JPS6062979A - 筋細胞の培養の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、細胞培養若しくは組織培養において、成長発
育を変え、かつ、微生物による汚染を抑制しうる方法に
関する。

（本発明の背景） 本発明は、１９８２年１１月８日出願の米国特許出願番
号筒４４０，０３９号の一部改良に係るものである。こ
の先願においては、線維増殖の抑制方法、並びに組織の
成長及び創傷組織の分化を促進する方法に関して開示し
ている。

この先願を行なってから、本出願人は、キ１ヘーサンが
、線維増殖の抑制に使用でき、かつ、組織の成長、およ
び組織培養における分化を促進するべく使用できること
を発見した。

細胞培養若しくは組織培養は、未分化新生物の成長パタ
ーンを研究するため、また、細胞代謝における基礎研究
に、長年用いられてきた。最近、製薬材料をつくるため
に、大規模な細胞培養技術が使われている。このような
細胞培養の成長または分化を刺激するべく用いられてい
る方法は、これら生物学的生産物の収率とか組成に悪い
影響を与える。

大部分の組織培養は、２次元構造の容器の底部若しくは
側部において、単一層で成長するか、培地中で、個々に
懸濁して成長している細胞として成長する。３次元的組
織培養は、コラーゲン（蛋白質）ゲルの形で報告されて
いる。複合細胞を３次元的に増殖することは、移植に対
する組織を成長させる可能性を高める。

微生物、特にバクテリア及びマイコプラズマ（ｍｙｃｏ
ｐｌａｓｍａ）は、細胞培養培地の中で増殖できる。

培養の汚染を予防的に抑制するため、通常、高濃度の抗
生物質が用いられている。この抗生物質は、調査の対象
となっている組織の成長発育を妨害する。

多くの場合、ひどく汚染された細胞培養は、排除しなけ
ればならず、そのため、大変な時間と材料が無駄になる
。

本発明の第１の目的は、特定の細胞の成長および分化を
高め、かつ選択的に低下させ、また場合によっては変え
るべく、組織培養若しくは細胞培養を処理する方法を提
供することにある。

本発明の第２の目的は、培養容器若しくは培地を処理し
、非蛋白性マトリックスにおける組織の３次元的成長を
維持するための方法を提供することにある。

本発明の第３の目的は、微生物によって細胞培養の汚染
を抑制しうる方法を提供することにある。

以上に述べた目的、およびそれ以外の目的は、以下の説
明により当業者であれば理解できることと思う。

（本発明の要約）　− 組織培養の成長及び発育を変えるための方法は、（１）
組織の３次元的成長に対して、非蛋白性マトリックスを
供給する段階と、（２）キト−サン若しくはその誘導体
を細胞培養に接触させることによって、微生物の汚染を
防止若しくは抑制する段階とから成っている。

本発明に用いられるキト−サンは、　１０，０００乃至
２．０５５，０００の分子量を有する約４５％乃至１０
０％脱アセチル化物である。キト−サンは、溶液状若し
くは固体状である。

（好適実施例） キト−サンに関する研究において、止血時や生体内組織
の成長分化時に、脈管移植片周囲のキト−サン層の中に
できた未分化細胞が、急速に成長することを観察した。

驚いたことに、細胞は、予期に反し、コラーゲン繊維組
織よりは、むしろ平滑筋の中へ発育していた。そこで、
組織培養における細胞の成長及び分化に関するキト−サ
ンの効果について調べることにした。

心臓の筋肉細胞を成長させるため、ヤッフェ（Ｙａｆｆ
ｅ）の方法〔ヤッフェ・ディー（Ｙａｆｆｅ、　Ｄ、）
、［ラットの骨格筋細胞Ｊ　−Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、　
１９７３版、発行者：クルーズ及びパダーリン（Ｋｒｕ
ｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）、発行所：　Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、　１０６〜１１４〕
によって、機能的で、かつ標準的な細胞培養標本を作成
した。

この組織培養標本と、米国特許第４　、３９４　、３７
３号明細書、並びに本発明に関連を有する米国特許出願
第４４０，０３９号明細書に記載されている方法によっ
て調製された無菌のキト−サン止血溶液とを用いて、実
験を行なった。

又見上 新生児のスプレイブ・ドーリ−（ＮｅｏｎａｔａｌＳｐ
ｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ）　・ラットを使用した。頭
部を滅菌鋏で切除し１体部を７０％エタノールに浸けた
。

