KR20030032968A

KR20030032968A - 배지 첨가제 및 동물 세포 배양용 배지

Info

Publication number: KR20030032968A
Application number: KR1020027017220A
Authority: KR
Inventors: 사사키마사히로; 야마다히데유키; 오사다가츠에; 데라다사토시
Original assignee: 세이렌가부시끼가이샤
Priority date: 2001-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2003-04-26
Also published as: US20070020760A1; US7157273B2; JP4047176B2; EP1302544A1; EP1302544B1; ATE422216T1; WO2002086133A1; EP1302544A4; DE60231074D1; US7803616B2; KR100882560B1; JPWO2002086133A1; US20030134388A1

Abstract

본 발명의 목적은 동물 세포 배양 및 동물 세포 배양용 배지를 위한 배지를 제공하는 것이다. 본 발명은 세리신 또는 그 유도체를 포함하는 동물 세포 배양을 위한 배지 첨가제 및 적어도 상기 배지 첨가제 및 기초 배지 조성물을 포함하는 동물 세포 배양용 배지에 관한 것이다.

Description

배지 첨가제 및 동물 세포 배양용 배지{MEDIUM ADDITIVES AND MEDIA FOR CULTURING ANIMAL CELLS}

생명과학 분야에서, 최근에 세포 배양 기술 또는 조직 배양 기술을 사용하여, 대상 물질을 생성하는 동물 세포의 대규모 배양에 의해 산업적 규모로 유용한 물질을 생성하는 것이 중요해지고 있다. 대상 동물 세포는 아미노산, 비타민, 무기염, 수크로오스 등을 포함하는 기본 배지를 함유하는 배양용 배지 및 동물 세포 성장 인자를 가지고 이런 방법으로 배양된다. 동물 세포 성장 인자로서, 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청과 같은 혈청 성분이 일반적으로 사용된다. 일반적으로, 소 태아 혈청 또는 소 새끼 혈청은 약 5 내지 20 부피% 정도에서 기초 배지에 첨가되는 것이 필요하다.

그러나, 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청과 같은 혈청 성분은 일반적으로 고가라서 공급이 제한된다. 이것은 대상 생성물의 제조 비용을 증가시킬 것이다. 또한, 혈청은 집단들 사이에 그 특성이 다른 경향이 있어서, 재생성을 요하는 배양에 바람직하지 않다. 게다가, 혈청을 포함하는 배양용 배지의 배양 상청액(supernatant)으로부터의 생성물을 정화시키는 것이 때때로 어렵다. 더우기, 동물로부터 유도된 혈청이 양에서 크로이펠츠 야곱병 및 스크레이피 뿐만 아니라 바이러스를 일으키는 것으로 염려되는 광우병과 관련된 프리온에 감염될 수 있는 가능성이 있기 때문에, 대상 생성물의 안전이 충분하게 보장되지 못할 수 있다.

게다가, 혈청을 포함하는 배지가 생물과학 분야의 실험에서 사용될 때, 실험 시스템이 복잡해지는 경향이 있어서, 원인과 효과 사이의 일상적 관계의 논의에 대해 미결의 혼란을 초래할 수 있다. 이것은 혈청이 미확인물을 포함하는 매우 크고 다양한 성분을 포함하고 있기 때문이다.

그러므로, 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청과 같은 혈청 대신에 공지된 세포 성장 인자, 호르몬 또는 기타를 포함하는 세포 배양용 배지에 대한 관심이 모여졌다.

그러나, 이들 세포 성장 인자 또는 호르몬은 자연계에서 그 존재가 희귀하여 그 사용이 제한되기 때문에, 일반적으로 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청 보다 훨씬 더 고가이다.

따라서, 상기의 혈청, 공지된 세포 성장 인자 등을 대체할 수 있는 안전하고 상대적으로 저렴한 세포 성장 인자 또는 세포 성장 방법에 대한 요구가 있다.

일반적으로, 동물 배양 세포는 그들의 배양 상태에 따라 고착성 세포 및 서스펜션 세포로 분류된다. 배양조직 안의 세포 상태에 맞는 적절한 방법을 고안함으로써 동물 세포 대량 배양에서 세포 성장의 자극에 대한 논의가 이루어졌다. 예를 들어, 고착성 세포 배양을 위해, 세포의 고착성을 증가시킴으로써 세포 성장을 자극하는 시도가 이루어졌다. 여기서, 세포 고착성을 증가시키기 위해서, 세포 배양대(cultrure bed)의 물질 표면에 콜라겐을 사용한 박층 코팅의 사용이 논의되었다. 그러나, 비록 상대적으로 쉽게 사용할 수 있긴 하지만, 일반적으로 콜라겐이 소로부터 유도되기 때문에 상기한 광우병 감염의 위험이 고려되어야 한다.

콜라겐 필름 코팅 치료 대신에, 생사 필름을 포함하는 세포 배양대의 사용이 일본 특개 제 평 11(1999)-243948호 및 제 평 11(1999)-253155호에서 제안된다. 이런 배양대는 상기의 콜라겐 코팅된 대와 같이 세포 고착성을 증가시키고 세포 성장을 자극한다; 그러나, 결정화 과정은 필름 형성에 대해 생사 단백질이 불용성이 되도록 만드는 것이 필요하기 때문에, 처리가 복잡해진다.

그래서, 배양대를 위한 생사에서 유도된 성분의 사용이 공지되었으나, 고치로부터 유도된 성분의 사용, 세포 배양을 위한 생사 또는 기타의 사용은 본 발명자가 알고 있는 한 논의되지 않았다.

본 발명은 동물 세포 배양을 위한 배지 첨가제 및 동일한 것을 포함하는 동물 세포 배양용 배지에 관한 것이다.

이제 본 발명자는 동물 세포가 누에고치 또는 기타로부터 제조될 수 있는 세리신(sericin)이 첨가된 동물 세포 배양을 위한 기초 배지에서 배양될 때, 대상 동물 세포가 효과적으로 성장할 수 있다는 것을 발견하였다. 게다가, 세리신에 의한 동물 세포에 대한 이런 성장 자극 효과는 화학적으로 합성된 세리신 및 유전 공학법에 의해서 얻어진 세리신에서도 유사하게 관찰되었다. 본 발명은 이 발견물들에 기초하여 만들어졌다.

따라서, 본 발명의 목적은 배지에 뛰어난 세포 성장 자극 능력을 부여하고안전과 처리면에서 뛰어난 동물 세포 배양용 배지 첨가제 및 배지를 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 동물 세포 배양용 배지 첨가제는 세리신 및 그 유도체를 포함한다.

