JP4233646B2 - 種々の基質の安定性および／または貯蔵寿命を増加させる方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば細胞接着コートされた基質などの種々のコートされた基質の安定性および／または保存寿命を増加させる方法に関連しており、この方法は基質の表面に塗布するための改善されたコーティング組成物を利用する工程を含んでいる。
【０００２】
【従来の技術】
組織培養によって生体外で維持および増殖するために組織から細胞を採取することは、医薬および生化学研究における主な手段である。組織培養は、形成された栄養環境において生物体（植物または動物）由来の組織または細胞の代謝を増殖するおよび／または支える技術または方法である。細胞はゆるやかな組織溶解によって一度分離されると、生命機能を支えることのできる栄養のある媒体中でインキュベートされる。いくつかの例外はあるが、細胞は通常の代謝機能、成長および分裂を行うために基層に付着する必要がある。組織において、細胞成長用支持体を提供する基層は、基底膜もしくはコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどからなる間質性マトリックスのどちらかである。生体外においては、ガラス、細孔性セルロースフィルターおよび他のフィルターが代替品としてしばしば用いられるが、この基層はほとんどの場合プラスチックである。組織培養を経て生成される細胞の使用例は、（１）細胞の代謝、細胞における感染性薬剤（すなわち、ウィルス、バクテリアなど）の影響、異なる細胞の種類（すなわち上皮細胞、線維芽細胞、免疫担当細胞、胸腺細胞、血小板など）の相互代謝、細胞性代謝における外因的要素の効果、そして（生体外診断の）細胞の一般組成物の研究、（２）特異的化合物、すなわちＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または他の細胞性成分の生成、および（３）皮膚、角膜の移植片、脳、脈管移植片、および生体外受精用としての細胞の再移植である。
【０００３】
近年、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および他の細胞外マトリックス成分は、動物組織から抽出され、精製され、そして、細胞接着プロモーターとして細胞および組織培養の研究者に販売される。合成ポリ−Ｄ−リジンおよびポリ−Ｌ−リジンは、そのような目的のために市販されている。その主な理由は、生体外であるプラスチックまたはガラスのような基質は、生物学的に不活性であり、適切な細胞または組織付着に対し十分な基質接着を付与しないときがあるからである。乏しい付着効率の説明としての特別な例は、主な細胞の分離体、低密度で播種された細胞、トランスフェクトされた細胞、および生物反応器または中空管培養システムのような連続フローシステム内で播種された細胞を含む。加えて、脈管の移植片用に用いられるいくつかの細孔性フィルターまたはTeflon（登録商標）材料のような特定の基質は、低い表面エネルギーのため細胞付着をしない。
【０００４】
細胞接着プロモーターは、かなりな程度に付着問題を助けてきたが、ある不適切さがまだ目に付く。特に、ほとんどのこれらの要素は一度基質に付着すると、種々のそして不適切な保存寿命を有する。
【０００５】
したがって本発明の一つの目的は、細胞接着プロモーターおよび安定剤として有用なコーティング組成物を提供し、組織培養または非組織培養材料および基質への細胞の付着効率、接着の速度および／または強度、成長、および特別機能を促進または増大させることであり、ここで基質としては、プラスチック、ガラス、金属、細孔性フィルター（セルロース、ナイロン、ガラスファイバー、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、および他の合成ポリマー材料ならびに前述の合成ポリマー材料になされる改質から得られる生成物を含む他の合成ならびに非合成材料）、天然ポリマーまたは他の非合成材料、および組織または補欠分子を移植する手順において用いてもよい合成または異質プラスチック（alloplastic ）材料（例えば、人工心臓およびポリテトラフルオロエチレンおよび関連の脈管移植する材料）が挙げられる。
【０００６】
本発明の第二の目的は、種々の基質つまり上述したもののいくつかへの、タンパク質、ＤＮＡ、ホルモン、および抗生物質のような他の生物学的に活性な部位の付着効率、接着の速度および／または強度を促進または増大させる細胞接着プロモーターとして有用な製剤を提供することである。
【０００７】
タンパク質および他の高分子のような生物学的に活性な部位は、水溶液からの非共有吸着によって、例えばポリスチレン表面のような基板表面上にコートされる。かかる表面上に吸着されるこれらの高分子の量は、コーティングの条件（例えば、ｐＨ、温度、イオン強度、イオン性組成物、反応物の濃度など）に依存する。表面上のコーティングの安定性は、同様のパラメーター、およびコーティングの乾燥および保存条件（例えば、湿度、温度、気体環境など）にも広がって依存する。
【０００８】
発明者は、表面に強度にコートされたポリ−Ｄ−リジンの安定性は、コーティング工程の間に用いられた対の陰イオンに依存するとわかっている。ポリ−Ｄ−リジンは中性のｐＨで非常に高く正に帯電しており、そのためコートされた表面上の対の陰イオンと複合される。例えばクエン酸塩溶液または硫酸塩溶液中のポリ−Ｄ−リジンを含有するコーティング組成物（従って対の陰イオンとしてクエン酸塩または硫酸塩を用いる）のような本発明の改善されたコーティング組成物を種々の基質表面に塗布することによって、これらの基質に増加された保存寿命が得られるということがわかった。得られた結果は、塩化物、酢酸塩、ＥＤＴＡ、炭酸塩、およびＰＢＳ（リン酸塩／塩化物の組み合わせ）溶液または水を用いる以前のコーティング組成物よりはるかに優れている。
【０００９】
ポリスチレン表面上にコートされたＰＤＬの１×ＰＢＳ溶液である本発明のＰＤＬ ＢＩＯＣＯＡＴ（登録商標）Cellware製品は、基質の形状（皿状、フラスコ状、またはプレート状であるかどうか、さらにプレート上の穴のサイズおよび数など）、貯蔵温度、湿度、パッケージングなどに依存した保存寿命を有する。コートされた基質の保存寿命（すなわち安定性）は、本発明の方法によって少なくとも２〜３倍に増幅される。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の方法は、上述したような種々の基質および例えばプラスチック製品を含む種々の基質をコートするために利用され、例えば４℃以下の温度で冷蔵を必要とする代わりにかかる生成物を室温で貯蔵することを可能にする。本発明の方法によって、例えばプラスチック製品のパッケージングに依存しない安定性／増加した保存寿命を得る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞接着コートされた基質のような種々のコートされた基質の保存寿命および／または安定性を増加させる方法に関しており、この方法は、基板表面に改善されたコーティング組成物を塗布する工程を含み、このコーティング組成物は、塩が例えばクエン酸塩または硫酸塩である塩溶液中の細胞接着プロモーターからなる。
【００１２】
本発明は、コートされた基質の保存寿命および／または安定性を増加させる方法に関しており、この方法は、
（ａ）約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液中に５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロモーターを含有するコーティング組成物で基質をコーティングする工程と、
（ｂ）基質上のコーティング組成物をインキュベートする工程と、
（ｃ）前記コートされた基質を洗浄し、基質にしっかりと結合していない余分な材料を取り除く工程と、
（ｄ）コーティング組成物を上に有する基質を乾燥する工程と、
（ｅ）増加した保存寿命および／または安定性を有するコートされた基質を得る工程と、
を具える。
【００１３】
本発明の方法から得られたコートされた基質は、室温で増加された保存寿命および／または安定性を有する。コートされた基質用の特別なパッケージングは必要ない。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、細胞接着コートされた基質のような種々のコートされた基質の保存寿命および／または安定性を増加させる方法に関する。本発明の方法の重要な態様は、基質表面に塗布され、改善された安定性および増加した保存寿命を有する表面が得られる改善されたコーティング組成物の調製および利用である。このコーティング組成物は、塩溶液中の細胞接着プロモーターを含有する。
【００１５】
本発明は、コートされた基質の保存寿命および／または安定性を増加させる方法に関しており、
