JPWO2016010082A1 - ラミニンフラグメントの細胞培養基質活性増強方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体の哺乳動物培養細胞に対する活性を増強する方法であって、前記ラミニンフラグメントまたはその改変体、および、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質を含むコーティング溶液を細胞培養器具の培養面に接触させ、前記ラミニンフラグメントまたはその改変体を培養面にコーティングすることを含み、前記コーティング溶液は、0.5μg/cm2より低いコーティング濃度になる量の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体を含み、かつ、前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が50μg/mL以上であり、前記哺乳動物培養細胞に対する活性が、細胞表面の接着受容体に対する結合活性、細胞接着活性、細胞増殖活性およびコロニー形成活性から選択される少なくとも一種であることを特徴とする活性増強方法。
[2]前記コーティング溶液の前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が200μg/mL以上であることを特徴とする前記[1]に記載の活性増強方法。
[3]前記コーティング溶液の前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が500μg/mL以上であることを特徴とする前記[2]に記載の活性増強方法。
[4]前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質の分子量が10000以上であることを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかに記載の活性増強方法。
[5]前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が、ゼラチン、血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−S−トランスフェラーゼおよびコラーゲンからなる群より選択される1種以上であることを特徴とする前記[4]に記載の活性増強方法。
[6]ラミニンフラグメントが、ラミニンα5β1γ1、ラミニンα5β2γ1、ラミニンα4β1γ1およびラミニンα2β1γ1から選択される少なくとも1種由来であることを特徴とする前記[1]〜[5]のいずれかに記載の活性増強方法。
[7]ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントであることを特徴とする前記[1]〜[6]のいずれかに記載の活性増強方法。
[8]インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体がコーティングされている細胞培養器具を用いる哺乳動物細胞の培養方法であって、前記細胞培養器具は、前記ラミニンフラグメントまたはその改変体、および、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質を含むコーティング溶液を細胞培養器具の培養面に接触させることにより作製され、前記コーティング溶液は、0.5μg/cm2より低いコーティング濃度になる量の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体を含み、かつ、前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が50μg/mL以上であることを特徴とする培養方法。
[9]前記コーティング溶液の前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が200μg/mL以上であることを特徴とする前記[8]に記載の培養方法。
[10]前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質の分子量が10000以上であることを特徴とする前記[8]または[9]に記載の培養方法。
[11]ラミニンフラグメントが、ラミニンα5β1γ1、ラミニンα5β2γ1、ラミニンα4β1γ1およびラミニンα2β1γ1から選択される少なくとも1種由来であることを特徴とする前記[8]〜[10]のいずれかに記載の培養方法。
[12]ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントであることを特徴とする前記[8]〜[11]のいずれかに記載の培養方法。
[13]細胞培養器具の培養面にラミニンフラグメントまたはその改変体をコーティングするための溶液であって、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体、および、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質を含み、前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が5μg/mL以下であり、前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質の濃度が50μg/mL以上であることを特徴とするコーティング溶液。
[14]細胞培養器具の培養面におけるラミニンフラグメントまたはその改変体のコーティング濃度が、0.5μg/cm2より低いコーティング濃度になるように、前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が調整されていることを特徴とする前記[13]に記載のコーティング溶液。
[15]前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質の分子量が10000以上であることを特徴とする前記[13]または[14]に記載のコーティング溶液。
[16]前記ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントであることを特徴とする前記[13]〜[15]のいずれかに記載のコーティング溶液。
本発明は、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体の哺乳動物培養細胞に対する活性増強方法を提供する。哺乳動物培養細胞に対する活性とは、哺乳動物細胞の培養基質としての活性を意味し、インテグリン等の細胞表面の接着受容体に対する結合活性、細胞接着活性、細胞増殖活性、コロニー形成活性等が含まれる。
増殖因子結合分子としては、例えば、パールカン、アグリン、XVIII型コラーゲン、シンデカン1〜4、グリピカン1〜6などのヘパラン硫酸プロテオグリカン、latent TGF−β binding protein1〜4などが好ましい。
