CN106559994A - 层粘连蛋白片段的细胞培养基质活性增强方法 - Google Patents

层粘连蛋白片段的细胞培养基质活性增强方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新的技术，其在使用包被有层粘连蛋白片段的细胞培养器具的细胞培养方法中，即使使用低于推荐包被浓度的包被浓度，也能够进行与以推荐浓度进行包被时同等的细胞培养。本发明为一种活性增强方法，其为增强具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：使含有层粘连蛋白片段或其改造体、及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触，在培养面包被层粘连蛋白片段或其改造体，包被溶液含有形成低于0.5μg/cm2的包被浓度的量的层粘连蛋白片段或其改造体，且其它蛋白质浓度为50μg/mL以上。

Description

层粘连蛋白片段的细胞培养基质活性增强方法
技术领域
本发明涉及层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性增强方法、使用包被有活性增强了的层粘连蛋白片段或其改造体的细胞培养器具的哺乳动物细胞的培养方法、以及可以在这些方法中使用的包被溶液。
背景技术
人ES细胞、人iPS细胞等人多能干细胞在再生医疗中的应用受到全世界的关注。为了将人多能干细胞应用于再生医疗，需要开发出对这些干细胞进行安全且稳定的培养、扩增的培养技术。特别是，在不使用饲养细胞(无饲养细胞)且不含来自异种动物的成分的(无异源体系)条件下的稳定培养法的开发成为紧迫的课题。
目前为止，已经开发了玻连蛋白、层粘连蛋白α5β1γ1(以下记作“层粘连蛋白511”)、层粘连蛋白α5β2γ1(以下记作“层粘连蛋白521”)等满足无饲养细胞且无异源体系条件的多种培养基质。本发明人们已经阐明：其中，仅含有层粘连蛋白511的整联蛋白结合位点的重组层粘连蛋白511E8片段(以下记作“层粘连蛋白511E8”)对人多能干细胞具有非常强的粘附活性，是比此前开发的所有基质都优良的培养基质(参照专利文献1、非专利文献1)。此外，通过将层粘连蛋白511E8用于培养基质，能够在无饲养细胞条件下连续地进行从人iPS细胞的建立至扩大培养、分化诱导的所有工序(非专利文献2)。
为了以层粘连蛋白511E8为基质来培养细胞，需要在培养器具的培养面上包被层粘连蛋白511E8。但是，层粘连蛋白511E8等满足无饲养细胞条件的培养基质大多是使用基因重组技术制备的重组蛋白，因此培养器具的包被中使用的重组蛋白的费用在人多能干细胞的培养中成为沉重的经济负担。在培养人ES细胞或人iPS细胞时，使用的层粘连蛋白511E8的包被浓度通常为0.25μg/cm2～1.0μg/cm2，例如将标准的直径为35mm的培养皿(培养面积：9.6cm2)用层粘连蛋白511E8包被时，每1个培养皿使用2.4μg～9.6μg的层粘连蛋白511E8。层粘连蛋白511E8为层粘连蛋白α5链、β1链及γ1链的各C末端区域的异三聚体，由于分子内含有多个二硫键，从而难以利用使用大肠杆菌等原核生物的表达系统制造重组层粘连蛋白511E8，需要使用制造成本更高的动物细胞、昆虫细胞的表达系统来制造。为了将层粘连蛋白511E8作为人多能干细胞用的无饲养细胞培养基质广泛普及，不仅强烈要求通过制造方法的改良来降低层粘连蛋白511E8的制造成本，而且强烈要求开发通过增强层粘连蛋白511E8的活性从而能够以更少的包被量进行人多能干细胞的培养、可以降低培养器具的包被所需要的费用的新的层粘连蛋白511E8的激活技术。
此外，为了在国内外普及使用层粘连蛋白511E8的培养方法，需要开发即使操作不熟练包被浓度的偏差也小、能够容易地进行包被操作的制品。现在，培养器具的包被中使用的层粘连蛋白511E8是以冷冻干燥品形式销售的(商品名：iMatrix-511、株式会社Nippi)。为了将其作为培养基质使用，通常制备成为200～1000μg/mL的溶解有冷冻干燥层粘连蛋白511E8的层粘连蛋白511E8保存液，将其分装并冷冻保存。在对培养器具进行包被时，将层粘连蛋白511E8保存液解冻，用PBS等稀释成目标包被浓度后，叠加到培养器具的培养面进行包被。因此，存在在冷冻干燥品溶解时、保存液稀释时产生人为误差的风险，难以在每次包被操作中完全避免产生包被浓度偏差。如果能够将预先稀释成目标包被浓度的层粘连蛋白511E8溶液用于每次的包被操作，则即使是经验少的操作者也可以进行稳定的包被操作，容易避免包被浓度的偏差。此外，由于可以省略层粘连蛋白511E8保存液的解冻和稀释的操作，因此可以大幅缩短操作时间。因此，要求开发出能够长期稳定地保存而不损害活性、不需要在使用时制备的层粘连蛋白511E8溶液。
作为与本发明类似的现有技术，专利文献2公开了如下方法：在将全长的层粘连蛋白511固定的条件下培养细胞的方法中，使层粘连蛋白511对细胞的活性提高。具体而言，专利文献2公开了“一种提高层粘连蛋白511对细胞的活性的方法，其中，包括在固定下述多肽和/或肽与层粘连蛋白511的条件下对哺乳类细胞进行培养的步骤，所述多肽和/或肽选自由血清、血清白蛋白、前白蛋白、免疫球蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)、触珠蛋白(Hp)、α2-巨球蛋白(α2-M)、甲胎蛋白(AFP)、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白(RBP)或脂连蛋白这些除胞外基质蛋白以外的血中蛋白质以及明胶、属于肿瘤坏死因子(TNF)家族的蛋白质、蛋白胨组成的组”(权利要求7)。然而，专利文献2中记载的发明是关于全长的层粘连蛋白511的发明，从所组合使用的多肽的浓度提高时不发挥活性提高效果来看，是完全不同于本发明的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2011/043405号
专利文献2：国际公开WO2013/047763号
非专利文献
非专利文献1：Miyazaki，T.et al.，Nature Commun.3：1236，doi：10.1038/ncomms2231，2012
非专利文献2：Nakagawa，M.et al.，Scientific Reports，4：3594，doi：10.1038/srep03594，2014
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供一种新颖的技术，其在使用包被有层粘连蛋白片段或它们的改造体的细胞培养器具的细胞培养方法中，即使使用比推荐的包被浓度低的包被浓度，也能够进行与以推荐浓度进行包被时同等的细胞培养。进而，本发明的课题在于，提供一种在细胞培养器具上包被层粘连蛋白片段或它们的改造体时使用的、无需在使用时制备、能够长期稳定地冷藏保存的包被溶液。
用于解决问题的方法
为了解决上述课题，本发明包括以下的发明。
[1]一种活性增强方法，其为增强具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：使含有前述层粘连蛋白片段或其改造体、及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触，在培养面包被前述层粘连蛋白片段或其改造体，前述包被溶液含有形成低于0.5μg/cm2的包被浓度的量的前述层粘连蛋白片段或其改造体，且前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为50μg/mL以上，前述对哺乳动物培养细胞的活性为选自对细胞表面的粘附受体的结合活性、细胞粘附活性、细胞增殖活性及集落形成活性中的至少一种。
[2]根据前述[1]所述的活性增强方法，其特征在于，前述包被溶液的前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为200μg/mL以上。
[3]根据前述[2]所述的活性增强方法，其特征在于，前述包被溶液的前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为500μg/mL以上。
[4]根据前述[1]～[3]中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的分子量为10000以上。
[5]根据前述[4]所述的活性增强方法，其特征在于，前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质为选自由明胶、血清白蛋白、转铁蛋白、髓鞘碱性蛋白、β-乳球蛋白、谷胱甘肽S-转移酶及胶原蛋白组成的组中的1种以上。
[6]根据前述[1]～[5]中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，层粘连蛋白片段来自选自层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α4β1γ1及层粘连蛋白α2β1γ1中的至少1种。
[7]根据前述[1]～[6]中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，层粘连蛋白片段为层粘连蛋白E8片段。
[8]一种培养方法，其为使用包被有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体的细胞培养器具的哺乳动物细胞的培养方法，其特征在于，前述细胞培养器具通过使含有前述层粘连蛋白片段或其改造体、及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触而制作，前述包被溶液含有形成低于0.5μg/cm2的包被浓度的量的前述层粘连蛋白片段或其改造体，且前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为50μg/mL以上。
[9]根据前述[8]所述的培养方法，其特征在于，前述包被溶液的前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为200μg/mL以上。
[10]根据前述[8]或[9]所述的培养方法，其特征在于，前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的分子量为10000以上。
[11]根据前述[8]～[10]中任一项所述的培养方法，其特征在于，层粘连蛋白片段来自选自层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α4β1γ1及层粘连蛋白α2β1γ1中的至少1种。
[12]根据前述[8]～[11]中任一项所述的培养方法，其特征在于，层粘连蛋白片段为层粘连蛋白E8片段。
[13]一种包被溶液，其为用于在细胞培养器具的培养面包被层粘连蛋白片段或其改造体的溶液，其特征在于，含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体、及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质，前述层粘连蛋白片段或其改造体的浓度为5μg/mL以下，前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的浓度为50μg/mL以上。
[14]根据前述[13]所述的包被溶液，其特征在于，对前述层粘连蛋白片段或其改造体的浓度进行了调整，以使细胞培养器具的培养面中的层粘连蛋白片段或其改造体的包被浓度成为低于0.5μg/cm2的包被浓度。
[15]根据前述[13]或[14]所述的包被溶液，其特征在于，前述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的分子量为10000以上。
[16]根据前述[13]～[15]中任一项所述的包被溶液，其特征在于，前述层粘连蛋白片段为层粘连蛋白E8片段。
发明效果
根据本发明，可以提供增强具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性的方法。如果使用本发明的活性增强方法，则即使以比推荐的层粘连蛋白片段的包被浓度低的包被浓度，也能够进行与以推荐浓度进行包被时同等的细胞培养。此外，根据本发明，可以提供用于对细胞培养器具进行包被的含有层粘连蛋白片段或其改造体的包被溶液。本发明的包被溶液无需在使用时制备、能够长期稳定地保存，因此可以避免人为误差，即使操作不熟练也可以以均匀的包被浓度对细胞培养器具进行包被。
