ES2629086T3 - Sustancia farmacéutica para promover la regeneración funcional de tejido dañado - Google Patents

Sustancia farmacéutica para promover la regeneración funcional de tejido dañado Download PDF

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Katsuto Tamai
Takehiko Yamazaki
Yasufumi Kaneda
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Abstract

Un promotor de la regeneración tisular que comprende uno cualquiera de los siguientes componentes (a) a (i) para uso en medicina regenerativa para tejido epitelial o neurológico: (a) una proteína HMGB1; (b) una célula que segrega una proteína HMGB1; (c) un vector insertado con un ADN que codifica una proteína HMGB1; (d) una proteína HMGB2; (e) una célula que segrega una proteína HMGB2; (f) un vector insertado con un ADN que codifica una proteína HMGB2; (g) una proteína HMGB3; (h) una célula que segrega una proteína HMGB3; y (i) un vector insertado con un ADN que codifica una proteína HMGB3;

Description

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Mejor modo para llevar a cabo la invención
Se describen inductores de células derivadas de médula ósea, que comprenden al menos uno de los siguientes ingredientes (a) a (i):
(a)
una proteína HMGB1;
(b)
una célula que segrega una proteína HMGB1;
(c)
un vector insertado con un ADN que codifica una proteína HMGB1;
(d)
una proteína HMGB2;
(e)
una célula que segrega una proteína HMGB2;
(f)
un vector insertado con un ADN que codifica una proteína HMGB2;
(g)
una proteína HMGB3;
(h)
una célula que segrega una proteína HMGB3; y
(i)
un vector insertado con un ADN que codifica una proteína HMGB3.
Con el uso de tal inductor, las células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea) son dirigidas a áreas locales (área de administración/adición con el ingrediente anterior,
o su vecindad), permitiendo la promoción de la regeneración del tejido funcional. Por lo tanto, un inductor se puede usar como un reactivo necesario para la investigación básica y clínica para el desarrollo de medicina regenerativa y medicina inductora de la regeneración. Por ejemplo, se hace posible movilizar células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea) a un tejido requerido in vivo en un animal experimental para examinar el grado de reparación tisular y la reconstrucción de la función tisular. Además, se puede llevar a cabo la investigación in vitro sobre la inducción de la regeneración tisular movilizando células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea).
Además, la regeneración del tejido dañado se puede promover usando un inductor. Se prevé el uso de un inductor anterior como un denominado fármaco preventivo que previene deterioros en funciones tisulares/orgánicas causados por la reducción de células madre tisulares, o como un fármaco antienvejecimiento que retrasa el progreso de alteraciones relacionadas con la edad, además del uso como un inductor/promotor de la regeneración del tejido funcional.
La presente invención también proporciona promotores de la regeneración tisular, o kits que comprenden al menos uno de los siguientes ingredientes (a) a (i) para uso en medicina regenerativa para tejido epitelial o neurológico:
(a)
una proteína HMGB1;
(b)
una célula que segrega una proteína HMGB1;
(c)
un vector insertado con un ADN que codifica una proteína HMGB1;
(d)
una proteína HMGB2;
(e)
una célula que segrega una proteína HMGB2;
(f)
un vector insertado con un ADN que codifica una proteína HMGB2;
(g)
una proteína HMGB3;
(h)
una célula que segrega una proteína HMGB3; y
(i)
un vector insertado con un ADN que codifica una proteína HMGB3.
Los promotores de la regeneración tisular o kits para uso según la presente invención se caracterizan por que la administración a un área de tejido dañado o la vecindad dirige células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea), que circulan en la sangre, desde la sangre periférica hacia el tejido dañado (inducción local).
Se describen métodos para producir un extracto de células que tiene una actividad inductora de células derivadas de médula ósea, que comprenden la etapa de sumergir las células en un disolvente. Además, se describen extractos de células producidos mediante el método de producción anterior y que tienen una actividad inductora de células derivadas de médula ósea.
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Además, se describen fracciones que se unen a un intercambiador aniónico producidas mediante el método de producción anterior y que tienen una actividad inductora de células derivadas de médula ósea.
Los ejemplos del intercambiador aniónico incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores que usan DEAE (dimetilaminoetilo) o Q (amonio cuaternario). También se pueden usar intercambiadores aniónicos comercialmente disponibles (tales como Source15Q Source30Q, MonoQ, MiniQ, PC3.2/3, Mini Q4.6/50 PE, Columnas HiTrap IEX, HiTrap SP HP, Q Sepharose High Performance, Hiload 16/10 Q Sepharose HP, HiPrep 16/10 SP XL, Q Sepharose XL, HiPrer 16/10 Q FF, HiPrep 16/10DEAE FF, Q Sepharose Fast Flow, y DEAE Sepharose Fast Flow (todos ellos de GE Healthcare)).
Los ejemplos de las condiciones para poner en contacto una fracción que se une a heparina con un intercambiador aniónico son un pH de alrededor de 7 a 9 (preferiblemente pH 8), y una concentración de sal de 0 a 100 mM, preferiblemente alrededor de 50 mM, pero no se limitan a ellas. El tiempo para poner en contacto un extracto con un intercambiador aniónico no está particularmente limitado, pero el contacto se retiene preferiblemente durante 5 minutos o más en aras de una absorción suficiente de la fracción que se une al intercambiador aniónico sobre el intercambiador aniónico. Los ejemplos de la temperatura incluyen, pero no se limitan a, 4 a 16ºC, y preferiblemente 4ºC. Además, los ejemplos de condiciones para eluir la fracción que se une a un intercambiador aniónico absorbida sobre el intercambiador aniónico incluyen, pero no se limitan a, un pH de alrededor de 7 a 9 (preferiblemente alrededor de pH 8) y una concentración de sal de 100 a 2000 mM (preferiblemente alrededor de 1000 mM).
Se describen inductores de células derivadas de médula ósea, que comprenden el extracto mencionado anteriormente, la fracción mencionada anteriormente, o un extracto o fracción producida por el método mencionado anteriormente.
