기초 배지에 첨가되는 것이 필요하다.

그러나, 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청과 같은 혈청 성분은 일반적으로 고가이고, 공급이 제한된다. 이것은 목적으로 하는 생성물의 제조 비용을 증가시킬 것이다. 또한, 혈청은 집단들 사이에 그 특성이 다른 경향이 있어서, 재생성을 요하는 배양에 바람직하지 않다. 게다가, 혈청을 사용한 배양시에는, 배양 상청액(supernatant)으로부터 생성물을 회수하는 경우에 정제시키는 것이 때때로 어렵다. 더욱이, 동물로부터 유도된 혈청에는, 야곱병을 일으킬 우려가 있는 광우병이나 양의 스크래피(scrapie)라는 프리온에 더하여, 바이러스에 의한 감염의 위험이 있기 때문에, 목적으로 하는 생성물의 안전이 충분하게 보장되지 못할 수도 있다.

게다가, 혈청을 포함하는 배지가 생물과학 분야의 실험에서 사용될 때, 실험 시스템이 복잡해지는 경향이 있어서, 원인과 결과의 인과 관계의 논의시에 혼란을 초래할 수 있다. 이는 혈청이 미지의 성분을 포함하는 매우 다양한 성분을 포함하고 있기 때문이다.

그러므로, 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청과 같은 혈청 대신에, 공지된 세포 성장 인자, 호르몬 등을 포함하는 세포 배양용 배지에 대한 관심이 모여졌다.

그러나, 이들 세포 성장 인자 또는 호르몬은 자연계에서 그 존재가 희귀하여 그 사용이 제한적이며, 일반적으로 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청보다 훨씬 더 고가이다.

따라서, 상기의 혈청, 공지된 세포 성장 인자 등을 대체할 수 있는 안전하고 비교적 저렴한 세포 증식 인자 또는 세포 증식 방법이 요구되고 있다.

일반적으로, 동물 배양 세포는 배지 안에서의 존재상태에 따라 부착성 세포 및 부유성 세포로 분류된다. 동물세포를 대량 배양하는데 있어서는, 그 세포의 배지안에서의 배양형태에 따른 고안에 의해, 세포의 증식 촉진을 꾀하는 것이 검토되고 있다. 예를 들어, 부착성 세포의 배양을 위해, 세포의 접착성을 증가시킴으로써 세포 증식을 촉진하는 시도가 이루어졌다. 여기서, 세포 접착성을 증가시키기 위해서, 세포 배양대(cultrure bed) 기재의 표면에 콜라겐을 사용한 박층 코팅의 사용이 논의되었다. 그러나, 비록 상대적으로 쉽게 사용할 수 있긴 하지만, 일반적으로 콜라겐이 소로부터 유도되기 때문에 상기한 광우병 감염의 위험이 고려되어야 한다.

콜라겐 필름 코팅 처리 대신에, 실크 필름을 포함하는 세포 배양대의 사용이 일본 특허공개 평11-243948호 및 평11-253155호에서 제안되고 있다. 그러나, 이런 배양대는 상기 콜라겐 코팅된 배양대와 같이 세포 접착성을 증가시키고 세포 증식을 촉진시키지만, 피막 형성시에 실크 단백질을 불용화시키기 위한 결정화처리가 필요하기 때문에, 처리가 복잡해진다.

이와같이, 배양대를 위한 실크에서 유도된 성분의 사용은 공지되었으나, 고치나 생사 등으로부터 유도된 성분을 세포 배양에 사용하는 것은 본 발명자가 알고 있는 한 논의되지 않았다.

이제 본 발명자는 동물 세포가, 누에고치 등으로부터 제조될 수 있는 세리신(sericin)이 첨가된 동물 세포 배양을 위한 기초 배지에서 배양될 때, 목적으로 하는 동물 세포가 효과적으로 증식할 수 있다는 것을 발견하였다. 게다가, 세리신에 의한 동물 세포에 대한 이런 증식 촉진 효과는, 화학적으로 합성된 세리신 및 유전 공학적 방법에 의해서 얻어진 세리신에서도 유사하게 관찰되었다. 본 발명은 이 발견물들에 기초하여 만들어졌다.

따라서, 본 발명의 목적은, 배지에 뛰어난 세포 증식 촉진 능력을 부여하고, 안전과 처리 면에서 뛰어난 동물 세포 배양용 배지 첨가제 및 배지를 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 동물 세포 배양용 배지 첨가제는 세리신 및 그 유도체를 포함한다.

더욱이, 본 발명에 따른 동물 세포 배양용 배지는, 적어도 상기의 배지 첨가제 및 배지 기초 성분을 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에 따라, 상기의 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계, 얻어진 배지를 사용하여 동물 세포를 배양하는 단계, 및 상기 동물 세포를 증식시키는 단계를 포함하여, 동물 세포를 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기의 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계, 얻어진 배지를 사용하여 단백질을 생성할 능력이 있는 동물 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배지 및/또는 상기 동물 세포로부터 생성된 단백질을 회수하는 단계를 포함하여, 단백질을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기의 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계, 얻어진 배지를 사용하여 바이러스 벡터에 감염된 동물 세포를 배양하여 증식시키는 단계, 및 상기 배지 및/또는 상기 동물 세포로부터 바이러스 벡터를 회수하는 단계를 포함하여, 바이러스 벡터를 복제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에 따라, 동물 세포 증식 촉진제를 생성하기 위해 세리신 또는 그 유도체의 사용이 제공된다.

본 발명에 따른 배지 첨가제 및 이것을 함유하는 배지는, 배양되는 동물 세포의 증식을 촉진시킬 수 있고, 세포의 생존 능력을 향상시킬 수 있다. 또한, 배지 첨가제 및 배지를 유용한 대상 물질을 생성할 능력이 있는 동물 세포의 배양에 사용함으로써, 유용한 물질의 생성이 증진될 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 배지 첨가제 및 이것을 포함하는 배지의 사용에 의한 이러한 효과는, 세포의 상태 즉, 부유성 세포 또는 부착성 세포, 및 세포의 유형 즉, 세포주(cell line) 또는 정상 세포와는 독립적으로 부여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따라, 동물 세포를 배양하는데 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청과 같은 혈청 성분의 양이 감소될 수 있거나, 또는 그 사용이 제거될 수 있기 때문에, 배양 생성물의 안전이 향상될 수 있다. 본 발명에 따른 배지 첨가제는, 이것을 배지에 첨가하는 것만으로 세포 증식을 간단히 촉진할 수 있기 때문에, 조작 및 처리면에서 유익하다. 본 발명에서 사용되는 세리신은 혈청 성분 보다 저렴하기 때문에 동물 세포 및 유용한 물질의 생성 비용을 절감할 수 있다.

배지 첨가제

본 발명에 따른 동물 세포 배양용 배지 첨가제는, 세리신 또는 그 유도체를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 배지 첨가제는 동물 세포 증식 촉진제로 사용된다.

세리신 또는 그 유도체

본 발명에 따른 세리신 또는 그 유도체는 천연으로부터 유도될 수도 있고, 통상의 화학 및/또는 유전 공학적 방법을 사용하여 인공적으로 합성될 수도 있으며, 둘 중 하나가 포함될 수 있다.

세리신

본 발명에서의 세리신은 천연적으로 유도되거나 합성되어진 것으로서, 세리신 단백질의 전부 또는 일부가 공지된 것이라면, 어느 것이든 포함된다. 이 세리신은 세포 증식 촉진 활성을 갖는다.

본 발명에서, 천연적으로 유도된 세리신은 바람직하게는 앞으로 기술되는 방법에 의해 얻어진다.

일반적으로, 길이가 2.6kbp 내지 10.6kbp인 여러 종류의 세리신 유전자는 예를 들어, Journal of Biological Chemistry 257, 15192-15199(1982)에서 입증되고 기술된다. 본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신은 그러한 유전자 서열을 가진다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신은 그 전체 서열이, 실질적으로 서열 ID No:2의 아미노산 서열을 포함한다. 전형적으로, 이 아미노산 서열은 38 아미노산(서열 ID No:1)으로 구성되는 본질적 지역 및 다른 비본질적 지역을 포함한다. 바람직하게는, 세리신은 상기 본질적 지역을 반복단위의 서열로서 포함한다. 예를 들어, 서열 ID No:2의 아미노산 서열을 포함하는 세리신은, 38 아미노산(서열 ID No:1)으로 구성되는 본질적 지역이 12 반복단위를 포함한다.

서열 ID No:2의 아미노산 서열을 인코딩하는 세리신 염기 서열에 대한 데이터는, 접근 번호: Z48802로 EMBL 데이터 라이브러리에 등록되었고, NCBI 홈페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 등에서 검색 및 사용할 수 있다.

