KR20160070169A - 생체내 기능적 세포의 고효율 채취법 - Google Patents

Abstract

생체내의 특정 기능 세포를 동원하는 활성을 가진 생체내 인자를 충전한 생체 저침습성 용기를 생체내에 유치하고 용기내에 특정 기능 세포를 유주시킨 후에 용기를 생체외로 꺼내거나 혹은 생체내에 유치한 용기로부터 직접 용기내로 동원한 기능적 세포 집단을 회수한다.

Description

생체내 기능적 세포의 고효율 채취법{Method for collecting functional cells in vivo with high efficiency}

본 발명은 생체내 조직에 극소수 존재하는 줄기세포 등의 기능적 세포를 저침습 및 고효율로 회수하기 위한 신규 세포 채취법에 관한 것이다.

종래 생체내에서 고기능 세포를 채취하는 방법으로서는, 예를 들면 조혈 골수줄기세포라면 장골이나 골반골의 골수안에 바늘을 직접 꽂아 골수액을 채취한 후 인간투여의 경우에는 원심분리에 의해 줄기세포 집단을 농축하여 줄기세포 표면 마커를 지표로 하여 형광 표식한 세포를 셀분류기로 채취·확인하는 등의 수법이, 말초혈 줄기세포라면 G-CSF를 투여하여 말초혈중에 조혈 줄기세포를 동원한 후 말초혈을 채취하여 조혈 줄기세포를 분리하는 등의 수법이, 중간엽 줄기세포라면 직접 골수액을 배양하여 부착성 증식 세포를 회수하여 중간엽 줄기세포를 얻고 지방조직 등의 말초 조직을 수술에 의해 채취하여 그 안에 존재하는 중간엽 줄기세포를 분리·배양하는 등의 수법이 있다. 그러나 골수로부터의 골수액 채취는 침습성이 강하여 통증을 동반하고 골수내 감염에 의한 골수염의 위험을 동반하기 때문에 그 시술에는 전문가에 의한 매우 엄밀한 의료 관리가 필요하므로 빈번한 시행은 어렵다. 말초 조직 수술적 채취도 같은 위험을 동반한다. G-CSF에 의한 조혈 줄기세포 동원은 경제적으로 부담이 많아 역시 빈번한 시행은 어렵다.

보다 효율적이고 안전하게 생체내 기능성 세포를 채취하는 방법이 개발된다면 그 세포를 필요로 하는 많은 난치성 질환으로 고통받는 환자에게 기쁜 소식이라는 것은 말할 것도 없다.

비특허문헌 1: Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. J Cell Mol Med. 2005; 9:37-50 비특허문헌 2: Role of mesenchymal stem cells in regenerate medicine: application to bone and cartilage repair. Expert Opin Biol Ther. 2008; 8:255-268

본 발명은 생체내 조직에 극소수 존재하는 줄기세포 등의 기능적 세포를 저침습 및 고효율로 회수하기 위한 신규 기술의 제공을 과제로 한다.

본 발명은 생체내에 저침습성으로 튜브를 삽입하는 것만으로도 고효율로 생체내 기능성 세포를 채취하는 완전히 새로운 기술을 제공한다.

구체적으로는 생체 저자극성 실리콘으로 만들어진 원통형 튜브(한쪽 면이 개방면, 그 반대 측면은 폐쇄면으로 이루어지고, 장직경은 10밀리미터, 단면적은 약 2평방밀리미터)안에 HMGB1, 히알루론산, 인산완충액 등을 각각 충전한 다음 GFP골수 이식 마우스 등부분 피하에 이식하였다. 이식 2주일 후에 튜브를 회수하고 튜브내에 동원되어 집적되어 있던 세포를 채취하여 일부는 세포배양, 일부는 FACS에 의한 세포 표면 마커의 해석을 진행하였다. 그 결과 인산완충액에 비해 우위로 다른 인자를 충전한 튜브로부터 많은 PDGFRα양성 세포가 회수되고, 그들 세포 집단 중에 골분화능력이나 연골 분화능력을 가진 중간엽 줄기세포가 포함되어 있는 것으로 확인되었다.

본원은 이 식견에 기초하여 하기 발명을 제공하는 것이다.

[1]피하로부터 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수하는 방법.

[2]피하로부터 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수하는 방법으로서, 해당 세포 집단이 하기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 하기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물에 의해 골수로부터 해당 용기내로 동원되는 상기 방법;

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(j)S100A8 단백질

(k)S100A8 단백질을 분비하는 세포

(l)S100A8 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(m)S100A9 단백질

(n)S100A9 단백질을 분비하는 세포

(o)S100A9 단백질을 코드하는 DNA가삽입된 벡터

(p)히알루론산

(q)세포 또는 조직 추출액

(r)세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획.

[3]피하에 매립된 용기로부터 회수된 세포 집단으로부터 골수세포를 단리하는 공정을 포함한, 골수세포를 수집하는 방법.

[4]피하에 매립된 용기로부터 회수된 세포 집단으로부터, 골수세포를 단리하는 공정을 포함한, 골수세포를 수집하는 방법으로서, 상기 세포 집단이 하기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 하기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물에 의해 골수로부터 상기 용기 내로 동원되는 방법;

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(j)S100A8 단백질

(k)S100A8 단백질을 분비하는 세포

(l)S100A8 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(m)S100A9 단백질

(n)S100A9 단백질을 분비하는 세포

(o)S100A9 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(p)히알루론산

(q)세포 또는 조직 추출액

(r)세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획.

[5]세포 집단으로부터 골수세포를 단리하는 공정 전에 체외로 꺼낸 해당 용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정을 포함한 [3] 또는 [4]에 기재된 방법.

[6]세포 또는 조직 추출액이 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조된 [2] 또는 [4]에 기재된 방법.

[7]세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획이 하기 공정을 포함한 방법으로 제조되는 [2] 또는 [4]에 기재된 방법;

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,

(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정, 및

c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.

[8][1], [2], [6] 및 [7]중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 회수되는 세포 집단.

[9][3]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 단리되는 골수세포.

[10][8]에 기재된 세포 집단을 함유한 조직 재생제.

[11][9]에 기재된 골수세포를 함유한 조직 재생제.

[12]하기 공정을 포함한, 세포 집단을 회수하는 방법;

(I)용기를 피하에 매립하는 공정,

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정.

[13]공정(I) 다음에 하기 (a) 내지 (r)중 어느 하나에 기재된 물질 또는 하기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한 [12]에 기재된 방법;

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(j)S100A8 단백질

(k)S100A8 단백질을 분비하는 세포

(l)S100A8 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(m)S100A9 단백질

(n)S100A9 단백질을 분비하는 세포

(o)S100A9 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(p)히알루론

(q)세포 또는 조직 추출

(r)세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획.

[14]용기가 하기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 하기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 함유한 [12]에 기재된 방법;

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(j)S100A8 단백질

(k)S100A8 단백질을 분비하는 세포

(l)S100A8 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(m)S100A9 단백질

(n)S100A9 단백질을 분비하는 세포

(o)S100A9 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(p)히알루론

(q)세포 또는 조직 추출

(r)세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획.

[15]하기 공정을 포함한, 골수세포를 수집하는 방법;

(I)용기를 피하에 매립하는 공정,

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정,

(III)회수한 세포 집단으로부터 골수세포를 단리하는 공정.

[16]공정(I) 다음에 하기 (a) 내지 (r)중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 하기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한 [15]에 기재된 방법;

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(j)S100A8 단백질

(k)S100A8 단백질을 분비하는 세포

(l)S100A8 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(m)S100A9 단백질

(n)S100A9 단백질을 분비하는 세포

(o)S100A9 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(p)히알루론

(q)세포 또는 조직 추출

(r)세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획.

[17]용기가 하기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 하기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 함유한 [15]에 기재된 방법;

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(j)S100A8 단백질

(k)S100A8 단백질을 분비하는 세포

(l)S100A8 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(m)S100A9 단백질

(n)S100A9 단백질을 분비하는 세포

(o)S100A9 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(p)히알루론

(q)세포 또는 조직 추출

(r)세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획.

[18]세포 또는 조직 추출액이 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조된 [13], [14], [16] 및 [17]중 어느 하나에 기재된 방법.

[19]세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획이 하기 공정을 포함한 방법으로 제조된 [13], [14], [16] 및 [17]중 어느 하나에 기재된 방법;

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,

(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정,

(c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.

[20][12]∼[14]중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 회수되는 세포 집단.

[21][15]∼[17]중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 단리되는 골수세포.

[22][20]에 기재된 세포 집단을 함유한 조직 재생제.

[23][21]에 기재된 골수세포를 함유한 조직 재생제.

발명을 실시하기 위한 형태

본 발명은 피하로부터 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 피하에 매립된 용기로부터 회수된 세포 집단으로부터 골수세포를 단리하는 공정을 포함한, 골수세포를 수집하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 세포 집단에서 골수세포를 단리하는 공정 전에 체외로 꺼낸 해당 용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정을 포함해도 좋다.

본 발명은 하기 공정을 포함한, 세포 집단을 회수하는 방법을 제공한다.

(I)용기를 피하에 매립하는 공정

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정

또한, 본 발명은 하기 공정을 포함한, 골수세포를 수집하는 방법을 제공한다.

(I)용기를 피하에 매립하는 공정

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정

(III)회수한 세포 집단으로부터 골수세포를 단리하는 공정

또한, 상기 방법은 공정(I) 다음에 용기를 피하로부터 꺼내는 공정을 포함해도 좋다.

상기 용기의 소재로서는, 실리콘, 비닐, 플라스틱, 기타 생체 저자극성 소재가 바람직하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 용기의 크기로서는 본 실시예에서는 장직경10㎜×단면적2㎜(용적20㎖, 마우스용)의 것을 사용하였으나, 피하에 삽입 가능한 사이즈라면 이에 제한되지 않는다. 용기의 두께로서는, 본 실시예에서는 벽의 두께가 약 0.5㎜인 용기를 사용하였으나, 충분한 강도 유지에 필요한 두께라면 이에 제한되지 않는다. 용기의 형상으로서는, 본 실시예에서는 원통형이면서 한쪽 면만 개방된 것을 사용하였으나 원통, 방추형, 구형, 계란형 등 생체 조직에 손상을 주지 않는 형상이라면 특별히 제한되지 않는다. 본원에 사용되는 용기로서는 실리콘 튜브, 비닐 백, 주사용 유치침 등 생체내 유치가 가능한 의료용 기재, 의료 재료라면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서 용기로부터 회수되는 세포 집단에는 골수 유래 세포가 포함된다.

본 발명의 골수세포는 조혈계 줄기세포 및 이로부터 유래되는 백혈구, 적혈구, 혈소판 이외의 세포로서, 지금까지 골수 중간엽 줄기세포 혹은 골수 간질 다능성 줄기세포 혹은 골수 다능성 줄기세포라고 불리는 세포로 대표되는 줄기세포 또는 골수중에 존재하는 조직 전구세포 집단을 포함한다. 본 발명의 골수세포로서는, 골수 채취(골수세포 채취), 혹은 말초혈 채혈에 의해 단리할 수 있는 세포이다. 조혈계 줄기세포는 비부착 세포이고, 본 발명의 골수세포는 골수 채취(골수세포 채취), 말초혈 채혈에 의해 얻어진 혈액중의 단핵구 분획 세포 배양에 의해 부착 세포로서 얻어진다. 또한, 본 발명의 골수세포는 중간엽 줄기세포를 포함하고 골아세포(분화를 유도하면 칼슘의 침착을 인정함으로써 특정 가능), 연골세포(알시안블루염색 양성, 사프라닌-O염색 양성 등으로 특정 가능), 지방세포(수단III염색 양성으로 특정 가능), 또한, 섬유아세포, 평활근세포, 간질세포, 건(腱)세포 등의 간엽계 세포, 또한, 신경세포, 상피세포(예를 들면 표피 각화세포, 장관 상피세포는 사이토케라틴 패밀리를 발현한다), 혈관 내피세포로의 분화능력을 갖는 것이 바람직하지만, 분화 후의 세포는 상기 세포로 한정되지 않으며 간장, 신장, 췌장 등의 실질 장기 세포로의 분화능력도 포함한다.

본 발명에서 골수 유래 중간엽 줄기세포 혹은 골수 간질 다능성 세포 혹은 골수 다능성 줄기세포란 골수내에 존재하는 세포로서, 골수로부터 직접 혹은 기타 조직(혈액이나 피부, 지방, 기타 조직)으로부터 간접적으로 채취되어 (플라스틱 혹은 유리제) 배양용기로의 부착 세포로서 배양·증식 가능하고 뼈, 연골, 지방 등의 중간엽 조직(중간엽 줄기세포), 혹은 골격근, 심근 나아가 신경조직, 상피조직(다능성 줄기세포)으로의 분화능력이 있다는 특징을 갖는 세포로서, 골수혈 채혈, 말초혈 채혈, 또한, 지방 등 중간엽 조직, 피부 등의 상피조직, 뇌 등의 신경조직으로부터의 채취에 의해 취득할 수 있다. 또한, 골수 유래 중간엽 줄기세포 혹은 골수 유래 다능성 줄기세포 혹은 골수 다능성 줄기세포는 일단 배양용기에 부착시킨 세포를 생체의 손상부에 투여함으로써 예를 들면 피부를 구성하는 케라티노사이토 등의 상피계조직, 뇌를 구성하는 신경계의 조직으로의 분화능력도 있다는 특징도 갖는다.

본 발명의 골수 중간엽 줄기세포 혹은 골수 중간질 다능성 줄기세포 혹은 골수 다능성 줄기세포는 골아세포(분화를 유도하면 칼슘의 침착을 인정함으로써 특정 가능), 연골세포(알시안블루염색 양성, 사프라닌-O염색양성 등으로 특정 가능), 지방세포(수단III염색 양성 등으로 특정 가능) 이외에, 예를 들면 섬유아세포, 평활근세포, 골격근세포, 간질세포, 건세포 등의 간엽계 세포, 신경세포, 색소세포, 표피세포, 모포세포(사이토케라틴 패밀리, 헤어케라틴 패밀리 등을 발현한다), 상피계 세포(예를 들면 표피 각화세포, 장관 상피세포는 사이토케라틴 패밀리 등을 발현한다), 내피세포, 나아가 간장, 신장, 췌장 등의 실질 장기 세포로 분화되는 능력을 갖는 것이 바람직하지만, 분화 후의 세포는 상기 세포로 한정되지는 않는다.

조직 전구세포는 혈액계 이외의 특정 조직 세포로의 일방향성 분화능력을 가진 미분화 세포로 정의되고, 상술한 중간엽 조직, 상피계 조직, 신경조직, 실질 장기, 혈관내피로의 분화능력을 가진 미분화 세포를 포함한다.

또한, 본 발명의 골수세포로서는, 예를 들면 세포 표면 마커 CD44, PDGFRα 및 PDGFRβ 중 적어도 하나에 대해 양성인 골수세포를 들 수 있지만, 이와 같은 세포로 한정되지는 않는다.

본 발명에서 용기를 피하에 매립하는 공정은 전신(혹은 국소)마취를 시행 후 메스에 의해 수밀리미터의 피부 절개를 시행, 끝단이 둥근 금속봉(モスキ―トペアン 등)을 사용하여 피하 지방조직내에 둔한 박리에 의해 필요한 공간을 만들고 그 공간내에 실리콘 튜브 등 세포 회수용 용기를 매립하고 마지막으로 봉합 혹은 호치키스 고정시킴으로서 수행된다.

피하로의 용기 유치를 위한 다른 방법으로서는, 주사용 바늘의 외통으로서 내통(주사바늘)마다 피하에 꽂은 후 내통만 꺼내고 외통을 유치하는, 가이드침이 삽입된 벌룬 카테터(Balloon catheter)로서 피하에 카테터를 삽입하고 가이드침을 제거한 후에 벌룬을 약액에 의해 확대시켜 유치하는 등의 방법을 생각할 수 있다.

용기를 매립하는 대상으로서는 인간 또는 비인간 동물을 들 수 있으며, 예를 들면 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 몰모트 등을 예시할 수 있는데, 바람직하게는 인간이다.