더우기, 본 발명에 따른 동물 세포 배양용 배지는 적어도 상기의 배지 첨가제 및 기초 배지 조성물을 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에 따라, 상기의 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계, 얻어진 배지를 사용하여 동물 세포를 배양하는 단계, 및 상기 동물 세포를 성장시키는 단계를 포함하여 동물 세포를 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기의 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계, 얻어진 배지를 사용하여 단백질을 생성할 능력이 있는 동물 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배지 및/또는 상기 동물 세포로부터 생성된 단백질을 회복하는 단계를 포함하여 대상 단백질을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기의 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계, 성장을 위해 얻어진 배지를 사용하여 바이러스 벡터에 감염된 동물 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배지 및/또는 상기 동물 세포로부터 바이러스 벡터를 회복하는 단계를 포함하여 대상 바이러스 벡터를 복제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에 따라, 동물 세포 성장 자극 물질을 생성하기 위해 세리신 또는 그 유도체의 사용이 제공된다.

본 발명에 따른 배지 첨가제 및 동일한 것을 함유하는 배지는 배양되는 동물 세포의 성장을 자극할 수 있고 세포의 생존 능력을 향상시킬 수 있다. 또한, 유용한 물질의 생성은 배지 첨가제 및 배지를 유용한 대상 물질을 생성할 능력이 있는 동물 세포를 배양하는데 사용함으로써 증진될 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 배지 첨가제 및 동일한 것을 포함하는 배지의 사용에 의한 이런 효과는 세포의 상태, 즉, 서스펜션 세포 또는 고착성 세포 및 세포의 유형, 즉, 세포 주(cell line) 또는 정상 세포와는 독립적으로 부여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따라, 소 태아 혈청 및 소 새끼 혈청과 같은 혈청 성분의 양이 감소될 수 있고 또는 동물 세포를 배양하는데 그 사용이 제거될 수 있기 때문에, 배양 생성물의 안전이 향상될 수 있다. 본 발명에 따른 배지 첨가제는 세포 성장이 이것을 배지에 첨가하는 것으로 간단히 자극될 수 있기 때문에, 제조 및 처리면에서 유익하다. 본 발명에서 사용되는 세리신은 혈청 성분 보다 저렴하기 때문에 동물 세포 및 유용한 물질의 생성 비용을 절감할 수 있다.

배지 첨가제

본 발명에 따른 동물 세포 배양용 배지 첨가제는 세리신 또는 그 유도체이다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 배지 첨가제는 동물 세포 성장 자극 물질로 사용된다.

세리신 또는 그 유도체

본 발명에 따른 세리신 또는 그 유도체는 통상의 화학 및/또는 유전 공학법을 사용하여 천연적으로 또는 인공적으로 합성될 수 있고, 둘중 하나가 포함될 수있다.

세리신

본 발명에서의 세리신은 천연적으로 유도되거나 합성되어진 것으로 공지된 어떤 세리신 단백질 모두 또는 그 일부를 의미한다. 이 세리신은 세포 성장 자극 기능을 갖는다.

본 발명에서, 천연적으로 유도된 세리신은 바람직하게는 앞으로 기술되는 방법에 의해 얻어진다.

일반적으로, 길이가 2.6kbp 내지 10.6kbp인 여러 종류의 세리신 유전자는 예를 들어, Journal of Biological Chemistry 257, 15192-15199(1982)에서 입증되고 기술된다. 본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신은 그러한 유전자 서열을 가진다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신의 전체 서열은 필수적으로 서열 아이디 번호:2의 아미노산을 포함한다. 전형적으로, 이 아미노산 서열은 38 아미노산(서열 아이디 번호:1)으로 구성되는 필수 지역 및 다른 불필요한 지역을 포함한다. 바람직하게는, 세리신은 상기 필수 지역의 복수 반복단위의 서열을 포함한다. 예를 들어, 서열 아이디 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 세리신은 38 아미노산(서열 아이디 번호:1)으로 구성되는 필수 지역의 12 반복단위를 포함한다.

서열 아이디 번호:2의 아미노산 서열을 인코딩하는 세리신 염기 서열에 대한 데이타는 접근 번호: Z48802로 EMBL 데이타 라이브러리에 등록되었고 NCBI 홈페이지(http://www.ncbi.nlm.nlm.nih.gov/) 등에서 검색 및 사용할 수 있다.

본 명세서에서, "세리신이 서열 아이디 번호: 2로 표현되는 아미노산 서열을 필수적으로 포함한다"라는 표현의 의미는 세리신이 세포 성장 자극 기능을 갖는 한, 하나 또는 그 이상의(바람직하게는 1 내지 2000, 보다 바람직하게는 1 내지 500 및 더욱 더 바람직하게는 1 내지 300)아미노산 서열(서열 아이디 번호: 2)에서의 아미노산 잔기가 결실되고, 치환되고, 삽입되고 또는 첨가될 수 있다는 것을 의미한다. 바람직한 실시예에 따라, 세리신이 천연적으로 유도될 때, 상기 아미노산 서열에서 결실되고, 치환되고, 삽입 또는 첨가되는 아미노산 잔기의 숫자는 바람직하게는 1 내지 2000, 보다 바람직하게는 1 내지 500 및 더욱 더 바람직하게는 1 내지 300이 될 수 있다.

아미노산 잔기의 상기 결실, 치환, 삽입 또는 첨가가 존재할 때, 이들은 바람직하게 필수 지역이외의 지역에 위치될 수 있다. 이런 경우에, 보존성 치환은 필수 지역에서 발생할 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 실시예에 따라, 예를 들어, 세리신이 세로 성장 자극 작용을 갖는 한, 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 세리신의 상기 아미노산 서열의 잔기의 1 내지 50, 및 보다 바람직하게는 1 내지 20이 보존적으로 치환될 수 있다.

본 명세서에서 "보존성 치환"이란 용어는 실질적으로 단백질 기능의 변화없이 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기와 다른 화학적으로 상동인 아미노산 잔기와의 치환을 의미한다. 예를 들어, 어떤 소수성 잔기는 다른 소수성 잔기와 치환될 수 있고, 어떤 극성 잔기는 동일한 전하를 띄는 다른 극성 잔기와 치환될 수 있고또는 어떤 방향족 아미노산은 다른 방향족 아미노산과 치환될 수 있다. 이런 방식으로 보존적으로 치환될 수 있는 기능적으로 상동인 아미노산은 모든 아미노산에 대한 기술분야에서 공지되었다. 다음의 6개 그룹은 구체적인 예이다. 동일한 그룹 내의 이런 아미노산은 상호간에 보존적으로 치환될 수 있다.

(1) 알라닌(Alanine(Ala)), 세린(serine(Ser)) 및 트레오닌(threonine(Thr))

(2) 아스파르트산(Aspartic acid(Asp)) 및 글루탐산(glutamine(Glu))

(3) 아스파라긴(Asparagine(Asn)) 및 글루타민(glutamine(Gln))

(4) 아르기닌(Arginine(Arg)) 및 리신(lysine(Lys))

(5) 이소류신(Isoleucine(Ile), 류신(leucine(Leu)), 메티오닌(methionine(M et), 발린(valine(Val)) 및

(6) 페닐알라닌(phenylalanine(Phe), 티로신(tyrosine(Tyr)), 및 트립토판(t ryptophan(Trp)).

본 명세서에서, 세리신은 가수분해 되지 않는 세리신(여기서 종종 "세리신 비가수분해물"로 언급된다)과 세리신 가수분해물을 자연스럽게 의미한다. 여기서 이 세리신 가수분해물은, 예를 들어, 산, 알칼리, 효소 또는 기타를 사용하여 세리신을 가수분해하는 통상의 방법에 의해 얻어질 수 있다.

