JPH01120283A - 細胞培養床 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、細胞を培養し、増殖させる際に用いられる細
胞培養床に関するものである。

〔従来技術〕

一般に、補乳類動物を始めとする生物の細胞は浮遊状態
では増殖せず、固体表面に付着してのみ増殖する性質を
有している。このような付着状態で増殖する性質をもつ
細胞を培養し、増殖させるためには細胞を多量に付着す
る固体表面、つまり培養床が必要となる。

従来、多糖類のような天然高分子物質、ポリスチレン等
の合成高分子物質などが培養床として用いられているが
、必らずしも効率的に細胞培養を行うことができないた
め、新しい細胞培養床の出現が強く望まれている。

また、絹タンパク質の１つであるフィブロインをグルタ
ルアルデヒド、ホルムアルデヒドなどの化学的架橋剤に
より架橋させる方法、または紫外線照射により架橋する
方法を用いて水に不溶化し、培養床として用いる方法（
特開昭６１−５２２８０号）がある。この場合、細胞に
対して毒性の強いアルデヒドや紫外線によるフィブロイ
ンの分解生成物が培養床に存在し、細胞に対して影響を
与える恐れがある。

〔目　　的〕

本発明の目的は、効率的に細胞培養を行うために、細胞
付着性の高い固体表面を有する細胞培養床を提供するこ
とにある。

〔構　　成〕

本発明は、絹タンパク質により表面が形成されており、
かつ該タンパク質は結晶質を含み、水不溶性であること
を特徴とする細胞培養床である。

本発明者は、細胞の付着、増殖しやすい性質を有する材
料の開発について種々研究を重ねた結果、絹タンパク質
を見出し、その結晶化度を増し、不溶化させることによ
り、付着依存性細胞に対して著しい増殖性を有する細胞
培養床を作製できることを見出し、本発明を完成するに
到った。

本明細書における細胞培養床としては、細胞を培養する
際に細胞を付着させて増殖をはかるために用いられる固
体表面を有する物質を意味し、シート状、繊維状、ビー
ズ状、中空糸状、プレート状、シャーレ状等の形状を有
するものである。

本発明の細胞培養床は、絹タンパク質水溶液から所望の
形状に成形するか、又は支持体の表面に絹タンパク質を
コーティングすることによって製造することができる。

ただし、このままでは非晶質で水溶性を示す。本発明で
は、この絹タンパク質を結晶化し、絹タンパク質成形体
あるいは絹タンパク質のコーティング層中に結晶質を含
有させ、水不溶性のものとする。絹タンパク質を結晶化
させるにはエタノールやメタノール等の絹タンパク質に
対する貧溶媒を用いて行うことができる。支持体として
はポリスチレンなどの高分子物質やガラス、マイカ等の
無機物も使用され、シート状、発泡状、ビーズ状、繊維
状、中空糸状、シャーレ状、プレート状等の形状を有す
るものである。

原料として用いる絹タンパク質はフィブロイン、セリシ
ン、及びそれらの混合物であり、家蚕あるいは野蚕由来
のものでよい。また絹タンパク質溶液は、熟蚕体内の絹
糸腺より取出した液状絹タンパク質を用いることができ
るし、吐糸繊維から再生した絹タンパク質を溶液化した
ものでもよい。

絹タンパク質の結晶化処理は、溶媒と水からなる混合溶
液中で、絹タンパク質成形体あるいは絹、タンパク質コ
ーティング暦を浸漬処理した後、乾燥することによって
実施することができる。この場合、混合溶液の組成、温
度、処理時間によってその結晶化度は異なるが、少なく
とも１０％、好ましくは１５〜８０％の範囲に規定する
のがよい。乾燥温度は５〜８０℃である。

本発明の細胞培養床は１種々の細胞の培養に用いること
ができる。細胞の種類は、特に限定されるものではない
が、その例をあげると、マウス結合組織由来繊維芽細胞
Ｌ９２９、ヒト子宮癌由来上皮性細胞）１ｅＬａなどが
ある。