본 명세서에서, 세리신이 "실질적으로 서열 ID No: 2의 아미노산 서열을 포함한다"라는 표현의 의미는, 세리신이 세포 증식 촉진 활성을 갖는 한, 하나 또는 그 이상의(바람직하게는 1 내지 2000, 보다 바람직하게는 1 내지 500 및 더욱 더 바람직하게는 1 내지 300) 아미노산 서열(서열 ID No: 2)에서의 아미노산 잔기가 결실(缺失)되고, 치환되고, 삽입되고 또는 첨가될 수 있다는 것을 의미한다. 바람직한 실시예에 따라, 세리신이 천연적으로 유도될 때, 상기 아미노산 서열에서 결실되고, 치환되고, 삽입 또는 첨가되는 아미노산 잔기의 숫자는, 바람직하게는 1 내지 2000, 더욱 바람직하게는 1 내지 500, 더욱더 바람직하게는 1 내지 300이 될 수 있다.

아미노산 잔기의 상기 결실, 치환, 삽입 또는 첨가가 존재할 때, 이들은 바람직하게 본질적 지역 이외의 지역에 위치될 수 있다. 이런 경우에, 보존성 치환은 본질적 지역에서 발생할 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 실시예에 따라, 상기 세리신의 아미노산 서열은 세리신이 세포 증식 촉진 활성을 갖는 한, 그 아미노산 서열의 예를 들어, 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 1 내지 50, 더욱 바람직하게는 1 내지 20이 보존적으로 치환될 수 있다.

본 명세서에서 보존적 치환이란, 실질적으로 단백질 기능의 변화없이, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기와 다른 화학적으로 유사한 아미노산 잔기와의 치환을 의미한다. 예를 들어, 어떤 소수성 잔기는 다른 소수성 잔기와 치환될 수 있고, 어떤 극성 잔기는 동일한 전하를 띄는 다른 극성 잔기와 치환될 수 있고, 또는 어떤 방향족 아미노산은 다른 방향족 아미노산과 치환될 수 있다. 이런 방식으로 보존적으로 치환될 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산은, 모든 아미노산에 대한 기술분야에서 공지되었다. 다음의 6개 그룹은 구체적인 예이다. 동일한 그룹 내의 이런 아미노산은 상호간에 보존적으로 치환될 수 있다.

(1) 알라닌(Alanine(Ala)), 세린(serine(Ser)) 및 트레오닌(threonine(Thr))

(2) 아스파르트산(Aspartic acid(Asp)) 및 글루탐산(glutamine(Glu))

(3) 아스파라긴(Asparagine(Asn)) 및 글루타민(glutamine(Gln))

(4) 아르기닌(Arginine(Arg)) 및 리신(lysine(Lys))

(5) 이소류신(Isoleucine(Ile), 류신(leucine(Leu)), 메티오닌(methionine(M et), 발린(valine(Val)) 및

(6) 페닐알라닌(phenylalanine(Phe), 티로신(tyrosine(Tyr)), 및 트립토판(t ryptophan(Trp)).

본 명세서에서, 세리신은 가수분해되지 않는 세리신(여기서 종종 "세리신 비가수분해물"로 언급된다)과 세리신 가수분해물을 자연스럽게 의미한다. 여기서 이 세리신 가수분해물은 통상의 방법, 예를 들어, 산, 알칼리, 효소 또는 기타를 사용하여, 세리신을 가수분해함으로써 얻어질 수 있다.

세리신 유도체

본 발명에서 세리신 유도체는, 본질적 지역으로서 38 아미노산으로 구성되는 서열 ID No: 1의 아미노산 서열을 적어도 포함하는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 이 세리신 유도체는 상기 본질적 지역과, 그 하나 또는 양쪽 말단에서 비본질적 지역을 포함하는 것으로서, 세포 증식 촉진 기능을 갖는다.

본 명세서에서 "세포 증식 촉진 기능을 갖는다"는 표현은, 폴리펩티드의 세포 증식 촉진 활성이 당업자에게 인정된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 다음의 실시예의 평가 시험 1에서 기술된 것과 동일한 조건하에서 측정될 때 세포 증식 촉진 활성이 인정되는 경우를 의미한다.

그래서, 본 발명의 세리신 유도체는, 오직 본질적 지역만을 포함할 수도 있고, 또는 적어도 본질적 지역을 포함하며 상기 세리신 유도체가 세포 증식 촉진 능력을 갖는 한, 본질적 지역 이외의 임의의 비본질적 지역을 포함할 수도 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신 유도체는 2000이하, 보다 바람직하게는 500이하, 및 더욱더 바람직하게는 300이하의 아미노산 서열의 전체길이를 갖는다.

더욱이, 본 발명의 보다 바람직한 실시예에 따라, 본질적 지역의 하나 또는 양쪽 말단에서 존재할 수 있는 비본질적 지역에서의 아미노산 잔기의 숫자는, 바람직하게는 1000이하, 더욱 바람직하게는 300이하, 더욱더 바람직하게는 100이하 이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 세리신 유도체는 서열 ID No: 1의 아미노산 서열을 여러번 반복한 서열을 갖는다. 즉, 세리신 유도체는 본질적 지역 이외에, 서열 ID No: 1과 동일한 아미노산 배열을 하나 이상 포함한다. 이런 반복 서열을 갖는 폴리펩티드가 향상된 세포 증식 촉진 활성을 갖는다고 여겨진다.

본 발명의 보다 바람직한 실시예에 따라, 세리신 유도체는 그 아미노산 서열에서 아미노산 잔기 100개당 적어도 하나, 더욱 바람직하게는 적어도 두개의 서열 ID No:1의 아미노산 서열을 갖는다. 세리신 유도체 안에 함유된 서열 ID No:1의 아미노산 서열의 함유비율은 높은 것이 바람직하다. 비록 세리신 유도체의 전체 길이에서의 아미노산 잔기의 숫자가 증가될지라도, 안정한 세포 증식 촉진 활성은 이러한 비율로 반복 서열을 갖음으로써 얻어질 수 있다.

합성에 의해 얻어질 때, 세리신 유도체는 바람직하게는 서열 ID No: 1의 아미노산 서열의 2 내지 8 반복단위, 더욱 바람직하게는 2 내지 6 반복단위, 및 더욱더 바람직하게는 2 내지 4 반복단위를 가지는 것이 좋다. 이런 수치는 합성 생성에서 유리하기 때문에 바람직하다.

본 발명에서, 예를 들어, 하나 내지 여러개, 바람직하게는 1 내지 5, 보다 바람직하게는 1 내지 3 아미노산 서열이, 세리신 유도체의 본질적 지역에서 보존적으로 치환될 수 있다.

본 발명에서, 세리신 유도체는, 예를 들어, 서열 ID No: 1의 상기의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 및 이종 폴리펩티드(예를 들어, 다른 기능성 단백질)를 하이브리드 시킨 융합 단백질을 포함한다.

본 명세서에서, 세리신 유도체는 가수분해 되지 않는 세리신 또는 세리신 유도체(여기서 종종 "비가수분해물"로 언급된다)을 자연스럽게 포함하고, 나아가 세리신 유도체의 가수분해물도 포함한다. 이 가수분해물은 통상의 방법, 예를 들어, 산, 알칼리, 효소 등을 사용하여 세리신 유도체를 가수분해함으로써 얻어질 수 있다.

천연적으로 유도된 세리신 또는 그 유도체

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신 및 그 유도체는 천연 자원으로부터 유도될 수 있다. 천연적으로 유도된 생성물은 인체에 안전하고 상대적으로 저렴하기 때문에 유익하다. 이런 세리신 또는 그 유도체는 배지 첨가제로서 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신 또는 그 유도체는 고치 또는 생사로부터 추출된다. 이 고치는 누에고치를 의미하고 생사는 누에고치로부터의 생사 섬유를 의미한다.

본 발명에서, 이 세리신 또는 그 유도체, 특히, 이들의 비가수분해물은, 통상의 추출 방법에 의해 고치 또는 생사로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 보다 구체적으로, 다음과 같이 추출에 의해 90%이상의 순도로 매우 정제된 단일 단백질로 얻어질 수 있다.

첫번째로, 고치 또는 생사는 물, 바람직하게는, 약 80 내지 100℃의 뜨거운 물속에서 처리함으로써 고치 또는 생사에 함유된 세리신을 상기 물 안에 용해시켜 수성 세리신 용액이 얻어진다. 그래서 얻어진 수성 세리신 용액은 예를 들어, 목적으로 하는 세리신 가수분해물을 회수하기 위해서, 다음 방법 (1),(2) 및 (3)의 어떤 것을 사용하여 분리 정제 처리된다.

(1) 수성 세리신 용액의 pH는, 유기산 또는 무기산으로 3 내지 5로 조절된 후, 세리신을 침전시키기 위해 유기 응집제 또는 무기 응집제가 첨가되고, 그 후에 여과 및 건조되어, 고체 세리신이 얻어진다.

(2) 수성 세리신 용액과, 메탄올, 에탄올 및 디옥산(dioxane)과 같은 수용성 용매를 혼합하여 세리신을 석출한 후, 여과 및 건조된 후에, 고체 세리신이 얻어진다.

