WO2024019080A1 - 血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法、および肺疾患治療用医薬組成物 - Google Patents
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- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- the present invention relates to a method for producing umbilical cord-derived mesenchymal cells that highly express vascular endothelial growth factor, and a pharmaceutical composition for treating lung diseases containing the produced umbilical cord-derived mesenchymal cells as an active ingredient.
- COPD chronic obstructive pulmonary disease
- COPD chronic obstructive pulmonary disease
- emphysema a progressive lung disease mainly caused by airflow obstruction caused by smoking and air pollution. It is an inflammatory disease.
- COPD is one of the major causes of death in countries around the world, including Japan, and is a disease with high morbidity.
- drug therapy for COPD is useful for improving symptoms, reducing the risk and severity of exacerbations, maintaining lung function, and improving patients' quality of life, there is still no treatment that completely cures chronic obstructive pulmonary disease.
- Non-Patent Document 1 reports that systemic administration of mesenchymal stem cells (MSCs) may be useful for suppressing inflammation in COPD patients.
- Non-Patent Document 2 discloses the results of administering bone marrow-derived MSCs to COPD patients, and reports that systemic inflammation and oxidative stress-related biomarkers were reduced. Specifically, inflammation levels have been shown to decrease most markedly approximately 12-24 hours after MSC administration and return to baseline levels within a few days after MSC administration, making it difficult to obtain clinical utility. , suggesting that it is important to administer MSCs once weekly.
- An object of the present invention is to provide a method for producing umbilical cord-derived mesenchymal cells that are effective in treating lung diseases and engraft in the lungs for a long time, and a pharmaceutical composition for treating lung diseases.
- the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
- a method for producing umbilical cord-derived mesenchymal cells highly expressing vascular endothelial growth factor which includes the step of culturing umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on a collagen gel.
- the collagen gel contains laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1 or laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1E8 fragment.
- the concentration of laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1 or laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1E8 fragment is 0.1 ⁇ g/cm 2 to 1.5 ⁇ g/cm 2 per culture area.
- a pharmaceutical composition for the treatment of lung diseases containing, as an active ingredient, umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method according to any one of [1] to [4] above.
- the lung disease is chronic obstructive pulmonary disease, acute respiratory distress syndrome, idiopathic pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, radiation pneumonitis, hypersensitivity pneumonitis, or eosinophilic pneumonitis, [5] The pharmaceutical composition described in ].
- a medicament for treating comorbidities induced by lung disease containing as an active ingredient umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method according to any one of [1] to [4] above.
- Composition [8] The pharmaceutical composition according to [7] above, wherein the comorbid disease is cardiovascular disease, diabetes, nutritional disorder, osteoporosis, or skeletal muscle dysfunction. [9] The above-mentioned [7], wherein the lung disease is chronic obstructive pulmonary disease, acute respiratory distress syndrome, idiopathic pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, radiation pneumonitis, hypersensitivity pneumonitis, or eosinophilic pneumonitis.
- the present invention it is possible to provide a method for producing umbilical cord-derived mesenchymal cells that are effective in treating lung diseases and engraft in the lungs for a long time. Furthermore, it is possible to provide a pharmaceutical composition for treating lung diseases, which contains the umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method as an active ingredient.
- FIG. 2 is a diagram showing the results of screening for extracellular matrices that enhance gene expression of blood vessel-related factors in umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
- FIG. 2 is a diagram showing the results of flow cytometry analysis of changes in the expression of extracellular matrix and angiogenic surface marker proteins used for culturing umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
- Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured on collagen gel, mixed gel of collagen and laminin 411E8, or non-coated plate were administered to emphysema model mice, and lung tissue specimens were prepared and stained with hematoxylin and eosin for observation. It is a figure showing a result.
- FIG. 1 shows the results of screening for extracellular matrices that enhance gene expression of blood vessel-related factors in umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
- FIG. 2 is a diagram showing the results of flow cytometry analysis of changes in the expression of extra
- FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring the alveolar wall area using the tissue specimen of FIG. 3 and comparing the average values of each group.
- Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells transfected with luciferase-GFP were cultured on collagen gel, collagen and laminin 411E8 mixed gel, or non-coated plate, and administered to emphysema model mice to prepare lung tissue specimens.
- FIG. 3 is a diagram showing the results of observing GFP-positive cells engrafted in the lungs.
- FIG. 4 shows the results of immunostaining with anti-F4/80 antibody (upper row) and the results of flow cytometry analysis of the expression of GFP and CD206 in collected lung cells (lower row).
- Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells transfected with luciferase-GFP were cultured on collagen gel, collagen and laminin 411E8 mixed gel, or non-coated plate, and administered to emphysema model mice to prepare lung tissue specimens. Immunostaining with anti-Elastin antibody and anti- ⁇ -SMA antibody (upper row), immunostaining with anti-CD34 antibody and anti-CD31 antibody (middle row), and immunostaining with anti-HO-1/HMOX1 antibody and anti-SP-C antibody (lower row). It is a figure showing the result of observation.
- FIG. 2 is a diagram showing the results of flow cytometry analysis of the expression of (upper row) and the results of immunostaining and observing lung tissue specimens prepared with anti-F4/80 antibody and anti-CD206 antibody (lower row).
- FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring the expression level of IL-6 in osteoclasts obtained by inducing differentiation by quantitative RT-PCR.
- Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured on non-coated plates were administered alone or together with collagen pseudopeptide or laminin-derived peptide to emphysema model mice, and lung tissue specimens were prepared and observed using hematoxylin and eosin staining. It is a figure showing a result.
- the present invention provides a method for producing umbilical cord-derived mesenchymal cells that highly express vascular endothelial growth factors (hereinafter referred to as "the production method of the present invention").
- the production method of the present invention is characterized by including a step of culturing umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on a collagen gel.
- the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells may be any mammalian umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, but it is preferable to use human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
- Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells can be obtained, for example, from the University of Tokyo Institute of Medical Science Hospital Umbilical Cord Blood Bank (IMSUT CORD).
- Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells can be collected non-invasively, and since they do not express HLA II, they can be transplanted allogeneically, and banking is underway, so a stable supply is possible. And it is highly useful.
- the method for culturing umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on collagen gel is not particularly limited, and any known collagen gel culture method can be used.
- any known collagen gel culture method can be used.
- Collagen gels can be prepared using commercially available reagents or kits.
- Nitta Gelatin's collagen for cell culture product name: Cell Matrix Type I-A
- collagen gel culture kit kit contents: Cell Matrix Type I-A, concentrated culture medium, reconstitution buffer
- Cell Matrix Type I-A is acid-extracted collagen derived from porcine tendon (collagen concentration: 3 mg/mL [pH 3]) and is sold as a product optimized for collagen gel culture.
- Nippi's Collagen Gel Cell Culture Kit Tri-D kit contents: collagen reagent, water for dilution, 3x concentrated medium
- the collagen reagent in this kit can be selected from type I collagen derived from bovine dermis (acid extraction), type I collagen derived from bovine dermis (pepsin solubilized), and type I collagen derived from porcine dermis (pepsin solubilized), all of which have different collagen concentrations. It is 3mg/mL.
- the collagen concentration in the collagen gel is not particularly limited, and it is preferable to conduct a preliminary test and measure the expression level of vascular endothelial growth factor in umbilical cord-derived mesenchymal stem cells after culturing, and select the optimal collagen concentration.
- the collagen concentration may be, for example, 0.5 mg/mL to 3 mg/mL, 0.5 mg/mL to 2.5 mg/mL, or 0.5 mg/mL to 2 mg/mL.
- vascular endothelial growth factors include VEGF (vascular endothelial growth factor), VEGFR1 (vascular endothelial growth factor receptor-1), and VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor-1).
- vascular endothelial growth factor receptor-2 vascular endothelial growth factor receptor-2
- PDGF ⁇ platelet-derived growth factor ⁇
- it is VEGF.
- the collagen gel used in the production method of the present invention may contain laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1 or laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1E8 fragment.
- Laminin is a major cell adhesion molecule in the basement membrane, and is a huge glycoprotein with a molecular weight of approximately 800,000, and is a heterotrimer consisting of three subunit chains: ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain.
- the three subunit chains associate at the C-terminus to create a coiled-coil structure, forming a heterotrimeric molecule stabilized by disulfide bonds.
- Laminin ⁇ 4 ⁇ 1 ⁇ 1 is a heterotrimeric molecule consisting of ⁇ 4, ⁇ 1, and ⁇ 1 chains.
- the laminin E8 fragment is a heterotrimer-forming fragment obtained by digesting mouse laminin 111 with elastase, and was identified as a fragment with strong cell adhesion activity (Edgar D et al. , J. Cell Biol., 105:589-598, 1987).
- Laminin 411E8 used in the method of the present invention may be any laminin 411 fragment that has the same cell adhesion activity and similar structure as mouse laminin 111E8.
- Laminin 411E8 is a C-terminal fragment of the ⁇ 4 chain with globular domains 4 and 5 removed ( ⁇ 4 chain E8), a C-terminal fragment of the ⁇ 1 chain ( ⁇ 1 chain E8), and a C-terminal fragment of the ⁇ 1 chain ( ⁇ 1 chain E8). is the fragment that formed the trimer.
- Laminin 411 and laminin 411E8 can be produced by appropriately using known genetic recombination techniques.
- the nucleotide sequence information of genes encoding the ⁇ 4 chain, ⁇ 1 chain, and ⁇ 1 chain that constitute laminin 411 of major mammals and the amino acid sequence information of each chain can be obtained from known databases (such as NCBI).
- Commercially available products can be used for laminin 411 and laminin 411E8.
- laminin 411 for example, human recombinant laminin 411 manufactured by BioLamina can be used.
- Laminin 411E8, iMatrix-411 manufactured by Nippi Corporation can be used.
- the amount of laminin 411 or laminin 411E8 added to collagen gel is not particularly limited, but for example, 0.1 ⁇ g/cm 2 or more, 0.2 ⁇ g/cm 2 or more, 0.3 ⁇ g/cm 2 or more, 0.4 ⁇ g per culture area of the culture container. / cm2 or more, or 1.5 ⁇ g/ cm2 or less, 1.0 ⁇ g/ cm2 or less, 0.8 ⁇ g/ cm2 or less, or 0.6 ⁇ g/ cm2 or less. .
- Gelation can be achieved by adding laminin 411 solution or laminin 411E8 solution to the cooled collagen solution, mixing it, dispensing it into a culture container, and heating it (for example, 25° C. to 37° C.).
- the thickness of the gel is not particularly limited, and may be, for example, 0.2 mm or more, 0.4 mm or more, 0.6 mm or more, 0.8 mm or more, 1.0 mm or more, 1.5 mm or more, or 2.0 mm or more.
- the medium used is not particularly limited, and can be appropriately selected from known media that can be used for culturing umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. Examples include Dulbecco's Modified Eagle Medium-Low Glucose (LG-DMEM) supplemented with serum and antibiotics, ⁇ -MEM supplemented with serum and antibiotics, and the like.
- LG-DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium-Low Glucose
- ⁇ -MEM supplemented with serum and antibiotics, and the like.
- Xeno-Free medium a medium containing no animal-derived components
- Xeno-Free medium a commercially available Xeno-Free medium for mesenchymal stem cells such as R:STEM Medium (Rohto Pharmaceutical Co., Ltd.) can be suitably used.
- the number of seeded cells is not particularly limited, and may be increased or decreased as appropriate depending on the size of the culture container used.
- the seeding cell density may be 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more, 1.5 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more, 2 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more, and 6 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, It may be 5 ⁇ 10 4 pieces/cm 2 or less, or 4 ⁇ 10 4 pieces/cm 2 or less.
- the culture period is not particularly limited, and may be, for example, 2 days to 10 days, or 3 days to 7 days.
- the medium may be replaced during the culture period.
- the frequency of medium exchange is not particularly limited, but may be, for example, once every 3 to 4 days.
- Cells cultured on collagen gel can be recovered by dissolving the gel with collagenase according to a standard method.
- the umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention are umbilical cord-derived mesenchymal cells that highly express vascular endothelial growth factors. may be measured. Furthermore, since the umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention preferably have stem cell properties, the expression level of mesenchymal stem cell markers may be measured. Examples of positive cell surface markers for mesenchymal stem cells include CD73, CD90, and CD105, and examples of negative cell surface markers include CD45, CD34, CD19, and HLA-DR.
- Umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention can be frozen and preserved by suspending them in a medium supplemented with a cryoprotectant according to a standard method. It is preferable to use liquid nitrogen for cryopreservation.
- Umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention remain in the lungs for a longer period of time than umbilical cord-derived mesenchymal cells obtained by culturing on plates coated with an extracellular matrix other than collagen gel. It has been confirmed that engraftment is possible. More specifically, the umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention can efficiently induce blood vessels, downregulate inflammatory cytokine production, and suppress apoptosis.
- the umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention enhance adhesion to alveolar tissues via integrin ⁇ 1, promote polarization of M2 macrophages, and collapse lungs through the formation of smooth muscle fibers. It can contribute to cell wall repair.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for treating lung diseases, which contains as an active ingredient the umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention.
- Pulmonary diseases to be treated include, for example, chronic obstructive pulmonary disease, acute respiratory distress syndrome, idiopathic pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, radiation pneumonitis, hypersensitivity pneumonitis, and eosinophilic pneumonitis. However, it is not limited to this.
- Preferred is chronic obstructive pulmonary disease.