本発明の培養方法は、上記本発明の活性増強方法を適用して哺乳動物細胞を培養する方法である。すなわち、ラミニンフラグメント等を推奨されるコーティング濃度より低いコーティング濃度で、大過剰量の他の蛋白質と共にコーティングした細胞培養器具を用いて哺乳動物細胞を培養する方法である。本発明の培養方法で使用する細胞培養器具は、上記本発明の活性増強方法で説明した細胞培養器具である。
本発明は、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメント等と、ラミニンフラグメント等に対して大過剰量の他の蛋白質を含むコーティング溶液を提供する。本発明のコーティング溶液は、上記本発明の活性増強方法または上記本発明の培養方法で使用するためのコーティング溶液として好適である。
ヒト組換えラミニン511E8(以下、「511E8」と記す)は、Idoら(Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007)に記載の方法に従い、以下のように作製した。
(i) 6×Hisタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号1)
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’(reverse、配列番号2)
(ii) HAタグ導入用プライマー
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号3)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(reverse、配列番号4)
(iii) FLAGタグ導入用プライマー
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号5)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(reverse、配列番号4)
(iv) α5鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’(forward、配列番号6)
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’(reverse、配列番号7)
(v) β1鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’(forward、配列番号8)
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’(reverse、配列番号9)
(vi) γ1鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’(forward、配列番号10)
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’(reverse、配列番号11)
ヒト組換えラミニン521E8(以下、「521E8」と記す)は、上記ヒト組換えラミニン511E8の作製方法に準じて作製した。すなわち、ヒトα5鎖E8フラグメント(N末端側に6×Hisタグを含む)、ヒトβ2鎖E8フラグメント(N末端側にHAタグを含む)、ヒトγ1鎖E8フラグメント(N末端側にFLAGタグを含む)の各発現ベクターをヒト腎臓由来293F細胞にトランスフェクトし、72時間培養を行ったのち、培養液を回収し、ラミニン511E8と同様にNi-NTA agaroseとANTI-FLAG M2 affinity Gelを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ヒトβ2鎖E8フラグメントの発現ベクターはTaniguchiら(Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiguti, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The C-terminal region of laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins” The Journal of Biological Chemistry, 284, 7820-7831, 2009)に記載の方法に従い、調製した。
ヒト組換えラミニン211E8(以下、「211E8」と記す)およびラミニン411E8(以下、「411E8」と記す)は、上記ヒト組換えラミニン511E8の作製方法に準じて、作製した。すなわち、ヒトα2鎖E8フラグメントあるいはα4鎖E8フラグメント(どちらもN末端側に6×Hisタグを含む)、ヒトβ1鎖E8フラグメント(N末端側にHAタグを含む)、ヒトγ1鎖E8フラグメント(N末端側にFLAGタグを含む)の各発現ベクターをヒト腎臓由来293F細胞にトランスフェクトし、72時間培養を行ったのち、培養液を回収し、ラミニン511E8と同様にNi-NTA agaroseとANTI-FLAG M2 affinity Gelを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ヒトα2E8フラグメントの発現ベクターおよびヒトα4E8フラグメントの発現ベクターはTaniguchiら(Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiguti, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The C-terminal region of laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins” The Journal of Biological Chemistry, 284, 7820-7831, 2009)に記載の方法に従い、調製した。
実験方法
(1)プレートのコーティング
50μg/mLまたは500μg/mLのヒト血清アルブミン(Biological Industries cat#05-720-1B;以下HSAと記す)を含むPBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)で終濃度が22nM、11nM、5.5nM、2.7nMになるように511E8を段階希釈したのち、96ウェルプレート(ベクトン・ディッキンソン #353072、培養面積0.32cm2/well)に50μL/well加え、4℃で一晩ゆるやかに振盪しながらコーティングを行った。コーティング量を単位面積あたりの重量で表した場合は、それぞれ0.5、0.25、0.125、0.0625μg/cm2となっている。同様に、50μg/mLまたは500μg/mLのゼラチン(ニッピ APAT)を含むPBS(Gibco、cat#10010049、pH 7.4)で終濃度が22nM、11nM、5.5nM、2.7nMになるように段階希釈した511E8を用いて96ウェルプレートをコーティングした。なお、対照として、HSAおよびゼラチンを含まないPBSで同様に段階希釈した511E8をコーティングした96ウェルプレートを調製した。