附图说明
图1为示出评价由人血清白蛋白引起的层粘连蛋白511E8的整联蛋白结合活性的增强作用的结果的图。
图2为示出评价由明胶引起的层粘连蛋白511E8的整联蛋白结合活性的增强作用的结果的图。
图3为示出评价由人血清白蛋白引起的层粘连蛋白521E8的整联蛋白结合活性的增强作用的结果的图。
图4为示出评价由明胶引起的层粘连蛋白521E8的整联蛋白结合活性的增强作用的结果的图。
图5为示出用添加了人血清白蛋白或明胶而包被层粘连蛋白511E8的培养板培养人iPS细胞并实施碱性磷酸酶染色的结果的图。
图6为示出用添加了人血清白蛋白或明胶而包被层粘连蛋白521E8的培养板培养人iPS细胞并实施碱性磷酸酶染色的结果的图。
图7为示出如下结果的图：将添加有明胶的层粘连蛋白511E8的包被溶液装入玻璃瓶中在4℃下保存，对保存16周后的整联蛋白结合活性与在使用时制备的层粘连蛋白511E8片段的包被溶液的整联蛋白结合活性进行比较。
图8为示出如下结果的图：将添加有人血清白蛋白的层粘连蛋白521E8的包被溶液装入聚丙烯制管中在4℃下保存13周后，使用保存后的包被溶液或在使用时制备的包被溶液对细胞培养用24孔板进行包被并培养人iPS细胞6天，实施碱性磷酸酶染色。
图9为示出如下结果的图：将添加有人血清白蛋白的层粘连蛋白511E8的包被溶液装入聚丙烯制管中在4℃下保存12个月后，使用保存后的包被溶液或在使用时制备的包被溶液对细胞培养用24孔板进行包被并培养人iPS细胞1周，实施碱性磷酸酶染色。
图10为示出如下结果的图：将添加有明胶的层粘连蛋白511E8的包被溶液装入聚丙烯制管中在4℃下保存12个月后，使用保存后的包被溶液或在使用时制备的包被溶液对细胞培养用24孔板进行包被并培养人iPS细胞1周，实施碱性磷酸酶染色。
图11为示出如下结果的图：将添加有人血清白蛋白的层粘连蛋白511E8的包被溶液装入聚丙烯制管中在4℃下保存12个月后，使用保存后的包被溶液或在使用时制备的包被溶液对细胞培养用6孔板进行包被并培养人iPS细胞1周，进行FACS分析。
图12为示出如下结果的图：将添加有明胶的层粘连蛋白511E8的包被溶液装入聚丙烯制管中在4℃下保存12个月后，使用保存后的包被溶液或在使用时制备的包被溶液对细胞培养用6孔板进行包被并培养人iPS细胞1周，进行FACS分析。
图13为示出如下结果的图：将添加有人血清白蛋白的层粘连蛋白521E8的包被溶液装入聚丙烯制管中在4℃下保存12个月后，使用保存后的包被溶液或在使用时制备的包被溶液对细胞培养用24孔板进行包被并培养人iPS细胞1周，实施碱性磷酸酶染色。
图14为示出如下结果的图：将添加有明胶的层粘连蛋白521E8的包被溶液装入聚丙烯制管中在4℃下保存12个月后，使用保存后的包被溶液或在使用时制备的包被溶液对细胞培养用24孔板进行包被并培养人iPS细胞1周，实施碱性磷酸酶染色。
图15为示出如下结果的图：将添加有人血清白蛋白的层粘连蛋白521E8的包被溶液装入聚丙烯制管中在4℃下保存12个月后，使用保存后的包被溶液或在使用时制备的包被溶液对细胞培养用6孔板进行包被并培养人iPS细胞1周，进行FACS分析。
图16为示出如下结果的图：将添加有明胶的层粘连蛋白521E8的包被溶液装入聚丙烯制管中在4℃下保存12个月后，使用保存后的包被溶液或在使用时制备的包被溶液对细胞培养用6孔板进行包被并培养人iPS细胞1周，进行FACS分析。
图17为示出评价由人血清白蛋白引起的层粘连蛋白211E8的整联蛋白结合活性的增强作用的结果的图。
图18为示出评价由人血清白蛋白引起的层粘连蛋白411E8的整联蛋白结合活性的增强作用的结果的图。
图19为示出评价由人血清白蛋白引起的层粘连蛋白片段改造体(在层粘连蛋白511E8的N末端部融合有人串珠蛋白聚糖的结构域I～III的改造体)的整联蛋白结合活性的增强作用的结果的图。
图20为示出评价由人血清白蛋白引起的层粘连蛋白片段改造体(层粘连蛋白511E8的C末端部融合有人串珠蛋白聚糖的结构域I的改造体)的整联蛋白结合活性的增强作用的结果的图。
具体实施方式
为了在干燥状态下长期稳定地维持包被到细胞培养器具上的层粘连蛋白片段的活性而进行技术开发的过程中，本发明人们发现，通过同时包被相对于层粘连蛋白片段的包被量大量过量的除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质(例如明胶、牛血清白蛋白、人血清白蛋白等，以下记作“其它蛋白质”)，层粘连蛋白片段因干燥而导致的活性降低得到抑制，可以维持与未干燥包被状态同等的活性(PCT/JP2014/062449)。进而，本发明人们发现，如果将层粘连蛋白片段与大量过量的其它蛋白质一起进行包被，则不仅由干燥导致的失活得到抑制，在包被更少量的层粘连蛋白片段时，层粘连蛋白片段的整联蛋白结合活性得到增强，同时在层粘连蛋白片段上的人iPS细胞的增殖亢进。
具体而言，本发明人们发现，将层粘连蛋白511E8或层粘连蛋白521E8以低于0.5μg/cm2(非专利文献2中记载的推荐的包被浓度)的浓度单独包被时，整联蛋白结合活性、人iPS细胞的集落形成率呈包被浓度依赖性地降低，但如果与大量过量的其它蛋白质一起进行包被，则即使以0.5μg/cm2的一半以下的浓度包被层粘连蛋白片段，也能够维持与0.5μg/cm2的情况同等的整联蛋白结合活性以及人iPS细胞的增殖和集落形成率。
根据常识会认为，如果同时包被大量过量的明胶、血清白蛋白等，则它们会拮抗性地抑制层粘连蛋白片段向细胞培养器具的吸附，结果层粘连蛋白片段的包被显著受损。专利文献2公开的技术中已经明确示出了这样的封闭效果。具体而言，专利文献2的段落[0086]及图1A中示出了如下实验结果：在96孔板上包被重组层粘连蛋白511(Biolamina公司制)和人血清白蛋白(3.13～100μg/mL)并培养大鼠干细胞株(BRL)，结果人血清白蛋白浓度超过12.5μg/mL时，细胞粘附活性比单独包被层粘连蛋白511时降低。该结果强烈启示了人血清白蛋白浓度超过12.5μg/mL时，由于人血清白蛋白的吸附，层粘连蛋白511的吸附受到抑制。
另一方面，在本申请发明中，即使在大量过量的明胶、血清白蛋白共存下包被层粘连蛋白片段，也未观察到整联蛋白结合活性的降低，认为层粘连蛋白片段的包被量基本不受影响。进而，令人惊讶的是，得到了层粘连蛋白片段的包被浓度低于0.5μg/cm2时其对哺乳动物细胞的活性增强这一预料不到的结果。因此可明确：虽然机制不清楚，但本申请发明和专利文献2公开的发明是完全不同的技术，基于专利文献2公开的发明无法容易地想到本申请发明。
进而，本发明人们发现，使已稀释成包被中使用的浓度的层粘连蛋白片段与大量过量的其它蛋白质共存时，溶液中的层粘连蛋白片段的活性能够稳定地维持而不会降低。根据经验可知，通常，将稀释了的蛋白质溶液用玻璃瓶等容器保存时，由于蛋白质吸附到容器的表面，从而溶液中的蛋白质有效浓度降低。实际上，本发明人们观察到，在不使大量过量的其它蛋白质共存的条件下保存层粘连蛋白片段时，溶液中的层粘连蛋白片段的活性随着时间而降低。本发明人们基于上述的新见解，完成了无需在使用时进行稀释等操作、从冰箱取出后可以立即用于包被、并且能够长期稳定地冷藏保存的包被溶液。
〔活性增强方法〕
本发明提供具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性增强方法。对哺乳动物培养细胞的活性是指作为哺乳动物细胞的培养基质的活性，包括对整联蛋白等细胞表面的粘附受体的结合活性、细胞粘附活性、细胞增殖活性、集落形成活性等。
本发明的活性增强方法包括如下步骤：使含有层粘连蛋白片段或其改造体、及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质(其它蛋白质)的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触，在培养面包被前述层粘连蛋白片段或其改造体。细胞培养器具只要可以用于哺乳动物细胞的培养则没有特别限定，优选可以用于哺乳动物的干细胞的培养的细胞培养器具，更优选可以用于人的干细胞的培养的细胞培养器具，进一步优选可以用于人多能干细胞的培养的细胞培养器具。细胞培养器具不限于培养皿等容器状的器具，也可以为平面状、珠状的器具。具体而言，可以列举例如：玻璃制或塑料制的培养皿、培养烧瓶、多孔板、培养玻片、微载体、聚偏氟乙烯膜等聚合物膜等。
层粘连蛋白为由α链、α链及γ链这3条亚基链构成的异三聚体分子。已知α链有α1～α5这5种，β链有β1～β3这3种，γ链有γ1～γ3这3种。通过它们的组合，存在至少12种以上的异形体。层粘连蛋白片段是指含有形成异三聚体的α链、β链及γ链中的至少1个以上比全长短的片段的分子。本发明中使用的层粘连蛋白片段优选为形成了异三聚体的层粘连蛋白片段。层粘连蛋白片段形成了异三聚体可以通过下述方式确认：将层粘连蛋白片段供于SDS-PAGE并检测条带数、或测定凝胶过滤色谱的洗脱位置等。
本发明中使用的层粘连蛋白片段优选具有整联蛋白结合活性。更优选为具有整联蛋白结合活性且形成了异三聚体的层粘连蛋白片段。作为这样的层粘连蛋白片段，可以优选使用层粘连蛋白E8片段(以下记作“层粘连蛋白E8”)。层粘连蛋白E8是将小鼠层粘连蛋白α1β1γ1(以下记作“小鼠层粘连蛋白111”)用弹性蛋白酶消化而得到的片段中被鉴定为具有较强的细胞粘附活性的片段(Edgar D.，Timpl R.，Thoenen H.The heparin-bindingdomain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth andneuronal survival.EMBO J.，3：1463-1468，1984.、Goodman SL.，Deutzmann R.，von derMark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promotenonneuronal cell adhesion and spreading.J.Cell Biol.，105：589-598，1987.)。推测对除小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白用弹性蛋白酶进行消化时也存在与小鼠层粘连蛋白111E8相当的片段，但还没有将除小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白用弹性蛋白酶消化并分离、鉴定E8的报告。因此，本发明中使用的层粘连蛋白E8并不要求为层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物，只要为具有与小鼠层粘连蛋白111E8同样的细胞粘附活性、具有同样的结构、具有同程度的分子量的层粘连蛋白的片段即可。
对成为层粘连蛋白片段或其改造体所具有的整联蛋白结合活性的对象的整联蛋白的种类没有特别限定，优选为整联蛋白α6β1、整联蛋白α6β4、整联蛋白α3β1、整联蛋白α7β1。作为具有与这些整联蛋白的结合活性的层粘连蛋白片段，优选为来自选自层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白411、层粘连蛋白421、层粘连蛋白311、层粘连蛋白321、层粘连蛋白332、层粘连蛋白211、层粘连蛋白221、层粘连蛋白111及层粘连蛋白121中的至少1种。更优选为来自选自层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白411及层粘连蛋白211中的至少1种的层粘连蛋白片段，进一步优选为来自选自层粘连蛋白511及层粘连蛋白521中的至少1种的层粘连蛋白片段。层粘连蛋白片段具有整联蛋白结合活性可以通过使用了作为结合对象的整联蛋白的固相结合分析等来确认。
已知人干细胞、特别是人多能干细胞较多表达整联蛋白中的α6β1(Miyazaki T，Futaki S.，Hasegawa K.，Kawasaki M.，Sanzen N.，Hayashi M.，Kawase E.，SekiguchiK.，Nakatsuji N.，Suemori H.Recombinant human laminin isoforms can support theundifferentiated growth of human embryonic stemcells.Biochem.Biophys.Res.Commun.，375：27-32，2008)。整联蛋白α6β1虽然与各种层粘连蛋白异形体结合，但尤其与含有α5链的层粘连蛋白511和层粘连蛋白521非常强地结合(Taniguchi Y.，Ido H.，Sanzen N.，Hayashi M.，Sato-Nishiuchi R.，Futaki S.，Sekiguchi K.The C-terminal region of laminin βchains modulates the integrinbinding affinities of laminins.J.Biol.Chem.，284：7820-7831，2009)，因此来自选自层粘连蛋白511及层粘连蛋白521中的至少1种的层粘连蛋白片段特别优选作为人干细胞的培养基质使用。