(3) 일본 특허공개 평04-202435호에서 기술된바 대로, 수성 세리신 용액은 초여과(ultrafiltration)막 또는 역삼투막에 사용되고, 그 후에 특정 여과법이 실행되고, 건조된 후에 세리신 가루가 얻어진다.

또한, 본 발명에서, 세리신 및 그 유도체의 가수분해물은, 통상적인 추출 방법에 의해 고치 또는 생사로부터 얻어질 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 다음과 같이 추출에 의해 90%이상의 순도로 매우 정제된 단일 단백질로 얻어질 수 있다.

첫번째로, 고치 또는 생사는 물, 바람직하게는, 약 80 내지 100℃의 뜨거운 물속에서 처리함으로써 고치 또는 생사에 함유된 세리신을 상기 물 안으로 용출시켜 수성 세리신 용액이 얻어진다. 이 단계에서, 만일 필요하다면, 세리신은 전기분해된 물, 산, 알칼리 또는 효소를 조합해서 사용하여 부분적으로 가수분해될 수 있다. 얻어진 수성 세리신 용액은, 예를 들어, 목적으로 하는 세리신 가수분해물을 회수하기 위해서 상기의 방법 (1),(2) 또는 (3)을 사용하여 분리 정제 처리된다.

본 발명에서, 바람직하게, 천연적으로 유도된 세리신 또는 그 유도체는, 500 내지 500,000의 분자량 분포를 갖고, 아미노산으로서 20 내지 40 몰% 정도의 세린을 함유한다.

화학적 또는 유전 공학적 방법에 의해 얻어진 세리신 또는 그 유도체

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신 및 그 유도체가 통상의 화학 또는 유전 공학 방법을 사용하여 인공적으로 합성될 수 있다. 전형적으로, 이런 세리신 또는 그 유도체의 세포 증식 촉진 기능은, 천연적으로 유도된 것과 동일하거나 높다. 따라서, 이런 세리신 또는 그 유도체는 배지 첨가제로서 적절하게 사용될 수 있다. 만일 필요하다면, 합성을 위한 이런 화학 및 유전 공학 방법은 조합해서 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에서, 세리신 및 그 유도체는 모두 화학적으로 합성되는 서열일 수 있고, 또는 천연적으로 유도된 세리신의 부분 서열을 사용하고 부분 서열에 기초하여 더욱 합성함으로써 얻어질 수도 있다. 화학적 합성을 위해서, t-Boc 방법 또는 Fmoc 방법을 사용하는 고체상-액체상 합성법과 같은 통상적인 펩티드 합성법이 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에서, 세리신 및 그 유도체는 유전 공학적 방법에 의해 생성될 수 있다. 그래서, 본 발명에서, 세리신 또는 그 유도체를 인코딩하는 DNA가 사용가능할 때 또는 제조될 수 있을 때, 세리신 및 그 유도체는 숙주 세포를 이런 DNA에 의해 형질전환함으로써 얻어지는 형질전환된 세포로 생성될 수 있다.

세리신 유도 펩티드를 인코딩하는 DNA는, 예를 들어, 누에 견사선으로부터 복제함으로써 얻어진 것이어도, 화학 합성함으로써 얻어진 것이어도, 또는 누에 견사선으로부터 얻어진 것을 일부 사용하고 이것에 기초하여 더욱 합성함으로써 얻어진 것이어도 좋다. 펩티드의 아미노산 서열이 부여되면, 일반적으로, 염기 서열 인코딩은 소위 코돈 테이블을 참고하여 쉽게 결정될 수 있다. 따라서, 세리신 및 그 유도체를 인코딩하는 DNA는, 그 축중관계에 있는 모든 코돈을 염기서열로서 가지는 것이 포함된다.

세리신 및 그 유도체는 그것을 인코딩하는 DNA 절편을, 이것을 숙주 세포에서 복제가능하고 상기 유전자가 발현가능한 상태로 포함하는 DNA, 특히 재조합 벡터의 형태로 사용하여 숙주 세포를 형질전환하여, 이렇게 얻어진 형질전환체를 배양함으로써 각각 생성될 수 있다. 즉, 소위 숙주-벡터 시스템은 상기 펩티드의 생성에 사용될 수 있다. 이런 숙주-벡터 시스템을 사용하는데 있어, 당업계에서 통상적으로 사용되는 각종 발현 벡터(재조합 벡터)를 구축하는 다양한 방법 및 형질전환법이 사용될 수 있다.

세리신 및 그 유도체의 생성에 사용되는 벡터는, 사용될 숙주 세포의 종류를 고려하여, 플라스미드, 바이러스, 파지 및 코스미드(cosmid) 벡터와 같이 숙주-벡터 시스템이 확립되어있는 통상적인 벡터계로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 보다 구체적으로, 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 사용되면, pBR계, pUC계 또는 pQE계의 플라스미드, 또는 람다 파지계의 박테리아 파지가 사용되고, 고초균(Bacillus subtilis)에 대해서는 pUB계의 플라스미드가 사용될 수 있고, 효모에 대해서는 YEp계 및 YCp계의 벡터가 사용될 수 있다. 플라스미드는 바람직하게 상기 펩티드를 생성하기 위한 벡터로서 사용된다.

사용가능한 플라스미드는 바람직하게 형질전환체를 선택하기 위한 선택 마커를 포함한다. 예를 들어, 앰피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin) 등의 약재 내성 마커 및 보조영양요구를 위한 유전자 마커를 사용할 수 있다. 게다가, 플라스미드 등의 벡터 DNA에 대해 생성된 특정 펩티드와, 숙주세포 내에 인코딩된 펩티드에 의한 β-갈락시다아제의 활성 회복은 선택 마커로 사용될 수 있다.

또한, 재조합 벡터로서 DNA는, 바람직하게는 세리신 또는 그 유도체의 발현에 필요한 DNA, 예를 들어, 프로모터, 전사 개시 신호, 번역 종결 신호 또는 전사 종결 신호 등의 전사 조절 신호, 번역 조절 신호 등을 가진다.

어떤 세포든지 숙주 벡터 시스템이 만들어지는 한, 세리신 및 그 유도체의 생성을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 이런 숙주 세포의 예는 대장균, 고초균, 효모 및 곰팡이를 포함한다.

고초균, 효모 또는 곰팡이가 숙주 세포로 사용될 때, 분비형 벡터는 목적으로 하는 세리신 또는 그 유도체를 세포외적으로 분비하는 벡터로 사용될 수 있다.

게다가, 본 발명에서, 세리신 유도체는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 이런 융합 단백질은 상기 본질적 지역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 및 이형 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 사용함으로써, 이 DNA들을 융합하여 융합 단백질을 인코딩하는 DNA를 제조하고, 이 DNA를 발현함으로써 생성된다.

본 명세서에서, "DNA" 및 "유전자" 라는 용어는 같은 의미로 사용되는 경우도 있다.

동물 세포 배양용 배지

본 발명에 따른 동물 세포 배양용 배지는, 적어도 동물 세포 배양용 배지 첨가제 및 기초 배지 조성물을 포함한다. 따라서, 만일 필요하다면, 이것은 상기 성분이 포함되는 한, 다양한 세포 증식 인자, 예를 들어, 알부민 및 트랜스페린과 같은 결합 단백질, 인슐린, 상피(epithelial) 증식 인자(EGF), 섬유 세포 증식 인자 및 다양한 스테로이드 호르몬 및 피브로넥틴(fibronectin)과 같은 세포 고착 인자 뿐만 아니라 혈청을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 동물 세포 배양용 배지는 바람직하게 통상의 배지 보다 더 적은 양의 혈청을 함유하는 배지이고, 더욱 바람직하게는 무혈청 배지이다. 무혈청 배지는 혈청을 함유하지 않는 배지이고, 혈청이외의 세포 증식 인자 및 호르몬을 포함할 수 있다.

동물 세포 배양용 배지에 함유된 세리신 또는 그 유도체의 양은 특별히 제한되지 않고, 배양되는 세포의 종류, 배양의 목적, 기초 배지 조성물의 종류 등에 따라 적절하게 변할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 배지 안의 세리신 또는 그 유도체의 백분율은 0.001 내지 10중량%, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.5중량% 및 더욱더 바람직하게는 0.05 내지 0.2중량%이다.

본 발명은 세리신 또는 그 유도체가 본 발명의 배지에 소량 포함될지라도, 충분한 효과를 나타낸다. 그러나, 비록 이들이 다량으로 첨가되더라도, 세리신이 무독성이고 수용성이 크기 때문에, 일반적으로 실질적인 문제가 되지 않는다.

본 발명에 따른 배지 첨가제가 통상적인 배지에 첨가됨으로써 유리하게 사용될 때, 배지 첨가제를 배지의 소량에서 용해한 후 이것을 전체 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 기초 배지 조성물은 일반적인 동물 세포가 동화할 수 있는 탄소원, 소화할 수 있는 질소원 및 무기염류로 이루어진다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 무기염류, 아미노산, 포도당 및 비타민이 포함된다. 만일 필요하다면, 영양 촉진을 위한 미량 물질 및 전구체와 같은 미량 유효 물질이 기초 배지 조성물에 포함될 수 있다.

