JP6336549B2 - 組織再生を誘導するためのペプチドとその利用 - Google Patents
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Description
〔1〕
以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質を含有する、細胞遊走を刺激するために用いられる組成物;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター。
〔2〕
以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質を含有する、細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター。
〔3〕
以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質を含有する、組織を再生するために用いられる組成物;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター。
〔4〕
遊走が刺激される、または骨髄から末梢血に動員される細胞がPDGFRα陽性細胞である、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の組成物。
〔5〕
遊走が刺激される、または骨髄から末梢血に動員される細胞が幹細胞である、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の組成物。
〔6〕
遊走が刺激される、または骨髄から末梢血に動員される細胞が骨髄細胞である、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の組成物。
〔7〕
遊走が刺激される、または骨髄から末梢血に動員される細胞が骨髄間葉系幹細胞である、〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の組成物。
〔8〕
細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドが、配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における1番目から195番目のアミノ酸配列もしくは1番目から185番目のアミノ酸配列の全部または一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の組成物。
〔9〕
細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドが、以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の組成物;
(1)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
(2)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
(3)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
(4)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
(5)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
〔10〕
細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチドが、配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における1番目から195番目のアミノ酸配列もしくは1番目から185番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の組成物;
(1)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
(2)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
(3)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
(4)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
(5)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
〔11〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドを含有する、細胞遊走を刺激するために用いられる組成物;
(1)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
(2)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
(3)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
(4)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
(5)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
〔12〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドを含有する、細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物;
(1)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
(2)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
(3)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
(4)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
(5)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
〔13〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドを含有する、組織を再生するために用いられる組成物;
(1)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
(2)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
(3)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
(4)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
(5)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
〔14〕
ペプチドが、合成されたペプチドである、〔1〕〜〔13〕のいずれかに記載の組成物。
〔15〕
ペプチドが、細胞を用いて製造されたペプチドである、〔1〕〜〔14〕のいずれかに記載の組成物。
〔16〕
ペプチドが、タグが付加されているペプチドである、〔1〕〜〔15〕のいずれかに記載の組成物。
〔17〕
ペプチドが、タグ由来のペプチド断片が付加されているペプチドである、〔1〕〜〔15〕のいずれかに記載の組成物。
〔18〕
細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド。
〔19〕
配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における1番目から195番目のアミノ酸配列もしくは1番目から185番目のアミノ酸配列の全部または一部からなる、細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔18〕に記載のペプチド。
〔20〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔18〕に記載のペプチド;
(1)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
(2)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
(3)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
(4)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
(5)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
〔21〕
配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における1番目から195番目のアミノ酸配列もしくは1番目から185番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチドである、〔18〕に記載のペプチド;
(1)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
(2)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
(3)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
(4)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
(5)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
〔22〕
以下のいずれかのアミノ酸配列を含む細胞遊走刺激活性を有するペプチド;
(1)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
(2)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
(3)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
(4)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
(5)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
〔23〕
ペプチドが、合成されたペプチドである、〔18〕〜〔22〕のいずれかに記載のペプチド。
〔24〕
ペプチドが、細胞を用いて製造されたペプチドである、〔18〕〜〔22〕のいずれかに記載のペプチド。
〔25〕
ペプチドが、タグが付加されているペプチドである、〔18〕〜〔22〕のいずれかに記載のペプチド。
〔26〕
ペプチドが、タグ由来のペプチド断片が付加されているペプチドである、〔18〕〜〔22〕のいずれかに記載のペプチド。
〔27〕
〔18〕〜〔26〕のいずれかに記載のペプチドをコードするDNA。
〔28〕
〔27〕に記載のDNAを有するベクター。
〔29〕
〔27〕に記載のDNAまたは〔28〕に記載のベクターを有する形質転換細胞。
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
本発明の細胞遊走を刺激するために用いられる組成物には、試薬組成物および医薬組成物が含まれる。本明細書において、試薬組成物は試薬とも表現され、医薬組成物は医薬、薬剤または薬学的組成物とも表現される。
本発明において、細胞遊走刺激活性とは、細胞遊走を刺激する活性を意味する。本明細書において、細胞遊走刺激活性は、細胞遊走誘導活性または細胞誘導活性とも表現される。
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
本発明の骨髄細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物には、試薬組成物および医薬組成物が含まれる。
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
本発明の組織を再生するために用いられる組成物には、試薬組成物および医薬組成物が含まれる。
・ HMGB1タンパク質やペプチドを挿入したシリコンチューブを皮下などに埋め込み、一定時間後に取り出してチューブ内に遊走した細胞を確認する方法。
・ HMGB1タンパク質やペプチドを樹脂ビーズなどに結合させ生体組織内に埋め込み、一定時間後に取り出してビーズに遊走した細胞を確認する方法。
・ ゼラチン、ヒアルロン酸などの徐放作用のある高分子体にHMGB1タンパク質やペプチドをしみこませ生体組織内に埋め込み、一定時間後に取り出して高分子体に遊走した細胞を確認する方法。
(1)17番目から25番目のアミノ酸配列
(2)45番目から74番目のアミノ酸配列
(3)55番目から84番目のアミノ酸配列
(4)85番目から169番目のアミノ酸配列、
(5)89番目から185番目のアミノ酸配列、および
(6)93番目から215番目のアミノ酸配列。
(1)17番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
(2)45番目から74番目のアミノ酸配列を含むペプチド
(3)55番目から84番目のアミノ酸配列を含むペプチド
(4)85番目から169番目のアミノ酸配列を含むペプチド、および
(5)89番目から185番目のアミノ酸配列を含むペプチド。
(1)1番目から44番目のアミノ酸配列
(2)1番目から25番目のアミノ酸配列
(3)1番目から34番目のアミノ酸配列
(4)1番目から42番目のアミノ酸配列
(5)1番目から43番目のアミノ酸配列
(6)1番目から45番目のアミノ酸配列
(7)1番目から46番目のアミノ酸配列
(8)1番目から47番目のアミノ酸配列
(9)1番目から48番目のアミノ酸配列
(10)1番目から49番目のアミノ酸配列
(11)1番目から50番目のアミノ酸配列
(12)1番目から51番目のアミノ酸配列
(13)1番目から52番目のアミノ酸配列
(14)1番目から62番目のアミノ酸配列
(15)1番目から84番目のアミノ酸配列
(16)10番目から25番目のアミノ酸配列
(17)11番目から25番目のアミノ酸配列