对层粘连蛋白片段的来源没有特别限定，可以使用来自各种生物的层粘连蛋白片段。优选为来自哺乳动物的层粘连蛋白片段。作为哺乳动物，可以列举例如：人、小鼠、大鼠、牛、猪等，但不被限定。其中，特别优选使用来自人的层粘连蛋白片段。为了得到人的再生医疗材料而培养人干细胞时，要求满足无异源体系条件、即从培养体系排除了来自异种生物的成分的培养环境，因此优选使用来自人的层粘连蛋白片段。
层粘连蛋白片段可以为天然型，也可以为在维持其生物学活性的状态下1个或1个以上的氨基酸残基被修饰的修饰型。对层粘连蛋白片段的制造方法没有特别限定，例如可以列举：将全长层粘连蛋白用弹性蛋白酶等蛋白水解酶消化，并分离、纯化目标片段的方法；以重组蛋白的形式来制造的方法等。从制造量、品质的均匀性、制造成本等观点出发，优选以重组蛋白的形式来制造。需要说明的是，全长层粘连蛋白例如可以通过如下的方法来制造：从层粘连蛋白高表达细胞进行纯化的方法、以重组蛋白的形式来制造的方法(Hiroyuki Ido，Kenji Harada，Sugiko Futaki，Yoshitaka Hayashi，Ryoko Nishiuchi，Yuko Natsuka，Shaoliang Li，Yoshinao Wada，Ariana C.Combs，James M.Ervasti，andKiyotoshi Sekiguchi，“Molecular dissection of the α-dystroglycan-and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10”The Journal ofBiological Chemistry，279，10946-10954，2004.)等。
重组层粘连蛋白片段可以通过使用公知的基因重组技术来制造。作为重组层粘连蛋白、重组层粘连蛋白片段的制造方法，例如可以通过如下方法制造：分别获取编码α链、β链及γ链的各全长蛋白或部分蛋白的DNA，将其分别插入表达载体，将所得到的3种表达载体共导入合适和宿主细胞并使其表达，通过公知方法来纯化形成了三聚体的蛋白质。作为重组层粘连蛋白E8的制造方法，可以列举例如：Ido等(Hiroyuki Ido，Aya Nakamura，ReikoKobayashi，Shunsuke Ito，Shaoliang Li，Sugiko Futaki，and Kiyotoshi Sekiguchi，“The requirement of the glutamic acid residue at the third position from thecarboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins”TheJournal of Biological Chemistry，282，11144-11154，2007.)的方法，但不受该方法限定。
编码构成主要的哺乳动物的层粘连蛋白的α链、β链、γ链的基因的碱基序列信息和各链的氨基酸序列信息可以从公知的数据库(GenBank等)获取。对于包括人在内的主要的哺乳动物，表1示出构成层粘连蛋白的各链的登录号。来自这些以外的各种生物的层粘连蛋白构成链的碱基序列信息及氨基酸序列信息也同样可以从公知的数据库(GenBank等)获取。
[表1]
氨基酸序列 碱基序列
人层粘连蛋白α1链 NP_005550 NM_005559
人层粘连蛋白α2链 NP_000417 NM_000426
人层粘连蛋白α3链 NP_000218 NM_000227
人层粘连蛋白α4链 NP_002281 NM_002290
人层粘连蛋白α5链 NP_005551 NM_005560
人层粘连蛋白β1链 NP-002282 NM_002291
人层粘连蛋白β2链 NP_002283 NM_002292
人层粘连蛋白β3链 NP_000219 NM_000228
人层粘连蛋白γ1链 NP_002284 NM_002293
人层粘连蛋白γ2链 NP_005553 NM_005562
人层粘连蛋白γ3链 NP_006050 NM-006059
小鼠层粘连蛋白α5链 NP_001074640 NM-001081171
小鼠层粘连蛋白β1链 NP_032508 NM_008482
小鼠层粘连蛋白γ1链 NP-034813 NM_010683
大鼠层粘连蛋白α5链 NP_001178538 NM_001191609
大鼠层粘连蛋白β1链 NP_001100191 NM-001106721
大鼠层粘连蛋白γ1链 NP_446418 NM_053966
层粘连蛋白E8是从α链的C末端片段除去球形结构域4和5后的片段(以下记作“α链E8”)、β链的C末端片段(以下记作“β链E8”)及γ链的C末端片段(以下记作“γ链E8”)形成三聚体后的片段，三聚体的分子量为约150～约170kDa。α链E8通常由约770个氨基酸构成，N末端侧的约230氨基酸与三聚体形成有关。B链E8通常由约220～约230个氨基酸构成。γ链E8通常由约240～约250个氨基酸构成。γ链E8的C末端部起第3位的谷氨酸残基对层粘连蛋白E8的细胞粘附活性是必须的(Hiroyuki Ido，Aya Nakamura，Reiko Kobayashi，ShunsukeIto，Shaoliang Li，Sugiko Futaki，and Kiyotoshi Sekiguchi，“The requirement ofthe glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini ofthe laminin γ chains in integrin binding by laminins”The Journal ofBiological Chemistry，282，11144-11154，2007.)。
作为本发明中使用的层粘连蛋白片段的改造体，可以列举例如：具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段与细胞粘附分子或增殖因子结合分子形成了嵌合分子的改造层粘连蛋白(参照国际公开公报第2012/137970号)。作为细胞粘附分子，优选例如：与整联蛋白结合的细胞粘附分子(纤连蛋白、胶原蛋白、玻连蛋白、肾连蛋白、骨桥蛋白、MAEG、生腱蛋白、SVEP1、TGF-β1潜在相关肽(TGF-β1 latency associated peptide)、TGF-β3潜在相关肽、EMILIN-1、EMILIN-2等)、与膜结合型蛋白聚糖结合的细胞粘附分子(纤连蛋白、玻连蛋白、肾连蛋白、层粘连蛋白等)、与盘状结构域受体结合的细胞粘附分子、与肌营养不良聚糖结合的细胞粘附分子(层粘连蛋白等)、与细胞表面的糖链结合的细胞粘附分子(刀豆蛋白A(Concanavalin A)、双花扁豆凝集素(Dolichos biflorus agglutinin)、花生凝集素(Arachishypogaea agglutinin)、蓖麻凝集素(Ricinus communis agglutinin)、麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin)等)。
作为增殖因子结合分子，优选例如：串珠蛋白聚糖、聚集蛋白、XVIII型胶原蛋白、多配体聚糖1～4、磷脂酰肌醇聚糖1～6等硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、潜在TGF-β结合蛋白1～4等。
具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段与细胞粘附分子或增殖因子结合分子的嵌合分子可以通过使用公知的基因重组技术以重组蛋白形式来制造。公知的细胞粘附分子及增殖因子结合分子的碱基序列信息及氨基酸序列信息可以从公知的数据库(GenBank等)获取。
本发明的活性增强方法的特征在于，使含有层粘连蛋白片段或其改造体(以下记作“层粘连蛋白片段等”)、及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质(其它蛋白质)的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触，在培养面包被层粘连蛋白片段等。其它蛋白质不受限定，任意蛋白质均可用于本发明中。其它蛋白质优选为水溶性蛋白质。对其它蛋白质的分子量没有特别限定，分子量优选为10000以上。其它蛋白质的分子量更优选为15000以上，进一步优选为20000以上，进一步优选为30000以上，进一步优选为40000以上，进一步优选为60000以上。
作为其它蛋白质，具体而言，可以列举例如：明胶、血清白蛋白、转铁蛋白、髓鞘碱性蛋白、β-乳球蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、丝胶蛋白、胶原蛋白等。优选明胶、血清白蛋白、转铁蛋白、髓鞘碱性蛋白、β-乳球蛋白、谷胱甘肽S-转移酶或胶原蛋白，更优选明胶、人血清白蛋白、牛血清白蛋白或转铁蛋白，进一步优选明胶或人血清白蛋白。其它蛋白质可以仅使用一种，也可以将两种以上组合使用。其它蛋白质优选使用来源于人的蛋白质。这是由于，在为了得到人的再生医疗材料而培养人干细胞时，要求满足无异源体系条件、即从培养体系排除了来自异种生物的成分的培养环境。
在使用明胶作为其它蛋白质时，可以适当使用用于细胞培养用途的公知的明胶。更优选使用医疗用途安全性已得到确认的明胶。作为医疗用途安全性已得到确认的明胶，可以列举：株式会社Nippi销售的高级明胶、中级明胶等。
包被溶液中所含的层粘连蛋白片段等的量优选为在细胞培养器具的培养面中成为低于0.5μg/cm2的包被浓度的量。更优选为包被浓度成为0.4μg/cm2以下的量，进一步优选为包被浓度成为0.3μg/cm2以下的量，进一步优选为包被浓度成为0.25μg/cm2以下的量，进一步优选为包被浓度成为0.2μg/cm2以下的量，进一步优选为包被浓度成为0.15μg/cm2以下的量，进一步优选为包被浓度成为0.125μg/cm2以下的量，进一步优选为包被浓度成为0.1μg/cm2以下的量。对下限没有特别限定，优选为0.01μg/cm2以上，更优选为0.05μg/cm2以上。
本说明书中，包被浓度为包被在细胞培养器具的培养面的层粘连蛋白片段等的每单位面积(1cm2)的重量。因此，包被浓度由细胞培养器具的培养面的面积(培养面积)和包被溶液的液量决定。例如，将代表性的细胞培养器具的培养面积和包被所需要的液量(液体在整个培养面扩展开的标准液量)示于表2。需要说明的是，培养面积基于“胞培養&胞生物学裂品合カタ口グ(细胞培养&细胞生物学制品综合目录)2014年4月修订(康宁国际株式会社)”，包被液量为发明人们通常使用的液量。
[表2]
细胞培养器具 培养面积(cm2) 包破液量(mL)
35mm培养皿 9.6 0.9～1.5
60mm培养皿 21.3 2.2～3.3
96孔板 0.32 0.05～0.075
48孔板 0.75 0.1～0.15
24孔板 1.88 0.3～0.45
12孔板 3.38 0.5～0.8
6孔板 9.60 0.9～1.5
基于表2的数值，包被溶液的层粘连蛋白片段等的浓度优选为5.0μg/mL以下，更优选为4.5μg/mL以下，进一步优选为4.0μg/mL以下，进一步优选为3.5μg/mL以下，进一步优选为3.0μg/mL以下，进一步优选为2.5μg/mL以下，进一步优选为2.0μg/mL以下，进一步优选为1.5μg/mL以下。对下限没有特别限定，优选为0.25μg/mL以上，更优选为0.5μg/mL以上，进一步优选为1.0μg/mL以上。
包被溶液中所含的其它蛋白质的量优选为与包被溶液中所含的层粘连蛋白片段等的量相比为大量过量。换言之优选为如下的量：在与层粘连蛋白片段等同时进行包被时，根据常识认为会产生封闭效果、层粘连蛋白片段等的包被会显著受损的量。本发明的活性增强方法具有如下技术特征：即使同时包被大量过量的其它蛋白质，也不会产生预想的封闭效果，不仅如此，在层粘连蛋白片段等的包被浓度低时，其活性得到增强。