インテグリン結合アッセイは、上記Idoら(Ido et al., The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007)に記載の方法に従って実施した。具体的には、上記のように511E8を単独で、またはHSAもしくはゼラチン(終濃度50μg/mLもしくは500μg/mL)を添加した511E8を用いてコーティングした96ウェルプレートに、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA; シグマ・アルドリッチ cat#A7906)、0.02% Tween-20(Wako cat#167-11515)、130 mM NaClを含む20mM Tris緩衝液、pH7.4(以下0.1% BSA/TBSTと記す)を200μL/well加えて、プレートを洗浄した。次に、1%ウシ血清アルブミン、0.02% Tween-20、130mM NaClを含む20mM Tris緩衝液、pH7.4(以下1% BSA/TBSTと記す)を200μL/well加え、シェーカー(B.Braun Biotech International CERTOMAT MT)上で振盪しながら室温で1時間ブロッキングを行った。200μL/wellの0.1% BSA/TBSTで1回洗浄後、α6β1インテグリン溶液(10nM α6β1インテグリン、19.6mM Tris、127mM NaCl、0.0056% Tween-20、0.1% BSA、1mM MnCl2)を50μL/well加え、室温にてシェーカー上で振盪しながら3時間反応させた。200μL/wellの1mM MnCl2/0.1% BSA/TBSTで3回洗浄後、1mM MnCl2/0.1% BSA/TBST で希釈した1μg/mL のビオチン標識抗Velcro抗体(Takagi, J., Erickson, H. P., and Springer, T. A. (2001) Nat. Struct. Biol. 8, 412-416の記載に従って作製)を50μL/well加え、室温にてシェーカー上で30分間反応させた。200μL/wellの1mM MnCl2/0.1% BSA/TBSTで3回洗浄後、1mM MnCl2/0.1% BSA/TBSTで希釈した0.6μg/mL streptavidin-horseradish peroxidase(Pierce cat#21126)を50μL/well加え、室温にてシェーカー上で15分間反応させた。200μL/wellの1mM MnCl2/0.1% BSA/TBSTで3回洗浄後、ο-phenylenediamine(OPD)溶液(0.04% OPD (Wako cat#161-11851)、0.04% H2O2、25mM クエン酸、50mM Na2HPO4)を50μL/well加えて2分20秒反応させた。2.5M H2SO4で反応停止後、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices EMax)を用いて490nmでの発色基質の吸光度を測定した。
(1)HSAの効果
50μg/mLまたは500μg/mLのHSAを添加して511E8をコーティングした場合のインテグリン結合活性の測定結果を図1に示した。HSAの添加の有無にかかわらず、インテグリン結合量はコーティングした511E8の濃度とともに増加したが、500μg/mLのHSAを添加することにより、明確な511E8のインテグリン結合活性の増加が観察された。特に低濃度の511E8でコーティングした場合にその傾向が顕著であり、2.7nMの511E8でコーティングした場合、HSAの添加によりインテグリン結合活性は80%以上増加した。50μg/mLのHSAの添加によっても10%程度の活性増加が観察された。
50μg/mLまたは500μg/mLのゼラチンを添加して511E8をコーティングした場合のインテグリン結合活性の測定結果を図2に示した。ゼラチンを添加した場合も、HSAを添加した場合と同様の結果が得られた。すなわち、500μg/mLのゼラチンを添加した場合、511E8のインテグリン結合活性の明確な増加が観察され、特に低濃度の511E8でコーティングした場合にその活性増強効果は顕著であった。2.7nMの511E8でコーティングした場合、インテグリン結合活性は2倍以上に増加した。50μg/mLのゼラチンの添加によっても20%〜60%の活性増加が観察された。
HSAやゼラチンの添加によるインテグリン結合活性の増加が511E8だけでなく、他のラミニンE8フラグメントでも観察されるかを、521E8を用いて検討した。
実験方法
(1)プレートのコーティング
511E8を521E8に代えた以外は実施例1と同じ手順で、プレートのコーティングを行った。
(2)インテグリン結合アッセイ
実施例1と同じ方法で、インテグリン結合活性を測定した。
(1)HSAの効果
50μg/mLまたは500μg/mLのHSAを添加して521E8をコーティングした場合のインテグリン結合活性の測定結果を図3に示した。511E8と同様、500μg/mLのHSAを添加すると521E8のインテグリン結合活性は有意に増加した。インテグリン結合活性の増加は、低濃度の521E8でコーティングした場合に、より著明に観察され、2.7nMの521E8でコーティングした場合、500μg/mLのHSAの添加によりインテグリン結合活性は60%以上増加した。50μg/mLのHSAの添加によっても10%〜20%の活性増加が観察された。
50μg/mLまたは500μg/mLのゼラチンを添加して521E8をコーティングした場合のインテグリン結合活性の測定結果を図4に示した。ゼラチンを添加した場合も、HSAを添加した場合と同様の結果が得られた。すなわち、500μg/mLのゼラチンを添加した場合、521E8のインテグリン結合活性の明確な増加が観察され、特に低濃度の521E8でコーティングした場合にその活性増強効果は顕著であった。2.7nMの521E8でコーティングした場合、インテグリン結合活性は80%以上増加した。また、50μg/mLのゼラチンの添加によっても10%〜60%の活性増加が観察された。
実験方法