（ａ）約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液中に５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロモーターを含有するコーティング組成物で基質をコーティングする工程と、
（ｂ）基質上のコーティング組成物をインキュベートする工程と、
（ｃ）コートされた基質を洗浄し、基質にしっかりと結合していない余分の材料を取り除く工程と、
（ｄ）コーティング組成物を上に有する基質を乾燥する工程と、
（ｅ）増加した保存寿命および／または安定性を有するコートされた基質を得る工程と、を具える。
【００１６】
基質は、基質のｃｍ2 あたり、約５μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロモーターを含む約５０μｌ〜約５００μｌの前述の組成物でコートされる。
【００１７】
好ましい具体例において、コーティング組成物は、塩溶液中の細胞接着プロモーターとしてポリ−Ｄ−リジンからなる。好ましくは、塩はクエン酸塩または硫酸塩である。もう一つの具体例において、細胞接着プロモーターは、ポリ−Ｌ−リジン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリオルニチン（ポリアミノ酸）または他の細胞接着基質またはそれらの混合物から選択される。ここでの塩溶液の好ましい具体例は、以下にさらに記載するようにクエン酸塩溶液または硫酸塩溶液であるが、本発明に用いられる塩溶液は、本発明の目的を達成できるいかなる塩溶液でもよく、ホウ酸；コハク酸、酒石酸、およびグルタル酸などのジカルボン酸の塩；両性イオンのスルホン酸塩；およびＭＥＳ、ビス−トリス、ＭＯＰＳ、およびＨＥＰＥＳのような有機緩衝液を含む。
【００１８】
慣用の細胞培養研究のための基質は、プラスチック、ガラス、および細孔性フィルター（例えば、セルロース、ナイロン、ガラスファイバー、ポリエステル、ポリカーボネート）を含む。バッチもしくは連続細胞培養、または一般的技術に用いられる生物反応器用の基質は、中空繊維管または微細担体ビーズを含む。脈管または骨移植片用の基質は、ポリテトラフルオロエチレン（Teflon（登録商標））、セラミックおよび関連のポリマー材料のような材料を含む。これらのほとんどの表面は、負の有効電荷を運び、したがって正の有効電荷を有する材料にしっかりと結合する。
【００１９】
真核生物の細胞の成長および通常の代謝は、基質への付着を必要としている。慣用的に、細胞培養はプラスチック基質を利用し、そしてわずかではあるが細胞の付着および増殖のためにガラスおよび細孔性フィルターを利用する。より最近では、生理学的基質（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ−Ｄ−リジンおよびポリ−Ｌ−リジン）は、プラスチック（ポリスチレン）上にコートされる目的で用いられ、トランスフェクトされた細胞、形質変換された細胞、主な細胞分離体、または低い播種密度で播種された細胞の培養に固有の問題を避ける。
【００２０】
本発明で考えられる好ましい基質形状は、多穴プレート（２４穴をもつおよび９６穴をもつプレートなど）、皿（ペトリ皿など）、培養フラスコなどを含む。
【００２１】
本発明の改善されたコーティング組成物での基質のコーティングおよび基質への付着は、一般に、以下のように行われる。所望の最終濃度に応じて、約０．５〜２．０ｍｌのコーティング組成物を６穴をもつ多穴プレート内の１つの穴に塗布し、約０．２５〜１．０ｍｌを２４穴をもつ多穴プレート内の１つの穴に塗布し、約５０μｌ〜１００μｌを９６穴をもつプレート中の１つの穴に塗布する。さらに、例えば、皿においては、約０．５〜２．０ｍｌを３５ｍｍ径の皿に塗布し、０．５〜４．０ｍｌを６０ｍｍ径の皿に塗布し、２．０〜１２．０ｍｌを１００ｍｍ径の皿に塗布する。
【００２２】
塗布後、コーティング組成物をインキュベートして、基質の表面に細胞接着物質を吸着させ、残りのコーティング組成物を取り除き、コートされた基質表面を洗浄して余分な材料を取り除き、乾燥し、最終的に増加した保存寿命を有する安定なコートされた基質を得る。
【００２３】
コートされた基質表面を、例えば水、エタノールまたは生物的に相溶な滅菌媒体であるいかなる媒体でも洗浄できる。
【００２４】
もう一つの具体例において、本発明は、生体外細胞培養システムに関しており、この生体外細胞システムは、基質と、その上の約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液中に約５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの接着プロモーターを含有するコーティング組成物のコーティングとを含有する。この基質、コーティング組成物、接着プロモーター、および塩溶液は、先に定義したいずれでもよい。
【００２５】
以下の実施例は、説明のためであって、本発明の形態を制限するものではない。
【００２６】
実施例１
ラットの小脳顆粒球分析を、事前に５０℃で飽和湿度、および５０℃で周囲湿度にて促進された安定性条件下で保存された９６穴を有するコートされた多穴プレートにおいて行われ、対照標準として４℃で保持されたプレートをテストした。
【００２７】
分析を、以下のコーティング組成物でそれぞれコートされた３個の別個の多穴プレートにおいて行った：（１）ポリ−Ｄ−リジンのクエン酸塩溶液でコートされた多穴プレート、（２）ポリ−Ｄ−リジンの硫酸塩溶液でコートされた多穴プレート、（３）ポリ−Ｄ−リジンのＰＢＳ溶液でコートされた多穴プレート。
【００２８】
これらのプレートを以下のようにして製造した。
【００２９】
（１）ポリ−Ｄ−リジンをｐＨ８．０に調整されたた５ｍＭトリスベースを有する０．１Ｍのクエン酸ナトリウム溶液中に溶解し、最終濃度５０μｇ／ｍｌにした。このコーティング組成物を約８０μｌ／穴で９６穴を有するプレートに加えた。このコーティング組成物を約１時間にわたってプレートの表面に吸着させるようにした。残りのコーティング組成物を活発にデカントした。次いで、前述の（コーティング組成物の）量の水を二回で穴に加え、取り除いた。この工程を繰り返した。次いで、このプレートを、室温で一晩減圧オーブン中で乾燥させた。次いでプレートを紫外線トンネルを通過させた。
【００３０】
（２）ポリ−Ｄ−リジンを、ｐＨ８に調整された５ｍＭトリスを有する１００ｍＭの硫酸塩溶液に溶解し、最終濃度を５０μｌ／ｍｌにした。
【００３１】
（１）と同じコーティング工程を（２）において行った。
【００３２】
（３）ポリ−Ｄ−リジンを、ｐＨ８．０に調整した１×ＰＢＳ溶液に溶解し、最終濃度を５０μｇ／ｍｌにした。（１×ＰＢＳ＝２．７ｍＭ ＫＣｌ；１．５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；３．７ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）
（１）および（２）と同じコーティング工程を（３）において行った。
【００３３】
コーティング組成物の質を評価するためのラットの小脳顆粒球（ＲＣＧ）分析を、ＲＣＧ細胞の初代培養の細胞付着を基にして、以下のように行った。
【００３４】
ラットの小脳顆粒球の付着分析
１．０ 細胞単離
ＲＣＧを以下のようにしてラットの小脳から分離した。
【００３５】
この手順は、６（および１２）対のラットの小脳からの細胞の単離を記載する。６（および１２）対より少ないまたはより多い小脳を用いる場合、試薬の量を比例して調節した。
【００３６】
１．１ 材料
１．１．１ 生後６〜１２日の仔ラットの小脳、６対（１２対）
１．１．２ トリパンブルー、Ｐ／Ｎ ０１−０６０９０
１．１．３ ０．２ミクロンのナルゲン（Nalgene ）減圧濾過器、 Ｐ／Ｎ ０１−０００４８
１．１．４ Millex GV フィルター 、Ｐ／Ｎ ０１−０００５２
１．１．５ カレントロット（current lot ）溶液１（ＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸］を含む培養媒体）
１．１．６ トリシン原液、１０ｍｇ／ｍｌ
１．１．７ ＤＮＡ分解酵素原液
１．１．８ 大豆トリプシン阻害剤原液、３．５ｍｇ／ｍｌ
１．１．９ ０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液
１．１．１０ ０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 原液
１．１．１１ ラットの小脳顆粒細胞成長培養液
【００３７】
【００３８】
１．３ 供給物
１．３．１ 遠心管、１５ｍｌ、Ｐ／Ｎ ０１−０００１８
１．３．２ 遠心管、５０ｍｌ、Ｐ／Ｎ ０１−０００１３
１．３．３ １ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００４２
