KR890003081B1

KR890003081B1 - 세포배양에 사용하기 위한 첨가물, 무혈청 배양용 배지 및 그것들을 사용하는 세포배양법

Info

Publication number: KR890003081B1
Application number: KR1019850003174A
Authority: KR
Inventors: 도시노부 미즈다; 마사가즈 아다찌
Original assignee: 오쓰까 세이야꾸 가부시기가이샤; 오쓰까 아끼히꼬
Priority date: 1984-05-11
Filing date: 1985-05-10
Publication date: 1989-08-21
Also published as: EP0166130A2; KR850008183A; EP0166130A3; IL75118A; IL75118A0; JPS60237989A

Abstract

내용 없음.

Description

세포배양에 사용하기 위한 첨가물, 무혈청 배양용 배지 및 그것들을 사용하는 세포배양법

제1도는 본 발명에 따르는 세로배양에 있어서 사용되는 "첨가물 제1호"의 첨가에 의하여 착생하는 새포의 번식효과를 표시하는 그래프.

제2도는 착생하는 세포가 RPMI-1640배지에서 배양됐을때의 세포의 번식상태를 표시하는 사진.

제3도 내지 제6도는 착생하는 세포가 RPM 1-1640배지에서 "첨가물번호 2 "와 함께 사용 배양될때의 세포의 번식상태를 표시하는 사진.

제7도는 "첨가물 제1호"와 첨가에 의한 유동세포의 번식효과를 나타내는 그래프.

제8도는 "첨가물 제1호"와 유동세포수간의 관계를 표시하는 그래프.

제9도는 배지를 사용하는 것들과 소의대아의 혈청(bovine fetal serum : FCS)과의 비교에 있어서의 본발명에 따르는 세포배양에 있어서 사용하는 "배지 제2호"를 사용할때의 세포의 신진대사의 청각과 생활력을 표시하는 그래프.

제11도와 제12도는 상술한 바와같은 배지를 사용하여 세포 2차 배양(sabcultivation)이 실시될때의 세포수의 증가를 표시하는 그래프.

제3도는 상술한 배지를 사용하여 세포 2차 배양이 실시됐을때의 세균의 축적된 숫자를 표시한다.

본 발명은 세포배양을 기술, 더 상세히 말하자면 만족한 세포 배양조건을 설정하기 위한 세포 배양에서 사용하기 위한 첨가물에 관계한다. 최근의 생물공학의 발전에 따라 기초적 시술수단으로서의 세포 배양기술은 대단히 중요하게 되었고, 그 중에서도 여러가지 연구가 특히 세포배양에 적합한 배지에서 이루어진다. 현재는 여러가지의 영양배지(기본배지)가 시판되어 있고, 그것은 일반적으로 혈청의 추가 특히 소의 태아의 혈청(FCS)세포 배양을 위한 배지로서 요구되고 있다.

그러나 이들 형청은 여러가지 종류의 성분을 포함하고 있기 때문에 예를 들면 세포 배양액에서 세포를 산출하는 유용한물질을 분리 또는 수집하는 것이 극도로 어렵거나 심지어는 불가능하기까지도 하다. 나아가서 혈청은 입수하기 임들고 값이비싸고, 또한 배양에 있어서 번식효과를 제공하지 않는 단점을 가지기도 한다.

본 발명인은 세포배양 조건에 있어서 금면한 연구를 하였으며, 특히 혈청을 위한 치환분 성분(substituent ingredients)분야에서 연구하였고, 그 결과 난백으로 입수가능한 오보매크로 글로블린(avomacroglobulin)이 탁월한 세포번식 효과를 가지며, 또한 혈청에 있어서와 같은 단점이 없는 점을 발견한데 입각하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 한 목적은 오보매크로글로블린을 포함하는 세포배양에 사용하기 위한 첨가물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 오보매크로 글로블린을 포함하는 무혈청(NON-SERUM)배양에 사용하기 위한 배지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 무혈청 조건하에서 세포 배양을 수행하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 오보매크로글로블린은 배양된 세포의 활동을 보호유지할 수 있고, 또한 대단히 그번식 특성을 바람직하게 조장한다. 나아가서 이것은 단일 성분으로 구성되는 물질이기 때문에 유용한 물질을 수집하기 위한 분리에 있어서, 방해가 되지 않으며, 또한 배양에 있어서의 번식효과를 제공한다.