Con el uso de tal inductor, las células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea) son dirigidas a áreas locales (área a la que se administra/añade el ingrediente anterior, o un área en su vecindad), que permite la promoción de la regeneración del tejido funcional. Por lo tanto, el inductor se puede usar como un reactivo necesario para la investigación básica y clínica para el desarrollo de medicamentos regenerativos y medicamentos inductores de la regeneración. Por ejemplo, se hace posible movilizar células derivadas de médula ósea (tal como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea) a un tejido requerido in vivo en un animal experimental para examinar el grado de reparación tisular y reconstrucción de la función tisular. Además, se puede llevar a cabo la investigación in vitro sobre la inducción de la regeneración tisular movilizando células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea).
Además, se puede promover la regeneración del tejido dañado usando el inductor anterior. Además del uso como inductor/promotor de la regeneración del tejido funcional, también se espera que el inductor anterior se use como un denominado fármaco preventivo que previene deterioros de la función tisular/orgánica causados por la reducción de células madre tisulares, o como un fármaco antienvejecimiento que retrasa el progreso de alteraciones relacionadas con la edad.
Las células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea) que se movilizan hacia el tejido dañado se diferencian en diversos tipos de células para contribuir a la regeneración funcional del tejido dañado, y al mantenimiento/mejora de las funciones. En la presente invención, los ejemplos de tejido dañado incluyen, pero no se limitan a, tejidos dañados por diversas patologías, trauma, quemaduras, inflamación, autoinmunidad, anomalías génicas, y similares, que provocan estados isquémicos, hipoperfusivos/hipóxicos. El tejido dañado también incluye tejidos necrosados.
Los tejidos en la presente invención son tejidos epiteliales y neurológicos. Además, con el uso de los promotores de la regeneración tisular anteriores, son posibles los tratamientos para inducir regeneración del tejido funcional no solamente en enfermedades cutáneas tales como úlceras cutáneas intratables, heridas de la piel, bullosis, y alopecia, pero también en daños tisulares tales como infarto cerebral, infarto de miocardio, fractura de hueso, infarto pulmonar, úlceras gástricas, y enteritis. Los tipos de animales a los que se les administrará el promotor de la regeneración tisular anterior incluyen animales humanos y no humanos, que se pueden ejemplificar mediante, pero no se limitan a, seres humanos, ratones, ratas, monos, cerdos, perros, conejos, hámsters, y cobayas.
Las células derivadas de médula ósea de la presente descripción son células distintas de las células madre hematopoyéticas, o células derivadas de ellas tales como leucocitos, eritrocitos, y plaquetas, e incluyen células madre representadas por células que se han denominado hasta ahora células madre mesenquimatosas de médula ósea y poblaciones de células progenitoras de tejidos que existen en la médula ósea. Las células derivadas de médula ósea de la presente descripción se pueden aislar de una recogida de sangre de médula ósea o recogida de sangre periférica. Las células madre hematopoyéticas son no adherentes, mientras que las células derivadas de médula ósea de la presente invención se obtienen como células adherentes por medio de un cultivo celular de una fracción monocítica de sangre obtenida a partir de la recogida de sangre de médula ósea o de la recogida de sangre periférica. Además, las células derivadas de médula ósea de la presente descripción incluyen células madre mesenquimatosas, y tienen el potencial para diferenciarse en, preferiblemente, osteoblastos (la inducción de la diferenciación se puede identificar observando la calcificación), condrocitos (que se pueden identificar mediante
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tinción positiva con azul alcián, tinción positiva con safranina O, o similar), adipocitos (que se pueden identificar mediante tinción positiva con Sudan III), y otras células mesenquimatosas tales como fibroblastos, células del músculo liso, células estrómicas, y células de tendón; y además células nerviosas, células epiteliales (por ejemplo, queratinocitos epidérmicos y células epiteliales intestinales que expresan la familia de citoqueratinas), y células endoteliales vasculares. Sin embargo, las células a diferenciar no están limitadas a las células anteriores, y también se incluye el potencial para diferenciarse en células de órganos parenquimatosos tales como hígado, riñón, y páncreas.
En la presente descripción, las células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea se refieren a células que existen en la médula ósea, que se recolectan directamente de la médula ósea o que se recolectan indirectamente de otros tejidos (tejidos mesenquimatosos tales como sangre, piel, y grasa), y se pueden cultivar y se pueden hacer proliferar como células adherentes en una cápsula de cultivo (hecha de plástico o de vidrio). Estas células se caracterizan por tener un potencial para diferenciarse en tejidos mesenquimatosos tales como hueso, cartílago, y grasa, y se pueden obtener a partir de la recogida de sangre de médula ósea, sangre periférica, o tejidos mesenquimatosos. Las células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea también se caracterizan por tener el potencial para diferenciarse en tejidos epiteliales tales como queratinocitos que constituyen la piel, administrando estas células que se han adherido antes sobre una cápsula de cultivo a un área de lesión del cuerpo vivo.
Las células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea de la presente descripción son células madre multipotentes, y tienen una potencia para diferenciarse preferiblemente en: osteoblastos (la inducción de la diferenciación se puede identificar observando la calcificación), condrocitos (que se pueden identificar mediante tinción positiva con azul alcián, tinción positiva con safranina O, o similar), adipocitos (que se pueden identificar mediante tinción positiva con Sudan III), y otras células mesenquimatosas tales como fibroblastos, células del músculo liso, células del músculo esqueléticos, células estrómicas, y células de tendón; células nerviosas, células pigmentarias, células epidérmicas, células del folículo piloso (que expresan familia de citoqueratinas, familia de queratina del pelo, o similar), células epiteliales (por ejemplo, queratinocitos epidérmicos y células epiteliales intestinales que expresan la familia de citoqueratinas, o similares), y células endoteliales; y además preferiblemente en células de órganos parenquimatosos tales como hígado, riñón, y páncreas. Sin embargo, las células diferenciadas no se limitan a las células anteriores.
Además, las células madre mesenquimatosas de médula ósea humanas se pueden ejemplificar mediante, pero no se limitan a, células que se pueden obtener directamente de la recogida de sangre de médula ósea, sangre periférica, o grasa, o que se pueden obtener como células adherentes cultivando una fracción de monocitos aislada. Los marcadores para las células madre mesenquimatosas de médula ósea humanas pueden ser, por ejemplo, todos
o algunos de los marcadores de Lin-negativo, CD45-negativo, y CD44-positivo, pero no se limitan a ellos.