包被溶液的其它蛋白质浓度优选为包被溶液的层粘连蛋白片段等的浓度的10倍以上的浓度，更优选为20倍以上的浓度，进一步优选为30倍以上的浓度，进一步优选为40倍以上的浓度，进一步优选为50倍以上的浓度，进一步优选为60倍以上的浓度，进一步优选为70倍以上的浓度，进一步优选为80倍以上的浓度，进一步优选为90倍以上的浓度，进一步优选为100倍以上的浓度。对上限没有特别限定，在可发挥活性增强效果的范围内适当设定即可。通常，设定为包被溶液的层粘连蛋白片段等的浓度的2000倍以下。
此外，包被溶液的其它蛋白质浓度优选为50μg/mL以上，更优选为100μg/mL以上，进一步优选为150μg/mL以上，进一步优选为200μg/mL以上，进一步优选为250μg/mL以上，进一步优选为300μg/mL以上，进一步优选为350μg/mL以上，进一步优选为400μg/mL以上，进一步优选为450μg/mL以上，进一步优选为500μg/mL以上。对上限没有特别限定，在可发挥活性增强效果的范围内适当设定即可。通常，设定为5mg/mL以下，优选为1mg/mL以下。
包被溶液可以通过将想要包被的层粘连蛋白片段等及其它蛋白质以成为期望的浓度的方式溶解于合适和溶剂来制备。包被溶液中可以使用的溶剂只要为不降低蛋白质的活性的溶剂则没有特别限定，优选为水性溶剂。可以优选使用通常作为蛋白质的溶剂使用的中性的缓冲液。具体而言，可以列举：用磷酸、柠檬酸、硼酸、乙酸、三羟甲基氨基甲烷、HEPES[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸]等将pH调节至中性左右的生理盐水等。包被溶液优选进行过滤灭菌等灭菌处理。
优选包被溶液中含有全部的想要包被的蛋白质(层粘连蛋白片段等及其它蛋白质)，但也可以分别制备含有层粘连蛋白片段等的包被溶液和含有其它蛋白质的包被溶液，并在细胞培养器具的培养面上混合。
对包被操作没有特别限定，通过使包被溶液与细胞培养器具的整个培养面接触并静置或缓慢地振荡一定时间，从而可以将包被溶液中所含的蛋白质包被于细胞培养器具的培养面。在容器状的细胞培养器具的情况下，将包被溶液添加到容器内即可。在对片状或膜状的细胞培养器具的表面进行包被时，将包被溶液叠加到所包被的区域即可。对包被条件没有特别限定，可以在4℃下进行约2～18小时、或在室温～37℃下进行约0.5～6小时。经过规定时间后将添加或叠加的包被溶液除去。优选在除去包被溶液后对被包被的表面进行洗涤。对洗涤液没有特别限定，优选使用PBS等缓冲生理盐水。包被操作优选在洁净室内、洁净台内等无菌环境下进行。
包被后的细胞培养器具可以直接用于细胞的培养，也可以在包被后对包被面进行干燥。通过使包被面干燥，从而使保存细胞培养器具成为可能。对干燥方法没有特别限定，可以使用自然干燥、减压干燥等公知的方法。干燥温度只要为所包被的蛋白质不会变性或失活的温度即可，可以在室温下适当地进行。通常可以为约2℃～约40℃的范围，优选为约4℃～约37℃，更优选为约10℃～约30℃，进一步优选为约15℃～约25℃。对干燥时间没有特别限定，可以在目视无液体残存、可确认包被的表面干燥的时刻结束干燥。优选预先根据细胞培养器具的形状、包被溶液的组成、干燥方法、干燥温度等条件设定最佳干燥时间。干燥操作优选在洁净室内、洁净台内等无菌环境下进行。
在对包被的蛋白质进行干燥后，可以设置对干燥后的蛋白质进行灭菌的工序。作为灭菌方法，优选使用电子束灭菌、X射线灭菌等放射线灭菌、紫外线灭菌等。以不使用可能使蛋白质变性的灭菌法(例如环氧乙烷气体灭菌等化学灭菌、施加高热的高压蒸汽灭菌等)为好。通过设置灭菌工序，细胞培养器具的制造无需在严格的无菌条件下进行，可以抑制制造成本。对包被面进行了干燥的细胞培养器具通过进行密封包装，可以长期稳定地保存。保存温度优选为室温以下，优选在更低温度(例如约4℃)下进行保存。
通过本发明的活性增强方法，在以低于推荐的包被浓度(例如0.5μg/cm2：非专利文献2)的包被浓度包被层粘连蛋白片段等时，使已确认到层粘连蛋白片段等的单独包被时会降低的整联蛋白结合活性、细胞粘附活性、细胞增殖活性、集落形成活性等增强，能够进行与以推荐的包被浓度单独包被层粘连蛋白片段等时同等的细胞培养。通过使用本发明的活性增强方法，可以减少包被中使用的层粘连蛋白片段等的使用量，可以大幅削减包被所需要的成本。
〔培养方法〕
本发明的培养方法为应用上述本发明的活性增强方法对哺乳动物细胞进行培养的方法。即，使用与大量过量的其它蛋白质一起包被有比推荐的包被浓度低的包被浓度的层粘连蛋白片段等的细胞培养器具，对哺乳动物细胞进行培养的方法。本发明的培养方法中使用的细胞培养器具为上述本发明的活性增强方法中说明的细胞培养器具。
本发明的培养方法可以应用于任意哺乳动物细胞的培养，但优选应用于干细胞的培养。干细胞是指具有自我复制能力和多潜能性的细胞，包括成体干细胞、多能干细胞等。作为成体干细胞，可以列举：神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞等。作为多能干细胞，可以列举：ES细胞(胚胎干细胞)、iPS细胞(诱导性多能干细胞)、mGS细胞(多能生殖干细胞)、ES细胞与体细胞的融合细胞等。更优选为多能干细胞，进一步优选ES细胞、iPS细胞。另外，本发明的培养方法还可以优选应用于由上述干细胞分化的细胞的培养。由干细胞分化的细胞包括将干细胞分化诱导而成的各种细胞。即，本发明的培养方法可以优选应用于由干细胞到最终分化细胞的过程中的各种分化阶段的细胞的培养。对哺乳动物没有特别限定，可以列举：人、小鼠、大鼠、牛、猪等。其中，优选人。即，本发明的培养方法优选用于人干细胞以及由人干细胞分化的细胞的培养。另外，使用本发明的培养方法进行人干细胞或由人干细胞分化的细胞的培养时，优选使用来自人的层粘连蛋白片段或其改造体。
利用本发明的培养方法对哺乳动物细胞进行培养时，对使用的培养基没有特别限定，可以根据培养对象细胞使用推荐的公知培养基。另外，对具体的培养步骤没有特别限定，优选根据培养对象细胞按照推荐的公知培养步骤进行培养。
〔包被溶液〕
本发明提供一种包被溶液，其含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段等以及相对于层粘连蛋白片段等大量过量的其它蛋白质。本发明的包被溶液优选作为在上述本发明的活性增强方法或上述本发明的培养方法中使用的包被溶液。
作为本发明的包被溶液中所含的层粘连蛋白片段等，可以优选使用上述本发明的活性增强方法中说明的层粘连蛋白片段或其改造体。此外，作为本发明的包被溶液中所含的其它蛋白质，可以优选使用上述本发明的活性增强方法中说明的除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质(其它蛋白质)。
本发明的包被溶液中，优选层粘连蛋白片段等的浓度为5.0μg/mL以下，其它蛋白质的浓度为50μg/mL以上。层粘连蛋白片段等的浓度更优选为4.5μg/mL以下，进一步优选为4.0μg/mL以下，进一步优选为3.5μg/mL以下，进一步优选为3.0μg/mL以下，进一步优选为2.5μg/mL以下，进一步优选为2.0μg/mL以下，进一步优选为1.5μg/mL以下。对下限没有特别限定，优选为0.25μg/mL以上，更优选为0.5μg/mL以上，进一步优选为1.0μg/mL以上。
其它蛋白质浓度优选为包被溶液的层粘连蛋白片段等的浓度的10倍以上的浓度，更优选为20倍以上的浓度，进一步优选为30倍以上的浓度，进一步优选为40倍以上的浓度，进一步优选为50倍以上的浓度，进一步优选为60倍以上的浓度，进一步优选为70倍以上的浓度，进一步优选为80倍以上的浓度，进一步优选为90倍以上的浓度，进一步优选为100倍以上的浓度。对上限没有特别限定，通常设定为包被溶液的层粘连蛋白片段等的浓度的2000倍以下。
其它蛋白质浓度优选为50μg/mL以上，更优选为100μg/mL以上，进一步优选为150μg/mL以上，进一步优选为200μg/mL以上，进一步优选为250μg/mL以上，进一步优选为300μg/mL以上，进一步优选为350μg/mL以上，进一步优选为400μg/mL以上，进一步优选为450μg/mL以上，进一步优选为500μg/mL以上。对上限没有特别限定，通常为5mg/mL以下，优选为1mg/mL以下。
本发明的包被溶液优选为可以直接用于包被而不在使用时进行稀释的溶液。因此，优选调整层粘连蛋白片段等的浓度，以使细胞培养器具的培养面中的层粘连蛋白片段等的包被浓度成为低于0.5μg/cm2的包被浓度。层粘连蛋白片段等的包被浓度更优选为0.4μg/cm2以下，进一步优选为0.3μg/cm2以下，进一步优选为0.25μg/cm2以下，进一步优选为0.2μg/cm2以下，进一步优选为0.15μg/cm2以下，进一步优选为0.125μg/cm2以下，进一步优选为0.1μg/cm2以下。
包被溶液可以通过将想要包被的层粘连蛋白片段等及其它蛋白质以成为期望的浓度的方式溶解于合适的溶剂来制备。包被溶液中可以使用的溶剂只要为不降低蛋白质的活性的溶剂则没有特别限定，优选为水性溶剂。可以优选使用通常作为蛋白质的溶剂使用的中性的缓冲液。具体而言，可以列举：用磷酸、柠檬酸、硼酸、乙酸、三羟甲基氨基甲烷、HEPES[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸]等将pH调节至中性左右的生理盐水等。包被溶液优选进行过滤灭菌等灭菌处理。
就本发明的包被溶液而言，只要不妨碍本来的目的，则也可以含有除层粘连蛋白片段等、其它蛋白质、及溶剂成分以外的成分，但优选不含除层粘连蛋白片段等、其它蛋白质、及溶剂成分以外的成分。本发明的包被溶液优选以在适当的容器中收容适当的体积的方式来实施。对容器没有特别限定，可以适当使用用于蛋白质溶液的保存的公知容器。容器优选为密封容器，优选为遮光容器。此外，本发明的包被溶液优选附有示出了与进行包被的细胞培养容器相应的包被液量以及包被浓度的说明书。因此，本发明可以以含有收容于适当和容器的本发明的包被溶液、以及上述说明书的层粘连蛋白片段等的包被用试剂盒形式来实施。
本发明的包被溶液优选以密封在容器中的状态在10℃以下的温度下冷藏保存。更优选为3℃～5℃。此外，为了防止紫外线等导致的蛋白质劣化，本发明的包被溶液优选遮光保存。本发明人们已经确认，可以将本发明的包被溶液以可直接用于包被的浓度稳定地冷藏保存至少12个月，长期保存实验目前还在继续进行。
本发明的包被溶液无需在使用时制备(冷冻保存液的解冻、溶解、稀释等)、可以长期稳定地冷藏保存。因此，在使用时，只将本发明的包被溶液从冰箱取出并将规定的液量添加或者叠加到培养器具中就可直接进行包被，可以缩短操作时间且简化，这方面是极大的优点。此外，由于反复使用冷藏保存的包被溶液，因此即使进行包被操作的日期、进行包被操作的操作者有所改变，也总是可以以均匀的包被浓度对细胞培养器具进行包被。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明不受这些实施例限定。
〔人重组层粘连蛋白511E8的制作〕
人重组层粘连蛋白511E8(以下记作“511E8”)按照Ido等(Hiroyuki Ido，AyaNakamura，Reiko Kobayashi，Shunsuke Ito，Shaoliang Li，Sugiko Futaki，andKiyotoshi Sekiguchi，“The requirement of the glutamic acid residue at thethird position from the carboxyl termini of the 1amininγchains in integrinbinding by laminins”The Journal of Biological Chemistry，282，11144-11154，2007)中记载的方法如下来制作。
首先，以克隆用质粒pBluescript KS(+)(Stratagene公司)为模板，使用以下3种引物对进行PCR，分别制作在质粒的多克隆位点内的EcoRV的5’侧插入有编码6×His标签的DNA、编码HA(血凝素)标签的DNA、或编码FLAG标签的DNA的3种pBluescript KS(+)。
(i)6×His标签导入用引物
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’(正向、序列号1)
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’(反向、序列号2)