細胞培養用6ウェルプレート(ベクトン・ディッキンソン cat#353046;培養面積 9.6cm2)を511E8単独で、またはHSA(Biological Industries cat#05-720-1B)もしくはゼラチン(ニッピ APAT)を添加した511E8を用いてコーティングし、細胞培養用基質としての511E8の活性が増強されるかを検討した。培養する細胞としては、ヒトinduced pluripotent stem(iPS)細胞201B7株を用い、培養方法はNakagawaら(Masato Nakagawa, Yukimasa Taniguchi, Sho Senda, Nanako Takizawa, Tomoko Ichisaka, Kanako Asano, Asuka Morizane, Daisuke Doi, Jun Takahashi, Masatoshi Nishizawa, Yoshinori Yoshida, Taro Toyoda, Kenji Osafune, Kiyotoshi Sekiguchi, Shinya Yamanaka, “A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells” Scientific Reports 4, 3594, 2014, doi:10.1038/srep03594)に記載の方法に従った。具体的には、終濃度500μg/mLのHSAまたはゼラチンを含むPBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)で32nM、16nM、8nMになるように511E8を段階希釈した後、各ウェルに0.5μg/cm2、0.25μg/cm2、0.125μg/cm2になるように511E8を加えて、4℃で一晩(約18時間)緩やかに振盪しながらプレートをコーティングした。対照として、HSAおよびゼラチンを含まないPBSで希釈した511E8を0.5μg/cm2、0.25μg/cm2、0.125μg/cm2になるように加えて、同様にプレートをコーティングした。コーティング溶液を除いたのち、TrypLE Select(ライフテクノロジーズ、cat#A12859-01)を用いて単一細胞に分散した201B7細胞を1.35×103個/cm2となるように播種し、1週間培養した。培地にはTeSR2(ステムセルテクノロジーズ、cat#05860)とNutriStem(バイオロジカルインダストリーズ、cat#05-100-1)の1:1混合液を用いた。培地は1日おきに交換した。培養開始1週間後に、細胞をアルカリホスファターゼ染色した。アルカリホスファターゼ染色は白血球アルカリホスファターゼキット(シグマ・アルドリッチ、cat#86R-1KT)を用いて、キットに添付の推奨プロトコールに従って行った。
細胞をアルカリホスファターゼ染色した結果を図5に示した。0.5μg/cm2で511E8をコーティングした場合、HSAまたはゼラチンを添加しても生じた細胞のコロニー数やコロニーの大きさに有意な差は認められなかった。一方、0.25μg/cm2または0.125μg/cm2で511E8をコーティングした場合は、HSAまたはゼラチンを添加して511E8をコーティングすることによりコロニー数の有意な増加が認められた。さらに、HSAまたはゼラチンを添加して511E8をコーティングすることにより、ヒトiPS細胞の培養に推奨される511E8のコーティング濃度(0.5μg/cm2:非特許文献2)の1/2量のコーティング濃度(0.25μg/cm2)でもほぼ同等のiPS細胞の増殖が認められた。さらに、終濃度500μg/mLのHSAを添加した場合には、推奨されるコーティング濃度の1/4量のコーティング濃度(0.125μg/cm2)でも十分なiPS細胞の増殖が観察された。また、HSAまたはゼラチンを添加して511E8をコーティングしたプレート上で培養したヒトiPS細胞は、アルカリホスファターゼ活性染色で強く染色されることから、未分化性が維持されていると考えられた。
実験方法
細胞培養用24ウェルプレート(ベクトン・ディッキンソン cat#353047;培養面積1.88 cm2)を521E8単独で、またはHSA(Biological Industries cat#05-720-1B)もしくはゼラチン(ニッピ APAT)を添加した521E8を用いてコーティングし、細胞培養用基質としての521E8の活性が増強されるかを、実施例3に記載の方法に準じて検討した。具体的には、終濃度500μg/mLのHSAまたはゼラチンを含むPBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)で希釈した521E8を各ウェルに0.25μg/cm2になるように加えて、4℃で一晩(約18時間)緩やかに振盪しながらプレートをコーティングした。対照として、HSAおよびゼラチンを含まないPBSで希釈した521E8を0.5μg/cm2または0.25μg/cm2になるように加えて、同様にプレートをコーティングした。コーティング溶液を除いたのち、TrypLE Select(ライフテクノロジーズ、cat#A12859-01)を用いて単一細胞に分散した201B7細胞を4.15×103個/cm2となるように播種して、1週間培養した。培地にはTeSR2とNutriStemの1:1混合液を用いた。培地は1日おきに交換した。培養開始1週間後に、細胞をアルカリホスファターゼ染色した。アルカリホスファターゼ染色は白血球アルカリホスファターゼキット(シグマ・アルドリッチ、cat#86R-1KT)を用いて、キットに添付の推奨プロトコールに従って行った。
細胞をアルカリホスファターゼ染色した結果を図6に示した。HSAおよびゼラチンを添加せずに521E8をコーティングした場合、0.5μg/cm2でコーティングしたプレート上では多数のコロニーがみられ、十分なiPS細胞の増殖が観察されたが、0.25μg/cm2でコーティングしたプレート上では、iPS細胞は増殖するものの、ウェル全体にわたるコロニーの成長はみられなかった。一方、500μg/mLのHSAまたはゼラチンを添加して521E8を0.25μg/cm2でコーティングしたプレート上では、ウェルの全面にわたってコロニーが生じており、HSAおよびゼラチンを添加せずに521E8を0.25μg/cm2でコーティングしたプレートと比較してiPS細胞の増殖が有意に亢進していた。また、521E8を0.5μg/cm2でコーティングしたプレートと比較しても、同等以上のiPS細胞の増殖が認められた。また、HSAまたはゼラチンを添加して521E8をコーティングしたプレート上で培養したヒトiPS細胞は、アルカリホスファターゼ活性染色で強く染色されることから、未分化性が維持されていると考えられた。
HSAやゼラチン等の他の蛋白質を含むPBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)でコーティング濃度付近まで希釈した511E8が、その活性を長期間安定に保持できるかどうかを、インテグリン結合活性を指標として検討した。
実験方法