Además, las células madre mesenquimatosas de médula ósea de ratón se pueden ejemplificar mediante, pero no se limitan a, células que se pueden obtener mediante métodos descritos en los Ejemplos. Los marcadores para las células madre mesenquimatosas de médula ósea de ratón pueden ser, por ejemplo, todos o algunos de los marcadores de Lin-negativo, CD45-negativo, y CD44-positivo, Sca-1 positivo y c-kit negativo, pero no se limitan a ellos.
Las células progenitoras de tejidos se definen como células no diferenciadas que tienen una potencia unidireccional para diferenciarse en tejidos/células específicos distintos del sistema sanguíneo, e incluyen células no diferenciadas que tienen la potencia para diferenciarse en tejido mesenquimatoso, tejido epitelial, tejido nervioso, órganos parenquimatosos, y endotelio vascular, como se menciona anteriormente.
Para los promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención, no hay ninguna limitación particular en los componentes distinta del al menos uno de los ingredientes (a) a (i) mencionados anteriormente, en tanto que el componente no inhiba la inducción de células derivadas de médula ósea (tales células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea) ni inhiba la promoción de la regeneración tisular. Por ejemplo, además de la al menos una de las sustancias (a) a (i) mencionadas anteriormente, los promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención pueden contener: moléculas (grupos moleculares) relacionados con la potenciación de la función de HMGB1, HMGB2, o HMGB3 para inducir la regeneración de tejido funcional; moléculas (grupos moleculares) que inhiben acciones no previstas de HMGB1, HMGB2, o HMGB3; factores que regulan la proliferación y diferenciación de células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea); y otros factores que potencian/mantienen estos factores o las funciones celulares.
Los tipos de animales que sirven como fuente de proteína HMGB1, HMGB2, o HMGB3 para los promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención incluyen animales humanos y no humanos, que se pueden ejemplificar mediante seres humanos, ratones, ratas, monos, cerdos, perros, conejos, hámsters, y cobayas, pero el tipo es preferiblemente el mismo que el animal al que se le administrará la proteína HMGB1, HMGB2, o HMGB3.
Las proteínas HMGB1 en promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención se pueden
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ejemplificar mediante, pero no se limitan a, proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, o 5. Las proteínas HMGB1 empleadas según la presente invención también pueden incluir proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, o 5. Los ejemplos de tales proteínas incluyen: 1) proteínas aisladas que comprenden una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, supresiones, inserciones, y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, o 5, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, o 5; y 2) proteínas aisladas que son codificadas por los ADN que se hibridan en condiciones restrictivas con los ADN que comprenden la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 2, 4, o 6, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, o 5.
Las proteínas HMGB2 en promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención se pueden ejemplificar mediante, pero no se limitan a, proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7, 9, u 11. Las proteínas HMGB2 empleadas según la presente invención también pueden incluir proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7, 9, u 11. Los ejemplos de tales proteínas incluyen: 1) proteínas aisladas que comprenden una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, supresiones, inserciones, y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7, 9, u 11, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7, 9, u 11; y 2) proteínas aisladas que son codificadas por los ADN que se hibridan en condiciones restrictivas con los ADN que comprenden la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 8, 10, o 12, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7, 9, u
11.
Las proteínas HMGB3 en promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención se pueden ejemplificar mediante, pero no se limitan a, proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 o 15. Las proteínas HMGB3 empleadas según la presente invención también pueden incluir proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 o 15. Los ejemplos de tales proteínas incluyen: 1) proteínas aisladas que comprenden una secuencia de aminoácidos con una
o más sustituciones, supresiones, inserciones, y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 o 15, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 o 15; y 2) proteínas aisladas que son codificadas por los ADN que se hibridan en condiciones restrictivas con los ADN que comprenden la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 14 o 16, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 13 o 15.
Las proteínas aisladas que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15 pueden ser homólogas o parálogas de la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. Los expertos en la técnica pueden aislar proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, mediante métodos conocidos (volumen suplementario de “Jikken Igaku (Experimental Medicine), Idenshi Kougaku Handbook (Genetic Engineering Handbook)”, p. 246-251, publicado por Yodosha Co., Ltd., 1991).
Los ejemplos de proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15 incluyen proteínas que tienen actividad inductora de células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea).
Las proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, supresiones, inserciones, y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, incluyen proteínas de origen natural. Generalmente, los genes eucariotas tienen un polimorfismo como se conoce en genes de interferón, etc. Las alteraciones en las secuencias nucleotídicas causadas por el polimorfismo pueden dar como resultado una o más sustituciones, supresiones, inserciones, y/o adiciones de aminoácidos. Las proteínas de origen natural, tales como las que comprenden una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, supresiones, inserciones, y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, están incluidas en las proteínas HMGB1, HMGB2, o HMGB3 de la presente invención.
La presente invención también incluye proteínas mutantes producidas artificialmente, en tanto que sean funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. Los métodos conocidos que provocan mutaciones aleatorias a una secuencia nucleotídica dada incluyen sustitución o sustituciones de par o pares de bases a través de tratamiento del ADN con ácido nitroso (Hirose, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:7258-7260, 1982). Este método permite la introducción aleatoria de sustitución o sustituciones de par o pares de bases en un segmento específico mediante tratamiento con ácido nitroso del segmento que se desea mutar. Como alternativa, las tecnologías para dirigir al sitio una mutación diana incluyen el método de dúplex con saltos (Kramer W. y Fritz HJ., Methods in Enzymol., 154:350-367, 1987), y similares. Un vector bicatenario cíclico, en el que se clona un gen al que se le va a introducir una mutación, se separa en hebras sencillas. Estas hebras sencillas se hibridan con un oligonucleótido sintético mutado en el sitio
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diana. Un ADN monocatenario complementario derivado del vector, linealizado mediante una enzima de restricción, se recombina con el vector monocatenario cíclico, y el espacio entre el oligonucleótido y el vector se llena usando una ADN polimerasa, que entonces se constituye en un vector bicatenario completo mediante ligación.
El número de aminoácidos a modificar estaría típicamente dentro de 50, preferiblemente dentro de 30, y más preferiblemente dentro de 5 aminoácidos (por ejemplo, un aminoácido).