세리신 유도체

본 발명에서, 세리신 유도체는 적어도 필수 지역으로서 38 아미노산으로 구성되는 서열 아이디 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 이 세리신 유도체는 그 하나 또는 양쪽 말단에서 상기의 필수 지역 및 불필요 지역을 포함하고 세포 성장 자극 기능을 갖는다.

본 명세서에서 "세포 성장 자극 기능을 갖는다"의 표현은 당업자에게 인식된 폴리펩티드의 세포 성장 자극 기능을 의미한다. 예를 들어, 세포 성장 자극 기능은 다음의 실시예의 평가 시험 1에서 기술된 것과 동일한 조건하에서 측정될 때 인식되는 경우를 의미한다.

그래서, 본 발명의 세리신 유도체는 세포 성장 자극 능력을 갖는 한, 오직 필수 지역을 포함할 수 있고 또는 적어도 필수 지역 및 필수 지역이외의 어떤 불필요 지역을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신 유도체는 2000이하, 보다 바람직하게는 500이하, 및 더욱 더 바람직하게는 300이하 잔기의 전체 길이를 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

더우기, 본 발명의 보다 바람직한 실시예에 따라, 필수 지역의 하나 또는 양쪽 말단에서 존재할 수 있는 불필요 지역에서의 아미노산 잔기의 숫자는 바람직하게는 1000이하, 보다 바람직하게는 300이하, 더욱 더 바람직하게는 100이하 이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 세리신 유도체는 서열 아이디 번호: 1의 여러 반복단위의 서열을 갖는다. 즉, 세리신 유도체는 필수 지역이외의 서열 아이디 번호: 1의 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 이런 반복 서열을 갖는 폴리펩티드가 향상된 세포 성장 자극 기능을 갖는다고 여겨진다.

본 발명의 보다 바람직한 실시예에 따라, 세리신 유도체는 그 아미노산 서열에서 서열 아이디 번호: 1의 적어도 하나, 보다 바람직하게는 적어도 두개의 아미노산 서열 당 100 아미노산 잔기를 갖는다. 세리신 유도체 안에 함유된 서열 아이디 번호: 1의 아미노산 서열의 고비율이 바람직하다. 비록 세리신 유도체의 전체 길이에서의 아미노산 잔기의 숫자가 증가될지라도, 안정한 세포 성장 자극 기능은 그 비율로 반복 서열을 갖음으로써 얻어질 수 있다.

합성에 의해 얻어질 때, 세리신 유도체는 바람직하게는 서열 아이디 번호: 1의 아미노산 서열의 2 내지 8 반복단위, 보다 바람직하게는 2 내지 6 반복단위, 및 더욱 더 바람직하게는 2 내지 4 반복단위이다. 이런 수치는 합성 생성에서 유리하기 때문에 바람직하다.

본 발명에서, 예를 들어, 하나 내지 여러개, 바람직하게는 1 내지 5, 보다 바람직하게는 1 내지 3 아미노산 서열이 세리신 유도체의 필수 지역에서 보존적으로 치환될 수 있다.

본 발명에서, 세리신 유도체는, 예를 들어, 서열 아이디 번호: 1의 상기의 아미노산 서열 및 이종 폴리펩티드(예를 들어, 다른 기능성 단백질)로 구성되는 폴리펩티드가 결합되는 융합 단백질을 포함한다.

본 명세서에서, 세리신 유도체는 가수분해 되지 않는 세리신 또는 세리신 유도체(여기서 종종 "비가수분해물"로 언급된다)을 자연스럽게 암시하고 세리신 유도체의 가수분해물을 더욱 암시한다. 이 가수분해물은 예를 들어, 산, 알칼리, 효소 및 기타를 사용하는 통상의 방법으로 세리신 유도체를 가수분해함으로써 얻어질 수 있다.

천연적으로 유도된 세리신 또는 그 유도체

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신 및 그 유도체는 천연 자원으로부터 유도될 수 있다. 천연적으로 유도된 생성물은 이들이 인체에 안전하고 상대적으로 저렴하기 때문에 유익하다. 이런 세리신 또는 그 유도체는 배지 첨가제로서가장 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신 또는 그 유도체는 고치 또는 생사로부터 추출된다. 이 고치는 누에고치를 의미하고 생사는 누에고치로부터의 생사 섬유를 의미한다.

본 발명에서, 이 세리신 또는 그 유도체, 특히, 이들의 비가수분해물은, 통상의 추출 방법에 의해 고치 또는 생사로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 보다 구체적으로, 다음과 같이 추출에 의해 90%이상의 순도로 매우 정화된 단일 단백질로 얻어질 수 있다.

첫번째로, 고치 또는 생사는 물, 바람직하게는, 물 속에 있는 고치 또는 생사에 함유된 세리신을 용해시키기 위해서 약 80 내지 100℃의 뜨거운 물속에서 처리되고 수성 세리신 용액이 얻어진다. 그래서 얻어진 수성 세리신 용액은 예를 들어, 대상 세리신 가수분해물을 회복하기 위해서 다음 방법 (1),(2) 및 (3)의 어떤 것을 사용하여 분리 및 정화 처리된다.

(1) 수성 세리신 용액의 pH는 유기산 또는 무기산으로 3 내지 5로 조절된 후, 세리신을 침전시키기 위해 유기 콜라겐 또는 무기 콜라겐이 첨가되고, 그 후에 여과 및 축조되어, 고체 세리신이 얻어진다.

(2) 수성 세리신 용액 및 메탄올, 에탄올, 디옥산(dioxane)과 같은 수용성용매가 세리신을 침전시키기 위해서 혼합되고, 여과 및 축조된 후에, 고체 세리신이 얻어진다.

(3) 일본 특개 제 평 04(1992)-202435호에서 기술한대로, 수성 세리신 용액은 초여과(ultrafiltration) 막 또는 역삼투막에 사용되고, 그 후에 특정 여과법이 실행되고, 축조된 후에 세리신 가루가 얻어진다.

또한, 본 발명에서, 세리신 및 그 유도체의 가수분해물은 통상적인 추출 방법에 의해 고치 또는 생사로부터 얻어질 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 다음과 같이 추출에 의해 90%이상의 순도로 매우 정화된 단일 단백질로 얻어질 수 있다.

첫번째로, 고치 또는 생사는 물, 바람직하게는, 물 속에 있는 고치 또는 생사에 함유된 세리신을 용해시키기 위해서 약 80 내지 100℃의 뜨거운 물속에서 처리되고 수성 세리신 용액이 얻어진다. 이 단계에서, 만일 필요하다면, 세리신은 전기분해된 물, 산, 알칼리 또는 효소를 조합해서 사용하여 부분적으로 가수분해될 수 있다. 얻어진 수성 세리신 용액은, 예를 들어, 대상 세리신 비가수분해물을 회복하기 위해서 상기의 방법 (1),(2) 또는 (3)을 사용하여 분리 및 정화 처리된다.