(18)11番目から27番目のアミノ酸配列
(19)11番目から28番目のアミノ酸配列
(20)11番目から29番目のアミノ酸配列
(21)11番目から30番目のアミノ酸配列
(22)11番目から34番目のアミノ酸配列
(23)11番目から44番目のアミノ酸配列
(24)12番目から25番目のアミノ酸配列
(25)12番目から30番目のアミノ酸配列
(26)13番目から25番目のアミノ酸配列
(27)13番目から30番目のアミノ酸配列
(28)14番目から25番目のアミノ酸配列
(29)14番目から30番目のアミノ酸配列
(30)15番目から25番目のアミノ酸配列
(31)15番目から30番目のアミノ酸配列
(32)16番目から25番目のアミノ酸配列
(33)16番目から30番目のアミノ酸配列
(34)17番目から30番目のアミノ酸配列
(35)1番目から70番目のアミノ酸配列
(36)1番目から81番目のアミノ酸配列
(37)1番目から170番目のアミノ酸配列
(38)2番目から25番目のアミノ酸配列
(39)2番目から34番目のアミノ酸配列
(40)2番目から42番目のアミノ酸配列
(41)2番目から43番目のアミノ酸配列
(42)2番目から44番目のアミノ酸配列
(43)2番目から45番目のアミノ酸配列
(44)2番目から46番目のアミノ酸配列
(45)2番目から47番目のアミノ酸配列
(46)2番目から48番目のアミノ酸配列
(47)2番目から49番目のアミノ酸配列
(48)2番目から50番目のアミノ酸配列
(49)2番目から51番目のアミノ酸配列
(50)2番目から52番目のアミノ酸配列
(51)2番目から62番目のアミノ酸配列
(52)2番目から70番目のアミノ酸配列
(53)2番目から81番目のアミノ酸配列
(54)2番目から84番目のアミノ酸配列
(55)2番目から170番目のアミノ酸配列
(56)17番目から44番目のアミノ酸配列
(57)1番目から185番目のアミノ酸配列
(58)1番目から195番目のアミノ酸配列
(59)2番目から185番目のアミノ酸配列
(60)2番目から195番目のアミノ酸配列、および
(61)17番目から25番目のアミノ酸配列。
(a)1番目から84番目のアミノ酸配列
(b)45番目から84番目のアミノ酸配列
(c)1番目から81番目のアミノ酸配列
(d)1番目から170番目のアミノ酸配列
(e)2番目から81番目のアミノ酸配列
(f)2番目から84番目のアミノ酸配列
(g)2番目から170番目のアミノ酸配列
(h)1番目から185番目のアミノ酸配列
(i)1番目から195番目のアミノ酸配列
(j)2番目から185番目のアミノ酸配列
(k)2番目から195番目のアミノ酸配列、および
(l)45番目から74番目のアミノ酸配列。
(A)1番目から84番目のアミノ酸配列
(B)45番目から84番目のアミノ酸配列
(C)1番目から170番目のアミノ酸配列
(D)2番目から84番目のアミノ酸配列
(F)2番目から170番目のアミノ酸配列を含むペプチド
(G)1番目から185番目のアミノ酸配列
(H)1番目から195番目のアミノ酸配列
(I)2番目から185番目のアミノ酸配列
(J)2番目から195番目のアミノ酸配列、および
(K)55番目から84番目のアミノ酸配列。
(i)1番目から170番目のアミノ酸配列
(ii)2番目から170番目のアミノ酸配列
(iii)1番目から185番目のアミノ酸配列
(iv)1番目から195番目のアミノ酸配列
(v)2番目から185番目のアミノ酸配列
(vi)2番目から195番目のアミノ酸配列、および
(vii)85番目から169番目。
(I)1番目から185番目のアミノ酸配列
(II)1番目から195番目のアミノ酸配列
(III)2番目から185番目のアミノ酸配列
(IV)2番目から195番目のアミノ酸配列、および
(V)89番目から185番目のアミノ酸配列。
(W)45番目から215番目のアミノ酸配列を含むペプチド
(X)63番目から215番目のアミノ酸配列を含むペプチド
(Y)89番目から215番目のアミノ酸配列を含むペプチド、および
(Z)93番目から215番目のアミノ酸配列を含むペプチド。
<1>1番目から44番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<2>1番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<3>1番目から34番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<4>1番目から42番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<5>1番目から43番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<6>1番目から45番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<7>1番目から46番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<8>1番目から47番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<9>1番目から48番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<10>1番目から49番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<11>1番目から50番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<12>1番目から51番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<13>1番目から52番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<14>1番目から62番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<15>1番目から84番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<16>10番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<17>11番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<18>11番目から27番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<19>11番目から28番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<20>11番目から29番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<21>11番目から30番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<22>11番目から34番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<23>11番目から44番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<24>12番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<25>12番目から30番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<26>13番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<27>13番目から30番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<28>14番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<29>14番目から30番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<30>15番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<31>15番目から30番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<32>16番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<33>16番目から30番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<34>17番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<35>17番目から30番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<36>45番目から74番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<37>45番目から84番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<38>45番目から215番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<39>55番目から84番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<40>63番目から215番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<41>1番目から70番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<42>1番目から81番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<43>1番目から170番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<44>2番目から25番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<45>2番目から34番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<46>2番目から42番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<47>2番目から43番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<48>2番目から44番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<49>2番目から45番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<50>2番目から46番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<51>2番目から47番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<52>2番目から48番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<53>2番目から49番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<54>2番目から50番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<55>2番目から51番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<56>2番目から52番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<57>2番目から62番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<58>2番目から70番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<59>2番目から81番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<60>2番目から84番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<61>2番目から170番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<62>85番目から169番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<63>89番目から185番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<64>89番目から195番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<65>89番目から205番目のアミノ酸配列を含むペプチド
(66)89番目から215番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<67>93番目から215番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<68>17番目から44番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<69>1番目から185番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<70>1番目から195番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<71>1番目から205番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<72>2番目から185番目のアミノ酸配列を含むペプチド
<73>2番目から195番目のアミノ酸配列を含むペプチド、および
<74>2番目から205番目のアミノ酸配列を含むペプチド。