１．３．４ ５ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００４４
１．３．５ １０ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００４１
１．３．６ ２５ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００４０
１．３．７ １００ｍｍ径ペトリ皿、Ｐ／Ｎ ０１−０３００３
１．３．８ 細胞スクレーパ、使い捨て、CoStar Ｃ／Ｎ ３０１０
１．３．９ リットル容無菌ボトル
１．３．１０ 注射器
必要とされた注射器の数
【００３９】
【表１】
【００４０】
１．４ 溶液の調製
注：かっこ内における全ての値および情報は、１２対の仔ラットの小脳の調製に適用する。
【００４１】
注：全ての溶液を、製造日時の２４時間以内で用いた。
【００４２】
１．４．１ 全ての溶液を層流フードの下で調製した。
１．４．２ 以下の溶液を３７℃の水浴内で溶かし、必要になるまで４℃の冷蔵庫内で保存した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
１．４．３ 溶液２の調製（トリプシン溶液）
１．４．３．１ ３５ｍｌの溶液１を２つの無菌５０ｍｌ容遠心管のそれぞれに移した。
１．４．３．２ ０．８７５ｍｌのトリプシン原液を各５０ｍｌ容遠心管に加えた。
１．４．３．３ 該管を蓋締めし、逆転するまたは回旋することによって混合した。
１．４．３．４ ６０ｍｌ容注射器およびMillex GV ０．２２μｍフィルターを、各管の溶液を新たな無菌５０ｍｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。
１．４．３．５ 得られる溶液２の入った管を後で用いるために保存した。
【００４５】
１．４．４ 溶液３の調製（ＤＮＡ分解酵素および大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）溶液）
１．４．４．１ ２０ｍｌの溶液１を２つの無菌５０ｍｌ容遠心管にそれぞれ移した。
１．４．４．２ ０．９５ｍｌのＤＮＡ分解酵素原液を各管に加えた。
１．４．４．３ ０．９４ｍｌのＳＴＩ原液を各管に加えた。
１．４．４．４ ２２μｌの０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液を各管に加えた。
１．４．４．５ 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋することによって混合した。
１．４．４．６ ３０ｍｌ容注射器およびMillex GV ０．２２μｍのフィルターを、管の溶液を新たな１５ｍｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。
１．４．４．７ 得られる溶液３の入った管を後で用いるために保存した。
【００４６】
１．４．５ 溶液４の調製（ＤＮＡ分解酵素およびＳＴＩ溶液）
１．４．５．１ ５ｍｌの溶液１を２つの無菌１５ｍｌ容遠心管にそれぞれ移した。
１．４．５．２ ０．５７ｍｌのＤＮＡ分解酵素原液を各管に加えた。
１．４．５．３ ０．７３４ｍｌのＳＴＩ原液を各管に加えた。
１．４．５．４ ３０μｌの０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液を各管に加えた。
１．４．５．５ 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋することによって混合した。
１．４．５．６ １０ｍｌ容注射器およびMillex GV ０．２２μｍフィルターを、管の溶液を新たな５０ｍｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。
１．４．５．７ 得られる溶液４の入った管を後で用いるために保存した。
【００４７】
１．４．６ 溶液５の調製（ＭｇＳＯ4 ／ＣａＣｌ2 溶液）
１．４．６．１ ２４ｍｌの溶液１を２つの無菌５０ｍｌ容遠心管にそれぞれ移した。
１．４．６．２ ６２μｌの０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液を各管に加えた。
１．４．６．３ ４８μｌの０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 原液を各管に加えた。
１．４．６．４ 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋することによって混合した。
１．４．６．５ ３０ｍｌ容注射器およびMillex GV ０．２２μｍのフィルターを、管の溶液を新たな５０ｍｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。
１．４．６．６ 得られる溶液５の入った管を後で用いるために保存した。
【００４８】
１．５ラットの脳の小脳顆粒細胞の調製
１．５．１ 細胞分散体（二つの調製）
注：ラットの小脳を調製した。これらは、氷上にあるが、冷凍されていない。
１．５．１．１ 無菌の使い捨て細胞スクレーパを１００ｍｍ径ペトリ皿に６対の小脳を移すのに用いた。
１．５．１．２ 組織をしごきストローク（wiping strokes）を設けた細胞スクレーパを用いて、スクレーパと皿の表面の間の組織を閉じこめながら穏やかにつぶた。
１．５．１．３ 組織を均質のペーストが得られるまで（２〜３分）スクレーパを用いた作業をした。
１．５．１．４ １０ｍｌの溶液１を、細胞スクレーパの先端に交わる溶液１を射出して粘着性のある小脳組織を取り除きながら、皿に加えた。
１．５．１．５ 細胞を、ピペットで懸濁液を吸引し射出すことによって懸濁させた。
１．５．１．６ 懸濁液を吸引し、５０ｍｌ容の無菌遠心管に移した。
１．５．１．７ 工程１．５．１．４〜１．５．１．６をペトリ皿から管に残りの組織を移すようにもう２回繰り返した。
１．５．１．８ この管を遠心分離用に保留した。
１．５．１．９ １２対のラットの小脳を調製するときは、残りの６対の小脳を１００ｍｍ径ペトリ皿に移し、工程１．５．１．２〜１．５．１．８をこれらの小脳に対して繰り返した。
１．５．１．１０ ペトリ皿および初めに小脳を収容した容器を廃棄した。
１．５．１．１１ 管を室温で５分間にわたて１０００ｒｐｍで遠心分離した。
１．５．１．１２ 上清を吸引し、廃棄した。
【００４９】
１．５．２トリプシン処理およびＤＮＡ分解酵素
１．５．２．１ ３０ｍｌの溶液２を工程１．５．１で得られた細胞ペレットに加えた。
１．５．２．２ 混合物を、２５ｍｌピペットを用いて細胞懸濁液を吸引し射出することによって分散させた。
１．５．２．３ 管を３７℃のＨ2 Ｏ浴で正確に１５分間にわってインキュベートした。
１．５．２．４ インキュベートしている管を２〜３分ごとに手で管を回旋させて攪拌した。
１．５．２．５ この管を浴から取り出した。
１．５．２．６ 混合物に存在する凝集塊またはゼラチン状の塊を、２５容ピペットを用いて細胞懸濁液を２〜３回、吸引し射出することによって混合物中に分散させた。
１．５．２．７ 工程１．５．２．６を５ｍｌ容ピペットを用いて繰り返した。
１．５．２．８ 凝集塊またはゼラチン状の塊が混合物中に存在しなくなったところで、混合物を、５ｍｌ容ピペットで細胞懸濁液を２〜３回、吸引し射出することによって分散させた。
１．５．２．９ １５ｍｌの溶液３を管に加え、３０〜６０秒間にわたって手で回旋させた。
１．５．２．１０ 管を３７℃のＨ2 Ｏ浴で正確に１５分間にわたってインキュベートした。
１．５．２．１１ インキュベートしている管を２〜３分毎に手で管を回旋することによって攪拌し、粘性を減少させた。
１．５．２．１２ 管を浴から取り出した。
１．５．２．１３ 管を室温で５分間にわたって１０００ｒｍｐで遠心分離させた。
１．５．２．１４ 上清を吸引し、廃棄した。
【００５０】
１．５．３ 単細胞懸濁液
１．５．３．１ ５ｍｌ容ピペットを用いて４ｍｌの溶液４を工程１．５．２で得られた細胞ペレットに加えた。
１．５．３．２ 混合物を、５ｍｌ容ピペットを用いて細胞懸濁液を４０回、吸引し射出して懸濁させた。過度の泡が発生することを避けるため、混合物を遠心管の壁をつたわらせて入れた。
１．５．３．３ １２対のラットの小脳を調製する場合は、両方の管の細胞を単一の５０ｍｌ容遠心管内にためた。
１．５．３．４ １０ｍｌの溶液５を各細胞懸濁液に加えた。
１．５．３．５ 混合物を、管の内容物を５〜１０回、吸引し射出することによって分散させた。
１．５．３．６ 懸濁液を正確に５分間にわたって静置させておいた。
１．５．３．７ 大きな沈降した凝集塊が発生したら、１０ｍｌ容ピペットを用いて凝集塊の上の細胞懸濁液を吸引し、細胞懸濁液を新たな無菌５０ｍｌ容遠心管に移し、凝集塊を廃棄した。
１．５．３．８ １０ｍｌの溶液５を各吸引されれた細胞懸濁液に加えた。