본 발명에서, 바람직하게, 천연적으로 유도된 세리신 또는 그 유도체는 500 내지 500,000의 분자량 분포를 갖고 아미노산으로서 20 내지 40 몰% 정도의 세린을 함유한다.

화학 또는 유전 공학 방법에 의해 얻어진 세리신 또는 그 유도체

본 발명의 한 바람직한 실시예에 따라, 세리신 및 그 유도체가 통상의 화학또는 유전 공학 방법을 사용하여 인공적으로 합성될 수 있다. 전형적으로, 이런 세리신 또는 그 유도체의 세포 성장 자극 기능은 천연적으로 유도된 것과 동일하거나 높다. 따라서, 이런 세리신 또는 그 유도체는 배지 첨가제로서 적절하게 사용될 수 있다. 만일 필요하다면, 합성을 위한 이런 화학 및 유전 공학 방법은 조합해서 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에서, 세리신 및 그 유도체는 모두 화학적으로 합성되는 서열일 수 있고 또는 천연적으로 유도된 세리신의 부분 서열을 사용하고 부분 서열에 기초하여 더욱 합성함으로써 얻어질 수 있다. 화학 합성을 위해서, t-Boc 방법 또는 Fmoc 방법을 사용하는 고체상-액체상 합성법과 같은 통상적인 펩티드 합성법이 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에서, 세리신 및 그 유도체는 유전 공학법에 의해 생성될 수 있다. 그래서, 본 발명에서, 세리신 또는 그 유도체를 인코딩하는 DNA가 사용가능할 때 또는 축조될 수 있을 때, 세리신 및 그 유도체는 숙주 세포를 이런 DNA로 변형함으로써 얻어지는 변형된 세포로 생성될 수 있다.

예를 들어, 세리신 유도 펩티드를 인코딩하는 DNA가 누에 생사선으로부터 복제, 화학 합성함으로써 또는 누에 생사선으로부터 얻어진 부분 DNA를 사용하고 이 부분 DNA에 기초하여 더욱 합성함으로써 얻어질 수 있다. 펩티드의 아미노산 서열을 고려하면, 일반적으로, 염기 서열 인코딩은 소위 코돈 테이블을 참고하여 쉽게 결정될 수 있다. 따라서, 세리신 및 그 유도체를 인코딩하는 DNA는 어떤 퇴화 코돈을 갖는 모든 염기 서열을 의미한다.

세리신 및 그 유도체는 특히, 표현가능한 상태에서 세리신 또는 그 유도체를 인코딩하는 DNA 절편을 운반하고 숙주 세포에서 복제가능한 재조합 벡터의 형태로 DNA를 얻고, DNA 또는 벡터를 사용하여 숙주 세포를 변형하고, 그래서 얻어진 변형체를 배양함으로써 각각 생성될 수 있다. 즉, 소위 숙주-벡터 시스템은 상기 펩티드의 생성에 사용될 수 있다. 이런 숙주-벡터 시스템을 사용하는데 있어, 당업계에서 통상적으로 사용되는 표현 벡터(재조합 벡터)를 구축하는 다양한 방법 및 변형 방법이 사용될 수 있다.

세리신 및 그 유도체의 생성에 사용되는 벡터는, 사용될 숙주 세포의 종류를 고려하여, 플라스미드, 바이러스, 파지 및 코스미드(cosmid) 벡터와 같이 숙주-벡터 시스템이 만든 통상적인 벡터로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 보다 바람직하게, 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 사용되면, pBR, pUC 또는 pQE 플라스미드 또는 람다 파지, 박테리아 파지가 사용되고, 고초균(Bacillus subtilis)에 대해서는 pUB 플라스마가 사용될 수 있고, 효모에 대해서는 YEp 및 YCp 벡터가 사용될 수 있다. 플라스미드는 바람직하게 상기 펩티드를 생성하기 위한 벡터로서 사용된다.

사용가능한 플라스미드는 바람직하게 변형체를 선택하기 위한 선택 마커를 포함한다. 예를 들어, 보조영양요구성(auxotrophy)을 위한 앰피실린(ampicillin) 저항 및 카나마이신(kanamycin) 저항 마커와 같은 약물 저항 마커 또는 마커 유전자는 이런 선택 마커로서 사용될 수 있다. 게다가, 특정 펩티드에 의한 β-갈락토시다아제 기능의 회복은 플라스미드와 같은 벡터 DNA에 의해 생성되고, 또한 숙주세포 안에 엔코드된 펩티드는 선택 마커로서 사용될 수 있다.

또한, 재조합 벡터로서 DNA는 바람직하게 세리신 또는 그 유도체, 예를 들어, 프로모터, 전사 개시 신호, 번역 종결 신호 및 전사 종결 신호 및 번역 조절 신호와 같은 전사 조절 신호를 표현하는데 필요한 DNA 서열을 갖는다.

어떤 세포는 숙주 벡터 시스템이 만들어지는 한, 세리신 및 그 유도체의 생성을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 이런 숙주 세포의 예는 대장균, 고초균, 효모 및 곰팡이를 포함한다.

대장균, 고초균, 효모 또는 곰팡이가 숙주 세포로 사용될 때, 분비형 벡터는 대상 세리신 또는 그 유도체를 세포외적으로 분비하는 벡터로 사용될 수 있다.

게다가, 본 발명에서, 세리신 유도체는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 이런 융합 단백질은 상기 필수 지역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 및 이형 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA의 조합에 의해 융합 단백질을 인코딩하는 DNA를 축조하고, 축조된 DNA를 표현함으로써 생성된다.

본 명세서에서, "DNA" 및 "gene" 이라는 용어는 통상적으로 상호 교환해서 사용된다.

동물 세포 배양용 배지

본 발명에 따른 동물 세포 배양용 배지는 적어도 동물 세포 배양용 배지 및 기초 배지 조성물에 대한 상기의 배지 첨가제를 포함한다. 따라서, 만일 필요하다면, 이것은 상기 성분이 포함되는 한, 다양한 세포 성장 인자, 예를 들어, 알부민 및 트랜스페린과 같은 결합 단백질, 인슐린, 상피(epithelial) 성장 요인(EGF), 섬유 세포 성장 인자 및 다양한 스테로이드 호르몬 및 피브로넥틴(fibronectin)과 같은 세포 고착 인자 뿐만 아니라 혈청을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 동물 세포 배양 배지는 바람직하게 통상의 배지 보다 더 적은 양의 혈청을 함유하는 배지이고, 보다 바람직하게는 혈청 제거 배지이다. 혈청 제거 배지는 혈청을 함유하지 않는 배지이고 혈청이외의 세포 성장 인자 및 호르몬을 포함할 수 있다.

동물 세포 배양용 배지에 함유된 세리신 또는 그 유도체의 양은 특별히 제한되지 않고 배양되는 세포의 종류, 배양의 목적, 기초 배지 조성물의 종류 등에 따라 적절하게 변할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라, 배지 안의 세리신 또는 그 유도체의 백분율은 0.001 내지 10중량%, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.5중량% 및 더욱 더 바람직하게는 0.05 내지 0.2중량%이다.