配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列の一部を含む、細胞遊走刺激活性を有するペプチドであって、以下の条件を満たすペプチド:
上記<1>から<74>の群より2つのペプチドを選択し、短い方をAとし、長い方をBとし、ここで、
Aを少なくとも含み、かつBの全部または一部からなるペプチド。
「1」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
「2」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
「3」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
「4」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
「5」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
(a)本発明のペプチドをコードするDNAを細胞に導入し、該ペプチドを発現させる工程、
(b)細胞から該ペプチドを回収する工程。
(a)本発明のペプチドをコードするDNAを細胞に導入し、該ペプチドを発現させる工程、および、
(b)細胞から該ペプチドを回収する工程。
当該製造方法は、さらに次の工程を含むことが出来る。
(c)HMGB1タンパク質と比較して高い細胞遊走刺激活性を有する、該ペプチドを選択する工程。
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
該キットは、細胞遊走を刺激するために、骨髄細胞を骨髄から末梢血に動員するために、あるいは、組織を再生するために使用できる。該キットとしては、(1)フィブリノゲンに溶解した上記物質、および(2)トロンビンを含むキット、または、(1)上記物質、(2)フィブリノゲン、および(3)トロンビンを含むキットが例示できる。本発明においては、市販のフィブリノゲンやトロンビンを使用することができる。例えば、フィブリノゲンHT-Wf(ベネシスー三菱ウェルファーマー)、ベリプラスト(ZLBベーリング)、ティシール(バクスター)、ボルヒール(化血研)、タココンブ(ZLBベーリング)が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
(1)以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質の有効量を投与する工程を含む、細胞遊走を刺激する方法;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
(2)以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質の有効量を投与する工程を含む、細胞を骨髄から末梢血に動員する方法;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
(3)以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質の有効量を投与する工程を含む、組織を再生させる方法;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
(4)細胞遊走を刺激するために用いられる組成物の製造における以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質の使用;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
(5)細胞を骨髄から末梢血に動員するために用いられる組成物の製造における以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質の使用;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
(6)組織を再生するために用いられる組成物の製造における以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質の使用;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
(7)細胞遊走を刺激する方法に使用するための、以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
(8)細胞を骨髄から末梢血に動員する方法に使用するための、以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
(9)組織を再生する方法に使用するための、以下の(a)から(c)のいずれかに記載の物質;
(a)細胞遊走刺激活性を有する、HMGB1タンパク質の一部からなるペプチド
(b)(a)に記載のペプチドを分泌する細胞
(c)(a)に記載のペプチドをコードするDNAが挿入されたベクター
「1」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列
「2」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列
「3」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列
「4」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における85番目から169番目のアミノ酸配列、および
「5」配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における89番目から185番目のアミノ酸配列。
新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNAを抽出し、SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した。このcDNAをテンプレートとしてHMGB1のcDNAをPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法を用いて増幅した。分泌シグナルとしてIgG κ鎖signal 配列、精製のためにアミノ酸配列のN末端にHA tag、GST tagおよび6XHis tagの配列を付加したタンパク質を発現するように、哺乳類細胞でタンパク質を発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した(図1)。さらにHis tagと目的タンパク質およびペプチドの間にHRV3Cで切断される配列を挿入した。HRV3C切断後は目的タンパク質およびペプチドのN末端側にGly Pro Gly Thy Gln(配列番号:7)のペプチド断片が付加される。なお全長HMGB1およびペプチドのcDNAはPCR法を用いて制限酵素サイトを付加しベクターのKpnIおよびEcoRI部分に挿入した。
マウス骨髄間葉系幹細胞株(MSC-1細胞、大阪大学玉井ら作製(PDGFRα-positive cells in bone marrow are mobilized by high mobility group box 1 (HMGB1) to regenerate injured epithelia.(tamai et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 4.)))をディッシュからトリプシンを使用して4℃、1200rpm、10分の遠心により回収した。ペレットをほぐし、細胞濃度が2.0〜3.0×106個/mlになるように、10%FBS(Fetal bovine serum)含D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)を加え混濁した。HEK293にて生産した組み換えタンパク質およびペプチドを10%FBS 含D-MEMに希釈した。陰性コントロールとしてはPBS(Phosphate buffered saline)を使用した。アクリル製ボイデンチャンバーを使用し、上層には、3X106個/mlに調製されたマウス骨髄間葉系幹細胞株を、下層には希釈したタンパク質もしくはペプチドを入れた。より詳細には、48穴ケモタキシスチャンバー(NEURO PROBE 48WELL CHEMOTAXIS CHAMBER)の底板穴にタンパク質またはペプチド溶解液を28μlずつ入れ、底板の上に8μm 孔のポリカーボネートメンブレン(Neuro Probe, Inc, Cat: 866-417-0014)を載せて、さらに上板を載せてネジでしっかり止めた。上板穴に細胞濃度調整をすませたマウス骨髄間葉系幹細胞株を50μl入れた。チャンバーは37℃、5%CO2のインキュベーター内で静置した。4時間後チャンバーのメンブレンを回収し、Diff-Quik(Sysmex, Cat: 16920)を用いて、膜の孔を通り抜け下層に向かってマイグレーションした細胞を染色により検出した。
マウス全長HMGB1(1-215)および1番目から84番目までのペプチド(1-84)、85番目から169番目までのペプチド(85-169)、1番目から44番目までのペプチド(1-44)、45番目から84番目までのペプチド(45-84)および陰性コントロール(PBS)のマイグレーション活性の有無を確認した。タンパク質およびペプチドはそれぞれ50μg/mlの濃度で使用した。85-169においてはマイグレーション活性を検出しなかったが、他の1-215、1-84、1-44、45-84においてマイグレーション活性を示した(図2)。
マウス、ラットおよびヒトのHMGB1(それぞれ配列番号:3、5および1)は1番目から85番目までのアミノ酸配列はA-box、86番目から169番目までのアミノ酸配列はB-boxとして知られている。マウス、ラットおよびヒトの1番目から185番目までのアミノ酸配列はすべて一致し、100%相同性を保っている。186番目から215番目までのアミノ酸配列はグルタミン酸およびアスパラギン酸の繰り返し配列であり、マウスとラットでは100%一致するがヒトとは2アミノ酸のみ異なる。85-169はマイグレーション活性が検出されず、この断片には活性がないか、或いは活性が今回の実験条件では検出限界以下であったものと考えられる。一方で1-84、1-44、45-84では、いずれにも良好なマイグレーション活性を認めることから、1番目から44番目までのアミノ酸配列の間と45番目から84番目までのアミノ酸配列の間の少なくとも2カ所にマイグレーション活性を有するドメインが存在することが予想された。HMGB1は樹状細胞などの細胞をマイグレーションさせることが知られているが、RAGEと呼ばれるレセプターをHMGB1が刺激することで誘発されると考えられている。HMGB1の中に存在するRAGE 結合 ドメインは150から181番目のアミノ酸に相当する部分に存在することが知られている。今回骨髄間葉系幹細胞をマイグレーションさせたドメインがRAGE結合ドメインと異なる部位でありなおかつ少なくとも2か所も発見したことは驚くべきことである。
1番目から42番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-42)、
1番目から43番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-43)、
1番目から45番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-45)、
1番目から46番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-46)、
1番目から47番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-47)、
1番目から48番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-48)、
1番目から49番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-49)、
1番目から50番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-50)、
1番目から51番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-51)、
1番目から52番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-52)、
1番目から62番目のアミノ酸配列を含むペプチド(1-62)。
ドナーマウス:B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J(PDGFRα-GFP Mouse)から大腿骨および脛骨を切り出し、周囲に付着した筋およびその他の組織を取り除いた後、骨を細かく破砕し、0.2%コラゲナーゼ(Roche, REF:10103586001)DMEM, 2% FBS(filtrated)に37℃、40分反応させた。40μmナイロンメッシュに通し、さらに細胞塊や筋組織を除去した。1200rpm、10分遠心し、αMEM10%FBS1%P/S培養液に懸濁し、37℃ 5%CO2インキュベーターにて100%コンフルエントになるまで培養した。細胞を回収し、CD11b マイクロビーズ(Miltenyi Biotec, order No:130-049-601)に付属しているプロトコールに従って以下の実験を行った。細胞をPBS(-)で107 個/90μl毎に調整し、CD11b マイクロビーズを107 個毎に10μlずつ加えて、4℃、15分間反応させた。その後、2回洗浄し、PBS(-)500μlに混濁した。AutoMACSセパレーターにチューブをセットし、"Depletes"分離プログラムにより細胞を回収した。回収した細胞を、接着細胞用培養皿に播種し、接着後蛍光顕微鏡を使用してGFPの蛍光を観察した。CD11b陰性細胞を使用し、前述のHEK293で生産したペプチド1-44に対するマイグレーション活性を調べた。ペプチドは40μg/mlの濃度で使用した。
CD11b陽性細胞にはPDGFRαGFP細胞はほとんど見られず、CD11b陰性細胞にはPDGFRαGFP細胞を多数認めた(図4)。また、CD11b陰性、PDGFRα陽性の細胞に対してHEK293を使用して生産した1-44のペプチドは強いマイグレーション活性を示した(図5)。
CD11b陰性、PDGFRα陽性の細胞には、骨髄中の多能性幹細胞一種である骨髄間葉系幹細胞が多く含まれると考えられる。1-44のペプチドは株化した骨髄間葉系幹細胞株の他、初代培養の骨髄間葉系幹細胞に対してもマイグレーション活性を有すると考えられる。