- the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating comorbid diseases induced by chronic obstructive pulmonary disease, which contains umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the above-described production method of the present invention as an active ingredient.
- Comorbidities induced by chronic obstructive pulmonary disease include, but are not limited to, cardiovascular disease, diabetes, nutritional disorders, osteoporosis, skeletal muscle dysfunction, and the like.
- Cardiovascular diseases include, for example, angina pectoris, arrhythmia, heart failure, and the like.
- the umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention highly express vascular endothelial growth factors and can engraft in the lungs for a long time, so they can alleviate chronic inflammation in the long term. This method is advantageous in that the administration interval can be extended compared to the clinical trial described in Section 2. Furthermore, the umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention can promote differentiation into vascular endothelium and smooth muscle cells, which is advantageous in that they contribute to high therapeutic effects.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for treating lung diseases containing the following (a), (b), or (c) (hereinafter referred to as "mixtures (a) to (c)”) as active ingredients. do.
- Umbilical cord-derived mesenchyme A mixture of type cells, collagen, collagen-derived peptide, or collagen pseudopeptide, and laminin or laminin-derived peptide
- pulmonary diseases to be treated include diseases similar to those exemplified in the pharmaceutical composition for treating pulmonary diseases containing umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention as an active ingredient. , preferably chronic obstructive pulmonary disease.
- the collagen-derived peptide and collagen-mimetic peptide are not particularly limited as long as they are peptides having a repeating sequence of three amino acids: glycine (Gly)-Xaa-Yaa (Xaa and Yaa represent any amino acids).
- Xaa may be proline and Yaa may be 4(R)hydroxyproline.
- Examples of collagen-mimetic peptides include GFOGER peptide (SEQ ID NO: 15), which specifically binds to integrin ⁇ 2 ⁇ 1.
- the laminin-derived peptide is preferably a peptide that consists of a partial sequence present in laminin and can be involved in cell adhesion.
- laminin-derived peptides include YIGSR peptide (SEQ ID NO: 16), which is present in laminin ⁇ 1 chain.
- the pharmaceutical composition containing the mixtures (a) to (c) of the present invention as active ingredients can stably engraft umbilical cord-derived mesenchymal cells on the alveolar wall
- the production method of the present invention can be used. It is possible to exhibit alveolar wall repair ability equivalent to or superior to that of a pharmaceutical composition for treating lung diseases containing the produced umbilical cord-derived mesenchymal cells as an active ingredient.
- the pharmaceutical composition of the present invention contains the umbilical cord-derived mesenchymal cells or mixtures (a) to (c) produced by the above-mentioned production method of the present invention as an active ingredient, and contains a pharmaceutically acceptable medium. good.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be implemented as an injection preparation, a cell mass or sheet-like structure implantation preparation, or a gel preparation mixed with any biocompatible gel.
- administration methods include, for example, subcutaneous injection, intralymph node injection, intravenous injection, intravenous drip injection, intraperitoneal injection, intrathoracic injection, and local direct injection.
- direct local administration is preferred as the method of administration.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Preferably it is a human.
- the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and may be any amount that provides a therapeutic effect to the recipient. The specific dosage can be appropriately determined depending on the dosage form, administration method, purpose of use, patient's age, body weight, symptoms, etc.
- the dose of umbilical cord-derived mesenchymal cells per dose is, for example, 10 4 cells/kg or more, 10 5 cells/kg or more, 10 6 cells/kg or more.
- the amount may be 10 9 pieces/kg or less, 10 8 pieces/kg or less, or 10 7 pieces/kg or less.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be stored in a frozen state until immediately before use.
- the temperature for cryopreservation is -30°C or below, -40°C or below, -50°C or below, -80°C or below, -90°C or below, -100°C or below, -150°C or below, -180°C or below, -196°C ( (liquid nitrogen temperature) or lower.
- it can be used after being rapidly thawed in warm water (about 37°C).
- the present invention further includes the following inventions.
- a method for treating a lung disease comprising administering to a patient an effective amount of umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention.
- Umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention for use in the treatment of lung diseases.
- a method for treating comorbid diseases induced by chronic obstructive pulmonary disease the method comprising administering to a patient an effective amount of umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention.
- Umbilical cord-derived mesenchymal cells produced by the production method of the present invention for use in the treatment of comorbidities induced by chronic obstructive pulmonary disease.
- a method for treating a lung disease comprising administering to a patient the following (a), (b) or (c): (a) A mixture of umbilical cord-derived mesenchymal cells and collagen, collagen-derived peptide, or collagen pseudopeptide, (b) a mixture of umbilical cord-derived mesenchymal cells and laminin or a laminin-derived peptide, or (c) a mixture of umbilical cord-derived mesenchymal cells, collagen, a collagen-derived peptide, or a collagen pseudopeptide, and laminin or a laminin-derived peptide.
- Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells (hereinafter referred to as "umbilical cord MSCs") were obtained from the umbilical cord blood and umbilical cord bank, University of Tokyo Institute of Medical Science Hospital. The medium was Dulbecco's modified Eagle's medium-low glucose (Sigma-Aldrich) supplemented with fetal bovine serum (FBS) (Nichirei, 175012-500ML) and penicillin-streptomycin-amphotericin B (Antibiotic-Antimycotic (100X), Sigma-Aldrich). , D6046-500ML) was used. Umbilical cord MSCs were thawed and passaged 4 to 6 times, and highly homogeneous cells were used.
- Nitta Gelatin's Cellmatrix Type I-C (collagen concentration: 3 mg/mL [pH 3]) was used as collagen for coating. According to Nitta Gelatin's "Collagen Gel Culture Method" mentioned above, Cellmatrix Type I-C was diluted by adding 10 times the amount of hydrochloric acid solution (pH 3). 1 mL of the resulting collagen solution with a collagen concentration of 0.3 mg/mL was added to each well and left to stand at room temperature for 1 hour to coat (coating concentration approximately 30 ⁇ g/cm 2 ).
- Fibronectin solution human (PromoCell, C-43060) was used as fibronectin. It was diluted to 50 ⁇ g/mL, added to the wells so that the coating concentration was 5 ⁇ g/cm 2 , and coated by standing at room temperature for 1 hour.
- laminin 211E8, laminin 411E8, and laminin 511E8, iMatrix-211, iMatrix-411, and iMatrix-511 manufactured by Nippi (all manufactured by Nippi, 0.5 mg/mL) were used. Coating was performed according to the product instruction manual so that the coating concentration was 0.5 ⁇ g/cm 2 . A non-coated plate was used as a control.
- the obtained cDNA was subjected to real-time PCR to detect VEGF (vascular endothelial growth factor), VEGFR1 (vascular endothelial growth factor receptor-1), and VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor-1).
- VEGF vascular endothelial growth factor
- VEGFR1 vascular endothelial growth factor receptor-1
- VEGFR2 vascular endothelial growth factor receptor-1
- the expression levels of vascular endothelial growth factor receptor-2 (receptor-2) and platelet-derived growth factor ⁇ (PDGF ⁇ ) were measured.
- GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
- hGAPDH Fwd GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC (SEQ ID NO: 1) hGAPDH Rvs: GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC (SEQ ID NO: 2) hVEGF Fwd: GGCCTTCGCTTACTCTCACC (SEQ ID NO: 3) hVEGF Rvs: CTGTCATGGGCTGCTTCTTC (SEQ ID NO: 4) hVEGFR-1 Fwd: CAGGCCCAGTTTCTGCCATT (SEQ ID NO: 5) hVEGFR-1 Rvs: TTCCAGCTCAGCGTGGTCGTA (SEQ ID NO: 6) hVEGFR-2 Fwd: CCAGCAAAAGCAGGGAGTCTGT (SEQ ID NO: 7) hVEGFR-2 Rvs: TGTCTGTGTCATCGGAGTGATATCCA (SEQ ID NO: 8) hPDGF ⁇ Fwd: GCAAGACCAGGACGGTCATTT (SEQ ID NO: 9) h
- Example 2 Examination of the extracellular matrix used for culturing umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and changes in the expression of angiogenic surface marker proteins]
- 2-1 Experimental method (1) Cells used, culture plate, and extracellular matrix The same umbilical cord MSCs and 6-well culture plate as in Example 1 were used.
- extracellular matrices plates coated with collagen, plates coated with a mixture of collagen and laminin 411E8, plates formed with collagen gel, and plates formed with collagen gel added with laminin 411E8 were prepared. The same collagen-coated plates and collagen gel-formed plates as in Example 1 were prepared and used.
- Plates coated with a mixture of collagen and laminin 411E8 were prepared by adding 9 ⁇ l of iMatrix-411 (0.5 mg/mL) to 1 mL of collagen solution (Cellmatrix Type I-A, Nitta gelatin) diluted to a collagen concentration of 0.3 mg/mL. Mix, add to wells and let stand at room temperature for 1 hour to coat. For the plate on which a collagen gel containing laminin 411E8 was formed, add 9 ⁇ l of iMatrix-411 (0.5 mg/mL) to 2 mL of collagen solution (Cellmatrix Type I-A, Nitta Gelatin) diluted to a collagen concentration of 2.4 mg/mL. It was prepared and used by adding it to a well, mixing it, and heating it at 37°C for 30 minutes to form a gel. A non-coated plate was used as a control.
- Example 2 Cell culture and cell surface marker protein expression analysis A cell suspension of 1 ⁇ 10 5 cells/mL was prepared in the same manner as in Example 1, and cells were seeded at 2 mL/well. After culturing for 3 days, the cells were collected in the same manner as in Example 1, washed twice with PBS, and subjected to flow cytometry analysis. A FACS Lyric (Becton-Dickinson) was used as a flow cytometer, and analysis was performed using FlowJo analysis software (Becton-Dickinson). First, CD90-positive/CD73-positive cells, which are mesenchymal stem cell markers, were sorted.
- FACS Lyric Becton-Dickinson
- Antibodies include anti-human CD73 antibody (PE/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody, BioLegend #344009) and anti-human CD90 antibody (Anti-CD90, Mouse-Mono (Thy-1A1), APC , R&D Systems #FAB2067A).
- anti-mouse IgG1 antibody PE/Cyanine7 Mouse IgG1, ⁇ Isotype Ctrl Antibody, BioLegend #400126
- anti-mouse IgG2A antibody (Mouse IgG2A-APC Isotype Control, R&D Systems #965667) were used as isotype controls.
- CD34 Monoclonal Antibody (4H11), PE, eBioscience #12-0349-42)
- anti-human CD31 antibody Alexa Fluor 488 anti-human CD31 Antibody, BioLegend #303109
- Results are shown in Figure 2.
- the upper row shows the results of flow cytometry analysis of umbilical cord MSCs cultured on each extracellular matrix, stained with anti-CD90 antibody and anti-CD73 antibody, and the lower row shows the results of flow cytometry analysis of umbilical cord MSCs cultured on each extracellular matrix. This is the result of staining with anti-CD73 antibody and flow cytometry analysis.
- the CD90-positive/CD73-positive cell rates when cultured on collagen coat and collagen + laminin 411E8 coat were 86.4% and 87.3%, respectively, whereas when cultured on collagen gel and collagen + laminin 411E8 gel, The CD90-positive/CD73-positive cell rates were 96.2% and 98.6%, respectively, which were significantly increased. Furthermore, the CD31-positive rate in CD90-positive/CD73-positive cells was 15.4% and 20.2% when cultured on collagen coat and collagen + laminin 411E8 coat, respectively, whereas collagen gel and collagen + laminin 411E8 When cultured on gel, the percentages were 61.3% and 71.5%, respectively.
- CD31-positive/CD34-positive rate of CD90-positive/CD73-positive cells was 1.2% and 1.6% when cultured on collagen coat and collagen + laminin 411E8 coat, respectively, whereas collagen gel and collagen +Laminin 411E8 gel culture yielded 5.6% and 7.5%, respectively.
- Example 3 Therapeutic effect of administration of umbilical cord-derived mesenchymal cells to elastase-induced emphysema model mice
- 3-1 Experimental method (1) Elastase-induced emphysema model mouse 8-9 week old C57BL/6 male mice (Nippon CLEA) were used. Mice were anesthetized with isoflurane, and 30 ⁇ g/24 ⁇ L of elastase (derived from porcine pancreas, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. #058-05361) (physiological saline) was intranasally administered once. The animals were kept for 4 weeks after administration to induce emphysema.
- Umbilical cord MSCs were cultured for 3 days on a collagen gel, a mixed gel of collagen and laminin 411E8, or on a non-coated plate, and the cells were collected on the day of administration to mice (Example 1 and (see 2). For each cell, a cell suspension of 3 ⁇ 10 6 cells/100 ⁇ L was prepared in physiological saline and administered into the tail vein of the mouse. Control animals received 100 ⁇ L of PBS intravenously (Day 0). Three mice were used per group.
- H&E hematoxylin and eosin
- the pathological condition of emphysema was observed using a microscope, and the alveolar wall area was measured using ImageJ. Alveolar wall area was measured in 20 fields per mouse.
- FIG. 3 shows representative H&E stained images of the lungs of each group, and the lower row is an enlarged view of the upper frame.
- FIG. 4 is a graph comparing the alveolar wall areas of each group. In the PBS group, alveolar walls were extensively destroyed and numerous alveolar expansions were observed. By administering umbilical cord MSCs, repair of the alveolar structure was observed, and significant repair was observed in the collagen gel group and collagen + laminin 411E8 gel group compared to the non-coated group. These results showed that administration of umbilical cord MSCs cultured on collagen gel or collagen + laminin 411E8 gel contributed to repair of alveolar walls in emphysema model mice.