본 발명은 세리신 또는 그 유도체의 소량이 본 발명의 배지에 포함될지라도, 충분한 효과를 나타낸다. 그러나, 비록 이들이 다량으로 첨가되더라도, 세리신이 무독성이고 수용성이 크기 때문에, 일반적으로 실질적인 문제가 되지 않는다.

본 발명에 따른 배지 첨가제가 통상적인 배지에 첨가됨으로써 유리하게 사용될 때, 배지 첨가제를 배지의 소량에서 용해한 후 이것을 전체 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 기초 배지 조성물은 일반적인 동물 세포, 소화가 잘 되는 질소 공급원 및 무기염에 의해 동화되는 탄소 공급원을 포함한다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 무기염, 아미노산, 포도당 및 비타민이 포함된다. 만일 필요하다면, 영양 자극을 위한 미량 물질 및 전구체와 같은 효과적인 미량 물질이 기초 배지 조성물에 포함될 수 있다.

당업자에게 공지된 어떤 배지 조성물도 기초 배지 조성물로 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어, MEM 배지(H, Eagle, Science, 130, 432(1959)), DMEM 배지(R. Dulbecco, Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 배지(G.E. Moore, J.A.M.A., 199, 519 (1967)), Ham's F12 배지(R.G.Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 53, 288 (1965)), MCDB104 배지(W.L. Mckeehan, In Vitro, 16, 526 (1980))가 사용될 수 있다.

본 발명에서 적절하게 사용될 수 있는 다른 배지들은 혈청 제거 배지 ASF104 (Ajinomoto Co., Inc.), 혈청 제거 배지 SF-02(Sanko Junyaku Co., Ltd.), 혈청 제거 배지 하이브리도머(hybridoma-SFM)(Lifetech Oriental), 혈청 제거 배지 BIO-MPM-1(Biological Industries), 혈청 제거 배지 EX-CELL^TM302-HDP(JRH Biosciences) , 혈청 제거 배지 코스미디움 001(Cosmo Bio), 및 혈청 제거 배지 SFM-101(Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)를 포함한다.

본 발명의 배지 안에서 배양될 수 있는 동물 세포는 특별히 제한되지 않고 이들은 생물학적 조직으로부터 얻은 확립된 세포 주 또는 비확립된 정상 세포가 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 동물 세포는, 예를 들어, 자신에 의해 단백질을 생성할 수 있고, 이종 단백질을 표현하기 위해서 유전 공학에 의해 변형되는 세포일 수있고 또는 다양한 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포일 수 있다.

자신에 의해 단백질을 생성할 수 있는 세포의 예는 단일 무성 항체를 생성하는 하이브리도마 세포, 인터페론(INF)-α를 생성하는 백혈구(leucocytes), INF-β를 생성하는 섬유아세포(fibroblasts), INF-γ를 생성하는 림프구(lymphocytes), 프로유로키나아제(prourokinase(pro-UK)) 또는 UK를 생성하는 인간 신장 세포, 플라스미노젠(plasminogen) 활성자 (tPA)를 생성하는 흑색종(melanoma) 세포, 인슐린을 생성하는 In-111 세포, 글루카곤을 생성하는 HIT 세포, 에리트로포이에틴(erythropoietin)을 생성하는 HepG2 세포 및 인터루킨-5를 생성하는 B151K12 세포를 포함한다.

유전 공학에 의해 변형되는 세포 주의 예는 베로(Vero) 세포, 헬라(HeLa) 세포, 중국 햄스터 난자(CHO (Chinese hamster overy)) 세포, HKG 세포, NIH3T3 세포, BHK 세포, COS-1 세포, COS-7 세포 및 골수종(myeloma) 세포를 포함한다.

바이러스 벡터에 의해 감염된 세포의 예는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 렌티바이러스(lentivirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스 벡터, 및 헤르페스바이러스(herpesvirus) 벡터를 포함한다. 이런 바이러스는 통상적인 유전 공학법에 의해 유전적으로 재조합될 수 있다. 또한, 이런 바이러스 벡터에 감염된 동물 세포 및 본 발명의 배지를 사용하여 배양되는 동물 세포의 예는 인간 배아 신장(HEK(human embryonic kidney)) 293 세포, A549 세포, 및 PER.C6 세포를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예는 동물 세포를 배양하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명의 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계 및 동물 세포를 성장시키기 위해서 얻어진 배지를 사용하여 동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

본 방법을 위한 배양 조건, 예를 들면, 산소 농도, 삼투압, pH, 배지의 온도는 배양될 세포의 종류, 배양의 목적, 배양의 양 및 기초 배지 조성물의 종류에 따라 적절하게 변화될 수 있다. 다발 배양, 연속 배양 또는 관류(perfusion) 배양과 같은 어떤 배양 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 고밀도 배양이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는, 본 발명의 배지 첨가제를 동물 세포 배양 배지에 첨가하는 단계, 동물 세포를 성장시키기 위해서 얻어진 배지를 사용하여 단백질을 생성하는 능력이 있는 동물 세포를 배양하는 단계 및 생성된 단백질을 상기 배지 및/또는 상기 동물 세포로부터 회복하는 단계를 포함하여, 단백질을 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따라 단백질을 생성하는 방법에서, 바람직하게 생성될 수 있는 단백질의 예는 단일 무성 항체, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, pro-UK 또는 UK, tPA, 인슐린, 글루카곤, 에리트로포이에틴 및 인터루킨-5를 포함한다.

생성된 단백질은 단백질의 화학적 또는 물리적 특성을 사용하여 회복될 수 있고 다양한 통상의 분리 방법에 의해 분리되고 정화된다. 예를 들어, 단백질은 단일 또는 조합해서, 단백질 응고제, 초여과, 흡착, 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, 투석 등으로 처리함으로써 회복, 분리 및 정화될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예는, 본 발명의 배지 첨가제를 동물 세포 배양 배지에 첨가하는 단계, 얻어진 배지를 사용하여 바이러스 벡터에 감염된 동물 세포를 성장시키기 위해서 배양하는 단계 및 상기 배지 및/또는 생성된 바이러스 벡터를 상기 동물 세포로부터 회복하는 단계를 포함하여, 바이러스 벡터를 복제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 복제 방법에 의해 복제가능한 바이러스 벡터는 예로서 상기한 다양한 바이러스 벡터이고, 만일 필요하다면, 유전자 재조합에 의해 생성될 수 있다.

적절하게 선택된 동물 세포는 통상의 방법에 의해 대상 바이러스 벡터에 감염된다.

더우기, 바이러스 벡터는 초여과 및 원심분리와 같은 다양한 통상의 분리 방법을 사용하여 분리 및 정화함으로써 성장된 세포로부터 회복될 수 있다. 여기서 바이러스 벡터의 종류에 따라 바이러스 벡터를 회복하는 방법을 적절하게 선택하는 것이 바람직하다.