500μg/mLのゼラチン(ニッピ APAT)を含むPBSで511E8を32nM(4.8μg/mL)に希釈したのち、ガラス瓶に入れて4℃で保存した。また、ゼラチンを含まないPBSで32nMに希釈した511E8を調製し、同様にガラス瓶に入れて4℃で保存した。16週間保存したコーティング溶液を22nM, 11nM, 5.5nM, 0nMとなるように希釈したのち、96ウェルプレート(ベクトン・ディッキンソン cat#353072)に50μL/well加え、4℃で一晩ゆるやかに振盪しながらプレートをコーティングした。対照として、コーティング直前に511E8濃度が22nM, 11nM, 5.5nM, 0nMとなるようにPBSで希釈した新たなコーティング溶液を調製し、96ウェルプレートに50μL/well加え、同様にプレートをコーティングした。インテグリン結合活性は、実施例1と同じ方法で測定した。
結果を図7に示した。用時調製したコーティング溶液でコーティングしたプレートと比較して、ゼラチンを添加せずに4℃で16週間保存したコーティング溶液を使用した場合は、5.5〜22 nMのいずれのコーティング濃度においても有意なインテグリン結合活性の低下が認められた。一方、500μg/mLのゼラチンを添加して16週間保存したコーティング溶液を使用した場合は、標準的なコーティング濃度である22 nM(0.5μg/cm2に相当)において、長期保存によるインテグリン結合活性の低下は認められなかった。驚くべきことに、5.5 nMまたは11 nMのコーティング濃度ではインテグリン結合活性の有意な増加が観察された。さらに、5.5 nMあるいは11 nMでも22 nMとほぼ同等のインテグリン結合活性が得られており、4℃で16週間保存後でもゼラチンによる511E8の賦活化効果が維持されていることが確認された。
HSAやゼラチン等の他の蛋白質を含むPBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)でコーティング濃度付近まで希釈した521E8が、その活性を長期間安定に保持できるかどうかを、ヒトiPS細胞の増殖を指標として検討した。
実験方法
500μg/mLまたは2000μg/mLのHSA(Biological Industries cat#05-720-1B)を含むPBSで521E8を16nM(2.4μg/mL)、8nM(1.2μg/mL)に希釈したのち、ポリプロピレン製50mLチューブ(IWAKI Cat.No.2345-050, Asahi Glass Co., Ltd)に入れて4℃で保存した。また、HSAを含まないPBSで16nM(2.4μg/mL)、8nM(1.2μg/mL)に希釈した521E8を調製し、同様にポリプロピレン製50mLチューブに入れて4℃で保存した。13週間保存した521E8コーティング溶液を細胞培養用24ウェルプレート(ベクトン・ディッキンソン cat#353047;培養面積1.88cm2)に0.25μg/cm2または0.125μg/cm2になるように加え、4℃で一晩ゆるやかに振盪しながらプレートをコーティングした。対照として、コーティング直前にHSAを含まないPBSで希釈した521E8を新たに調製し、0.25μg/cm2または0.125μg/cm2になるように加えて、同様にプレートをコーティングした。コーティング溶液を除いたのち、TrypLE Select(ライフテクノロジーズ、cat#A12859-01)を用いて単一細胞に分散したヒトiPS細胞409B2株を1.3×104個/wellとなるように播種して、6日間培養した。培地にはTeSR2とNutriStemの1:1混合液を用いた。培地は1日おきに交換した。培養開始6日後に、細胞をアルカリホスファターゼ染色した。アルカリホスファターゼ染色は白血球アルカリホスファターゼキット(シグマ・アルドリッチ、cat#86R-1KT)を用いて、キットに添付の推奨プロトコールに従って行った。
細胞をアルカリホスファターゼ染色した結果を図8に示した。HSAを添加せずに521E8をコーティングした場合、0.25μg/cm2でコーティングしたプレート上では多数のコロニーがみられ、十分なiPS細胞の増殖が観察されたが、0.125μg/cm2でコーティングしたプレート上では、iPS細胞は増殖するものの、ウェル全体にわたるコロニーの成長はみられなかった。このiPS細胞の増殖性の違いは、コーティング溶液を用事調製したか、調製後13週間冷蔵保存したかにかかわらず観察された。一方、500μg/mLあるいは2000μg/mL のHSAを添加して13週間冷蔵保存した521E8を0.125μg/cm2でコーティングしたプレート上では、ウェルの全面にわたってコロニーが生じており、HSAを添加せずにコーティングしたプレートと比較してiPS細胞の増殖が有意に亢進していた。また、521E8を0.25μg/cm2でコーティングしたプレートと比較しても、同等のiPS細胞の増殖が認められた。また、HSAを添加して521E8をコーティングしたプレート上で培養したヒトiPS細胞は、アルカリホスファターゼ活性染色で強く染色されることから、未分化性が維持されていると考えられた。
実験方法
(1)1×コーティング溶液の調製および保存
500μg/mLまたは2000μg/mLのHSA(Biological Industries cat#05-720-1B)を含むPBS(ナカライ)で511E8を3.2μg/mLおよび1.6μg/mLにそれぞれ希釈したのち、ポリプロピレン製50mLチューブ(ベクトン・ディッキンソン)に入れて4℃で保存した。また、500μg/mLまたは2000μg/mLのゼラチン(ニッピ APAT)を含むPBSで511E8を3.2μg/mLおよび1.6μg/mLにそれぞれ希釈したのち、ポリプロピレン製50mLチューブに入れて4℃で保存した。対照として、HSA、ゼラチン等の他の蛋白質を含まないPBSで511E8を3.2μg/mLおよび1.6μg/mLにそれぞれ希釈し、同様にポリプロピレン製50mLチューブに入れて4℃で保存した。
12か月間冷蔵保存したコーティング溶液を用いて、細胞培養用24ウェルプレート(ベクトン・ディッキンソン cat#353047;培養面積1.88cm2)または細胞培養用6ウェルプレート(ベクトン・ディッキンソン cat#353046;培養面積 9.6cm2)をコーティングした。511E8のコーティング濃度が0.5μg/cm2(511E8濃度が3.2μg/mLの場合)または0.25μg/cm2(511E8濃度が1.6μg/mLの場合)になるように、コーティング液量を、24ウェルプレートでは300μL/well、6ウェルプレートでは1.5mL/wellとした。コーティング溶液をウェルに添加した後、4℃で一晩ゆるやかに振盪しながらプレートをコーティングした。対照として、コーティング直前に、HSA、ゼラチン等の他の蛋白質を含まないPBSで希釈した511E8を新たに調製し、0.5μg/cm2または0.25μg/cm2になるように加えて、同様にプレートをコーティングした。