Cuando un aminoácido se sustituye artificialmente, la sustitución por un aminoácido que tiene propiedades similares daría como resultado el mantenimiento de la actividad de la proteína original. Las proteínas empleadas según la presente invención incluyen proteínas que resultan de una sustitución conservativa en la sustitución anterior del aminoácido o aminoácidos, y que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. La sustitución conservativa se considera importante cuando se sustituye un aminoácido o aminoácidos de dominios importantes para las actividades de la proteína. Tal sustitución conservativa de aminoácido o aminoácidos es bien conocida por los expertos en la técnica.
Los ejemplos de grupos de aminoácidos adecuados para la sustitución conservativa incluyen aminoácidos básicos (tales como lisina, arginina, e histidina), aminoácidos ácidos (tales como ácido aspártico y ácido glutámico), aminoácidos polares no cargados (tales como glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, y cisteína), aminoácidos no polares (tales como alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, y triptófano), aminoácidos -ramificados (tales como treonina, valina, e isoleucina), y aminoácidos aromáticos (tales como tirosina, fenilalanina, triptófano, e histidina).
Además, la sustitución no conservativa puede incrementar las actividades de la proteína (por ejemplo, proteínas activadas constitutivamente).
Además, las proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15 se pueden obtener por métodos que utilizan la hibridación. Es decir, se usa como sonda un ADN que codifica la proteína HMGB1, HMGB2, o HMGB3 de la presente invención como se muestra en la SEC ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16, o un fragmento del mismo, y después se aíslan los ADN que se pueden hibridar a él. Una reacción de hibridación realizada en condiciones restrictivas conduce a la selección de ADN muy homólogo como secuencia nucleotídica. Esto aumenta las posibilidades de proteínas aisladas que contienen proteínas que son funcionalmente equivalentes a la proteína HMGB1, HMGB2, o HMGB3. Los ejemplos de una secuencia nucleotídica muy homóloga incluyen aquellas que tienen 70% o más, y deseablemente 90% o más de identidad.
En un ejemplo específico, la expresión “condiciones restrictivas” se refiere a condiciones de hibridación con 6 x SSC, formamida al 40% a 25ºC, y lavado subsiguiente con 1x SSC a 55ºC. La restricción depende de las condiciones tales como concentración de sal, concentración de formamida, o temperatura; sin embargo, para los expertos en la técnica es obvio cómo ajustar estas condiciones para obtener una restricción necesaria.
Usando la hibridación, por ejemplo, se pueden aislar ADN que codifican homólogos de las proteínas HMGB1, HMGB2, o HMGB3 distintas de aquellas proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15.
Las proteínas que son funcionalmente equivalentes a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15 tienen normalmente una homología elevada con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. La expresión “homología elevada” se refiere a una identidad de secuencia de al menos 30% o más, preferiblemente 50% o más, más preferiblemente 80% o más (por ejemplo, 95% o más). La identidad de las secuencias nucleotídicas y secuencias de aminoácidos se puede determinar usando un sitio de búsqueda de homología vía internet (por ejemplo, se pueden usar búsquedas de homología tales como FASTA, BLAST, PSI-BLAST, y SSEARCH en DNA Data Bank of Japan (DDBJ) [cuyos ejemplos incluyen la página de búsqueda de homología (Search and Analysis) en el sitio web del DNA Data Bank of Japan (DDBJ); http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html]. Además, se pueden llevar a cabo búsquedas usando BLAST a través del sitio web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (cuyos ejemplos incluyen la página de BLAST en la página de inicio del sitio web de NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.govBLAST/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402)).
Por ejemplo, en el cálculo de la identidad de las secuencias de aminoácidos usando Advanced BLAST 2.1, el valor de la identidad (%) se puede obtener mediante lo siguiente: se usa blastp como el programa, el valor esperado se ajusta a 10, todos los filtros se ajustan a OFF, se usa BLOSUM62 para la matriz, y el coste de la existencia de espacios, por coste de espacio de resto, y la relación lambda se ajustan a 11, 1, y 0,85, respectivamente (parámetros por defecto) (Karlin, S. y S. F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. y S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7).
Las proteínas empleadas según la presente invención, o proteínas funcionalmente equivalentes a ellas, pueden ser proteínas sometidas a diversas modificaciones, tal como modificación fisiológica con cadenas de azúcar y similares, marcaje con sustancias fluorescentes o radioactivas, o fusión con otras proteínas. Particularmente en recombinantes
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que codifica una proteína HMGB1, HMGB2, o HMGB3 ligado con un ADN que codifica una señal de secreción (ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC; SEC ID NO: 17), en un vector de expresión conocido o un vector de terapia génica. El vector producido se introduce en células de mamífero tales como fibroblastos (tales como fibroblastos de piel normales y estirpes celulares derivadas de ellos), células de insectos, y otras células. No hay limitaciones particulares en los tipos de animales a partir de los que derivan estas células, aunque se usan preferiblemente células procedentes del tipo de animal del animal diana sometido a regeneración tisular, células de la propia diana, o células derivadas de un pariente consanguíneo de la diana sometida a regeneración tisular.
Los ADN que codifican proteínas HMGB1, HMGB2, o HMGB3 de los promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención pueden ser los ADNc, ADN genómicos, ADN naturales, o ADN sintetizados artificialmente, en tanto que codifiquen la proteína HMGB1, HMGB2, o HMGB3. Los ADN que codifican proteínas HMGB1, HMGB2, o HMGB3 están contenidos normalmente en promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención en una forma insertada en vectores (tales como vectores de terapia génica).
Los ejemplos de los vectores de terapia génica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, vectores plasmídicos, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados, vectores del virus de Sendai, vectores de la cubierta del virus de Sendai, y vectores del virus del papiloma. Los vectores de la terapia génica pueden contener secuencias de ADN promotoras que inducen eficazmente la expresión génica, factores que regulan la expresión génica, y moléculas que son necesarias para mantener la estabilidad del ADN.
Los promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención también pueden contener: péptidos parciales de la proteína HMGB1, HMGB2, o HMGB3 que tienen actividad induciendo células derivadas de médula ósea (tales como células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea); células que segregan estos péptidos parciales; o vectores insertados con los ADN que codifican estos péptidos parciales.