본 발명에서 용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정으로서는, 피하에 매립한 상태의 용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정, 또는 피하로부터 용기를 꺼내고 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정 중 어느 쪽이어도 좋다. 예를 들면 본원 실시예에서는 피하에 매립한 실리콘 튜브를 피부 절개에 의해 회수하고 튜브내에서 세포를 피펫에 의해 흡인·회수하였으나, 다른 방법을 사용해도 좋다.

피하에 매립한 상태의 용기로부터 세포 집단을 회수하는 방법으로서는, 피하에 매립하는 용기의 한쪽 끝을 튜브 형태로 연장시켜 체외로 꺼낸 상태에서 고정시키고 세포 회수시에 튜브에 주사기를 고정시키고 음압에 의해 세포를 흡인·회수한다. 그 후에 HMGB1용액 등 세포 유도액을 생체내에 유치한 튜브내에 재주입함으로써 반복해서 피하에 매립한 용기내의 세포를 회수할 수 있다. 이 방법을 가능하게 하는 형상의 용기를 생체내에 유치한다.

본 발명에서 회수한 세포 집단으로부터 골수세포를 단리하는 공정은, 예를 들면 회수한 세포 집단에서 배양용기에 부착하는 부착성 세포를 단리함으로써 수행된다.

기타 방법으로서는, 예를 들면 체외로 꺼낸 튜브내에서 피펫 조작에 의해 회수한 세포를 세포 표면 마커 CD44, PDGFRα, PDGFRβ 중 적어도 하나와 반응시키고 다른 형광종으로 표식된 항체와 반응시킨 후 셀 분류기를 사용하여 각각의 형광 유무를 지표로 특정 세포 표면 마커를 가진 세포 집단을 분리함으로써 수행된다.

또 다른 방법으로서는, 예를 들면 형광 대신에 금속입자를 고정시킨 항체를 사용하여 마찬가지로 각각의 세포 표면 마커와 반응시키고, 이 금속 부착 항체와 결합한 세포를 자력으로 튜브내에서 한쪽 벽에 흡착·고정시켜 항체와 비반응성의 세포는 충분히 용출시킨 후 자력을 없앰으로써 튜브내에 흡착된 목적 세포를 회수하는 방법(MACS)도 있다.

본 발명은 피하로부터 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수하는 방법으로서, 해당 세포 집단이 하기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 하기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물에 의해 골수로부터 해당 용기내로 동원되는 상기 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 피하에 매립된 용기로부터 회수된 세포 집단으로부터, 골수세포를 단리하는 공정을 포함한 골수세포를 수집하는 방법으로서, 해당 세포 집단이 하기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 하기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물에 의해 골수로부터 해당 용기내로 동원되는 상기 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포 집단에서 골수세포를 단리하는 공정 전에 체외로 꺼낸 해당 용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정을 포함해도 좋다.

(a)HMGB1 단백질

(b)HMGB1 단백질을 분비하는 세포

(c)HMGB1 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(d)HMGB2 단백질

(e)HMGB2 단백질을 분비하는 세포

(f)HMGB2 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(g)HMGB3 단백질

(h)HMGB3 단백질을 분비하는 세포

(i)HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(j)S100A8 단백질

(k)S100A8 단백질을 분비하는 세포

(l)S100A8 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(m)S100A9 단백질

(n)S100A9 단백질을 분비하는 세포

(o)S100A9 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터

(p)히알루론산

(q)세포 또는 조직 추출액

(r)세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합분획

본 발명은 하기 공정을 포함하고, 공정(I) 다음에 상기 (a) 내지 (r)중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 상기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한, 세포 집단을 회수하는 방법을 제공한다:

(I)용기를 피하에 매립하는 공정

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정.

공정(II)에 대해서는 체내에 있는 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋고, 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋다.

또한, 본 발명은 하기 공정을 포함하고 공정(I) 다음에 상기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 상기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한, 골수세포를 수집하는 방법을 제공한다:

(I)용기를 피하에 매립하는 공정

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정

(III)회수한 세포 집단으로부터 골수세포를 단리하는 공정.

공정(II)에 대해서는 체내에 있는 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋고, 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋다.

본 발명은 하기 공정을 포함한, 용기가 상기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 상기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 함유한, 세포 집단을 회수하는 방법을 제공한다:

(I)용기를 피하에 매립하는 공정

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정

공정(II)에 대해서는 체내에 있는 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋고 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋다.

또한, 본 발명은 하기 공정을 포함한, 용기가 상기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 상기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 함유한, 골수세포를 수집하는 방법을 제공한다:

(I)용기를 피하에 매립하는 공정

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정

(III)회수한 세포 집단으로부터 골수세포를 단리하는 공정.

공정(II)에 대해서는 체내에 있는 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋고, 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋다.

또한 본 발명은 하기 공정을 포함하고, 용기가 상기 (a) 내지 (r)중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 상기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 함유하고, 또한 공정(I) 다음에 상기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 상기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한, 세포 집단을 회수하는 방법을 제공한다:

(I)용기를 피하에 매립하는 공정

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정.

공정(II)에 대해서는 체내에 있는 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋고, 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋다.

또한, 본 발명은 하기 공정을 포함하고, 용기가 상기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 상기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 함유하고, 또한 공정(I) 다음에 상기 (a) 내지 (r) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 상기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물을 혈관 또는 근육에 투여하는 공정을 포함한, 골수세포를 수집하는 방법을 제공한다:

(I)용기를 피하에 매립하는 공정

(II)용기로부터 세포 집단을 회수하는 공정

(III)회수한 세포 집단으로부터 골수세포를 단리하는 공정.

공정(II)에 대해서는 체내에 있는 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋고 체외로 꺼낸 용기로부터 세포 집단을 회수해도 좋다.

본 발명에서의 HMGB1 단백질로서는, 서열번호:1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 예시할수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 HMGB1 단백질에는 서열번호:1,3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 그와 같은 단백질로서는, 예를 들면 1)서열번호:1,3 또는 5에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호:1,3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호:2,4 또는 6에 기재된 염기서열을 포함한 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈되는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호:1,3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.

본 발명에서의 HMGB2 단백질로서는, 서열번호:7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 예시할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 HMGB2 단백질에는 서열번호:7,9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 그와 같은 단백질로서는, 예를 들면 1)서열번호:7,9 또는 11에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호:7,9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호:8,10 또는 12에 기재된 염기서열을 포함한 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈되는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호:7,9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.

본 발명에서의 HMGB3 단백질로서는, 서열번호:13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 예시할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 HMGB3 단백질에는 서열번호:13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 그와 같은 단백질로서는, 예를 들면 1)서열번호:13 또는 15에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호:13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호:14 또는 16에 기재된 염기서열을 포함한 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈되는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호:13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.

본 발명에서의 S100A8 단백질로서는 서열번호:17,19 또는 21에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 예시할수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 S100A8 단백질에는 서열번호:17,19 또는 21에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 그와 같은 단백질로서는, 예를 들면 1)서열번호:17,19 또는 21에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호:17,19 또는 21에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호:18,20 또는 22에 기재된 염기서열을 포함한 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈되는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호:18,20 또는 22에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.

본 발명에서의 S100A9 단백질로서는, 서열번호: 23, 25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 예시할수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 S100A9 단백질에는 서열번호: 23, 25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 그와 같은 단백질로서는, 예를 들면 1)서열번호: 23, 25 또는 27에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호: 23, 25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호: 24, 26 또는 28에 기재된 염기서열을 포함한 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈되는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호: 23, 25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.

서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질은 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질의 호모로그 혹은 파라로그일 수 있다. 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 당업자에 의해 주지의 방법(실험의학 별책·유전자 공학 핸드북, pp246-251, 요도샤, 1991년 발행)으로 단리할 수 있다.

서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질로서는, 골수 유래 세포의 유도 활성을 가진 단백질을 들 수 있다.

서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 천연에 존재하는 단백질을 포함한다. 일반적으로 진핵 생물의 유전자는, 인터페론 유전자 등에서 알려진 것처럼 다형현상(polymorphism)을 가진다. 이 다형현상에 의해 생긴 염기서열 변화에 의해 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되는 경우가 있다. 이와 같이 자연히 존재하는 단백질로서, 또한 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지고, 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 본 발명의 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질에 포함된다.

또한, 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한 단백질이기만 하면 인위적으로 제조된 변이 단백질도 본 발명에 포함된다. 주어진 염기서열에 대해 랜덤으로 변이를 가하는 방법으로서는, 예를 들면 DNA의 아질산 처리에 의한 염기쌍의 치환이 알려져 있다(Hirose, S.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:7258-7260, 1982). 이 방법에서는 변이를 도입하고자 하는 세그먼트를 아질산 처리함으로써 특정 세그먼트내에 랜덤으로 염기쌍의 치환을 도입할 수 있다. 혹은 또 목적으로 하는 변이를 임의의 장소에 일으키는 기술로서는 gapped duplex법 등이 있다(Kramer W. and Fritz HJ., Methods in Enzymol., 154:350-367, 1987). 변이를 도입해야 할 유전자를 클로닝한 환형 2쇄의 벡터를 1쇄로 하고, 목적으로 하는 부위에 변이를 가진 합성 올리고뉴클레오티드를 하이브리다이즈시킨다. 제한 효소에 의해 절단하여 선형화시킨 벡터 유래의 상보1쇄 DNA를 상기 환형1쇄 벡터에 어닐링시키고 상기 합성 뉴클레오티드간의 갭을 DNA폴리메라아제로 충전하고 또한 라이게이션함으로써 완전한 2쇄 환형벡터로 한다.

개변되는 아미노산의 수는 전형적으로는 50 아미노산 이내이며, 바람직하게는 30아미노산 이내이고, 더욱 바람직하게는 5 아미노산 이내(예를 들면, 1 아미노산)라고 생각된다.

아미노산을 인위적으로 치환할 경우 성질이 유사한 아미노산으로 치환하면 원래의 단백질 활성이 유지되기 쉽다고 생각된다. 본 발명의 단백질에는 상기 아미노산 치환에서 보존적 치환이 가해진 단백질로서, 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질이 포함된다. 보존적 치환은 단백질의 활성에 중요한 도메인의 아미노산을 치환할 경우에 중요하다고 생각된다. 이와 같은 아미노산의 보존적 치환은 당업자에게는 잘 알려져 있다.

보존적 치환에 상당하는 아미노산의 그룹으로서는, 예를 들면 염기성 아미노산(예를 들면 리신, 알기닌, 히스티딘), 산성 아미노산(예를 들면 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전극성 아미노산(예를 들면 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 아미노산(예를 들면 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β분지 아미노산(예를 들면 트레오닌, 발린, 이소로이신) 및 방향족 아미노산(예를 들면 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 들 수 있다.

또한, 비보존적 치환에 의해 단백질의 활성 등을 보다 상승(예를 들면 항상적 활성화형 단백질 등을 포함한다)시키는 것도 생각할 수 있다.

기타 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 얻는 방법으로서, 하이브리다이제이션을 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 서열번호:2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26 또는 28에 나타낸 바와 같은 본 발명에 따른 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하는 DNA, 혹은 그 단편을 프로브로 하고, 이것과 하이브리다이즈할 수 있는 DNA를 단리한다. 하이브리다이제이션을 엄격한 조건하에서 실시하면, 염기서열로서는 상동성이 높은 DNA가 선택되고 그 결과로서 단리되는 단백질에는 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질과 기능적으로 동등한 단백질이 포함될 가능성이 높아진다. 상동성이 높은 염기서열이란, 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타낼 수 있다.

아울러 엄격한 조건이란, 구체적으로는 예를 들면 6×SSC, 40%포름아미드, 25℃에서의 하이브리다이제이션과 1×SSC, 55℃에서의 세정이라는 조건을 나타낼 수 있다. 엄격성은 염농도, 포름아미드의 농도 혹은 온도라는 조건으로 좌우되지만, 당업자라면 이러한 조건을 필요한 엄격성을 얻을 수 있도록 설정하는 것은 자명하다.

하이브리다이제이션을 이용함으로써 예를 들어 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질 이외의 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질의 호모로그를 코드하는 DNA의 단리가 가능하다.

서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 통상 서열번호:1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25 또는 27에 기재된 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다. 높은 상동성이란, 적어도 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상(예를 들면, 95% 이상)의 서열 동일성을 가리킨다. 염기서열이나 아미노산 서열의 동일성은 인터넷을 이용한 호몰로지 검색 사이트를 이용하여 수행할 수 있다[예를 들면 일본DNA데이터 뱅크(DDBJ)에서 FASTA, BLAST, PSI-BLAST 및 SSEARCH 등의 상동성 검색을 이용할 수 있다[예를 들면 일본DNA데이터 뱅크(DDBJ)의 웹사이트의 상동성 검색(Search and Analysis)의 페이지; http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j. Html]. 또한, National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 BLAST를 사용한 검색을 할 수 있다(예를 들면 NCBI의 홈페이지 웹사이트의 BLAST의 페이지; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/;Altschul, S.F.et al., J.Mol.Biol., 1990, 215(3):403-10;Altschul, S.F.&Gish, W., Meth.Enzymol., 1996, 266:460-480;Altschul, S.F.et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402)].

예를 들면 Advanced BLAST 2. 1에서의 아미노산 서열의 동일성 산출은 프로그램에 blastp를 사용하여 Expect값을 10, 필터는 전부 OFF시키고 Matrix에 BLOSUM62를 사용하여 Gap existence cost, Per residue gap cost 및 Lambda ratio를 각각 11, 1, 0.85(디폴트값)로 설정하고 검색하여 동일성(identity)의 값(%)을 얻을 수 있다(Karlin, S. and S.F.Altschul(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68; Karlin, S.and S. F. Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7).

본 발명에 의한 단백질, 또는 그 기능적으로 동등한 단백질은 당쇄 등의 생리적인 수식, 형광이나 방사성 물질과 같은 표식, 혹은 다른 단백질과의 융합이라는 각종 수식을 더한 단백질일 수 있다. 특히 후술하는 유전자 재조합체에서는 발현시키는 숙주에 의해 당쇄에 의한 수식에 차이가 생길 가능성이 있다. 그러나 가령 당쇄의 수식에 차이가 있다고 해도 본 명세서중에 개시된 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질과 같은 성상을 나타내는 것이라면 모두 본 발명에 의한HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질 또는 기능적으로 동등한 단백질이다.

HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질은 생체 재료뿐만 아니라 이것을 코드하는 유전자를 적당한 발현계에 재조합시켜 유전자 재조합체(recombinant)로서 얻을 수도 있다. HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 유전자 공학적인 수법에 의해 얻기 위해서는 상술한 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하는 DNA를 적당한 발현계에 재조합시켜 발현시키면 된다. 본 발명에 응용 가능한 호스트/벡터계로서는, 예를 들면 발현 벡터 pGEX와 대장균을 나타낼 수 있다. pGEX는 외래 유전자를 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있기(Gene, 67:31-40, 1988) 때문에 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하는 유전자를 조합시킨 pGEX를 히트 쇼크로 BL21과 같은 대장균주에 도입하고 적절한 배양 시간후에 isopropylthio-β―D-galactoside(IPTG)를 첨가하여 GST융합HMGB1, GST융합HMGB2, GST융합HMGB3, GST융합S100A8 또는 GST융합S100A9 단백질의 발현을 유도한다. 본 발명에 의한 GST는 글루타티온세파로스4B에 흡착되기 때문에 발현 생성물은 어피니티 크로마토그래피에 의해 용이하게 분리·정제할 수 있다.

HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질의 재조합체를 얻기 위한 호스트/벡터계로서는, 이밖에도 다음과 같은 것을 응용할 수 있다. 우선 세균을 호스트에 이용할 경우에는 히스티딘 태그, HA태그, Flag tag 등을 이용한 융합 단백질의 발현용 벡터가 시판되고 있다. 효모에서는, Pichia속 효모가 당쇄를 구비한 단백질의 발현에 유효하다는 것이 공지되어 있다. 당쇄의 부가라는 점에서는 곤충 세포를 호스트로 하는 배큘로바이러스 벡터를 이용한 발현계도 유용하다(Bio/Technology, 6: 47-55, 1988). 또한 포유동물의 세포를 이용하여 CMV, RSV 혹은 SV40 등의 프로모터를 이용한 벡터의 트랜스펙션이 이루어지고 있으며, 이들 호스트/벡터계는 모두 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질의 발현계로서 이용할 수 있다. 또한, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 이용하여 유전자를 도입할 수도 있다.