당업자에게 공지된 어떤 배지 조성물도 기초 배지 조성물로 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어, MEM 배지(H, Eagle, Science, 130, 432(1959)), DMEM 배지(R. Dulbecco, Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 배지(G.E. Moore, J.A.M.A., 199, 519 (1967)), Ham's F12 배지(R.G. Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 53, 288 (1965)), MCDB104 배지(W.L. Mckeehan, In Vitro, 13, 399 (1977)), MCDB153 배지(D.M. Peehe, In Vitro, 16, 526 (1980))가 사용될 수 있다.

본 발명에서 적절하게 사용될 수 있는 다른 배지들은 무혈청 배지 ASF104 (Ajinomoto Co., Inc.), 무혈청 배지 SF-02(Sanko Junyaku Co., Ltd.), 무혈청 배지 하이브리도머(hybridoma)-SFM(Lifetech Oriental), 무혈청 배지 BIO-MPM-1(Biological Industries), 무혈청 배지 EX-CELL^TM302-HDP(JRH Biosciences) , 무혈청 배지 코스미디움 001(Cosmo Bio), 및 무혈청 배지 SFM-101(Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)를 포함한다.

본 발명의 배지 안에서 배양될 수 있는 동물 세포는 특별히 제한되지 않고, 배양세포로서 확립된 것이어도, 생물학적 조직으로부터 얻은 비확립된 정상 세포가 될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 동물 세포는, 예를 들어, 자신에 의해 단백질을 생성할 수 있는 세포여도, 이종 단백질을 발현하기 위해서 유전 공학에 의해 형질전환되는 세포일 수도 있고, 또는 다양한 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포일 수도 있다.

자신에 의해 단백질을 생성할 수 있는 세포의 예는, 단일 무성 항체를 생성하는 하이브리도마 세포, 인터페론(INF)-α를 생성하는 백혈구(leucocytes), INF-β를 생성하는 섬유아세포(fibroblasts), INF-γ를 생성하는 림프구(lymphocytes), 프로유로키나아제(prourokinase(pro-UK)) 또는 UK를 생성하는 인간 신장 세포, 플라스미노겐(plasminogen) 활성자 (tPA)를 생성하는 흑색종(melanoma) 세포, 인슐린을 생성하는 In-111 세포, 글루카곤을 생성하는 HIT 세포, 에리트로포이에틴(erythropoietin)을 생성하는 HepG2 세포 및 인터루킨-5를 생성하는 B151K12 세포를 포함한다.

유전 공학적 방법에 의해 형질전환되는 세포주의 예는, 베로(Vero) 세포, 헬라(HeLa) 세포, 중국 햄스터 난자(CHO (Chinese hamster overy)) 세포, HKG 세포, NIH3T3 세포, BHK 세포, COS-1 세포, COS-7 세포 및 골수종(myeloma) 세포를 포함한다.

바이러스 벡터에 의해 감염된 세포의 예는, 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 렌티바이러스(lentivirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스 벡터, 및 헤르페스바이러스(herpesvirus) 벡터 등에 의해 감염된 세포를 포함한다. 이런 바이러스는 통상적인 유전 공학적 방법에 의해 유전적으로 재조합될 수 있다. 또한, 이런 바이러스 벡터에 감염시켜, 본 발명의 배지를 사용하여 배양되는 동물 세포의 예는, 인간 배아 신장(HEK(human embryonic kidney)) 293 세포, A549 세포, 및 PER.C6 세포를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예는 동물 세포를 배양하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계 및 동물 세포를 증식시키기 위해서 얻어진 배지를 사용하여 동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

본 방법을 위한 배양 조건, 예를 들면, 배지 안의 산소 농도, 삼투압, pH, 배지의 온도는, 배양될 세포의 종류, 배양의 목적, 배양의 양 및 기초 배지 조성물의 종류에 따라 적절하게 변화될 수 있다. 또한 다발 배양, 연속식 배양 또는 관류(perfusion) 배양과 같은 어떤 배양 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 고밀도 배양이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는, 본 발명의 배지 첨가제를 동물 세포 배양 배지에 첨가하는 단계, 동물 세포를 증식시키기 위해서 얻어진 배지를 사용하여 단백질을 생성하는 능력이 있는 동물 세포를 배양하는 단계 및 생성된 단백질을 상기 배지 및/또는 상기 동물 세포로부터 채취하는 단계를 포함하여, 단백질을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따라 단백질을 생성하는 방법에서, 바람직하게 생성될 수 있는 단백질의 예는, 단일 무성 항체, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, pro-UK 또는 UK, tPA, 인슐린, 글루카곤, 에리트로포이에틴 및 인터루킨-5를 포함한다.

생성된 단백질은 단백질의 화학적 또는 물리적 특성을 사용하여 채취될 수 있고, 다양한 통상의 분리 방법에 의해 분리 정제된다. 예를 들어, 단백질 응고제에 의한 처리, 초여과, 흡착, 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, 투석 등을 단일 또는 조합하여 실시함으로써, 상기 단백질을 분리 정제하여 회수할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예는, 본 발명의 배지 첨가제를 동물 세포 배양 배지에 첨가하는 단계, 얻어진 배지를 사용하여 바이러스 벡터에 감염된 동물 세포를 증식시키기 위해서 배양하는 단계, 및 상기 배지 및/또는 생성된 바이러스 벡터를 상기 동물 세포로부터 회수하는 단계를 포함하여, 바이러스 벡터를 복제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 복제 방법에 의해 복제가능한 바이러스 벡터는 예로서 상기한 다양한 바이러스 벡터이고, 만일 필요하다면, 유전자 재조합에 의해 생성될 수 있다.

적절하게 선택된 동물 세포는 통상의 방법에 의해 대상 바이러스 벡터에 감염된다.

더욱이, 바이러스 벡터는 초여과 및 원심분리와 같은 다양한 통상의 분리 방법을 사용하여 분리 및 정제함으로써 증식된 세포로부터 회수될 수 있다. 여기서 바이러스 벡터의 종류에 따라 바이러스 벡터를 회수하는 방법을 적절하게 선택하는 것이 바람직하다.

일반적으로, 유전자 치료는 두 종류, 즉, ex vivo 유전자 치료 및 in vivo 유전자 치료로 분류된다. 전자는 환자로부터 유도된 세포가 신체 외부에서 일단 배양되고 그 후에 유전자 도입을 위해 처리되어, 이 세포가 환자에 투여되는 치료법이다. 후자는 유전자가 도입된 벡터를 직접 환자의 몸속으로 투입하는 치료방법이다.

본 발명에 따른 방법은 통상적인 방법보다 더욱 효과적으로, 이런 유전자 치료법에 사용되는 유전자가 도입된 바이러스 벡터를 복제할 수 있다. 게다가, 본 발명의 배지는 293 세포와 같은 이런 복제 방법에 사용되는 동물 세포에 대한 뛰어난 증식 촉진 효과를 보여준다.

본 발명은 발명을 제한하려고 의도하지 않은 다음의 예를 통해서 더 한층 설명될 수 있다.

세리신 또는 그 유도체를 생성하는 방법은 다음의 제조예 1 및 제조예 2에 나타난다.

제조예 1

세리신 가수분해물을 추출하기 위해서, 1kg의 고치(누에고치에 의해 만들어짐(Bombyx mori))를 95℃에서 2시간 동안 0.2% 탄산나트륨 수용액(pH 11-12) 50L에서 열수(熱水)처리하였다. 침전물을 제거하기 위해서, 얻어진 세리신 가수분해 추출물을 0.2㎛의 평균 공극 지름을 갖는 필터를 사용하여 여과하였고, 그 후에 0.2%의 세리신 농도를 갖는 세리신 가수분해물의 투명하고 무색인 수성 용액을 얻기 위해서, 여과액을 역삼투막을 사용하여 염분을 제거하였다.

이 수성 용액을 증발기를 사용하여 약 2%의 세리신 농도로 농축시켰고, 그 후에 90%이상의 순도로 20,000의 평균 분자량을 갖는 100g의 세리신 가수분해물 분말(폴리펩티드 A)을 얻기 위해 동결건조처리했다.

제조예 2

(세리신 유도체를 인코딩하는 DNA 절편의 화학적 합성)
세리신 유도체의 한 예로서, 세리신에서 공통적으로 보존되는 38아미노산으로 구성되는 서열(서열 ID No:1)의 두개의 반복단위를 포함하는 다음의 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 디자인하였다:

삭제

Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Thr-Asp-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser-

Ala-Gly-Ser-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly--Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Tyr-Ser-

Ser-Asn-Ser-Arg-Asp-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-Ser-Ser-

Asn-Thr-Asp-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser-Ala-Gly-Ser-Ser-Thr-Ser-Gly-

Gly-Ser-Ser-Thr-Try-Gly-Tyr-Ser-Ser-Asn-Ser-Arg-Asp-Gly-Ser-

Val (서열 ID No:4).