Los métodos para administrar promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención incluyen la administración oral o parenteral. Los ejemplos específicos de los métodos de administración incluyen la administración mediante inyección, administración intranasal, administración transpulmonar, y administración percutánea. Los ejemplos de administración mediante inyección incluyen inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, e inyección hipodérmica, mediante las cuales los inductores o los promotores de la regeneración tisular de la presente invención se pueden administrar sistémica o localmente (tal como subcutánea o intracutáneamente, o a la superficie de la piel, globo ocular, conjuntiva palpebral, mucosa nasal, mucosa intraoral, mucosa gastrointestinal, mucosa vaginal/intrauterina, o sitio de lesión).
El método de administración se puede seleccionar apropiadamente según la edad y los síntomas del paciente. Cuando se administra una proteína HMGB1, HMGB2, o HMGB3, la dosis por tiempo de la proteína se puede seleccionar en un intervalo de 0,0000001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal de un paciente. Como alternativa, la dosis se puede seleccionar en un intervalo de 0,00001 mg a 100000 mg por cuerpo de paciente, por ejemplo. Cuando se administran células que segregan proteínas HMGB1, HMGB2, o HMGB3, o vectores de terapia génica a los que se les ha insertado los ADN que codifican proteínas HMGB1, HMGB2, o HMGB3, se pueden administrar de manera que las cantidades de proteína HMGB1, HMGB2, o HMGB3 en los tejidos dañados están dentro del intervalo anterior. Sin embargo, la dosis de los promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención no está limitada a ellas.
Los promotores de la regeneración tisular para uso según la presente invención se pueden formular según los métodos habituales (por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Science, última edición, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), y pueden contener juntos vehículos farmacéuticamente aceptables y aditivos. Los ejemplos incluyen tensioactivos, excipientes, colorantes, perfumes, conservantes, estabilizantes, amortiguadores, agentes de suspensión, agentes isotonificantes, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, promotores de la fluidez, y agentes saborizantes, aunque no están limitados a ellos, y se pueden usar apropiadamente otros vehículos habituales. Los ejemplos específicos incluyen ácido silícico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, carmelosa cálcica, carmelosa sódica, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicérido de ácido graso de cadena media, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 60, azúcar blanca, carboximetilcelulosa, almidón de maíz, y sales inorgánicas.
Ejemplos
La presente invención se describirá aquí más abajo con referencia a los Ejemplos, pero no se ha de interpretar como limitada a estos Ejemplos.
[Ejemplo 1]
Objetivo: Evaluación de la contribución de células derivadas de médula ósea a la regeneración funcional de tejido de piel transplantado a un cuerpo vivo.
Método: En vista del objetivo anterior, se llevaron a cabo estudios mediante los siguientes métodos.
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1) Se examinó el grado de contribución de células derivadas de médula ósea a la regeneración funcional de tejido injertado, utilizando el sistema de transplante de piel viva de ratones a los que se les ha transplantado la médula ósea y que expresan GFP. Específicamente, ratones C57BL/6 machos de 6 a 8 semanas se irradiaron con una dosis letal de radiación (10 Gy), e inmediatamente después de eso, se transplantaron células de médula ósea derivadas de ratones transgénicos que expresan GFP (proteína fluorescente verde) (5 x 106 células/0,1 ml de disolución fisiológica amortiguadora de fosfato a pH 7,4) a través de la vena caudal (Fig. 1).
2) Las células de médula ósea transplantadas se dejaron injertar (durante 6 semanas) y como resultado, se obtuvieron ratones a los que se les transplantó la médula ósea que expresan GFP. Después, se transplantó piel de un ratón neonatal (hembra) a la piel dorsal de los ratones a los que se les transplantó la médula ósea y que expresan GFP.
3) El injerto de piel se dejó injertar y, habiendo tenido una regeneración tisular de la piel satisfactoria (4 semanas), se observó el grado de acumulación de fluorescencia de GFP en el área de la piel injertada, usando microscopio estereoscópico de fluorescencia.
4) Bajo anestesia mediante inhalación, el injerto de piel se recolectó mediante biopsia. Después, se prepararon secciones de piel congeladas (6 m) usando un microtomo con un dispositivo de enfriamiento, y entonces se fijaron con paraformaldehído al 4% (durante 30 minutos). Los núcleos celulares en el tejido se tiñeron con DAPI. La inmunotinción se llevó a cabo usando un anticuerpo contra queratina 5 específica de células epidérmicas. El tejido se selló para examinar la presencia de células derivadas de médula ósea positivas a GFP con un microscopio de láser confocal. Una parte de la muestra se tiñó con HE, para examinar su construcción tisular.
Resultado: En el sistema del transplante de piel viva de ratones a los que se les transplantó la médula ósea y que expresan GFP, se observó una fuerte acumulación de fluorescencia de GFP que corresponde a la región de piel regenerada (Fig. 2). Además, con la observación histológica usando la muestra de HE del injerto de piel, se observó regeneración funcional del tejido de la piel que contiene un gran número de folículos pilosos (Fig. 2). Con la observación usando un microscopio de láser confocal, se observó fluorescencia de GFP en muchos queratinocitos epidérmicos que expresan queratina 5, fibroblastos dérmicos, y otras células del músculo liso y adipocitos, mostrando que estas células derivan de la médula ósea (Fig. 3). Es decir, por primera vez se dio a conocer que muchas de las células epiteliales y mesenquimatosas requeridas para la regeneración funcional de la piel transplantada fueron suministradas a partir de células madre derivadas de médula ósea.
Discusión: Por primera vez, estos resultados del estudio mostraron claramente un descubrimiento exitoso de que las células derivadas de médula ósea contribuyen enormemente a la regeneración de la piel tras el transplante de piel, que es un procedimiento clínico rutinario.
Se da a conocer que la médula ósea tiene dos sistemas de células madre: las células madre hematopoyéticas, y las células madre mesenquimatosas. Es difícil imaginar que el gran número de células epiteliales y células mesenquimatosas derivadas de médula ósea que se movilizaron a la piel transplantada (como se muestra mediante el presente estudio) se suministraron solamente a partir de células madre hematopoyéticas derivadas de médula ósea. Esto sugiere fuertemente la posible contribución de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea a la regeneración funcional de tejidos transplantados. Es decir, se predijo que, inmediatamente tras el injerto de piel, se libera del tejido de piel receptor un factor para movilizar células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea, que conduce a la hipoperfusión/necrosis, en el que las células madre mesenquimatosas se movilizan desde la médula ósea a través de la circulación de la sangre periférica hacia el trozo de piel transplantada, e induciendo así la regeneración del tejido funcional de la piel.