얻어진 본 발명의 단백질은 숙주 세포내 또는 세포외(배지 등)로부터 단리되어 실질적으로 순수하고 균일한 단백질로서 정제할 수 있다. 단백질의 분리, 정제는 통상의 단백질 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 되고 전혀 한정되지 않는다. 예를 들면 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외 여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 단백질을 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그래피로서는, 예를 들면 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 액상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R.Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질은 실질적으로 정제된 단백질인 것이 바람직하다. 여기에서 「실질적으로 정제된」이란, 본 발명의 단백질의 정제도(단백질 성분 전체에서의 본 발명의 단백질의 비율)이 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100% 또는 100%에 가까운 것을 의미한다. 100%에 가까운 상한은 당업자의 정제 기술이나 분석 기술에 의존하는데, 예를 들면 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99% 등이다.

또한, 상기 정제도를 갖는 것이라면, 어떠한 정제 방법에 의해 정제되더라도 실질적으로 정제된 단백질에 포함된다. 예를 들면 상술한 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외 여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택 또는 조합함으로써 실질적으로 정제된 단백질을 예시할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서의 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 방출 또는 분비하는 세포로서는, 기본적으로 생체내의 모든 조직 유래 세포가 해당된다. 채취 및 배양이 용이한 세포로서는 섬유아세포(예를 들면 정상 피부 섬유아세포 및 그에 유래하는 주화세포)를 예시할수 있지만 여기에 한정되지는 않는다. 또한, HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 분비하는 세포는 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하는 DNA, 혹은 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하는 DNA에 분비 신호를 코드하는 DNA(ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC;서열번호:29)를 결합시킨 DNA를 공지의 발현 벡터나 유전자 치료용 벡터에 삽입함으로써 제조된 벡터를 섬유아세포(예를 들면 정상 피부 섬유아세포 및 그에 유래하는 주화세포) 등의 포유류 세포나 곤충 세포, 기타 세포에 도입함으로써도 제조할 수 있다. 분비 신호를 코드하는 DNA로서는 상기 서열을 갖는 DNA가 예시되지만 이에 한정되지는 않는다. 또한, 이들 세포가 유래하는 동물종에 특별히 제한은 없지만 벡터가 투여되는 대상 동물종의 세포, 대상 자신의 세포, 혹은 벡터가 투여되는 대상의 혈연에 해당하는 사람에게 유래하는 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서의 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하는 DNA는 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하기만 하면 cDNA여도 좋고, 게놈 DNA여도 좋고 또한, 천연 DNA여도 좋고 인공적으로 합성된 DNA여도 좋다. HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하는 DNA는 통상 벡터에 삽입된 상태로 투여된다.

본 발명의 벡터로서는, 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌치바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노어소시에이트바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 센다이바이러스엔벨로프 벡터, 유두종바이러스 벡터 등을 예시할 수 있는데 이에 한정되지는 않는다. 해당 벡터에는 유전자 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터 DNA 서열이나 유전자 발현을 제어하는 인자, DNA의 안정성을 유지하기 위해 필요한 분자가 포함되어도 좋다.

아울러 본 발명에서는 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질의 부분 펩티드로서, 골수 유래 세포의 유도 활성을 가진 펩티드, 해당 부분 펩티드를 분비하는 세포 또는 해당 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터를 이용할 수도 있다.

히알루론산은 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산의 2당이 결합·연결된 글리코사미노글리칸(무코다당)이며 히알노난이라고도 불린다. 화학명은 [→3]-2acetamiod-2deoxy-β―D-glucopyranosyl-(1→4)β―D-glucopyranosyluronic acid-(1→]n로 표기된다. 천연 히알루론산의 대부분은 분자량 수십만 이상의 분자량을 가진 고분자 히알루론산이지만, 한편 인공적으로 2당부터 14당까지의 저분자 히알루론산을 제조할 수 있다. 예를 들면 의료분야에서는 관절강내에 주입하는 용도로 히알루론산나트륨으로서 사용되고 있다. 제조방법으로는, 유산균의 일종인 Streptococcus zooepidemicus에 생산시킨 히알루론산을 추출하여 정제하는 방법, 닭벼슬 등에서 추출하여 정제하는 방법 등이 있다. 히알루론산은 에스테르화, 과요오드산 산화, 이소우레아 커플링, 황산화 등 여러가지 수식을 할 수 있다. 또한, 에테르 가교, 에스테르 가교를 할 수도 있다. 이와 같은 수식을 함으로써 분해에 대해 안정화되거나 불용성이 되거나 스폰지 형태로 정형되어 물질을 서방화하는 성질을 부가할 수 있다. 또한, CD44는 히알루론산의 리셉터로서, CD44를 세포 표면에 가진 중간엽 줄기세포에 대해 히알루론산은 유주 활성을 갖는다.

본 발명의 방법에서 이용되는 세포 또는 조직 추출액은 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조할 수 있다.

용매에 침지되는 세포 또는 조직으로서는 특별히 제한은 없지만 조직 유래 세포, 조직 유래 세포로부터 수립된 주화세포(예를 들면, HeLa, HEK293을 예시할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다), 단리된 세포, 단리되지 않은 세포(예를 들면 단리된 조직중에 존재하는 세포), HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하는 DNA가 도입된 세포 등을 예시할 수 있다. 상기 조직으로서는 어떠한 조직이든 좋고, 예를 들면 생체 피부조직, 체내 생검(수술)조직(뇌, 폐, 심장, 간장, 위, 소장, 대장, 췌장, 신장, 방광, 비장, 자궁, 정소나 혈액 등)을 예시할 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다.

상기 용매로서는 생리식염수, PBS(Phosphate-버퍼ed saline), TBS(Tris-버퍼ed saline)를 예시할 수 있지만 이들에 제한되지 않는다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 시간으로는 세포 괴사가 유도되기 위해 필요·충분한 시간, 즉 1시간 내지 48시간(예를 들면 6시간 내지 48시간), 바람직하게는 12 내지 24시간이지만 이 시간에 한정되지는 않는다. 따라서 「세포를 용매에 침지하는 공정」은 「괴사가 유도되기 위해 필요·충분한 시간, 세포를 용매에 침지하는 공정」이나 「세포를 괴사시키는 공정」으로 바꿔 말할 수 있다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 온도는 4℃ 내지 25℃(예를 들면 4℃ 내지 8℃), 바람직하게는 4℃를 예시할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 pH는 pH7 내지 8, 바람직하게는 pH7.5를 예시할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 완충액의 성분으로서 10mM∼50mM, 바람직하게는 10∼20mM농도의 인산완충액을 들 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서는 세포나 조직을 용매에 침지한 후에 세포나 조직을 포함한 용매로부터 해당 세포나 해당 조직을 제거할 수도 있다. 용매로부터 세포나 조직을 제거하는 방법은 당업자에게 주지의 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 4℃∼25℃(예를 들면 4℃), 또한, 중력 가속도 10G∼100000G(예를 들면 440G)로 원심분리하고 상청액을 분리함으로써 용매로부터 세포나 조직을 제거할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 해당 상청액을 세포나 조직 추출액으로서 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조되는 세포 또는 조직 추출액으로는, 예를 들면 피부 추출액이나 말초혈 단핵구 추출액(말초혈 추출액)을 들 수 있지만 이들에 제한되지 않는다.

말초혈 추출액의 조정 방법은, 주사기 등을 사용하여 채혈한 후 냉동고나 액체질소, 드라이아이스 등으로 세포를 동결하고 그 후 0℃ 이상의 온도하에서 재융해한다. 또한 세포의 불용 성분을 제거하기 위해, 예를 들면 4℃∼25℃(예를 들면 4℃), 또한, 중력 가속도 10G∼100000G(예를 들면 440G)로 원심분리하고 상청액을 분리함으로써 용매로부터 세포의 불용 성분을 제거할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 해당 상청액을 세포나 조직 추출액으로서 이용할 수 있다. 세포의 불용 성분을 제거하기 위해서는 원심분리 조작 대신에 0.45㎛의 미세공을 가진 니트로셀룰로스 필터 등에 통과시킴으로써 불용 성분을 제거할 수 있다. 또한, 채혈한 말초혈을 3시간 내지 48시간 4℃의 상태로 둠으로써 세포의 괴사를 유발하여 말초혈중의 세포로부터 세포내 성분을 분비시킬 수 있다. 이후 중력 가속도 10G∼100000G(예를 들면 440G)로 원심분리하여 상청액을 분리함으로써 용매로부터 세포의 불용성분을 제거할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 해당 상청액을 세포나 조직 추출액으로서 이용할 수 있다. 세포의 불용 성분을 제거하기 위해서는 원심분리 조작 대신에 0.45㎛의 미세공을 가진 니트로셀룰로스 필터 등에 통과시킴으로써 불용 성분을 제거할 수 있다.

본 발명의 방법에서 이용되는 세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획은 하기 공정을 포함한 방법으로 제조할 수 있다:

(a)세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정,

(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정, 및

(c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획(헤파린 정제 분획, 헤파린 칼럼 정제 분획이라고도 표현 가능)을 용출하는 공정.

고정화 헤파린은, 헤파린을 불용성 담체에 공유 결합시킨 것이다. 상기 불용성 담체로서는 Sepharose 비즈(Sepharose 4B, Sepharose 6B 등: GE Healthcare)가 예시되는데 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서는 시판되는 고정화 헤파린(Hitrap Hepalin HP column: GE Healthcare)을 사용해도 좋다.

세포나 조직 추출액과 고정화 헤파린의 접촉 조건으로서는, PH7∼8 정도(바람직하게는 pH7.5), 염농도는 0∼200mM, 바람직하게는 100∼200mM 정도가 예시되지만 이들에 제한되지 않는다. 추출액과 고정화 헤파린이 접촉되는 시간은 특별히 한정되지 않지만 헤파린 결합 분획을 고정화 헤파린에 충분히 흡착시킨다는 관점에서는 5분 이상 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 온도로서는 4∼8℃, 바람직하게는 4℃를 들 수 있지만 이들에 제한되지 않는다. 또한, 고정화 헤파린에 흡착된 헤파린 결합 분획의 용출 조건으로서는 pH 7∼8 정도, 염농도 200∼1000mM(바람직하게는 1000mM 정도)가 예시되지만 이들로 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명의 방법에서 이용되는 상기 (a) 내지 (r)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물로서는, 예를 들면 히알루론산과 HMGB1 단백질, 히알루론산과 HMGB2 단백질, 히알루론산과 HMGB3 단백질, 히알루론산과 S100A8 단백질, 히알루론산과 S100A9 단백질, 히알루론산과 HMGB1 단백질과 HMGB2 단백질, 히알루론산과 HMGB2 단백질과 HMGB3 단백질, 히알루론산과 HMGB1 단백질과 HMGB3 단백질, 히알루론산과 HMGB1 단백질과 HMGB2 단백질과 HMGB3 단백질, 히알루론산과 S100A8 단백질과 S100A9 단백질, 히알루론산과 HMGB1 단백질과 S100A8 단백질, 히알루론산과 HMGB2 단백질과 S100A8 단백질, 히알루론산과 HMGB3 단백질과 S100A8 단백질, 히알루론산과 HMGB1 단백질과 S100A9 단백질, 히알루론산과 HMGB2 단백질과 S100A9 단백질, 히알루론산과 HMGB3 단백질과 S100A9 단백질, 세포 또는 조직 추출액과 히알루론산, 세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획과 히알루론산 등의 조합을 들 수 있고, 바람직하게는 세포나 조직 추출액과 히알루론산의 혼합액이지만 이에 한정되지는 않는다. 혼합의 비율은 용매에 용해된 상태에서 부피비로서 가장 적은 성분을 1로 한 경우 10000배까지 다른 성분을 혼합할 수 있지만, 바람직하게는 제일 적은 성분을 1로 한 경우 다른 성분은 1 내지 10배 늘릴 수 있다.

본 발명에서의 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질의 기원이 되는 동물종으로서는 인간 또는 비인간 동물을 들 수 있으며, 예를 들면 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 몰모트 등을 예시할 수 있지만 상기 추출액 등이 투여되는 동물종과 같은 동물종인 것이 바람직하다.

본 발명의 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 투여할 경우 그 투여 방법은 혈관내 또는 근육으로의 비경구 투여이다. 상기 투여 방법으로는 구체적으로는 주사 투여를 들 수 있다. 예를 들면 혈관내 주사(동맥내 주사, 정맥내 주사 등), 근육내 주사, 피하주사 등에 의해 본 발명의 약제를 혈관, 근육 또는 피하(예를 들면 피하에 매립한 용기 안이나 용기의 근방)에 투여할 수 있다. 또한, 경피 흡수 가능한 접착제나 외용제에 의해 서서히 흡수시킬 수도 있다.

또한, 투여 대상의 연령, 증상에 의해 적절히 투여 방법을 선택할 수 있다. HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 투여할 경우, 예를 들면 1회의 투여에 대해서 체중1㎏당 0.0000001㎎ 내지 1000㎎의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 혹은 예를 들면 대상당 0.00001 내지 100000㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 분비하는 세포나HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 유전자 치료용 벡터를 투여할 경우에도 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질의 분량이 상기 범위내가 되도록 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명에서의 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질의 투여량은 이러한 투여량에 제한되지는 않는다.

투여시에는 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있으며(예를 들면 Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함해도 좋다. 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제등을 들 수 있는데 이들에 제한되지 않으며 기타 통상의 담체를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는 경질무수규산, 유당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로스칼슘, 카르멜로스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄지방산트리글리세라이트, 폴리옥시에틸렌경화피마자유60, 백설탕, 카복시메틸셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기염류 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 용기에 함유할 경우 추출액, 헤파린 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질을 용기에 주입하는 것은 다음과 같이 이루어진다. 구체적으로는 생리식염수에 각각의 용매를 용해하고 주사기나 피펫을 사용하여 수동(manual)으로 주입한다. 혹은 튜브 제조시에 기계적으로 주입한다.

또한, 용기에 함유되는 본 발명의 추출액, 헤파린 결합분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8 또는 S100A9 단백질에 대해서 용기에 대한 주입량에 대해서는 세포 회수용 용기의 용적에 따라 적절히 결정한다. 예를 들면 복부 피하지방내에 유치할 때에는 10㎖ 정도의 주입이 가능하고 기타 피하에 유치할 때에는 ∼수㎖가 예상된다.

본 발명은 상기 세포 집단을 회수하는 방법에 의해 회수되는 세포 집단을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 골수세포를 수집하는 방법에 의해 회수되는 골수세포를 제공한다.

본 발명의 세포 집단 또는 골수세포는 유전성 질환, 피부질환(열상, 피부궤양 등), 뇌신경질환(뇌경색, 알츠하이머병, 척수손상, 뇌손상 등), 순환기 질환(심근경색, 심근증, 동맥색전증 등), 골연골 질환(골절, 류마티스 등) 등의 조직 손상을 동반하는 질환에 대해 투여함으로써 치료할 수 있다. 채취 후 직접 정맥내, 동맥내 등의 순환혈류내에 투여하는 것, 또는 손상조직 부위에 직접 투여함으로써 조직을 재생할 수 있다. 또는 배양용기, 배양 플라스크를 사용하여 배양 조작을 가한 후에 세포를 확산시킨 상태, 쉬트 형태로 정형한 상태, 세포 덩어리를 형성한 상태로 투여함으로써 조직을 재생할 수 있다. 투여량은 세포 1개 내지 10¹⁴개 투여할 수 있지만, 바람직하게는 10²개 내지 10¹⁰개를 투여할 수 있다. 따라서 본 발명은 또한, 상기 세포 집단을 회수하는 방법에 의해 회수되는 세포 집단 또는 상기 골수세포를 수집하는 방법에 의해 회수되는 골수세포를 함유한 조직 재생제를 제공한다.

재생되는 조직으로는 특별히 제한은 없으며 손상된 조직이기만 하면 어떠한 조직이어도 좋고, 예를 들면 생체 피부조직, 체내 생검(수술)조직(뇌, 폐, 심장, 간장, 위, 소장, 대장, 췌장, 신장, 방광, 비장, 자궁, 정소나 혈액 등)을 예시할 수 있다. 특히 본 발명의 약제는 체외에서 직접 약제를 투여하기 힘든 조직(뇌, 심장 등)을 재생하기 위해 유효하게 이용된다. 본 발명에서 손상조직으로는 허혈, 관류저하·저산소 상태를 초래하는 여러가지 병태, 외상, 열상, 염증, 자기 면역, 유전자 이상 등에 의해 손상된 조직을 들 수 있지만,이들 원인으로 한정되지는 않는다. 또한, 손상조직에는 괴사 조직도 포함된다.