- Example 4 Evaluation of engraftment of umbilical cord-derived mesenchymal cells administered to elastase-induced emphysema model mice
- 4-1 Experimental method (1) Administration of umbilical cord MSCs to elastase-induced emphysema model mice Except for the use of umbilical cord MSCs transfected with luciferase-GFP (hereinafter referred to as "Luc-hUC”) as the umbilical cord MSCs, the same procedures as in Examples were carried out.
- Luc-hUC luciferase-GFP
- Elastase-induced emphysema model mice were prepared in the same manner as in 3, and Luc-hUC (3 ⁇ 10 cells/100 ⁇ L) cultured for 3 days on a collagen gel, a mixed gel of collagen and laminin 411E8, or a non-coated plate was injected into the mouse. was administered into the tail vein of the patient. Control animals received 100 ⁇ L of PBS intravenously in the tail vein. Three mice were used per group.
- mice were euthanized 24 hours after Luc-hUC administration, and lung tissues were collected. A portion of the lung tissue was subjected to flow cytometry analysis, and the remaining lung tissue was fixed with 4% paraformaldehyde at 4°C overnight to prepare a paraffin block. The paraffin sections were deparaffinized, stained with DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), and GFP-positive engrafted cells were observed using a fluorescence microscope. Separately, thin paraffin sections were deparaffinized, antigen was activated, blocked for 1 hour at room temperature, and then stained with anti-F4/80 antibody (MCA497GA, Bio-rad).
- DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole
- the results are shown in Figure 6.
- the upper row shows representative fluorescence microscopy images of each group immunostained with anti-mouse F4/80 antibody, and the lower row shows the results of flow cytometry analysis.
- Interaction between the administered Luc-hUC and macrophages (F4/80 positive cells) was observed from fluorescence microscopy images.
- Interaction between Luc-hUC and macrophages (F4/80 positive cells) was observed more often in the following order: uncoated group ⁇ collagen gel group ⁇ collagen and laminin 411E8 mixed gel group.
- Example 5 Smooth muscle fiber formation by administration of umbilical cord-derived mesenchymal cells to elastase-induced emphysema model mice
- 5-1 Experimental method Example except that control animals (control group, wild-type mice) were provided to which elastase was not administered, and lung tissue was collected on day 12 (Day 12) after Luc-hUC administration (Day 0). Experiments were conducted in the same manner as in 4, and tissue sections for immunostaining were prepared. The following primary antibodies were used.
- Anti-Elastin antibody (Abcam #ab21610), anti-alpha smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) antibody (Abcam #ab21027), anti-CD34 antibody (Abcam #ab81289), anti-CD31 antibody (LifeSpan BioSciences #LS-C348736), anti-HO- 1/HMOX1 antibody (proteintech #66743-1-IG) and anti-SP-C antibody (Bioss #bs-10067R).
- Secondary antibodies include Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 (Invitrogen #A-11031), Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) (Abcam #ab150073) and Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 594) preadsorbed (Abcam #ab150136).
- the immunostained specimens were observed using a confocal microscope (LSM710, Carl Zeiss).
- the results are shown in Figure 7.
- the upper row is a representative image stained with anti-Elastin antibody and anti- ⁇ -SMA
- the middle row is a representative image stained with anti-CD34 antibody and anti-CD31 antibody
- the lower row is a representative image stained with anti-HO-1/HMOX1 antibody and anti-SP- This is a representative image stained with C antibody.
- Example 6 Suppression of alveolar wall collapse by administration of umbilical cord-derived mesenchymal cells to elastase-induced emphysema model mice] 6-1 Experimental method The experiment was conducted in the same manner as in Example 5, except that umbilical cord MSCs not transfected with luciferase-GFP, which were the same as in Example 1, were used as umbilical cord MSCs, and from umbilical cord MSC administration (Day 0) Lung tissue was collected on day 12, a portion of the lung tissue was subjected to flow cytometry analysis, and the remaining lung tissue was used to prepare tissue sections for immunostaining.
- Anti-F4/80 antibody Bio-rad #MCA497GA
- anti-CD206 antibody proteintech #18704-1-AP
- Donkey Anti-Mouse IgG H&L Alexa Fluor 488)
- Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor 594 preadsorbed
- Flow cytometry analysis was the same as in Example 4, except that the CD206 positive rate and CD11b positive rate were calculated using anti-CD206 antibody (proteintech #18704-1-AP) and anti-CD11b antibody (BioLegend #101206). I followed the steps.
- Example 7 Inhibition of osteoclast formation by administration of umbilical cord-derived mesenchymal cells to elastase-induced emphysema model mice] 7-1 Experimental method (1) Collection of bone marrow cells from elastase-induced emphysema model mice administered with umbilical cord MSCs and induction of differentiation into osteoclasts The experiment was conducted in the same manner as in Example 3, and the mice were euthanized on Day 12. The tibia was removed.
- Bone marrow cells were collected from the tibia and cultured for 3 days in a medium containing ⁇ -MEM (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) supplemented with M-CSF (Macrophage colony stimulating factor) to induce monocyte-macrophage cells. Then, they were cultured for 3 days in ⁇ -MEM supplemented with RANKL (Receptor activator of NF- ⁇ B ligand) to induce differentiation into osteoclasts.
- ⁇ -MEM Flujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- M-CSF Macrophage colony stimulating factor
- osteoclasts obtained in (1) were stained with TRAP (Tartrate-Resistant Acid Phosphatase), and their morphology was observed using a microscope.
- TRAP staining cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) according to the method described in Egusa et al. (Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274).
- TRAP solution 0.1 M sodium acetate, 0.1 M acetic acid, 10 mg/mL Naphtol AS-MX Phosphate (Sigma), 0.1% Triton X-100, 0.3 M potassium tartrate, 0.3 mg/mL Fast Red Violet LB Salt (Sigma) at 37°C for 15 minutes.
- Brilliant III Ultra-Fast SYBR QPCR MasterMix (Agilent #600882) was used as the reagent for quantitative RT-PCR, and analysis was performed using the real-time PCR system AriaMx (Agilent). The primers used are shown below.
- mGAPDH Fwd TTGAGGTCAATGAAGGGGTC (SEQ ID NO: 11)
- mGAPDH Rvs: TCGTCCCGTAGACAAAATGG SEQ ID NO: 12
- mIL-6 Fwd CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA (SEQ ID NO: 13)
- RNA sample Prepare a cell suspension of umbilical cord MSCs at 1 ⁇ 10 cells/mL in the same manner as in Example 1, and place the cells in a 6-well culture plate at 2 mL/well. was sown. Three types of culture plates were used: a non-coated plate, collagen gel, and collagen + laminin 411E8 gel. After 3 days of culture, umbilical cord MSCs were collected. Umbilical cord MSCs cultured on collagen gel and collagen + laminin 411E8 gel were recovered by dissolving the gel with collagenase. Umbilical cord MSCs cultured on non-coated plates were detached with trypsin and collected. Cell Innovator Co., Ltd. was commissioned to perform everything from RNA extraction to microarray analysis on the collected cells.
- Microarray analysis For microarray analysis, a microarray for human gene expression analysis "SurePrint G3 Human GE Microarray 8x60K v3.0" (Agilent Technology) was used.
- the results of microarray analysis showed increased expression of genes involved in differentiation, cytoskeleton, and immunity in the collagen gel group and collagen + laminin 411E8 gel group (Table 1).
- genes involved in the cytoskeleton increased expression of TUBA1C, TUBA1B, and CFL1, which are factors contributing to cytoskeletal variability that is said to have a major impact on stem cell differentiation, was observed.
- increased expression of NFE2L1 which promotes differentiation by inducing expression of biological defense enzymes through regulation of oxidative stress
- VIM which is expressed in mesenchymal cells and promotes differentiation into blood vessels, cardiomyocytes, etc.
- Example 9 Therapeutic effect of administration of a mixture of umbilical cord-derived mesenchymal cells and collagen pseudopeptide or laminin-derived peptide to elastase-induced emphysema model mice]
- 9-1 Experimental method (1) Preparation of elastase-induced emphysema model mouse After anesthetizing 8-9 week old C57BL/6 male mice in the same manner as in Example 3, elastase was administered once intranasally for 4 weeks. Elastase-induced emphysema model mice were produced by breeding.
- Umbilical cord MSCs were cultured on a non-coated plate for 3 days, and the cells were collected. The collected umbilical cord MSCs were prepared and administered on the same day of collection. VitroGel COL High Concentration (TheWell Bioscience, TWG009) was used as a collagen pseudopeptide, and VitroGel YIGSR High Concentration (TheWell Bioscience, TWG008) was used as a laminin-derived peptide.
- mice Dilute 50 ⁇ L of gel containing each peptide with 120 ⁇ L of the attached dilution solution (VitroGel Dilution Solution) and add 30 ⁇ L of cell suspension so that the number of cells is 3 ⁇ 10 6 cells/200 ⁇ L. did. 200 ⁇ L of the prepared mixture was administered into the tail vein of the mouse.
- a cell suspension of 3 ⁇ 10 6 cells/200 ⁇ L was prepared in PBS and administered into the tail vein (Day 0). Three mice were used per group.
- FIG. 11 shows representative H&E stained images of the lungs of each group. Scale bar is 500 ⁇ m. Compared to the non-coated group, slight restoration of the alveolar structure was observed in the collagen pseudopeptide group, and significant restoration of the alveolar structure was observed in the laminin-derived peptide group. These results indicate that umbilical cord MSCs can contribute to alveolar wall repair in emphysema model mice when used together with these peptides, and in particular, use of umbilical cord MSCs together with laminin-derived peptides can improve the alveolar wall repair function. Ta.
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Abstract
本発明は、臍帯由来間葉系幹細胞をコラーゲンゲル上で培養する工程を含む、血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法、および、製造された血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物を提供する。
Description
本発明は、血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法および、製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物に関するものである。
慢性閉塞性肺疾患（COPD：chronic obstructive pulmonary disease）は、従来、慢性気管支炎や肺気腫と呼ばれてきた病気の総称であり、喫煙や大気汚染が原因の気流閉塞を主体とする進行性の肺の炎症性疾患である。COPDは日本を含め世界各国の主要な死亡原因の一つであり、罹患率の高い疾患である。COPDの薬物療法は、症状の改善、増悪のリスクおよび重症度の軽減、肺機能の維持ならびに患者のQOLの改善に有用であるが、慢性閉塞性肺疾患を完治させる治療法は未だ存在しない。
非特許文献１には、間葉系幹細胞（MSC）の全身投与がCOPD患者の炎症抑制に有用である可能性が報告されている。また、非特許文献２は、COPD患者に骨髄由来MSCを投与した結果を開示しており、全身性炎症と酸化ストレス関連バイオマーカーの減少を示したことを報告している。具体的には、炎症レベルはMSC投与後約１２～２４時間で最も顕著に減少し、MSC投与後数日でベースラインレベルに戻ることが示されており、臨床的有用性を得るためには、MSCを毎週１回投与することが重要であることを示唆している。
Eur Respir J. 2018 Mar 1;51(3):1702369. doi: 10.1183/13993003.02369-2017.