[Ejemplo 2]
Objetivo: Identificación de un factor inductor de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea en un extracto de tejido de piel.
Método: Con el objetivo de identificar un factor movilizador de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea que se espera que sea liberado de la piel cortada en condiciones hipoperfusivas, se llevaron a cabo estudios mediante los siguientes métodos.
1) Para obtener células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea de ratón, se recolectaron células de médula ósea a partir del fémur o hueso de la tibia de ratones C57BL/6, y entonces se extendieron sobre una placa de cultivo celular que tiene D-MEM que contiene 10% de suero fetal bovino (Nacalai) como medio de cultivo celular, y entonces se cultivaron en la condición de 5% de CO2 a 37ºC. Cuando las células proliferaron hasta el punto de ocupar 70 a 100% del área inferior de la placa de cultivo, las células se despegaron de la placa de cultivo usando 0,25% de tripsina/1 mM de EDTA (Nacalai), y entonces se cultivaron en las condiciones anteriores. Este procedimiento de pasada y cultivo se repitió al menos cinco veces. Posteriormente, estas células adherentes se aislaron y cultivaron, seguido de un análisis de antígenos de la superficie celular usando citometría de flujo, para confirmar que todas estas células eran Lin-negativas,
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fluorescencia de GFP que se emite de las células derivadas de médula ósea que habían migrado al tubo. Después, las células migratorias se extrajeron del tubo, y se inocularon en un medio DMEM/10% de suero fetal bovino, seguido del cultivo en una incubadora de CO2, para examinar la actividad movilizadora de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea in vivo. Estas células que se cultivaron de forma continua durante 2 semanas se fijaron con paraformaldehído al 2% a 25ºC durante 10 minutos, y se enjuagaron con PBS cuatro veces, 5 minutos cada vez, para eliminar el paraformaldehído por lavado. Entonces, se trató con una disolución de leche desnatada al 2%, y se dejó reaccionar con una dilución de 1000 veces de un anticuerpo anti-queratina 5 de ratón (diluido con leche desnatada al 2% que contiene 0,5% de tween 20) a 4ºC durante 16 horas. El anticuerpo se eliminó por lavado con PBS cuatro veces durante 5 minutos cada vez. Entonces se dejó reaccionar con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Alexa546 diluido 1000 veces (diluido con leche desnatada al 2%) a 25ºC durante 1 hora. El protocolo experimental anterior de 1) a 8) se resume en la Fig. 4.
Resultado: Partiendo de la disolución del extracto de piel cortada de ratón neonato en PBS (Fig. 5), las proteínas que tienen la actividad movilizadoras de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea se sometieron a identificación y análisis funcional mediante los métodos mencionados anteriormente. La evaluación de la actividad migratoria usando una cámara de Boyden mostró que el extracto de piel tiene una actividad inductora de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea extremadamente fuerte (Fig. 6). Usando esta actividad como índice, se usó una columna de afinidad de heparina y una columna de intercambio aniónico (columna Q) para proceder con la purificación del factor diana. Las fracciones obtenidas se analizaron cada una mediante electroforesis en SDS-PAGE. Como resultado, se mostró una fuerte actividad movilizadora de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea mediante tinción con plata en la preparación purificada que contiene varias proteínas que se separaron en el gel en forma de bandas individuales (Línea 7 en la Fig. 7). Las bandas obtenidas teñidas con plata se cortaron, y entonces se sometieron a espectrometría de masas y análisis de bases de datos. Como resultado, se reveló que la proteína que tiene un peso molecular de alrededor de 25.000 indicada por la flecha fue HMGB1 (Fig. 7). Para aclarar que HMGB1 contenida en esta fracción purificada (Línea 7) tiene la actividad movilizadora de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea pretendida, se llevó a cabo un experimento de inhibición de la migración usando el anticuerpo policlonal anti-MGB1. Como resultado, se reveló que el anticuerpo policlonal anti-HMGB1 inhibe fuertemente la actividad migratoria de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea en la preparación purificada (Fig. 8), y que el factor movilizador de células madre derivadas de médula ósea presente en el extracto de piel es HMGB1.
Además, para confirmar que HMGB1 tiene una actividad movilizadora de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea in vivo, se insertó subcutáneamente un tubo de silicona que contiene esta preparación purificada en la espalda de un ratón al que se le transplantó la médula ósea y que expresa GFP. Dos semanas más tarde, se examinaron las propiedades de las células movilizadas al tubo (Fig. 9). Como resultado, la preparación purificada de HMGB1 movilizó un mayor número de células derivadas de médula ósea positivas a GFP hacia el tubo (alrededor de tres veces) en comparación con el control comparativo (preparación purificada usada para la Línea 4 en SDS-PAGE de la Fig. 7) (Fig. 10). La Fig. 11 muestra una imagen de gran aumento mediante un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Posteriormente, las células positivas a GFP movilizadas hacia el tubo se extrajeron, y se cultivaron en medio DMEM/10% de suero fetal bovino. Como resultado, inmediatamente después del cultivo se observaron células que flotan con forma redonda (Fig. 12); sin embargo, 24 horas después se confirmó que las células derivadas de médula ósea positivas a GFP se adhieren sobre la cápsula de cultivo y proliferaron en forma de células similares a fibroblastos con forma de husillo, y posteriormente en forma de células similares a las epiteliales con forma de cilindroide (Fig. 13). Cuando estas células se cultivaron de forma continua durante otras 2 semanas, se observaron células que forman folículos pilosos entre las células derivadas de médula ósea positivas a GFP (Fig. 14A; campo de luz, bajo aumento, Fig. 14B; fluorescencia de GFP, bajo aumento, Fig. 14C; campo de luz, gran aumento, Fig. 14D; fluorescencia de GFP, gran aumento). Además, cuando se usaron técnicas inmunohistoquímicas para queratina 5, un marcador de queratinocitos epiteliales, se observaron células positivas a queratina 5 entre las células derivadas de médula ósea positivas a GFP (Fig. 14E; campo de luz, Fig. 14F; fluorescencia de células positivas a queratina 5).