方法
ヒト間葉系幹細胞(hMSC, human Mesenchymal Stem Cell)(タカラバイオ株式会社、製品番号PT034)をヒト間葉系幹細胞専用完全合成培地キット(MSCGM-CD(tm) BulletKit(tm))(タカラバイオ株式会社、製品番号B0632)を使用して製品マニュアルに従い培養した。少なくとも実験に使用する細胞は5継代以内の細胞を使用した。
ポジティブコントロールである大腸菌で生産したラットPDGFRαが約170kDaのサイズにバンドが認められた。一方、ヒト骨髄間葉系幹細胞のPDGFRαはやや分子量が大きい位置に検出された(図2B)。
マウスだけではなくヒトの骨髄間葉系幹細胞においてもPDGFRαタンパクの発現がウエスタンブロットで検出された。大腸菌で生産したラットPDGFRαに比較してやや大きなサイズにみられるのは糖鎖等の修飾によるものの可能性が考えられる。PDGFRαはヒトにおいても骨髄間葉系幹細胞においても発現を確認できた。
PDGFRα陽性、Lineage陰性、c-kit陰性細胞のFACSソーティング
C57Bl6マウス(6週齢、雄)に対しイソフルランを用い十分に深い麻酔を施行し、二酸化炭素を吸入させ安楽死させた。大腿骨及び脛骨を取り出し、脂肪および筋組織を切除し、EtOHに浸し骨に付着した組織を十分に取り除いた。26G針をつけたシリンジを使い骨髄組織を取出した。取り出した骨髄細胞に0.2% Collagenase A を含むDMEMを加え、37℃で40分間 インキュベートした。10% FBS DMEMを加え遠心機で1500rpmの速度で 10分間遠心を行った。上精を捨て沈殿した骨髄細胞を回収した。
骨分化誘導
細胞が70%コンフルエントになった状態で、Osteogenic differentiation培地 (R & D, SC010で培地を調整ずみ)を2〜3日毎に交換した。37℃ 5%CO2インキュベーターにて培養した。約3週間培養を継続した。
ALP染色
骨分化誘導した細胞をキットの固定液(あらかじめ固定準備液から調整)にて、10秒固定した。Fast Blue RR Saltと基質原液にて作った基質液(武藤化学、Cat.No.1568-2)にて、37℃で3分染色した。ALP陽性細胞は青紫色に着色する。
脂肪分化誘導
細胞が100%コンフルエントになった状態で、Adipogenic differentiation 培地 (R & D, SC010で培地を調整ずみ)を3〜4日毎に交換した。37℃ 5%CO2インキュベーターにて培養した。約2週間培養を継続した。
Oil Red染色
脂肪分化誘導した細胞を、キット付属のPropylene Glycol固定液にて固定し、その後、oil red O solution(DBS, item#KT 025)を用いて、脂肪細胞の染色を行った。
骨分化誘導した細胞において青紫色に染まる細胞が認められ、骨芽細胞へ分化することが示された(図6A)。脂肪分化誘導下では、赤色に染まった脂肪細胞の油滴が認められ、脂肪細胞へ分化することが示された(図6B)。
骨髄中のPDGFRα陽性細胞の中に少なくとも骨分化、脂肪分化可能な骨髄間葉系幹細胞が含まれていることが考えられた。
以下のペプチドを、MBL(株式会社医学生物学研究所)に依頼し固相法で合成した。なお、マウスHMGB1の配列(配列番号:3)に基づき、ペプチドを合成した。以降の実施例における合成ペプチドも同様にマウスHMGB1の配列に基づき作成されたものである。
HMGB1の1番目から10番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1-10)、
1番目から34番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1-34)、
37番目から62番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(37-62)、
27番目から62番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(27-62)、
56番目から72番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(56-72)、
11番目から20番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-20)、
11番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-25)、
11番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-30)、
11番目から34番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-34)、
11番目から44番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-44)、
17番目から44番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(17-44)、
1番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1-25)、および
陽性コントロールとしてHEK293で生産したマウス全長HMGB1(1-215(HEK))を、100μg/mlになるように調整し、ケモタキシスチャンバーの下層に入れ、株化骨髄間葉系幹細胞(MSC-1)に対するマイグレーション活性を検討した。
少なくとも、合成ペプチド(11-34)、(1-34)、(11-44)、(1-44)、(11-30)には、陽性コントロールと同等以上の活性を認めた(図7)。また、合成ペプチド(11-25)、(1-25)にも活性を認めた(図7)。
実施例1の結果から1番目から44番目までのアミノ酸配列、45番目から84番目までのアミノ酸のなかにそれぞれマイグレーション活性部分が少なくとも1カ所ずつ存在することが予想された。今回実施例4の結果から、合成ペプチド(11-34)においても強いマイグレーション活性を有しており、少なくとも11番目から34番目までのアミノ酸配列の中に活性中心があると予想された。また、活性は若干弱いものの合成ペプチド(11-25)にも活性を認め、11番目から25番目までのアミノ酸配列に活性中心部分があり、その前後のアミノ酸配列は活性を増強する配列であると予想された。
さらに活性中心部分を絞り込むために短いペプチドを以下のように合成した。
HMGB1の11番目から27番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-27)、
11番目から28番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-28)、
11番目から29番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-29)、
12番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(12-30)、
13番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(13-30)、
14番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(14-30)、
15番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(15-30)、
16番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(16-30)、
17番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(17-30)、
18番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(18-30)、
19番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(19-30)、
20番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(20-30)、
21番目から30番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(21-30)、
10番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(10-25)、
11番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(11-25)、
12番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(12-25)、
13番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(13-25)、
14番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(14-25)、
15番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(15-25)、
16番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(16-25)、
17番目から25番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(17-25)、
186番目から215番目のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(186-215)。
少なくとも5μMの濃度の合成ペプチド(11-27)、(11-28)、(11-29)、(12-30)、(13-30)、(14-30)、(10-25)に強いマイグレーション活性を認めた。また、合成ペプチド(11-25)、(12-25)、(13-25)、(14-25)、(15-25)、(15-30)、(16-25)、(16-30)、(17-25)、(17-30)では弱い活性を認めた。(図8A、図8B)
実施例4の結果から11番目から25番目のアミノ酸配列の中にマイグレーション活性を有するドメインが存在すると予想されたため、マイグレーション活性を有するドメインのうち一箇所は、17番目のアミノ酸から25番目のアミノ酸の間(9アミノ酸)に存在することが考えられる。
方法
HMGB1の断片からなる合成ペプチド15-30,16-30,17-30,17-44,45-74,55-84それぞれの骨髄間葉系幹細胞(MSC-1)に対するマイグレーション活性の強さをネガティブコントロール(PBS)と比較した。前述と同様にボイデンチャンバー法を行った。ペプチドはそれぞれ10μMになるようにチャンバーの下層に挿入した。チャンバーの上層には1.5 X 106個の細胞を1mLの10%FBS含DMEMに拡散させ挿入した。上層と下層の間には直径8μm の孔のポリカーボネート膜を挿入した。37℃、5%CO2のインキュベーターで4時間インキュベートした後、膜を回収し下層側に移動した細胞のみをディフ・クイック染色(Diff-Quik stain(商標))で染色した。染色後風乾し顕微鏡にて下層側に移動した細胞の数を計測し平均値を計算した。
いずれのペプチドにおいても陰性コントロールに比較してより強いマイグレーションの活性を認めた。
合成ペプチドは、HEK293や大腸菌などの細菌を使用した製造方法に比較して、安価で安定した生産量を確保できる他、生物由来の毒素などのコンタミネーションが予防できるなど医薬品製造においては非常に優れた製造方法である。一方、生物内での生成と異なり、翻訳後修飾やフォールディングが正確に行われないため、疎水性の高いアミノ酸からなる低分子のペプチドは水溶液に対し極めて難溶性となることがしばしばある。本実施例においても、マイグレーション活性が比較的弱いペプチドであったため、ネガティブコントロールに対する活性の強さを、顕微鏡を使用し正確に検出した。いずれのペプチドにおいてもネガティブコントロールに比較し強いマイグレーション活性を検出した(図8C)。
実施例4において使用した合成ペプチド(1-44)、(1-34)、45番目のアミノ酸から74番目のアミノ酸からなるペプチド(45-74)、55番目のアミノ酸から84番目のアミノ酸からなるペプチド(55-84)を実施例5と同様にケモタキシスチャンバーを使用してマイグレーションアッセイを施行した。それぞれ10μMおよび5μMの2種類の濃度で同時に行なった。
合成ペプチド(1-44)、(1-34)に比較して弱いものの、合成ペプチド(45-74)にも合成ペプチド(55-84)にもマイグレーション活性を認めた(図9)。
実施例1の結果では、HEK293で生産したペプチド(1-84)、(1-44)、(45-84)にPDGFRα陽性間葉系幹細胞に対する強いマイグレーション活性が認められた。実施例4の結果から合成ペプチドにおいても合成ペプチド(1-44)、(1-34)において強い活性が保存されていることが示された。一方、今回の実施例6の結果では、合成ペプチド(45-74)、(55-84)は若干減弱しているものの、同様に、マイグレーション活性が認められた。
実施例1と同様に、HEK293細胞にポリエチレンイミンを用いてマウスHMGB1(1-44)発現ベクターをトランスフェクションし、細胞上清中に分泌されるHMGB1を回収し精製した(HEK293 transient)。また、同様にトランスフェクションした後2μg/mlのピューロマイシンを培養液中に添加し恒常的にHMGB1(1-44)を分泌する細胞を薬剤選択した。この細胞上清中に分泌されたHMGB1を精製した(HMGB1-stable)。
大腸菌による1番目のアミノ酸から44番目までのアミノ酸のペプチドを作製するために、HRV3Cで切断されるマウスHMGB1の1番目のアミノ酸から44番目までのアミノ酸をコードするcDNAのN末側に付加するキメラペプチドを発現するcDNA をpENTR ベクター(インビトロジェン社製)に挿入した。LR反応を行いpDEST17 ベクターに組み替えを行った。本発現ベクターはT7 プロモーターを有し、大腸菌でタンパク質を発現することが可能である。また、6XHis tag をN末端側に付加する。HRV3C切断後は6X His tagは切除され、ペプチドのN末端側にGly Pro Gly Thy Gln(配列番号:7)のペプチド断片が付加される。