본 발명에서의 조직으로서는, 골수 유래 세포가 분화 가능한 조직이기만 하면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 피부조직, 골조직, 연골조직, 근조직, 지방조직, 심근조직, 신경계조직, 폐조직, 소화관조직, 간·담·췌조직, 비뇨·생식기 등 생체내의 모든 조직을 예시할 수 있다. 또한, 상기 조직 재생제를 사용함으로써 난치성 피부궤양, 피부창상, 수포증, 탈모증 등의 피부질환은 물론 뇌경색, 심근경색, 골절, 폐경색, 위궤양, 장염, 등의 조직 손상에 대한 치료가 가능해진다. 상기 조직 재생제가 투여되는 동물종으로서는 인간 또는 비인간 동물을 들 수 있으며, 예를 들면 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 몰모트 등을 예시할 수 있는데 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약제는 당뇨병 환자에 대해 투여할 수 있다. 당뇨병에서의 피부의 합병증인 난치성 피부궤양은 정상인의 피부궤양에 비해 치유가 어려운 것으로 알려져 있는데 본 발명의 약제는 이와 같은 당뇨병 환자에게도 유효하게 이용된다.

본 발명의 조직 재생제는 채취 후 생리적 식염수를 사용하여 세포를 확산시켜 정맥내, 동맥내 등의 순환혈류내에 투여함으로써 조직을 재생할 수 있다. 또는 손상조직 부위의 표면에 바르거나 붙여서 투여함으로써 조직을 재생할 수 있다. 또한 손상 부위의 내부에 주사기 등을 사용하여 주입함으로써 조직을 재생할 수도 있다. 또한, 배양용기, 배양 플라스크를 사용하여 배양 조작을 가한 후에 세포를 확산시킨 상태, 쉬트형으로 정형한 상태, 세포 덩어리를 형성한 상태로 손상 부위에 투여함으로써 조직을 재생할 수 있다. 투여량은 세포 1 개 내지 10¹⁴ 개 투여할수 있는데 바람직하게는 10²개 내지 10¹⁰개를 투여할 수 있다.

아울러 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술문헌은 참조로서 본 명세서에 추가된다.

도 1은 생체내 기능적 세포의 고효율 회수법의 개략도이다. 생체내 기능성 세포의 특이적 동원 인자를 충전한 저자극성 튜브(실리콘 튜브 등)를 생체내에 유치함으로써 말초 순환중 혹은 조직중에 존재하는 기능적 세포가 선택적으로 튜브내에 동원된다.
도 2는 튜브내에 집적된 세포(tube-entrapping cells;TECs)가 GFP양성 임을 도시한 사진이다.
도 3은 TECs의 배양 개시 24 시간 후의 사진이다. 왼쪽 사진은 배양 플라스틱 샤알레에 부착되어 증식하고 있는 섬유아세포양 세포 및 상피세포양 세포의 명시야상(明視野像)을, 오른쪽 사진은 그 암시야에서의 GFP형광상을 도시한다.
도 4는 튜브내로부터 회수한 TECs의 골아세포 분화능력을 평가한 사진이다. 튜브에서 회수한 세포를 골아세포 분화 유도 배지중에서 배양한 결과, 약 2주일만에 알리자린 레드 염색 양성 골아세포로의 분화가 확인되었다.
도 5는 튜브내에서 회수한 TECs의 지방세포 분화능력을 평가한 사진이다. 튜브에서 회수한 세포를 지방세포 분화 유도 배지중에서 배양한 결과, 약 2주일만에 오일 레드 염색 양성 지방세포로의 분화가 확인되었다.
도 6은 튜브내에서 회수한 TECs의 표피 세포 분화능력을 평가한 사진이다. 튜브에서 회수한 세포를 표피 세포 분화 유도 배지 중에서 배양한 결과, 약 2주일만에 표피 세포 특이적 케라틴 5를 발현하는 각화세포로의 분화가 확인되었다.
도 7은 PDGFRα 및 CD44의 TECs에서의 발현을 검토한 도면이다. PDGFRα양성 및 CD44양성 세포가 튜브내에 회수된 것이 확인되었다.
도 8은 신생 마우스 피부 추출액중의 HMGB패밀리를 Western blot법을 사용하여 검출한 사진이다.
도 9는 HMGB1발현 벡터의 도면이다.
도 10은 HEK293세포에 발현시킨 정제 재조합 Flag tag-HMGB패밀리 융합 단백질의 Western blot의 결과를 도시한 사진이다.
도 11은 보이덴 챔버를 사용한 재조합 HMGB1·HMGB2·HMGB3의 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 도시한 도면이다. 모든 재조합 단백질은 대조군에 비해 유주 활성을 나타냈다.
도 12는 마우스의 피부궤양 치료 모델에서의 HMGB패밀리에 의한 치료 결과를 도시한 도면이다. HMGB1·HMGB2·HMGB3 모두 대조군에 비해 유의적으로 궤양 면적의 축소 효과를 나타냈다.
도 13은 인간 HMGB1 및 인간 피부 추출액이 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성을 보이덴 챔버를 사용하여 확인한 사진이다.
도 14는 마우스 심장, 마우스 뇌 및 마우스 피부 추출액 중의 골수 중간엽 줄기세포 유도 활성 물질을 헤파린 칼럼으로 정제하고 보이덴 챔버를 사용하여 활성을 확인한 사진이다.
도 15는 배양 세포주 HEK293 및 HeLa 추출액의 인간 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 보이덴 챔버법을 사용하여 확인한 사진이다. 모든 배양 세포주가 인간 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 나타냈다.
도 16은 A는 마우스를 뇌정위 고정 장치에 고정시키고 메스로 두부 한가운데를 절개하고 드릴을 사용하여 천두(穿頭)한 사진이다. B는 뇌에 주사기를 사용하여 음압을 걸고 뇌조직을 일부 흡인한 사진이다. C는 피브린 접착제(피브리노겐)에 용해한 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획을 5㎕ 주입하고, 다음에 피브린 접착제(트롬빈)를 5㎕ 주입한 후의 사진이다. D 및 E는 뇌손상 모델 치료 후 2주일 후의 사진이다. 대조군D에 비해 피부 추출액으로의 헤파린 칼럼 정제 분획에 의한 치료군 E에서 GFP 양성세포의 집적이 인정되었다. F 및 G는 뇌손상 모델 치료 후 6주일 후의 사진이다. 대조군 F에 비해 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획에 의한 치료군G에서 GFP양성 세포의 집적이 인정되었다.
도 17은 보이덴 챔버를 사용한 피부 추출액의 골수 유래 중간엽 줄기세포 유주능력 활성 측정 결과를 도시한 사진이다. 보이덴 챔버의 상조(上槽)내로부터 8㎛의 미세공을 가진 폴리카보네이트 멤브레인막의 미세공을 통과하여 피부 추출액을 포함한 하조(下槽)쪽으로 유주하고, 막하조쪽에 부착되어 있는 골수 중간엽 줄기세포를 청색 색소로 염색한 상이다. 하층에는 2일령 마우스 및 6주령 마우스로부터 채취한 피부의 추출액을 넣었다.
도 18은 피부 추출액중의 S100A8, S100A9의 단백질의 존재를 Western blot법으로 확인한 도면이다.
도 19는 피부 추출액중의 Heparin결합 단백질을 Heparin affinity column으로부터 NaCl농도 경사에 의해 용출한 결과를 도시한 사진이다. 각각의 프랙션의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분획하여 은염색으로 검출하였다.
도 20은 보이덴 챔버를 사용한 피부 추출액의 골수 유래 중간엽 줄기세포 유주능력 활성 측정 결과를 도시한 사진이다. 보이덴 챔버 상조내로부터 막위의 미세공을 통과하여 피부 추출액의 헤파린 결합된 각 분획(하조쪽)으로 유주하고, 막하조쪽에 부착되어 있는 골수 중간엽 줄기세포를 청색 색소로 염색한 상이다.
도 21은 피부 추출액의 헤파린 결합된 각 분획 중의 S100A8, S100A9 단백질의 존재를 Western blot법을 사용하여 검출한 결과를 도시한 사진이다.
도 22는 S100A8, S100A9발현 벡터의 도면이다.
도 23은 보이덴 챔버를 사용한 피부 추출액의 골수 유래 중간엽 줄기세포 유주능력 활성 측정 결과를 도시한 사진이다. 보이덴 챔버 상조내로부터 막위의 미세공을 통과하여 재조합 GST-S100A8, GST-S100A9, 피부 추출액을 각각 포함한 하층쪽으로 유주하고 막하조쪽에 부착되어 있는 골수 중간엽 줄기세포를 청색 색소로 염색한 상이다.
도 24는 A는 마우스의 꼬리정맥(尾靜脈)으로부터 GST-S100A8, GST-S100A9를 투여하고 12시간후 말초혈중의 CD45음성 세포의 분획에 대해 CD44, PDGFRα, PDGFRβ의 FACS를 수행한 도면이다. B는 FACS의 결과를 토대로 하여 GST-S100A8, GST-S100A9투여 12시간후 말초혈중의 CD45음성 CD44양성 PDGFRα양성 세포 혹은 CD45음성 CD44양성 PDGFRβ양성 세포의 출현을 정량적으로 그래프화한 도면이다.
도 25는 정상 마우스에서의 S100A8의 피부궤양 치료 효과를 도시한 도면이다.
도 26은 당뇨병 마우스에서의 S100A8의 피부궤양 치료 효과를 도시한 도면이다.
도 27은 피부 추출액, 말초혈 추출액에 의해 디바이스내에 동원한 세포에 의한 피부궤양의 치료 효과를 도시한 도면이다.
도 28은 말초혈 추출액의 헤파린 어피니티 칼럼 결합 성분에 의해 디바이스내에 동원한 골수세포를 형광 현미경으로 검출한 도면이다.
도 29는 말초혈 추출액의 헤파린 어피니티 칼럼 결합 성분에 의해 디바이스내에 동원한 골수세포를 형광 현미경으로 검출하고 화상 처리 소프트를 사용하여 세포수를 정량화한 그래프이다.
도 30은 S100A8, HMGB1, HMGB2, HMGB3각각을 사용하여 디바이스내에 동원한 골수 유래 세포(GFP양성 세포)를 형광 현미경으로 검출한 도면이다(A:S100A81, B:HMGB1, C:HMGB2, D:HMGB3, E:음성대조군).
도 31은 S100A8, HMGB1, HMGB2 각각을 사용하여 디바이스내에 동원한 골수 유래 세포에 의한 BALB/cAJcl-nu/nu에 만든 피부궤양에 대한 치료 효과를 도시한 도면이다.
도 32는 HMGB1발현 벡터의 도면이다.
도 33은 마우스 꼬리정맥으로부터 피부 추출액(SE)을 투여하여 말초혈을 채취하는 도면이다.
도 34는 피부 추출액(SE)을 투여후 12시간후의 마우스 말초혈 단핵구(球) 분획을 항마우스PDGFRα항체, 항마우스CD44항체로 형광 표식하고 유세포 분석기로 분획한 도면이다. 상단 3개는 음의 대조군의 PBS투여군(n=3), 하단 3개는 피부 추출액(SE) 투여군(n=3)이다. 종축은 CD44의 발현량을, 횡축은PDGFRα의 발현량을 나타내고 있다. 파란 선으로 둘러싼 부분이 CD44양성이면서 PDGFRα양성 세포군을 나타내며, 피부 추출액 투여군(SE)에서 PBS군에 비해 증가된다.
도 35는 마우스 꼬리정맥으로부터 HMGB1을 투여하여 말초혈을 채취하는 도면이다.
도 36은 HMGB1을 투여후 12시간된 마우스 말초혈 단핵구 분획을 항마우스PDGFRα항체, 항마우스CD44항체로 형광 표식하고 유세포 분석기로 분획한 도면이다. 왼쪽은 음의 대조군의 PBS투여 마우스, 오른쪽은 HMGB1투여 마우스의 도면이다. 종축은 CD44의 발현량을, 횡축은 PDGFRα의 발현량을 나타내고 있다. 파란 선으로 둘러싼 부분이 CD44양성이면서 PDGFRα양성 세포군을 나타내고, HMGB1투여 마우스에서 PBS투여 마우스에 비해 증가된다.
도 37은 A는 CD44 및 PDGFRα를 가진 세포의 존재 빈도를 나타낸 유세포 분석기의 결과를 도시한 도면이다. 말초혈중의 PDGFRα양성이면서 CD44양성 세포 및 PDGFRα양성이면서 CD44음성 세포의 모든 세포군이 HMGB1투여에 의해 증가된다. B는 PDGFRα양성이면서 CD44양성세포, C는 PDGFRα양성이면서 CD44음성 세포에 대해서 각각 PBS투여군과 HMGB1투여군에서 말초혈중의 출현 빈도를 비교한 결과를 도시한 도면이다. 모든 세포군은 HMGB1투여군에서 통계적으로 유의미하게 증가되었다.

<실시예>

이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예로 제한되지는 않는다.

[실시예 1]

목적: 생체내 조직에 극소수 존재하는 줄기세포 등의 기능적 세포를 저침습 및 고효율로 회수하기 위한 신규 기술 개발

방법: 상기 목적에 대해 하기 방법에 의해 연구를 하였다.

1)8주령 마우스(수컷)에 방사선(10Gy) 조사한 후 Green fluorescent protein(GFP) 트랜스제닉 마우스 유래 골수세포(5×10⁶개/0.1㎖ 생리적 인산 완충용액pH7. 4)를 꼬리정맥으로부터 이식하여 GFP골수 이식 마우스를 만들었다.

2)생체내 저자극성 재료(실리콘)로 만들어진 튜브에 HMGB1, 히알루론산, 피부 추출액, 생리적 인산완충 용액(pH7.4)을 각각 충전하고 이것을 GFP골수 이식 마우스의 등부분 피하에 이식하였다(도 1).

3)2주일후에 이식 튜브를 꺼내어(도 2), 튜브내에 집적된 세포(tube-entrapping cells;TECs)를 회수한 후 10% 우태아혈청 함유 둘베코 배지(D-MEM)에서 37℃, 탄산가스 농도5%의 조건하에서 배양하였다.

4)TECs의 배양 밀도가 배양용기 바닥면적의 약 80%가 된 단계에서 배지를 골분화 유도 배지, 지방 분화 유도배지, 표피 분화 유도 배지 각각으로 교환하여 다시 배양을 계속하였다. 각각의 분화 유도 배지에서 배양 개시 2주일 후에 골분화는 알리자린 레드 염색, 지방 분화는 오일 레드 염색, 표피 분화는 케라틴5에 대한 면역 염색에 의해 평가하였다.

5)TECs에서의 platelet-derived growth factorα(PDGFRα양성, CD44양성 세포의 비율을 유세포 분석기에 의해 해석하였다.

결과: HMGB1, 히알루론산, 피부 추출액을 충전한 실리콘 튜브를 GFP골수 이식 마우스 피하에 이식한 결과 어떠한 용액을 충전한 경우에도 1주일만에 GFP양성의 골수 유래 세포(TECs)가 다수 튜브내에 집적되었다. 도 2에 HMGB1 충전 실리콘 튜브내에 집적된 GFP양성 세포상을 도시한다. 한편 인산완충액을 충전한 실리콘 튜브에서는 회수된 부착성 TECs의 수는 유의적으로 적었다. HMGB1 충전 실리콘 튜브로부터 회수한 세포를 배양한 결과, 배양 개시후 24 시간만에 배양용기에 부착되어 증식하는 부착성 TECs가 관찰되었다(도 3). 이들 HMGB1 충전 실리콘 튜브내로 유주한 부착성 TECs를 골분화, 지방 분화 및 표피 분화 유도 배지로 배양한 결과, 각각 알리자린 레드 양성 골아세포, 오일 레드 양성 지방세포, 케라틴 5양성 표피세포로의 분화능력을 나타내고, 부착성 TECs에 간엽계 및 상피계의 분화능력을 가진 세포 집단이 존재한다는 것이 명백해졌다(도 4∼6). 또한, 유세포 분석기에서 중간엽 줄기세포 표면에서 발현되는 것으로 알려져 있는 PDGFRα 및 CD44의 TECs에서의 발현을 검토한 결과, TECs의 약 60%가 PDGFRα 및 CD44양성인 것으로 나타났다(도 7).