１．５．３．９ 管の混合物を手で管を回旋することによって攪拌した。
１．５．３．１０ 管を室温にて１００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離した。
１．５．３．１１ 上清を吸引し、廃棄した。
【００５１】
１．６ 細胞数および生存度
１．６．１ 細胞ペレットを２０ｍｌの成長培養液中で再懸濁させた。
１．６．１．１ ５ｍｌ容ピペットを用いて５ｍｌの成長培養液を細胞ペレットに加えた。
１．６．１．２ 混合物を５ｍｌ容ピペットを用いて細胞懸濁液を吸引し射出して分散させた。
１．６．１．３ １５ｍｌの成長培養液を細胞分散液に加えた。
１．６．１．４ 混合物を、細胞懸濁液を吸引し射出することによって分散させた。
【００５２】
１．６．２ 細胞の１：１０希釈液を、
１．６．２．１ ０．１ｍｌの細胞懸濁液を無菌の５ｍｌ遠心管にピペットで加える工程と、
１．６．２．２ ０．４ｍｌの成長培養液を管に加える工程と、
１．６．２．３ ０．５ｍｌのトリパンブルーを管に加える工程と
から調製した。
【００５３】
１．６．３ 管の内容物を手でゆっくりを回旋させて混合した。
【００５４】
１．６．４ ０．１ｍｌの希釈液を細胞カウント用に取り除いた。
【００５５】
１．６．５ １：１０希釈液を、血球計数器が満たされるまで血球計数器に注入した。
【００５６】
１．６．６ ３×３格子のますめを決定し、生存可能の細胞をその格子の４つの角のますめにおいて数えた。
【００５７】
注：生存可能の細胞は、白くて屈折してみえる。生存不可能の細胞は、青みを帯びているようである。
【００５８】
１．６．７ 各四角形内の細胞の数を記録し、その平均を、総細胞数を４で割って決定した。
【００５９】
１．７ 希釈度の計算
１．７．１ 平均細胞／ｍｌの溶液を、工程１．６．７で得られた数を採用し１０5 をかけることによって計算した。
１．７．２ コートされたプレートをテストするために必要な細胞懸濁液の総量を、特別容量（容量は遠心分離によって変わる）をプレートの数にかけて計算した。
１．７．３ １．０×１０6 細胞／ｍｌ溶液を作るために必要な基の細胞懸濁液の量を、総量（工程１．７．２）を１×１０6 倍にし、この結果を平均細胞／ｍｌ（工程１．７．１）で割って計算した。
１．７．４ 総量を工程１．７．２で計算された量に導くための成長培養液の量を、総量（工程１．７．２）から細胞の量（工程１．７．３）を引くことによって計算した。
【００６０】
１．８ 播種／プレーティング用の細胞懸濁液を、
１．８．１ 工程１．７．３で計算された元の細胞懸濁液から細胞の量をピペットを用いて移す工程と、
１．８．２ 工程１．７．２で計算された量を収容するのに十分の大きさのＴ字型フラスコにこの量を加える工程と、
１．８．３ Ｔ字型フラスコに工程１．７．４で計算された量の成長培養液を加える工程と、
１．８．４ 手で緩やかにＴ字型フラスコを回旋し、懸濁液を混合する工程と、
から製造した。
【００６１】
２．０ 分析手順−９６穴プレート
【００６２】
２．１ 細胞懸濁液を１．０×１０6 細胞／ｍｌに調整した。
【００６３】
２．２ ０．１ｍｌ細胞／穴をＣおよびＤ列に播種した。（１２列あり、ＣとＤを任意に取り出した。）
【００６４】
２．３ インキュベートを２２〜２６時間にわたって、３７℃にて５％ＣＯ2 平衡空気、１００％湿度で行った。
【００６５】
２．４ 穴を、手がかりとして参照分析検量写真を用いる分析において少なくとも２つの別個の技術によって各列を評価した。
【００６６】
２．５ データを記録し、平均をとり、グラフ化した。
【００６７】
２．６ 有効分析のため、正の対照標準は、点数が２．０以上であり、負の対照標準は、点数が０を有する。点数は１〜３のスケールにおけるものである。
【００６８】
ＲＣＧ分析の結果は、クエン酸塩溶液を有するコーティング組成物を利用したプレートおよび硫酸塩溶液を有するコーティング組成物を利用したプレートの増加した安定性を示した。
【００６９】
実施例２
この実施例において、同じＲＣＧ分析が、予め５０℃で飽和湿度、および５０℃で周囲湿度にて保持した２４穴を有するコートされた多穴プレートにも行われ、対照標準として４℃にて保持されたプレートをテストした。２４穴を有する３つの多穴プレートを、（１）ポリ−Ｄ−リジンのクエン酸塩溶液、（２）ポリ−Ｄ−リジンの硫酸塩溶液、または（３）ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）のＰＢＳ溶液のいずれかでコートした。
【００７０】
コーティング組成物およびコートされたプレートは、実施例１に記載した方法で製造した。
【００７１】
ＲＣＧ分析を、工程２．２において０．５ｍｌの細胞を２４穴プレートの穴当たりに塗布したことを除いて、実施例１と同様に行った。
【００７２】
このＲＣＧ分析の結果はクエン酸塩溶液を含むコーティング組成物または硫酸塩溶液を含むコーティング組成物を有するプレートの増加した安定性を示している。
【００７３】
実施例３
この実施例では、ＲＣＧ分析を、予め５０℃で飽和湿度、および５０℃で周囲湿度にて保持された９６穴プレートに１２種類のコーティング組成物を用いて行われ、対照標準として４℃にて保持されたプレートをテストした。
【００７４】
この実施例に用いられた多穴（９６穴）プレートを、（１）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ ＰＯ4 溶液、（２）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ 酢酸塩溶液、（３）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液、（４）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液、（５）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリス溶液、（６）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ炭酸塩溶液、（７）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ クエン酸塩溶液、（８）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ 硫酸塩溶液、（９）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む１×ＰＢＳ溶液、（１０）１×ＰＢＳおよび１２．５％のＥｔＯＨ中のＰＤＬ、（１１）１×ＰＢＳおよび２５％ＥｔＯＨ中のＰＤＬ、または（１２）１×ＰＢＳおよび５０％ＥｔＯＨ中のＰＤＬでコートした。
【００７５】
各溶液において、ポリ−Ｄ−リジンを最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように溶液中に溶解した。
【００７６】
コーティング工程を、ピペッティングを手で行うのではなく自動化された機械で行うことを除いて実施例１および２と同様に行った。
【００７７】
ＲＣＧ分析を実施例１に記載したように行った。
【００７８】
第７日から第５６日のこのＲＣＧ分析の結果は、プレート上の１２のコートされた組成物のそれぞれの安定性／保存寿命を示した。このクエン酸塩溶液を有するコーティング組成物および硫酸塩溶液を有するコーティング組成物の増加した保存寿命は、この分析によって明らかに示された。
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば細胞接着コートされた基質などの種々のコートされた基質の安定性および／または保存寿命を増加させる方法に関連しており、この方法は基質の表面に塗布するための改善されたコーティング組成物を利用する工程を含んでいる。
【０００２】
【従来の技術】
組織培養によって生体外で維持および増殖するために組織から細胞を採取することは、医薬および生化学研究における主な手段である。組織培養は、形成された栄養環境において生物体（植物または動物）由来の組織または細胞の代謝を増殖するおよび／または支える技術または方法である。細胞はゆるやかな組織溶解によって一度分離されると、生命機能を支えることのできる栄養のある媒体中でインキュベートされる。いくつかの例外はあるが、細胞は通常の代謝機能、成長および分裂を行うために基層に付着する必要がある。組織において、細胞成長用支持体を提供する基層は、基底膜もしくはコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどからなる間質性マトリックスのどちらかである。生体外においては、ガラス、細孔性セルロースフィルターおよび他のフィルターが代替品としてしばしば用いられるが、この基層はほとんどの場合プラスチックである。組織培養を経て生成される細胞の使用例は、（１）細胞の代謝、細胞における感染性薬剤（すなわち、ウィルス、バクテリアなど）の影響、異なる細胞の種類（すなわち上皮細胞、線維芽細胞、免疫担当細胞、胸腺細胞、血小板など）の相互代謝、細胞性代謝における外因的要素の効果、そして（生体外診断の）細胞の一般組成物の研究、（２）特異的化合物、すなわちＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または他の細胞性成分の生成、および（３）皮膚、角膜の移植片、脳、脈管移植片、および生体外受精用としての細胞の再移植である。