等モルあたりでは全長のHMGB1に対してHEK293で産生したペプチド(1-44)も、大腸菌で産生したペプチド(1-44)も約1.6倍高いマイグレーション活性を示した。等質量あたりでは全長のHMGB1に対してHEK293で産生したペプチド(1-44)も、大腸菌で産生したペプチド(1-44)も約8倍高いマイグレーション活性を示した。合成ペプチド(1-44)は全長のHMGB1に対し等モルでは0.57倍であったが、等質量あたりでは2.86倍の高いマイグレーション活性を示した(図10)。
実施例1及び実施例6等から、マイグレーション活性の中心は1番目から44番目までのアミノ酸配列、および45番目から84番目までのアミノ酸配列のなかにそれぞれ少なくとも1カ所以上存在し、全体としては2カ所以上の活性部位が存在することが考えられる。さらに、今回、実施例7の結果から、当質量あたりでは、HEK293で生産したペプチド(1-44)は全長のHMGB1に比較して8倍近いマイグレーション活性(等モルで約1.6倍)を有することが示された。さらに、HEK293で生産したペプチド(45-84)も同等のマイグレーション活性を有する(図2)。以上からHMGB1の中には、等モル量の全長HMGB1を上回るマイグレーション活性を持つ部位が少なくとも1番目から44番目のアミノ酸配列、45番目から84番目のアミノ酸配列の2カ所に存在するが、全長HMGB1の活性は、これら2カ所の活性の和より極めて弱いことが明らかとなった。全長のHMGB1の結晶解析の結果から1番目から44番目までのペプチドと45番目から84番目までのペプチドは互いに隣接しているため、互いの活性を阻害している可能性が予想される。ペプチド化することによって阻害が解消され、それぞれの活性が増強されたと考えられる。
マウス由来骨髄間葉系幹細胞株MSC-1を直径10cmの培養皿に播種し10%FBS 含DMEM 1Xストレプトマイシン・ペニシリンで5%CO2、37℃のインキュベーターを用い培養した。80-90%コンフルエントに増殖した後、培地を捨て、細胞に10mlのPBSを加え、2回洗浄した。0.25% トリプシン5mlを加え、37℃、10分間インキュベートした。培養皿から剥がれた細胞を回収し、10% FBS 含有DMEMを加え、トリプシンの反応を止めた。細胞を遠心機で1200rpm の速度で3min遠心し、沈殿した細胞を回収した。回収した細胞を丸底96 well に、1×106細胞は、100μlの2% FBS含有PBSに希釈し、各ウェルに分注した。一次抗体として、APC-mouse Lineage antibody cocktail(BD Phamingen, Cat.558074)を、1well当り10μlずつ加え、PE-mouse CD140a(PDGFRα)(BD Bioscience, Cat.12-1401-81)、FITC-mouse CD44(BD Bioscience, Cat.553-133)をそれぞれ1μlずつ各ウェルに加え、遮光し、4℃、20分間反応させた。2% FBS含有PBSを200μlずつ各ウェルに加え 遠心機を用いて1500rpmの速度で10分間遠心し、上清をすてた。 さらに2回、同様に細胞を洗浄した。PBS100μlに細胞を懸濁し、BD FACSCantTMIIで解析を行った。
株化骨髄間葉系幹細胞(MSC-1)はPDGFRα陽性、Lineage陰性、CD44陽性であった(図11)。
マイグレーション活性に使用している本細胞は、PDGFRα陽性の骨髄間葉系幹細胞の性質を保持している。
C57/Bl6新生マウスに対しイソフルランおよび二酸化炭素吸入によって安楽死させた後、EtOH, PBSでよく洗浄した。真皮ごと皮膚を剥離し、PBSで血を洗い流した。剥離した皮膚をディスパーゼI(三光純薬, Cat: GD81060)の中に4℃、16時間静置した。攝子で表皮と真皮を剥離し、表皮をトリプシン(Nacalai tesque, Cat: 3554-64)の中に、10分、37℃で静置した。白く濁り始めたら、S-MEM(GIBCO, Cat: 11380)15%FBS(Ca−)P/Sで反応を止め、160×G、5分で遠心した。CnT-07 培地(CELLnTEC, Cat: CnT-07 BM)に懸濁し、10cmディッシュに播種した。5%CO2、37℃で培養し、3日ごとに培地を交換し、80〜90%コンフルエントで継代を行った。細胞をトリプシンでディッシュから回収し、10%FBS含有D-MEMでトリプシンを不活性化した。その後、前述のマイグレーションアッセイ法にしたがって、1番目から34番目までのアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1-34)のマイグレーション活性を調べた。
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/Jマウスの新生に4%PFAで還流固定を行った。新生皮膚を1.0×1.0 cm2に切り出し、4%PFA, 12時間 + 30%スクロース、12時間、4℃でさらに浸潤固定した。PBS(‐)で洗浄し、OTCコンパウンドで凍結包埋した。クリオスタットで8μmの凍結切片を切り出した。PBSで2回洗浄し、コンパウンドを洗い流し、10% ヤギ血清PBSで、室温で1時間ブロッキングした。1次抗体は10%ヤギ血清PBSで500倍希釈したウサギ抗-ケラチン5(Covance, Cat: PRB-160P) 、もしくはウサギ抗-ビメンチン(Abcam, Cat: ab7783-500) を用い、5時間、4℃でインキュベートした。その後、PBSで2回洗浄した。2次抗体は10%ヤギ血清PBSで500倍希釈した Alexa Fluor 546 ヤギ 抗-ウサギ IgG(H+L)(Invitrogen, Cat: A11035) を用い、45分間室温でインキュベートした。その後、PBSで2回洗浄した。2μg/mlのDAPI(4',6-diamino-2-phenylindole)で3分間、室温でインキュベートした。さらにPBSで2回洗浄し、蛍光体退光防止剤を含むマウント剤を載せて封入した。
マウスケラチノサイトに対して合成ペプチド(1-34)はマイグレーション活性を示さなかった(図12A)。また、マウスケラチノサイトのマーカーであるケラチン5陽性細胞においてGFPの蛍光は観察されなかった(図12B)。
ケラチノサイトはPDGFRαを発現してなかった。またケラチノサイトに対して合成ペプチド(1-34)はマイグレーション活性を有していなかった。
C57/Bl6新生マウスに対しイソフルランおよび二酸化炭素吸入によって安楽死させた後EtOH, PBSでよく洗浄した。真皮ごと皮膚を剥離し、PBSで血を洗い流した。剥離した皮膚を鋏でよく切り刻み破砕した。0.2%コラゲナーゼ(Roche, REF:10103586001) DMEM (Nacalai tesque, Cat: 08458-45)の中に切り刻まれた皮膚を入れて、37℃, 30分振盪した。DMEM30%FBS/P/Sで反応を止めて、160×G, 5分で遠心した。10cmディッシュに播種した。5%CO2、37℃で培養し、3日ごとに培地を交換し、80〜90%コンフルエントで継代を行った。細胞をトリプシンでディッシュから回収し10%FBS含D-MEMでトリプシンを不活性化後、前述のマイグレーションアッセイ法にしたがって、1番目から34番目までのアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1-34)のマイグレーション活性を調べた。
合成ペプチド(1-34)は皮膚線維芽細胞に対してマイグレーション活性を示した(図13A)。また、線維芽細胞のマーカーであるビメンチン陽性細胞においてGFPの蛍光が陽性である細胞が観察された(図13B)。
皮膚線維芽細胞はPDGFRαを発現していた。皮膚線維芽細胞に対して合成ペプチド(1-34)はマイグレーション活性を有していた。骨髄間葉系幹細胞も新生皮膚線維芽細胞もPDGFRα陽性であり、いずれにおいてもペプチド(1-34)に対してマイグレーション活性をもち、PDGFRα陰性細胞であるケラチノサイトにはマイグレーション活性を示さなかった。ペプチド(1-34)を含むアミノ酸配列がマイグレーション活性を示す細胞のマーカーとしてPDGFRαが有益であると予想された。
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J新生マウスをEtOH, PBSでよく洗浄した。皮膚を筋肉から剥がし、3mm幅の細片にした。500unit/mlのディスパーゼの入った5%FBS-DMEMに移し4℃で18時間インキュベートした。真皮と表皮を剥離し、真皮を鋏でよく切り刻み破砕した。0.2%コラゲナーゼ含DMEMの中に細かく刻んだ真皮を入れて、37℃、 30分温浴中で振盪した。30%FBS含DMEMを加え遠心機で160×G, 5分間遠心した。沈殿した細胞を10cmディッシュに播種した。5%CO2、37℃で培養し、3日ごとに培地を交換し、80〜90%コンフルエントで継代を行った。細胞をトリプシンでディッシュから回収し10%FBS含D-MEMを加えた後細胞を遠心し回収した。細胞のGFP蛍光をBD FACSCantTMIIで検出し解析を行った。
新生マウス皮膚の線維芽細胞の98%以上がPDGFRα陽性であった(図14)。
FACSでPDGFRα陽性細胞の数を定量化した。免疫組織化学の結果と同様に線維芽細胞のほとんどがPDGFRα陽性細胞であることが示された。
C57Bl6 マウス(8週齢、雌)の尾静脈から10μgの合成ペプチド(1番目のアミノ酸から44番目のアミノ酸)を200 μl のPBSに希釈し30ゲージ針付きシリンジを用いて投与した。陰性コントロールには同量のPBSを投与した。12時間後イソフルランによる全身麻酔下で左心室から末梢血液を採血した。3mlのPBS(Nacalai tesque, Cat.14249-95)加えた後、Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare,Cat.17-1440-02) 3mlを重層した。遠心機を用い400G、25℃で45分間遠心を行った。上層の血清を捨てて、中間層の白いバンドとして見える細胞のみを回収した。回収した細胞にPBS 45ml を加えて、遠心機を用いて800G、25℃で20分間遠心を行った。上清すててPBS 10ml加え遠心機で1500rpmの速度、25℃で 10分間遠心を行った。上清すてて、HLB(溶血用緩衝液)(免疫生物研究所社製)を1ml加えピペッティングし5分間静置する。10mlのPBS加えて1500rpm の速度、25℃で10分間遠心を行った。沈殿した単核細胞を回収した。回収した単核細胞を丸底96 well プレートに、1×106 個/ 100μl(2% FBS 含PBS)で調整した。PE-mouse CD140a(PDGFRα)(BD Bioscience, Cat.12-1401-81)もしくはFITC-mouse CD44(BD Bioscience, Cat.553-133)を、それぞれ単核細胞の入ったウェルに1μlずつ加え遮光し20分間4℃でインキュベートした。PBS 200μlずつ加え、1500rpm の速度、4℃で10分間遠心を行った。上精を捨て再度PBS 200μlずつ加え、1500rpm の速度、4℃で10分間遠心を行った。PBS 100μlに細胞を懸濁後、1%パラホルムアルデヒド300μlを加えた。なおイソタイプコントロール用抗体を使用して同様にコントロールを作製した。FACSCantTMIIを使用して上記で調整した細胞の解析を行った。
陰性コントロール群(PBS投与群)では、末梢血中のPDGFRα陽性かつCD44陽性細胞の割合は平均1.33%であったのに対し、ペプチド(1-44)投与群では平均4.33%に増えていた。(図15)
HMGB1の1番目のアミノ酸から44番目のアミノ酸までのペプチドを合成し、マウスの静脈内に投与したところ、12時間後にPDGFRα陽性かつCD44陽性の細胞が増加した。実施例8においてはin vitro におけるPDGFRα陽性かつCD44陽性である骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性を認めた。本実施例ではin vivoにおいても末梢血中にPDGFRα陽性かつCD44陽性の細胞を動員することが示された。PDGFRα陽性とCD44陽性はいずれも骨髄間葉系幹細胞のマーカーである。骨髄間葉系幹細胞は再生医療に有効であることが知られており、本ペプチドの静脈内投与が損傷組織の治療に有効であることが期待される。
8-10週齢雄Wister Ratを使用した。体温モニター付きホットマットで保温しながらラットにイソフルランで吸入麻酔を施行した。十分な麻酔効果を確認した後、頚部の毛を除去し皮膚を露出させ術部をアルコール消毒した。頚部正中線上の皮膚をメスで切開した。右外頸動脈を結紮し右総頸動脈に緊張を加えて一時的に血流を止めた後、4号ナイロンモノフィラメントの先端をシリコンによってコートした塞栓糸を右外頸動脈から右内頸動脈に向けて挿入した。総頸動脈の緊張をゆるめ血流に乗せて塞栓糸を内頸動脈から中大脳動脈分岐部まですすめ血流を遮断した。さらに、右総頸動脈にかけている糸を結紮し血流を50分間完全に遮断した。塞栓糸を抜去し総頸動脈の糸を緩めた後、皮膚を縫合し手術を終了した。
合成ペプチド(1-44)50μgを尾静脈から投与した。初回投与は脳梗塞作成後6時間とし、以後、24時間間隔で計5回(計5日間)投薬した。
最終薬剤投与から14日後に十分に深い麻酔をラットに行った後、二酸化炭素を充満した容器内で心臓の拍動および呼吸の停止したことを確認した。脳を取り出し速やかに10%。緩衝ホルマリン中に浸し固定した。パラフィン包埋後切片を薄切し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。切片はブレグマから前方1.92mm(1.92)、0.60mm(0.60)および後方1.56mm(-1.56)、3.24mm(-3.24)の4枚をそれぞれの脳に対し作製し面積を比較した。
合成ペプチド(1-44)を投与した群(N=10)のうち皮質まで梗塞巣が拡大したのは1匹のみで残りの9匹は基定核にとどまっていた(図16 A1(ブレグマからの距離前方1.92mm)、B1(ブレグマからの距離前方0.60mm)、C1(ブレグマからの距離後方1.56mm)、D1(ブレグマからの距離後方3.24mm))に対し、陰性コントロール群(N=11)のうち8匹において基定核から皮質にかけて梗塞巣が拡大した(図16 A2(ブレグマからの距離前方1.92mm)、B2(ブレグマからの距離前方0.60mm)、C2(ブレグマからの距離後方1.56mm)、D2(ブレグマからの距離後方3.24mm))。また作製した4箇所の切片に対し、それぞれ右脳の脳梗塞部分の面積を測定し右脳正常脳面積に対する%比を計測した。いずれの切片においても有意に合成ペプチド投与群の梗塞面積が陰性コントロール群に比較して縮小していた(図17)。