コーティング溶液を除いたのち、TrypLE Select(ライフテクノロジーズ、cat#A12859-01)を用いて単一細胞に分散したヒトiPS細胞409B2株を、24ウェルプレートには1.3×104個/well、6ウェルプレートには5.2×104個/wellとなるように播種して、1週間培養した。培地にはTeSR2とNutriStemの1:1混合液を用いた。細胞播種時のみ細胞死を抑制するためのROCK阻害剤(Y-27632、和光純薬)を最終濃度が10μMとなるよう培地に添加した。細胞播種した翌日に培地交換し、その後5日目までは1日おきに、5日目以降は毎日培地交換した。1週間目に80〜90%コンフルエントに達したので、以下の試験に供した。
24ウェルプレートで培養したヒトiPS細胞をアルカリホスファターゼ染色に供した。アルカリホスファターゼ染色は、実施例6と同様に、白血球アルカリホスファターゼキット(シグマ・アルドリッチ、cat#86R-1KT)を用いて、キットに添付の推奨プロトコールに従って行った。
6ウェルプレートで培養したヒトiPS細胞をフローサイトメトリー解析に供した。フローサイトメトリー解析は山田ら(Yamada et al., Biochem. J., 2008)に記載の方法に基づいて、一部変更した方法で実施した。使用した未分化マーカーに対する抗体は、FITC標識マウスIgG3(コントロール)、FITC標識抗マウスSSEA4抗体、FITC標識抗マウスTra 1-60抗体、Alexa flour 488標識IgG1(コントロール)(以上は細胞表面マーカー用)、およびAlexa flour 488標識抗OCT3/4抗体(細胞内マーカー)である。これらの抗体は、いずれもBD Pharmingen社製である。
80μL細胞懸濁液は細胞表面マーカー用(IgG3、SSEA4、Tra 1-60、IgG1)として使用した。1500rpmで遠心後上清を除去し、80μLの1.5%牛胎児血清(FBS、ライフテクノロジーズ)/PBSを加えて再懸濁した。細胞懸濁液を4等分(20μL/tube)し、15分間氷上に静置してブロッキングを行なった。ブロッキング後、20μLの各抗体をそれぞれチューブに添加し、氷上で遮光して1時間インキュベーションした。
20μLの細胞懸濁液は細胞内マーカー用(OCT3/4)として使用した。細胞懸濁液にTriton X-100濃度が0.1%となるように20μLの0.2%Triton X-100/PBSを加えて15分間室温で細胞透過処理を行った。遠心後上清を除去し、100μLの1.5%FBS/PBSを添加し、室温で15分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、20μLの抗OCT3/4抗体を添加し、室温で遮光して1時間インキュベーションした。
各抗体で染色した細胞をPBSで洗浄し、500μLのPBSに再懸濁した。フローサイトメーター(FACScan;BD社製)を用いて解析を行った。
(1)アルカリホスファターゼ染色
細胞をアルカリホスファターゼ染色した結果を図9および図10に示した。図9は他の蛋白質としてHSAを用いた結果、図10は他の蛋白質としてゼラチンを用いた結果である。他の蛋白質を添加せずに511E8をコーティングした場合、0.25μg/cm2でコーティングしたプレート上では、iPS細胞は増殖するものの、ウェル全体にわたるコロニーの成長はみられなかった(図9,10の左から2,3番目)。これは用事調製したコーティング溶液を用いた場合も、12か月間保存したコーティング溶液を用いた場合も同じであった。他の蛋白質を添加しないコーティング溶液を用事調製し、0.5μg/cm2でコーティングしたプレート上では、十分なiPS細胞の増殖が観察された(図9,10の左端)。
一方、図9および図10から明らかなように、500μg/mLあるいは2000μg/mL のHSAまたはゼラチンを添加して12か月間保存した511E8を0.25μg/cm2でコーティングしたプレート上では、ウェルの全面にわたってコロニーが生じており、用事調製したコーティング溶液を用いて0.5μg/cm2でコーティングしたプレートと同等のiPS細胞の増殖が認められた。すなわち、12か月間保存後の1×コーティング溶液を用いても、ヒトiPS細胞の培養に推奨される511E8のコーティング濃度(0.5μg/cm2:非特許文献2)の1/2量のコーティング濃度(0.25μg/cm2)で同等のiPS細胞の増殖が得られることが示された。また、HSAまたはゼラチンを添加して511E8をコーティングしたプレート上で培養したヒトiPS細胞は、アルカリホスファターゼ活性染色で強く染色されることから、未分化性が維持されていると考えられた。
解析の結果を図11および図12に示した。図11は他の蛋白質としてHSAを用いた結果、図12は他の蛋白質としてゼラチンを用いた結果である。いずれの群においても、未分化マーカー(SSEA4、Tra 1-60、OCT3/4)の蛍光強度(FL-1値)は、IgGコントロールより高くなっており、未分化性が維持されていることが示された。その値はHASまたはゼラチンの添加および12か月の保存により低下しなかった。
実験方法
(1)1×コーティング溶液の調製および保存
500μg/mLまたは2000μg/mLのHSA(Biological Industries cat#05-720-1B)を含むPBS(ナカライ)で521E8を3.2μg/mL、1.6μg/mLおよび0.8μg/mLにそれぞれ希釈したのち、ポリプロピレン製50mLチューブ(ベクトン・ディッキンソン)に入れて4℃で保存した。また、500μg/mLまたは2000μg/mLのゼラチン(ニッピ APAT)を含むPBSで521E8を3.2μg/mL、1.6μg/mLおよび0.8μg/mLにそれぞれ希釈したのち、ポリプロピレン製50mLチューブに入れて4℃で保存した。対照として、HSA、ゼラチン等の他の蛋白質を含まないPBSで521E8を3.2μg/mL、1.6μg/mLおよび0.8μg/mLにそれぞれ希釈し、同様にポリプロピレン製50mLチューブに入れて4℃で保存した。
12か月間冷蔵保存したコーティング溶液を用いて、実施例7と同じ方法で、細胞培養用24ウェルプレートおよび細胞培養用6ウェルプレートに521E8をコーティングした。521E8のコーティング濃度は、0.5μg/cm2(521E8濃度が3.2μg/mLの場合)、0.25μg/cm2(521E8濃度が1.6μg/mLの場合)または0.125μg/cm2(521E8濃度が0.8μg/mLの場合)とした。対照として、コーティング直前に、HSA、ゼラチン等の他の蛋白質を含まないPBSで希釈した521E8を新たに調製し、0.5μg/cm2、0.25μg/cm2または0.125μg/cm2になるように加えて、同様にプレートをコーティングした。
実施例7と同じ方法で行った。
(4)アルカリホスファターゼ染色
実施例7と同じ方法で行った。
(5)FACS解析
実施例7と同じ方法で行った。
(1)アルカリホスファターゼ染色