【０００３】
近年、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および他の細胞外マトリックス成分は、動物組織から抽出され、精製され、そして、細胞接着プロモーターとして細胞および組織培養の研究者に販売される。合成ポリ−Ｄ−リジンおよびポリ−Ｌ−リジンは、そのような目的のために市販されている。その主な理由は、生体外であるプラスチックまたはガラスのような基質は、生物学的に不活性であり、適切な細胞または組織付着に対し十分な基質接着を付与しないときがあるからである。乏しい付着効率の説明としての特別な例は、主な細胞の分離体、低密度で播種された細胞、トランスフェクトされた細胞、および生物反応器または中空管培養システムのような連続フローシステム内で播種された細胞を含む。加えて、脈管の移植片用に用いられるいくつかの細孔性フィルターまたはTeflon（登録商標）材料のような特定の基質は、低い表面エネルギーのため細胞付着をしない。
【０００４】
細胞接着プロモーターは、かなりな程度に付着問題を助けてきたが、ある不適切さがまだ目に付く。特に、ほとんどのこれらの要素は一度基質に付着すると、種々のそして不適切な保存寿命を有する。
【０００５】
したがって本発明の一つの目的は、細胞接着プロモーターおよび安定剤として有用なコーティング組成物を提供し、組織培養または非組織培養材料および基質への細胞の付着効率、接着の速度および／または強度、成長、および特別機能を促進または増大させることであり、ここで基質としては、プラスチック、ガラス、金属、細孔性フィルター（セルロース、ナイロン、ガラスファイバー、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、および他の合成ポリマー材料ならびに前述の合成ポリマー材料になされる改質から得られる生成物を含む他の合成ならびに非合成材料）、天然ポリマーまたは他の非合成材料、および組織または補欠分子を移植する手順において用いてもよい合成または異質プラスチック（alloplastic ）材料（例えば、人工心臓およびポリテトラフルオロエチレンおよび関連の脈管移植する材料）が挙げられる。
【０００６】
本発明の第二の目的は、種々の基質つまり上述したもののいくつかへの、タンパク質、ＤＮＡ、ホルモン、および抗生物質のような他の生物学的に活性な部位の付着効率、接着の速度および／または強度を促進または増大させる細胞接着プロモーターとして有用な製剤を提供することである。
【０００７】
タンパク質および他の高分子のような生物学的に活性な部位は、水溶液からの非共有吸着によって、例えばポリスチレン表面のような基板表面上にコートされる。かかる表面上に吸着されるこれらの高分子の量は、コーティングの条件（例えば、ｐＨ、温度、イオン強度、イオン性組成物、反応物の濃度など）に依存する。表面上のコーティングの安定性は、同様のパラメーター、およびコーティングの乾燥および保存条件（例えば、湿度、温度、気体環境など）にも広がって依存する。
【０００８】
発明者は、表面に強度にコートされたポリ−Ｄ−リジンの安定性は、コーティング工程の間に用いられた対の陰イオンに依存するとわかっている。ポリ−Ｄ−リジンは中性のｐＨで非常に高く正に帯電しており、そのためコートされた表面上の対の陰イオンと複合される。例えばクエン酸塩溶液または硫酸塩溶液中のポリ−Ｄ−リジンを含有するコーティング組成物（従って対の陰イオンとしてクエン酸塩または硫酸塩を用いる）のような本発明の改善されたコーティング組成物を種々の基質表面に塗布することによって、これらの基質に増加された保存寿命が得られるということがわかった。得られた結果は、塩化物、酢酸塩、ＥＤＴＡ、炭酸塩、およびＰＢＳ（リン酸塩／塩化物の組み合わせ）溶液または水を用いる以前のコーティング組成物よりはるかに優れている。
【０００９】
ポリスチレン表面上にコートされたＰＤＬの１×ＰＢＳ溶液である本発明のＰＤＬ ＢＩＯＣＯＡＴ（登録商標）Cellware製品は、基質の形状（皿状、フラスコ状、またはプレート状であるかどうか、さらにプレート上の穴のサイズおよび数など）、貯蔵温度、湿度、パッケージングなどに依存した保存寿命を有する。コートされた基質の保存寿命（すなわち安定性）は、本発明の方法によって少なくとも２〜３倍に増幅される。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の方法は、上述したような種々の基質および例えばプラスチック製品を含む種々の基質をコートするために利用され、例えば４℃以下の温度で冷蔵を必要とする代わりにかかる生成物を室温で貯蔵することを可能にする。本発明の方法によって、例えばプラスチック製品のパッケージングに依存しない安定性／増加した保存寿命を得る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞接着コートされた基質のような種々のコートされた基質の保存寿命および／または安定性を増加させる方法に関しており、この方法は、基板表面に改善されたコーティング組成物を塗布する工程を含み、このコーティング組成物は、塩が例えばクエン酸塩または硫酸塩である塩溶液中の細胞接着プロモーターからなる。
【００１２】
本発明は、コートされた基質の保存寿命および／または安定性を増加させる方法に関しており、この方法は、
（ａ）約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液中に５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロモーターを含有するコーティング組成物で基質をコーティングする工程と、
（ｂ）基質上のコーティング組成物をインキュベートする工程と、
（ｃ）前記コートされた基質を洗浄し、基質にしっかりと結合していない余分な材料を取り除く工程と、
（ｄ）コーティング組成物を上に有する基質を乾燥する工程と、
（ｅ）増加した保存寿命および／または安定性を有するコートされた基質を得る工程と、
を具える。
【００１３】
本発明の方法から得られたコートされた基質は、室温で増加された保存寿命および／または安定性を有する。コートされた基質用の特別なパッケージングは必要ない。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、細胞接着コートされた基質のような種々のコートされた基質の保存寿命および／または安定性を増加させる方法に関する。本発明の方法の重要な態様は、基質表面に塗布され、改善された安定性および増加した保存寿命を有する表面が得られる改善されたコーティング組成物の調製および利用である。このコーティング組成物は、塩溶液中の細胞接着プロモーターを含有する。
【００１５】
本発明は、コートされた基質の保存寿命および／または安定性を増加させる方法に関しており、
（ａ）約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液中に５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロモーターを含有するコーティング組成物で基質をコーティングする工程と、
（ｂ）基質上のコーティング組成物をインキュベートする工程と、
（ｃ）コートされた基質を洗浄し、基質にしっかりと結合していない余分の材料を取り除く工程と、
（ｄ）コーティング組成物を上に有する基質を乾燥する工程と、
（ｅ）増加した保存寿命および／または安定性を有するコートされた基質を得る工程と、を具える。
【００１６】
基質は、基質のｃｍ2 あたり、約５μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロモーターを含む約５０μｌ〜約５００μｌの前述の組成物でコートされる。
【００１７】
好ましい具体例において、コーティング組成物は、塩溶液中の細胞接着プロモーターとしてポリ−Ｄ−リジンからなる。好ましくは、塩はクエン酸塩または硫酸塩である。もう一つの具体例において、細胞接着プロモーターは、ポリ−Ｌ−リジン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリオルニチン（ポリアミノ酸）または他の細胞接着基質またはそれらの混合物から選択される。ここでの塩溶液の好ましい具体例は、以下にさらに記載するようにクエン酸塩溶液または硫酸塩溶液であるが、本発明に用いられる塩溶液は、本発明の目的を達成できるいかなる塩溶液でもよく、ホウ酸；コハク酸、酒石酸、およびグルタル酸などのジカルボン酸の塩；両性イオンのスルホン酸塩；およびＭＥＳ、ビス−トリス、ＭＯＰＳ、およびＨＥＰＥＳのような有機緩衝液を含む。