近年、脳梗塞患者においても、自己の骨髄間葉系幹細胞を静脈内投与することで、治療予後が改善するとの報告もあり、骨髄内の細胞による脳梗塞に対する治療効果が明らかになりつつある。また、齧歯類の実験によって骨髄間葉系幹細胞は骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等に分化することが知られていたが、さらに上皮細胞、神経細胞など様々な細胞に分化することが明らかになっている。また、骨髄細胞は種々の成長因子や細胞増殖因子を分泌するため、梗塞部に移動した骨髄細胞が分泌する物質による神経保護作用も期待できる。
ヒトHMGB1のN末端側のメチオニン(M)を削除し、代わりにMKHHHHHHENLYFQ(配列番号:11)を付加した。HHHHHH(配列番号:12)は発現したタンパク質もしくはペプチドを、ニッケルカラムを用いて精製するためのtag(6xHis tag)であり、ENLYFQG(配列番号:13)はTEV protease が認識する配列である(図18A)。またT7 promoter、lac operator の下流に目的のタンパクもしくはペプチド(2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 2-170, 93-215,85-169)をコードするcDNAを挿入し、さらに薬剤耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子、複製開始点をpBR322 ori、f1 ori を使用したベクターを構築した。本発現ベクターを用いて作製したタンパク質もしくはペプチドをTEV protease で切除すると、2番目のアミノ酸から始まるヒトHMGB1のタンパク質もしくはペプチドを作製することができる。作製したプラスミドを用いてBL-21(DE3)を形質転換した。カナマイシン含有LB培地中で、37℃で一晩振盪培養した菌液5 mlを100 mlのLB培地に移し、37℃、140 rpmで振盪培養した。濁度計で濁度を測定し、OD 0.5〜0.7になったら終濃度1 mMになるようにIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) を加えた。2-215, 2-84, 2-70, 2-81, 2-170, 93-215,85-169は37℃で5時間、2-44, 45-84, 2-62は15℃で一晩の振盪培養後、集菌した。発現したタンパク、ペプチドの確認はSDS-PAGEを行った後タンパク染色およびtagもしくは抗HMGB1抗体によるウエスタンブロットによっておこなった。
集菌した菌体に平衡バッファー (PBS (137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4), 10 mM imidazole; pH7.4) を3 ml加え、超音波破砕を行った。4℃、15,000 rpmで10分間の遠心分離を行い、上清を回収した。マイクロバイオスピンカラム (Bio-Rad社) にHis-Pur(商標) Ni-NTA Resin (Thermo Scientific社) を1 ml充填し、平衡バッファーで平衡化した。タンパク質溶液を入れ2000 rpmで2分間遠心後、洗浄バッファー (PBS, 25 mM imidazole; pH 7.4) でResinを洗浄した。溶出バッファー (PBS, 250 mM or 500 mM imidazole) で段階的に溶出し、各フラクションをSDS-PAGE (e-PAGEL(登録商標) 15% (ATTO)) に供して溶出タンパク質を確認した。ニッケルカラムによるアフィニティ精製後、2-215はQ sepharose(商標) Fast Flow (GE healthcare社)を、93-215はQ sepharose(商標) Fast Flow (GE healthcare社)およびSP sepharose(商標) Fast Flow (GE healthcare社)を、その他はSP sepharose(商標) Fast Flow (GE healthcare社) を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。
マイクロバイオスピンカラムに各sepharoseを1 mlずつ充填し、PBSでsepharoseの平衡化を行った。アフィニティ精製を行ったタンパク質溶液を充填後、PBSで洗浄した。溶出バッファー (20 mM HEPES, 1 M NaCl; pH 7.5) で溶出を行い、各フラクションをSDS-PAGEで確認した。
アフィニティ精製を行ったタンパク質溶液を、QおよびSPの両sepharoseでそれぞれ陰イオン交換、陽イオン交換を行った。さらに、SP sepharose(商標) Fast Flow充填時の通過画分をQ sepharose(商標) Fast Flowに充填して陰イオン交換を行った 。各フラクションをSDS-PAGEで確認した。
集菌した菌体に0.1 gあたり1 mlのバッファー (PBS, 10 mM imidazole; pH7.4) を加え、超音波破砕を行った。4℃、20,000 rpmで1時間の遠心分離を行い、上清を回収した。BioLogic DuoFlow (Bio-Rad社) を用いてカラムクロマトグラフィーで精製を行った。まず、HisTrap(商標) FF 5 ml (GE healthcare社)、Buffer Aに菌体破砕溶液 (PBS, 10 mM imidazole (pH7.4))、Buffer B にPBS, 500 mM imidazole (pH 7.4) を用いてアフィニティ精製を行った。カラムをBuffer Aで平衡化後、タンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った:
Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 20 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 20 ml)→Isocratic Flow (Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (20〜40 mlを2 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 10 ml)→Isocratic Flow (Buffer A: 50%, Buffer B: 50%, 2 ml)→Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (10〜32 mlを1 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
各断片の濃度測定はブラッドフォード法 (Bio-Rad Protein Assay) を用いたBSA換算で行った。
Migration Assay
骨髄間葉系幹細胞株MSC-1に対する上記の各ペプチドのマイグレーション活性の確認を行った。それぞれの断片を含む500mMNaCl含リン酸バッファーを2倍容のDMEMで終濃度2μMに希釈してチャンバーの下層に挿入し、8μmの穴を有するポリカーボネート膜を挟んで、上層には10%FBS含有DMEM に拡散したMSC-1を挿入した。37℃、5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートした後、ディフ・クイック染色(Diff-Quik stain(商標))を使用し、上層から下層側にマイグレーションした細胞を検出した。
2-215, 2-84, 2-44, 45-84, 2-62, 2-70, 2-81, 2-170, 93-215すべてにおいて骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性が認められた。(図18B)2-215のマイグレーション活性を1とした場合モル濃度あたり、2-84は2.37倍、2-44は1.82倍、45-84は2.04倍の活性が認められ、等質量に換算するとそれぞれ5.5倍、7.1倍、8.1倍であった。(図18C、D)
大腸菌で作製したヒトHMGB1(2-215)のN末端側を断片化することでマイグレーション活性の増強が認められた。さらにN末端側には少なくとも2-44および45-84の2箇所にマイグレーション活性が認められた。これは真核生物の培養細胞(HEK293細胞)で作製したHMGB1断片と同様の結果であった。断片化によりMSC-1のレセプターに対するエピトープが露出しレセプターに結合しやすくなっているのではないかと予想される。タンパク質によっては断片化によって活性を失うものがあるが、本タンパク質では断片化によってむしろ活性が増強している。タンパク質の発現においてHEK293などの真核細胞では糖鎖付加などの翻訳後修飾が行われることが知られており、レセプターのリガンドではこれらの有無が活性を左右することがある。そのため真核細胞と同様の翻訳後修飾が行われない大腸菌で作製したタンパク質が修飾だけではなく、大腸菌で生産した断片においても活性を保持していることから、これらの断片による活性は翻訳後修飾が必須ではないことを示している。以上のことから、HMGB1の断片化によってより高い活性を有する骨髄間葉系幹細胞の動員薬を開発することが可能になる。さらに翻訳後修飾が必須ではないことから、大腸菌や化学合成を用いた生産法が可能になり、より安価で安定した品質の製剤を作製することが可能である。また、本実施例に記載のペプチドとその他の実施例に記載のペプチドの比較(例えば1-44と2-44の比較、あるいは、1-84と2-84の比較)から、HMGB1タンパク質のファーストメチオニンの有無はマイグレーション活性に影響しないことが判明した。よって、あるペプチドがマイグレーション活性を有する場合、そのペプチドからファーストメチオニンを除去したペプチドもまたマイグレーション活性を有すると考えられる。また、ファーストメチオニンが除去されたペプチドがマイグレーション活性を有する場合、そのペプチドにファーストメチオニンを付加したペプチドもまたマイグレーション活性を有すると考えられる。
ヒトHMGB1のN末端側のメチオニン(M)を削除し、代わりにMKHHHHHHENLYFQ(配列番号:11)を付加した。HHHHHH(配列番号:12)は発現したタンパク質もしくはペプチドを、ニッケルカラムを用いて精製のためのtag(6xHis tag)であり、ENLYFQG(配列番号:13)はTEV protease が認識する配列である(図18A)。またT7 promoter 、lac operator の下流に目的のタンパクもしくはペプチド(89-215, 89-205, 89-195, 89-185)をコードするcDNAを挿入し、さらに薬剤耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子、複製開始点をpBR322 ori、f1 ori を使用したベクターを構築した。本発現ベクターを用いて作製したタンパク質もしくはペプチドをTEV protease で切除すると、2番目のアミノ酸から始まるヒトHMGB1のタンパク質もしくはペプチドを作製することができる。
集菌した菌体に0.1 gあたり2 mlのバッファー (PBS, 10 mM imidazole; pH7.4) を加え、超音波破砕を行った。4℃、20,000 rpmで1時間の遠心分離を行い、上清を回収した。BioLogic DuoFlow (Bio-Rad社) を用いてカラムクロマトグラフィーで精製を行った
集菌した菌体に0.1 gあたり1 mlのバッファー (PBS, 10 mM imidazole; pH7.4) を加え、超音波破砕を行った。4℃、20,000 rpmで1時間の遠心分離を行い、上清を回収した。BioLogic DuoFlow (Bio-Rad社) を用いてカラムクロマトグラフィーで精製を行った。まず、HisTrap(商標) FF 5 ml (GE healthcare社)、Buffer Aに菌体破砕溶液 (PBS, 10 mM imidazole (pH7.4))、Buffer B にPBS, 500 mM imidazole (pH 7.4) を用いてアフィニティ精製を行った。カラムをBuffer Aで平衡化後、タンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った:
Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 20 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 20 ml)→Isocratic Flow (Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (20〜40 mlを2 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 10 ml)→Isocratic Flow (Buffer A: 50%, Buffer B: 50%, 2 ml)→Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (10〜32 mlを1 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
可溶性タンパク質溶液の調製はヒトHMGB1断片(89-215)と同様に行った。その後、各カラムクロマトグラフィーにて以下のようにグラジエント溶出を行った。
まず、HisTrap(商標) FF 5 ml、Buffer A (PBS, 10 mM imidazole (pH7.4))、Buffer B (PBS, 500 mM imidazole (pH 7.4)) を用いてアフィニティ精製を行った。カラムをBuffer Aで平衡化後、タンパク質溶液を充填し以下のプログラムで洗浄及び精製を行った。プログラムは以下の通りで行った:
→Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 50 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 120 ml)→Fraction Collection (50〜170 mlを5 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 50 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 100%→0%, Buffer B: 0%→100%, 50 ml)→ Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 5 ml)→Fraction Collection (50〜105 mlを3 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
各断片の濃度測定はブラッドフォード法 (Bio-Rad Protein Assay) を用いたBSA換算で行った。
Migration Assay
骨髄間葉系幹細胞株MSC-1に対する上記の各ペプチドのマイグレーション活性の確認を行った。それぞれの断片を含む500mMNaCl含リン酸バッファーを2倍容のDMEMで終濃度2μMに希釈してチャンバーの下層に挿入し、8μmの穴を有するポリカーボネート膜を挟んで、上層には10%FBS含有DMEM に拡散したMSC-1を挿入した。37℃、5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートした後、ディフ・クイック染色(Diff-Quik stain(商標))を使用し、上層から下層側にマイグレーションした細胞を検出した。
ヒトHMGB1断片(89-215)をニッケルカラムでアフィニティ精製行った後、イオン交換クロマトグラフィー(Qカラム)を用いて塩濃度を徐々に上げることによってグラジエント溶出を行った。フラクション6、7では15.5kDaのペプチドがフラクション8、9では15.5、16、17kDaのペプチドが、フラクション10、11では16、17kDaのペプチドが分収された。(図19A)
ヒトHMGBN1断片(89-215、89-205、89-195、89-185)を、大腸菌を用いて作製した。89-215、89-205の骨髄間葉系幹細胞マイグレーション活性は弱かったが、大腸菌由来のプロテアーゼによると思われる切断が起きており(図19A、C)、短い切断片に強い活性が認められた(図19B、D)。一方、89-195、89-185は強い骨髄間葉系幹細胞マイグレーション活性が認められた(図19C、D)。HMGB1のC末端186〜215番目のアミノ酸にはグルタミンとアスパラギン酸の繰り返し配列が存在する。これらの配列はタンパク質の安定化に寄与していると言われている。本研究によってはじめてこの部分がHMGB1断片(89-215)のマイグレーション活性を抑制しており、この配列を除去することによってHMGB1断片(89-215)のマイグレーション活性を増強することができることを明らかにした。なおHMGB1のC末に存在するグルタミン酸とアスパラギン酸の繰り返し配列(186番目から215番目のアミノ酸配列)は、acidic-tail と呼ばれRAGEとの結合に必須であるとの知見がある。また、RAGEは樹状細胞等がHMGB1によってマイグレーションする際のレセプターであることから、マイグレーション活性を発揮するにはC末およびRAGE リガンド部分が必要であると予想されたが、実際は、驚くべきことに骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性にはC末がない方がよいことが分かった。このことは、大腸菌でC末を含有するHMGB1断片を作製した際に大腸菌由来のプロテアーゼによると思われる分解産物の方が分解されていないHMGB1断片以上のマイグレーション活性を示し、さらにC末を欠如したHMGB1断片を作製したところC末を有するHMGB1断片より強い活性を発揮したことから初めて明らかになった。通常はタンパク質の特定の活性に寄与する部位は1か所であるが、驚くべきことにHMGB1の骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性に寄与する部分は複数部位あり、さらに驚くべきことにそれぞれの部位の活性は等分子数あたりにすると全長のHMGB1の約2倍の活性を有していた。また、通常は生理活性を有するペプチドは、長さが短くなるほど不安定化し活性が低くなるが、驚くべきことに短い断片の方が長い断片以上の強い活性を有するものが存在した。
ヒトHMGB1のN末端側のメチオニン(M)を削除し、代わりにMKHHHHHHENLYFQ(配列番号:11)を付加した。HHHHHH(配列番号:12)は発現したタンパク質もしくはペプチドを、ニッケルカラムを用いて精製のためのtag(6xHis tag)であり、ENLYFQG(配列番号:13)はTEV protease が認識する配列である(図18A)。またT7 promoter、lac operatorの下流に目的のタンパクもしくはペプチド(85-169, 2-215)をコードするcDNAを挿入し、さらに薬剤耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子、複製開始点をpBR322 ori、f1 oriを使用したベクターを構築した。本発現ベクターを用いて作製したタンパク質もしくはペプチドをTEV proteaseで切除すると、2番目のアミノ酸から始まるヒトHMGB1のタンパク質もしくはペプチドを作製することができる。
Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 20 ml)→Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 20 ml)→ Isocratic Flow (Buffer B: 100%, 20 ml)→Fraction Collection (20〜40 mlを2 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEで確認を行った。
組換えタンパク質の濃度測定はブラッドフォード法 (Bio-Rad Protein Assay) を用いたBSA換算で行った。
骨髄間葉系幹細胞株MSC-1に対する上記の各ペプチドのマイグレーション活性の確認を行った。それぞれの断片を含む500mMNaCl含リン酸バッファーを2倍容のDMEMで終濃度2μMに希釈してチャンバーの下層に挿入し、8μmの穴を有するポリカーボネート膜を挟んで、上層には10%FBS含有DMEM に拡散したMSC-1を挿入した。37℃、5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートした後、ディフ・クイック染色(Diff-Quik stain(商標))を使用し、上層から下層側にマイグレーションした細胞を検出した。
ヒトHMGB1断片(85-169)はヒトHMGB1断片(2-215)よりも強い骨髄間葉系幹細胞マイグレーション活性が認められた。(図20A)マイグレーション活性を1とした場合モル濃度あたり、1.59倍、等質量に換算するとそれぞれ3.6倍であった。(図20B、C)
ヒトHMGB1断片(85-169)にも(89-195)や(89-185)と同様に(2-215)より強い骨髄間葉系幹細胞マイグレーション活性を認めた。以上のことから85〜185番目のアミノ酸配列中に骨髄間葉系幹細胞動員活性を有する配列が少なくとも一箇所存在すると予想される。実施例1ではHEK293で生産したHMGB1断片85-169にマイグレーション活性を認めなかった。本実施例では大腸菌で生産したHMGB1断片85-169でマイグレーション活性を認めている。この違いは、生産方法の違いによってマイグレーション活性が極めて減弱したかもしくは消失したものと予想される。HEK293のような真核生物と大腸菌のような原核生物では、翻訳後修飾やフォールディングなどに違いがあるため同じタンパクやペプチドを生産させても性質が異なることがしばしばある。
HMGB1断片の精製
KOD-Plus-ver.2 (Toyobo社)を用いてinverse PCRを行った。前述のヒトHMGB1の2番目から215番目までのアミノ酸を含むHMGB1断片用発現ベクターを鋳型のプラスミドとした。2番目から205番目のアミノ酸、2番目から195番目のアミノ酸、2番目から185番目のアミノ酸それぞれをコードするcDNAとN末端側に存在するヒスチジンタグ、TEVプロテアーゼ認識配列、プラスミドのバックボーンも含めてPCR法で増幅した。なおこのPCR産物から作製される遺伝子産物はN末端からヒスチジンタグ、TEVプロテアーゼ認識配列、ヒトHMGB1断片がタンデムに配列したタンパクとなる。PCR産物に制限酵素DpnI(Toyobo社)を添加することで鋳型プラスミドを消化した。次にT4 Polynucleotide kinase (NEB社)を用いてPCR産物にリン酸基を付加し、ligase (2x Quick Ligase; NEB社 or Ligation Convenience kit; Nippongene社)を用いてself-ligationを行った。これを大腸菌JM109株に形質転換し、カナマイシンによる選抜でコロニーを得た。GenElute Plasmid Miniprep kit (SIGMA-ALDRICH社)を用いてプラスミド抽出を行い、シークエンス解析により塩基配列を確認後、大腸菌BL21 (DE3)株に形質転換し、コロニーを得た。
それぞれのコロニーを終濃度50mg/Lカナマイシン含有LB培地中で、37℃で一晩振盪培養した菌液5 mlを100 mlのLB培地に移し、37℃、140 rpmで振盪培養した。濁度計で濁度を測定し、OD 0.5-0.7になったら終濃度1 mMになるようにIsopropyl -β-D - thiogalactopyranoside(IPTG)を加えた。さらに15℃で一晩の振盪培養後、集菌した。
集菌した菌体に平衡バッファー (PBS (137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4), 10 mM imidazole; pH7.4) を12 ml (25-50 mg/ml), Leupeptin hydrochlorideを終濃度 5 μg/mlになるように加え、超音波破砕を行った。4℃、15,000 rpmで60分間の遠心分離を行い、上清を回収した。上清の一部をとり抗ヒトHMGB1抗体を使用したウエスタンブロット法を行い目的タンパクの発現の確認を行った。残りの上清を0.45 μmのフィルターを通し、除菌した。目的タンパクの精製はBioLogic DuoFlow (Bio-Rad社)を用いてカラムクロマトグラフィーで行った。
Isocratic Flow (Buffer A: 97%, Buffer B: 3%, 50 ml)
Linear Gradient (Buffer A: 97%→0%, Buffer B: 3%→100%, 120 ml)
Fraction Collection (50〜170 mlを5 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGE (e-PAGEL(登録商標)5-20% (ATTO))で確認を行った。
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 50 ml, 4 ml/min)
Linear Gradient (Buffer A: 100%→0%, Buffer B: 0%→100%, 50 ml, 4ml/min)
Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 5 ml, 4ml/min)
Fraction Collection (50〜105 mlを3 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEし、ゲルのタンパク染色を行うことで精製タンパクの確認を行った。
組換えタンパク質の濃度測定は、ブラッドフォード法(Bio-Rad Protein Assay)を用いたBSA換算で行った。
骨髄間葉系幹細胞株MSC-1に対する上記の各ペプチドのマイグレーション活性の確認を行った。それぞれの断片を含む500mMNaCl含リン酸バッファーを2倍容のDMEMで終濃度2μMに希釈してチャンバーの下層に挿入し、8μmの穴を有するポリカーボネート膜を挟んで、上層には10%FBS含有DMEM に拡散したMSC-1を挿入した。37℃、5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートした後、ディフ・クイック染色(Diff-Quik stain(商標))を使用し、上層から下層側にマイグレーションした細胞を検出した。
2-215の断片、2-205の断片に比較し、2-195の断片および2-185の断片で強いマイグレーション活性が認められた(図21A)。
186番目から215番目までの断片はアスパラギン酸とグルタミン酸合計30アミノ酸の繰り返し配列であり、Acidic-tailと呼ばれている。今回のデータからHMGB1の骨髄間葉系幹細胞のマイグレーション活性はAcidic-tailによって強く抑制されており、特にC末端側20アミノ酸の配列が抑制に関与していることが示唆された。これまでのデータからHMGB1の骨髄間葉幹細胞遊走活性作用の活性ドメインは複数個所同定されており、これらのすべての活性を抑制しているかは、さらに詳細な実験が必要である。
方法
ヒトHMGB1断片(2-215、2-84、2-44、45-84、85-169、89-185、89-195、89-205)については前述の実施例14、15、16と同様に大腸菌に生産させ適切なカラムを用い精製を行った。ただし、89-215については、実施例15における89-205と同様の方法で精製した。
各断片の濃度測定はブラッドフォード法 (Bio-Rad Protein Assay) を用いたBSA換算で行った。
各断片について前述のマウス由来骨髄間葉系幹細胞(MSC-1)に対するマイグレーションアッセイと同様にヒト由来骨髄間葉系幹細胞に対して行った。断片は最終濃度2μM相当を使用した。またヒト由来骨髄間葉系幹細胞は4継代目のhMSC(human Mesenchymal Stem Cell,Takara社製)を使用した。増殖用の培地は、間葉系幹細胞増殖培地(MF medium,TOYOBO社製)を使用し、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。2-4日ごとに新鮮な培地に取り替え、80%コンフルエントになった時点で継代を行った。