滅菌鋏を用いて、心臓を取り出し、次にそれを、９０．
８ｍΩの遊離性カルシウム及びマグネシウムの入ったリ
ン酸緩衝セーライン（以下、ＰＢＳ−ＣＭＦと略す）、
５ｍＱの胎児の牛の血清（以下、ＦＢＳと略す）、１ｍ
ｆｌ当り１０，０００単位のペニシリンと１０，０００
μｇのストレプトマイシンを含有する２ｍｌ１の溶液（
以下、ｐｓと略す）、１ｍｆｉ当り２５０μｇを含有す
る２ｍＱのアンホテリシンＢ（以下、ＡＢと略す）、並
びに１０ｍｇ／ｍＱのゲンタマイシンを含有する２ｍＱ
の溶液（以下、ＧＮＴと略す）が入った試験管に移した
。

新生児の心臓を、室温になっている抗生物質溶液に入れ
て、動物室から組織培養実験室へ運んだ。

３０分以内に、その心臓を、ＰＢＳ−ＣＭＦの入った１
　０ｍｆｌ　滅菌ペトリ皿へ移し、清浄な溶液で２回洗
浄した。心臓部を、心房によって支え、心室を小片に分
割し、次に、滅菌刃を用いて細かく切断した。

１０ｍ１２の細分された心室筋肉を、５＋ｎＱの２゜５
％トリプシン溶液を加えた４５ｒａＱ　のＰＢＳ−ＣＭ
Ｆが入ったコニカルチューブに移した。この懸濁液を、
毎分１００回転する回転ミキサーで、３７℃に保ち２時
間かけてふ卵した。各試験管に、１６ｍＱのダルベツコ
の改良型イーグル培地［Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）　（以下、Ｄ
ＭＥＭと略す）と４ｍＱのＦＢＳを加えた。

懸濁液を完全に混合し、試験管を真直ぐに立てて置いた
。５ｍｆｌ　のＦＩ３Ｓを、試験管の底部で層になるよ
う注意深く加え、１０分間残渣物を沈殿させた。残漬物
層の上方にある細胞懸濁液を注意深く取り分け、１５０
０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。

細胞ペレツ１−を８７，８％のＤＭＥＭ、１０％のＦＢ
Ｓ、１％のｐｓ、１％のＡＢ、および０．２％のＯＮ　
’ｒが入ったものの中へ再懸濁させ、１０ｍＱの培養皿
で２時間平板培養した。懸濁液中に、筋肉細胞を残して
、殆んどの不要な繊維芽細胞は、この第１の培養平板に
しつかり付着した。

次に、細胞の濃度を測定し、３５ＩＩｌｎｌ培養皿につ
き、１００万の細胞が含まれた懸濁液を平板培養した。

二酸化炭素に富んだ空気を充たし、温度を３７℃にして
平板をふ卵した。

古い培地を流し去り、２日目に新鮮な培地を加えた後、
平板培養し、その後２日ごとにそれを繰り返えした。

調整のため加えられる培地は、８７．８＋ｎＱのＤＭＥ
Ｍ、１０ＩＩＩＱのＦＢＳ、１ｍＡのＰＳ、１ｍｆｌの
ＡＢおよびＱ、２ｍｕのＧＮＴが含まれた混合物とした
。

実験室におけるこの方法ではラットの心臓筋肉の成長発
育について、他の実験も含め１００以上の平板培養に関
し測定した。

殆んどの筋肉細胞は、２４時間乃至４８時間のあいだに
倒潰し、それから平板培養される。４日乃至５日のうち
に、筋肉管（ｍｙｏｔｕｂｅｓ）が平板の縁部周辺にで
き始める。７日乃至１０日の間に、収縮中央部が形成さ
れる。平板は、１４日間の成長によって被覆される。１
５日間には、平板の全面にわたって均一な収縮ができ始
める。

キト−サンによる最初の実験では、通常の方法で、筋肉
細胞を平板培養した。栄養溶液は、前述の栄養溶液９０
ｗｎ　に、好適なキト−サン止血溶液（０，０２６Ｎ酢
酸中に、　２ｍｇ／ｍΩのキト−サン薄片、若しくはそ
の粉末を含んだ）１０ｍＱを加えて調製した。

３５ｍｍ平板には、各栄養補給に、新鮮な溶液約５ｍＱ
　を必要とした。１日後、平板の底部で筋肉細胞を覆っ
ているキ１ヘーサン層が、はっきり現われた。

キト−サンは、平板及び筋肉細胞に付着、そのため、栄
養溶液の取り替えによって、古いキト−サンを完全に注
ぎ出せなかった。平板上のキト−サン濃度は、各溶液の
取り替えとともに増大している。