STEM CELLS Transl Med. 2021; 10: 1470-1481. DOI: 10.1002/sctm.21-0024
本発明は、肺疾患の治療に有効であり、かつ長時間肺に生着する臍帯由来間葉系細胞の製造方法、および肺疾患治療用医薬組成物を提供することを課題とする。
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］臍帯由来間葉系幹細胞をコラーゲンゲル上で培養する工程を含む、血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法。
［２］コラーゲンゲルが、ラミニンα4β1γ1またはラミニンα4β1γ1E8フラグメントを含む、前記［１］に記載の製造方法。
［３］ラミニンα4β1γ1またはラミニンα4β1γ1E8フラグメントの濃度が、培養面積当たり0.1μg/cm2～1.5μg/cm2である、前記［２］に記載の製造方法。
［４］培養期間が2日間～10日間である、前記［１］に記載の製造方法。
［５］前記［１］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物。
［６］前記肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、間質性肺炎、放射線肺臓炎、過敏性肺臓炎または好酸球性肺炎である、前記［５］に記載の医薬組成物。
［７］前記［１］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する、肺疾患により誘発される併存疾患の治療用医薬組成物。
［８］前記併存疾患が、心血管疾患、糖尿病、栄養障害、骨粗鬆症または骨格筋機能障害である、前記［７］に記載の医薬組成物。
［９］前記肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、間質性肺炎、放射線肺臓炎、過敏性肺臓炎または好酸球性肺炎である、前記［７］に記載の医薬組成物。
［１］臍帯由来間葉系幹細胞をコラーゲンゲル上で培養する工程を含む、血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法。
［２］コラーゲンゲルが、ラミニンα4β1γ1またはラミニンα4β1γ1E8フラグメントを含む、前記［１］に記載の製造方法。
［３］ラミニンα4β1γ1またはラミニンα4β1γ1E8フラグメントの濃度が、培養面積当たり0.1μg/cm2～1.5μg/cm2である、前記［２］に記載の製造方法。
［４］培養期間が2日間～10日間である、前記［１］に記載の製造方法。
［５］前記［１］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物。
［６］前記肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、間質性肺炎、放射線肺臓炎、過敏性肺臓炎または好酸球性肺炎である、前記［５］に記載の医薬組成物。
［７］前記［１］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する、肺疾患により誘発される併存疾患の治療用医薬組成物。
［８］前記併存疾患が、心血管疾患、糖尿病、栄養障害、骨粗鬆症または骨格筋機能障害である、前記［７］に記載の医薬組成物。
［９］前記肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、間質性肺炎、放射線肺臓炎、過敏性肺臓炎または好酸球性肺炎である、前記［７］に記載の医薬組成物。
本発明により、肺疾患の治療に有効であり、かつ長時間肺に生着する臍帯由来間葉系細胞の製造方法を提供することができる。また、当該製造方法により製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分とする肺疾患治療用医薬組成物を提供することができる。
〔血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法〕
本発明は、血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法（以下「本発明の製造方法」という）を提供する。本発明の製造方法は、臍帯由来間葉系幹細胞をコラーゲンゲル上で培養する工程を含むことを特徴とする。
本発明は、血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法（以下「本発明の製造方法」という）を提供する。本発明の製造方法は、臍帯由来間葉系幹細胞をコラーゲンゲル上で培養する工程を含むことを特徴とする。
臍帯由来間葉系幹細胞は、どのような哺乳動物の臍帯由来間葉系幹細胞であってもよいが、ヒトの臍帯由来間葉系幹細胞を用いることが好ましい。臍帯由来間葉系幹細胞は、例えば、東京大学医科学研究所附属病院臍帯血・臍帯バンク（IMSUT CORD）から入手することができる。臍帯由来間葉系幹細胞は採取が非侵襲的に可能であり、HLA IIの発現がないため同種異系（アロ）で移植可能であり、バンキングが進められているため安定供給が可能である点で、高い有用性がある。
臍帯由来間葉系幹細胞をコラーゲンゲル上で培養する方法は、特に限定されず、公知のコラーゲンゲル培養法を用いることができる。例えば、榎並淳平ら「コラーゲン・ゲル培養法(I)」 組織培養 13(1), 26-30, 1987、および、榎並淳平ら「コラーゲン・ゲル培養法(II)」 組織培養 13(2), 64-68, 1987に記載の培養法が挙げられる。コラーゲンゲルは、市販の試薬またはキットを用いて調製することができる。例えば、新田ゼラチン製の細胞培養用コラーゲン（製品名：セルマトリックス Type I-A）、コラーゲンゲル培養キット（キット内容：セルマトリックス Type I-A、濃縮培養液、再構成用緩衝液）を用いることができる。セルマトリックス Type I-Aは、豚腱由来の酸抽出コラーゲン（コラーゲン濃度：3mg/mL［pH 3］）であり、コラーゲンゲル培養に最適化した製品として販売されている。また、例えば、ニッピ製のコラーゲンゲル細胞培養キット Tri・D（キット内容：コラーゲン試薬、希釈用水、3倍濃縮培地）を用いることができる。このキットのコラーゲン試薬は、ウシ真皮由来I型コラーゲン（酸抽出）、ウシ真皮由来I型コラーゲン（ペプシン可溶化）、ブタ真皮由来I型コラーゲン（ペプシン可溶化）から選択でき、コラーゲン濃度はいずれも3mg/mLである。
コラーゲンゲル中のコラーゲン濃度は特に限定されず、予備試験を行って、培養後の臍帯由来間葉系幹細胞の血管内皮増殖因子発現量を測定して、最適なコラーゲン濃度を選択することが好ましい。コラーゲン濃度は、例えば0.5mg/mL～3mg/mLであってもよく、0.5mg/mL～2.5mg/mLであってもよく、0.5mg/mL～2mg/mLであってもよい。血管内皮増殖因子としては、例えば、VEGF（vascular endothelial growth factor：血管内皮細胞増殖因子）、VEGFR1（Vascular endothelial growth factor receptor-1：血管内皮増殖因子受容体-1）、VEGFR2（Vascular endothelial growth factor receptor-2：血管内皮増殖因子受容体-2）、PDGFα（platelet-derived growth factor α：血小板由来増殖因子α）などが挙げられるが、これに限定されない。好ましくはVEGFである。
本発明の製造方法に用いるコラーゲンゲルは、ラミニンα4β1γ1またはラミニンα4β1γ1E8フラグメントを含むものであってもよい。ラミニンは基底膜の主要な細胞接着分子であり、α鎖、β鎖およびγ鎖の3本のサブユニット鎖からなるヘテロ三量体で、分子量約80万の巨大な糖タンパク質である。3本のサブユニット鎖はC末端側で会合してコイルドコイル構造を作り、ジスルフィド結合によって安定化したヘテロ三量体分子を形成している。α鎖はα1～α5の5種類、β鎖はβ1～β3の3種類、γ鎖はγ1～γ3の3種類が知られており、それらの組み合わせで少なくとも12種類以上のアイソフォームが存在する。ラミニンα4β1γ1（ラミニン411）は、α4鎖、β1鎖およびγ1鎖からなるヘテロ三量体分子である。
ラミニンE8フラグメントは、マウスラミニン111をエラスターゼで消化して得られたヘテロ三量体を形成しているフラグメントであり、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D et al., J. Cell Biol., 105:589-598, 1987）。本発明の方法に用いられるラミニン411E8は、マウスラミニン111E8と同様の細胞接着活性を有し、類似の構造を有するラミニン411フラグメントであればよい。ラミニン411E8は、α4鎖のC末端フラグメントから球状ドメイン4および5が除かれたフラグメント（α4鎖E8）、β1鎖のC末端フラグメント（β1鎖E8）およびγ1鎖のC末端フラグメント（γ1鎖E8）が三量体を形成したフラグメントである。
ラミニン411およびラミニン411E8は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。主要な哺乳動物のラミニン411を構成するα4鎖、β1鎖、γ1鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（NCBI等）から取得することができる。ラミニン411およびラミニン411E8は、市販品を使用することができる。ラミニン411としては、例えばBioLamina社製のヒト組換えラミニン411を使用することができる。ラミニン411E8としては、ニッピ社製のiMatrix-411を使用することができる。
コラーゲンゲルへのラミニン411またはラミニン411E8の添加量は特に限定されないが、例えば、培養容器の培養面積当たり、0.1μg/cm2以上、0.2μg/cm2以上、0.3μg/cm2以上、0.4μg/cm2以上になるように添加してもよく、1.5μg/cm2以下、1.0μg/cm2以下、0.8μg/cm2以下、0.6μg/cm2以下になるように添加してもよい。冷却したコラーゲン溶液にラミニン411溶液またはラミニン411E8溶液を添加して混合し、培養容器に分注して加温（例えば25℃～37℃）することにより、ゲル化させることができる。ゲルの厚さは特に限定されず、例えば、0.2mm以上、0.4mm以上、0.6mm以上、0.8mm以上、1.0mm以上、1.5mm以上、2.0mm以上であってもよい。
用いる培地は特に限定されず、臍帯由来間葉系幹細胞の培養に使用可能な公知の培地から適宜選択して用いることができる。例えば、血清および抗生物質を添加したダルベッコ改変イーグル培地-低グルコース（LG-DMEM）、血清および抗生物質を添加したα-MEMなどが挙げられる。本発明の製造方法によりヒトに投与する臍帯由来間葉系細胞を製造する場合は、動物由来の成分が入っていない培地（Xeno-Free培地）を使用することが好ましい。例えば、R:STEM Medium（ロート製薬）などの市販の間葉系幹細胞用のXeno-Free培地を好適に使用することができる。
播種細胞数は特に限定されず、用いる培養容器の大きさに応じて適宜増減すればよい。播種細胞密度は、1×104個/cm2以上、1.5×104個/cm2以上、2×104個/cm2以上であってもよく、6×104個/cm2以下、5×104個/cm2以下、4×104個/cm2以下であってもよい。
培養期間は特に限定されず、例えば2日間～10日間であってもよく、3日間～7日間であってもよい。培養期間中に培地交換を行ってもよい。培地交換の頻度は特に限定されないが、例えば3～4日に1回であってもよい。コラーゲンゲル上で培養した細胞は、定法に従い、コラゲナーゼでゲルを溶解して回収することができる。
本発明の製造方法により製造される臍帯由来間葉系細胞は、血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞であるので、培養期間終了後に回収した細胞の血管内皮増殖因子、例えばVEGFの発現を測定してもよい。また、本発明の製造方法により製造される臍帯由来間葉系細胞は、幹細胞性を有していることが好ましいため、間葉系幹細胞マーカーの発現量を測定してもよい。間葉系幹細胞の細胞表面陽性マーカーとしては、例えばCD73、CD90、CD105等が挙げられ、細胞表面陰性マーカーとしては、例えばCD45、CD34、CD19、HLA-DR等が挙げられる。
本発明の製造方法により製造された臍帯由来間葉系細胞は、定法に従い、凍結保護剤を添加した培地に懸濁して凍結保存することができる。凍結保存には液体窒素を用いることが好ましい。
本発明の製造方法により製造された臍帯由来間葉系細胞は、コラーゲンゲル以外の細胞外マトリックスをコーティングしたプレートで培養して得られた臍帯由来間葉系細胞と比較して、肺に長時間生着できることが確認されている。より詳細には、本発明の製造方法により製造された臍帯由来間葉系細胞は、効率的に血管誘導を発揮し、炎症性サイトカイン産生をダウンレギュレートし、アポトーシスを抑制することができる。さらに、本発明の製造方法により製造された臍帯由来間葉系細胞は、インテグリンβ1を介して肺胞組織への接着を高め、M2マクロファージの極性を促進し、平滑筋線維の形成により崩壊した肺胞壁の修復に寄与することができる。
〔医薬組成物〕
本発明は、上記本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物を提供する。治療対象の肺疾患としては、例えば、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、間質性肺炎、放射線肺臓炎、過敏性肺臓炎、好酸球性肺炎などが挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、慢性閉塞性肺疾患である。
本発明は、上記本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物を提供する。治療対象の肺疾患としては、例えば、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、間質性肺炎、放射線肺臓炎、過敏性肺臓炎、好酸球性肺炎などが挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、慢性閉塞性肺疾患である。
また、本発明は、上記本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する、慢性閉塞性肺疾患により誘発される併存疾患の治療用医薬組成物を提供する。慢性閉塞性肺疾患により誘発される併存疾患としては、例えば、心血管疾患、糖尿病、栄養障害、骨粗鬆症、骨格筋機能障害などが挙げられるが、これに限定されない。心血管疾患には、例えば、狭心症、不整脈、心不全などが含まれる。
本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞は、血管内皮増殖因子を高発現し、長時間肺に生着することができるので、長期的に慢性炎症を緩和し、非特許文献２に記載の臨床試験と比較して、投与間隔を広げることができる点で有利である。さらに、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞は、血管内皮や平滑筋細胞への分化を促進できるので、高い治療効果に寄与する点で有利である。
さらに、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）（以下、「混合物（ａ）～（ｃ）」と記す）を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物を提供する。
（ａ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドとの混合物
（ｂ）臍帯由来間葉系細胞と、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物
（ｃ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドと、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物
（ａ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドとの混合物
（ｂ）臍帯由来間葉系細胞と、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物
（ｃ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドと、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物
治療対象の肺疾患としては、例えば、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物において例示されたものと同様の疾患が挙げられ、好ましくは慢性閉塞性肺疾患である。
コラーゲン由来ペプチドおよびコラーゲン疑似ペプチドは、グリシン（Ｇｌｙ）－Ｘａａ－Ｙａａ（ＸａａおよびＹａａは、任意のアミノ酸を示す）の３つのアミノ酸の繰返し配列を有するペプチドであれば特に限定されない。Ｘａａは、プロリンであってもよく、Ｙａａは、４（Ｒ）ヒドロキシプロリンであってもよい。コラーゲン疑似ペプチドとしては、例えば、インテグリンα2β1に特異的に結合する、GFOGERペプチド（配列番号１５）などが挙げられる。
ラミニン由来ペプチドは、ラミニン中に存在する部分配列からなり、細胞接着に関与できるペプチドであることが好ましい。ラミニン由来ペプチドとしては、例えば、ラミニンβ1鎖に存在する、YIGSRペプチド（配列番号１６）などが挙げられる。
本発明の混合物（ａ）～（ｃ）を有効成分として含有する医薬組成物は、臍帯由来間葉系細胞を肺胞壁に安定的に生着することができるので、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物と同等の、またはより優れた肺胞壁の修復能力を発揮することができる。