細胞をアルカリホスファターゼ染色した結果を図13および図14に示した。図13は他の蛋白質としてHSAを用いた結果、図14は他の蛋白質としてゼラチンを用いた結果である。他の蛋白質を添加せずに521E8をコーティングした場合、0.125μg/cm2でコーティングしたプレート上では、iPS細胞はほとんど増殖せず(図13の左から2,3番目)、0.25μg/cm2でコーティングしたプレート上では、iPS細胞は増殖するものの、ウェル全体にわたるコロニーの成長はみられなかった(図13の左端、図14の左から2,3番目)。これは用事調製したコーティング溶液を用いた場合も、12か月間保存したコーティング溶液を用いた場合も同じであった。他の蛋白質を添加しないコーティング溶液を用事調製し、0.5μg/cm2でコーティングしたプレート上では、十分なiPS細胞の増殖が観察された(図14の左端)。
一方、図13から明らかなように、500μg/mLあるいは2000μg/mL のHSAを添加して12か月間保存した521E8を0.125μg/cm2でコーティングしたプレート上では、ウェルの全面にわたってコロニーが生じており、用事調製したコーティング溶液を用いて0.25μg/cm2でコーティングしたプレートより顕著に優れたiPS細胞の増殖が認められた。また、図14から明らかなように、500μg/mLあるいは2000μg/mL のゼラチンを添加して12か月間保存した521E8を0.25μg/cm2でコーティングしたプレート上では、ウェルの全面にわたってコロニーが生じており、用事調製したコーティング溶液を用いて0.5μg/cm2でコーティングしたプレートと同等のiPS細胞の増殖が認められた。すなわち、12か月間保存後の1×コーティング溶液を用いても、他の蛋白質を用いずに用時調製した場合に十分なiPS細胞の増殖が認められたコーティング濃度(0.5μg/cm2)の1/4〜1/2量のコーティング濃度(0.125〜0.25μg/cm2)で同等のiPS細胞の増殖が得られることが示された。また、HSAまたはゼラチンを添加して521E8をコーティングしたプレート上で培養したヒトiPS細胞は、アルカリホスファターゼ活性染色で強く染色されることから、未分化性が維持されていると考えられた。
解析の結果を図15および図16に示した。図15は他の蛋白質としてHSAを用いた結果、図16は他の蛋白質としてゼラチンを用いた結果である。いずれの群においても、未分化マーカー(SSEA4、Tra 1-60、OCT3/4)の蛍光強度(FL-1値)は、IgGコントロールより高くなっており、未分化性が維持されていることが示された。その値はHSAの添加および12か月の保存により低下しなかった。なお、他の蛋白質を添加せずに521E8を12か月間保存したコーティング溶液を用いて0.125μg/cm2でコーティングした群は、FACS解析に供する十分な細胞数が得られず、解析不可能であった。
HSAやゼラチンの添加によるインテグリン結合活性の増加が511E8や521E8だけでなく、他のラミニンE8フラグメントでも観察されるかを、211E8および411E8を用いて検討した。
実験方法
(1)プレートのコーティング
500μg/mLのヒト血清アルブミン(Biological Industries cat#05-720-1B;以下HSAと記す)を含むPBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)で終濃度が25nM、10nM、5nM、0nMになるように211E8または411E8を段階希釈したのち、それぞれ96ウェルプレート(ベクトン・ディッキンソン #353072、培養面積0.32cm2/well)に50μL/well加え、4℃で一晩ゆるやかに振盪しながらコーティングを行った。
(2)インテグリン結合アッセイ
実施例1に記載の方法に従い、インテグリン結合活性を測定した。ただし、411E8に対してはα6β1インテグリン溶液(30nM α6β1インテグリン、19.6mM Tris、127mM NaCl、0.0056% Tween-20、0.1% BSA、1mM MnCl2)を用い、211E8に対してはα7X2β1インテグリン溶液(30nM α7X2β1インテグリン、19.6mM Tris、127mM NaCl、0.0056% Tween-20、0.1% BSA、1mM MnCl2)を用いて、インテグリン結合アッセイを行った。アッセイに用いた組換えα7X2β1インテグリンは、Taniguchiら(Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiguti, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The C-terminal region of laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins” The Journal of Biological Chemistry, 284, 7820-7831, 2009)に記載の方法に従い、調製した。
500μg/mLのHSAを添加して211E8をコーティングした場合のインテグリン結合活性の測定結果を図17に示した。511E8や521E8と同様、低濃度(5nMおよび10nM)の211E8でコーティングした場合に、HSAの添加による有意なインテグリン結合活性の増加が観察された。211E8のコーティング濃度が25nMの場合には、521E8をコーティングした場合と同様、インテグリン結合活性の増加は認められなかった。
HSAやゼラチンの添加によるインテグリン結合活性の増加がラミニンE8フラグメントと細胞接着分子または増殖因子結合分子のキメラ分子でも観察されるかを、増殖因子結合分子と511E8とのキメラ分子を用いて検討した。増殖因子結合分子と511E8とのキメラ分子としては、511E8のN末端部にヒトパールカンのドメインI〜IIIを融合させたラミニンフラグメント改変体(Plus#3ラミニンE8)および511E8のC末端部にヒトパールカンのドメインIを融合させたラミニンフラグメント改変体(Plus#5ラミニンE8)の2種類の511E8改変体を用いた。Plus#3ラミニンE8およびPlus#5ラミニンE8は、国際公開WO2014/199754に記載の方法により調製し、インテグリン結合活性の測定に供した。
(1)プレートのコーティング
500μg/mLのヒト血清アルブミン(Biological Industries cat#05-720-1B;以下HSAと記す)を含むPBS(Gibco、cat#10010-049、pH 7.4)で終濃度が22nM、11nM、5.5nM、0nMになるようにPlus#3ラミニンE8またはPlus#5ラミニンE8を段階希釈したのち、それぞれ96ウェルプレート(ベクトン・ディッキンソン #353072、培養面積0.32cm2/well)に50μL/well加え、4℃で一晩ゆるやかに振盪しながらコーティングを行った。
(2)インテグリン結合アッセイ
実施例1に記載の方法に従い、α6β1インテグリン溶液(10nM α6β1インテグリン、19.6mM Tris、127mM NaCl、0.0056% Tween-20、0.1% BSA、1mM MnCl2)を用いてインテグリン結合活性を測定した。