여기서, 다른 융합 펩티드를 절단하기 위한 프로테아제(인자 Xa)의 인식 자리(Ile-Glu-Gly-Arg(서열 ID No:5))를, 상기 폴리펩티드의 N 말단에 배치하였다. 또한, 벡터에 결합하기 위한 제한 효소 인식 자리(PstI, EcoRI)를, 상기의 펩티드를 인코딩하는 DNA의 양 말단에 배치하였고, 또한 두개의 번역 종결 코돈을 3'말단쪽에 첨가하였다. 이런 방법으로, 상기의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 디자인하였다.

다음으로, 디자인된 DNA를 포스포아미디트(phosphoamidite) 방법에 의해 DNA 합성기(활용된 바이오시스템)를 사용하여 화학적으로 합성하였다. 구체적으로, 각각 약 60 내지 70 염기의 DNA 길이를 갖는 8개의 절편들을 화학적으로 합성하였다.

합성된 8개 DNA 절편은 다음과 같다:

절편 (1):

5'-GTGATCAATCGAAGGTCGCTCGAGTACTGGTTCTTCTTCTAACACCGACTCTAACTCTAAC-3'

(서열 ID No: 6)

절편 (2):

5'-TCTGCTGGTTCTTCTACCTCTGGTGGTTCTTCTACCTACGGTTACTCTTCTAACTCTCGTGACGGTTC T-3' (서열 ID No: 7)

절편 (3):

5'-GTTTCTTCTACCGGTTCTTCTTCTAACACCGACTCTAACTCTAACTCTGCTGGTTCTTCTACCTC-3'

(서열 ID No: 8)

절편 (4):

5'-TGGTGGTTCTTCTACCTACCTACGGTTACTCTTCTAACTCTCGTGACGGATCCGTTTAATAGCTGAGC G-3' (서열 ID No: 9)

절편 (1'):

5'-CAGAGTTAGAGTTAGAGTCGGTGTTAGAAGAAGAACCAGTACTCGAGCGACCTTCGATTGATCACTGC A-3' (서열 ID No: 10)

절편 (2'):

5'-AAACAGAACCGTCACGAGAGTTAGAAGAGTAACCGTAGGTAGAAGAACCACCAGAGGTAGAAGAACCA G-3' (서열 ID No: 11)

절편 (3'):

5'-ACCAGAGGTAGAAGAACCAGCAGAGTTAGAGTTAGAGTCGGTGTTAGAAGAAGAACCGGTAGAAG-3'

(서열 ID No: 12)

절편 (4'):

5'-AATTCGCTCAGCTATTAAACGGATCCGTCACGAGAGTTAGAAGAGTAACCGTAGGTAGAAGAACC-3'

(서열 ID No: 13)

(펩티드를 인코딩하는 DNA의 축조)

상기대로 합성된 8개 절편(약 70 염기)을, 각각 상보적 서열을 갖는 절편들과 가열냉각함으로써 이중가닥 사슬로 하여, 펩티드를 인코딩하는 DNA로 구성되는 4개의 이중가닥 DNA의 절편을 얻었다.

또한, 화학적으로 합성된 올리고핵산이 5'말단에서 인산을 갖지 않기 때문에, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여, 합성된 유전자 절편 각각의 5'말단에 인산을 첨가하였다.

다음으로, 4개의 DNA 절편을 타가라 접합 장치 버전 Ⅱ(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여 접합하였다.

(대장균용 발현 플라스미드의 축조)

접합된 DNA 절편을 대장균(Qiagen)용 고발현 벡터 pQE 30과 혼합하고, 타가라 접합 장치 버전 Ⅱ(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여 접합 반응을 하였다. 얻어진 반응 혼합물을 대장균 JM109속으로 도입하였고 DNA 절편속에 삽입된 발현 플라스미드를 형질전환체로부터 얻었다.

(발현 유도)

폴리펩티드를 인코딩하는 유전자를 포함하는 발현 플라스미드가 도입된 대장균 JM109 주형 형질전환체 세포를, 앰피실린 50㎍/㎖가 첨가된 M9 + 2% 카사미노산(casamino acid) 배지에서 37℃로 교반하에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양한 후에, 얻어진 배양액을 2%의 농도에서 동일한 배지 속에 주입하고 배양을 37℃에서 교반하에서 계속하였다.

610nm에서 광학 농도가 0.3 내지 0.5에 도달할 때, 1mM의 최종 농도로 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalctopyranoside)를 얻어진 배양액에 첨가하였고, 4시간 동안 배양을 계속하였다.

(펩티드의 정제)

발현유도 이후에, 상청액으로부터 가용성 부분으로서 폴리펩티드를 회수하기 위해서, 균체의 초음파 파쇄액을 100℃에서 10분 동안 처리하고, 6500rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다.

다음으로, 폴리펩티드를 QIA Express Ni-NTA 단백질 정제 시스템(Qiagen)을 사용하여 정제하였다.

상기의 방법에 의해 약 8,000의 분자량을 갖는 세리신 유도체(폴리펩티드B)를 얻었다.

평가 시험

상기의 생성 예들에서 얻어진 세리신 및 그 유도체(폴리펩티드 A 및 B)를 사용하여 다음의 평가 시험을 실행하였다.

평가 시험 1: 하이드로마 세포 증식에 대한 촉진 효과 및 항체 생성에 대한 촉진 효과

아래의 표 1에서 나타난 7개의 다른 실험 그룹에 대한 배지를 제조하기 위해서, 세리신 또는 소 혈청 알부민(BSA)이 특정 농도가 되도록, 무혈청 기초 배지 ASF104(Ajinomoto Co., Inc.)에 첨가시키고 용해시켰다.

24-웰 배양판(well culture plate)을 준비하고, 여기에 각 실험용 그룹의 배지에 대하여 항체생성 쥐 하이브리도마 세포(F, Makishima, Cytotechnology, 10, 15(1992))의 세포밀도가 각각 1.5 ×10⁴(세포/ml)가 되도록 주입시켰다. 사용된 하이브리도마 세포들은 부유성 세포이다.

각 실험 그룹의 세포를 5 부피% 이산화탄소 및 95 부피% 공기의 대기에서 37℃로 3일 동안 배양시켰다.

배양 후에, 배양액의 세포 농도를 통상의 혈구 계산기(hemocytometer)를 사용하여 측정하였다. 각 실험 그룹에 대한 세포 증식 촉진 효과를 세포 농도의 변화로부터 측정하였다.

배양 상청액에서 생성된 항체의 양은, 단백질 G에 의한 정제 항체를 표준으로 한 통상의 효소면역측정법(ELISA법)으로 정량적으로 측정하였다. 측정에서, 양고추냉이 퍼록시다아제-표식 항마우스(horserad ish peroxidase-labeled antimouse)-IgG(G+L)를 효소-표식 제 2항체로서 사용하였고, 오르소-페닐렌디아민(o-phenylenediamine)을 발색제로서 사용하였다. 세포 제거액에서의 항체의 양은 배지 안의 IgG 농도(㎍/㎖)로 표현하였다. 각 실험 그룹 안의 항체 생산능력을 항체 농도의 변화로부터 평가하였다.

얻어진 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

실험 그룹	세포 농도(10⁴ 세포/ml)	항체 농도(㎍/ml)
첨가제 미첨가	8.2 ±1.5	19 ±2
폴리펩티드 A 0.05%	16.5 ±2.0	22 ±2
폴리펩티드 A 0.1%	18.5 ±1.3	23 ±1
BSA 0.05%	15.5 ±0.8	20 ±1
BSA 0.1%	18.2 ±1.7	18 ±1
폴리펩티드 A 및 BSA, 각각 0.05%	23.4 ±0.6	24 ±2
폴리펩티드 B 0.1%	22.3 ±0.6	23 ±2

평균 ±표준 편차 (n=3)

결과에서, 본 발명(각 배지는 단독으로 폴리펩티드 A 또는 폴리펩티드 B가첨가된다)에 따른 배지는, 하이브리도마 세포의 증식 및 항체 생산능력을 강하게 촉진할 수 있었다. 이 효과는 BSA가 첨가된 배지와 적어도 동일하거나 크다.

평가 시험 2: HepG2 세포 증식에 대한 촉진 효과, 알부민 분비에 대한 촉진 효과 및 생존 능력에 대한 촉진 효과

아래의 표 2에 나타난 6개의 다른 실험 그룹에 대한 배지를 제조하기 위해서, 폴리펩티드 A, 폴리펩티드 B 또는 BSA가 특정 농도가 되도록, 무혈청 배지 SF-02(Sanko Junyaku Co.,Ltd.)에 첨가시키거나 용해시켰다.

24-웰 배양판을 준비하고 인간 간암유래의 세포인 HepG2(J. Skelly, Nature, 282, 615(1979))를, 웰 속에 각각 1.0 ×10⁴(세포/ml)의 세포 농도로 주입하였다. 사용된 HepG2 세포는 부착성 세포이다.