キト−サンによって処理された２０個の平板を＊察する
と、筋肉管は、２日乃至３日で形成された。収縮中央部
は、４日乃至５日で形成された。

平板は、９日間の成長によって覆われた。表面の単一な
収縮は、１０日１に始った。

個々の筋肉細胞が、ガラスとの接触による分裂細胞から
、キト−サン層の中へ上げられ、かつ、成長と分裂を続
けていることが、際立って観測された。１４日１までに
、平板上の病巣には、一定の３次元的成長パターンをも
っているものがあった。

層状細胞は、機能的かつ３次元的な心臓組織のように、
下方の細胞と一致した搏動を打っている。

対照平板には、近接成長によって接触面から掻き取られ
ている個体細胞がよく見られた。

それらは、栄養溶液中で球形をしており、しかも、表面
接触がないと成長もしないし作用もしない。培地中のキ
ト−サン繊維は、筋肉細胞に成長を続けさせ、かつ作用
を続けさせるべく、十分な「表面」接触を明確に提供し
ていた。

このようなキト−サン表面は、容器中での表面接触成長
層を増大させるため、底部及び側部につけられるか、溶
液中に懸濁しているビーズ状物につけられる。

ス１」− 同一の細胞懸濁液の分割試料を用い、対照培養とキト−
サン処理培養の調製を繰り返えし行ない、成長速度およ
び発育においてＩＩ察された差異が、対照平板とキト−
サン平板とにおける細胞の違いによって生じた結果でな
いということを確証した。

これまでの観測によると、ラットの心臓筋肉細胞は、細
胞密度が高いとより速く成長した。２０個の平板に対す
る対照実験は、それぞれ同じ結果を生み、キト−サン処
理培養の成長発育がより早いことを確認した。真性「組
織」の３次元的成長を再び見ることができた。

失隨見 濃度を変え実験を行なった。５０％のキト−サン止血溶
液に、５０％の通常の栄養溶液（１００ｍＱ　の栄養溶
液当り、１００−ｍｇのキト−サンを含む）を加えた栄
養溶液の添加によって、厚いキト−サン・ゲル層の下に
おける通常の成長発育より遅い結果が得られた。

３次元的成長が、３０日間維持された平板に見られた。

繊維芽細胞は、この濃度では成長しなかった。それぞれ
、１００ｍ１１　当すキトーサンを１０ｍｇ含んだ栄養
溶液と、５ｍｇ含んだ栄養溶液は、電子顕微鏡によって
調べた筋肉細胞表面に付着しているキト−サン繊維によ
り、大きな成長発育速度を示した。しかし、３次元的成
長は、あまり顕著でなかった。

失簾ｙ ８個の培養において、４５％の脱アセチル化キト−サン
溶液は、栄養溶液と混合した際に、厚くて、しかもはっ
きりしたゲル層を生じた。しかし、細胞成長は、対照に
比較して遅れていた。

平均的に低分子量（低粘度）の１００％脱アセチル化ポ
リグルコサミンは、２０ｍｇ／ｍＱの濃度で筋肉細胞に
付着したが、大部分は、キト−サン粒子として、流体中
に懸濁状になっており、明確なゲル層を形成、しなかっ
た。成長発育速度は、ポリグルコサミンによって高まっ
たが、３次元的成長は、７個の培養において、顕著でな
かった。

叉監ヱ 人の繊維芽細胞の純粋培養を行なった。１００ｍＱ　の
栄養溶液当り２０＋ａｇのキト−サンが含まれる濃度を
有するキ１−−サン止血溶液を添加することによって、
通常の栄養溶液より速い成長が得られた。互いに垂直に
交錯した繊維芽細胞を有する３次元的成長が現われ、繊
維芽細胞の編み目状マットを生じた。栄養溶液中のキト
−サン濃度が高いと、繊維芽細胞の成長が抑制された。

ラットの繊維芽細胞と筋肉細胞の混合培養によって分か
ったことは、栄養溶液１００ＩＩＩＱ　当たり３０ｍｇ
のキト−サンが含まれる濃度で、筋肉細胞の成長は続行
可能である一方、繊維芽細胞を抑制していた。最終的に
、平板は、９５％の筋肉細胞と５％の繊維芽細胞で覆わ
れた。

