JPH06501623A - 細胞のインビトロ培養のための支持体材料として多孔性炭酸カルシウムを使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞のインビトロ培養のための支持体材料として多孔性炭酸カルシウムを使用す る方法本発明は、真核の又は原核の細胞のインビトロ培養のための支持体材料と して多孔性炭酸カルシウム、特に多孔性サンゴ骨格を使用する方法に関する。

殆どの真核の細胞は、固体の支持体上のみでインビトロ培養され得ることが知ら れている。そのような培養は、通常容器又はフラスコ中で実施され、そして、そ の中で単細胞の層が、液体の栄養培地と接触して壁部分を完全に覆うとき、細胞 増殖が停止する そのような培養法は、多数の容器の処理を必要とする欠点を有する。

その上、真核細胞は、いくつかの材料上では成長せず、また与えられた材料がこ れらの細胞のインビトロ培養に適するかどうか予測できない。

現在、種々の分野で真核細胞のインビトロ培養のためのかなりの要求がある。

例えば、植物細胞のインビトロ培養は、自然物を野外で培養の制置及び妨害を経 験することなしに生産し、分離することを可能にすることができる。

植物細胞は、通常、培養装！で使用される系によって引き起こされる剪断効果に 対して、バクテリアより著しく敏感である。それ故、固体の支持体上でこれらの 細胞を培養することが有利である。各々の場合にその濃度が定義されるホルモン の作用下で、植物の小片は隔離状態で、また無菌の粂件下で培養され得る。未分 化の細胞（カルス）は、通常植物のある特定の器官のみに見られる代謝物質を合 成することができる。

現在、医薬の有効成分が、製造された最初の物質であり、更に、分子の複雑性が 化学合成を非常に困難及び／又は非常に高価にするところの種々の揮発性植物油 、調味料、着色料及び殺虫剤がある。

植物細胞培養の適用として、下記のものが示され得る。

−ガリウムアバリン（ＧＡＬＬＩＵＭ　ＡＰＡＲＩＮＥ）によるアントラキノン の製造、 一トリテリチュウムウイルホルディー（ＴＲＹＴＥＲＩ　ＺＨＩｔＪＭ　ＷＩＬ ＦＯＲＤＩＩ）による抗癌薬、トリプディオライドの製造、 −アトロープベラドーナ（ＡＴＲＯＰＥ　ＢＥＬＬＡＤＯＮＡ）による鎮痙薬（ アトロビン）の製造、−バババーソムニフェラム（ＰＡＰＡＶＥＲＳＯＭＮＩＦ ＥＲＵＭ＞によるアルカロイドの製造。

更に、インビトロで維持された植物細胞は、生物的転化の強い能力を（７ばしば 有する。例えば、サリチル酸誘導体は、アスピリンより早い鎮痛活性並びにより 良い胃の許容性を有する。

同機に、例えば医学の目的のために多くの動物細胞をインビトロ培養できること が望ましい、そのような培養が同種移植又は自己移植の領域で大きな価値がある けれども、免疫性の系の細胞の前駆体である骨髄細胞は、インビトロ培養するこ とが非常に難しいことが知られている。

良好な細胞インビトロ増殖の価値は、遺伝子組換えによって修飾された細胞に及 ぶ、今まで、そのような細胞が、癌細胞とのハイブリッド形成により又はウィル スを用いる形質転換によって不死化される場合にのみ、実際にそれらは培養され 得る。

細胞のインビトロ培養の池の価値は、骨物質の進行中の又は予測し得る損失で苦 しむ患者における、この患者からの骨細胞の回収、適当な支持体上でのこれらの 細胞のインビトロ培養、及び次に物質の損失を良好にするために培養したこのよ うな細胞を包含する該支持体の導入である。実際には、サンゴは、生分解性の骨 人工装具を構成し、劣化が起こると共に骨による再占拠が、この方法によって再 導入された培養細胞によって促進される。

また、ＣＨＯ及びＶＥＲＯ系統、あるいはプロティン、ワクチン、ホルモン、抗 体等の製造の目的にためのハイブリドーマのような細胞系統の培養方法を改善す ることは有利である。