각 실험 그룹의 세포를 5 부피% 이산화탄소 및 95 부피% 공기의 대기에서 37℃로 배양하였다.

배양 후에, 배양액의 세포 농도를 통상적인 혈구 계산기를 사용하여 측정하였다. 각 실험 그룹에 대한 세포 증식 촉진 효과는 세포 농도의 변화로부터 평가하였다.

세포 생존성은 트리팬 블루(trypane blue) 염색 및 생존 세포 계측으로 평가하였다.

분비된 알부민의 양은 표준으로서 시판중인 정제된 인간 혈청 알부민을 사용하여 통상의 효소면역측정법(ELISA법)으로 정량적으로 측정하였다.

측정에서, 양고추냉이 퍼록시다아제-표식 항체(horseradish peroxidase-labeled antibody)를 효소-표식 항체로 사용하였고, 오르소-페닐렌디아민(o-phenylenediamine)을 발색제로 사용하였다.

얻어진 결과를 아래의 표 2에 나타내었다.

실험 그룹	5일 동안 배양액의 세포 농도(10⁴ 세포/ml)	5일 동안 배양액에서 분비된 알부민(ng/ml)	17일 동안 배양액에서의 생존성(%)
첨가제 미첨가	7.9 ±0.6	390 ±23	3.1 ±0.5
폴리펩티드 A 0.05%	13.5 ±0.4	431 ±28	8.6 ±0.4
폴리펩티드 A 0.1%	17.3 ±1.1	476 ±19	10.3 ±0.8
BSA 0.05%	12.1 ±0.8	420 ±13	4.9 ±0.4
BSA 0.1%	15.5 ±0.7	448 ±24	6.2 ±0.3
폴리펩티드 A 및 BSA, 각각 0.05%	19.4 ±1.2	510 ±21	12.4 ±0.7
폴리펩티드 B 0.1%	20.1 ±1.5	525 ±19	13.0 ±0.4

평균 ±표준 편차 (n=3)

결과에서, 본 발명에 따른 배지가 HepG2 세포의 증식 및 알부민 분비와 같은 간기능에 특유한 단백질의 생산능력을 강하게 촉진한다는 것을 나타내었다. 일반적으로, 배지의 교환없이 세포가 배양될 때, 세포의 대부분은 과잉성장으로 인해 죽는데 반하여, 본 발명에 따른 배지에서의 세포 생존성은 증가될 수 있다.

평가 시험 3: 인간 피부 표피 각화 세포(human epidermal keratinocyte cells)에 대한 증식 촉진 효과

아래의 표 3에 나타난 4개의 다른 시험 그룹을 위한 각 배지를 제조하기 위해서, 폴리펩티드 A 또는 B가 특정 농도가 되도록, 피부 표피 각화 세포용 배지(CCM-3111, Clonetics Corporation (California, USA))에 첨가하고 용해시켰다.

24-웰 배양판을 준비하고, 신생아의 피부 표피 각화 세포(Normal Human Epidermal Keratinocyte cells, Clonetics Corporation(California, USA))를 웰 속에 1.0 ×10⁴(세포/ml)의 세포농도가 되도록 주입시켰다. 사용된 세포는 세포주가 유도되지 않은 정상 세포이고, 부착성 세포이다.

각 실험 그룹 안의 세포를 5 부피%의 이산화탄소 및 95 부피% 공기의 대기에서 37℃에서 배양시켰다.

배양 후에, 배양액의 세포 밀도를 통상의 혈구 계산기를 사용하여 측정하였다. 각 실험 그룹에 대한 세포 증식에 대한 촉진 효과를 세포 밀도의 변화로부터 평가하였다.

얻어진 결과는 아래의 표 3에 나타내었다.

실험 그룹	세포 밀도 (10⁴ 세포/ml)
첨가제 미첨가	3.4 ±0.1
폴리펩티드 A 0.01%	5.5 ±1.3
폴리펩티드 A 0.05%	5.8 ±0.8
폴리펩티드 B 0.01%	5.9 ±1.5
폴리펩티드 B 0.05%	6.3 ±0.4

평균 ±표준 편차 (n=3)

경우에 따라서, 피부 표피 각화 세포와 같은 정상 세포는 BSA와 함께 배지에 첨가될 때 세포가 증식되기 보다는 분화되기 때문에 BSA를 배지에 첨가할 수 없다. 상기의 결과는, 본 발명에 따른 배지가 피부 표피 각화 세포의 증식을 촉진하고, 세포 분화는 유도하지 않는다는 것을 증명하였다.

평가 시험 4: 아데노바이러스 벡터 생성에 대한 촉진 효과

이 시험을 타가라 아데노바이러스 발현 벡터 키트(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여 실행하였다.

4×10⁷PFU의 아데노바이러스를, 293 세포 9.5×10⁵개 포함하는 배지(Nephrigen; Celox (Minnesota, USA))에 첨가시켰고, 세포를 바이러스에 감염시키기 위해서 혼합물을 한 시간 동안 방치하였다.

다음으로, 배양된 세포를 갖는 배지를 아래의 표 4(세리신이 없는 1개의 배지 및 각각 0.02% 폴리펩티드 A 또는 폴리펩티드 B를 포함하는 2개의 배지)에 나타난 실험 그룹용 3종류의 다른 배지와 교환하고, 이것을 바이러스 생성을 위해서 3일 동안 배양을 계속하였다. 각 실험 그룹의 세포를 5 부피% 이산화탄소 및 95 부피% 공기의 대기에서 37℃로 배양하였다.

배양 후에, 얻어진 바이러스액을 회수하고, 293 세포를 사용하여 바이러스 규정농도를 결정하였다. 바이러스 규정 농도를 TCID 50 방법(50% 조직 배양 영향 양)으로 계산하였다.

얻어진 결과를 아래의 표 4에 나타내었다.

실험 그룹	바이러스 규정농도 (×10⁷PFU)
첨가제 미첨가	3.36 ±1.50
폴리펩티드 A 0.02% 첨가	5.18 ±1.22
폴리펩티드 B 0.02% 첨가	7.62 ±2.04

결과에서 본 발명에 따른 세리신 또는 그 유도체가 첨가된 배지는, 유전자 치료를 위해 사용된 바이러스 벡터의 생성을 촉진한다는 것을 나타내었다. 이런 효과는 폴리펩티드 B에 의해 현저하게 나타났다.

내용중에 포함되어 있음.