本発明の医薬組成物は、上記本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞または混合物（ａ）～（ｃ）を有効成分とし、製薬上許容し得る媒体を含むものであればよい。本発明の医薬組成物は、注射用製剤、細胞塊またはシート状構造の移植用製剤、任意の生体適合性ゲルと混合したゲル製剤として実施してもよい。注射用製剤として実施する場合、投与方法は、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、点滴静脈注射、腹腔内注射、胸腔内注射、局所直接注射等が挙げられる。移植用製剤またはゲル製剤として実施する場合、投与方法は、局所への直接投与が好適である。
本発明の医薬組成物は、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。好ましくはヒトである。本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、投与対象に治療効果が得られる量であればよい。具体的な投与量は、投与形態、投与方法、使用目的、患者の年齢、体重、症状等によって適宜決定することができる。本発明の医薬組成物をヒトに投与する場合、臍帯由来間葉系細胞の１回の投与量は、例えば、104個/kg以上、105個/kg以上、106個/kg以上であってもよく、109個/kg以下、108個/kg以下、107個/kg以下であってもよい。
本発明の医薬組成物は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。凍結保存の温度は、-30℃以下、-40℃以下、-50℃以下、-80℃以下、-90℃以下、-100℃以下、-150℃以下、-180℃以下、-196℃（液体窒素温度）以下であってもよい。本発明の医薬組成物を投与する際には、温水（約37℃）で急速に解凍して使用することができる。
本発明には、さらに以下の各発明が含まれる。
本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞の有効量を患者に投与する工程を含む、肺疾患の治療方法。
肺疾患の治療に使用するための、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞。
肺疾患治療用医薬組成物を製造するための、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞の使用。
本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞の有効量を患者に投与する工程を含む、慢性閉塞性肺疾患により誘発される併存疾患の治療方法。
慢性閉塞性肺疾患により誘発される併存疾患の治療に使用するための、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞。
慢性閉塞性肺疾患により誘発される併存疾患の治療用医薬組成物を製造するための、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞の使用。
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を患者に投与する工程を含む、肺疾患の治療方法：
（ａ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドとの混合物、
（ｂ）臍帯由来間葉系細胞と、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物、または
（ｃ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドと、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物。
本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞の有効量を患者に投与する工程を含む、肺疾患の治療方法。
肺疾患の治療に使用するための、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞。
肺疾患治療用医薬組成物を製造するための、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞の使用。
本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞の有効量を患者に投与する工程を含む、慢性閉塞性肺疾患により誘発される併存疾患の治療方法。
慢性閉塞性肺疾患により誘発される併存疾患の治療に使用するための、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞。
慢性閉塞性肺疾患により誘発される併存疾患の治療用医薬組成物を製造するための、本発明の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞の使用。
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を患者に投与する工程を含む、肺疾患の治療方法：
（ａ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドとの混合物、
（ｂ）臍帯由来間葉系細胞と、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物、または
（ｃ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドと、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：臍帯由来間葉系幹細胞における血管関連因子の遺伝子発現を高める細胞外基質の検討〕
１－１ 実験方法
（１）使用細胞
臍帯血由来間葉系幹細胞（以下「臍帯MSC」と記す）は、東京大学医科学研究所附属病院臍帯血・臍帯バンクから入手した。培地には、牛胎児血清(FBS)（ニチレイ、175012-500ML）およびペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンB（Antibiotic-Antimycotic (100X), Sigma-Aldrich）を添加したダルベッコ改変イーグル培地-低グルコース（Sigma-Aldrich, D6046-500ML）を使用した。臍帯MSCを解凍して4～6回継代培養し、均一性の高い細胞を使用した。
１－１ 実験方法
（１）使用細胞
臍帯血由来間葉系幹細胞（以下「臍帯MSC」と記す）は、東京大学医科学研究所附属病院臍帯血・臍帯バンクから入手した。培地には、牛胎児血清(FBS)（ニチレイ、175012-500ML）およびペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンB（Antibiotic-Antimycotic (100X), Sigma-Aldrich）を添加したダルベッコ改変イーグル培地-低グルコース（Sigma-Aldrich, D6046-500ML）を使用した。臍帯MSCを解凍して4～6回継代培養し、均一性の高い細胞を使用した。
（２）培養プレートおよび細胞外マトリックス
培養には、6ウェル培養プレート（Nunc Cell-Culture Treated Multidishes, 140685）を使用した。コラーゲンゲルは、新田ゼラチンのCellmatrix TypeI-A（コラーゲン濃度：3mg/mL［pH 3］）を使用した。新田ゼラチンのウェブサイト（https://www.nitta-gelatin.co.jp/ja/product/biomedical/Cellmatrix/cellmatrix.html）に記載の「コラーゲン・ゲル培養法」に従い、A：Cellmatrix Type I-A、B：10倍濃度の濃縮培養液（新田ゼラチン）、C：再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を準備して、冷却しながら、A（8容量）とB（1容量）を泡立てないようによく混合し、次にC（1容量）を加えて混合した。得られたコラーゲン濃度が2.4mg/mLのコラーゲン溶液を、1ウェルに2mL添加して37℃で30分間加温してゲル化させた（ゲルの厚さは約2mm）。
培養には、6ウェル培養プレート（Nunc Cell-Culture Treated Multidishes, 140685）を使用した。コラーゲンゲルは、新田ゼラチンのCellmatrix TypeI-A（コラーゲン濃度：3mg/mL［pH 3］）を使用した。新田ゼラチンのウェブサイト（https://www.nitta-gelatin.co.jp/ja/product/biomedical/Cellmatrix/cellmatrix.html）に記載の「コラーゲン・ゲル培養法」に従い、A：Cellmatrix Type I-A、B：10倍濃度の濃縮培養液（新田ゼラチン）、C：再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を準備して、冷却しながら、A（8容量）とB（1容量）を泡立てないようによく混合し、次にC（1容量）を加えて混合した。得られたコラーゲン濃度が2.4mg/mLのコラーゲン溶液を、1ウェルに2mL添加して37℃で30分間加温してゲル化させた（ゲルの厚さは約2mm）。
コーティング用のコラーゲンは、新田ゼラチンのCellmatrix TypeI-C（コラーゲン濃度：3mg/mL［pH 3］）を使用した。上記新田ゼラチンの「コラーゲン・ゲル培養法」に従い、Cellmatrix TypeI-C に10倍量の塩酸溶液（pH 3）を加えて希釈した。得られたコラーゲン濃度が0.3mg/mLのコラーゲン溶液を、1ウェルに1mL添加して室温で1時間静置してコーティングした（コーティング濃度は約30μg/cm2）。
フィブロネクチンは、フィブロネクチン溶液（ヒト）（PromoCell, C-43060）を使用した。50μg/mLに希釈して、コーティング濃度が5μg/cm2になるようにウェルに添加し、室温で1時間静置してコーティングした。ラミニン211E8、ラミニン411E8およびラミニン511E8は、ニッピ製のiMatrix-211、iMatrix-411およびiMatrix-511（いずれもニッピ、0.5 mg/mL）を使用した。製品の取扱説明書に従い、コーティング濃度が0.5μg/cm2になるようにコーティングした。コントロールには、ノンコートプレートを使用した。
（３）細胞培養および遺伝子発現量の測定
1×105個/mLの細胞懸濁液を調製し、2mL/ウェルで細胞を播種した。3日間培養後、臍帯MSCを回収した。コラーゲンゲル上で培養した臍帯MSCは、コラゲナーゼでゲルを溶解した後に回収した。それ以外のコーティングプレートおよびノンコートプレートで培養した臍帯MSCは、トリプシンで剥離して回収した。回収した各臍帯MSCから定法に従いRNAを抽出し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（商品名、東洋紡）を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAをリアルタイムPCRに供し、VEGF（vascular endothelial growth factor：血管内皮細胞増殖因子）、VEGFR1（Vascular endothelial growth factor receptor-1：血管内皮増殖因子受容体-1）、VEGFR2（Vascular endothelial growth factor receptor-2：血管内皮増殖因子受容体-2）およびPDGFα（platelet-derived growth factor α：血小板由来増殖因子α）の発現量を測定した。内在性コントロールとして、GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）の発現量を測定した。定量RT-PCRの試薬には、Brilliant III Ultra-Fast SYBR QPCR MasterMix（Agilent #600882）を用い、リアルタイムPCRシステムAriaMx（Agilent）により解析した。使用したプライマーを以下に示す。
hGAPDH Fwd: GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC（配列番号１）
hGAPDH Rvs: GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC（配列番号２）
hVEGF Fwd: GGCCTTCGCTTACTCTCACC（配列番号３）
hVEGF Rvs: CTGTCATGGGCTGCTTCTTC（配列番号４）
hVEGFR-1 Fwd: CAGGCCCAGTTTCTGCCATT（配列番号５）
hVEGFR-1 Rvs: TTCCAGCTCAGCGTGGTCGTA（配列番号６）
hVEGFR-2 Fwd: CCAGCAAAAGCAGGGAGTCTGT（配列番号７）
hVEGFR-2 Rvs: TGTCTGTGTCATCGGAGTGATATCCA（配列番号８）
hPDGFα Fwd: GCAAGACCAGGACGGTCATTT（配列番号９）
hPDGFα Rvs: GGCACTTGACACTGCTCGT（配列番号１０）
1×105個/mLの細胞懸濁液を調製し、2mL/ウェルで細胞を播種した。3日間培養後、臍帯MSCを回収した。コラーゲンゲル上で培養した臍帯MSCは、コラゲナーゼでゲルを溶解した後に回収した。それ以外のコーティングプレートおよびノンコートプレートで培養した臍帯MSCは、トリプシンで剥離して回収した。回収した各臍帯MSCから定法に従いRNAを抽出し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（商品名、東洋紡）を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAをリアルタイムPCRに供し、VEGF（vascular endothelial growth factor：血管内皮細胞増殖因子）、VEGFR1（Vascular endothelial growth factor receptor-1：血管内皮増殖因子受容体-1）、VEGFR2（Vascular endothelial growth factor receptor-2：血管内皮増殖因子受容体-2）およびPDGFα（platelet-derived growth factor α：血小板由来増殖因子α）の発現量を測定した。内在性コントロールとして、GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）の発現量を測定した。定量RT-PCRの試薬には、Brilliant III Ultra-Fast SYBR QPCR MasterMix（Agilent #600882）を用い、リアルタイムPCRシステムAriaMx（Agilent）により解析した。使用したプライマーを以下に示す。
hGAPDH Fwd: GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC（配列番号１）
hGAPDH Rvs: GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC（配列番号２）
hVEGF Fwd: GGCCTTCGCTTACTCTCACC（配列番号３）
hVEGF Rvs: CTGTCATGGGCTGCTTCTTC（配列番号４）
hVEGFR-1 Fwd: CAGGCCCAGTTTCTGCCATT（配列番号５）
hVEGFR-1 Rvs: TTCCAGCTCAGCGTGGTCGTA（配列番号６）
hVEGFR-2 Fwd: CCAGCAAAAGCAGGGAGTCTGT（配列番号７）
hVEGFR-2 Rvs: TGTCTGTGTCATCGGAGTGATATCCA（配列番号８）
hPDGFα Fwd: GCAAGACCAGGACGGTCATTT（配列番号９）
hPDGFα Rvs: GGCACTTGACACTGCTCGT（配列番号１０）
１－２ 結果
結果を図１に示した。コラーゲンゲル上で臍帯MSCを培養することにより、VEGFの発現量が、ノンコートプレートで培養した場合と比較して約14倍に増加することが示された。一方、コラーゲンコート上で培養した場合はノンコートプレートの約1.5倍で、顕著な増加は認められなかった。ラミニン411E8コート上で培養した臍帯MSCは、いずれの遺伝子についても、発現量をノンコートプレートの2倍以上に増加させた。
結果を図１に示した。コラーゲンゲル上で臍帯MSCを培養することにより、VEGFの発現量が、ノンコートプレートで培養した場合と比較して約14倍に増加することが示された。一方、コラーゲンコート上で培養した場合はノンコートプレートの約1.5倍で、顕著な増加は認められなかった。ラミニン411E8コート上で培養した臍帯MSCは、いずれの遺伝子についても、発現量をノンコートプレートの2倍以上に増加させた。
〔実施例２：臍帯由来間葉系幹細胞の培養に使用する細胞外基質と血管形成表面マーカータンパク質の発現変化の検討〕
２－１ 実験方法
（１）使用細胞、培養プレートおよび細胞外マトリックス
実施例１と同じ臍帯MSCと6ウェル培養プレートを使用した。細胞外マトリックスとして、コラーゲンをコーティングしたプレート、コラーゲンとラミニン411E8の混合液をコーティングしたプレート、コラーゲンゲルを形成させたプレートおよびラミニン411E8を添加したコラーゲンゲルを形成させたプレートを準備した。コラーゲンをコーティングしたプレートおよびコラーゲンゲルを形成させたプレートは、実施例１と同じものを作製して使用した。コラーゲンとラミニン411E8の混合液をコーティングしたプレートは、コラーゲン濃度を0.3mg/mLに希釈したコラーゲン溶液（Cellmatrix TypeI-A、新田ゼラチン）1mLにiMatrix-411（0.5 mg/mL）を9μl加えて混合し、ウェルに添加して室温で1時間静置してコーティングした。ラミニン411E8を添加したコラーゲンゲルを形成させたプレートは、コラーゲン濃度を2.4mg/mLに希釈したコラーゲン溶液（Cellmatrix TypeI-A、新田ゼラチン）2mLに、iMatrix-411（0.5 mg/mL）を9μl加えて混合し、ウェルに添加して37℃で30分間加温してゲル化させることにより作製して使用した。コントロールには、ノンコートプレートを使用した。
２－１ 実験方法
（１）使用細胞、培養プレートおよび細胞外マトリックス