(ii)HA标签导入用引物
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’(正向、序列号3)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(反向、序列号4)
(iii)FLAG标签导入用引物
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’(正向、序列号5)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(反向、序列号4)
然后，以含有α5链、β1链、γ1链的全长碱基序列的质粒(Ido et al.，J.Biol.Chem.，279，10946-10954，2004.)为模板，使用以下的引物进行PCR，分别扩增与α5链E8(Ala2534-Ala3327)、β1链E8(Leu1561-Leu1786)、γ1链E8(Asn1362-Pro1608)相当的区域。
(iv)α5链E8片段扩增用引物
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’(正向、序列号6)
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’(反向、序列号7)
(v)β1链E8片段扩增用引物
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’(正向、序列号8)
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’(反向、序列号9)
(vi)γ1链E8片段扩增用引物
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’(正向、序列号10)
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’(反向、序列号11)
将所扩增的cDNA插入到添加了标签序列的pBluescript KS(+)的多克隆位点的EcoRV位点后，以含有编码5’侧的标签的序列的方式将所扩增的cDNA用限制酶EcoRI和HindIII切出，并插入到哺乳细胞用表达载体pSecTag2B(Invitrogen)的该位点，分别制作人α5链E8片段(N末端侧含有6×His标签)、人β1链E8片段(N末端侧含有HA标签)、人γ1链E8片段(N末端侧含有FLAG标签)的表达载体。
511E8的表达通过将所制作的各链的表达载体导入到来自人肾脏的293F细胞(由Invitrogen公司购入)而进行。对300ml的293F细胞(1.0×106个/ml)使用转染试剂293fectin(商品名、Invitrogen)及Opti-MEM(商品名、Invitrogen)同时转染各链表达载体各180μg，进行72小时培养后，回收培养液。培养液以1000×g离心10分钟，将其上清进一步以15,000×g离心30分钟，除去细胞、不溶物。在培养上清中添加5ml的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)，孵育一晚，使目标蛋白质吸附。回收Ni-NTA琼脂糖，用TBS(-)(不含Ca、Mg的Tris缓冲生理盐水)及10mM咪唑/TBS(-)洗涤后，用200mM咪唑/TBS(-)洗脱。洗脱组分利用SDS-PAGE及银染色进行确认，在洗脱出511E8的组分中添加2ml的ANTI-FLAG M2亲和凝胶(sigma)，在4℃下旋转一晚。将凝胶转移到Econo-Column，用含有1mM PMSF的TBS(-)洗涤后，用含有100μg/ml FLAG肽(sigma)的TBS(-)洗脱。将洗脱组分用银染色进行确认，与洗脱出511E8的组分合并，对TBS(-)进行透析。
〔人重组层粘连蛋白521E8的制作〕
人重组层粘连蛋白521E8(以下记作“521E8”)按照上述人重组层粘连蛋白511E8的制作方法而制作。即，将人α5链E8片段(N末端侧含有6×His标签)、人β2链E8片段(N末端侧含有HA标签)、人γ1链E8片段(N末端侧含有FLAG标签)的各表达载体转染到来自人肾脏的293F细胞，进行72小时培养后，回收培养液，与层粘连蛋白511E8同样地使用Ni-NTA琼脂糖和ANTI-FLAG M2亲和凝胶通过亲和层析进行纯化。人β2链E8片段的表达载体按照Taniguchi等(Yukimasa Taniguchi，Hiroyuki Ido，Noriko Sanzen Maria Hayashi，RyokoSato-Nishiguti，Sugiko Futaki，and Kiyotoshi Sekiguchi，“The C-terminal regionof laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins”TheJournal of Biological Chemistry，284，7820-7831，2009)中记载的方法来制备。
〔人重组层粘连蛋白211E8及411E8的制作〕
人重组层粘连蛋白211E8(以下记作“211E8”)及层粘连蛋白411E8(以下记作“411E8”)按照上述人重组层粘连蛋白511E8的制作方法来制作。即，将人α2链E8片段或者α4链E8片段(N末端侧均含有6×His标签)、人β1链E8片段(N末端侧含有HA标签)、人γ1链E8片段(N末端侧含有FLAG标签)的各表达载体转染到来自人肾脏的293F细胞，进行72小时培养后，回收培养液，与层粘连蛋白511E8同样地使用Ni-NTA琼脂糖和ANTI-FLAG M2亲和凝胶通过亲和层析进行纯化。人α2E8片段的表达载体及人α4E8片段的表达载体按照Taniguchi等(Yukimasa Taniguchi，Hiroyuki Ido，Noriko Sanzen Maria Hayashi，Ryoko Sato-Nishiguti，Sugiko Futaki，and Kiyotoshi Sekiguchi，“The C-terminal region oflamininβchains modulates the integrin binding affinities of laminins”TheJournal of Biological Chemistry，284，7820-7831，2009)中记载的方法来制备。
〔实施例1：由其它蛋白质引起的511E8的整联蛋白结合活性的增强〕
实验方法
(1)板的包被
利用含有50μg/mL或500μg/mL的人血清白蛋白(Biological Industries cat#05-720-1B；以下记作HSA)的PBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)，按照终浓度成为22nM、11nM、5.5nM、2.7nM的方式对511E8进行梯度稀释后，在96孔板(Becton，Dickinson and Company#353072、培养面积0.32cm2/孔)中加入50μL/孔，一边在4℃下缓慢地振荡一晚一边进行包被。以每单位面积的重量来表示包被量时，分别为0.5、0.25、0.125、0.0625μg/cm2。同样地，使用利用含有50μg/mL或500μg/mL的明胶(Nippi APAT)的PBS(Gibco、cat#10010049、pH7.4)并按照终浓度成为22nM、11nM、5.5nM、2.7nM的方式进行了梯度稀释的511E8包被96孔板。需要说明的是，作为对照，制备了包被有利用不含HSA及明胶的PBS同样地进行了梯度稀释的511E8的96孔板。
(2)整联蛋白结合分析
整联蛋白结合分析按照上述Ido等(Ido et al.，The Journal of BiologicalChemistry，282，11144-11154，2007)中记载的方法来实施。具体而言，在按照上述方式使用单独的511E8、或使用添加有HSA或明胶(终浓度50μg/mL或500μg/mL)的511E8进行了包被的96孔板中，加入pH7.4的含有0.1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich cat#A7906)、0.02％吐温20(Wako cat#167-11515)、130mM NaCl的20mM Tris缓冲液(以下记作0.1％BSA/TBST)200μL/孔，对板进行洗涤。然后，加入pH7.4的含有1％牛血清白蛋白、0.02％吐温20、130mMNaCl的20mM Tris缓冲液(以下记作1％BSA/TBST)200μL/孔，一边在摇床(B.Braun BiotechInternational CERTOMAT MT)上振荡一边在室温下进行1小时的封闭。用200μL/孔的0.1％BSA/TBST洗涤1次后，加入α6β1整联蛋白溶液(10nM α6β1整联蛋白、19.6mM Tris、127mMNaCl、0.0056％吐温20、0.1％BSA、1mM MnCl2)50μL/孔，一边在室温下在摇床上振荡一边反应3小时。用200μL/孔的1mM MnCl2/0.1％BSA/TBST洗涤3次，加入用1mM MnCl2/0.1％BSA/TBST稀释的1μg/mL的生物素标记抗Velcro抗体(按照Takagi，J.，Erickson，H.P.，andSpringer，T.A.(2001)Nat.Struct.Biol.8，412-416的记载而制作)50μL/孔，在室温下在摇床上反应30分钟。用200μL/孔的1mM MnCl2/0.1％BSA/TBST洗涤3次，加入用1mM MnCl2/0.1％BSA/TBST稀释的0.6μg/mL链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Pierce cat#21126)50μL/孔，在室温下在摇床上反应15分钟。用200μL/孔的1mM MnCl2/0.1％BSA/TBST洗涤3次，加入邻苯二胺(OPD)溶液(0.04％OPD(Wako cat#161-11851)、0.04％H2O2、25mM柠檬酸、50mMNa2HPO4)50μL/孔，反应2分20秒。用2.5M H2SO4使反应停止后，用酶标仪(MolecularDevices EMax)测定490nm处的显色底物的吸光度。
实验结果
(1)HSA的效果
将添加50μg/mL或500μg/mL的HAS而包被511E8时的整联蛋白结合活性的测定结果示于图1。不论是否添加HSA，整联蛋白结合量均随着所包被的511E8的浓度而增加，通过添加500μg/mL的HAS，观察到511E8的整联蛋白结合活性明显增加。特别是包被有低浓度的511E8时，该倾向显著，以2.7nM的511E8进行包被时，通过HSA的添加，整联蛋白结合活性增加80％以上。即使添加50μg/mL的HAS，也观察到10％左右的活性增加。
(2)明胶的效果
将添加50μg/mL或500μg/mL的明胶而包被511E8时的整联蛋白结合活性的测定结果示于图2。添加明胶时，也得到与添加HAS时同样的结果。即，添加500μg/mL的明胶时，观察到511E8的整联蛋白结合活性的明显增加，特别是以低浓度的511E8进行包被时，其活性增强效果显著。以2.7nM的511E8进行包被时，整联蛋白结合活性增加到2倍以上。即使添加50μg/mL的明胶，也观察到20％～60％的活性增加。
以上的结果表示，在HSA、明胶的共存下包被511E8时，与单独包被511E8时相比，511E8的整联蛋白结合活性显著增加。此外可知，添加的HSA、明胶的浓度越高，则整联蛋白结合活性的增加越大。
〔实施例2：由其它蛋白质引起的层粘连蛋白521E8片段的整联蛋白结合活性的增强〕
对于由HSA、明胶的添加引起的整联蛋白结合活性的增加是否不仅在511E8中、而且在其它层粘连蛋白E8片段中也可观察到，使用521E8进行了研究。
实验方法
(1)板的包被
除了将511E8替代为521E8以外，按照与实施例1同样的步骤来进行板的包被。
(2)整联蛋白结合分析
通过与实施例1同样的方法来测定整联蛋白结合活性。
实验结果
(1)HSA的效果
将添加50μg/mL或500μg/mL的HAS而包被521E8时的整联蛋白结合活性的测定结果示于图3。与511E8同样地，添加500μg/mL的HAS时，521E8的整联蛋白结合活性显著增加。以低浓度的521E8进行包被时，更明显地观察到整联蛋白结合活性的增加，以2.7nM的521E8进行包被时，通过添加500μg/mL的HAS，整联蛋白结合活性增加60％以上。通过添加50μg/mL的HAS，也观察到10％～20％的活性增加。