또한, 히알루론산을 100ng/㎖(PBS)로 충전한 실리콘 튜브를 GFP골수 이식 마우스의 등부분 피하에 이식하고 2 주일후에 꺼내어 튜브내에 동원된 세포의 표면 마커를 FACS에서 해석한 결과 HMGB1 튜브에서 얻어진 TECs와 마찬가지로 약 60%가 CD44양성, PDGFRα양성의 P44세포이고, 골아세포나 지방세포 등의 간엽계 세포나 상피계 세포로의 분화능력을 나타냈다.

고찰: 이번 본 발명자들은 HMGB1, 히알루론산, 피부추출액을 각각 충전한 실리콘 튜브를 피하에 이식함으로써 매우 효율적으로 골 분화능력, 지방 분화능력, 표피 분화능력을 가진 골수 유래 TECs를 회수할 수 있다는 것을 발견하였다. 이들 골수 유래 TECs의 대부분이 중간엽 줄기세포 표면에서 발현하는 것으로 알려져 있는 PDGFRα 및 CD44를 발현하는 것, HMGB1, 히알루론산, 피부 추출액이 모두 중간엽 줄기세포 동원 활성을 갖는 것을 함께 감안하면 TECs에 골수 유래 중간엽 줄기세포가 선택적으로 동원되어 있다고 생각된다. 실리콘 튜브에 충전하는 용액을 선택함으로써 그 용액내에 포함되는 특정 기능세포 동원 활성 물질에 따라 선택적 및 고효율로 특정 생체내 기능 세포를 회수할 수 있게 된다. 이 새로운 발명 기술을 사용함으로써 골수에 바늘을 꽂아넣는 등의 고침습성 방법을 탈피하여 필요에 따른 생체내 기능 세포를 회수하고, 목적에 따른 주문 제작 재생 의료를 디자인할 수 있게 될 것으로 기대된다. 또한, 회수한 세포는 간세포 연구를 비롯한 많은 기초 연구 재료로서 제공 가능하여 기초적, 임상적 연구의 진전, 신약, 의료 기술의 진보에 크게 기여한다고 확신한다.

[실시예 2]

목적: 피하 디바이스에 동원한 골수 유래 세포의 피부궤양 치료 효과의 평가

방법:

1)체내 매립형 디바이스를 제조하였다.

2)골수 다능성 줄기세포 동원 인자를 함유한 피부 조직 추출액을 조제하기 위해 C57/BL6신생 마우스(2일령) 2마리에서 얻은 유리 피부조각을 생리적 인산완충액 pH7.4(PBS) 2㎖ 안에 침지하고 4℃에서 24시간 인큐베이션한 후 조직을 제거하기 위해 4℃에서 10분간 440G로 원심분리하여 상청액을 회수하여 피부 추출액을 제조하였다. 또한, 말초혈 단핵구 추출액을 조제하기 위해 4주령 C57/BL6마우스 2마리에서 말초혈 전혈을 채취한 후 PBS를 사용하여 전량을 4mL로 희석하였다. 원심관에 Ficoll-Paque Plus(GE)액을 3mL 삽입 후 그 위에 희석 혈액을 중층하였다. 100G(18℃)에서 10분간 원심분리하여 단핵구를 포함한 중간층을 새로운 원심관에 회수하였다. 회수한 중간층에서 Ficoll-Paque Plus액을 제거하기 위해 45mL의 PBS를 가하여 440G(18℃)에서 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하고, 또한, 재차 45mL의 PBS를 가하여 440G(18℃)에서 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 침전된 세포에 200μL의 PBS를 가하여 현탁시켰다. 세포 현탁액은 -80℃의 냉동고 내에서 30분간 동결하고 얼음위에서 융해하였다. 이 동결 융해 조작을 3회 반복하였다. 또한, 440G(4℃)에서 15분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다(말초혈 추출액).

3)C57/BL6 수컷 마우스(6∼8주령)에 치사량 방사선(10Gy)을 조사하고 그 직후에 꼬리정맥으로부터 GFP(Green fluorescent protein) 트랜스제닉 마우스 유래 골수세포(5×x10⁶개/0.1㎖ 생리적 인산완충 용액 pH 7.4)를 이식하였다. 이식후 8주일후까지 생존해 있는 마우스만 이후의 실험에 사용하였다.

4)디바이스에, 2)에서 제조한 피부 추출액, 말초혈 추출액, 음의 대조군을 위한 PBS 40μL를 삽입하였다. 이 디바이스를 3)에서 제조한 마우스의 좌우 등부분 피하의 근막쪽에 디바이스의 구멍이 접하도록 좌우 1개씩(합계 2개/마리) 삽입하였다. 2주일후 디바이스를 마우스로부터 꺼내었다.

5)C.B-17/lcr-scid/scidJcl 8주령(일본 찰스리버)의 등부분 털을 제거 후 등부분의 좌우에 직경 6㎜의 원형 피부궤양을 만들었다. 마우스의 피부가 수축되는 것을 막기 위해 실리콘제의 외직경10㎜ 내직경6㎜ 두께1㎜의 원반을 양면 점착 테잎 및 의료용 접착제 아론알파A(일본 산쿄)를 사용하여 궤양부에 접착하였다. 3)에서 꺼낸 좌우 디바이스의 한쪽 디바이스 내부에서 세포를 채취하여 피부궤양에 투여하였다. 궤양부의 건조와 세균 감염을 막기 위해 직경10㎜ 두께1㎜의 실리콘제 원반으로 궤양부를 덮었다. 궤양부를 보호하기 위해 테가덤(3M)으로 피복하였다. 7일후에 궤양의 면적을 측정하였다.(도 27)

그 결과 음의 대조군의 궤양면이 7일 경과해도 폐쇄되지 않은 데 반해, 혈액 추출액으로부터 채취한 세포를 투여한 궤양에서는 5일째에 궤양 면적의 감소가 관찰되었다. 또한, 피부 추출액에서 채취한 세포를 투여한 궤양에서는 7일째에 궤양 면적의 폐쇄가 관찰되었다(도 27).

본 실시예에 의해 조직 추출액을 포함한 체내 매립형 디바이스내에 동원된, 골수 유래의 세포를 피부궤양부에 투여함에 따른 궤양 치료 효과가 확인되었다. 골수세포를 골수로부터 채취하는 것이 아닌, 체내 디바이스에 동원하여 그 세포를 이용하여 치료에 응용하는 예는 지금까지 없던 신규 치료법이다.

[실시예 3]

1)상기 실시예 2에 기재된 방법으로 피부 추출액 및 말초혈 추출액을 제조하였다.

HiTrap Heparin HP 1mL칼럼(GE)을 10mM 인산버퍼 pH.7.5 10mL로 평형화하였다. 피부 추출액, 말초혈 추출액을 각각 10 배 용량의 10mM 인산버퍼 pH 7.5로 희석하여 평형화된 칼럼에 결합시켰다. 10mM 인산버퍼 pH 7.5를 10mL 사용하여 칼럼내를 세정하고 비특이적으로 흡착된 성분을 씻어내었다. 흡착된 성분은 1000mM NaCl 함유 10mM 인산버퍼 pH7.5를 사용하여 용출하고 120μL씩 플라스틱 튜브에 분주하였다. Protein assay kit(Bio-Rad)를 사용하여 단백량을 정량하여 가장 농도가 높은 3프랙션을 회수하였다(조직 추출액 헤파린 흡착).

3)0.1% 히알루론산 함유 PBS를 제조하고 그 히알루론산 용액 10μL와 조직 추출액 40μL를 혼합하여 실시예 2의 디바이스내에 삽입하였다. 음의 대조군은 1000mM NaCl함유 10mM 인산버퍼 pH 7.5와 히알루론산의 혼합액을 사용하였다.

3)실시예 2와 같이 GFP 골수 이식 마우스를 제조하여 동마우스의 등부분 피하에 2)에서 제조한 디바이스를 삽입하였다. 삽입 10일후 피하에서 디바이스를 꺼내어 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 10% 우태아 혈청 함유 IMDM(Invitrogen) 중에서 배양용기를 사용하여 37℃, 5% CO₂환경하에서 배양하였다. 배양 개시 1일후에 배지를 교환하여 비부착성 세포를 제거하였다. 그 후에는 3일 간격으로 배지를 교환하였다. 세포 회수 1주일후에 형광 현미경을 사용하여 관찰하고 골수 유래 세포(GFP양성 세포)를 검출하였다(도28). 또한, GFP양성 세포수를 화상 처리 소프트(Image J)를 사용하여 계측하였다(도 29).

히알루론산과 조직 추출액의 헤파린 결합 분획 혼합액(혈액 추출액(도28C), 피부 추출액(도 28D))에서는 히알루론산 단독(도 28B)이나 PBS(도 28A)에 비해 디바이스내로의 골수 유래 부착계 세포에 대해 강한 동원 활성이 있는 것으로 관찰되었다(도 28, 29).

본 실시예에 의해 조직 추출액의 골수세포 동원 인자를 헤파린 칼럼으로 정제할 수 있는 것으로 확인되었다. 피부 추출액중에는 HMGB1, HMGB2, HMGB3, S100A8, S100A9가 함유되어 있으며 이들 성분은 헤파린 칼럼에 결합되기 때문에 골수세포의 동원은 이들 세포가 관여될 가능성이 시사된다. 또한, 헤파린 칼럼에는 많은 성장 인자 등의 사이토카인도 결합되기 때문에 이들 복수 개의 인자에 의한 종합적인 효과에 의한 것이라고도 생각된다.

[실시예 4]

1)신생 마우스 피부로부터 Trizol(invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고, 또한, SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 템플릿으로 하여 S100A8의 cDNA를 PCR(폴리메라아제 연쇄 반응)법을 사용하여 증폭하고, 정제를 위해 아미노산 서열의 N말단에 Flag tag 및 6Xhis tag의 서열을 부가한 단백질을 발현하도록 포유류 세포로 단백질을 발현시키는 플라스미드 벡터 pCAGGS에 삽입하였다. 인간 태아 신세포 유래 HEK293 배양 세포주에 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 pCAGGS-Flag-His-S100A8을 트랜스펙션하고 48시간후 세포 및 배양 상청액을 회수하였다. 세포 및 배양 상청액은 4℃에서 4400G·5분간 원심분리하고 상청액과 세포를 분리하여 각각 회수하였다. 회수한 상청액은 또한, 직경 0.8㎛ 구멍을 가진 셀룰로오스 아세테이트 필터(Nalgene)를 통과시킨 후, 0.45㎛ 구멍을 가진 니트로셀룰로스 필터(Corning)를 통과시켜 불용(不溶) 분획을 제거한 샘플을 조제하였다. 본 샘플을 50mM NaCl 함유 50mM Tris HCl pH8.0(50mL)으로 평형화한 5mL HisTrap FF(GE)에 삽입하고 흡착 성분을 10mM 이미다졸 함유 50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0으로 더 세정하여 비특이적 흡착 성분을 제거하였다. 특이적 흡착 성분을 칼럼으로부터 100mM이미다졸 함유 50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0 용출하였다. 흡착 분획은 각각 500μL씩 실리콘 코팅한 플라스틱 튜브에 분획하고, 단백질 함유 프랙션을 모아 항Flag 항체M2비즈(Sigma)와 혼합하고 4℃에서 12시간 천천히 혼합하면서 반응시켰다. 반응 후 비즈를 440G로 5분간 원심분리하여 상청액을 제거 후 PBS로 비즈를 현탁하고 또한, 동일하게 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 비즈를 용량 3mL 내직경 1㎝의 칼럼에 삽입하고 100mM Glycine-pH3.5로 비즈에서 흡착 단백질을 용출시키고 10분의 1양의 500mM Tris HCl pH7.5를 사용하여 중화하였다. 정제한 단백질량은 Protein assay kit(Bio-Rad)를 사용하여 정량하였다.

2)신생 마우스 피부로부터 Trizol(invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고 또한, SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 템플릿으로 하여 HMGB1의 cDNA를 PCR(폴리메라아제 연쇄 반응)법을 사용하여 증폭하고 정제를 위해 아미노산 서열의 N 말단에 Flag tag 및 6XHis tag의 서열을 부가한 단백질을 발현하도록 포유류 세포로 단백질을 발현시키는 플라스미드 벡터 pCAGGS에 삽입하였다. 인간 태아 신세포 유래 HEK293배양 세포주에 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 pCAGGS-GST-His-HMGB1을 트랜스펙션하고 48시간후 세포 및 배양 상청액을 회수하였다. 세포 및 배양 상청액은 4℃에서 4400g·5분간 원심분리하여 상청액과 세포를 분리하여 각각 회수하였다. 회수한 상청액은 직경 0.8㎛ 구멍을 가진 셀룰로오스아세테이트 필터에 통과시킨 후, 0.45㎛구멍을 가진 니트로셀룰로스 필터에 통과시켜 불용 분획을 제거한 샘플을 조정하였다. 본 샘플을 50mM NaCl함유 50mM Tris HCl pH8.0(50mL)로 평형화한 5mL HisTrap FF(GE)에 삽입하고 흡착 성분을 10mM 이미다졸 함유 50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0으로 세정하여 비특이적 흡착 성분을 제거하였다. 특이적 흡착 성분을 칼럼으로부터 100mM 이미다졸 함유 50mM NaCl 50mM Tris HCl pH 8.0에 용출하였다. 흡착 분획은 각각 500μL씩 실리콘 코팅한 플라스틱 튜브에 분획하고 단백질 함유 프랙션을 모은 후 탈염칼럼 PD10(GE)을 사용하여 이미다졸을 제거하고 50mM Tris HCl pH.7.5, 150mM NaCl을 사용하여 용출하였다. 용출한 샘플에 HRV3C(Novagen)를 첨가하고 4℃에서 3시간 반응시켰다. 절단후 샘플을 50mM Tris HCl pH.7.5, 150mM NaCl로 평형화한 HiTrap Heparin 1mL칼럼(GE)에 결합시키고 50mM Tris HCl pH.7.5, 150mM NaCl로 칼럼 내부를 세정 후 50mM Tris HCl pH.7.5, 1000mM NaCl로 결합 단백질을 용출하였다. 용출한 샘플은 실리콘 코팅한 플라스틱 튜브에 500μL씩 분주하였다.

3)S100A8, HMGB1, HMGB2, HMGB3를 각각 40㎍씩 실리콘제 디바이스에 삽입하고, GFP골수 이식 마우스의 좌우 등부분 피하에 구멍이 근막과 접하도록 삽입하였다. 삽입 10일후 피하로부터 디바이스를 꺼내어 디바이스 내에 집적된 세포를 회수하였다. 세포는 10% 우태아 혈청 함유 IMDM(Invitrogen)중에서 배양용기를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 환경 하에서 배양하였다. 배양 개시 1일후에 배지를 교환하여 비부착성 세포를 제거하였다. 그 후에는 3일 간격으로 배지를 교환하였다. 세포 회수 1주일후에 형광 현미경을 사용하여 관찰하고 골수 유래 세포(GFP양성 세포)를 검출하였다(도 30).

4)BALB/cAJcl-nu/nu 8주령(일본 클레아)의 등부분 좌우에 직경6㎜의 원형의 피부궤양을 만들었다. 마우스의 피부가 수축되는 것을 방지하기 위해 실리콘제의 외직경10㎜ 내직경6㎜ 두께1㎜의 원반을 양면 점착 테잎 및 의료용 접착제 아론알파A(산쿄)를 사용하여 궤양부에 접착하였다.

5)3)의 세포를 0.5g/l-Trypsin/0.53㎜ol/l-EDTA액(나카라이)을 사용하여 처리하고 배양용기로부터 유리시켜 10% FBS함유 IMDM으로 트립신을 불활성화한 후 440G, 4℃, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거 후 4)에서 만든 궤양에 투여하였다. 국소의 건조와 세균 감염을 방지하기 위해 직경10㎜ 두께1㎜의 실리콘제 원반으로 궤양부를 덮었다. 또한, 궤양부를 보호하기 위해 테가덤(3M)으로 피복하였다. 7일후에 궤양의 크기를 측정하였다(도 31).