<110> SEIREN CO., LTD <120> Medium additive and medium for culturing animal cell <150> JP2001-118559 <151> 2001-04-17 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptides derived from sericin <400> 1 Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser Asn Ser Asn Ser Ala 1 5 10 15 Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Arg Asp Gly Ser Val 35 <210> 2 <211> 1217 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 2 Met Arg Phe Val Leu Cys Cys Thr Leu Ile Ala Leu Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Val Lys Ala Phe Gly His His Pro Gly Asn Arg Asp Thr Val Glu Val 20 25 30 Lys Asn Arg Lys Tyr Asn Ala Ala Ser Ser Glu Ser Ser Tyr Leu Asn 35 40 45 Lys Asp Asn Asp Ser Ile Ser Ala Gly Ala Arg Arg Ala Lys Ser Val 50 55 60 Glu Gln Ser Gln Asp Lys Ser Lys Tyr Thr Ser Gly Pro Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Gln Asn Tyr Lys Asp Ser Lys Gln Ala Tyr 85 90 95 Ala Asp Tyr His Asn Asp Pro Asn Gly Gly Ser Ala Ser Ala Gly Gln 100 105 110 Ser Arg Asp Thr Ser Leu Arg Glu Arg Lys Val Asn Tyr Val Ser Asp 115 120 125 Gly Gln Ala Val Ala Ala Ser Ser Asp Ala Arg Asp Glu Asn Arg Ser 130 135 140 Ala Gln Gln Asn Ala Gln Ala Asn Trp Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Gly 145 150 155 160 Val Ser Ala Asp Arg Ser Gly Ser Ala Ser Ser Arg Arg Arg Gln Ala 165 170 175 Asn Tyr Tyr Ser Asp Lys Asp Ile Thr Ala Ala Ser Lys Asp Asp Ser 180 185 190 Arg Ala Asp Ser Ser Arg Arg Ser Asn Ala Tyr Tyr Asn Arg Asp Ser 195 200 205 Asp Gly Ser Glu Ser Ala Gly Leu Ser Asp Arg Ser Ala Ser Ser Ser 210 215 220 Lys Asn Asp Asn Val Phe Val Tyr Arg Thr Lys Asp Ser Ile Gly Gly 225 230 235 240 Gln Ala Lys Ser Ser Arg Ser Ser His Ser Gln Glu Ser Asp Ala Tyr 245 250 255 Tyr Asn Ser Ser Pro Asp Gly Ser Tyr Asn Ala Gly Thr Arg Asp Ser 260 265 270 Ser Thr Ser Asn Lys Lys Lys Ala Ser Ser Thr Ile Tyr Ala Asp Lys 275 280 285 Asp Gln Ile Arg Ala Ala Asn Asp Arg Ser Ser Ser Lys Gln Leu Lys 290 295 300 Gln Ser Ser Ala Gln Ile Ser Ser Gly Pro Lys Gly Thr Ser Val Ser 305 310 315 320 Ser Lys Asp Arg Gln Tyr Ser Asn Asp Lys Arg Ser Lys Ser Asp Ala 325 330 335 Tyr Val Gly Arg Asp Gly Thr Val Ala Tyr Ser Asn Lys Asp Ser Glu 340 345 350 Lys Thr Ser Arg Gln Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Gln Asn Ser Val 355 360 365 Arg Ser Asp Ser Ala Ala Ser Asp Gln Thr Ser Lys Ser Tyr Asp Arg 370 375 380 Gly Tyr Ser Asp Lys Asn Ile Val Ala His Ser Ser Gly Ser Arg Gly 385 390 395 400 Ser Gln Asn Gln Lys Ser Ser Ser Tyr Arg Ala Asp Lys Asp Gly Phe 405 410 415 Ser Ser Ser Thr Asn Thr Glu Lys Ser Lys Phe Ser Ser Ser Asn Ser 420 425 430 Val Val Glu Thr Ser Asp Gly Ala Ser Ala Ser Arg Glu Ser Ser Ala 435 440 445 Glu Asp Thr Lys Ser Ser Asn Ser Asn Val Gln Ser Asp Glu Thr Gly 450 455 460 Glu Glu Glu Glu Leu Phe Asp Val Val Ser Tyr Gln Lys Ile Glu Asp 465 470 475 480 Gly Lys Pro Val Ile Ile Met Lys Val Ile Pro Val Glu Lys Ser Ala 485 490 495 Ser Gln Ser Ser Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Ala Ser Tyr Ser 500 505 510 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Leu Ser Glu Asp Ser Ser Glu Val Asp 515 520 525 Ile Asp Leu Gly Asn Leu Gly Trp Trp Trp Asn Ser Asp Asn Lys Ala 530 535 540 Gln Arg Ala Ala Gly Gly Ala Thr Lys Ser Glu Ala Ser Ser Ser Thr 545 550 555 560 Gln Ala Thr Thr Val Ser Gly Ala Asp Asp Ser Ala Asp Ser Tyr Thr 565 570 575 Trp Trp Trp Asn Pro Arg Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser 580 585 590 Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asn Val Gly Gly Ser Ser Gln Ser Ser Gly 595 600 605 Gln Ser Thr Ser Gly Ser Asn Ala Arg Gly His Leu Gly Thr Val Ser 610 615 620 Ser Thr Gly Ser Thr Ser Asn Thr Asp Ser Ser Ser Lys Ser Ala Gly 625 630 635 640 Ser Arg Thr Ser Gly Gly Thr Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Ser His 645 650 655 Arg Gly Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser 660 665 670 Ser Thr Lys Asn Ala Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ser Thr Tyr 675 680 685 Gly Tyr Ser Ser Ser His Arg Gly Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser 690 695 700 Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ser Thr Lys Ser Ala Gly Ser Ser Thr Ser 705 710 715 720 Gly Gly Thr Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Arg His Arg Gly Gly Ser 725 730 735 Val Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ser Thr Lys Asn 740 745 750 Ala Gly Ser Arg Thr Ser Gly Gly Thr Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser 755 760 765 Ser His Arg Gly Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr 770 775 780 Asp Ser Ser Thr Lys Asn Ala Gly Ser Arg Thr Ser Gly Gly Thr Ser 785 790 795 800 Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Ser His Arg Gly Gly Ser Val Ser Ser Thr 805 810 815 Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ser Thr Lys Asn Ala Gly Ser Arg 820 825 830 Thr Ser Gly Gly Thr Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Ser His Arg Gly 835 840 845 Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ser Thr 850 855 860 Lys Asn Ala Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Tyr 865 870 875 880 Ser Ser Asp Ser Arg Asp Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser 885 890 895 Asn Thr Asp Ala Ser Thr Asp Leu Ala Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly 900 905 910 Ser Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Asp Ser Arg Asp Gly Ser Val Ser 915 920 925 Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ala Ser Thr Asp Leu Ala Gly 930 935 940 Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Asp Ser 945 950 955 960 Arg Asp Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ala 965 970 975 Ser Thr Asp Leu Thr Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr 980 985 990 Gly Tyr Ser Ser Asp Ser Arg Asp Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser 995 1000 1005 Ser Ser Asn Thr Asp Ala Ser Thr Asp Leu Ala Gly Ser Ser Thr Ser 1010 1015 1020 Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Ser Asn Arg Asp Gly Ser 1025 1030 1035 1040 Val Ser Ala Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ala Ser Thr Thr Glu 1045 1050 1055 Glu Ser Thr Thr Ser Ala Gly Ser Ser Thr Glu Gly Tyr Ser Ser Ser 1060 1065 1070 Ser His Asp Gly Ser Val Thr Ser Thr Asp Gly Ser Ser Thr Ser Gly 1075 1080 1085 Gly Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ser Thr Ala Lys Ser Asp Ala Ala Ser 1090 1095 1100 Ser Glu Asp Gly Phe Trp Trp Trp Asn Arg Arg Lys Ser Gly Ser Gly 1105 1110 1115 1120 His Lys Ser Ala Thr Val Gln Ser Ser Thr Thr Asp Lys Thr Ser Thr 1125 1130 1135 Asp Ser Ala Ser Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ser Thr Ser Gly Ala Ser 1140 1145 1150 Thr Thr Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ser 1155 1160 1165 Asp Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ser Val Ser Arg Ser His His Ser Gly 1170 1175 1180 Val Asn Arg Leu Leu His Lys Pro Gly Gln Gly Lys Ile Cys Leu Cys 1185 1190 1195 1200 Phe Lys Asn Ile Phe Asp Ile Pro Tyr His Leu Arg Lys Asn Ile Gly 1205 1210 1215 Val <210> 3 <211> 3651 <212> DNA <213> Bombyx mori <400> 3 atgcgtttcg ttctgtgctg cactttgatt gcgttggctg cgctcagcgt aaaagctttc 60 ggtcaccacc ccggcaatcg agatacagtc gaagtcaaaa accgaaagta caatgcagct 120 agcagtgaaa gctcttacct caacaaagat aatgattcga taagtgccgg agcgcgccgt 180 gccaagtccg tagagcagag tcaggataaa agcaaatata catctggtcc agaaggcgtg 240 tcgtacagcg gaaggtctca gaactataaa gattccaagc aagcttatgc cgattatcac 300 aacgatccga acggcggatc tgcttctgcg ggacaatctc gcgacacgag cctgagggag 360 agaaaagtaa attacgtctc tgacggtcaa gcagtggccg cttccagtga cgctcgcgat 420 gaaaaccgat ccgcccaaca gaatgctcag gccaattgga acgctgacgg ttcttacgga 480 gttagcgctg atcgaagtgg ttccgctagt tctagacgcc gccaagccaa ttactactcc 540 gataaagaca tcactgctgc ttctaaagac gattcacgtg cagattcttc taggagaagc 600 aatgcctatt acaacagaga tagtgacggc tcagaatccg ctggattaag tgaccgtagt 660 gcttcttcct cgaaaaatga taatgtattt gtttaccgca ctaaggattc tattggagga 720 caagcgaaat cttcaagatc atctcattca caagagagcg acgcttatta taactccagt 780 ccggatggaa gctacaacgc tggtacgcga gacagttcaa cttctaacaa aaagaaggcg 840 agctctacca tctacgctga taaggatcaa atacgcgccg cgaatgatcg ttcttcttcg 900 aaacagttaa aacagagcag cgctcaaatc tcctccgggc caaagggcac ctctgtaagc 960 agtaaggata ggcaatactc gaacgacaaa cgcagcaaat ctgatgcgta cgtcggacgg 1020 gacggcaccg ttgcttactc aaacaaggac agcgaaaaga cctcacgaca aagtaatacg 1080 aactatgccg accaaaactc cgttcgctct gactctgccg cttcggacca gaccagcaag 1140 agttacgaca ggggctacag tgataaaaat atagttgccc atagctctgg tagtaggggc 1200 agtcagaatc agaaatcgtc gagttaccgc gctgacaagg acggtttttc ctccagtacg 1260 aatactgaaa aatccaaatt tagttcttcg aatagcgtcg tagaaacttc agatggagct 1320 tctgctagtc gcgaatcatc agcggaggat accaaatcat ccaatagtaa cgttcagagc 1380 gatgaaacag gcgaagaaga ggaattgttc gatgttgtat cttaccagaa aattgaagat 1440 ggcaagcctg taatcataat gaaagttata ccagtcgaga aatccgcgtc ccaatcaagt 1500 tcttcgcggt catctcagga gtctgcaagc tatagcagca gcagcagttc atcgacacta 1560 agtgaagact cttccgaggt ggatattgat cttggcaatt taggctggtg gtggaattca 1620 gacaataagg cacaaagagc ggcaggcggc gccacaaagt ctgaagcttc atcatccact 1680 caagctacta cagtcagtgg cgcagacgac agtgctgatt cttacacctg gtggtggaat 1740 cctagacgat caagcagctc ctcttcatca gcaagttcta gcagctctgg ctccaatgtt 1800 ggtggttcct ctcaatccag cggtcagagc acttctggaa gtaatgcccg cggtcatcta 1860 ggaaccgttt cgtccactgg cagtaccagt aacaccgatt caagctcaaa aagtgcagga 1920 tcccgtacat ccggcggtac gagcacttat ggatatagct ccagccatcg tggtggaagc 1980 gtatcatcca ccggcagttc cagcaacact gattcaagca caaagaatgc aggatccagt 2040 acatctggcg gtacgagcac ttatggatat agctctagcc atcgtggtgg aagtgtatca 2100 tccaccggca gttccagcaa cactgattca agcacaaaga gtgcaggatc cagtacatcc 2160 ggcggtacga gcacttacgg atatagctcc aggcatcgtg gtggaagcgt atcatccacc 2220 ggcagttcca gcaacactga ttcaagcaca aagaatgcag gatcccgtac atccggcggt 2280 acgagcactt atggatatag ctccagccat cgtggtggaa gcgtatcatc caccggcagt 2340 tccagcaaca ctgattcaag cacaaagaat gcaggatccc gtacatccgg cggtacgagc 2400 acttatggat atagctccag ccatcgtggt ggaagcgtat catccaccgg cagttccagc 2460 aacactgatt caagcacaaa gaatgcagga tcccgtacat ccggcggtac gagcacttat 2520 ggatatagct ccagccatcg tggtggaagc gtatcatcca ccggcagttc cagcaacact 2580 gattcaagca caaagaatgc aggatccagt acatccggcg gtagcagcac ttatggatac 2640 agttccgaca gtcgtgatgg aagtgtatca tccaccggca gttccagtaa cactgatgca 2700 agcacagacc tggcaggatc cagtacatcc ggcggtagca gcacttatgg atacagttcc 2760 gacagtcgtg atggaagtgt atcatccacc ggcagttcca gtaacactga tgcaagcaca 2820 gacctggcag gatccagtac atccggcggt agcagcactt atggatacag ttccgacagt 2880 cgtgatggaa gtgtatcatc caccggcagt tccagtaaca ctgatgcaag cacagacctt 2940 acaggatcca gtacatccgg cggtagcagc acttatggat acagttccga cagtcgtgat 3000 ggaagtgtat catccaccgg cagttccagt aacactgatg caagcacaga cctggcagga 3060 tccagtacat ccggcggtag cagcacttat ggatatagct caagcaatcg tgatggaagt 3120 gtatcggcca ctggcagttc cagtaacact gatgcaagca ccacagaaga atccaccacg 3180 tccgctggta gcagcactga aggatatagt tccagtagcc atgatggaag cgtaacatcc 3240 accgacggtt ccagcacaag tggaggagct tcttccagct cagcgtcaac cgccaaaagc 3300 gacgccgcgt catctgaaga cggtttctgg tggtggaata gaaggaaatc aggatccggt 3360 cacaaaagcg ctaccgtaca gtcatccaca accgataaga cgagcaccga cagtgccagc 3420 agcaccgatt ccacctcaag cacgtccggg gcaagcacaa ccacttcagg cagttcttct 3480 acctcgggcg gttcaagtac atcggacgct tcctccactt cgtctagtgt ttccaggagt 3540 catcattcag gcgtgaacag acttttacac aagcctggtc aaggaaaaat atgcctttgc 3600 ttcaaaaaca tattcgatat tccttaccat ctccgtaaga atatcggtgt t 3651 <210> 4 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: peptides derived from sericin <400> 4 Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp Ser Asn Ser Asn Ser Ala 1 5 10 15 Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Tyr Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Arg Asp Gly Ser Val Ser Ser Thr Gly Ser Ser Ser Asn Thr Asp 35 40 45 Ser Asn Ser Asn Ser Ala Gly Ser Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Thr 50 55 60 Tyr Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Arg Asp Gly Ser Val 65 70 75 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: recoginition site for factor Xa <400> 5 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 6 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA fragment coded a part of the peptide derived from sericin <400> 6 gtgatcaatc gaaggtcgct cgagtactgg ttcttcttct aacaccgact ctaactctaa 60 c 61 <210> 7 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA fragment coded a part of the peptide derived from sericin <400> 7 tctgctggtt cttctacctc tggtggttct tctacctacg gttactcttc taactctcgt 60 gacggttct 69 <210> 8 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA fragment coded a part of the peptide derived from sericin <400> 8 gtttcttcta ccggttcttc ttctaacacc gactctaact ctaactctgc tggttcttct 60 acctc 65 <210> 9 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA fragment coded a part of the peptide derived from sericin <400> 9 tggtggttct tctacctacg gttactcttc taactctcgt gacggatccg tttaatagct 60 gagcg 65 <210> 10 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA fragment coded a part of the peptide derived from sericin <400> 10 cagagttaga gttagagtcg gtgttagaag aagaaccagt actcgagcga ccttcgattg 60 atcactgca 69 <210> 11 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA fragment coded a part of the peptide derived from sericin <400> 11 aaacagaacc gtcacgagag ttagaagagt aaccgtaggt agaagaacca ccagaggtag 60 aagaaccag 69 <210> 12 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA fragment coded a part of the peptide derived from sericin <400> 12 accagaggta gaagaaccag cagagttaga gttagagtcg gtgttagaag aagaaccggt 60 agaag 65 <210> 13 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA fragment coded a part of the peptide derived from sericin <400> 13 aattcgctca gctattaaac ggatccgtca cgagagttag aagagtaacc gtaggtagaa 60 gaacc 65