일반적으로, 유전자 치료는 두 종류, 즉, ex vivo 유전자 치료 및 in vivo 유전자 치료로 분류된다. 전자는 부모로부터 유도된 세포가 신체 외부에서 처음으로 배양되고 그 후에 유전자 이식을 위해 처리되어, 이 세포가 부모에 투여되는 치료법이다. 후자는 벡터와 이식된 유전자가 직접 환자의 몸속으로 투입되는 치료방법이다.

본 발명에 따른 방법은 바이러스 벡터를 복제할 수 있고, 통상적인 방법 보다 더욱 효과적으로, 이런 유전자 치료법에 사용되는 유전자는 바이러스 벡터에 도입된다. 게다가, 본 발명의 배지는 293 세포와 같이, 이런 복제 방법에 사용되는 동물 세포에 대한 뛰어난 성장 자극 효과를 보여준다.

본 발명은 발명을 제한하려고 의도하지 않은 다음의 예를 통해서 더 한층 설명될 수 있다.

세리신 또는 그 유도체를 생성하는 방법은 다음의 제조예 1 및 제조예 2에 나타난다.

제조예 1

세리신 가수분해물을 추출하기 위해서, 1kg의 고치(누에고치에 의해 만들어짐(Bombyx mori))를 95℃에서 2시간 동안 0.2% 탄산나트륨 용액(pH 11-12) 50L에서 처리하였다. 침전물을 제거하기 위해서, 얻어진 세리신 가수분해 추출물을 0.2㎛의 평균 공극 지름을 갖는 필터를 사용하여 여과하였고, 그 후에 0.2%의 세리신 농도를 갖는 세리신 가수분해물의 투명하고 무색인 수성 용액을 얻기 위해서, 여과액을 역삼투막을 사용하여 염분을 제거하였다.

이 수성 용액을 증발기를 사용하여 약 2%의 세리신 농도로 농축시켰고, 그 후에 90%이상의 순도로 20,000의 평균 분자량을 갖는 100g의 세리신 가수분해물 분말(폴리펩티드 A)을 얻기 위해 동결축조시켰다.

제조예 2

세리신 유도체를 인코딩하는 DNA 절편의 화학적 합성:

DNA는 세리신에서 공통적으로 보존되는 38아미노산으로 구성되는 서열(서열아이디 번호:1)의 두개의 반복단위를 포함하는 다음의 아미노산을 포함하는 세리신 유도체의 한 예로서, 폴리펩티드를 암호화하기 위해 디자인하였다:

Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Thr-Asp-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser-

Ala-Gly-Ser-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly--Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Tyr-Ser-

Ser-Asn-Ser-Arg-Asp-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-Ser-Ser-

Asn-Thr-Asp-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser-Ala-Gly-Ser-Ser-Thr-Ser-Gly-

Gly-Ser-Ser-Thr-Try-Gly-Tyr-Ser-Ser-Asn-Ser-Arg-Asp-Gly-Ser-

Val (서열 아이디 번호:4).

여기서 다른 융합 펩티드를 절단하기 위해서 프로테아제(인자 Xa)의 인식 자리(Ile-Glu-Gly-Arg(서열 아이디 번호:5))를 상기의 펩티드의 N 말단에서 교환하였다. 또한, 벡터를 결합하기 위해서, 제한 효소 인식 자리(PstI, EcoRI)를 상기의 펩티드를 인코딩하는 DNA의 양말단에서 교환하였고 두개의 번역 종결 코돈을 DNA의 3'말단쪽에 첨가하였다. 이런 방법으로, 상기의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 디자인하였다.

다음으로, 디자인된 DNA를 포스포아미디트(phosphoamidite) 방법에 의해 DNA 합성기(활용된 바이오시스템)를 사용하여 화학적으로 합성하였다. 구체적으로, 각각 약 60 내지 70 염기의 DNA 길이를 갖는 8개의 절편들을 화학적으로 합성하였다.

합성된 8개 DNA 절편은 다음과 같다:

절편 (1):

5'-GTGATCAATCGAAGGTCGCTCGAGTACTGGTTCTTCTTCTAACACCGACTCTAACTCTAAC-3'

(서열 아이디 번호: 6)

절편 (2):

5'-TCTGCTGGTTCTTCTACCTCTGGTGGTTCTTCTACCTACGGTTACTCTTCTAACTCTCGTGACGGTTC T-3' (서열 아이디 번호: 7)

절편 (3):

5'-GTTTCTTCTACCGGTTCTTCTTCTAACACCGACTCTAACTCTAACTCTGCTGGTTCTTCTACCTC-3'

(서열 아이디 번호: 8)

절편 (4):

5'-TGGTGGTTCTTCTACCTACCTACGGTTACTCTTCTAACTCTCGTGACGGATCCGTTTAATAGCTGAGC G-3' (서열 아이디 번호: 9)

절편 (1'):

5'-CAGAGTTAGAGTTAGAGTCGGTGTTAGAAGAAGAACCAGTACTCGAGCGACCTTCGATTGATCACTGC A-3' (서열 아이디 번호: 10)

절편 (2'):

5'-AAACAGAACCGTCACGAGAGTTAGAAGAGTAACCGTAGGTAGAAGAACCACCAGAGGTAGAAGAACCA G-3' (서열 아이디 번호: 11)

절편 (3'):

5'-ACCAGAGGTAGAAGAACCAGCAGAGTTAGAGTTAGAGTCGGTGTTAGAAGAAGAACCGGTAGAAG-3'

(서열 아이디 번호: 12)

절편 (4'):

5'-AATTCGCTCAGCTATTAAACGGATCCGTCACGAGAGTTAGAAGAGTAACCGTAGGTAGAAGAACC-3'

(서열 아이디 번호: 13)

펩티드를 인코딩하는 DNA의 축조

펩티드를 인코딩하는 DNA로 구성되는 4개의 이중가닥 DNA를 얻기 위해서, 상기대로 합성된 8개 절편(약 70 염기)을 각각 보상 서열을 갖는 절편들과 가열냉각함으로써 이중가닥 사슬로 변환시켰다.

또한, 화학적으로 합성된 올리고핵산이 5'말단에서 인산을 갖지 않기 때문에, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여 합성된 유전자 절편 각각의 5'말단에 인산을 첨가하였다.

다음으로, 4개의 DNA 절편을 타가라 접합 장치 버전 Ⅱ(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여 접합하였다.

대장균용 표현 플라스마의 축조:

접합된 DNA 절편을 대장균(Qiagen)용 고표현 벡터 pQE 30과 혼합하였고 타가라 접합 장치 버전 Ⅱ(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여 접합 반응을 하였다. 얻어진 반응 혼합물을 대장균 JM109속으로 유도하였고 DNA 절편속에 삽입된 표현 플라스마를 변형체로부터 얻었다.

표현 유도:

폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 유전자를 운반하는 표현 플라스미드가 삽입된 대장균 JM109 가닥 변형체 세포를 앰피실린 50㎍/㎖가 첨가된 M9 + 2% 카사미노산(casamino acid) 배지에서 37℃로 교반하에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양한후에, 얻어진 배양액을 2%의 농도에서 동일한 배지 속에 주입하고 배양을 37℃에서 교반하에서 계속하였다.