(2)明胶的效果
将添加50μg/mL或500μg/mL的明胶而包被521E8时的整联蛋白结合活性的测定结果示于图4。添加明胶时，也得到与添加HAS时同样的结果。即，添加500μg/mL的明胶时，观察到521E8的整联蛋白结合活性明显增加，特别是以低浓度的521E8进行包被时，其活性增强效果显著。以2.7nM的521E8进行包被时，整联蛋白结合活性增加80％以上。此外，即使添加50μg/mL的明胶，也观察到10％～60％的活性增加。
由以上的结果可明确，就511E8及521E8任一者而言，通过添加50μg/mL～500μg/mL的HSA或明胶而对板进行包被，整联蛋白结合活性显著增加。此外，任意情况下，添加的HSA、明胶的浓度越高，整联蛋白结合活性的增加越显著。
〔实施例3：添加其它蛋白质而包被511E8的培养板上的人iPS细胞的培养〕
实验方法
将细胞培养用6孔板(Becton，Dickinson and Company cat#353046；培养面积9.6cm2)利用511E8单独进行包被或利用添加有HSA(Biological Industries cat#05-720-1B)或明胶(Nippi APAT)的511E8进行包被，研究作为细胞培养用基质的511E8的活性是否得到增强。使用人诱导性多能干(iPS)细胞201B7株作为所培养的细胞，培养方法按照Nakagawa等(Masato Nakagawa，Yukimasa Taniguchi，Sho Senda，Nanako Takizawa，Tomoko Ichisaka，Kanako Asano，Asuka Morizane，Daisuke Doi，Jun Takahashi，Masatoshi Nishizawa，Yoshinori Yoshida，Taro Toyoda，Kenji Osafune，KiyotoshiSekiguchi，Shinya Yamanaka，“A novel efficient feeder-free culture system forthe derivation of human induced pluripotent stem cells”Scientific Reports 4，3594，2014，doi：10.1038/srep03594)中记载的方法。具体而言，用含有终浓度500μg/mL的HSA或明胶的PBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)按照成为32nM、16nM、8nM的方式对511E8进行梯度稀释后，在各孔中按照成为0.5μg/cm2、0.25μg/cm2、0.125μg/cm2的方式加入511E8，一边在4℃下缓慢地振荡一晚(约18小时)一边对板进行包被。作为对照，将利用不含HSA及明胶的PBS稀释的511E8按照成为0.5μg/cm2、0.25μg/cm2、0.125μg/cm2的方式来加入，同样地对板进行包被。除去包被溶液后，按照成为1.35×103个/cm2的方式播种用TrypLESelect(Life Technologies、cat#A12859-01)分散为单个细胞的201G7细胞，培养1周。培养基使用了TeSR2(STEMCELL Technologies、cat#05860)和NutriStem(BiologicalIndustries、cat#05-100-1)的1∶1混合液。每隔1天进行培养基交换。在培养开始1周后对细胞进行碱性磷酸酶染色。碱性磷酸酶染色使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich、cat#86R-1KT)并按照试剂盒附带的推荐操作流程来进行。
实验结果
将对细胞进行碱性磷酸酶染色的结果示于图5。以0.5μg/cm2包被511E8时，即使添加HSA或明胶，也未确认到产生的细胞的集落数、集落的尺寸的显著差异。另一方面，以0.25μg/cm2或0.125μg/cm2包被511E8时，确认到通过添加HSA或明胶而包被511E8，集落数显著增加。进而，通过添加HSA或明胶而包被511E8，即使以人iPS细胞的培养中推荐的511E8的包被浓度(0.5μg/cm2：非专利文献2)的1/2量的包被浓度(0.25μg/cm2)，也确认到几乎同等的iPS细胞的增殖。进而，添加终浓度500μg/mL的HAS时，即使以推荐的包被浓度的1/4量的包被浓度(0.125μg/cm2)，也观察到iPS细胞的充分增殖。此外，在添加HSA或明胶而包被511E8的板上培养的人iPS细胞在碱性磷酸酶活性染色中被强染色，因此认为维持了未分化性。
〔实施例4：添加其它蛋白质包被521E8的培养板上的人iPS细胞的培养〕
实验方法
将细胞培养用24孔板(Becton，Dickinson and Company cat#353047；培养面积1.88cm2)利用521E8单独进行包被或利用添加有HSA(Biological Industries cat#05-720-1B)或明胶(Nippi APAT)的521E8进行包被，基于实施例3中记载的方法来研究作为细胞培养用基质的521E8的活性是否得到增强。具体而言，将用含有终浓度500μg/mL的HSA或明胶的PBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)稀释的521E8按照成为0.25μg/cm2的方式加入各孔中，一边在4℃下缓慢地振荡一晚(约18小时)一边对板进行包被。作为对照，将利用不含HSA及明胶的PBS稀释的521E8按照成为0.5μg/cm2或0.25μg/cm2的方式来加入，同样地对板进行包被。除去包被溶液后，按照成为4.15×103个/cm2的方式播种用TrypLE Select(Life Technologies、cat#A12859-01)分散为单个细胞的201B7细胞，培养1周。培养基使用了TeSR2和NutriStem的1∶1混合液。每隔1天进行培养基交换。在培养开始1周后对细胞进行碱性磷酸酶染色。碱性磷酸酶染色使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich、cat#86R-1KT)并按照试剂盒附带的推荐操作流程来进行。
实验结果
将对细胞进行碱性磷酸酶染色的结果示于图6。在不添加HSA及明胶而包被521E8时，在以0.5μg/cm2包被的板上可见多个集落，观察到iPS细胞的充分增殖；但在以0.25μg/cm2包被的板上，iPS细胞虽然增殖但孔整体中未见集落的生长。另一方面，添加500μg/mL的HSA或明胶以0.25μg/cm2包被521E8的板上，在孔的整个表面均形成了集落，与不添加HSA及明胶以0.25μg/cm2包被521E8的板相比，iPS细胞的增殖显著亢进。此外，即使与以0.5μg/cm2包被521E8的板相比，也确认到同等以上的iPS细胞的增殖。此外，在添加HSA或明胶而包被521E8的板上培养的人iPS细胞在碱性磷酸酶活性染色中被强染色，因此认为维持了未分化性。
这些结果表明，由HSA或明胶的添加引起的层粘连蛋白E8片段的活性的增强不仅在511E8中、而且在521E8中也发生；并且表明，通过添加HSA或明胶，可以将板上包被的层粘连蛋白E8片段量减半。如果可以减少包被中使用的层粘连蛋白E8片段量，则可以节约iPS细胞的培养所需要的经费，具有极大的优点。
〔实施例5：由其它蛋白质的添加引起的含有511E8的包被溶液的长期稳定化〕
以整联蛋白结合活性为指标，研究利用含有HSA、明胶等其它蛋白质的PBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)稀释到包被浓度附近的511E8是否可以长期稳定地保持其活性。
实验方法
用含有500μg/mL的明胶(Nippi APAT)的PBS将511E8稀释成32nM(4.8μg/mL)后，装入玻璃瓶中在4℃下保存。此外，制备用不含明胶的PBS稀释成32nM的511E8，同样地装入玻璃瓶并在4℃下保存。将保存了16周的包被溶液按照成为22nM、11nM、5.5nM、0nM的方式进行稀释后，在96孔板(Becton，Dickinson and Company cat#353072)中加入50μL/孔，一边在4℃下缓慢地振荡一晚一边对板进行包被。作为对照，在临包被前，制备按照511E8浓度成为22nM、11nM、5.5nM、0nM的方式用PBS稀释的新鲜包被溶液，在96孔板中加入50μL/孔，同样地对板进行包被。通过与实施例1同样的方法测定整联蛋白结合活性。
实验结果
将结果示于图7。与用在使用时制备的包被溶液进行包被的板相比，使用不添加明胶且在4℃下保存16周的包被溶液时，在5.5～22nM的任一包被浓度之下，均确认到整联蛋白结合活性的显著降低。另一方面，使用添加500μg/mL的明胶并保存16周的包被溶液时，在标准包被浓度、即22nM(与0.5μg/cm2相当)下，未确认到长期保存所致的整联蛋白结合活性的降低。令人吃惊的是，在5.5nM或11nM的包被浓度下观察到整联蛋白结合活性的显著增加。进而，在5.5nM或者11nM下得到与22nM时几乎同等的整联蛋白结合活性，确认即使在4℃下保存16周后也维持了由明胶引起的511E8的激活效果。
〔实施例6：由其它蛋白质的添加引起的含有521E8的包被溶液的长期稳定化〕
以人iPS细胞的增殖为指标，研究利用含有HSA、明胶等其它蛋白质的PBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)稀释到包被浓度附近的521E8是否可以长期稳定地保持其活性。
实验方法
用含有500μg/mL或2000μg/mL的HSA(Biological Industries cat#05-720-1B)的PBS将521E8稀释成16nM(2.4μg/mL)、8nM(1.2μg/mL)后，装入聚丙烯制50mL管(IWAKICat.No.2345-050，Asahi Glass Co.，Ltd)中，在4℃下保存。此外，制备用不含HAS的PBS稀释成16nM(2.4μg/mL)、8nM(1.2μg/mL)的521E8，同样地放入聚丙烯制50mL管中并在4℃下保存。将保存了13周的521E8包被溶液在细胞培养用24孔板(Becton，Dickinson and Companycat#353047；培养面积1.88cm2)中加入0.25μg/cm2或0.125μg/cm2，一边在4℃下缓慢地振荡一晚一边对板进行包被。作为对照，在临包被前，新制备用不含HAS的PBS稀释的521E8并按照成为0.25μg/cm2或0.125μg/cm2的方式来加入，同样地对板进行包被。除去包被溶液后，按照成为1.3×104个/孔的方式播种用TrypLE Select(Life Technologies、cat#A12859-01)分散为单个细胞的人iPS细胞409B2株，培养6天。培养基使用了TeSR2和NutriStem的1∶1混合液。每隔1天进行培养基交换。培养开始6天后，对细胞进行碱性磷酸酶染色。碱性磷酸酶染色使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich、cat#86R-1KT)并按照试剂盒附带的推荐操作流程来进行。
实验结果
将对细胞进行碱性磷酸酶染色的结果示于图8。不添加HAS而包被521E8时，在以0.25μg/cm2包被的板上可见多个集落，观察到iPS细胞的充分增殖，但在以0.125μg/cm2包被的板上，iPS细胞虽然增殖但孔整体中未见集落的生长。无论是在使用时制备包被溶液、还是制备后冷藏保存13周的情况下，均观察到该iPS细胞的增殖性差异。另一方面，在将添加500μg/mL或者2000μg/mL的HAS并冷藏保存13周的521E8以0.125μg/cm2进行包被的板上，在孔的整个表面均形成了集落，与不添加HSA而包被的板相比，iPS细胞的增殖显著亢进。此外，即使与以0.25μg/cm2包被521E8的板相比，也确认到了同等的iPS细胞的增殖。此外，在添加HAS而包被521E8的板上培养的人iPS细胞在碱性磷酸酶活性染色中被强染色，因此认为维持了未分化性。
〔实施例7：含有511E8及其它蛋白质的1×包被溶液的长期保存试验〕
实验方法
(1)1×包被溶液的制备及保存