오보 매크로글로블린은 단백에서 고분자량 당 단백질로서 알려져 있고, 그를 위한 비교법도 이미 알려저있다.

(Feeney R·E… : Comp·Biochem, Rhysiol, 154A,281(1976), 의 IKai A : J.Biochem, 92,1679-1682(1982), 그리고 93,121-127(1983) : Nagase H의 : J·B·C…Vo1.258, NO.12,7489(1983)등). 오보매크로 글로블린의 준비를 위한 최초물질로서의 난백은 특별히 제한은 없으며, 여러가지 동물의 난백이 사용될 수 있다. 일반적으로 닭, 오리, 메추라기, 타조 등의 입수가 용이한 난백이 선호되며, 또한 오보매크로 글로블린의 물리학적 특성등을 이용하는 여러가지의 처리과정, 예를들면 단백질 침전제(precipitatingagent)분자체 크로마트그래피(겔여과), 이온교환 크로마토그래피, 원심분리, 전기영동과 특석(dialysis)등을 사용하는 처리가 단백질 성분의 분리에 일반적으로 채택되는 동일한 방법으로, 단독 또는 조합해서 사용될 수 있다.

예를 들면 오보매크로 글로 블린은 삼염산 완충액과 같은 수용성 용매에서의 난백혼합에 의한 600,000내지800,000 분자량의 당 단백질로서 입수될 수 있고, 이것은 오보뮤우신(ovomucin)과 같은 비수용성 단백질성분을 제거하며, 또한 그 다음에는 나머지를 겔여과시킨다.

본질적인 성분으로서의 오보매크로 글로블린을 포함하는 본 발명에 따르는 세포 배양에 사용하기 위한 첨가물에 관해서는 그 상태에 관한 특별한 제한과 임의적으로 그것으로 혼합된 성분에 관한 제한은 없으며, 그 성과를 해치지 않는 한은 그렇다는 것이다.

비교의 한예로서는 수성용제의 용해, 동열건조분말(freezedried powder)등을 말할 수 있을 것이다.

후술하는 바와같이 만족한 세포배양은 오보매크로 글로블린을 함유하는 기본배지의 사용에 의하여 가능한 것이고, 그중에서도 더욱 적절한 배양조건은 낮은 밀도의 지방단백질(LDL), 특히 노른자(yalk) LDL, 카탈라아제, 알부민, 인슈린, 트란스페린(transferrin)과 세렌(seleniun)이 함께 존재하는 경우에 설정될 수 있다.

따라서 현재의 기본지배가 어떤 그런 성분을 결핍하고 있음을 고려한다면 오보매크로글로블린과 추가하여 최소한 그 성분들중에서 임의 적으로 혼합한 하나를 함유하는 첨가제를 준비하는 것이 사용상 편리하다.

본 발명이 이들 성분과 혼합된 첨가물을 포함하고 있음은 명백하다.

이들 성분을 혼합하는 첨가물을 준비하는 경우 그 혼합비율에 특별한 장애가 없기 때문에 적절한 각 성분의 혼합비율 범위는 아래와 같다.

성 분 중 량 부

오보매크로플로블린 1-100

LDL(트리글리세리드양으로서 0.1-500

카탈라아제 2.4×10^-6-24

알부민 10-10,000

인슈린 1-100

트란스페린 1-100

셀렌 0.001-0.1

본 발명에 따른 첨가물은 물론, 보통의 회석으로 기본배지를 위한 성분과 성분을 유지하는 알려진 번식유지체, 보전제 등을 합동 또는 혼합할 수 있다.