Discusión: Esta vez, los presentes inventores han descubierto por primera vez en el mundo que: trozos de piel libre producen HMGB1; la HMGB1 producida tiene actividad movilizadora de una gran cantidad de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea hacia los trozos de piel; las células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea movilizadas hacia los trozos de piel se diferencian en células mesenquimatosas tales como fibroblastos, adipocitos, células del músculo liso en el tejido de la piel, y se diferencian además en células que forman folículos pilosos de células epidérmicas, para inducir regeneración funcional de tejidos de piel transplantados. Se puede predecir fácilmente que esta movilización de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea por HMGB1, y las funciones de regeneración de tejido funcional resultantes, no solo para la regeneración de piel transplantada, sino también como un mecanismo para inducir la regeneración de tejido funcional en diversos órganos/tejidos dañados que acompañan a la hipoperfusión/necrosis. Los presentes inventores creen firmemente que, si el desarrollo de fármacos usando una formulación de HMGB1 permite la movilización de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea hacia el área local durante la regeneración de los tejidos dañados, permitiría una terapia inductora de la regeneración de tejido funcional para órganos funcionales vitales, sin que los órganos se hagan disfuncionales debido a la curación de cicatrices fibrosas.
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[Ejemplo 3]
Objetivo: Identificación de la familia de HMGB1 en el extracto de piel, y examen de la actividad inductora de células madre mesenquimatosas de médula ósea
Método: Usando el método de transferencia Western se confirmó si el extracto de piel de ratón neonato contenía o no la familia de proteínas HMGB. Se usaron como muestra diez l del extracto de piel obtenido en el [Ejemplo 2], y se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE. Las proteínas separadas en el gel se transfirieron sobre una membrana de PVDF usando un dispositivo de transferencia (ATTO). La membrana se incubó con PBS que contiene 3% de leche desnatada y 0,1% de Tween 20 (S-T-PBS) a temperatura ambiente durante 1 hora, y entonces se dejó reaccionar con cada uno de anticuerpo de conejo anti-HMGB1 de ratón, anticuerpo de conejo anti-HMGB2 de ratón,
o anticuerpo de conejo anti-HMGB3 de ratón, que se diluyeron 1000 veces con S-T-PBS, a 4ºC durante 16 horas. Tras la reacción, la membrana de PVDF se lavó con S-T-PBS cinco veces durante 5 minutos. Después, la membrana de PVDF se incubó con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa diluido 2000 veces (diluido con S-T-PBS) (GE Healthcare) a 25ºC durante 1 hora. Posteriormente, tras lavar con S-T-PBS cinco veces durante 5 minutos, la membrana de PVDF se dejó reaccionar con ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare). La película de ECL se expuso y se desarrolló para detectar la presencia de las proteínas HMGB1, HMGB2, y HMGB3.
Se extrajo ARN de la piel de ratón neonato usando Trizol (invitrogen), y posteriormente el ADNc se sintetizó usando el kit de síntesis de ADNc SuperScript III (Invitrogen). Usando este ADNc como molde, los ADNc de HMGB 1, HMGB2, y HMGB3 se amplificaron usando el método de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los ADNc se insertaron en el vector plasmídico pCAGGS para expresar proteínas en células de mamífero, de manera que se pudiesen expresar proteínas con una secuencia de etiqueta Flag adicional (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys; SEC ID: 18) en el término N de la secuencia de aminoácidos. Estos vectores plasmídicos se introdujeron en HEK293 (estirpe celular de cultivo derivado de riñón embrionario humano) y se cultivaron durante 48 horas para expresar las proteínas. Las células que expresan cada una de las proteínas HMGB1, HMGB2, y HMGB3, y el sobrenadante del cultivo se incubaron a 4ºC durante 16 horas, que entonces se centrifugó a 4400 g durante 5 minutos para recolectar el sobrenadante. Se mezclaron 100 l del gel del anticuerpo anti-Flag (Sigma) en 50 ml de este sobrenadante, y entonces se incubó a 4ºC durante 16 horas. La centrifugación se llevó a cabo entonces para recolectar el gel, y se lavó con PBS cinco veces. Posteriormente, la proteína se eluyó usando 3X de péptido Flag (final 100 g/ml). Las expresiones de las proteínas recombinantes se observaron mediante el método de transferencia Western usando anticuerpo de ratón anti-Flag diluido 1000 veces (diluido con S-T-PBS) y anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa diluido 2000 veces (diluido con S-T-PBS) (GE Healthcare). La actividad migratoria de las células madre mesenquimatosas de médula ósea de ratón en estas proteínas recombinantes purificadas se evaluó de la misma manera como en el [Ejemplo 2] usando una cámara de Boyden. Además, a fin de observar la eficacia del fármaco in vivo de la familia de HMGB, se cortó un círculo, que tiene un diámetro de 8 m, en la piel dorsal de ratones C57BL/6 de 8 semanas, para preparar modelos de úlcera cutánea. Se mezclaron cada una de HMGB1, HMGB2, y HMGB3 purificadas (100 ng) con la misma cantidad de disolución de ácido hialurónico que tiene una concentración de 1 g/100 ml de PBS, y se administraron 100 l de la misma a la superficie de la úlcera. La superficie de la úlcera se cubrió con una gasa/material protector de heridas adhesivo transparente Tegaderm (3M Healthcare) para evitar que se seque, y la superficie de la herida se midió a lo largo del tiempo para determinar el efecto terapéutico.
Además, para examinar si el extracto de piel humana y la HMGB1 humana purificada tienen o no actividad que permita la migración de células madre mesenquimatosas de médula ósea humanas, para la evaluación se usó una cámara de Boyden de la misma manera como en el [Ejemplo 2]. Se sumergió una piel humana que tiene un área de 1 cm2 en 1 ml de PBS, y entonces se incubó a 4ºC durante 16 horas y posteriormente se centrifugó a 440 G a 4ºC durante 10 minutos. Se recolectó el sobrenadante solo, para ser usado como extracto de piel humana. Además, las células madre mesenquimatosas de médula ósea humanas (Cambrex) se usaron como las células a colocar en la cámara superior de la cámara de Boyden (como resultado del análisis de antígenos de superficie mediante citometría de flujo, se confirmó que estas células son positivas para CD105, positivas para CD166, positivas para CD29, positivas para CD44, negativas para CD34, y negativas para CD45. También se ha encontrado, mediante ensayos de inducción de la diferenciación, que se diferencian en adipocitos, condrocitos, y células óseas). Además, en la cámara inferior se colocaron 100 ng/pocillo de HMGB1 humana (R&D) y extracto de piel humana diluido 10 veces con PBS. Como control, se usó PBS.