【００１８】
慣用の細胞培養研究のための基質は、プラスチック、ガラス、および細孔性フィルター（例えば、セルロース、ナイロン、ガラスファイバー、ポリエステル、ポリカーボネート）を含む。バッチもしくは連続細胞培養、または一般的技術に用いられる生物反応器用の基質は、中空繊維管または微細担体ビーズを含む。脈管または骨移植片用の基質は、ポリテトラフルオロエチレン（Teflon（登録商標））、セラミックおよび関連のポリマー材料のような材料を含む。これらのほとんどの表面は、負の有効電荷を運び、したがって正の有効電荷を有する材料にしっかりと結合する。
【００１９】
真核生物の細胞の成長および通常の代謝は、基質への付着を必要としている。慣用的に、細胞培養はプラスチック基質を利用し、そしてわずかではあるが細胞の付着および増殖のためにガラスおよび細孔性フィルターを利用する。より最近では、生理学的基質（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ−Ｄ−リジンおよびポリ−Ｌ−リジン）は、プラスチック（ポリスチレン）上にコートされる目的で用いられ、トランスフェクトされた細胞、形質変換された細胞、主な細胞分離体、または低い播種密度で播種された細胞の培養に固有の問題を避ける。
【００２０】
本発明で考えられる好ましい基質形状は、多穴プレート（２４穴をもつおよび９６穴をもつプレートなど）、皿（ペトリ皿など）、培養フラスコなどを含む。
【００２１】
本発明の改善されたコーティング組成物での基質のコーティングおよび基質への付着は、一般に、以下のように行われる。所望の最終濃度に応じて、約０．５〜２．０ｍｌのコーティング組成物を６穴をもつ多穴プレート内の１つの穴に塗布し、約０．２５〜１．０ｍｌを２４穴をもつ多穴プレート内の１つの穴に塗布し、約５０μｌ〜１００μｌを９６穴をもつプレート中の１つの穴に塗布する。さらに、例えば、皿においては、約０．５〜２．０ｍｌを３５ｍｍ径の皿に塗布し、０．５〜４．０ｍｌを６０ｍｍ径の皿に塗布し、２．０〜１２．０ｍｌを１００ｍｍ径の皿に塗布する。
【００２２】
塗布後、コーティング組成物をインキュベートして、基質の表面に細胞接着物質を吸着させ、残りのコーティング組成物を取り除き、コートされた基質表面を洗浄して余分な材料を取り除き、乾燥し、最終的に増加した保存寿命を有する安定なコートされた基質を得る。
【００２３】
コートされた基質表面を、例えば水、エタノールまたは生物的に相溶な滅菌媒体であるいかなる媒体でも洗浄できる。
【００２４】
もう一つの具体例において、本発明は、生体外細胞培養システムに関しており、この生体外細胞システムは、基質と、その上の約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液中に約５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの接着プロモーターを含有するコーティング組成物のコーティングとを含有する。この基質、コーティング組成物、接着プロモーター、および塩溶液は、先に定義したいずれでもよい。
【００２５】
以下の実施例は、説明のためであって、本発明の形態を制限するものではない。
【００２６】
実施例１
ラットの小脳顆粒球分析を、事前に５０℃で飽和湿度、および５０℃で周囲湿度にて促進された安定性条件下で保存された９６穴を有するコートされた多穴プレートにおいて行われ、対照標準として４℃で保持されたプレートをテストした。
【００２７】
分析を、以下のコーティング組成物でそれぞれコートされた３個の別個の多穴プレートにおいて行った：（１）ポリ−Ｄ−リジンのクエン酸塩溶液でコートされた多穴プレート、（２）ポリ−Ｄ−リジンの硫酸塩溶液でコートされた多穴プレート、（３）ポリ−Ｄ−リジンのＰＢＳ溶液でコートされた多穴プレート。
【００２８】
これらのプレートを以下のようにして製造した。
【００２９】
（１）ポリ−Ｄ−リジンをｐＨ８．０に調整されたた５ｍＭトリスベースを有する０．１Ｍのクエン酸ナトリウム溶液中に溶解し、最終濃度５０μｇ／ｍｌにした。このコーティング組成物を約８０μｌ／穴で９６穴を有するプレートに加えた。このコーティング組成物を約１時間にわたってプレートの表面に吸着させるようにした。残りのコーティング組成物を活発にデカントした。次いで、前述の（コーティング組成物の）量の水を二回で穴に加え、取り除いた。この工程を繰り返した。次いで、このプレートを、室温で一晩減圧オーブン中で乾燥させた。次いでプレートを紫外線トンネルを通過させた。
【００３０】
（２）ポリ−Ｄ−リジンを、ｐＨ８に調整された５ｍＭトリスを有する１００ｍＭの硫酸塩溶液に溶解し、最終濃度を５０μｌ／ｍｌにした。
【００３１】
（１）と同じコーティング工程を（２）において行った。
【００３２】
（３）ポリ−Ｄ−リジンを、ｐＨ８．０に調整した１×ＰＢＳ溶液に溶解し、最終濃度を５０μｇ／ｍｌにした。（１×ＰＢＳ＝２．７ｍＭ ＫＣｌ；１．５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；３．７ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）
（１）および（２）と同じコーティング工程を（３）において行った。
【００３３】
コーティング組成物の質を評価するためのラットの小脳顆粒球（ＲＣＧ）分析を、ＲＣＧ細胞の初代培養の細胞付着を基にして、以下のように行った。
【００３４】
ラットの小脳顆粒球の付着分析
１．０ 細胞単離
ＲＣＧを以下のようにしてラットの小脳から分離した。
【００３５】
この手順は、６（および１２）対のラットの小脳からの細胞の単離を記載する。６（および１２）対より少ないまたはより多い小脳を用いる場合、試薬の量を比例して調節した。
【００３６】
１．１ 材料
１．１．１ 生後６〜１２日の仔ラットの小脳、６対（１２対）
１．１．２ トリパンブルー、Ｐ／Ｎ ０１−０６０９０
１．１．３ ０．２ミクロンのナルゲン（Nalgene ）減圧濾過器、 Ｐ／Ｎ ０１−０００４８
１．１．４ Millex GV フィルター 、Ｐ／Ｎ ０１−０００５２
１．１．５ カレントロット（current lot ）溶液１（ＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸］を含む培養媒体）
１．１．６ トリシン原液、１０ｍｇ／ｍｌ
１．１．７ ＤＮＡ分解酵素原液
１．１．８ 大豆トリプシン阻害剤原液、３．５ｍｇ／ｍｌ
１．１．９ ０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液
１．１．１０ ０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 原液
１．１．１１ ラットの小脳顆粒細胞成長培養液
【００３７】
１．３ 供給物
１．３．１ 遠心管、１５ｍｌ、Ｐ／Ｎ ０１−０００１８
１．３．２ 遠心管、５０ｍｌ、Ｐ／Ｎ ０１−０００１３
１．３．３ １ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００４２
１．３．４ ５ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００４４
１．３．５ １０ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００４１
１．３．６ ２５ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００４０
１．３．７ １００ｍｍ径ペトリ皿、Ｐ／Ｎ ０１−０３００３
１．３．８ 細胞スクレーパ、使い捨て、CoStar Ｃ／Ｎ ３０１０
１．３．９ リットル容無菌ボトル
１．３．１０ 注射器
必要とされた注射器の数
【００３９】
【表１】
１．４ 溶液の調製
注：かっこ内における全ての値および情報は、１２対の仔ラットの小脳の調製に適用する。
【００４１】
注：全ての溶液を、製造日時の２４時間以内で用いた。
【００４２】
１．４．１ 全ての溶液を層流フードの下で調製した。
１．４．２ 以下の溶液を３７℃の水浴内で溶かし、必要になるまで４℃の冷蔵庫内で保存した。
【００４３】
【表２】
１．４．３ 溶液２の調製（トリプシン溶液）
１．４．３．１ ３５ｍｌの溶液１を２つの無菌５０ｍｌ容遠心管のそれぞれに移した。
１．４．３．２ ０．８７５ｍｌのトリプシン原液を各５０ｍｌ容遠心管に加えた。
１．４．３．３ 該管を蓋締めし、逆転するまたは回旋することによって混合した。