본 발명에 따른 세포배양에 사용하는 첨가물이 보통의 기본배지에 첨가됨으로서 세포배양은 혈청을 이용하는 재래방법과 같은 조건에서 실시될 수 있다.

기본배지는 예를들어 CEM배지, CMRL-1066배지, DM-160배지, 이글스 최필수매체(Eagle's MEM), 고압(autaclavable)MEM 피셔배지, F-10 또는 F-12배지, L-15배지, NCTC-109배지, PRMI-1640배지, 맥코이 5A배지등을 포함한다.

본 명세서에서는 기본배지는 상술한 시판제품에 한정되는데 그 배지는 대체로 동일한 성분구성을 가지며, 또한 그러한 구성을 가지도록 새로이 준비된 것이다.

본 발명에 따른 세포배양에서 사용하기 위한 첨가물은, 기본배지1ml에 대하여 오보매크로 글로블린의 양이 0.1ug 내지 2mg, 바람직하게는 0.1ug 내지 1mg, 더욱 바람직하게는 1 내지 100ug의 범위로 배정된 분량으로 첨가된다.

본 발명에 따른 첨가물이 혼합된 배지를 사용하여, 배양이 PH6내지 8, 온도 37℃에서 실시될때에 대단히바람직한 결과를 얻을 수 있다.

상술한 배지는 여러가지 종류의 동물세포의 배양에 사용될 수 있으며, 그 세포들은 착성 또는 유동세포이거나 또는 주화세포(established cell), 신선한 유해세포 또는 정상세포이다.

본 발명의 다른 실시예로서는 효과적인 오보매크로블로글린양을 포함하는 무혈청 배양에서 사용하기 위한 배지가 설명될 것이다.

상술한 배지가 필수성분으로서 오보매크로 글리블린을 함유할 것이 필요하다. 오보매크로글로블린산의 농도는 일반적으로 0.1ug 내지 2mg/ml이며, 적절한 것은 0.1ug 내지 1 mg/ml 더 적절하게는 1 내지 100ug/ml의 범위에서 혼합된다.

기타 성분에 대하여는 특별한 제한은 없으며, 상술한 기본배지를 오보매크로 그로블린과 혼합하여 준비된그들 배지가 예시될 것이다.

더욱 바람직한 배지로서는 상술한 예시 기본배지를 하기의 것을 포함하도록 마련할 수 있다.

1-100g/ml 오보매크로글로블린

1-500g/ml의 노른자 CDL(예컨데 틀리글리세리드의 양으로서)

1-100g/ml의 인슈린

1-100gm/ml의 셀린

10g-10gm/ml의 알부민

약 10^-14-10^-7M의 카탈리아제(대충농도)

본 발명의 다른 실시예로서 위에 규정한 배양밥법에 의한 무혈청 조건하에서의 세포배양방법이 설명된다.

이 방법에 따르면 세포배양은 세포기능이 만족스럽게 유지되는 동안 극히 소망스럽게 실시될 수 있다.

본 발명은 이제부터 실시예와 실험예를 따라 설명된다.

[실시예 1]

20개의 달걀에서 분리한 단백을 1％ NaCl가 첨가된 동량의 25mM의 3염산완충액(pH 7.6)속으로 넣고, 원실분리(10,000rpm×10min)를 하면서 농도를 2％로 조절하도록 폴리에틸레글리콜(분자량 : 7,500, 와 코퓨어 케리칼 산업사 제품)을 첨가하고, 상청액을 모았다.

폴리 에틸렌 글리콜올 농도가 ％가 되도록 첨가하고, 다음에는 침전한 부분을 수집하기 위하여 원심분리(10,000rpm×10min)를 실시했다. 텀전물은 완충액 내에서 용해하고, 그 다은 원심분리(10,000rpm×10min)하여 침전부분을 모았다.

수집한 부분은 Cl-⁶B(파마시아 파인케이칼사 제품)을 사용하여 관크로마토그래피 처리하고, 상기와 같은 완충액을 써서 용리시켜 효소저해 활성을 갖는 오보매크로글로블린을 얻었다. 분자량은 700,000정도였다.