610nm에서 광학 농도가 0.3 내지 0.5에 도달할 때, 1mM의 최종 농도로 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalctopyranoside)를 얻어진 배양액에 첨가하였고 4시간 동안 배양을 계속하였다.

펩티드의 정화:

표현 도입 이후에, 세포를 초음파로 파괴하였고 상청액으로부터 가용성 부분으로서 폴리펩티드를 회복하기 위해서 얻어진 서스펜션을 100℃에서 10분 동안 처리하였고 6500rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다.

다음으로, 폴리펩티드를 QIA Express Ni-NTA 단백질 정화 시스템(Qiagen)을 사용하여 정화시켰다.

상기의 방법에 의해 약 8,000의 분자량을 갖는 세리신 유도체(폴리펩티드B)를 얻었다.

평가 시험

상기의 생성 예들에서 얻어진 세리신 및 그 유도체(폴리펩티드 A 및 B)를 사용하여 다음의 평가 시험을 실행하였다.

평가 시험 1: 하이드로마 세포 성장에 대한 자극 효과 및 항체 생성에 대한 자극 효과

아래의 표1에서 나타난 7개의 다른 실험 그룹에 대한 배지의 각각을 제조하기 위해서, 세리신 또는 소 혈청 알부민(BSA)을 특정 농도에서, 혈청 제거 기초 배지 ASF104(Ajinomoto Co., Inc.)에 첨가시키고 용해시켰다.

쥐 하이브리도마 세포(F, Makishima, Cytotechnology, 10, 15(1992))를 생성하는 항체를 24-웰 배양판(well culture plate)의 웰에 제공되는 실험용 그룹에 대한 배지의 각각에 1.5 ×10⁴(세포/ml)의 세포 농도에서 주입시켰다. 사용된 하이브리도마 세포들은 서스펜션 세포이었다.

각 실험 그룹의 세포를 5 부피% 이산화탄소 및 95 부피% 공기의 대기에서 37℃로 3일 동안 배양시켰다.

배양 후에, 배양액의 세포 농도를 통상의 혈구 계산기(hemocytometer)를 사용하여 측정하였다. 각 실험 그룹에 대한 세포 성장 자극 효과를 세포 농도의 변화로부터 측정하였다.

배양 상청액에서 생성된 항체의 양을 기준으로 단백질 G 정화 항체를 사용하여 통상의 enzyme-linked immunosorbent assay 방법(ELISA 방법)으로 정량적으로 측정하였다. 측정에서, 양고추냉이 퍼록시다아제-레이블드 안티마우스(horserad ish peroxidase-labeled antimouse)-IgG(G+L)를 효소-레이블드 제 2항체로 사용하였고, 오르토-페닐렌디아민(o-phenylenediamine)을 발색제로 사용하였다. 세포 제거 배양 상청액에서의 항체의 양은 배지 안의 IgG 농도(㎍/㎖)로 표현하였다. 각 실험 그룹 안의 항체 생산성을 항체 농도의 변화로부터 평가하였다.

얻어진 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

실험 그룹	세포 농도(10⁴세포/ml)	항체 농도(㎍/ml)
첨가제 미첨가	8.2 ±1.5	19 ±2
폴리펩티드 A 0.05%	16.5 ±2.0	22 ±2
폴리펩티드 A 0.1%	18.5 ±1.3	23 ±1
BSA 0.05%	15.5 ±0.8	20 ±1
BSA 0.1%	18.2 ±1.7	18 ±1
폴리펩티드 A 및 BSA, 각각 0.05%	23.4 ±0.6	24 ±2
폴리펩티드 B 0.1%	22.3 ±0.6	23 ±2

평균 ±표준 편차 (n=3)

이런 결과는 본 발명(각 배지는 단독으로 폴리펩티드 A 또는 폴리펩티드 B가첨가된다)에 따른 배지를 하이브리도마 세포의 성장 및 항체 생산성을 강하게 자극한다. 이 효과는 BSA가 첨가된 배지와 적어도 동일하거나 크다.

평가 시험 2: HepG2 세포 성장에 대한 자극 효과, 알부민 분비에 대한 증가 효과 및 생존 능력에 대한 자극 효과

아래의 표 2에 나타난 6개의 다른 실험 그룹에 대한 각각의 배지를 제조하기 위해서, 폴리펩티드 A, 폴리펩티드 B 또는 BSA를 특정 농도로 혈청 제거 배지 SF-02(Sanko Junyaku Co.,Ltd.)에 첨가시키거나 용해시켰다.

인간 간암 세포(J. Skelly, Nature, 282, 615(1979))로부터 유도된 HepG2를 24-웰 배양판의 웰 속에 1.0 ×10⁴(세포/ml)의 세포 농도로 주입하였다. 사용된 HepG2 세포는 고착성 세포이었다.

각 실험 그룹의 세포를 5 부피% 이산화탄소 및 95 부피% 공기의 대기에서 37℃로 배양하였다.

배양 후에, 배양액의 세포 농도를 통상적인 혈구 계산기를 사용하여 측정하였다. 각 실험 그룹에 대한 세포 성장 자극 효과는 세포 농도의 변화로부터 평가하였다.

세포 생존성은 트리팬 블루(trypane blue) 염색 및 생존 세포 계측으로 평가하였다.

분비된 알부민의 양은 표준으로서 상업적인 정화된 인간 혈청 알부민을 사용하여 통상의 enzyme-linked immunosorbent assay 방법(ELISA 방법)으로 정량적으로 측정하였다.

측정에서, 호스래디시 퍼록시다아제-라벨된 안티마우스(horseradish peroxidase-labeled antimouse)는 효소-라벨된 제 2항체로 사용하였고, 오르토-페닐렌디아민(o-phenylenediamine)을 발색제로 사용하였다.

얻어진 결과를 아래의 표 2에 나타내었다.

실험 그룹	5일 동안 배양액의 세포 농도(10⁴세포/ml)	5일 동안 배양액에서 분비된 알부민(ng/ml)	17일 동안 배양액에서의 생존성(%)
첨가제 미첨가	7.9 ±0.6	390 ±23	3.1 ±0.5
폴리펩티드 A 0.05%	13.5 ±0.4	431 ±28	8.6 ±0.4
폴리펩티드 A 0.1%	17.3 ±1.1	476 ±19	10.3 ±0.8
BSA 0.05%	12.1 ±0.8	420 ±13	4.9 ±0.4
BSA 0.1%	15.5 ±0.7	448 ±24	6.2 ±0.3
폴리펩티드 A 및 BSA, 각각 0.05%	19.4 ±1.2	510 ±21	12.4 ±0.7
폴리펩티드 B 0.1%	20.1 ±1.5	525 ±19	13.0 ±0.4

평균 ±표준 편차 (n=3)

이 결과는 본 발명에 따른 배지가 HepG2 세포의 성장 및 알부민 분비와 같은 간기능에 특유한 단백질 생산성을 강하게 자극한다는 것을 나타내었다. 일반적으로, 배지의 변화없이 세포가 배양될 때, 세포의 대부분은 과잉성장으로 인해 죽는다. 반대로, 본 발명에 따른 배지에서의 세포 생존성은 증가될 수 있다.