１．４．３．４ ６０ｍｌ容注射器およびMillex GV ０．２２μｍフィルターを、各管の溶液を新たな無菌５０ｍｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。
１．４．３．５ 得られる溶液２の入った管を後で用いるために保存した。
【００４５】
１．４．４ 溶液３の調製（ＤＮＡ分解酵素および大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）溶液）
１．４．４．１ ２０ｍｌの溶液１を２つの無菌５０ｍｌ容遠心管にそれぞれ移した。
１．４．４．２ ０．９５ｍｌのＤＮＡ分解酵素原液を各管に加えた。
１．４．４．３ ０．９４ｍｌのＳＴＩ原液を各管に加えた。
１．４．４．４ ２２μｌの０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液を各管に加えた。
１．４．４．５ 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋することによって混合した。
１．４．４．６ ３０ｍｌ容注射器およびMillex GV ０．２２μｍのフィルターを、管の溶液を新たな１５ｍｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。
１．４．４．７ 得られる溶液３の入った管を後で用いるために保存した。
【００４６】
１．４．５ 溶液４の調製（ＤＮＡ分解酵素およびＳＴＩ溶液）
１．４．５．１ ５ｍｌの溶液１を２つの無菌１５ｍｌ容遠心管にそれぞれ移した。
１．４．５．２ ０．５７ｍｌのＤＮＡ分解酵素原液を各管に加えた。
１．４．５．３ ０．７３４ｍｌのＳＴＩ原液を各管に加えた。
１．４．５．４ ３０μｌの０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液を各管に加えた。
１．４．５．５ 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋することによって混合した。
１．４．５．６ １０ｍｌ容注射器およびMillex GV ０．２２μｍフィルターを、管の溶液を新たな５０ｍｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。
１．４．５．７ 得られる溶液４の入った管を後で用いるために保存した。
【００４７】
１．４．６ 溶液５の調製（ＭｇＳＯ4 ／ＣａＣｌ2 溶液）
１．４．６．１ ２４ｍｌの溶液１を２つの無菌５０ｍｌ容遠心管にそれぞれ移した。
１．４．６．２ ６２μｌの０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液を各管に加えた。
１．４．６．３ ４８μｌの０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 原液を各管に加えた。
１．４．６．４ 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋することによって混合した。
１．４．６．５ ３０ｍｌ容注射器およびMillex GV ０．２２μｍのフィルターを、管の溶液を新たな５０ｍｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。
１．４．６．６ 得られる溶液５の入った管を後で用いるために保存した。
【００４８】
１．５ラットの脳の小脳顆粒細胞の調製
１．５．１ 細胞分散体（二つの調製）
注：ラットの小脳を調製した。これらは、氷上にあるが、冷凍されていない。
１．５．１．１ 無菌の使い捨て細胞スクレーパを１００ｍｍ径ペトリ皿に６対の小脳を移すのに用いた。
１．５．１．２ 組織をしごきストローク（wiping strokes）を設けた細胞スクレーパを用いて、スクレーパと皿の表面の間の組織を閉じこめながら穏やかにつぶた。
１．５．１．３ 組織を均質のペーストが得られるまで（２〜３分）スクレーパを用いた作業をした。
１．５．１．４ １０ｍｌの溶液１を、細胞スクレーパの先端に交わる溶液１を射出して粘着性のある小脳組織を取り除きながら、皿に加えた。
１．５．１．５ 細胞を、ピペットで懸濁液を吸引し射出すことによって懸濁させた。
１．５．１．６ 懸濁液を吸引し、５０ｍｌ容の無菌遠心管に移した。
１．５．１．７ 工程１．５．１．４〜１．５．１．６をペトリ皿から管に残りの組織を移すようにもう２回繰り返した。
１．５．１．８ この管を遠心分離用に保留した。
１．５．１．９ １２対のラットの小脳を調製するときは、残りの６対の小脳を１００ｍｍ径ペトリ皿に移し、工程１．５．１．２〜１．５．１．８をこれらの小脳に対して繰り返した。
１．５．１．１０ ペトリ皿および初めに小脳を収容した容器を廃棄した。
１．５．１．１１ 管を室温で５分間にわたて１０００ｒｐｍで遠心分離した。
１．５．１．１２ 上清を吸引し、廃棄した。
【００４９】
１．５．２トリプシン処理およびＤＮＡ分解酵素
１．５．２．１ ３０ｍｌの溶液２を工程１．５．１で得られた細胞ペレットに加えた。
１．５．２．２ 混合物を、２５ｍｌピペットを用いて細胞懸濁液を吸引し射出することによって分散させた。
１．５．２．３ 管を３７℃のＨ2 Ｏ浴で正確に１５分間にわってインキュベートした。
１．５．２．４ インキュベートしている管を２〜３分ごとに手で管を回旋させて攪拌した。
１．５．２．５ この管を浴から取り出した。
１．５．２．６ 混合物に存在する凝集塊またはゼラチン状の塊を、２５容ピペットを用いて細胞懸濁液を２〜３回、吸引し射出することによって混合物中に分散させた。
１．５．２．７ 工程１．５．２．６を５ｍｌ容ピペットを用いて繰り返した。
１．５．２．８ 凝集塊またはゼラチン状の塊が混合物中に存在しなくなったところで、混合物を、５ｍｌ容ピペットで細胞懸濁液を２〜３回、吸引し射出することによって分散させた。
１．５．２．９ １５ｍｌの溶液３を管に加え、３０〜６０秒間にわたって手で回旋させた。
１．５．２．１０ 管を３７℃のＨ2 Ｏ浴で正確に１５分間にわたってインキュベートした。
１．５．２．１１ インキュベートしている管を２〜３分毎に手で管を回旋することによって攪拌し、粘性を減少させた。
１．５．２．１２ 管を浴から取り出した。
１．５．２．１３ 管を室温で５分間にわたって１０００ｒｍｐで遠心分離させた。
１．５．２．１４ 上清を吸引し、廃棄した。
【００５０】
１．５．３ 単細胞懸濁液
１．５．３．１ ５ｍｌ容ピペットを用いて４ｍｌの溶液４を工程１．５．２で得られた細胞ペレットに加えた。
１．５．３．２ 混合物を、５ｍｌ容ピペットを用いて細胞懸濁液を４０回、吸引し射出して懸濁させた。過度の泡が発生することを避けるため、混合物を遠心管の壁をつたわらせて入れた。
１．５．３．３ １２対のラットの小脳を調製する場合は、両方の管の細胞を単一の５０ｍｌ容遠心管内にためた。
１．５．３．４ １０ｍｌの溶液５を各細胞懸濁液に加えた。
１．５．３．５ 混合物を、管の内容物を５〜１０回、吸引し射出することによって分散させた。
１．５．３．６ 懸濁液を正確に５分間にわたって静置させておいた。
１．５．３．７ 大きな沈降した凝集塊が発生したら、１０ｍｌ容ピペットを用いて凝集塊の上の細胞懸濁液を吸引し、細胞懸濁液を新たな無菌５０ｍｌ容遠心管に移し、凝集塊を廃棄した。
１．５．３．８ １０ｍｌの溶液５を各吸引されれた細胞懸濁液に加えた。
１．５．３．９ 管の混合物を手で管を回旋することによって攪拌した。
１．５．３．１０ 管を室温にて１００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離した。
１．５．３．１１ 上清を吸引し、廃棄した。
【００５１】
１．６ 細胞数および生存度
１．６．１ 細胞ペレットを２０ｍｌの成長培養液中で再懸濁させた。
１．６．１．１ ５ｍｌ容ピペットを用いて５ｍｌの成長培養液を細胞ペレットに加えた。
１．６．１．２ 混合物を５ｍｌ容ピペットを用いて細胞懸濁液を吸引し射出して分散させた。
１．６．１．３ １５ｍｌの成長培養液を細胞分散液に加えた。
１．６．１．４ 混合物を、細胞懸濁液を吸引し射出することによって分散させた。
【００５２】
１．６．２ 細胞の１：１０希釈液を、
１．６．２．１ ０．１ｍｌの細胞懸濁液を無菌の５ｍｌ遠心管にピペットで加える工程と、
１．６．２．２ ０．４ｍｌの成長培養液を管に加える工程と、
１．６．２．３ ０．５ｍｌのトリパンブルーを管に加える工程と
から調製した。
【００５３】
１．６．３ 管の内容物を手でゆっくりを回旋させて混合した。
【００５４】
１．６．４ ０．１ｍｌの希釈液を細胞カウント用に取り除いた。
【００５５】
１．６．５ １：１０希釈液を、血球計数器が満たされるまで血球計数器に注入した。
【００５６】
１．６．６ ３×３格子のますめを決定し、生存可能の細胞をその格子の４つの角のますめにおいて数えた。
【００５７】
注：生存可能の細胞は、白くて屈折してみえる。生存不可能の細胞は、青みを帯びているようである。