음의 대조군(E)과 비교하여 S100A8, HMGB1, HMGB2, HMGB3 모두에서 골수세포의 동원 활성이 인정되었다(도 30―A;S100A8, B;HMGB1, C;HMGB2, D;HMGB3). 특히 HMGB1, HMGB2에 강한 동원 활성이 관찰되었다.

또한, HMGB1, HMGB2, S100A8에 의해 동원된 골수 유래 세포를 투여함으로써 피부궤양을 치료한 결과 음의 대조군(PBS투여)에 비해 궤양의 축소 효과가 관찰되었다(도 31).

본 실시예에서는 S100A8, HMGB1, HMGB2, HMGB3 모두 디바이스내로의 골수 유래 부착성 세포의 동원 활성이 인정되었다. 골수내의 주요 세포는 적혈구, 혈구 등의 혈구계 세포이지만, 이들 세포의 대부분은 비부착성 세포이다. 부착성 세포로는 중간엽 줄기세포 등의 간엽계 세포가 알려져 있으며, 또한, 상피계나 신경계로 분화 가능한 다능성 세포가 포함되어 있다고 생각된다. 본 실시예에 의해 S100A8, HMGB1, HMGB2에 의해 디바이스내에 동원된 세포에 의해 피부궤양의 치료 효과가 인정됨에 따라 디바이스내에 동원된 세포는 조직 손상을 치료 유도할 수 있는 골수 유래세포이다. 골수 중간엽 줄기세포를 피부궤양 부위에 투여함으로써 치료 효과를 나타낸다는 보고도 있으며(Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Wu Y, Chen L, Scott PG, Tredget EE. Stem Cells. 2007 Oct; 25(10): 2648-59. Epub 2007 Jul 5.), 본 실시예에서의 치료 효과에는 골수 중간엽 줄기세포의 관여가 시사된다. 또한, 골수 중간엽 줄기세포 등의 골수 유래 세포는 신경세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 상피계 세포로 분화되는 것이 알려져 있다. 본 디바이스에서 채취한 세포에 의해 손상조직에서 이들 세포를 공급하여 치료하는 새로운 재생 유도 의료에 응용하는 것이 가능하다.

[참고예 1]

목적: 피부 추출액 중 HMGB1패밀리의 동정과 골수 중간엽 줄기세포 유도활성의 검토

방법: 신생 마우스 피부 추출액 중에 포함되는 HMGB 단백질 패밀리의 유무를 Western blot법을 이용하여 확인하였다. 샘플로서 신생 마우스 400마리에서 얻은 유리 피부조각을 생리적 인산완충액 pH 7.4(PBS) 400㎖내에 침지하고 4℃에서 24시간 인큐베이션한 후 조직을 제거하기 위해 4℃의 조건하에서 10분간 440G로 원심분리하여 상청액을 회수하여 얻어진 피부 추출액 10㎕을 SDS-PAGE법을 이용하여 전기영동하고, 겔 중에서 분리된 단백질을 블로팅 장치(ATTO)를 이용하여 PVDF막으로 통과시켰다. 3% 탈지유 및 0.1% Tween 20 함유 PBS(S-T-PBS)로 실온에서 1 시간 배양한 후, S-T-PBS로 1000배로 희석한 토끼 항마우스 HMGB1 항체, 토끼 항마우스 HMGB2항체, 토끼 항마우스 HMGB3항체를 각각 4℃에서 16시간 반응시켰다. 반응 후, 동 PVDF막을 S-T-PBS로 5분간 5회 세정 후, S-T-PBS로 2000배 희석한 퍼옥시다아제 표식 염소 항토끼 IgG항체(GE Healthcare)에서 동 PVDF막을 25℃에서 1시간 배양하였다. 또한 S-T-PBS에서 5분간 5회 세정 후 ECL Western 블로팅 Detection System(GE Healthcare)을 동 PVDF막과 반응시키고, ECL 필름을 감광시킨 후 현상하여 HMGB1, HMGB2, HMGB3 단백질의 존재를 검출하였다.

신생 마우스 피부로부터 Trizol(invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출하고, 또한, SuperScript Ⅲ cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로 하여 HMGB1, HMGB2 및 HMGB3의 cDNA를 PCR(폴리메라아제 연쇄반응)법을 이용하여 증폭하고, 아미노산 서열의 N말단에 Flag tag의 서열(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys; 서열번호: 30)을 부가한 단백질을 발현하도록 포유류세포에서 단백질을 발현시키는 플라스미드 벡터 pCAGGS에 삽입하였다. 이들의 플라스미드 벡터를 HEK293(인간 태아 신세포 유래 배양 세포주)에 유전자 도입하고 48시간 배양하여 단백질을 발현시켰다. HMGB1, HMGB2 및 HMGB3 단백질을 각각 발현시킨 세포 및 배양액의 상청액은 4℃에서 16시간 배양한 후, 4400g·5분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 이 상청액 50mL당 100μL의 항 Flag항체 겔(Sigma)을 혼합하여 4℃에서 16시간 배양하였다. 원심분리하여 겔을 회수한 후 PBS를 이용하여 5회 세정하였다. 또, 3XFlag 펩티드(최종 100㎍/㎖)를 이용하여 용출하였다. 재조합 단백질의 발현을 S-T-PBS로 1000배 희석한 마우스 항Flag항체 및 S-T-PBS로 2000배 희석한 퍼옥시다아제 표식 항마우스 IgG항체(GE Healthcare)를 이용한 Western blot법으로 확인하였다. 이들의 정제 재조합 단백질의 마우스 골수 중간엽 줄기세포의 유주 활성을 보이덴 챔버를 이용하여 평가하였다. 또한, HMGB 패밀리의 in vivo에서의 약효를 관찰하기 위해, 8주령 C57BL/6 마우스의 등 피부를 직경 8㎛의 원형으로 절제하여 피부궤양모델을 제조하고, 거기에 정제한 HMGB1·HMGB2·HMGB3 각각(100ng/μL)을 1g/100mL PBS 농도의 히알루론산 용액과 동량으로 혼합하고 그 중에서 100μL을 궤양면에 투여하였다. 궤양면은 건조하지 않도록 점착성 투명 창상피복·보호재 Tegaderm(3M Healthcare)로 덮고 경시적으로 창상면적을 계측하여 치유효과를 측정하였다.

또한 인간 골수 중간엽 줄기세포를 인간 피부 추출액 및 인간 정제 HMGB1이 유주하는 활성이 있는지를 조사하기 위해, 보이덴 챔버를 이용하여 평가하였다. 면적 1㎠의 인간 피부를 1㎖의 PBS에 담그고 4℃의 조건하에서 16시간 배양한 후, 4℃의 조건하에서 10분간 440G로 원심분리하였다. 상청액만을 회수하여 인간 피부 추출액으로서 사용하였다. 또한, 보이덴 챔버의 상부에 넣는 세포는 인간 골수 중간엽 줄기세포(Cambrex사)를 이용하였다.(본 세포는 유세포 분석기에 의한 세포표면 항원의 분석결과, CD105양성, CD166양성, CD29양성, CD44양성, CD34음성, CD45음성으로 되어 있다. 또, 분화유도시험에 의해 지방세포, 연골세포, 골세포로의 분화가 양성이다.) 또한 챔버 하부에는 인간 HMGB1을 100ng/웰(R&D사) 및 PBS로 10배 희석한 인간 피부 추출액을 넣고, 대조군으로서 PBS를 이용하였다.

결과: Western blot의 결과, HMGB1의 밴드 이외에 HMGB2나 HMGB3의 밴드가 검출되었다. 따라서, 신생 마우스 피부 추출액 중에는 HMGB1 이외에 패밀리 단백질인 HMGB2 및 HMGB3이 함유되어 있는 것이 확인되었다(도 8). 각각의 단백질의 N말단에 Flag tag를 부가한 HMGB1·HMGB2·HMGB3의 발현 벡터를 제조하였다(도 9). HEK293세포에 발현 벡터를 유전자 도입하고, 발현한 단백질을 플래그 태그(Flag tag)를 이용하여 정제한 후, Western blot법을 이용하여 단백질을 확인하였다(도 10). 이들의 정제 단백질을 이용하여 마우스 골수 중간엽 줄기세포의 유주 활성을 측정한 바 모든 단백질에서 활성이 확인되었다(도 11). 마우스의 등부분에 제조한 궤양 면적을 7일마다 계측한 바, 비치료군에 비해 HMGB1, 2 및 3에 의한 치료군쪽이 유의적으로 궤양 면적의 축소 효과를 확인할 수 있다(도 12). 마우스의 경우와 같이, 인간 HMGB1 및 인간 피부 추출액은 인간 골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성이 있다는 것이 명백해졌다(도 13).

고찰: HMGB1과 상동성이 높은 단백질로서 HMGB2 및 HMGB3이 알려져 있다. 이들의 단백질도 HMGB1과 같은 성질을 가지는 것이 기대된다. 그래서, 유리된 피부 조각 추출액으로부터 HMGB1의 패밀리인 HMGB2 및 HMGB3도 생산되는 것을 확인하였다. 또, HMGB1·HMGB2·HMGB3의 재조합 단백질을 제조하여 in vitro에서의 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 확인하고, in vivo에서의 피부궤양 치료효과도 확인하였다. 신생 마우스 유리 피부 조각 중의 HMGB패밀리(HMGB1·HMGB2·HMGB3) 및 재조합 HMGB 패밀리에는 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이나 골수 유래의 상피계로 분화 가능한 줄기세포를 국소로 유도하는 활성이 있고, 또한, 이들의 유도된 골수 유래의 세포군이 손상조직에 있어서 표피 각질세포나 모낭이나 섬유아세포와 같은 여러가지 세포로 분화하여 손상조직의 치유를 촉진하는 효과가 있는 것이 명백해졌다. 또한, 골수 중간엽 줄기세포는 다능성 줄기세포이므로, 다른 조직손상상태, 예를 들어 뇌손상, 심근경색, 골절 등의 조직손상의 치료에 HMGB 패밀리를 전신투여 또는 국소투여함으로써 마찬가지로 치료효과를 기대할 수 있다고 확신한다.

또한, 인간과 마우스의 HMGB1은 각각을 구성하는 아미노산 서열에서 98%(213/215)의 상동성이 있고, HMGB2는 각각을 구성하는 아미노산 서열에서 96%(202/210)의 상동성이 있으며, HMGB3은 각각을 구성하는 아미노산 서열에서 97%(195/200)의 상동성이 있음을 알 수 있다. 그래서, 인간의 HMGB가 마우스의 HMGB와 동일한 활성을 가지는 것이 생각되는데, 본 결과로부터, 인간의 피부 추출액이나 HMGB1이 마우스의 피부 추출액이나 HMGB1과 동일하게 골수 중간엽 줄기세포를 유도하는 활성이 있음이 명백해졌다.

[참고예 2]

목적: 골수 중간엽 줄기세포 유도인자 조직 추출액의 제조방법의 확립

방법: 6주령 C57BL6 1 마리의 뇌, 심장, 장, 신장, 간장 및 신생 마우스 피부를 생리적 인산완충액 pH7.4(PBS) 1㎖ 내에 담그고 4℃에서 24시간 배양한 후 조직을 제거하기 위해서 4℃의 조건하에서 10분간, 440G에서 원심분리하여 상청을 회수하여 조직 추출액으로 하였다. 얻어진 추출액 중에 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이 존재하는 것을 확인하기 위해 보이덴 챔버를 이용하여 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대한 유주 활성을 검토하였다. 또한, 동일한 샘플 중에 포함되는 HMGB1의 농도를 HMGB1 ELISA kit(시노테스트)를 이용하여 측정하였다. 또한, 뇌, 심장 및 피부의 조직 추출액을 헤파린 친화성 칼럼에 결합시키고, 결합 분획의 단백질의 골수 중간엽 줄기세포 유도활성을 보이덴 챔버를 이용하여 확인하였다.

결과: 마우스 뇌 추출액에는 신생 마우스 피부 추출액과 동등한 HMGB1이 함유되어 있었다. 또, 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성은 마우스 뇌에서도 피부와 동일하게 인정되었다. 마우스 장 추출액과 마우스 심장 추출액 중에 HMGB1은 거의 포함되어 있지 않았지만, 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성은 인정되었다. 또한 마우스 뇌, 마우스 심장의 헤파린 칼럼 결합 분획은 마우스 피부의 헤파린 칼럼 결합 분획과 같이 골수 중간엽 줄기세포를 유도하는 활성이 있다(도 14). 표 1은 마우스 각 조직 추출액의 HMGB1 농도와 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성을 측정한 결과를 나타낸다.

	HMGB1 농도(ng/mL)	골수 중간엽 줄기세포 유도활성
피부	110	있음
뇌	140	있음
심장	4	있음
장	0	있음
신장	115	ND
간장	61	ND

ND:시행하지 않음

고찰: 피부뿐만 아니라 뇌에서도 장기를 생리적 완충액에 침지할 뿐인 간편한 방법으로 HMGB1을 간편하게 추출하는 방법을 개발하였다. 이 방법은, 다른 장기, 예를 들어 간장이나 신장에서도 동일하다. 또한 심장이나 장으로부터의 추출액에는 HMGB1을 거의 함유하지 않음에도 불구하고 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이 인정되었다. 이는 추출액 중에 HMGB1과 다른 별개의 골수 중간엽 줄기세포 유도물질이 포함되어 있는 것으로 생각할 수 있다. 이들의 추출액에 포함되는 물질은 원래 각각의 조직에 존재하는 것이고, 생리적으로는 조직 손상시에 골수 중간엽 줄기세포를 손상조직으로 유도하고 있다고 생각된다. 본 발명에 의해 HMGB1을 포함한 복수의 골수 중간엽 줄기세포 유도물질을 각종 장기로부터 기능적이고 간편하게 추출하는 신규의 방법을 개발할 수 있었다. 또, 조직 추출액으로부터 골수 중간엽 줄기세포 유도물질을 정제하기 위해 헤파린 칼럼에 결합시키는 방법을 개발하였다. 또한 이들의 골수 중간엽 줄기세포 유도활성을 가지는 성분은 피부와 같은 방법으로 뇌나 심장으로부터도 헤파린 칼럼을 이용하여 정제할 수 있다.

[참고예 3]

목적: 배양세포로부터 중간엽 줄기세포 유주 활성 물질을 추출하는 방법을 확립한다.

방법: 인간 태아 신장 유래 배양 세포주 HEK293 및 인간 자궁경부암 세포주 HeLa는 각각 10% 우태아혈청 함유 D-MEM(nacalai사 제품)으로 배양하였다. 각각의 세포를 PBS로 세정 후, 세포 10⁷개를 4℃의 5㎖의 PBS(nacalai사 제품)에 16시간 침지하였다. 중력 가속도 440G로 4℃에서 5분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 보이덴 챔버의 상층에 인간 골수 중간엽 줄기세포를 넣고 하층에 DMEM으로 5배 희석한 세포 추출액을 넣어 인간 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 확인하였다.

결과: HEK293 추출액도 HeLa 추출액도 모두 골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성을 나타냈다(도 15).

고찰: 배양세포를 PBS에 침지하는 간편한 방법으로 골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성물질을 추출하는 데 성공하였다.

[참고예 4]

목적: 마우스 뇌 결손 모델을 제조하여 국소 손상부위에 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획을 서방화(徐放化)하여 투여시 자기의 골수계에 포함되는 줄기세포를 국소 손상부위에 유주시킴으로써 신경계세포의 재생을 유도할 수 없는지 검토한다.

방법:

(1)피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획의 제조

절제한 신생 마우스 피부로부터 PBS(1마리/㎖) 중에 4℃에서 16 시간 배양하여 추출한 피부 추출액을 4℃의 9배 용적 20mM 인산버퍼 pH7.5를 이용하여 10배로 희석하였다. 미리 20mM 인산완충용액 pH7.5(30㎖)를 HiTrap Hepalin HP column(칼럼 용량: 5㎖, GE Healthcare) 중에 흘려서 칼럼을 평형화하였다. 또한, 희석액을 칼럼에 결합시켰다. 그 후, 20mM 인산완충용액 pH7.5, 100mM NaCl(30㎖)로 칼럼을 세정하였다. 흡착된 단백질을 용출하기 위해 20mM 인산버퍼 pH7.5, 1000mM NaCl을 칼럼 내에 유입하고 용출액을 튜브에 분획하였다. 흡착 분획에 대해 각각 마우스 골수 유래 세포주의 유주 활성을 보이덴 챔버법을 이용하여 평가하여 유주능력을 가진 분획을 모았다. 이 활성을 가진 용액을 피부 추출액 헤파린 정제 분획으로서 하기 참고예에 사용하였다.