Claims

세리신, 또는 서열 ID No: 1로 나타나는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 필수적으로 포함하는 세리신 유도체를 포함하여 이루어지는 동물 세포 배양을 위한 배지 첨가제로서, 배지 중에 용해되어 첨가되는 것을 특징으로 하고, 동물 세포 증식 촉진제로서 사용되는 배지 첨가제.
삭제
제 1 항에 있어서,

세리신 유도체가 상기 세리신 유도체의 아미노산 잔기 100개당 서열 ID No: 1로 나타나는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 배지 첨가제.
제 1 항에 있어서,

세리신 유도체가 서열 ID No: 1로 나타나는 아미노산 서열의 반복단위를 1~8개조 포함하는 폴리펩티드로 이루어지는 배지 첨가제.
세리신 또는 세리신 유도체를 포함하여 이루어지는 동물 세포 배양을 위한 배지 첨가제로서, 배지중에 용해되어 첨가되는 것을 특징으로 하고 동물세포 증식 촉진제로서 사용되는 배지 첨가제에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체가 서열 ID No:2로 나타나는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드이거나, 또는 상기 서열 ID No:2에서 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기가, 서열 ID No: 1로 나타나는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 이외의 영역에서의 결실, 치환, 삽입 또는 첨가, 및 서열 ID No: 1로 나타나는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드에서의 보존적 치환 중 적어도 어느 하나가 일어난 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 세포 증식 촉진 활성을 갖는 폴리펩티드인 배지 첨가제.
제 1 항에 있어서,

세리신 유도체가 서열 ID No: 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 이종 단백질로 이루어지는 융합 단백질인 배지 첨가제.
제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체가 고치 또는 생사(raw silk)로부터 추출되는 배지 첨가제.
제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체가 화학적으로 합성되는 배지 첨가제.
제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체가 유전 공학적 방법으로 얻어지는 배지 첨가제.
삭제
제 1 항 및 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 세리신 또는 세리신 유도체와 배지 기초 성분을 적어도 포함하는 동물 세포 배양을 위한 배지.
제 11 항에 있어서,

상기 배지는 무혈청인 배지.
제 11 항에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체를 배지 전체에 대하여 0.001 내지 10 중량% 함유하여 이루어지는 배지.
제 1 항 및 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 첨가제를, 동물 세포 배양용 배지 중에 용해하여 첨가하는 단계와,

얻어진 배지를 사용하여 동물세포를 배양하고, 이 동물세포를 증식시키는 단계를 포함하는 동물세포를 배양하는 방법.
제 1 항 및 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 첨가제를, 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계,

얻어진 배지를 사용하여, 단백질을 생성할 능력이 있는 동물 세포를 배양하는 단계, 및

상기 배지 또는 상기 동물 세포로부터 생산된 단백질을 채취하는 단계를 포함하여 이루어지는 단백질을 생성하는 방법.
제 1 항 및 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 첨가제를, 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계,

얻어진 배지를 사용하여, 바이러스 벡터에 감염된 동물 세포를 배양하여 증식시키는 단계, 및

상기 배지 또는 상기 동물 세포로부터 바이러스 벡터를 채취하는 단계를 포함하는, 바이러스 벡터를 복제하는 방법.
세리신 또는 세리신 유도체를 사용하여, 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 배지첨가제를 제조하는 방법.
삭제