【００５８】
１．６．７ 各四角形内の細胞の数を記録し、その平均を、総細胞数を４で割って決定した。
【００５９】
１．７ 希釈度の計算
１．７．１ 平均細胞／ｍｌの溶液を、工程１．６．７で得られた数を採用し１０5 をかけることによって計算した。
１．７．２ コートされたプレートをテストするために必要な細胞懸濁液の総量を、特別容量（容量は遠心分離によって変わる）をプレートの数にかけて計算した。
１．７．３ １．０×１０6 細胞／ｍｌ溶液を作るために必要な基の細胞懸濁液の量を、総量（工程１．７．２）を１×１０6 倍にし、この結果を平均細胞／ｍｌ（工程１．７．１）で割って計算した。
１．７．４ 総量を工程１．７．２で計算された量に導くための成長培養液の量を、総量（工程１．７．２）から細胞の量（工程１．７．３）を引くことによって計算した。
【００６０】
１．８ 播種／プレーティング用の細胞懸濁液を、
１．８．１ 工程１．７．３で計算された元の細胞懸濁液から細胞の量をピペットを用いて移す工程と、
１．８．２ 工程１．７．２で計算された量を収容するのに十分の大きさのＴ字型フラスコにこの量を加える工程と、
１．８．３ Ｔ字型フラスコに工程１．７．４で計算された量の成長培養液を加える工程と、
１．８．４ 手で緩やかにＴ字型フラスコを回旋し、懸濁液を混合する工程と、
から製造した。
【００６１】
２．０ 分析手順−９６穴プレート
【００６２】
２．１ 細胞懸濁液を１．０×１０6 細胞／ｍｌに調整した。
【００６３】
２．２ ０．１ｍｌ細胞／穴をＣおよびＤ列に播種した。（１２列あり、ＣとＤを任意に取り出した。）
【００６４】
２．３ インキュベートを２２〜２６時間にわたって、３７℃にて５％ＣＯ2 平衡空気、１００％湿度で行った。
【００６５】
２．４ 穴を、手がかりとして参照分析検量写真を用いる分析において少なくとも２つの別個の技術によって各列を評価した。
【００６６】
２．５ データを記録し、平均をとり、グラフ化した。
【００６７】
２．６ 有効分析のため、正の対照標準は、点数が２．０以上であり、負の対照標準は、点数が０を有する。点数は１〜３のスケールにおけるものである。
【００６８】
ＲＣＧ分析の結果は、クエン酸塩溶液を有するコーティング組成物を利用したプレートおよび硫酸塩溶液を有するコーティング組成物を利用したプレートの増加した安定性を示した。
【００６９】
実施例２
この実施例において、同じＲＣＧ分析が、予め５０℃で飽和湿度、および５０℃で周囲湿度にて保持した２４穴を有するコートされた多穴プレートにも行われ、対照標準として４℃にて保持されたプレートをテストした。２４穴を有する３つの多穴プレートを、（１）ポリ−Ｄ−リジンのクエン酸塩溶液、（２）ポリ−Ｄ−リジンの硫酸塩溶液、または（３）ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）のＰＢＳ溶液のいずれかでコートした。
【００７０】
コーティング組成物およびコートされたプレートは、実施例１に記載した方法で製造した。
【００７１】
ＲＣＧ分析を、工程２．２において０．５ｍｌの細胞を２４穴プレートの穴当たりに塗布したことを除いて、実施例１と同様に行った。
【００７２】
このＲＣＧ分析の結果はクエン酸塩溶液を含むコーティング組成物または硫酸塩溶液を含むコーティング組成物を有するプレートの増加した安定性を示している。
【００７３】
実施例３
この実施例では、ＲＣＧ分析を、予め５０℃で飽和湿度、および５０℃で周囲湿度にて保持された９６穴プレートに１２種類のコーティング組成物を用いて行われ、対照標準として４℃にて保持されたプレートをテストした。
【００７４】
この実施例に用いられた多穴（９６穴）プレートを、（１）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ ＰＯ4 溶液、（２）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ 酢酸塩溶液、（３）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液、（４）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液、（５）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリス溶液、（６）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ炭酸塩溶液、（７）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ クエン酸塩溶液、（８）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ 硫酸塩溶液、（９）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む１×ＰＢＳ溶液、（１０）１×ＰＢＳおよび１２．５％のＥｔＯＨ中のＰＤＬ、（１１）１×ＰＢＳおよび２５％ＥｔＯＨ中のＰＤＬ、または（１２）１×ＰＢＳおよび５０％ＥｔＯＨ中のＰＤＬでコートした。
【００７５】
各溶液において、ポリ−Ｄ−リジンを最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように溶液中に溶解した。
【００７６】
コーティング工程を、ピペッティングを手で行うのではなく自動化された機械で行うことを除いて実施例１および２と同様に行った。
【００７７】
ＲＣＧ分析を実施例１に記載したように行った。
【００７８】
第７日から第５６日のこのＲＣＧ分析の結果は、プレート上の１２のコートされた組成物のそれぞれの安定性／保存寿命を示した。このクエン酸塩溶液を有するコーティング組成物および硫酸塩溶液を有するコーティング組成物の増加した保存寿命は、この分析によって明らかに示された。
Claims (9)
- コートされた基質の貯蔵寿命および／または安定性を増加させる方法であって、
（ａ）０．００５Ｍ〜０．５Ｍの塩溶液中に５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジンを含有するコーティング組成物で基質をコーティングする工程であって、前記塩がクエン酸塩および硫酸塩からなる群から選択される工程と、
（ｂ）前記基質上の前記コーティング組成物をインキュベートする工程と、
（ｃ）前記コートされた基質を洗浄し、前記基質にしっかりと結合していない余分の材料を取り除く工程と、
（ｄ）コーティング組成物をその上に有する基質を乾燥する工程と、
（ｅ）増加した安定性および／または保存寿命を有するコートされた基質を得る工程と、
を具えることを特徴とする方法。 - 前記基質が、基質のｃｍ２あたり、５μｇ／ｍｌ〜１０００μｍ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジンを含む５０μｌ〜５００μｌの前記組成物でコートされていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記コーティング組成物が、生物学的に相溶性の滅菌用媒体を用いて前記基質を洗浄することによって前記基質上で滅菌されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記滅菌用媒体がエタノールであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
- 前記基質を水または緩衝溶液で洗浄して、余分な材料を除去することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記基質が、合成ポリマー材料、ガラス、金属、および細孔性フィルターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 生体外の細胞培養システムであって、基質と、その上の０．００５Ｍ〜０．５Ｍの塩溶液中に５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジンを含有するコーティング組成物のコーティングと、を含有し、前記塩がクエン酸塩および硫酸塩からなる群から選択されることを特徴とする細胞培養システム。
- 前記基質が、合成ポリマー材料、ガラス、金属、および細孔性フィルターよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の細胞培養システム。
- 前記基質が、基質のｃｍ２当たり、５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジンを含む５０μｌ〜５００μｌの前記組成物でコートされることを特徴とする請求項７に記載の細胞培養システム。
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