用含有500μg/mL或2000μg/mL的HSA(Biological Industries cat#05-720-1B)的PBS(ナカライ)将511E8分别稀释成3.2μg/mL及1.6μg/mL后，装入聚丙烯制50mL管(Becton，Dickinson and Company)中，在4℃下保存。此外，用含有500μg/mL或2000μg/mL的明胶(Nippi APAT)的PBS将511E8分别稀释成3.2μg/mL及1.6μg/mL后，装入聚丙烯制50mL管中，在4℃下保存。作为对照，用不含HSA、明胶等其它蛋白质的PBS将511E8分别稀释成3.2μg/mL及1.6μg/mL，同样地装入聚丙烯制50mL管中并在4℃下保存。
(2)板的包被
使用冷藏保存了12个月的包被溶液，对细胞培养用24孔板(Becton，Dickinsonand Company cat#353047；培养面积1.88cm2)或细胞培养用6孔板(Becton，Dickinson andCompany cat#353046；培养面积9.6cm2)进行包被。按照511E8的包被浓度为0.5μg/cm2(511E8浓度为3.2μg/mL时)或0.25μg/cm2(511E8浓度为1.6μg/mL时)的方式，在24孔板时将包被液量设为300μL/孔，在6孔板时将包被液量设为1.5mL/孔。将包被溶液添加到孔中后，一边在4℃下缓慢地振荡一晚一边对板进行包被。作为对照，在临包被前，新制备用不含HSA、明胶等其它蛋白质的PBS稀释的511E8，按照成为0.5μg/cm2或0.25μg/cm2的方式来加入，同样地对板进行包被。
(3)人iPS细胞的培养
除去包被溶液后，按照24孔板中为1.3×104个/孔、6孔板中为5.2×104个/孔的方式播种用TrypLE Select(Life Technologies、cat#A12859-01)分散为单个细胞的人iPS细胞409B2株，培养1周。培养基使用了TeSR2和NutriStem的1∶1混合液。仅在细胞播种时，将用于抑制细胞死亡的ROCK抑制剂(Y-27632、和光纯药)按照最终浓度为10μM的方式添加到培养基中。在细胞播种的第二天进行培养基交换，其后至第5天每隔1天进行培养基交换，第5天以后每天进行培养基交换。第1周达到80～90％汇合，因此供于以下的试验。
(4)碱性磷酸酶染色
将用24孔板培养的人iPS细胞供于碱性磷酸酶染色。与实施例6同样地，碱性磷酸酶染色使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich、cat#86R-1KT)并按照试剂盒附带的推荐流程来进行。
(5)流式细胞仪分析
将用6孔板培养的人iPS细胞供于流式细胞仪分析。流式细胞仪分析通过基于山田等(Yamada et al.，Biochem.J.，2008)中记载的方法并进行了部分变更的方法来实施。使用的抗未分化标志物的抗体为FITC标记小鼠IgG3(对照)、FITC标记抗小鼠SSEA4抗体、FITC标记抗小鼠Tra 1-60抗体、Alexa flour 488标记IgG1(对照)(以上为细胞表面标志物用)、及Alexa flour 488标记抗OCT3/4抗体(细胞内标志物)。这些抗体为均为BD Pharmingen公司制。
除去培养基，将用TrypLE Select分散为单个细胞的iPS细胞，使用利用PBS稀释的福尔马林(福尔马林∶PBS＝1∶10)在室温下固定10分钟。将固定后的细胞用PBS洗涤2次后，用100μL的PBS悬浮，分成80μL和20μL的细胞悬浮液两部分。
80μL细胞悬浮液作为细胞表面标志物用途(IgG3、SSEA4、Tra1-60、IgG1)来使用。以1500rpm离心后除去上清，加入80μL的1.5％胎牛血清(FBS、Life Technologies)/PBS再悬浮。将细胞悬浮液4等分(20μL/管)，在冰上静置15分钟进行封闭。封闭后，将20μL的各抗体分别添加到管中，在冰上遮光孵育1小时。
20μL的细胞悬浮液作为细胞内标志物用途(OCT3/4)来使用。在细胞悬浮液中按照Triton X-100浓度为0.1％的方式加入20μL的0.2％Triton X-100/PBS，在室温下进行细胞透化处理15分钟。离心后除去上清，添加100μL的1.5％FBS/PBS，在室温下进行15分钟的封闭。封闭后，添加20μL的抗OCT3/4抗体，在室温下遮光孵育1小时。
将用各抗体染色的细胞用PBS洗涤，再悬浮于500μL的PBS中。用流式细胞仪(FACScan；BD公司制)进行分析。
实验结果
(1)碱性磷酸酶染色
将对细胞进行碱性磷酸酶染色的结果示于图9及图10。图9为使用HSA作为其它蛋白质的结果，图10为使用明胶作为其它蛋白质的结果。不添加其它蛋白质而包被511E8时，在以0.25μg/cm2包被的板上，iPS细胞虽然增殖，但孔整体中未见集落的生长(图9、10从左边起第2、3号)。在利用在使用时制备的包被溶液时、和在利用保存了12个月的包被溶液时均如此。在使用时制备不添加其它蛋白质的包被溶液并以0.5μg/cm2包被的板上，观察到iPS细胞的充分增殖(图9、10的左端)。
另一方面，由图9及图10可明确，在将添加500μg/mL或者2000μg/mL的HSA或明胶并保存了12个月的511E8以0.25μg/cm2包被的板上，在孔的整个表面均形成了集落，确认到了与利用在使用时制备的包被溶液以0.5μg/cm2包被的板同等的iPS细胞的增殖。即表示，即使使用保存12个月后的1×包被溶液，以人iPS细胞的培养中511E8的推荐的包被浓度(0.5μg/cm2：非专利文献2)的1/2量的包被浓度(0.25μg/cm2)也得到同等的iPS细胞的增殖。此外，在添加HSA或明胶而包被511E8的板上培养的人iPS细胞在碱性磷酸酶活性染色中被强染色，因此认为维持了未分化性。
(2)流式细胞仪分析
将分析的结果示于图11及图12。图11为使用HSA作为其它蛋白质的结果，图12为使用明胶作为其它蛋白质的结果。在任一组中，未分化标志物(SSEA4、Tra 1-60、OCT3/4)的荧光强度(FL-1值)均高于IgG对照，表示维持了未分化性。其值并未由于HAS或明胶的添加及12个月的保存而降低。
〔实施例8：含有521E8及其它蛋白质的1×包被溶液的长期保存试验〕
实验方法
(1)1×包被溶液的制备及保存
用含有500μg/mL或2000μg/mL的HSA(Biological Industries cat#05-720-1B)的PBS(于カライ)将521E8分别稀释成3.2μg/mL、1.6μg/mL及0.8μg/mL后，装入聚丙烯制50mL管(Becton，Dickinson and Company)中，在4℃下保存。此外，用含有500μg/mL或2000μg/mL的明胶(Nippi APAT)的PBS将521E8分别稀释成3.2μg/mL、1.6μg/mL及0.8μg/mL后，装入聚丙烯制50mL管中，在4℃下保存。作为对照，用不含HSA、明胶等的其它蛋白质的PBS将521E8分别稀释成3.2μg/mL、1.6μg/mL及0.8μg/mL，同样地装入聚丙烯制50mL管中，在4℃下保存。
(2)板的包被
使用冷藏保存了12个月的包被溶液，通过与实施例7同样的方法在细胞培养用24孔板及细胞培养用6孔板上包被521E8。521E8的包被浓度设为0.5μg/cm2(521E8浓度为3.2μg/mL时)、0.25μg/cm2(521E8浓度为1.6μg/mL时)或0.125μg/cm2(521E8浓度为0.8μg/mL时)。作为对照，在即将包被前，重新制备用不含HSA、明胶等其它蛋白质的PBS稀释的521E8，按照成为0.5μg/cm2、0.25μg/cm2或0.125μg/cm2的方式来加入，同样地对板进行包被。
(3)人iPS细胞的培养
通过与实施例7同样的方法来进行。
(4)碱性磷酸酶染色
通过与实施例7同样的方法来进行。
(5)FACS分析
通过与实施例7同样的方法来进行。
实验结果
(1)碱性磷酸酶染色
将对细胞进行碱性磷酸酶染色的结果示于图13及图14。图13为使用HSA作为其它蛋白质的结果，图14为使用明胶作为其它蛋白质的结果。不添加其它蛋白质而包被521E8时，在以0.125μg/cm2包被的板上，iPS细胞几乎不增殖(图13从左边起第2、3号)；在以0.25μg/cm2包被的板上，iPS细胞虽然增殖，但孔整体中未见集落的生长(图13的左端、图14从左边起第2、3号)。在利用在使用时制备的包被溶液时、和在利用保存了12个月的包被溶液时均如此。在使用时制备不添加其它蛋白质的包被溶液并以0.5μg/cm2包被的板上，观察到iPS细胞的充分增殖(图14的左端)。
另一方面，由图13可明确，在将添加500μg/mL或者2000μg/mL的HAS并保存了12个月的521E8以0.125μg/cm2包被的板上，在孔的整个表面均形成了集落，与利用在使用时制备的包被溶液以0.25μg/cm2包被的板相比，确认到显著优良的iPS细胞的增殖。此外，由图14可明确，在将添加500μg/mL或者2000μg/mL的明胶并保存了12个月的521E8以0.25μg/cm2包被的板上，在孔的整个表面均形成了集落，确认到与利用在使用时制备的包被溶液以0.5μg/cm2包被的板同等的iPS细胞的增殖。即表示，即使使用保存了12个月后的1×包被溶液，在不使用其它蛋白质且在使用时制备的情况下可确认充分和iPS细胞的增殖的包被浓度(0.5μg/cm2)的1/4～1/2量的包被浓度(0.125～0.25μg/cm2)下，得到同等的iPS细胞的增殖。此外，在添加HSA或明胶而包被521E8的板上培养的人iPS细胞在碱性磷酸酶活性染色中被强染色，因此认为维持了未分化性。
(2)流式细胞仪分析
将分析的结果示于图15及图16。图15为使用HSA作为其它蛋白质的结果，图16为使用明胶作为其它蛋白质的结果。在任一组中，未分化标志物(SSEA4、Tra 1-60、OCT3/4)的荧光强度(FL-1值)均高于IgG对照，表示维持了未分化性。其值并未由于HSA的添加及12个月的保存而降低。需要说明的是，使用不添加其它蛋白质并将521E8保存了12个月的包被溶液以0.125μg/cm2包被的组未得到足以供于FACS分析的细胞数，不能进行分析。
以上的结果表示，通过添加HSA、明胶等其它蛋白质，不仅可以增强已经稀释成无需在使用时稀释的浓度的层粘连蛋白E8作为细胞培养基质的活性，而且可以以1×包被溶液的状态长期稳定地冷藏保存1年以上。此外还表示，HSA、明胶等其它蛋白质的添加对人多能干细胞的未分化性的维持没有不良影响。
用于细胞培养器具的包被的511E8以冷冻干燥品形式销售(商品名：iMatrix-511、Nippi.Inc.)。将其作为人多能干细胞的培养基质使用时，建议将以200～1000μg/mL的浓度溶解该冷冻干燥品并分装后、再冷冻保存的溶液作为511E8保存液并使用。例如，在对培养板进行包被时，将冷冻的保存液解冻，用PBS等稀释成3～5μg/mL后，按照成为0.5μg/cm2的方式加入各孔中进行培养板的包被。即，每次对培养板进行包被时，必须进行保存液的解冻和稀释。根据本发明，通过将HSA、明胶等蛋白质添加到包被溶液中，从而制作预先稀释成包被浓度的511E8溶液，能够不损害其活性地在4℃下长期稳定地保管。从而，不仅可以减轻进行细胞培养的操作者的负担，而且可以避免制备包被溶液时可能产生的人为误差，进而还具有可以节约包被中使用的511E8的使用量的优点。
〔实施例9：由其它蛋白质引起的211E8及411E8的整联蛋白结合活性的增强〕
使用211E8及411E8，来研究由HSA、明胶的添加引起的整联蛋白结合活性的增加是否不仅在511E8、521E8中、而且在其它层粘连蛋白E8片段中也可观察到。
实验方法
(1)板的包被
用含有500μg/mL的人血清白蛋白(Biological Industries cat#05-720-1B；以下记作HSA)的PBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)按照终浓度为25nM、10nM、5nM、0nM的方式对211E8或411E8进行梯度稀释后，分别在96孔板(Becton，Dickinson and Company#353072、培养面积0.32cm2/孔)中加入50μL/孔，一边在4℃下缓慢地振荡一晚一边进行包被。
(2)整联蛋白结合分析