(2)골수 억제 마우스의 제조

마우스에 10Gy의 X선 단회조사를 하여 골수 억제 마우스를 제조하였다.

(3)골수 억제 마우스로의 GFP 마우스 골수 이식

GFP 마우스의 양측 대퇴골 및 하퇴골로부터 골수세포를 채취하였다. 이를 조사 후 24시간 경과한 골수 억제 마우스의 꼬리정맥을 통해 투여하였다. 또한, 투여는 이소플루란에 의한 흡입 마취하에 시행하였다.

(4)마우스 뇌 손상(뇌조직 결손) 모델의 작성

GFP 마우스의 골수세포를 이식한 골수 억제 마우스에 이소플루란으로 흡입마취를 하고 펜토바르비탈(45mg/㎏)을 복강 내에 주입하였다. 마우스를 뇌정위 고정장치에 고정시키고 메스로 머리부에 정중앙 절개를 가하였다. 정수리점(bregma)으로부터 우외측 2.5㎜, 전방 1㎜에 드릴을 이용하여 천두를 실시하였다(도 16A). 이 부위에서 깊이 3㎜의 위치를 끝단으로 하여 20G 서플로우(Surflow) 침의 외통을 삽입하여 고정하였다. 여기서 주사기를 이용하여 음압을 가하여 뇌조직을 일부 흡인하였다(도 16B).

(5)피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획의 뇌조직 결손부로의 투여

상기 위치에 해밀턴 주사기와 26G 주사기를 이용하여 피브린 접착제(피브리노겐)(Bolheal(Kaketsuken))에 용해한 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획을 5㎕ 주입하고, 다음에 피브린 접착제(트롬빈)(Bolheal(Kaketsuken))를 5㎕ 주입하였다(도 16C). 이 조작은 피부 추출액에 헤파린 칼럼 정제 분획의 서방제로서의 효과를 위한 것이다.

(6)뇌조직 결손부에서의 신경계세포 재생효과의 평가

대조군과 치료군의 마우스를 이용하여 평가하였다. 적절한 경과설정을 정하고(경시적으로) 마우스를 4% 파라포름알데히드로 관류 고정시킨 후 뇌 절취를 수행하였다. 또, 4% 파라포름알데히드를 외부 고정하였다. 15%와 30% 경사의 수크로오스로 탈수 후 동결 단편을 제조하였다.

DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) 용액으로 핵을 염색하고 광표백 방지제를 이용하여 봉입하였다. 공초점 레이저 현미경으로 손상부위(뇌조직 결손부)에서의 GFP 양성세포의 집적을 평가하였다.

결과: 투여 후 2주일 및 6주일 후의 GFP 양성세포 집적을 정성적으로 나타냈다. 2주일 후(대조군; 도 16D, 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획; 도 16E) 및 6주일 후(대조군; 도 16F, 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획; 도 16G) 모두 대조군에 비해 치료군의 손상부위에 GFP 양성세포의 집적이 높은 경향이 있었다.

고찰: 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획 투여에 의해 골수 유래 세포가 뇌조직 결손부위에 집적하여 신경세포의 형태를 나타냈다. 골수 유래 중간엽 줄기세포는 신경세포로도 분화하는 것이 알려져 있고, 본 결과로부터, 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획에 의해 뇌손상부위에서의 신경계세포의 재생을 유도할 수 있는 것이 명백해졌다. 또한 이는 뇌허혈성 질환이나 뇌타박상에서의 뇌조직 장해부위에서의 신경재생에도 응용 가능하다.

[참고예 5]

목적: 피부 조직 추출액내에 존재하는 골수 유래 조직 줄기세포 유도 인자의 동정

방법: 관류저하 상태에 있는 절제 피부로부터의 방출이 예상되는 골수 중간엽 줄기세포 동원 인자의 동정을 목적으로 하여 하기 방법과 같이 연구를 진행하였다.

1)마우스 골수 유래 중간엽 줄기세포를 얻기 위해 C57BL/6마우스의 골수세포를 대퇴골 또는 종아리뼈에서 채취하여 10% 태아 소혈청 함유 D-MEM(Nacalai사제)을 세포 배양 배지로 하여 세포 배양용기에 분산시키고 37℃, 탄산가스 농도 5%의 조건하에서 배양하였다. 세포가 차지하는 면적이 배양용기 바닥면적에 대해 70 내지 100%로 증식된 시점에서 0.25% 트립신 1mM EDTA(Nacalai사제)를 사용하여 세포를 배양용기로부터 꺼내어 다시 같은 조건으로 계대 배양하였다. 계대 작업은 적어도 5회 이상 반복하였다. 또한, 이들 부착 세포를 단리 배양하여 유세포 분석기에 의한 세포 표면 항원을 분석하여 Lin음성, CD45음성, CD44양성, Sca-1양성, c-kit 음성임을 확인하였다. 이들 세포는 골세포, 지방세포로 분화 가능하여 골수 중간엽 줄기세포의 성질을 갖는다는 것을 확인하였다.

2)신생 마우스(2일령) 5마리로부터 얻은 유리 피부조각을 생리적 인산완충액 pH 7.4(PBS) 5㎖내에 침지하여 4℃에서 24시간 인큐베이션한 후 조직을 제거하기 위해 4℃의 조건 하에서 10분간, 440G로 원심분리하여 상청액을 회수하고 피부추출액을 제조하였다. 또한, 마찬가지로 6주령 마우스 1마리에서 얻은 유리 피부조각을 생리적 인산완충액 pH 7.4(PBS) 5㎖ 내에 침지하고 4℃에서 24시간 인큐베이션한 후 조직을 제거하기 위해 4℃의 조건 하에서 10분간 440G로 원심분리하여 상청액을 회수하고 피부추출액을 제조하였다.

3)얻어진 피부 추출액 중에 골수 중간엽 줄기세포 유도 활성이 존재하는 것을 확인하기 위해 보이덴 챔버를 사용하여 본 발명자들이 이미 주화(株化)된 C57BL6마우스 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대한 유주활성을 검토하였다. 구체적으로는 보이덴·챔버의 하조(下槽)(용량 25 ㎕)에 2 일령 또는 6 주령의 마우스 피부 추출액(5㎕)과 DMEM(20㎕)의 혼합액을 삽입하여 8㎛의 미세공을 가진 폴리카보네이트멤브레인을 얹고 또한, 여기에 접하여 보이덴 챔버 상조(上槽)(용량50㎕)를 얹고 그 안에 골수 유래 중간엽 줄기세포 부유액(5×10⁴개/50㎖ 배양액: DMEM/10% 소태아 혈청)을 넣어 CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃, 4∼24시간 배양하였다. 배양후 챔버 상조를 떼어내고 실리콘 박막을 꺼내고 그 미세공을 통과하여 챔버 하조로 유주한 골수 유래 중간엽 줄기세포의 수를 염색에 의해 정량적으로 검토하였다(도 17).

4)2일령 마우스, 6주령 마우스 각각의 피부를 약 2㎠ 채취하여 신속하게 액체질소로 동결후 유발을 사용하여 분쇄하였다. 이들 샘플로부터 RNeasy(Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출 정제하였다. 정제한 RNA를 사용하여 마이크로 어레이 어세이에 의해 2일령 마우스에서 보다 많이 발현되는 mRNA를 스크리닝하였다. 2일령 마우스쪽이 2배 이상 스코어가 높은 유전자는 767 있었다. 이들 유전자 중 헤파린에 대한 친화성이 높은 단백질, 분비될 가능성이 있는 단백질, 2일령 마우스쪽이 6배 이상 스코어가 높은 유전자를 검토했을 때 상위 57번째 유전자로서 S100A9가 존재하였다. 그래서 S100A9와 헤테로다이머를 형성하는 것으로 알려져 있는 S100A8의 2일령 피부 추출액중의 존재를 Western blot법으로 검출하였다. 즉, 2일령 피부 추출액 5㎕와 SDS-PAGE sample buffer 5㎕(Bio-Rad)를 혼합하여 98℃, 5분간 히트 블록으로 가열한 후 25℃까지 냉각하였다. 이 샘플을 12.5% 아크릴아미드겔의 e-PAGEL(ATTO)에 적용하고 전기영동 장치(ATTO)를 사용하여 40mA에서 75분간 전기영동하였다. 상기 전기영동 후 겔을 회수하고 블로팅 장치(ATTO)를 사용하여 사전에 100% 메탄올로 처리한 세로 7㎝ 가로 9㎝의 PVDF막(Millipore)에 겔안의 단백질을 전사하였다. 전사는 120mA, 75분간 시행하였다. 전사 종료 후 PVDF막을 회수하여 4% 탈지유 함유 PBS(nacalai)중에서 30분간 실온 진탕하였다. 그 후 항S100A8항체(R&D) 또는 항S100A9(R&D) 5㎕를 10mL의 4% 탈지유 함유 PBS로 희석한 액중에 회수한 PVDF막을 침지하여 60분간 실온 진탕하였다. 항체액을 제거후 30mL의 0.1% Tween20 함유 PBS에서 막을 5분간 실온에서 진탕하고 세정하였다. 세정은 5회 반복하였다. 세정 후 HRP표식 항goat IgG항체(GE healthcare) 5㎕를 10mL의 4% 스킴밀크 함유 PBS로 희석한 액중에 막을 넣어 실온에서 45분간 진탕하였다. 항체액을 제거 후 30mL의 0.1% Tween20 함유 PBS로 막을 5분간 실온에서 진탕하여 세정하였다. 세정은 5회 반복하였다. 막을 ECL검출 키트(GE healthcare)로 발광시켜 필름을 감광시켰다. 현상장치로 필름을 현상하여 S100A8 및 S100A9의 단백질의 신호를 얻었다(도 18).

5)피부 추출액내의 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원 활성을 가진 인자를 정제하기 위해 헤파린 어피니티 칼럼 크로마토그래피를 시행하였다. 하기 조작은 FPLC장치(GE healthcare)를 사용하여 시행하였다. 우선 2일령 마우스 피부 추출액을 4℃의 9배용 20mM 인산버퍼 pH 7.5를 사용하여 10배로 희석하였다(희석액 A). 사전에 20mM 인산버퍼 pH 7.5(300㎖)를 HiPrep 16/10 Heparin FF(GE healthcare)안에 흘려보내어 칼럼을 평형화하였다. 또한 희석액 A를 칼럼에 결합시켰다. 그 후 20mM 인산버퍼 pH 7.5,(300㎖)로 칼럼을 세정하였다. 흡착한 단백질을 용출하기 위해 (A액)20mM 인산버퍼pH7.5, 10mM NaCl과 (B액)20mM 인산버퍼 pH 7.5, 500mM NaCl을 제조하였다. 먼저 A액100%/B액0%로 송액하고 서서히 B액의 비율을 증가시켜 최종적으로 A액0%/B액100%로 송액하였다. 총 송액량은 150mL로 하였다. 용출액은 실리콘 코팅한 튜브에 3mL씩 분획하였다. 분획한 샘플의 각각 5㎕와 SDS-PAGE sample buffer 5㎕(Bio-Rad)를 혼합하여 98℃, 5분간 히트 블럭으로 가열한 후 25℃까지 냉각하였다. 이 샘플을 (5-20% graduent)아크릴아미드겔의 e-PAGEL(ATTO)에 적용하고 전기영동 장치(ATTO)를 사용하여 40 mA로 75분간 전기영동하였다. 영동후 Dodeca silver stain kit(Bio-Rad)를 사용하여 영동한 단백질을 검출하였다(도 19).

분획한 샘플을 각각 상기와 같이 보이덴 챔버를 이용한 유주 활성을 평가하였다(도 20).

분획한 샘플을 각각 상기와 같이 Western blot법을 사용하여 S100A8과 S100A9의 단백질의 존재를 검출하였다(도 21).

6)신생 마우스 피부로부터 Trizol(invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고 또한, SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 템플릿으로 하여 S100A8 및 S100A9의 cDNA를 PCR(폴리메라아제 연쇄 반응)법을 사용하여 증폭하고 아미노산 서열의 N말단에 GST tag의 서열(서열번호:31(아미노산서열), 서열번호:32(DNA서열))을 부가한 단백질을 발현하도록 포유류 세포에서 단백질을 발현시키는 플라스미드 벡터pCAGGS에 삽입하였다(도 22). 인간 태아 신세포 유래 HEK293 배양 세포주에 리포펙션 시약(Invitrogen)을 사용하여 pCAGGS-GST-S100A8 또는 pCAGGS-GST-S100A9를 트랜스펙션하고 48시간후 세포 및 배양 상청액을 회수하였다. 세포 및 배양 상청액은 4℃에서 4400g·5분간 원심분리하여 상청액(상청A)과 세포를 분리하여 각각 회수하였다. 세포는 0.1% Tween20 함유 PBS를 가하고 냉각 하에서 30초간 초음파를 가함으로써 세포막을 파괴하였다. 또한 4℃에서 4400g·5분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다(상청B). 상청A 및 상청B를 혼합하고 사전에 30mL의 PBS로 버퍼를 치환한 HiTrap GST FF column(GE healthcare, 5mL)에 첨가하였다. 첨가후 PBS 100mL로 칼럼을 세정하고 환원형 글루타티온 함유 20mM 인산버퍼(pH.8)로 흡착한 단백질을 용출하였다. 재조합 S100A8 및 S100A9의 보이덴 챔버를 사용한 골수중간엽 줄기세포 유주 활성을 검토하였다. 보이덴 챔버의 하층에는 정제한 S100A8 및 S100A9 단백질을 0.1ng/μL의 농도로 조정하여 DMEM에 녹인 샘플 또는 2일령 마우스 피부 추출액은 4배용 DMEM으로 희석한 샘플을 삽입하였다. 음의 대조군은 S100A 및 S100A9 cDNA를 삽입하지 않은 대조군 벡터를 트랜스펙션한 세포로부터 단백질을 추출하고 HiTrap GST FF column으로부터 용출한 분획을 동일하게 사용하였다. 하층에 샘플을 삽입후 8㎛의 미세공을 가진 폴리카보네이트멤브레인을 얹고 또한, 여기에 접하여 보이덴 챔버 상조(용량50㎕)를 얹고 그 안에 골수 유래 중간엽 줄기세포 부유액(5×10⁴개/50㎖ 배양액: DMEM/10% 우태아 혈청)을 넣어 CO₂인큐베이터 안에서 37℃, 4∼24시간 배양하였다. 배양 후 챔버의 상조를 떼어내고 실리콘 박막을 꺼내어 그 미세공을 통과하여 챔버 하조로 유주한 골수 유래 중간엽 줄기세포의 수를 염색에 의해 정량적으로 검토하였다(도 23).

7)상기 정제한 GST-S100A8 및 S100A9 재조합 단백질을 8주령 수컷 마우스의 꼬리정맥으로부터 250μL(1ng/μL) 주입하였다. 12시간후 이소퓨란에 의한 흡입 마취하에 마우스의 심장으로부터 헤파린 코팅한 1mL의 주사기를 사용하여 말초혈 1mL를 채혈하고 3mL의 PBS와 혼합한 후 3mL의 Ficol(GE healthcare)위에 조용히 중층하였다. 원심기를 사용하여 25℃에서 400g, 40분간 원심분리하였다. 중간층의 백탁된 층의 세포를 단핵구 분획으로서 회수하였다. 회수한 세포에 1mL의 용혈제인 HLB solution(면역 생물 연구소)을 가하여 실온에서 5분 인큐베이트하였다. 이 용혈 조작을 2회 반복하였다. 10mL의 PBS를 가하고 25℃에서 440g, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하여 세포를 회수하였다. 이 세포 1,000,000개에 항마우스PE표식 PDGFRα항체(e-Bioscience), PE표식 항마우스PDGFRβ항체(e-Bioscience), FITC표식 항마우스CD45항체(BDbiosciences), PerCy5표식 항마우스CD44항체(BDbiosciences) 각각을 PBS로 100배 희석하여 20분간 실온에서 인큐베이트하였다. 그 후 이 세포를 25℃, 440g, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 1% 파라포름알데히드 함유 PBS를 400μL 가하여 유세포 분석기 해석의 샘플로 하였다. 항체는 (I)PDGFRα/CD45/CD44 (II)PDGFβ/CD45/CD44의 조합으로 사용하였다. 해석 결과는 CD45 약(弱)양성―음성 세포에 대한 PDGFRα(또는 β) 및 CD44의 발현세포의 비율을 검토하였다(도 24A, 도 24B).