実施例１と同じ臍帯MSCと6ウェル培養プレートを使用した。細胞外マトリックスとして、コラーゲンをコーティングしたプレート、コラーゲンとラミニン411E8の混合液をコーティングしたプレート、コラーゲンゲルを形成させたプレートおよびラミニン411E8を添加したコラーゲンゲルを形成させたプレートを準備した。コラーゲンをコーティングしたプレートおよびコラーゲンゲルを形成させたプレートは、実施例１と同じものを作製して使用した。コラーゲンとラミニン411E8の混合液をコーティングしたプレートは、コラーゲン濃度を0.3mg/mLに希釈したコラーゲン溶液（Cellmatrix TypeI-A、新田ゼラチン）1mLにiMatrix-411（0.5 mg/mL）を9μl加えて混合し、ウェルに添加して室温で1時間静置してコーティングした。ラミニン411E8を添加したコラーゲンゲルを形成させたプレートは、コラーゲン濃度を2.4mg/mLに希釈したコラーゲン溶液（Cellmatrix TypeI-A、新田ゼラチン）2mLに、iMatrix-411（0.5 mg/mL）を9μl加えて混合し、ウェルに添加して37℃で30分間加温してゲル化させることにより作製して使用した。コントロールには、ノンコートプレートを使用した。
（２）細胞培養および細胞表面マーカータンパク質発現解析
実施例１と同様に1×105個/mLの細胞懸濁液を調製し、2mL/ウェルで細胞を播種した。3日間培養後、実施例１と同様に細胞を回収してPBSで2回洗浄し、フローサイトメトリー解析に供した。フローサイトメーターにはFACS Lyric（Becton-Dickinson）を用い、FlowJo解析用ソフトウェア（Becton-Dickinson）で解析した。最初に、間葉系幹細胞マーカーであるCD90陽性/CD73陽性細胞をソーティングした。抗体には、抗ヒトCD73抗体（PE/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody、BioLegend #344009）および抗ヒトCD90抗体（Anti-CD90, Mouse-Mono (Thy-1A1), APC、R&D Systems #FAB2067A）を使用した。また、アイソタイプコントロールとして抗マウスIgG1抗体（PE/Cyanine7 Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody、BioLegend #400126）および抗マウスIgG2A抗体（Mouse IgG2A-APC Isotype Control、R&D Systems #965667）使用した。続いて、分取したCD90陽性/CD73陽性細胞について、血管内皮前駆細胞マーカーであるCD34と血管内皮細胞マーカーであるCD31の発現を解析した。抗体には、抗ヒトCD34抗体（CD34 Monoclonal Antibody (4H11), PE、eBioscience #12-0349-42）および抗ヒトCD31抗体（Alexa Fluor 488 anti-human CD31 Antibody、BioLegend #303109）を使用した。
実施例１と同様に1×105個/mLの細胞懸濁液を調製し、2mL/ウェルで細胞を播種した。3日間培養後、実施例１と同様に細胞を回収してPBSで2回洗浄し、フローサイトメトリー解析に供した。フローサイトメーターにはFACS Lyric（Becton-Dickinson）を用い、FlowJo解析用ソフトウェア（Becton-Dickinson）で解析した。最初に、間葉系幹細胞マーカーであるCD90陽性/CD73陽性細胞をソーティングした。抗体には、抗ヒトCD73抗体（PE/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody、BioLegend #344009）および抗ヒトCD90抗体（Anti-CD90, Mouse-Mono (Thy-1A1), APC、R&D Systems #FAB2067A）を使用した。また、アイソタイプコントロールとして抗マウスIgG1抗体（PE/Cyanine7 Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody、BioLegend #400126）および抗マウスIgG2A抗体（Mouse IgG2A-APC Isotype Control、R&D Systems #965667）使用した。続いて、分取したCD90陽性/CD73陽性細胞について、血管内皮前駆細胞マーカーであるCD34と血管内皮細胞マーカーであるCD31の発現を解析した。抗体には、抗ヒトCD34抗体（CD34 Monoclonal Antibody (4H11), PE、eBioscience #12-0349-42）および抗ヒトCD31抗体（Alexa Fluor 488 anti-human CD31 Antibody、BioLegend #303109）を使用した。
２－２ 結果
結果を図２に示した。上段は各細胞外マトリックス上で培養した臍帯MSCについて、抗CD90抗体と抗CD73抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果であり、下段はCD90陽性/CD73陽性細胞に対して抗CD90抗体と抗CD73抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果である。コラーゲンコートおよびコラーゲン＋ラミニン411E8コート上で培養した場合のCD90陽性/CD73陽性細胞率はそれぞれ86.4％および87.3％であったのに対して、コラーゲンゲルおよびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した場合のCD90陽性/CD73陽性細胞率はそれぞれ96.2％および98.6％であり、顕著に上昇した。また、CD90陽性/CD73陽性細胞におけるCD31陽性率については、コラーゲンコートおよびコラーゲン＋ラミニン411E8コート上で培養した場合はそれぞれ15.4％および20.2％であったのに対して、コラーゲンゲルおよびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した場合はそれぞれ61.3％および71.5％であった。また、CD90陽性/CD73陽性細胞におけるCD31陽性/CD34陽性率については、コラーゲンコートおよびコラーゲン＋ラミニン411E8コート上で培養した場合はそれぞれ1.2％および1.6％であったのに対して、コラーゲンゲルおよびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した場合はそれぞれ5.6％および7.5％であった。この結果から、コラーゲンゲル上で臍帯MSCを培養することにより、高効率で血管内皮細胞誘導能をもつMSCを取得でき、ラミニン411E8を添加することにより、血管内皮細胞誘導能をもつMSCの誘導効率が上昇することが示された。
結果を図２に示した。上段は各細胞外マトリックス上で培養した臍帯MSCについて、抗CD90抗体と抗CD73抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果であり、下段はCD90陽性/CD73陽性細胞に対して抗CD90抗体と抗CD73抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果である。コラーゲンコートおよびコラーゲン＋ラミニン411E8コート上で培養した場合のCD90陽性/CD73陽性細胞率はそれぞれ86.4％および87.3％であったのに対して、コラーゲンゲルおよびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した場合のCD90陽性/CD73陽性細胞率はそれぞれ96.2％および98.6％であり、顕著に上昇した。また、CD90陽性/CD73陽性細胞におけるCD31陽性率については、コラーゲンコートおよびコラーゲン＋ラミニン411E8コート上で培養した場合はそれぞれ15.4％および20.2％であったのに対して、コラーゲンゲルおよびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した場合はそれぞれ61.3％および71.5％であった。また、CD90陽性/CD73陽性細胞におけるCD31陽性/CD34陽性率については、コラーゲンコートおよびコラーゲン＋ラミニン411E8コート上で培養した場合はそれぞれ1.2％および1.6％であったのに対して、コラーゲンゲルおよびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した場合はそれぞれ5.6％および7.5％であった。この結果から、コラーゲンゲル上で臍帯MSCを培養することにより、高効率で血管内皮細胞誘導能をもつMSCを取得でき、ラミニン411E8を添加することにより、血管内皮細胞誘導能をもつMSCの誘導効率が上昇することが示された。
〔実施例３：エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスへの臍帯由来間葉系細胞の投与による治療効果〕
３－１ 実験方法
（１）エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウス
8-9週齢のC57BL/6 雄マウス（日本クレア）を使用した。マウスをイソフルランで麻酔し、エラスターゼ（ブタ膵臓由来、富士フイルム和光純薬株式会社 #058-05361）30μg/24μL（生理食塩水）を鼻腔内に単回投与した。投与から4週間飼育し、肺気腫を誘導した。
３－１ 実験方法
（１）エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウス
8-9週齢のC57BL/6 雄マウス（日本クレア）を使用した。マウスをイソフルランで麻酔し、エラスターゼ（ブタ膵臓由来、富士フイルム和光純薬株式会社 #058-05361）30μg/24μL（生理食塩水）を鼻腔内に単回投与した。投与から4週間飼育し、肺気腫を誘導した。
（２）臍帯MSCの調製および投与
臍帯MSCをコラーゲンゲル上、コラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル上、またはノンコートプレート上で3日間培養し、マウスに投与する当日に細胞を回収した（実施例１および２参照）。各細胞について、生理食塩水で3×106個/100μLの細胞懸濁液を調製し、マウスの尾静脈内に投与した。対照動物には100μLのPBSを尾静脈内に投与した（Day0）。1群あたり3匹のマウスを用いた。
臍帯MSCをコラーゲンゲル上、コラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル上、またはノンコートプレート上で3日間培養し、マウスに投与する当日に細胞を回収した（実施例１および２参照）。各細胞について、生理食塩水で3×106個/100μLの細胞懸濁液を調製し、マウスの尾静脈内に投与した。対照動物には100μLのPBSを尾静脈内に投与した（Day0）。1群あたり3匹のマウスを用いた。
（３）肺組織回収および組織学的分析
Day12にマウスを安楽死させ、肺組織を回収した。肺組織を10％中性緩衝ホルマリン（関東化学）で固定し、定法に従いパラフィン包埋し、厚さ5μmにスライスしてヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色を行った。顕微鏡で肺気腫の病態を観察し、ImageJを用いて肺胞壁面積を測定した。マウス1匹あたり20視野の肺胞壁面積を測定した。
Day12にマウスを安楽死させ、肺組織を回収した。肺組織を10％中性緩衝ホルマリン（関東化学）で固定し、定法に従いパラフィン包埋し、厚さ5μmにスライスしてヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色を行った。顕微鏡で肺気腫の病態を観察し、ImageJを用いて肺胞壁面積を測定した。マウス1匹あたり20視野の肺胞壁面積を測定した。
３－２ 結果
結果を図３および図４に示した。図３は、各群の代表的な肺のH&E染色画像であり、下段は上段枠内の拡大図である。図４は、各群の肺胞壁面積を比較したグラフである。PBS群では、肺胞壁が広範囲に破壊され、肺胞の拡大が多数観察された。臍帯MSCを投与することにより、肺胞構造の修復が観察されたが、コラーゲンゲル群、コラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群は、ノンコート群と比較して顕著な修復が観察された。
この結果から、コラーゲンゲル上で培養した臍帯MSCまたはコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した臍帯MSCの投与が、肺気腫モデルマウスの肺胞壁の修復に寄与することが示された。
結果を図３および図４に示した。図３は、各群の代表的な肺のH&E染色画像であり、下段は上段枠内の拡大図である。図４は、各群の肺胞壁面積を比較したグラフである。PBS群では、肺胞壁が広範囲に破壊され、肺胞の拡大が多数観察された。臍帯MSCを投与することにより、肺胞構造の修復が観察されたが、コラーゲンゲル群、コラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群は、ノンコート群と比較して顕著な修復が観察された。
この結果から、コラーゲンゲル上で培養した臍帯MSCまたはコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した臍帯MSCの投与が、肺気腫モデルマウスの肺胞壁の修復に寄与することが示された。
〔実施例４：エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスに投与した臍帯由来間葉系細胞の生着の評価〕
４－１ 実験方法
（１）エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスへの臍帯MSCの投与
臍帯MSCとして、ルシフェラーゼ-GFPをトランスフェクションした臍帯MSC（以下「Luc-hUC」と記す）を使用した以外は、実施例３と同じ方法でエラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスを作製し、コラーゲンゲル上、コラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル上、またはノンコートプレート上で3日間培養したLuc-hUC（3×106個/100μL）をマウスの尾静脈内に投与した。対照動物には100μLのPBSを尾静脈内に投与した。1群あたり3匹のマウスを用いた。
４－１ 実験方法
（１）エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスへの臍帯MSCの投与
臍帯MSCとして、ルシフェラーゼ-GFPをトランスフェクションした臍帯MSC（以下「Luc-hUC」と記す）を使用した以外は、実施例３と同じ方法でエラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスを作製し、コラーゲンゲル上、コラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル上、またはノンコートプレート上で3日間培養したLuc-hUC（3×106個/100μL）をマウスの尾静脈内に投与した。対照動物には100μLのPBSを尾静脈内に投与した。1群あたり3匹のマウスを用いた。
（２）肺組織回収および免疫組織化学的分析
Luc-hUC投与の24時間後にマウスを安楽死させ、肺組織を回収した。肺組織の一部をフローサイトメトリー解析に供し、残りの肺組織を4％パラホルムアルデヒドで、4℃で一晩固定し、パラフィンブロックを作製した。薄切したパラフィン切片を脱パラフィンし、DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）で染色して、蛍光顕微鏡でGFP陽性の生着細胞を観察した。別途、薄切したパラフィン切片を脱パラフィンし、抗原を賦活化し、室温で1時間ブロッキングした後、抗F4/80抗体（MCA497GA, Bio-rad）で染色した。
Luc-hUC投与の24時間後にマウスを安楽死させ、肺組織を回収した。肺組織の一部をフローサイトメトリー解析に供し、残りの肺組織を4％パラホルムアルデヒドで、4℃で一晩固定し、パラフィンブロックを作製した。薄切したパラフィン切片を脱パラフィンし、DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）で染色して、蛍光顕微鏡でGFP陽性の生着細胞を観察した。別途、薄切したパラフィン切片を脱パラフィンし、抗原を賦活化し、室温で1時間ブロッキングした後、抗F4/80抗体（MCA497GA, Bio-rad）で染色した。
（３）フローサイトメトリー解析
Luc-hUC投与24時間後の肺組織におけるCD206陽性細胞率およびLuc-GFP陽性細胞率を、フローサイトメトリーを用いて以下の手順で解析した。
(i) 肺組織を細切後、15 mg/mLコラゲナーゼ溶液を加え、温浴槽（37℃）2時間、振盪しながら酵素処理を行った。得られた組織溶解液をセルストレーナー（100μmナイロンメッシュフィルター、Falcon #352360）に通した。回収した組織懸濁液と等量の2%EDTA-PBSを添加し、十分撹拌した。1500rpmで10分間遠心し、上清を除去した。
(ii) PBSでペレットを洗浄し、2％FBS含有2mM EDTA/PBSを添加して、1.0×106個/mLの細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を、5mL丸底チューブ（Falcon #352058）に100μLずつ分注した。
(iii) 分注した細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットに2％FBS含有2mM EDTA/PBSを100μLずつ添加し、続いて抗CD206抗体（proteintech #18704-1-AP）を添加した。
(iv) 2％FB含有2mM EDTA/PBSを添加し、遠心分離により細胞を洗浄した後、2％FBS含有2mM EDTA/PBSにて細胞を懸濁し、セルストレーナー（35μmナイロンメッシュフィルター、Corning #352235）に通した。