Resultado: Como resultado de la transferencia Western, se detectaron bandas de HMGB2 y HMGB3, así como la banda de HMGB1. Por lo tanto, se confirmó que el extracto de piel de ratón neonato contiene las proteínas de la familia, HMGB2 y HMGB3, además de HMGB1 (Fig. 15). Se prepararon vectores de expresión de HMGB1/HMGB2/HMGB3 que tienen una etiqueta Flag añadida al término N de cada proteína (Fig. 16). Estos vectores de expresión se introdujeron en células HEK293, y las proteínas expresadas se purificaron usando la etiqueta Flag, y se llevó a cabo la transferencia Western para observar estas proteínas (Fig. 17). La actividad migratoria de las células madre mesenquimatosas de médula ósea de ratón se midió usando estas proteínas purificadas, y la actividad se confirmó en todas las proteínas (Fig. 18). El área de la úlcera producida en la espalda del ratón se midió cada 7 días, y se confirmó un efecto significativo a la hora de reducir el área de la úlcera en el grupo de tratamiento con HMGB1, 2, y 3, en comparación con el grupo sin tratamiento (Fig. 19). Similar al caso del
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ratón, se reveló que HMGB1 humana y el extracto de piel humana tienen actividad migratoria de células madre mesenquimatosas de médula ósea humanas (Fig. 20).
Discusión: HMGB2 y HMGB3 son conocidas como proteínas que tienen grandes homologías con HMGB1. También se espera que estas proteínas tengan propiedades similares a HMGB1. Se confirmó que HMGB2 y HMGB3 de la familia de HMGB1 también son producidas a partir del extracto de la sección de piel libre. Además, se produjeron proteínas recombinantes HMGB1/HMGB2/HMGB3, y también se confirmó su actividad migratoria de células madre mesenquimatosas de médula ósea in vitro y el efecto terapéutico in vivo sobre una úlcera cutánea. Se reveló que la familia de HMGB (HMGB1/HMGB2/HMGB3) y la familia de HMGB recombinante, en la sección de piel libre de ratón neonato, tienen actividad inductora de células madre mesenquimatosas de médula ósea y actividad inductora localmente de células madre derivadas de médula ósea que se diferencian en epitelio, y que el grupo de células derivadas de médula ósea así inducidas se diferencian en diversas células tales como queratinocitos epidérmicos, folículos pilosos y fibroblastos en el tejido dañado, para promover la recuperación del tejido dañado. Además, puesto que las células madre mesenquimatosas de médula ósea son células madre multipotentes, los presentes inventores creen que los efectos terapéuticos también son de esperar de la misma manera mediante la administración sistemática o administración local de la familia de HMGB para tratar estados dañados en otros tejidos, por ejemplo daños tisulares tales como lesión cerebral, infarto de miocardio, y fractura de huesos.
Además, se sabe que, entre el ser humano y el ratón, la homología de secuencias de aminoácidos para HMGB1 es 98% (213/215), 96% (202/210) para HMGB2, y 97% (195/200) para HMGB3. Por lo tanto, se considera que HMGB humana y HMGB de ratón tienen actividades similares, y los resultados de los presentes Ejemplos revelaron que el extracto de piel humana y HMGB1 humana tienen actividades inductoras de células madre mesenquimatosas de médula ósea de la misma manera que aquellas del extracto de piel de ratón y de HMGB1 de ratón.
[Ejemplo 4]
Objetivo: Establecimiento de un método para producir un extracto tisular que contenga factores inductores de células madre mesenquimatosas de médula ósea.
Método: Se sumergió el cerebro, corazón, intestino, riñón e hígado de un ratón C57BL6 de 6 semanas, y piel de un ratón neonato, en 1 ml de disolución fisiológica amortiguada de fosfato (PBS) a pH 7,4. Las disoluciones se incubaron a 4ºC durante 24 horas, y entonces se centrifugaron a 440 G a 4ºC durante 10 minutos para eliminar los tejidos. Se recolectaron los sobrenadantes para preparar extractos tisulares. Para confirmar si el extracto así obtenido tiene actividad inductora de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea, se examinó la actividad migratoria de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea de la misma manera como en el [Ejemplo 2], usando una cámara de Boyden. Además, la concentración de HMGB1 contenida en estas muestras se midió usando un kit de ELISA para HMGB1 (Shino-Test). Después, los extractos tisulares del cerebro, corazón y piel se dejaron unir a una columna de afinidad de heparina de la misma manera como en el [Ejemplo 2], y la actividad inductora de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea en la fracción unida a la proteína se confirmó usando la cámara de Boyden.
Resultado: El extracto de cerebro de ratón contenía una cantidad de HMGB1 equivalente al extracto de piel de ratón neonato. Además, también se observó actividad inductora de células madre mesenquimatosas de médula ósea en el cerebro de ratón así como también en la piel. Aunque el extracto de intestino de ratón y el extracto de corazón de ratón contenían poca HMGB1, se observaron actividades inductoras de células madre mesenquimatosas de médula ósea. Además, las fracciones de cerebro de ratón y de corazón de ratón unidas a la columna de heparina, así como también la fracción de piel de ratón unida a la columna de heparina, mostraron actividades inductoras de células madre mesenquimatosas de médula ósea (Fig. 21). La Tabla 1 muestra los resultados de las medidas de la concentración de HMGB1 y de la actividad inductora de células madre mesenquimatosas de médula ósea en cada uno de los extractos tisulares de ratón.
[Tabla 1]
Concentración de HMGB1 (ng/ml)
Actividad inductora de células madre mesenquimatosas de médula ósea
Piel
110 Presente
Cerebro
140 Presente
Corazón
4 Presente
Intestino
0 Presente
Riñón
115 ND
Hígado
61 ND
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