평가 시험 3: 인간 상피 피부 세포(human epidermal keratinocyte cells)에 대한 성장 자극 효과

아래의 표 3에 나타난 4개의 다른 시험 그룹를 위한 각 배지를 제조하기 우해서, 폴리펩티드 A 또는 B를 특정 농도에서 상피 피부 세포(CCM-3111, Clonetics Corporation (California, USA))용 배지에 첨가하고 용해시켰다.

신생아의 상피 피부 세포(Normal Human Epidermal Keratinocyte cells, Clonetics Corporation(California, USA))를 24-웰 배양판의 웰 속에 1.0 ×10⁴(세포/ml)의 세포 밀도에서 주입시켰다. 사용된 세포는 세포 주가 유도되지 않은 정상 세포이고 고착성 세포이다.

각 실험 그룹 안의 세포를 5 부피%의 이산화탄소및 95 부피% 공기의 대기에서 37℃에서 배양시켰다.

배양 후에, 배양액의 세포 밀도를 통상의 혈구 계산기를 사용하여 측정하였다. 각 실험 그룹에 대한 세포 성장에 대한 자극 효과를 세포 밀도의 변화로부터 평가하였다.

얻어진 결과는 아래의 표 3에 나타내었다.

실험 그룹	세포 밀도 (10⁴세포/ml)
첨가제 미첨가	3.4 ±0.1
폴리펩티드 A 0.01%	5.5 ±1.3
폴리펩티드 A 0.05%	5.8 ±0.8
폴리펩티드 B 0.01%	5.9 ±1.5
폴리펩티드 B 0.05%	6.3 ±0.4

평균 ±표준 편차 (n=3)

경우에 따라서, 상피 피부 세포와 같은 정상 세포는 BSA와 함께 배지에 첨가될 때 세포가 증식되기 보다는 분화되기 때문에 BSA를 배지에 첨가할 수 없다. 상기의 결과는 본 발명에 따른 배지가 상피 피부 세포의 성장을 자극하고 세포 분화는 유도하지 않는다는 것을 증명하였다.

평가 시험 4: 아데노바이러스 벡터 생성에 대한 자극 효과

이 시험을 타가라 아데노바이러스 표현 벡터 키트(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 사용하여 실행하였다.

아데노바이러스의 4 ×10⁷PFU를 293 세포의 9.5 ×10⁵를 포함하는 배지(Nephrigen; Celox (Minnesota, USA))에 첨가시켰고, 세포를 바이러스에 감염시키기 위해서 혼합물을 한 시간 동안 방치하였다.

다음으로, 배양된 세포를 갖는 배지를 아래의 표 4(분비 없는 한 배지 및 각각 0.02% 폴리펩티드 A 또는 폴리펩티드 B를 포함하는 2개의 배지)에 나타난 실험 그룹용 3개의 다른 배지와 교환하였고 바이러스 생성을 위해서 3일 동안 배양을 계속하였다. 각 실험 그룹의 세포를 5 부피% 이산화탄소 및 95 부피% 공기의 대기에서 37℃로 배양하였다.

배양 후에, 얻어진 바이러스 서스펜션을 회복하였고 293 세포를 사용하여 바이러스 규정농도를 결정하였다. 바이러스 규정 농도를 TCID 50 방법(50% 조직 배양 양향 양)으로 계산하였다.

얻어진 결과를 아래의 표 4에 나타내었다.

실험 그룹	바이러스 규정농도 (×10⁷PFU)
첨가제 미첨가	3.36 ±1.50
폴리펩티드 A 0.02% 첨가	5.18 ±1.22
폴리펩티드 B 0.02% 첨가	7.62 ±2.04

얻어진 결과는 본 발명에 따른 세리신 또는 그 유도체가 첨가된 배지는 유전자 치료를 위해 사용된 바이러스 벡터의 생성을 자극한다는 것을 나타내었다. 이런 효과는 폴리펩티드 B에 의해 현저하게 나타났다.

내용중에 포함되어 있음

Claims

세리신 또는 세리신 유도체를 포함하는 동물 세포 배양을 위한 배지 첨가제.
제 1 항에 있어서,

세리신 유도체가 필수 영역으로서 서열 아이디 번호: 1로 나타나는 아미노산 서열로 구성되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 배지 첨가제.
제 2 항에 있어서,

세리신 유도체가 상기 세리신 유도체의 아미노산 잔기 100 당 서열 아이디 번호: 1로 나타나는 아미노산 서열로 구성되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 배지 첨가제.
제 1 항에 있어서,

세리신 유도체가 서열 아이디 번호: 1로 나타나는 아미노산 서열의 1 내지 8의 반복단위를 포함하는 배지 첨가제.
제 1 항에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체가 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가이 결실, 치환, 삽입 또는 첨가되는 서열 아이디 번호: 2로 나타나는 아미노산으로 구성되거나 서열 아이디 번호: 2의 변형된 아미노산 서열로 구성되고 세포 성장 자극 기능을 갖는 폴리펩티드인 배지 첨가제.
제 1 항에 있어서,

세리신 유도체가 서열 아이디 번호: 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 융합 단백질 및 이종 단백질인 배지 첨가제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체가 고치 또는 생사(raw silk)로부터 추출되는 배지 첨가제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체가 화학적으로 합성되는 배지 첨가제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체가 유전 공학 방법으로 얻어지는 배지 첨가제.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

배지 첨가제가 동물 세포 자극제로 사용되는 배지 첨가제.
적어도 제 1 항 내지 제 1 항 중 어느 한 항에 따른 배지 첨가제 및 기초 배지 조성물을 포함하는 동물 세포 배양을 위한 배지.
제 11 항에 있어서,

배지의 혈청이 제거된 배지.
제 11 항에 있어서,

세리신 또는 세리신 유도체가 0.001 내지 10 중량%의 범위에서 배지 안에 함유되는 배지.
제 1 항에 따른 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계,

얻어진 배지를 사용하여 동물 세포를 배양하여 동물세포를 생장시키는 단계를 포함하는 동물세포를 배양하는 방법.
제 1 항에 따른 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계,

얻어진 배지를 사용하여 대상 단백질을 생성할 능력이 있는 동물 세포를 배양하는 단계, 및

상기 배지 및/또는 상기 동물 세포로부터 생성된 단백질을 회복하는 단계를 포함하여 대상 단백질을 생성하는 방법.
제 1 항에 따른 배지 첨가제를 동물 세포 배양용 배지에 첨가하는 단계,

성장을 위해서 얻어진 배지를 사용하여 바이러스 벡터에 감염된 동물 세포를 배양하는 단계, 및

상기 배지 및/또는 상기 동물 세포로부터 바이러스 벡터를 회복하는 단계를 포함하여 대상 바이러스 벡터를 복제하는 방법.
동물 세포 성장 자극 성분을 생성하기 위한 세리신 또는 세리신 유도체의 용도.