500μg/mLのHSAを添加してPlus#3ラミニンE8およびPlus#5ラミニンE8をコーティングした場合のインテグリン結合活性の測定結果を図19および図20に示した。いずれのラミニンフラグメント改変体においても、コーティング濃度が5.5nMおよび11nMの場合に、500μg/mLのHSAを添加してコーティングすることによって、インテグリン結合活性の有意な増加が観察された。一方、22nMでラミニンフラグメント改変体をコーティングした場合には、500μg/mLのHSAを添加してもインテグリン結合活性の増加は観察されなかった。
Claims (16)
- インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体の哺乳動物培養細胞に対する活性を増強する方法であって、
前記ラミニンフラグメントまたはその改変体、および、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質を含むコーティング溶液を細胞培養器具の培養面に接触させ、前記ラミニンフラグメントまたはその改変体を培養面にコーティングすることを含み、
前記コーティング溶液は、0.5μg/cm2より低いコーティング濃度になる量の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体を含み、かつ、前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が50μg/mL以上であり、
前記哺乳動物培養細胞に対する活性が、細胞表面の接着受容体に対する結合活性、細胞接着活性、細胞増殖活性およびコロニー形成活性から選択される少なくとも一種であることを特徴とする活性増強方法。 - 前記コーティング溶液の前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が200μg/mL以上であることを特徴とする請求項1に記載の活性増強方法。
- 前記コーティング溶液の前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が500μg/mL以上であることを特徴とする請求項2に記載の活性増強方法。
- 前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質の分子量が10000以上であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の活性増強方法。
- 前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質が、ゼラチン、血清アルブミン、トランスフェリン、ミエリン塩基性蛋白質、β−ラクトグロブリン、グルタチオン−S−トランスフェラーゼおよびコラーゲンからなる群より選択される1種以上であることを特徴とする請求項4に記載の活性増強方法。
- ラミニンフラグメントが、ラミニンα5β1γ1、ラミニンα5β2γ1、ラミニンα4β1γ1およびラミニンα2β1γ1から選択される少なくとも1種由来であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の活性増強方法。
- ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントであることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の活性増強方法。
- インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体がコーティングされている細胞培養器具を用いる哺乳動物細胞の培養方法であって、
前記細胞培養器具は、前記ラミニンフラグメントまたはその改変体、および、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質を含むコーティング溶液を細胞培養器具の培養面に接触させることにより作製され、
前記コーティング溶液は、0.5μg/cm2より低いコーティング濃度になる量の前記ラミニンフラグメントまたはその改変体を含み、かつ、前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が50μg/mL以上であることを特徴とする培養方法。 - 前記コーティング溶液の前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質濃度が200μg/mL以上であることを特徴とする請求項8に記載の培養方法。
- 前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質の分子量が10000以上であることを特徴とする請求項8または9に記載の培養方法。
- ラミニンフラグメントが、ラミニンα5β1γ1、ラミニンα5β2γ1、ラミニンα4β1γ1およびラミニンα2β1γ1から選択される少なくとも1種由来であることを特徴とする請求項8〜10のいずれかに記載の培養方法。
- ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントであることを特徴とする請求項8〜11のいずれかに記載の培養方法。
- 細胞培養器具の培養面にラミニンフラグメントまたはその改変体をコーティングするための溶液であって、
インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントまたはその改変体、および、ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質を含み、
前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が5μg/mL以下であり、前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質の濃度が50μg/mL以上であることを特徴とするコーティング溶液。 - 細胞培養器具の培養面におけるラミニンフラグメントまたはその改変体のコーティング濃度が、0.5μg/cm2より低いコーティング濃度になるように、前記ラミニンフラグメントまたはその改変体の濃度が調整されていることを特徴とする請求項13に記載のコーティング溶液。
- 前記ラミニンまたはそのフラグメント以外の蛋白質の分子量が10000以上であることを特徴とする請求項13または14に記載のコーティング溶液。
- 前記ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントであることを特徴とする請求項13〜15のいずれかに記載のコーティング溶液。
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