ヒトHMGB1断片(2-215、2-84、2-44、45-84)については実施例14と同様にヒトHMGB1断片(2-215)よりもHMGB1断片(2-84、2-44、45-84)により強い活性を認めた。ヒトHMGB1断片(89-185、89-195、89-205、89-215)については、実施例15と同様にC末のacidic-tail を短くした活性ヒトHMGB1断片(89-185、89-195)により強い活性が認められた。ヒトHMGB1断片(85-169)については実施例16と同様にヒトHMGB1断片(2-215)より強い活性が認められた。(図21B)
ヒト由来骨髄間葉系幹細胞においてもマウス由来骨髄間葉系幹細胞と同様のマイグレーション活性がそれぞれの断片において認められた。少なくともヒトHMGB1断片(2-44、45-84、85-169)にヒト骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性を有する部位が独立に存在することが明らかになった。このことは、通常タンパクの特定の活性を有する部位は1か所であるため、複数の活性部位の存在は驚くべき結果であった。また、それぞれの断片の活性が全長に近い配列(2-215)の活性よりも強いことも驚くべきことであった。一方、RAGE binding 部位は150番目から183番目までのアミノ酸配列であるが、89番目から169番目のアミノ酸配列にも活性があることからヒト骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性はRAGEを必要としない可能性が示唆された。ヒトHMGB1断片(89-185、89-195、89-205、89-215)については、マウス由来の細胞の場合と同様に、C末のacidic-tailを欠如した断片により強い活性が生じた。このことはヒト骨髄間葉系幹細胞のマイグレーションにおいても、C末端はマイグレーション活性において抑制性に働いており、C末のacidic-tailを短くしたり、欠如することによって、より強い活性のHMGB1断片を作製することが可能になると考えられる。
方法
ヒトHMG1断片2-84のC末端に同じくヒトHMGB1の断片186-215,186-205もしくは186-195が付加されるように融合したcDNAを作成した。なお前述のように、大腸菌で発現される断片が、ヒトHMGB1のN末端側のメチオニン(M)が削除され、代わりにMKHHHHHHENLYFQ(配列番号:11)を付加されるように、発現ベクターを設計した。なおHHHHHH(配列番号:12)は発現したタンパク質もしくはペプチドを、ニッケルカラムを用いて精製するためのタグ(6xHis tag)であり、ENLYFQG(配列番号:13)はTEV protease が認識する配列である(図18)。またT7 promoter、lac operatorの下流に上述のcDNAを挿入し、さらに薬剤耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子、複製開始点をpBR322 ori、f1 ori を使用したベクターを構築した。本発現ベクターを用いて作製したタンパク質もしくはペプチドをTEV proteaseで切除すると、2番目のアミノ酸から始まるヒトHMGB1のタンパク質もしくはペプチドを作製することができる。
集菌した菌体に平衡バッファー (PBS (137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4), 10 mM imidazole; pH7.4) を終濃度 5 μg/mlになるように加え、超音波破砕を行った。4℃、15,000 rpmで60分間の遠心分離を行い、上清を回収した。残りの上清を0.45 μmのフィルターを通し、除菌した。目的タンパクの精製はBioLogic DuoFlow (Bio-Rad社)を用いてカラムクロマトグラフィーで行った。
Isocratic Flow (Buffer A: 100%, Buffer B: 0%, 50 ml, 4 ml/min)
Linear Gradient (Buffer A: 100%→0%, Buffer B: 0%→100%, 50 ml, 4ml/min)
Isocratic Flow (Buffer A: 0%, Buffer B: 100%, 5 ml, 4ml/min)
Fraction Collection (50〜105 mlを3 mlずつ)
各フラクションはSDS-PAGEし、ゲルのタンパク染色を行うことで精製タンパクの確認を行った。
なお、各断片はヒトHMGB1を認識する抗体を用いてウエスタンブロットを行い目的の断片であることの確認をおこなった。
前述の方法で作成した断片を使用し骨髄間葉系幹細胞株MSC-1を使用したマイグレーションアッセイを行った。マイグレーションアッセイは既述と同様に行った。
断片2-84はマイグレーション活性を示したが、Acidic-tailの配列をそれぞれ、10アミノ酸、20アミノ酸、30アミノ酸付加したヒトHMGB1融合断片はいずれもマイグレーション活性を示さなかった(図21C)。
前述の実施例からヒトHMGB1断片89-215は間葉系幹細胞に対する極めて弱いマイグレーション活性を有するが、C末端側に存在するAcidic tailを削っていくとマイグレーション活性が増強することを示している。このことと本実施例からAcidic tailには2-84の断片および89-185の断片が有するマイグレーション活性を減弱する機能を有していることが明らかになった。また、2-84の断片には複数のマイグレーション活性のコア領域が存在するが、2-84の断片に186-215の断片を融合するとマイグレーション活性がほぼ消失することから2-84に存在するコア領域のすべてについて抑制されていると予想された。HMGB1という一つの分子の中に少なくとも3か所以上の骨髄間葉系幹細胞に対するマイグレーション活性のコア配列が存在するという発見は驚くべきことである。さらにC末端に存在するわずか30アミノ酸のAcidic tail がHMGB1のN末端側の2-84の断片に少なくとも2か所存在するコア配列のマイグレーション活性をほぼ完全に抑制し、85-185の断片に存在するコア配列のマイグレーション活性についても抑制しており、ひいてHMGB 1全体のマイグレーション活性を減弱させていることの発見も極めて驚くべきことである。HMGB1の1-85断片はLPS(リポポリサッカロイド)などによって惹起される炎症に対する抗炎症効果があるとされているが、Wei Gongらは、1-85の断片に186-215断片を融合した断片には1-85の断片よりもLPSに投与による死亡率を減少させることを報告している。(Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2010, Article ID 915234, doi:10.1155/2010/915234)Wei Gongらの論文では1-85の抗炎症効果の増強のためにはAcidic tail は必要であることを示しているが、本発明によって骨髄間葉系幹細胞の遊走にはむしろAcidic tail は阻害することがあきらかになった。本発明から、骨髄間葉系幹細胞投与によって治療効果がみられるような疾患においては、Acidic tail は短くするか完全に削除する方がより治療効果を改善できることが期待される。
実験動物はSDラット(雄、8週齢)を使用した。イソフルランによる吸入麻酔によって十分な麻酔を施行した後、背部に横3cm縦7cmの短冊状の皮膚切開を作製した。ただし、頭側の一辺は切除せず、皮膚は皮下の組織から十分に遊離した。切開した3辺を周囲の皮膚と4号絹糸を用いて縫合し、テガダーム(3M社製)を使用して保護し細菌感染を予防した。
手術1週後に陰性コントロール群では5匹中4匹に皮膚壊死が発生した。全長HMGB1投与群では5匹中3匹で皮膚壊死が発生した。HMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)群では5匹中1匹で皮膚壊死が発生した。手術7週後には陰性コントロール群では5匹中4匹において皮膚の強い拘縮が起きているのに対し、全長HMGB1投与群では5匹中3匹で、HMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)群では5匹中2匹で拘縮が認められた(図24)。
HEK293で産生した全長を含むHMGB1投与群およびHMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)投与群で1週間後の壊死組織の縮小効果を認め、HMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)群ではより縮小効果が認められた。1週間後、2週間後、3週間後では創傷面積がいずれもネガティブコントロール群の半分の面積に縮小していた。3週間後以降はHMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)投与群が他の2群に比較してさらに創傷面積が縮小していた。7週間の治癒過程においても、HMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)群の方がより創傷面積が小さい傾向にあった。7週間後の創傷部分の拘縮においてもHMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)群がもっとも拘縮が軽度であった。骨髄間葉系幹細胞は低酸素状態における皮膚細胞の増殖を促進することが知られており、HMGB1によって動員された骨髄間葉系幹細胞が 皮弁作製によって生じた低栄養、低酸素による皮膚壊死の拡大を抑制し、創傷治癒を促進したと予想された。このような効果は皮膚の疎血、外傷、手術による損傷の拡大抑制とともに治癒後美容面においてもすぐれた効果があることが示唆される。
実験動物は1群15匹のSDラット(雄、8週齢)を使用した。イソフルランによる吸入麻酔によって
十分な麻酔を施行した後、背部に横3cm縦7cmの短冊状の皮膚切開を作製した。ただし、頭側の一辺は切除せず、皮膚は皮下の組織から十分に遊離した。切開した3辺を周囲の皮膚と4号絹糸を用いて縫合し、テガダーム(3M社製)を使用して保護し細菌感染を予防した。
皮弁作成2週間後の皮弁全体の面積に対する非治癒部分の面積の比率(%)を算出した。HMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)群では非治癒部分は平均14.1%であったのに対し、HMGB1ペプチド(17〜25アミノ酸、50μg/回/日)群では平均9.1%であった。さらに皮弁作成6週間後の皮弁全体の面積に対する非治癒部分の面積の比率(%)を算出したところ、HMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)群では非治癒部分は平均4.1%であったのに対し、HMGB1ペプチド(17〜25アミノ酸、50μg/回/日)群では平均3.5%であった(図26)。
実施例19における皮膚損傷モデルの試験において、HEK293で産生した全長を含むHMGB1投与群に比較し化学合成したHMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)投与群で損傷1週間後から7週間までの治癒過程において、HMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸)群の方がより創傷面積が小さい傾向にあった。また化学合成した今回の試験によってHMGB1ペプチド(17〜25アミノ酸)群では、HMGB1ペプチド(1〜44アミノ酸、50μg/回/日)群と同等以上の皮膚損傷の改善効果が認められた。In vitro での骨髄間葉系幹細胞動員活性部位(コア配列)は複数か所あるが、現時点で判明している最も短い配列は、17番目から25番目のアミノ酸の9つのアミノ酸からなる配列である。他間葉系幹細胞動員活性部位のコア配列の長さは30アミノ酸の長さもしくは85アミノ酸の長さが必要であった。今回in vitro ばかりではなくin vivo においてもわずか9つのアミノ酸からなるHMGB1ペプチド(17〜25アミノ酸)群にも皮膚損傷の改善効果が認められ、9アミノ酸をコアドメインとして含むペプチドは、HEK293などの真核生物由来の培養細胞から作製するタンパク製剤に比較しはるかに安価で安定した生産が可能になることが期待される。
Claims (10)
- 配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における1番目から84番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、以下のいずれかのアミノ酸配列を含む骨髄間葉系幹細胞遊走刺激活性を有するペプチド:
(1)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列;
(2)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における45番目から74番目のアミノ酸配列;および
(3)配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における55番目から84番目のアミノ酸配列。 - 配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における1番目から84番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列を含む骨髄間葉系幹細胞遊走刺激活性を有するペプチド。
- 配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における1番目から44番目のアミノ酸配列の全部または一部からなるペプチドであって、配列番号:1、3、5のいずれかに記載のアミノ酸配列における17番目から25番目のアミノ酸配列を含む骨髄間葉系幹細胞遊走刺激活性を有するペプチド。
- ペプチドが、合成されたペプチドである、請求項1〜3のいずれかに記載のペプチド。
- ペプチドが、細胞を用いて製造されたペプチドである、請求項1〜3のいずれかに記載のペプチド。
- ペプチドが、タグが付加されているペプチドである、請求項1〜3のいずれかに記載のペプチド。
- ペプチドが、タグ由来のペプチド断片が付加されているペプチドである、請求項1〜3のいずれかに記載のペプチド。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のペプチドをコードするDNA。
- 請求項8に記載のDNAを有するベクター。
- 請求項8に記載のDNAまたは請求項9に記載のベクターを有する形質転換細胞。
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