(1) 실시예 1에서 얻은 오보매크로글로블린을 25mM의 염산 완충액(1％ NaCl포함)속에서 투석처리하고, 0.6mg 단백질량/ml으로 조절하고 4℃에서 보전햇다. 이것을 "첨가물 제1호"하 칭한다.

단백질의 양은 "토네인 TP"(등록상포, 오스카 에세이랩 제품)으로 측정했다. (이 단계는 뒤에 계속되는 예에서도 공통이다)

(2)실시예 1에서 얻은 오보매크로글로블린을 0.01M의 인산염 완충액(pH=·7.4)에서 투석처리하고, 1mg의 단백질량/ml로 마련된다. 이것은 이하 "첨가물 제2호"로 칭한다.

(3) 동경대학교 이까이 교수(J.Biochem 93,121-127(1983)가 공급한 악어나백과 상술한(1)항에서와 마찬가지 방법으로 인출한 오보매크로글로블린을 10mg의 단백질량/ml로 마련된다.

이것은 이하"첨가물 제3호"로 칭한다.

(4) 상술한 첨가물(1)의 한 부분은 동결건조시켰다. 이것은 이하 "첨가물 제4호"로 칭한다.

[실험예 1]

하기 배양실험은 착생세포 QG-90(인간의 폐암세포선 Human ling, cancer cell line cancer Res, 42, 601-608(1982))을 사용하여 실시했다.

4-(2-옥시에틸)-1-피페라딘 탄술폰산(HEPES) 10M을 함유하는 RPMI-1640 배지(GIBCO CO제품)에 1.0×10⁵세포/ml로 제조한 QG-90 각 1ml를 24웰플레이트에 비치하고 37℃에서 5％ 인산화탄소가스 배양기내에서 배양시켰다.

본 발명에 따른 첨가물 제1호는 여러가지 농도에서 첨가되고 배양시간 18시간과 48시간후의 세포증식성과는 MTT에세이(Assay, 프로그레스 오브메디슨, vol, 128, No 1, P9-10(1984)로 측정했다.

그 결과는 제1도에 표시된다. 제1도에서는 백선은 18시간후에 측정된 570nm(OD570)에서의 흡수를 나타내고 흑선은 48시간후에 측정된 OD570nm을 나타낸다.

MTT 분석은 활성 미토콘드리아를 반영하며, 또한 본 발명에 따른 첨가물을 첨가함으로서 대단의 바람직한 영양공급조건이 설정됨을 제1도에서 볼 수 있다.

(2)상술한 제1항과 동일한 방법으로 QG-90을 여러가지 농도에서 첨가물 제2호를 혼합한 배지 RPMI-1640을 사용하여 5일간 37℃에서 배양시켰다.

그 결과는 제2 내지 제6도에 표시한다.

상기 도면은 각각 아래와 같이 표시한다.

제2도 : 첨가없음(조절배지)

제3도 : 0.1mg의 단백질/ml이 첨가됨.

제4도 : 0.05mg의 단백질/ml이 첨가됨.

제5도 : 0.025mg의 단백질/mg이 첨가됨.

제6도 : 0.013mg의 단백질/ml이 첨가된.

제2도 내지 제6도에서 본 발명에 따른 첨가물이 각 그풉에 첨가되어 만족한 번식을 나타냄을 볼수 있다.

[실험예 2]

하기의 배양실험은 유동세포리지(Raji)[버어킷트의 인체림프종세포선(Burkitts human lymphoma cell line : J.Nat cancer Inst. 34,231(1965)]를 사용하여 실시했다.

(1) 여러가지 농도에서 첨가물 제1호와 혼합한 PRMI-1640에서 1.0×10⁵셀/ml로 제조한 각 1ml의 레지를 24웰 플레이트상에 배치하고 5％의 이산화타소가스 배양기내에서 37℃에서 배양시켰다.

24시간 배양후의 세포증식성과는 MTT에세이로 측정했다.

결과는 제7도에 표시한다.