同じことが、組換え蛋白質又はウィルス（例えばバクロウィルス）の製造目的の ための昆虫細胞の培養に妥当する。

る。

興味ある他の分野は、線状菌類、特に子のう菌類、とりわけイースト（例えばア スペルギルス、ペニシリン等）の培養である。更に特別には、アフラトキシンの 製造のためのＡ　フラビウス（、Ａ、ＦＬＡＶＩＵＳ）の培養又は種々の有機酸 の製造のためめＡ、二カー（Ａ、ＮＩＧＥＲ）の培養が挙げられてよい。

特にアラブナイト、そしてとりわけ多孔性サンゴの骨格の形の、多孔性の炭酸カ ルシウムは、細胞、特に上記の種マのタイプの細胞のインビトロ培養のための特 に有利な支持体材料を構成することが全発見された。

下記に、炭酸カルシウム（アラゴナイト）の結晶よりなることが知られているサ ンゴ骨格、又はより単純にはサンゴが簡便さのために言及されるか、これらの表 現が、任意の天然の又は合成の多孔性石灰質材料、特に多結晶性形態のものを意 味するとここで解釈されるべきであることを指摘しておく。

それ故、本発明の主体は、真核細胞のインビトロ培養のための三次元固体支持体 として本質的に炭酸カルシウムより成る多孔性材料の使用である。

真の三次元培養支持体として使用されることができるサンゴのために、それは０ ．５ｍｍより大きな、特に１ｍｍより大きな寸法を通常有する片の形で使用され るべきである。

例えばこの材料は、円筒、球、板等の形態をとることができる。

例えば、このような材料は、次の方法によって得られる。

即ち、未加工のサンゴ片が流水で十分に洗浄され、乾燥され、そして切片に切断 され、次いで公知の方法により要求された寸法を有する要求された形状にされる 。これらの切片は、４８時間、１２グラム／リヅトルの濃度の次亜塩素酸ナトリ ウム溶液中で浸漬され、次いで４８時間流水で洗浄され、そして乾燥される。最 後に、ガンマ線による殺菌がなされる。

サンゴ骨格の使用の価値の一つは、この骨格中で細孔が互いに連絡し、従って比 較的大きなサイズの片の形においてでさえ、骨格の全部分か使用できることであ る。加えて、この細孔の連絡は、培養された細胞による支持体材料の完全な侵入 を増進し、それ故、使用された支持体材料の容積に関して表現される培養の収率 が最適である。サンゴが三次元支持体を構成する故に、この容積に関し表現され た収率は、明らかに高い。

５０〜２５０μｍの細孔径を有し、多孔性、即ち材料の全容積に関して通常２０ 〜８０％の細孔容積を有する材料を支持体材料として使用することが好ましい。

特に、これはボリテス（Ｐｏｒｉｔｅｓ）−アクロボラ（Ａｃｒｏｐｏｒａ）− ゴニオボラ（Ｇｏｎｉｏｐｏｒａ）、ロボフィリア（Ｌｏｂｏｐｈｙ　Ｉ　ｌ　 ｉ　ａ）　、シンフイリア（Ｓｙｍｐｈｙ　Ｉ　Ｉ　ｉ　ａ）及びミリボラ（Ｍ ｉｌｌｉｐｏｒａ）属のサンゴの場合である。

当然、本発明に使用される培養培地及び条件は、培養されている特定の細胞に適 したものである。これらの培養培地及び条件は、よく知られており、又は簡単な きまった実験により決定されることができる。

本発明は、全ての真核１Ｍｌｌ１！、特に植物又はヒトの細胞を含む動物の細胞 のインビトロ培養における支持体材料としてのサンゴ骨格の使用方法に関する。

例えば、これらは線鱈芽細胞、内皮細胞、全能性幹細胞及び遺骨細胞を含む骨髄 細胞；あるいはハイプリドーマ等のような形質転換細胞であることができる。

また本発明の主体は、真核細胞をインビトロ培養するための方法であり、ここで 適当な液状栄養培地中に浸漬された多孔性炭酸カルシウムで作られた三次元固体 支持体を含む栄養培地が該細胞を接種される。