按照实施例1中记载的方法测定整联蛋白结合活性。其中，对411E8，使用α6β1整联蛋白溶液(30nMα6β1整联蛋白、19.6mM Tris、127mM NaCl、0.0056％吐温20、0.1％BSA、1mMMnCl2)来进行整联蛋白结合分析；对211E8，使用α7X2β1整联蛋白溶液(30nMα7X2β1整联蛋白、19.6mM Tris、127mM NaCl、0.0056％吐温20、0.1％BSA、1mM MnCl2)来进行整联蛋白结合分析。分析中使用的重组α7X2β1整联蛋白按照Taniguchi等(Yukimasa Taniguchi，Hiroyuki Ido，Noriko Sanzen Maria Hayashi，Ryoko Sato-Nishiguti，Sugiko Futaki，and KiyotoshiSekiguchi，“The C-terminal region of lamininβchains modulates theintegrin binding affinities of laminins”The Journal of Biological Chemistry，284，7820-7831，2009)中记载的方法来制备。
实验结果
将添加500μg/mL的HAS而包被211E8时的整联蛋白结合活性的测定结果示于图17。与511E8、521E8同样地，在以低浓度(5nM及10nM)的211E8进行包被时，观察到由HSA的添加因此的整联蛋白结合活性的显著增加。在211E8的包被浓度为25nM时，与包被521E8时同样地，未确认到整联蛋白结合活性的增加。
将添加500μg/mL的HAS而包被411E8时的整联蛋白结合活性的测定结果示于图18。在包被411E8时，确认到由HSA的添加引起的整联蛋白结合活性的增加更显著。如图18所示，以低浓度(5nM及10nM)的411E8进行包被时，如果不添加HAS则仅极微弱地检测到整联蛋白结合活性，但添加500μg/mL的HAS时则检测到非常强的整联蛋白结合活性。以25nM的411E8进行包被时，未观察到由HAS引起的整联蛋白结合活性的明显增强。
(实施例10：由其它蛋白质引起的层粘连蛋白片段改造体的整联蛋白结合活性的增强〕
使用增殖因子结合分子和511E8的嵌合分子，来研究由HSA、明胶的添加引起的整联蛋白结合活性的增加是否在层粘连蛋白E8片段与细胞粘附分子或增殖因子结合分子的嵌合分子中也可观察到。作为增殖因子结合分子和511E8的嵌合分子，使用在511E8的N末端部融合有人串珠蛋白聚糖的结构域I～III的层粘连蛋白片段改造体(Plus#3层粘连蛋白E8)及在511E8的C末端部融合有人串珠蛋白聚糖的结构域I的层粘连蛋白片段改造体(Plus#5层粘连蛋白E8)这2种511E8改造体。Plus#3层粘连蛋白E8及Plus#5层粘连蛋白E8通过国际公开WO2014/199754中记载的方法而制备并供于整联蛋白结合活性的测定。
实验方法
(1)板的包被
用含有500μg/mL的人血清白蛋白(Biological Industries cat#05-720-1B；以下记作HSA)的PBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)按照终浓度为22nM、11nM、5.5nM、0nM的方式对Plus#3层粘连蛋白E8或Plus#5层粘连蛋白E8进行梯度稀释后，分别在96孔板(Becton，Dickinson and Company#353072、培养面积0.32cm2/孔)中加入50μL/孔，一边在4℃下缓慢地振荡一晚一边进行包被。
(2)整联蛋白结合分析
按照实施例1中记载的方法，使用α6β1整联蛋白溶液(10nMα6β1整联蛋白、19.6mMTris、127mM NaCl、0.0056％吐温20、0.1％BSA、1mM MnCl2)测定整联蛋白结合活性。
实验结果
将添加500μg/mL的HAS而包被Plus#3层粘连蛋白E8及Plus#5层粘连蛋白E8时的整联蛋白结合活性的测定结果示于图19及图20。在任一层粘连蛋白片段改造体的情况下，在包被浓度为5.5nM及11nM时，通过添加500μg/mL的HAS进行包被，观察到整联蛋白结合活性的显著增加。另一方面，以22nM包被层粘连蛋白片段改造体时，添加500μg/mL的HAS也未观察到整联蛋白结合活性的增加。
以上的结果表示，通过以高浓度添加HSA、明胶等其它蛋白质，不仅能够增强511E8、521E8、211E8、411E8之类的层粘连蛋白E8片段的活性，而且能够增强增殖控制分子(细胞粘附分子、增殖因子结合分子)和层粘连蛋白E8片段的嵌合分子的活性。即，本发明的层粘连蛋白片段的活性增强法能够广泛适用于层粘连蛋白片段及其改造体(包括与增殖控制分子的嵌合分子)。
需要说明的是，本发明不受上述各实施方式及实施例限定，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的学术文献及专利文献全部以参考形式援引到本说明书中。
序列表
<110> 国立大学法人大阪大学（Osaka University）
<120> 层粘连蛋白片段的细胞培养基质活性增强方法（Method for enhancing cellculture substrate activity of laminin fragment）
<130> O11F5309
<150> JP 2014-145536
<151> 2014-07-16
<160> 11
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
atgatgatga agcttatcga taccgt 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
catcatcatg atatcgaatt cctgca 26
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
atcatatgga taaagcttat cgataccgt 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
gtgccagatt atgcagatat cgaattcct 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
atccttgtaa tcaagcttat cgataccgt 29
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
gctgccgagg atgctgctgg ccagg 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
ctaggcagga tgccgggcgg gctga 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
cttcagcata gtgctgctga cattg 25
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
ttacaagcat gtgctataca cagcaac 27
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
aatgacattc tcaacaacct gaaag 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
ctagggcttt tcaatggacg gggtg 25

Claims (16)

1.一种活性增强方法，其为增强具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体对哺乳动物培养细胞的活性的方法，其特征在于，
包括如下步骤：使含有所述层粘连蛋白片段或其改造体、以及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触，在培养面包被所述层粘连蛋白片段或其改造体，
所述包被溶液含有形成低于0.5μg/cm2的包被浓度的量的所述层粘连蛋白片段或其改造体，且所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为50μg/mL以上，
所述对哺乳动物培养细胞的活性为选自对细胞表面的粘附受体的结合活性、细胞粘附活性、细胞增殖活性及集落形成活性中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的活性增强方法，其特征在于，所述包被溶液的所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为200μg/mL以上。
3.根据权利要求2所述的活性增强方法，其特征在于，所述包被溶液的所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为500μg/mL以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的分子量为10000以上。
5.根据权利要求4所述的活性增强方法，其特征在于，所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质为选自由明胶、血清白蛋白、转铁蛋白、髓鞘碱性蛋白、β-乳球蛋白、谷胱甘肽S-转移酶及胶原蛋白组成的组中的1种以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，层粘连蛋白片段来自选自层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α4β1γ1及层粘连蛋白α2β1γ1中的至少1种。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的活性增强方法，其特征在于，层粘连蛋白片段为层粘连蛋白E8片段。
8.一种培养方法，其为使用包被有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体的细胞培养器具的哺乳动物细胞的培养方法，其特征在于，
所述细胞培养器具通过使含有所述层粘连蛋白片段或其改造体、以及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的包被溶液与细胞培养器具的培养面接触而制作，
所述包被溶液含有形成低于0.5μg/cm2的包被浓度的量的所述层粘连蛋白片段或其改造体，且所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为50μg/mL以上。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述包被溶液的所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质浓度为200μg/mL以上。
10.根据权利要求8或9所述的培养方法，其特征在于，所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的分子量为10000以上。
11.根据权利要求8～10中任一项所述的培养方法，其特征在于，层粘连蛋白片段来自选自层粘连蛋白α5β1γ1、层粘连蛋白α5β2γ1、层粘连蛋白α4β1γ1及层粘连蛋白α2β1γ1中的至少1种。
12.根据权利要求8～11中任一项所述的培养方法，其特征在于，层粘连蛋白片段为层粘连蛋白E8片段。
13.一种包被溶液，其为用于在细胞培养器具的培养面包被层粘连蛋白片段或其改造体的溶液，其特征在于，
含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体、以及除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质，
所述层粘连蛋白片段或其改造体的浓度为5μg/mL以下，所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的浓度为50μg/mL以上。
14.根据权利要求13所述的包被溶液，其特征在于，对所述层粘连蛋白片段或其改造体的浓度进行了调整，以使细胞培养器具的培养面中的层粘连蛋白片段或其改造体的包被浓度成为低于0.5μg/cm2的包被浓度。
15.根据权利要求13或14所述的包被溶液，其特征在于，所述除层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的分子量为10000以上。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的包被溶液，其特征在于，所述层粘连蛋白片段为层粘连蛋白E8片段。
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