(2) 시험(1)에서 24시간 배양후 각 웰(well)을 피팻팅(pipeting)한 후에 각 100μ의 부유세표(cellsuspension)를 취하고 인산염 완충액을 함유하는 2％트리블루(tripan blue)100μ1와 혼합시키고 이것을 비이커-터너크 계산기 디스크에 충전하고 현미경으로 염색되지 않는 살아있는 수치를 계산했다.

결과는 제8도에 표시한다.

(3) 실험(1)에서의 RPMI-1640배지를 CEM 배지(스콧사제품)와 교체하여 동일한 방법으로 실험하여 대체로 같은 결과를 얻었다.

[실험예 3]

여러가지 농도에서 첨가물 제3호와 혼합한 10mM HEPES를 함유하는 RPMI-1640배지내에서 1.0×10⁵세포/ml로 제조한 고도로 혈청을 요구하는 다우디(Daudi)(버터킷트의 인체림프종 세포선(Eur.J.Immunol.6(12),913-916(1976)을 각 1ml가 24웰 플레이트상에 배치하고, 5％이산화탄소가스 배양기내에서 37℃에서 배양시켰는데 실험예 2-(2)와 동일한 방법으로 측정하였다.

결과는 다음 제1표에 표시된다.

첨가물 제3호 세포수

첨가량 (×10⁵/ml)

첨가 없음(조절) 0

50g 단백질 량/ml 1.4

25 〃 1.2

12.5 〃 0.6

6.3 〃 0.2

[실시예 2]

(1)1000g의 난백을 10mM의 삼염산 완충액냉에 투여하고, 그리고, 폴리에틸렌 글리콜을 가하여 최종농도를 2.5％로 한다음 원심분리(10,000rpm ×.10min)하여 상청액을 모았다.

폴리에틸렌 글리콜을 농도를 10％로 조절하도록 더 첨가하고, 원심분리(10,000rpm ×.10min)하여 침전물을 모았다.

나아가서 1％ NaCl가 첨가된 118ml의 10mM삼염산 완충액을 첨가하여 용해시키고, 또한, 상청액을 모으기 위하여 동일한 방법으로 원심분리를 했다.

상청액을 10mM의 3-HCl완충액내에서 투석처리하고, 그리고나서 이온 교환 크로마토그리피(DEAE-트리스아크릴 M.LKB프러두크러 AB…유동율 75ml/hr, 50 내지 150mM NaCl그라디엔트, Fr, 10g/tube)처리한 다음, 프랙션(fraction)제5호 내지 50호를 모으고, 농축시킨 다음 겔여과(CL⁶B : 유동율 150ml/hr,Fr.20g/tube처리하여 오보매크로 글로블린 212mg을 얻었다.

(2) 6,541mg의 오브보매크로글로블린을 식료용 냉동 난백(큐우피라마고 K.K.제)20kg을 사용하여 얻었는데, 그 방법은 상술한(1)과 같다.

(3)노른자39ml에 0.16M NaCl수용액 동일양을 가하고, 원심분리(90,000 G×1hr,4℃)하여 중간층을 모았다.

1.84M Nacl의 수용액을 같은 량 첨가하고, 그 다음 원심분리(90,000 G×48hr,0℃)하여 상층(유층)을 모았다.

0.16M Macl숭요액을 첨가하여 상층을 용해한 후 그 용액을 투석처리하고 살균(0.22 마이크로 밀리 포아필터, 밀리포아사제붐)하여 LDL 116ml를 얻었다.

LDL의 재성분(mg/ml)

단백질 20.0

트리글리세리드 49.8

인지질 16.7

콜레스테롤 3.1

비에스테르화 지방산 0.23

[예 2]

(1) 실시예 2-(1)에서 얻은 오보매크로글로블린을 1mM의 인산염 완충액(PH 7.7)에서 투석한 다음, 10mg/ml로 조절하고, 그 결과로 생긴 액체 20ml에 실시예 2-(3)에서 얻은 LDL 1ml를 첨가했다.