(v) 回収した細胞懸濁液を、BD FACSLyri（日本ベクトン・ディッキンソン）にてAll Event 20000で解析し、CD206陽性細胞率およびLuc-GFP陽性細胞率を算出した。
Luc-hUC投与24時間後の肺組織におけるCD206陽性細胞率およびLuc-GFP陽性細胞率を、フローサイトメトリーを用いて以下の手順で解析した。
(i) 肺組織を細切後、15 mg/mLコラゲナーゼ溶液を加え、温浴槽（37℃）2時間、振盪しながら酵素処理を行った。得られた組織溶解液をセルストレーナー（100μmナイロンメッシュフィルター、Falcon #352360）に通した。回収した組織懸濁液と等量の2%EDTA-PBSを添加し、十分撹拌した。1500rpmで10分間遠心し、上清を除去した。
(ii) PBSでペレットを洗浄し、2％FBS含有2mM EDTA/PBSを添加して、1.0×106個/mLの細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を、5mL丸底チューブ（Falcon #352058）に100μLずつ分注した。
(iii) 分注した細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットに2％FBS含有2mM EDTA/PBSを100μLずつ添加し、続いて抗CD206抗体（proteintech #18704-1-AP）を添加した。
(iv) 2％FB含有2mM EDTA/PBSを添加し、遠心分離により細胞を洗浄した後、2％FBS含有2mM EDTA/PBSにて細胞を懸濁し、セルストレーナー（35μmナイロンメッシュフィルター、Corning #352235）に通した。
(v) 回収した細胞懸濁液を、BD FACSLyri（日本ベクトン・ディッキンソン）にてAll Event 20000で解析し、CD206陽性細胞率およびLuc-GFP陽性細胞率を算出した。
４－２ 結果
各群の肺組織に生着した細胞の代表的な蛍光顕微鏡画像を図５に示した。投与されたLuc-hUCは、24時間後においても肺組織に生着していることが示された。生着細胞数はノンコート群＜コラーゲンゲル群＜コラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群の順に多くなった。
各群の肺組織に生着した細胞の代表的な蛍光顕微鏡画像を図５に示した。投与されたLuc-hUCは、24時間後においても肺組織に生着していることが示された。生着細胞数はノンコート群＜コラーゲンゲル群＜コラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群の順に多くなった。
結果を図６に示した。上段は、抗マウスF4/80抗体で免疫染色した各群の代表的な蛍光顕微鏡画像であり、下段はフローサイトメトリー解析を行った結果である。蛍光顕微鏡画像から、投与されたLuc-hUCとマクロファージ（F4/80陽性細胞）の相互作用が観察された。Luc-hUCとマクロファージ（F4/80陽性細胞）の相互作用は、ノンコート群＜コラーゲンゲル群＜コラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群の順に多く観察された。フローサイトメトリー解析の結果から、コラーゲンゲル群およびコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群において、発現したマクロファージの特性が抗炎症マクロファージ（M2マクロファージ、CD206陽性）への極性変化することが示された。これは、コラーゲンゲル群およびコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群の臍帯MSCを投与することにより、抗炎症効果を発揮することを示唆するものである。M2マクロファージへの極性変化は、コラーゲンゲル群よりコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群の方が高かった。
〔実施例５：エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスへの臍帯由来間葉系細胞の投与による平滑筋線維形成〕
５－１ 実験方法
エラスターゼを投与しない対照動物（コントロール群、野生型マウス）を設けたこと、およびLuc-hUC投与（Day0）から12日目（Day12）に肺組織を回収したこと以外は実施例４と同じ方法で実験を行い、免疫染色用の組織切片を作製した。一次抗体には、以下を使用した。抗Elastin抗体（Abcam #ab21610）、抗alpha smooth muscle Actin（α-SMA）抗体（Abcam #ab21027）、抗CD34抗体（Abcam #ab81289）、抗CD31抗体（LifeSpan BioSciences #LS-C348736）、抗HO-1/HMOX1抗体（proteintech #66743-1-IG）および抗SP-C抗体（Bioss #bs-10067R）。二次抗体には、Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568（Invitrogen #A-11031）、Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)（Abcam #ab150073）およびDonkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 594) preadsorbed（Abcam #ab150136）を使用した。免疫染色標本は、共焦点顕微鏡（LSM710, Carl Zeiss）で観察した。
５－１ 実験方法
エラスターゼを投与しない対照動物（コントロール群、野生型マウス）を設けたこと、およびLuc-hUC投与（Day0）から12日目（Day12）に肺組織を回収したこと以外は実施例４と同じ方法で実験を行い、免疫染色用の組織切片を作製した。一次抗体には、以下を使用した。抗Elastin抗体（Abcam #ab21610）、抗alpha smooth muscle Actin（α-SMA）抗体（Abcam #ab21027）、抗CD34抗体（Abcam #ab81289）、抗CD31抗体（LifeSpan BioSciences #LS-C348736）、抗HO-1/HMOX1抗体（proteintech #66743-1-IG）および抗SP-C抗体（Bioss #bs-10067R）。二次抗体には、Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568（Invitrogen #A-11031）、Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)（Abcam #ab150073）およびDonkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 594) preadsorbed（Abcam #ab150136）を使用した。免疫染色標本は、共焦点顕微鏡（LSM710, Carl Zeiss）で観察した。
５－２ 結果
結果を図７に示した。上段は抗Elastin抗体および抗α-SMAで染色した代表的画像であり、中段は抗CD34抗体および抗CD31抗体で染色した代表的画像であり、下段は抗HO-1/HMOX1抗体および抗SP-C抗体で染色した代表的画像である。これらの結果から、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群では、抗酸化作用の亢進により、エラスチンが活性化し、肺胞壁の平滑筋線維形成が促進したことが示唆された。詳細には、上段の画像から、PBS群では組織損傷の形態が観察され、平滑筋マーカーであるエラスチンおよびαSMAの発現が低いことが観察された。一方、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群では、どちらのマーカーも強く発現しており、平滑筋への誘導が確認された。中段の新生血管マーカー（CD34およびCD31）についても各群において同様の傾向が観察された。下段の画像から、抗酸化マーカーHO-1および肺胞上皮マーカーproSP-C（SP-C）がコラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群の肺組織内に高発現しており、これらの群ではproSPC陽性の2型肺胞上皮が形成されていると考えられた。さらに、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群では、proSPCとHO-1が共発現（黄色シグナル）しており、抗酸化作用が2型肺胞上皮形成に直接寄与したと考えられる。すなわち、コラーゲンゲル上で培養した臍帯MSC、およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した臍帯MSCは、上皮細胞の修復に寄与し、肺胞損傷の治療効果をもたらすことが確認された。
結果を図７に示した。上段は抗Elastin抗体および抗α-SMAで染色した代表的画像であり、中段は抗CD34抗体および抗CD31抗体で染色した代表的画像であり、下段は抗HO-1/HMOX1抗体および抗SP-C抗体で染色した代表的画像である。これらの結果から、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群では、抗酸化作用の亢進により、エラスチンが活性化し、肺胞壁の平滑筋線維形成が促進したことが示唆された。詳細には、上段の画像から、PBS群では組織損傷の形態が観察され、平滑筋マーカーであるエラスチンおよびαSMAの発現が低いことが観察された。一方、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群では、どちらのマーカーも強く発現しており、平滑筋への誘導が確認された。中段の新生血管マーカー（CD34およびCD31）についても各群において同様の傾向が観察された。下段の画像から、抗酸化マーカーHO-1および肺胞上皮マーカーproSP-C（SP-C）がコラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群の肺組織内に高発現しており、これらの群ではproSPC陽性の2型肺胞上皮が形成されていると考えられた。さらに、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群では、proSPCとHO-1が共発現（黄色シグナル）しており、抗酸化作用が2型肺胞上皮形成に直接寄与したと考えられる。すなわち、コラーゲンゲル上で培養した臍帯MSC、およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した臍帯MSCは、上皮細胞の修復に寄与し、肺胞損傷の治療効果をもたらすことが確認された。
〔実施例６：エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスへの臍帯由来間葉系細胞の投与による肺胞壁崩壊抑制〕
６－１ 実験方法
臍帯MSCとして、実施例１と同じルシフェラーゼ-GFPをトランスフェクションしていない臍帯MSCを使用したこと以外は、実施例５と同じ方法で実験を行い、臍帯MSC投与（Day0）から12日目（Day12）に肺組織を回収し、肺組織の一部をフローサイトメトリー解析に供し、残りの肺組織を用いて免疫染色用の組織切片を作製した。一次抗体には、抗F4/80抗体（Bio-rad #MCA497GA）および抗CD206抗体（proteintech #18704-1-AP）を使用した。二次抗体には、Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)（Abcam #ab150105）およびGoat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 594) preadsorbed（Abcam #ab150084）を使用した。フローサイトメトリー解析は、抗CD206抗体（proteintech #18704-1-AP）および抗CD11b抗体（BioLegend #101206）を用いて、CD206陽性率およびCD11b陽性率を算出したこと以外は、実施例４と同じ手順で行った。
６－１ 実験方法
臍帯MSCとして、実施例１と同じルシフェラーゼ-GFPをトランスフェクションしていない臍帯MSCを使用したこと以外は、実施例５と同じ方法で実験を行い、臍帯MSC投与（Day0）から12日目（Day12）に肺組織を回収し、肺組織の一部をフローサイトメトリー解析に供し、残りの肺組織を用いて免疫染色用の組織切片を作製した。一次抗体には、抗F4/80抗体（Bio-rad #MCA497GA）および抗CD206抗体（proteintech #18704-1-AP）を使用した。二次抗体には、Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)（Abcam #ab150105）およびGoat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 594) preadsorbed（Abcam #ab150084）を使用した。フローサイトメトリー解析は、抗CD206抗体（proteintech #18704-1-AP）および抗CD11b抗体（BioLegend #101206）を用いて、CD206陽性率およびCD11b陽性率を算出したこと以外は、実施例４と同じ手順で行った。
６－２ 結果
結果を図８に示した。上段はフローサイトメトリー解析を行った結果、下段は、抗F4/80抗体（Bio-rad #MCA497GA）と抗CD206抗体（proteintech #18704-1-AP）で免疫染色した各群の代表的な蛍光顕微鏡画像である。フローサイトメトリー解析結果より、エラスターゼを投与したマウス（PBS群、ノンコート群、コラーゲンゲル群およびコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群）ではいずれもCD11bが全体的に増加したが、臍帯MSCを投与したマウス（ノンコート群、コラーゲンゲル群およびコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群）では、M2マクロファージの発現レベルが上昇し、特にコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群では、M2マクロファージレベルが有意に上昇した。蛍光顕微鏡画像から、臍帯MSCを投与した群では、組織修復部位にF4/80とCD206が共陽性のM2マクロファージの集積か観察された。中でもコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群において、M2マクロファージの顕著な集積が観察された。
結果を図８に示した。上段はフローサイトメトリー解析を行った結果、下段は、抗F4/80抗体（Bio-rad #MCA497GA）と抗CD206抗体（proteintech #18704-1-AP）で免疫染色した各群の代表的な蛍光顕微鏡画像である。フローサイトメトリー解析結果より、エラスターゼを投与したマウス（PBS群、ノンコート群、コラーゲンゲル群およびコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群）ではいずれもCD11bが全体的に増加したが、臍帯MSCを投与したマウス（ノンコート群、コラーゲンゲル群およびコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群）では、M2マクロファージの発現レベルが上昇し、特にコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群では、M2マクロファージレベルが有意に上昇した。蛍光顕微鏡画像から、臍帯MSCを投与した群では、組織修復部位にF4/80とCD206が共陽性のM2マクロファージの集積か観察された。中でもコラーゲンとラミニン411E8の混合ゲル群において、M2マクロファージの顕著な集積が観察された。
〔実施例７：エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスへの臍帯由来間葉系細胞の投与による破骨細胞形成抑制〕
７－１ 実験方法
（１）臍帯MSCを投与したエラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスからの骨髄細胞採取および破骨細胞への分化誘導
実施例３と同じ方法で実験を行い、Day12にマウスを安楽死させ、脛骨を摘出した。脛骨から骨髄細胞を採取し、α-MEM（富士フイルム和光純薬株式会社）にM-CSF（Macrophage colony stimulating factor）を添加した培地で3日間培養して単球－マクロファージ系の細胞を誘導し、続いてα-MEMにRANKL（Receptor activator of NF-κB ligand）を添加した培地で3日間培養して破骨細胞に分化誘導した。
７－１ 実験方法
（１）臍帯MSCを投与したエラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスからの骨髄細胞採取および破骨細胞への分化誘導
実施例３と同じ方法で実験を行い、Day12にマウスを安楽死させ、脛骨を摘出した。脛骨から骨髄細胞を採取し、α-MEM（富士フイルム和光純薬株式会社）にM-CSF（Macrophage colony stimulating factor）を添加した培地で3日間培養して単球－マクロファージ系の細胞を誘導し、続いてα-MEMにRANKL（Receptor activator of NF-κB ligand）を添加した培地で3日間培養して破骨細胞に分化誘導した。
（２）破骨細胞の形態観察
（１）で得られた破骨細胞にTRAP（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase）染色を行い、顕微鏡で形態観察を行った。TRAP染色は、江草ら（Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274）に記載の方法に従って、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄した後、4% パラホルムアルデヒドを用いて固定し、TRAP溶液（0.1 M 酢酸ナトリウム、0.1 M 酢酸、10 mg/mL Naphtol AS-MX Phosphate（シグマ）、0.1% Triton X-100、0.3 M 酒石酸カリウム、0.3 mg/mL Fast Red Violet LB Salt（シグマ））にて37℃で15分間反応させることにより行った。