尖敢■ １００ＩＩＩＱ　当り２Ｑｍｇのキト−サンを含んだ栄
養溶液５＋ａ１２　を用いて、８個の平板を前処理し、
平板の表面を覆うゲル層を作った。

このキト−サン・ゲルに加えられた筋肉細胞は、倒潰の
仕方が可成りゆっくりであったが、細胞分裂と細胞増殖
速度は非常に大きかった。

平板を前処理したものに、更に、好適なキト−サンアセ
テート溶液５ＩＩｌρ　を加えて実験を続け。

デシケータ−中で、それを蒸発乾燥させた。平板の底部
及び側部には、乾燥キトーサンアテセテートの薄い透明
膜が被覆されているのが見られた。

キト−サンを含まない標準細胞懸濁液状の筋肉細胞を、
これらの平板上、および対照平板上に置いた。１６時間
で、対照筋肉細胞の２５％は、倒潰し、それらの形状が
変化し始め、いつもの通り、その約１０％が分裂中であ
った。

キト−サン被覆平板上では、細胞の１０％だけが倒潰し
てしまっていたが、これら筋肉細胞の９０％が分裂中で
あった。第３日日に、細胞分裂の早いものは、キト−サ
ンと栄養溶液の境界部分に筋肉細胞の堆積層を生じてい
た。幅の３倍程度に伸びた細胞のうちいくらかは鼓動を
開始した。

栄養溶液を２回取り替えてから、第６日日に、大部分の
膜は、洗い落されていたが、堆積し、かつ鼓動を打って
いる筋肉細胞の島が、平板にへばすついていたキト−サ
ンの病巣部に残っていた。

５０％のラット筋肉細胞と、５０％のラット繊維芽細胞
の混合培養を、キト−サン被覆平板に付けて分かったこ
とは、１０％の筋肉細胞が１６時間で倒潰したが、繊維
芽細胞は全く倒潰していなかったことである。

これは、繊維芽細胞が、筋肉細胞より相当早く倒潰して
いた対照混合細胞培養と大幅に異なり、筋肉細胞が表面
に達するのを阻止したためである。

６日目まで、鼓動を打っている筋肉細胞の島は、平板上
に残った。

繊維芽細胞は、死んでしまっていたか、または、取り替
えられた栄養溶液によって、平板から洗い落とされてし
まっていたかである。

失敗！ 凍結乾燥されたキト−サンアセテート繊維によって覆わ
れた平板は、細胞の平板培養を受容でき、かつ急速成長
を刺激しうる同じ能力を示した。栄養溶液により予め湿
すことによって、細胞懸濁液を固形キト−サン繊維に直
接注いで得られたちのより、倒潰が早く起こり、かつ、
残存する細胞が多かった。

平板を被覆する前に、いろいろ取り替えられる栄養溶液
に対してキト−サンを透析すると、平板培養された懸濁
液から得られる残存細胞数を高めることができた。

失歓豊 間隔は一定しないが、通常、春には、ラットの子供の組
織の培養は、標準培地において、ペニシリン、ストレプ
トマイシン、アンホテリシンＢおよびゲンタマイシンの
存在下で繁殖しうるマイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓ
ｍａ）によって新たに汚染される。このような組織培養
は、普通捨てられる。

数匹の雌の飼育ラットは、子孫にまで広まる慢性マイコ
プラズマ感染により死んでしまった。

実験■を行なっている際に、いくつかの平板は、平板培
養後２日経ち（第１回の栄養溶液を取り替える直前）、
マイコプラズマによる全体的汚染によって、顕微鏡の下
で培地が激しい運動をしているのが分かった。

微生物の存在に拘わらず、流体の上澄みを注ぎ。

キト−サンを含有する栄養溶液を、汚染された平板に加
えた。顕微鏡によって観察すると、キト−サンを加えた
平板では全ての動きが止まっていた。

筋肉の細胞は、予期した通り１次の３０日にわたって、
検出しうるマイコプラズマ侵入の再発もなく成長発育し
た。汚染された胎児組織を用い慎重に平板培養さ肛た２
４個の平板は、２日でマイコプラズマによる全体的汚染
を確認し、引き続いて平板培養した。

半分に対して、１００ｍＡ当り２０ｍｇのキト−サンを
含有する栄養溶液を加えた。４倍量の標準抗生物質溶液
を加えられた汚染平板は、筋肉細胞の死亡を示し、一方
、キ１−一サンが加えられた平板は、汚染されておらず
、しかもキト−サンで処理された組織培養と同じ位成長
発育した。