이것은 이하 "첨가물 제5호"로 칭한다.

(12)생리학적 염류용액(PH=7.2)내지 100mM의 HEPES를 사용하여 하기 조성을 준비했다.

오보매크로글로블린 2mg/ml

LDL(트리글리세리드 양으로서) 500μg/ml

보빈혈청알부민

(Bopvine Serun Albumin)BSA 10mg/ml

(프랙션 V. #4503 : 시그마화학사 제품)

카탈라아제 10^-6M

SGF-3(인슐린 5mg/ml, 셀렌 5g/ml) 1％(V/V)

트랜스폐린 5mg/ml : (스콧사 제품)

이것은 "첨가물 제6호"라 칭한다.

(3) 실시예2-(1)에서 얻은 오보매크로글로블린을 RPMP-1640에서 투석시킨 후에 5.7mg/ml로 조절했다.

이것은 "첨가물 제7호"라 칭한다.

(4) 최종 함유량으로서 100μg/ml의 오보매크로 글로 블린을 함유하는 MEM배지를 첨가물 제4호를 사용하여 제조했다.

이것을 배지 제1호라 칭한다.

(5) RPMI-1640배지를 사용하여 하기 각 성분이 최종종도를 조절할 수 있도록 첨가했다.

DLD(트리글리세리드양으로서) 50μg/ml

카탈라아제 10^-8M

인슈린 5μg/ml

트랜스패린 5μg/ml

셀린 5μg/ml

BSA 1mg/ml

오보매크로 글로블린산 200μg/ml

이것은 배지 제2호라 칭한다.

(6) RPMI-1640을 사용하여 100ml의 배지를 제조하고, 치종 농도를 얻기 위하여 하기 각 성분이 첨가됐다.

LDL(트리글리세리드양으로서) 250μg/ml

카탈라아제 5×10^-7M

인슈린 25×10^-7M

트랜스패린 25μg/ml

셀린 25μg/ml

BSA 5μg/ml

오보매크로 글로블린산 1mg/ml

이와같이 준비된 배지 10ml에 , 맥코이 5A 40ml, L-15 40ml 또는, 맥코리 5A+L-15(1 : 1)를 가하여 배지를 각각 제조했다.

이것들은 배지 제3호, 배지 제4호 그리고, 배지 제5호록 각각 칭한다.

[실험예 4]

10％의 소태아 혈청으로 RPMI-1640에서 2차 배양된 다우디(Daudi)를 17일간 배지 제2호에서 배양시켰다.

2×16⁶셀/ml를 가지도록 조절했고, 각 웰이 0.5ml 인 6-웰 플레이이트 내에 넣고, 배지 제2호, 제3호, 제4호 혹은 제5호의 최종량으로 2.5ml에서 37℃에서 이산화탄소가스 배양기내에서 4일간 배양시켰다.

4일후의 생존한 세포수는 상술한 실험예 2-(2)와 같은 방법으로 측정했다.

그 결과는 제2표에 표시한다.

배 지 세포수(x10⁵/ml)

배지 제2호 8.0

배지 제3호 9.1

배지 제4호 6.2

배지 제5호 8.7

상술한 실험에 있어서, 추가적인 여러 실험은 기지의 성장인자 [미트제닉(mitogenic)자극인자 : MGF,섬유아세포 성장인자 : FGF, 표피성장인자 : FGF, 섬유아세포 성장인자 : FGF, 표피성장인자 : FGF, 에탄올아민, 트리이오도티로닌 : T3 및 하이드로코오티조운(hydroc0rtisome)]를 각 배지에 첨가함으로서 실시된다.

그러나, 추가적인 효과는 인정되지 않고, 이와같이 하여 본 발명에 따른 배지는 충분한 배양 조건을 설정하였음을 발견했다.

[실험예 5]

(1) 1×10⁵/ml로 조절된 QG-90을 24웰 플레이트내에서 배지 제2호를 사용하여 배양시켰다.