（１）で得られた破骨細胞にTRAP（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase）染色を行い、顕微鏡で形態観察を行った。TRAP染色は、江草ら（Egusa, H. et al., Bone (2011) 49(2): 264-274）に記載の方法に従って、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄した後、4% パラホルムアルデヒドを用いて固定し、TRAP溶液（0.1 M 酢酸ナトリウム、0.1 M 酢酸、10 mg/mL Naphtol AS-MX Phosphate（シグマ）、0.1% Triton X-100、0.3 M 酒石酸カリウム、0.3 mg/mL Fast Red Violet LB Salt（シグマ））にて37℃で15分間反応させることにより行った。
（３）破骨細胞におけるIL-6の発現解析
（１）で得られた破骨細胞から定法に従いRNAを抽出し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（商品名、東洋紡）を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAをリアルタイムPCRに供し、IL-6の発現量を測定した。定量RT-PCRの試薬には、Brilliant III Ultra-Fast SYBR QPCR MasterMix（Agilent #600882）を用い、リアルタイムPCRシステムAriaMx（Agilent）により解析した。使用したプライマーを以下に示す。
mGAPDH Fwd: TTGAGGTCAATGAAGGGGTC（配列番号１１）
mGAPDH Rvs: TCGTCCCGTAGACAAAATGG（配列番号１２）
mIL-6 Fwd: CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA（配列番号１３）
mIL-6 Rvs: GCAAGTGCATCATCGTTGTTCATAC（配列番号１４）
（１）で得られた破骨細胞から定法に従いRNAを抽出し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（商品名、東洋紡）を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAをリアルタイムPCRに供し、IL-6の発現量を測定した。定量RT-PCRの試薬には、Brilliant III Ultra-Fast SYBR QPCR MasterMix（Agilent #600882）を用い、リアルタイムPCRシステムAriaMx（Agilent）により解析した。使用したプライマーを以下に示す。
mGAPDH Fwd: TTGAGGTCAATGAAGGGGTC（配列番号１１）
mGAPDH Rvs: TCGTCCCGTAGACAAAATGG（配列番号１２）
mIL-6 Fwd: CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA（配列番号１３）
mIL-6 Rvs: GCAAGTGCATCATCGTTGTTCATAC（配列番号１４）
７－２ 結果
TRAP染色による破骨細胞の形態観察の結果を図９に示した。PBS群では、エラスターゼ誘導肺気腫に起因する異常な形態の破骨細胞が観察されたが、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群では、異常な形態の破骨細胞は観察されなかった。したがって、コラーゲンゲル上、またはコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養された臍帯MSCを肺気腫患者に投与することにより、異常な形態の破骨細胞形成を抑制することが示唆された。
TRAP染色による破骨細胞の形態観察の結果を図９に示した。PBS群では、エラスターゼ誘導肺気腫に起因する異常な形態の破骨細胞が観察されたが、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群では、異常な形態の破骨細胞は観察されなかった。したがって、コラーゲンゲル上、またはコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養された臍帯MSCを肺気腫患者に投与することにより、異常な形態の破骨細胞形成を抑制することが示唆された。
定量RT-PCRによるIL-6発現解析の結果を図１０に示した。コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群では、PBS群と比較してIL-6発現量が有意に抑制されていることが示された。したがって、コラーゲンゲル上、またはコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養された臍帯MSCを肺気腫患者に投与することにより、破骨細胞に起因する炎症を抑制できることが示唆された。
肺気腫の炎症は全身性で、多くの併存疾患を誘発することが知られている。その併存疾患の一つに骨粗鬆症がある。この結果は、肺気腫患者にコラーゲンゲル上、またはコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養された臍帯MSCを投与することで、肺気腫により誘発される骨粗鬆症を改善できることを示すものである。
〔実施例８：マイクロアレイ解析を用いた遺伝子発現による細胞特性〕
８－１ 実験方法
（１）RNAサンプルの調製
実施例１と同様に臍帯MSCを1×105個/mLとなるように細胞懸濁液を調製し、6ウェル培養プレートに2mL/ウェルで細胞を播種した。培養プレートには、ノンコートプレート、コラーゲンゲル、およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲルの3種を使用した。3日間培養後、臍帯MSCを回収した。コラーゲンゲルおよびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した臍帯MSCは、コラゲナーゼでゲルを溶解して回収した。ノンコートプレート上で培養した臍帯MSCは、トリプシンで剥離して回収した。回収した細胞について、株式会社セルイノベーターに委託して、RNA抽出からマイクロアレイ解析まで実施した。
８－１ 実験方法
（１）RNAサンプルの調製
実施例１と同様に臍帯MSCを1×105個/mLとなるように細胞懸濁液を調製し、6ウェル培養プレートに2mL/ウェルで細胞を播種した。培養プレートには、ノンコートプレート、コラーゲンゲル、およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲルの3種を使用した。3日間培養後、臍帯MSCを回収した。コラーゲンゲルおよびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル上で培養した臍帯MSCは、コラゲナーゼでゲルを溶解して回収した。ノンコートプレート上で培養した臍帯MSCは、トリプシンで剥離して回収した。回収した細胞について、株式会社セルイノベーターに委託して、RNA抽出からマイクロアレイ解析まで実施した。
（２）マイクロアレイ解析
マイクロアレイ解析には、Human遺伝子発現解析用マイクロアレイ「SurePrint G3 Human GE Microarray 8x60K v3.0」（Agilent Technology社）を使用した。
マイクロアレイ解析には、Human遺伝子発現解析用マイクロアレイ「SurePrint G3 Human GE Microarray 8x60K v3.0」（Agilent Technology社）を使用した。
８－２ 結果
解析結果を表１に示した。表１における「Noncoat」はノンコート群、「gel」はコラーゲンゲル群、「gel-Lam」はコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群を指し、「compare1」はノンコート群に対するコラーゲンゲル群の結果、「compare2」はノンコート群に対するコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群の結果、「compare3」はコラーゲンゲル群に対するコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群の結果を指す。Zscoreは、平均値を基準とした、値の広がりを表し、それぞれの値から平均値を引いた後に標準偏差（SD）で割ることにより算出でき、ratioは、比較対象となる群との比を示し、signalは各群におけるシグナル強度を示している。
解析結果を表１に示した。表１における「Noncoat」はノンコート群、「gel」はコラーゲンゲル群、「gel-Lam」はコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群を指し、「compare1」はノンコート群に対するコラーゲンゲル群の結果、「compare2」はノンコート群に対するコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群の結果、「compare3」はコラーゲンゲル群に対するコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群の結果を指す。Zscoreは、平均値を基準とした、値の広がりを表し、それぞれの値から平均値を引いた後に標準偏差（SD）で割ることにより算出でき、ratioは、比較対象となる群との比を示し、signalは各群におけるシグナル強度を示している。
マイクロアレイ解析の結果から、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群において、分化、細胞骨格および免疫に関与する遺伝子群の発現上昇が見られた（表１）。細胞骨格に関与する遺伝子群としては、幹細胞の分化に大きな影響を及ぼすといわれている細胞骨格の可変性に寄与する因子である、TUBA1C、TUBA1BおよびCFL1の発現上昇が見られた。また、酸化ストレスの調節により生体防御系酵素の発現誘導を介して分化を促進するNFE2L1や間葉系細胞に発現し、血管、心筋細胞などに分化誘導を促進するVIMの発現上昇が認められた。さらに、免疫に関与する遺伝子群では、癌抑制因子のTNFAIP3やNFKBIA、マクロファージ刺激因子CSF1についても顕著な発現上昇が見られた。したがって、コラーゲンゲル群およびコラーゲン＋ラミニン411E8ゲル群の細胞は、分化誘導や細胞骨格および免疫調節に寄与する特性を有することが示唆される。
〔実施例９：エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスへの臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン疑似ペプチドまたはラミニン由来ペプチドとの混合物の投与による治療効果〕
９－１ 実験方法
（１）エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスの作製
実施例３と同じ方法で8-9週齢のC57BL/6雄マウスに麻酔した後、エラスターゼを鼻腔内に単回投与し、4週間飼育してエラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスを作製した。
９－１ 実験方法
（１）エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスの作製
実施例３と同じ方法で8-9週齢のC57BL/6雄マウスに麻酔した後、エラスターゼを鼻腔内に単回投与し、4週間飼育してエラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスを作製した。
（２）臍帯MSCの調製および投与
臍帯MSCをノンコートプレート上で3日間培養し細胞を回収した。回収した臍帯MSCは、回収した当日中に調製から投与まで行った。コラーゲン疑似ペプチドとしてVitroGel COL High Concentration（TheWell Bioscience、TWG009）を使用し、ラミニン由来ペプチドとしてVitroGel YIGSR High Concentration（TheWell Bioscience、TWG008）を使用した。各ペプチドを含むゲル50μLを、それぞれ付属の希釈液（VitroGel Dilution Solution）120μLを用いて希釈して、細胞数が3×106個/200μLとなるように、細胞懸濁液を30μL加えて調製した。調製した混合物200μLをマウスの尾静脈内に投与した。対照動物には3×106個/200μLの細胞懸濁液をPBSで調製して、尾静脈内に投与した（Day0）。1群あたり3匹のマウスを用いた。
臍帯MSCをノンコートプレート上で3日間培養し細胞を回収した。回収した臍帯MSCは、回収した当日中に調製から投与まで行った。コラーゲン疑似ペプチドとしてVitroGel COL High Concentration（TheWell Bioscience、TWG009）を使用し、ラミニン由来ペプチドとしてVitroGel YIGSR High Concentration（TheWell Bioscience、TWG008）を使用した。各ペプチドを含むゲル50μLを、それぞれ付属の希釈液（VitroGel Dilution Solution）120μLを用いて希釈して、細胞数が3×106個/200μLとなるように、細胞懸濁液を30μL加えて調製した。調製した混合物200μLをマウスの尾静脈内に投与した。対照動物には3×106個/200μLの細胞懸濁液をPBSで調製して、尾静脈内に投与した（Day0）。1群あたり3匹のマウスを用いた。
（２）肺組織回収および組織学的解析
実施例３と同じ方法でヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色まで行い、顕微鏡で肺気腫の病態を観察した。
実施例３と同じ方法でヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色まで行い、顕微鏡で肺気腫の病態を観察した。
９－２ 結果
結果を図１１に示した。図１１は、各群の代表的な肺のH&E染色画像である。スケールバーは、500μmである。ノンコート群と比較してコラーゲン疑似ペプチド群ではわずかな肺胞構造の修復が観察され、ラミニン由来ペプチド群では顕著な肺胞構造の修復が見られた。この結果から、臍帯MSCをこれらのペプチドと共に使用することで肺気腫モデルマウスへの肺胞壁の修復に寄与でき、特にラミニン由来ペプチドと共に使用することで肺胞壁の修復機能を向上できることが示された。
結果を図１１に示した。図１１は、各群の代表的な肺のH&E染色画像である。スケールバーは、500μmである。ノンコート群と比較してコラーゲン疑似ペプチド群ではわずかな肺胞構造の修復が観察され、ラミニン由来ペプチド群では顕著な肺胞構造の修復が見られた。この結果から、臍帯MSCをこれらのペプチドと共に使用することで肺気腫モデルマウスへの肺胞壁の修復に寄与でき、特にラミニン由来ペプチドと共に使用することで肺胞壁の修復機能を向上できることが示された。
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
Claims (10)
- 臍帯由来間葉系幹細胞をコラーゲンゲル上で培養する工程を含む、血管内皮増殖因子を高発現する臍帯由来間葉系細胞の製造方法。
- コラーゲンゲルが、ラミニンα4β1γ1またはラミニンα4β1γ1E8フラグメントを含む、請求項１に記載の製造方法。
- ラミニンα4β1γ1またはラミニンα4β1γ1E8フラグメントの濃度が、培養面積当たり0.1μg/cm2～1.5μg/cm2である、請求項２に記載の製造方法。
- 培養期間が2日間～10日間である、請求項１に記載の製造方法。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物。
- 前記肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、間質性肺炎、放射線肺臓炎、過敏性肺臓炎または好酸球性肺炎である、請求項５に記載の医薬組成物。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法で製造された臍帯由来間葉系細胞を有効成分として含有する、肺疾患により誘発される併存疾患の治療用医薬組成物。
- 前記併存疾患が、心血管疾患、糖尿病、栄養障害、骨粗鬆症または骨格筋機能障害である、請求項７に記載の医薬組成物。
- 前記肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、間質性肺炎、放射線肺臓炎、過敏性肺臓炎または好酸球性肺炎である、請求項７に記載の医薬組成物。
- 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を有効成分として含有する肺疾患治療用医薬組成物：
（ａ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドとの混合物、
（ｂ）臍帯由来間葉系細胞と、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物、または
（ｃ）臍帯由来間葉系細胞と、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、もしくはコラーゲン疑似ペプチドと、ラミニンもしくはラミニン由来ペプチドとの混合物。
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| JP2022-114988 | 2022-07-19 | ||
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Citations (8)
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