犬員見 ８個の一連の平板は、平板培養後２日でマイコプラズマ
およびバクテリアで汚染されていた。４個の平板を、１
００ＩｌＩＱ当り２０ｍｇのキト−サンが含まれた溶液
で処理することで、通常の成長発育を可能にした。４個
の未処理平板上の筋肉細胞は、混濁培地中で死んだ。

寒象人 他の研究所の研究者から、汚染された２つのマイコプラ
ズマを分けてもらった。一方は、汚染された新生児の牛
の組織で、他方は、汚染された新生児の犬の組織であっ
た。

犬のマイコプラズマは、本出願人による標準的栄養溶液
中でよく成長したが、対照培養を破壊した。牛のマイコ
プラズマは、標準的栄養溶液が加えられた本出願人によ
る対照培養中で抑制されながら、ゆっくり増殖していっ
た。

いずれも、栄養溶液にキト−サンを加えることによって
、マイコプラズマを消失させ、かつ、組織培養の通常の
成長発育を可能にした。

標準的な臨床微生物実験室において、ピー・ピー・エル
・オー（ＰＰＬＯ）培地でマイコプラズマを成長させる
ことができ、しかも、微生物が、エム・ホミニス（Ｍ、
　１１０ｍ１ｎｉｓ）でも、また、エム・ニューモニア
エ（Ｍ、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）でもなく、しかも、
ニー・ユーリアリティキュム（Ｕ、　ｕｒｅａｌｙｔｉ
ｃｕｍ）でもないことを決定できた。従って、それらを
、ラット、犬または牛に起源を発するマイコプラズマ種
と呼ぶことにした。

以上行なった実験工乃至Ｘを通して結論をまとめると、
本発明によるキト−サンは、細胞培養の成長発育を変え
、組織の３次元的成長に対して、非蛋白性マトリックス
を提供でき、しかも、組繊細胞における微生物による汚
染を抑制できる。

本発明による方法によれば、前に述べた目的のすべてを
達成することができる。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）組織培養の成長及び発育を変える方法であって。 特定細胞の成長発育を差動的に高めるか、若しくは遅ら
   せる段階と、 組織の３次元的成長に対して、非蛋白性マトリックスを
   供給する段階と、 キ１ヘーサン若しくはその誘導体を細胞培養に接触させ
   ることによって、微生物の汚染を防止若しくは抑制する
   段階 とから成ることを特徴とする組織培養の成長及び発育を
   変える方法。
2. （２）キト−サンが、脱アセチル化キチンであることを
   特徴とする特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。
3. （３）キ１−一サンが、４５％乃至１００％の脱アセチ
   ル化物であることを特徴とする特許請求の範囲第（２）
   項に記載の方法。
4. （４）キト−サンが、１０，０００乃至２，０５５，０
   ００の分子量を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第（１）項に記載の方法。
5. （５）キト−サンが、溶液状であることを特徴とする特
   許請求の範囲第（４）項に記載の方法。
6. （６）キト−サンが、固体状であることを特徴とする特
   許請求の範囲第（１）項に記載の方法。
7. （７）キト−サンが、塩であることを特徴とする特許請
   求の範囲第（６）項に記載の方法。
8. （８）培地若しくは細胞を付ける前に、キ１−一サンを
   培養容器に付けるか、またはそれに結合させることを特
   徴とする特許請求の範囲第（６）項に記載の方法。
9. （９）キト−サンを、培養培地中で懸濁している小球若
   しくは粒子と接触させるか、またはそれらに結合させる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第（６）項に記載の方
   法。
10. （１０）キト−サンが、膜であることを特徴とする特許
    請求の範囲第（６）項に記載の方法。
11. （１１）キト−サンが、シートであることを特徴とする
    特許請求の範囲第（６）項に記載の方法。
12. （１２）キト−サンが、繊維状であることを特徴とする
    特許請求の範囲第（６）項に記載の方法。
13. （１３）キト−サンが、粉末であることを特徴とする特
    許請求の範囲第（６）項に記載の方法。
14. （１４）キト−サン繊維を、マット状に形成したことを
    特徴とする特許請求の範囲第（６）項に記載の方法。
15. （１５）キト−サンを、平板培養培地に加えることを特
    徴とする特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。
16. （１６）キト−サンを、栄養溶液に加えることを特徴と
    する特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。