배양 10일후에 누클레오 DNA량은 EB방법(JIMRO FBT, 저팬 임뮤노리서치사 제)를 사용하여 측정하고, 살아 있는 세포수는 실험예2-(2)와 같은 방법으로 측정하고, 미토콘드리아 활성도(대사 성과)은 각각실험예 1-(1)와 동일한 방법으로 MTT법으로 측정했다.

10％ 소태아 혈청을 가는 RPMI-1640을 사용하여 비교실험을 했다.

그 결과 EB방법에 의한 누클레오 DNA양은 실제적으로 두개의 배지와 동일하였다.

MTT값과 생활력(살아 있는 세포의 수자에 관한 퍼센테이지)에 관한 결과는 제9도에 표시한다.

이도에서 더 바람직한 배양조건은 소태아 혈청이 배지에 첨가된 것과 비교한 본 발명에 다른 배지에 의하여 설정된다.

배지에 첨가된 소태아 혈청내에서의 생활력의 측정에 있어서는 세포는 실질적인 두께를 가지지 않으며, 현미경 관찰에서 크기가 감소하고, 겨우 살아 있는 세포로 간주된다. 그러나, 그들은 트리판블루로 염색되지 않기 대문에 살아 있는 세포로 계산되는 것이다.

(2) 이 실험은 MKN-45(단백질 핵산 효소 23,6, P697-711(1978))의 사용을 제외하고는 상술한 (1)과 동일한 방법으로 실시했거, 0.5×10⁵/ml로 조절하고, 14일만에 측정했다.

그 결과는 제도에 표시하였다.

[실험예 6]

QG-90, 디우디 및 KATO-111(Jpm·j·Exp·Med…48,61(1978))등을 배지 제2호를 사용하여 2차 배향시켰다.

KATO-111에 관한 결과는 제11도에 표시한다.

이 도에서 세로좌표는 상술한 실험예 2-(2)와 동일한 방법으로 측정한 살아 있는 세포의 수를 가르킨다.

디우디의 결과는 12도에 표시한다.

QG-90은 제13도에 표시한다.

이를 도면에서 세로좌표는 살아 있는 세포수의 측정을 표시한다.

Claims

오보매크로글로블린을 함유하는 세포배양에 사용되는 첨가물.
오보매크로글로블린양을 0.1μg~1mg/ml함유하는 세포배양에 사용하는 첨가물.
제1황에 있어서, 노른자(Tolk)LDL 트랜스페린, 인슈린, 셀렌, 알부민과 카탈라아제로 구성되는 그룹에서 선정된 성분중에서 최소한 하나를 함유하는 세포배양에 사용되는 첨가물.
제1항에 있어서, 각각 하기와 같은 중량부의 비율로 이루어진 세포배양에 사용되는 첨가물.

성분 중량부

오보매크로글로블린 1-100

노른자 LDL(트리글리 세리드로서) 0.1-500

카탈라아제 2.4×10^-6-24

알부민 10-10,000

인슈린 1-100

트랜스페린 1-100

셀렌 0.001-0.12
CEM, CMRL-1066, DM-160, 이글스(Eagle'S)MEN, 고압 MEN, 피셔(Fisher's)배지, F-10, F-12, L-15, NCTC-109, RPMI-1640 및 맥코이(Mccoy's)5A로 구성되는 구릅에서 선택한 세포배양용기본배지에 대하여 0.1ug 내지 1mg/ml의 오보매크로 글로블린을 함유하는 무혈청 배양용 배지.
제5항에 있어서, 하기 성분으로 구성되는 그룹에서 선택한 최소한 한 성분을 함유하는 배지

노른자 LDL(트리글리세리드양으로서) 0.1-500μg/ml

트랜스페린 1-100μg/ml

인슈린 1-100g/ml

셀렌 1-100mg/ml

알부민 10-10mg/ml

카탈라아제 1×10^-14-1×10^-7M
제5항 또는, 6항의 어느 한 항에 기재된 배지에서 세포가 배양되는 무혈청 조건하에서의 세포배양법.