支持体材料、培養培地及び／又は該真核細胞は特に、上記のように定義される。

培養は、培養される細胞の増殖に適したｐＨで実行される。このＰＨは、支持体 材料の認め得る溶解を避けるため好ましくは７以上である。もし必要なら、ＰＨ は、適当なＰＨ調整剤を用いて培養中に調節される。

植物！ｌ１ｌｌ胞の培養のために、特に、無機質成分、窒素源及び種々の添加物 例えばヘラ−（ＨＥＬＬＥＲ）のミクロ成分を含む栄養液体培地が使用される。

好ましくは、植物細胞の培養のために、炭素及び窒素源、無機質及びビタミン成 分及び通常培養装置で用いられる系によって起こされる剪断効果を防止するため に特効のホルモンが、使用される。線状菌Ｍ（子のう菌類）の培養のために、栄 養培地は炭素及び窒素源及びＳ？機質及びビタミン成分を含む。

通常、全容？１（？Ｉｉ体＋固＃）に対する固体支持体の容積比は、５％より大 きく、そして特に１０％より大きい、それは、はとんどにおいて５０％より小さ いか、又は等しい。

培養後に細胞を集めることがもし必要なら、例えば公知の方法でトリプシン処理 を実行することが可能である。特定の実施！ｌＥｌｉｍにおいて、同一の支持体 上で同一の動物種の二つの異なった細胞を順次に培養することによって発明の方 法を実施することができる。このような方法は、特に直接に固体支持体の直接上 よりも細胞（例えば内皮細胞又は繊維芽細胞）の層上でよりたやすく成長する骨 髄細胞（幹細胞又は遺骨細胞）のような細胞を培養するために有利である。

また本発明の主体は、真核細胞により占められた三次元多孔性炭酸カルシウムか ら成る細胞培養生成物であり、特にこの培養生成物を上記で定義された方法によ り得ることができる。

本発明の培養生成物は、特に内皮細胞又は線瞠芽細胞の被膜で覆われた固体支持 体からなることができる０本発明の培養生成物はまた、骨髄幹細胞及び／又は遺 骨細胞で自体覆われているそのような被膜で覆われた支持体であることができる 。

以下の実施例により本発明の詳細な説明するが、これにより本発明が限定される ものではない。

Ｋ腹上ユニ　ｍｔｎｌｌ サンゴ移植片の細胞（繊維芽細胞）コーティングが行われ、そして次にこれらの 繊維芽細胞コートされた移植片が患者からの骨髄で含浸される。

１、繊維芽細胞コーティング １．１２社月 材料二円盤状で、直径３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのポリテスサンゴ。

栄養培地：１０％の胎児の子ウシの血清及び１％の抗生物質（ペニシリン／スト レプトマイシン）を追加されなＭ１９９゜ 細胞タイグ：ラヴトの表皮線維芽細胞 １・２・１羞 外植法によるラットの表皮′ａ維芽細胞培養の製造：皮をそった後、皮膚は曲が ったビンセットによりつままれ、次いでビンセットの二点間に保持された皮膚は 、小力で切り出され、そしてその切片は高濃度（６％）で抗生物質を含む食塩溶 液中に！かれる０次ぎにそれぞれの片は、い刃で約２ｍｍ２の小さな正方形に再 び切断された。

このバイオプシー物は、通常の濃度より６倍、４倍そして次ぎに２倍大きいペニ シリン／ストレプトマイシン濃度を含有する栄養培地中で３回すすがれた。

２ｍｍ２の片のバイオプシーは、「きれいな」切口で切られ５そしてそれらは、 プラスチックの培養皿中に置かれた。

バイオプシーは、胎児の子ウシの血清が少なくとも１０％の比率で添加された栄 養培地の添加前に支持体に付着される。良好な付着は、ビンを平らに据える前に 培養器中で４０〜６０分閏培地なしでびんを縦に立てることによって得られる。