また本発明の細胞培養床は１種々の細胞培養液を用いて
種々の条件下で細胞を培養できる。細胞培養液および培
養条件は特に限定されるものではなく、従来公知の方法
に従って実施される。培養対象となる細胞は、血清を含
む培地に添加し、炭酸ガスインキュベーター（２〜５％
の炭酸ガスが好ましい）中で温度３５〜４０℃で培養さ
れる。この培養において、細胞は、固体表面によく付着
し、効率的に増殖される。

〔実施例〕

次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１ 桑葉で飼育した家蚕（日１３７号×支１３７号）の熟蚕
体内より、液状絹タンパク質が多量に蓄積されている中
部絹糸腺を取り出し、蒸留水で充分水洗いした後、絹糸
腺細胞を除去した。そして絹糸内液状絹タンパク質を所
定の時間、２５℃で蒸留水に分散させた。すなわち、３
０分、１．５時間、２．５時間、並びに４時間の分散時
間に対応して得られた絹タンパク質水溶液をそれぞれＡ
、　Ｂ、　Ｃ及びＤとした。

これらの絹タンパク質水溶液の濃度を０．２〜０．３％
になるように蒸留水で希釈あるいは濃縮させて調製した
。

実施例２ 実施例１で得た新鮮な絹タンパク質水溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ
，Ｏ）中に、エタノールで洗浄し乾燥したポリスチレン
フィルム（９Ｘ　９　Ｘ　Ｏ，０２ｍｍ）を浸漬した。

２５℃で１時間経過後そのポリスチレンフィルムをその
溶液から引き上げ、過剰の液滴を除去して２５℃で乾燥
したにのようにして絹タンパク質を表面に被覆させたポ
リスチレンフィルムを２５℃の５０体積％メタノール水
溶液中に１時間浸漬して結晶化処理し、その後温度２５
℃で乾燥した。

次に、この絹タンパク質を表面に被覆させたフィルム上
に、マウス由来の繊維芽細胞Ｌ９２９を含む培養液（約
１０万個／ｍＱ）を接触させたまま、炭酸ガスａ度５％
、湿度］、ＯＯ％、３７℃のインキュベータ内に静置し
た。培養液は１０％の牛胎児血清を含むＥａｇｌｅＭＥ
Ｍを用いた。１７時間後及び５０時間後、そのフィルム
上に付着している細胞の量をクリスタルバイオレットを
用いた核染色法により定量した。

比較のため、ポリスチレンフィルムを用いて、同様の細
胞付着試験を行った。

これらのフィルムに付着した細胞の量を標準試料（和光
純薬工業株式会社製組織培養用プラスチックシート）に
付着した細胞の量で割ることにより、細胞付着率を求め
た。その結果を第１表に示り：絹タンパク質水溶液りで
被覆した試料実施例３ 実施例１の４種類の絹タンパク質水溶液中にガラスピー
ズ（直径約０．５ｍｍ）を浸漬し、１時間後ガラスピー
ズを取り出し乾燥した。このビーズを２５℃の５０体積
Ｘメタノール水溶液中に】時間浸漬して結晶化処理し、
その後２５℃で乾燥して、絹タンパク質を表面に有する
ビーズ状細胞培養床を得た。

実施例４ 実施例１の４種類の絹タンパク質水溶液を２５℃でポリ
スチレン製シャーレに注ぎ入れ、１時間後その溶液を除
去、２５℃で乾燥した。このシャーレに２５℃の５０体
積％メタノール水溶液を注ぎ入れて結晶化処理し、１時
間後その溶液を除去して２５℃で乾燥して、絹タンパク
貿を表面に有するシャーレ状細胞培養床を得た。

〔効　　果〕

以上説明したように１本発明の細胞培養床は、極めて多
量の細胞を付着し、増殖させることができ、その産業的
意義は大きい。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）絹タンパク質により表面が形成されており、かつ
   該タンパク質は結晶質を含み、水不溶性であることを特
   徴とする細胞培養床。