次いで、皿は、静かに保たれなければならず、そして２又は３日後、繊維芽細胞 は、外植片の周囲に増殖し始める。

！ｌ維芽細胞は、一度増殖が始まると排除される故に、次いで培地は、２又は３ 日毎に交換されなければならない、そして第一の継代培養が実行されてよい、も し、繊維芽細胞が、培養がより摂取的な細胞（例えば筋芽細胞又は内皮細胞）と 共に最初の培養中に共存するなら、繊維芽細胞は、（繊維芽細胞は耐えるが、他 の細胞は耐えない）栄養培地の貧化により選択される。＃！維芽＃Ｉ胞が、融合 に達しなとき、即ち＃触抑止が、さらなる増殖を妨げるとき、継代培！Ｉｌ後に 次の段階は、三次元培養である。この型の培養中、細胞は、三次元支持体上の三 次元金てで増殖する。

この培養を実行するなめに、これらの細胞懇濁物が直径１ｍｍそして厚さ１ｍｍ のポリテスサンゴの円盤の上に１かれる。これは、６つのくぼみの皿中又は直径 ３５ｍｍのベトリ皿中で行われる。細胞成長の定量化は、サンゴ円盤中に含まれ た細胞の数の増加を評価するように規則的な間隔で実施される。

サンゴが繊維芽細胞で覆われるとき、第二Ｖ１階、即ち、全体又は無核の細胞（ 赤血球及び脂肪細胞）の除去後の新鮮な骨髄に含まれる細胞での含浸が実行され る。

２．骨髄細胞の培養 骨髄は、カルシバリン（３ミリリツトル１５００ミリリツトル）を含むフラスコ 中にう・ットから採取することにより回収される。４１１胞は、よく分散され、 そして次いで１８℃で、骨髄懸濁物の２０ミリリツトルに対してフィニル（Ｆｉ ｃｏｌｌ）の１２ミリリツトルの比率でフィコル上に！かれる。全体は、制動の ない安定した遠心分離器中で２０分間１６００回転で遠心分離される。幹細胞は 、この方法で単離され得る。

繊維芽細胞で覆われたサンゴを含む栄養培地は、次いで液状栄養培地の１ミリリ ｙトル当たり１ｏ７の幹細胞を接種される。

骨髄細胞の実質的な三次元成長が観察される。

同様な結果が、ヒト真皮の繊維芽細胞を初めに培養、及び次にはヒト骨髄細胞の 培養により得られた。

１１舅ユニヒトの肺の胚　細　の 支持体材料は、ボリテス属のサンゴ骨格の球又は円筒より成る０球は、直径３〜 ４ｍｍであり、円筒は、直径３ｍｍ及び長さ４ｍｍの寸法を有する。

２０％空隙率を有するサンゴ骨格又は５０％空隙率を有する骨格のいずれかが使 用された。培養された細胞は、ＭＲＣ５系統であり、そしてそれは、ヒトの肺の 胚ｆａＭ芽細胞系統である。

培養は、多数のくぼみのある培養板上で実行される。＃種は、５０，０００の細 胞を含む培地１ミリリツトルの比率でなされる。

栄養培地は、新生の子ウシの血清の５％を追加されたウィリアムス（Ｗｉ　１１ 　ｉ　ａｍｓ　）培地である０次いで、支持体が栄養培地で覆われる。板は、湿 気のある雰囲気（５％の二酸化炭素を含む空気）下３７℃で温度調節された室内 に！かれる。２４時間インキュベート後、支持体は、無菌の条件下で取り出され 、そして３７℃で新鮮な培地を含む他の板中でインキュベートされ、そして培養 が前記と同じ条件下で再開される０次に、培地は、７日間の全培養期間中、２日 毎に交換される。

培１！！７日後、細胞集団は、同じくローリ−法によって蛋白質をアプセイする ことによって、並びにメチレンブルーでのＤＮＡの染色により評価される。

良好な細胞成長が、球の形及び円筒の形の両方の支持体で！Ｉ察される。

成長は、５０％空隙率を持つ材料上より２０％空隙率を持つ材料上でより激しい 。

ハイブリドーマは、抗葉酸塩モノクローナル抗体を分泌する。

それは５％の新生の子ウシの血清を追加されたＲＰＭ　Ｉ培地中で培養される。

他の培養条件は、実施例２で述べたものと同じである。

細胞成長は、製造されたモノクローナルの量をＥＬＩＳＡ法を使用して決定する ことによって証明された。

フロントページの続き （７２）発明者　マニエ、アラン フランス国　７７１２０．クーロンミール、プルバール　ロリミ　１８

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞のインビトロ培養のための三次元固体支持体として多結晶性炭酸カルシ ウムを本質的に含む多孔性材料の使用方法。
2. ２．該材料がアラゴナイトからなる請求項１記載の使用方法。
3. ３．該支持体が多孔性のサンゴ骨格の片から成る請求項１記数の使用方法。
4. ４．該支持体が、所望の形態及び寸法を有する片から成り、この寸法は０．５ｍ ｍより大きい、そして特に１ｍｍより大きい請求項１〜３のいずれか一に記載の 使用方法。
5. ５．該支持体が、円筒、球又は坂の形態をとる請求項１〜４のいずれか一に記載 の使用方法。
6. ６．細孔直径が、５０〜２５０μｍである請求項１〜５のいずれか一に記載の使 用方法。
7. ７．細孔容積が、支持体の全容積の２０〜８０％を示す請求項１〜６のいずれか 一に記載の使用方法。
8. ８．該サンゴが、ポリテス、アクロポラ、ゴニオポラ、ロボフィリア、シンフィ リア及びミリポラ属から選ばれる請求項３〜７のいずれか一に記載の使用方法。
9. ９．該固体支持体が液状栄養培地中に浸漬される請求項１〜８のいずれか一に記 載の使用方法。
10. １０．全容積（液体＋固体）に関する固体支持体の容積比が、５％より大きく、 そして特に１０％より大きい請求項９記載の使用方法。
11. １１．適当な液状栄養培地中に浸漬された、多孔性炭酸カルシウムでつくられた 三次元固体支持体を含む栄養培地が、該細胞を接種されるところの真核細胞のイ ンビトロ培養のための方法。
12. １２．該支持体及び／又は該液状培地が請求項２〜１０のいずれか一つで定義さ れる請求項１１に記載の方法。
13. １３．該細胞が植物細胞、動物細胞及び線状菌類の細胞から選ばれる請求項１１ 又は１２のいずれかに記載の方法。
14. １４．該細胞が、ヒト細胞、昆虫細胞、未分化の植物細胞またはイースト細胞で ある請求項１３記載の方法。
15. １５．該細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、全能性幹細胞を含む骨髄細胞及び造骨 細胞から選ばれる請求項１３及び１４のいずれかに記載の方法。
16. １６．該細胞が形質転換細胞、特にハイブリドーマである請求項１１及び１２の いずれかに記載の方法。
17. １７．同一の動物種の二の異なった細胞が、同一の支持体上で順次に培養される 請求項１１〜１５のいずれか一に記数の方法。
18. １８．線維芽細胞又は内皮細胞が初めに培養され、及び次には骨髄細胞がその後 に培養される請求項１７記載の方法。
19. １９．該骨髄細胞が、全能性幹細胞又は造骨細胞である請求項１８記載の方法。
20. ２０．真核細胞によって占められた三次元、多孔性炭酸カルシウム支持体より成 る細胞培養生成物。
21. ２１．請求項１１〜１９のいずれか一の方法により得られ得る請求項２０記載の 生成物。
22. ２２．該支持体が、内皮細胞又は線維芽細胞の被膜で覆われている請求項２０又 は２１のいずれかに記載の生成物。
23. ２３．該被膜が、骨髄細胞及び／又は造骨細胞で自体覆われている請求項２２記 載の生成物。
24. ２４．該細胞が、ヒト細胞である請求項２２又は２３のいずれかに記載の生成物 。