결과: 절제한 2일령 마우스 피부 및 6주령 마우스 피부의 골수 중간엽 줄기세포의 유주 활성을 검토하여 6주령 마우스에 비해 2일령 마우스의 피부 추출액에 강한 활성을 찾아내었다. DNA 마이크로 어레이의 결과로 보아 S100A9가 2일령 마우스 피부에서 강한 발현이 인정되었다. 피부 추출액을 헤파린 칼럼으로 조(粗)정제한 샘플의 중간엽 줄기세포 유주 활성과 S100A9 및 S100A8의 함유에 상관관계가 인정되었다. 이들 단백질의 발현 벡터를 제조하고 HEK293을 사용하여 재조합 단백질을 생산 정제하였다. 이들 S100A8·S100A9 정제품은 보이덴 챔버를 사용한 어세이에서 골수 중간엽 줄기세포 유주 활성을 가지고 있었다. 또한, 마우스 정맥 투여에 의해서도 PDGFRα, CD44양성세포군을 말초혈중에 동원하는 활성이 인정되었다(도 24).

고찰: 금번 본 발명자들은 세계 최초로 유리 피부조각이 S100A8 및 S100A9를 생산하고, 생산된 S100A8 및S100A9는 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유주하는 강한 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 또한, 골수 중간엽 줄기세포는 골조직, 지방조직, 연골조직, 섬유아세포 등으로 분화되는 다능성 줄기세포라는 것이 알려져 있는데 최근 골수 유래 세포 중에는 심근, 신경세포, 표피세포 등의 조직으로도 분화되는 다능성 줄기세포도 존재한다고도 지적되었다. 이번 이식피부조각의 표피세포, 모포세포, 피하조직의 섬유아세포 등이 골수 유래 세포로 구성되어 있기 때문에 S100A8이나 S100A9가 골수 유래 조직 줄기세포를 이식피부조각에 동원하여 손상조직의 기능적 복원을 유도한다고 생각된다. S100A8 및 S100A9는 정맥 주사에 의한 투여로 말초혈중에 골수 중간엽 줄기세포를 동원할 수 있기 때문에 국소 투여가 어려운 심부 조직(뇌, 심장, 척수 등)에도 말초 순환을 통해 투여 가능하다. 본 기술을 의약품으로서 이용함으로써 손상조직 재생시에 중간엽 줄기세포를 포함한 골수 유래 조직 줄기세포를 국소에 동원할 수 있게 되면 피부 조직의 조직 손상 치유뿐만 아니라 뇌, 근육, 뼈 등의 여러가지 조직 손상 치유과정에서 치유 기간의 단축, 손상조직의 기능적 재생 등의 효과가 기대된다고 확신한다.

[참고예 6]

목적: 정상 마우스 및 당뇨병 마우스에서의 S100A8의 피부궤양 치료 효과의 확인

방법: 마우스 피부궤양 모델에 재조합 S100A8 단백질을 투여하여 궤양 치료 효과를 검토하였다. 피험 마우스는 GFP를 발현하는 골수세포를 이식한 C57/Bl6마우스 또는 당뇨병 모델 마우스인 BKS.Cg-m+/+Leprdb/J(db마우스)를 사용하였다. 마우스 피부에 직경 6㎜의 피부궤양을 만들었다. 마우스에 만든 피부궤양은 피부 결손부분 주위의 피부가 빠르게 수축된다. 본 실험에서는 결손 피부를 수축이 아닌 재생 피부로 덮음으로써 치료하는 모델을 제조하기 위해 피부 결손부에 외직경 10㎜, 내직경 6㎜, 두께 0.5㎜의 실리콘 고무제 원반을 피부 수술용 접착제(아론알파A) 및 나일론사로 궤양 주위의 피부를 고정시켰다. 또한, 재조합 S100A8 단백질을 1.5㎍/일, 7일간 연일 궤양면에 직접 투여하였다. 또한, 궤양면의 건조를 막기 위해 표면을 필름 드레싱제 Tegaderm(3M)으로 보호하였다. 치료 효과를 확인하기 위해 경시적으로 궤양 면적을 측정하였다.

결과와 고찰: 정상 마우스에서는 치료 개시 7일째 이후부터 S100A8 치료군에서 대조군보다 우위로 궤양 면적의 축소가 보였다(도 25). 또한, 당뇨병 마우스에서도 치료 개시 7 일째 이후부터 S100A8 치료군에서 대조군보다 우위로 궤양 면적의 축소가 보였다(도 26). 즉, 정상 마우스, 당뇨병 마우스 모두 유의한 피부궤양의 축소 효과가 확인되었다. 이번 결과로 S100A8은 정상 마우스뿐만 아니라 당뇨병 마우스에서도 피부궤양의 치료 효과를 갖는다고 확인되었다.

[참고예 7]

목적: 피부조직 추출액내에 존재하는 골수 유래 조직 줄기세포 유도 인자에 의한 골수조직 줄기세포 말초혈로의 동원

방법: 상기 목적에 대해 하기 방법에 의해 연구를 하였다.

1)골수 유래 조직 줄기세포 유도제의 조제: 신생 마우스(2일령) 25마리로부터 얻은 유리 피부조각을 생리적 인산완충액 pH 7.4(PBS) 25㎖에 침지하고 4℃에서 24시간 인큐베이션한 후 조직을 제거하기 위해 4℃의 조건하에서 10분간 440G로 원심분리하고 상청액을 회수하여 피부 추출액(SE)을 제조하였다.

또한, C57/Bl6신생 마우스 피부로부터 Trizol(invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고 또한, SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 템플릿으로 하여 HMGB1의 cDNA를 PCR(폴리메라아제 연쇄 반응)법을 사용하여 증폭하고 아미노산 서열의 N말단에 Flag tag의 서열(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys;서열번호:30)을 부가한 단백질을 발현하도록, 포유류 세포에서 단백질을 발현시키는 플라스미드 벡터 pCAGGS에 삽입하였다(도 32). 이들 플라스미드 벡터를 HEK293(인간 태아 신세포 유래 배양 세포주)에 유전자 도입하고 48시간 배양하여 단백질을 발현시켰다. HMGB1 단백질을 각각 발현시킨 세포 및 배양 상청액은 4℃에서 16시간 인큐베이트한 후 4400g·5분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 이 상청액 50mL당 100μL의 Anti Flag항체Gel(Sigma)을 혼합하여 4℃에서 16시간 인큐베이트하였다. 원심분리하여 겔을 회수한 후 PBS를 사용하여 5회 세정하였다. 또한 3X Flag peptide(final 100㎍/㎖)를 사용하여 용출하였다. 용출한 단백질은 HMGB1 ELISA kit(시노테스트)를 사용하여 농도를 확인하고 동결 건조 후 PBS를 사용하여 200㎍/mL로 조정하였다.

2)8주령 수컷 마우스(C57/Bl6)의 꼬리정맥으로부터 전술한 피부 추출액(SE) 500μL 또는 음의 대조군으로서 PBS 500μL를 30G1/2의 주사바늘을 장착한 주사기를 사용하여 투여하였다(도 33). 투여 6/12/24/48시간후 이소퓨란에 의한 흡입 마취하에서 마우스의 심장으로부터 헤파린 코팅한 1mL의 주사기를 사용하여 말초혈1mL를 채혈하고 3mL의 PBS와 혼합한 후 3mL의 Ficol(GE healthcare)위에 조용히 중층하였다. 원심기를 사용하여 25℃에서 400g, 40분간 원심분리하였다. 중간층의 백탁된 층의 세포를 단핵구 분획으로서 회수하였다. 회수한 세포에 용혈제인 HLB solution(면역 생물 연구소) 1mL를 가하여 실온에서 5분 인큐베이트하였다. 이 용혈 조작을 2회 반복하였다. 10mL의 PBS를 가하여 25℃에서 440g, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하고 세포를 회수하였다. 이 세포 1,000,000개에 항마우스 PE표식 PDGFRα항체(e-Bioscience), PE표식 항마우스 PDGFRβ항체(e-Bioscience), PerCy5 표식 항마우스 CD44 항체(BDbiosciences) 각각을 PBS로 100배 희석하여 20분간 실온에서 인큐베이트하였다. 그 후 이 세포를 25℃, 440g, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 1% 파라포름알데히드 함유 PBS를 400μL 가하여 유세포 분석기 해석의 샘플로 하였다.

8주령 수컷 마우스(C57/Bl6)의 꼬리정맥으로부터 마우스HMGB1을 250μL(1㎍/μL) 또는 음의 대조군으로서 PBS250μL를 30G1/2의 주사바늘을 장착한 주사기를 사용하여 투여하였다(도 35). 투여 12시간후 이소퓨란에 의한 흡입 마취하에 마우스의 심장으로부터 헤파린 코팅한 1mL의 주사기를 사용하여 말초혈 1mL를 채혈하고 3mL의 PBS와 혼합한 후 3mL의 Ficol(GE healthcare)위에 조용히 중층하였다. 원심기를 사용하여 25℃에서 400g, 40분간 원심분리하였다. 중간층의 백탁된 층의 세포를 단핵구 분획으로서 회수하였다. 회수한 세포에 1mL의 용혈제인 HLB solution(면역 생물 연구소)를 가하여 실온에서 5분 인큐베이트하였다. 이 용혈 조작을 2회 반복하였다. 10mL의 PBS를 가하여 25℃에서 440g, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하고 세포를 회수하였다. 이 세포 1,000,000개에 항마우스 PE표식 PDGFRα항체(e-Bioscience), PerCy5표식 항마우스CD44항체(BDbiosciences) 각각을 PBS로 100배 희석하고 20분간 실온에서 인큐베이트하였다. 그 후 이 세포를 25℃, 440g, 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 1% 파라포름알데히드 함유 PBS를 400μL 가하여 유세포 분석기 해석의 샘플로 하였다.

결과: 피부 추출액(SE) 주사 12시간후의 말초혈에서 유의적으로 PDGFRα양성, CD44양성세포가 동원되는 것이 확인되었다(도 34). HMGB1 주사 12시간후 말초혈에서 유의적으로 PDGFRα양성, CD44양성 세포가 동원되는 것이 확인되었다(도 36).

[참고예 8]

목적: 재조합 HMGB1 단백질의 정맥내 투여에 의해 중간엽 줄기세포가 말초혈 중에 동원되는지를 확인하였다.

방법: C57BL6마우스(8∼10 주령, 수컷) 꼬리정맥으로 재조합 HMGB1단백/생리식염수(100㎍/㎖)를 400㎕(40㎍HMGB1) 혹은 생리식염수 400㎕ 투여하였다. 12시간후에 마우스 말초혈을 채취하고 PBS를 가하여 전량을 4mL로 희석하였다. 원심관에 Ficoll-PaquePlus(GE)액을 3mL 삽입 후 그 위에 희석 혈액을 중층하였다. 100G(18℃)로 10분간 원심분리하여 단핵구를 포함한 중간층을 새로운 원심관에 회수하고 45mL의 PBS를 가하여 440G(18℃) 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 또한, 재차 45mL의 PBS를 가하여 440G(18℃) 5분간 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 얻어진 단핵구를 Phycoerythrobilin(PE)표식 항마우스 PDGFRα항체 및 Allophycocyanin(APC)표식 항마우스 CD44 항체로 반응시킨 후 유세포 분석기(Facscan;Becton Dickinson and Company)에 의해 단핵구 분획내의 PDGFRα양성/CD44양성 세포의 존재 빈도를 평가하였다.

결과: HMGB1투여 12시간후에 말초혈 단핵구 분획내의 PDGFRα양성이면서 CD44양성 세포 및 PDGFRα양성이면서 CD44음성 세포가 유의적으로 증가한다는 것이 명백해졌다(도 37). 즉, HMGB1은 골수내에서 말초혈중에 중간엽 줄기세포의 마커로서 알려져 있는 PDGFRα양성 세포를 동원하는 활성이 있는 것으로 나타났다.

고찰: PDGFRα 및 CD44는 골수 유래 다능성 줄기세포를 대표하는 골수 중간엽 줄기세포의 표면 마커로서 알려져 있다. 골수 중간엽 줄기세포는 골세포, 연골세포, 지방세포로 분화 가능한 다능성 줄기세포이며, 또한 신경세포나 상피세포 등으로도 분화 가능하다. 또한, 본 실험에서 사용한 피부조각은 조혈 상태이므로 서서히 조직이 괴사 상태가 되어 세포 표면의 단백질 내지 핵 등의 세포내 단백질이 주위로 방출된다. 또한, HMGB1은 피부 추출액에 함유되는 단백질이다. 이식피부 등에서는 이들 단백질이 신호가 되어 식피조각에 골수 유래의 조직 줄기세포를 동원하여 이식피부조각 내에서 골수세포 유래 표피, 피하조직, 모포조직 등을 재구축하여 기능적 피부를 재생한다고 생각된다. 본 실험은 이와 같은 피부 추출액 또는 HMGB1을 정맥내에 투여함으로써 말초 순환중에 골수 유래 조직 줄기세포를 동원하는 것에 성공한 최초의 발견이다. 본 발견에 의해 골수 유래 다능성 줄기세포를 말초혈중에 동원하여 뇌경색이나 심근경색, 골절, 피부궤양 등의 조직 손상을 동반하는 난치성 질환에 대한 신규 치료법이 가능해진다. 또한, 말초혈중에 동원된 세포는 통상의 채혈과 같이 채취가 가능하며 지금까지 뇌경색 치료를 위해 골수로부터 채취해온 종래의 방법에 비해 간편하고 안전한 골수 유래 조직 줄기세포의 채취 방법이 가능해졌다.

본 발명은 종래 불가능했던 생체내 기능적 세포의 저침습성 회수를 가능하게 하는 것이다. 그 결과 그 생체 유래 기능성 세포를 사용한 기초 연구의 진전, 회수 세포를 이용한 재생 의료의 진전이 기대되어 난치성 질환으로 고통받는 환자에게 새로운 의료를 제공하기 위한 혁신 기술이라고 기대된다. 또한, 생체내에 삽입하는 용기는 새로운 의료 재료 개발을 위한 토대로서, 이 분야의 산업 진전에 기여할 것으로 기대된다.

SEQUENCE LISTING <110> GENOMIX CO., LTD. OSAKA UNIVERSITY <120> Method for collecting functional cells in vivo with high efficiency <130> G6-A0802P <150> JP 2008-119355 <151> 2008-04-30 <160> 32 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg 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norvegicus <400> 5 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu 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Val Ile Lys Met Gly Val 65 70 75 80 Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu 85 90 <210> 22 <211> 282 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 atgttgaccg agctggagaa agccttgaac tctatcatcg acgtctacca caagtactcc 60 ctgataaagg ggaatttcca tgccgtctac agggatgacc tgaagaaatt gctagagacc 120 gagtgtcctc agtatatcag gaaaaagggt gcagacgtct ggttcaaaga gttggatatc 180 aacactgatg gtgcagttaa cttccaggag ttcctcattc tggtgataaa gatgggcgtg 240 gcagcccaca aaaaaagcca tgaagaaagc cacaaagagt ag 282 <210> 23 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Met Ala Asn Lys Ala Pro Ser Gln Met Glu Arg Ser Ile Thr Thr Ile 1 5 10 15 Ile Asp Thr Phe His Gln Tyr Ser Arg Lys Glu Gly His Pro Asp Thr 20 25 30 Leu Ser Lys Lys Glu Phe Arg Gln Met Val Glu Ala Gln Leu Ala Thr 35 40 45 Phe Met Lys Lys Glu Lys Arg Asn Glu Ala Leu Ile Asn Asp Ile Met 50 55 60 Glu Asp Leu Asp Thr Asn Gln Asp Asn Gln Leu Ser Phe Glu Glu Cys 65 70 75 80 Met Met Leu Met Ala Lys Leu Ile Phe Ala Cys His Glu Lys Leu His 85 90 95 Glu Asn Asn Pro Arg Gly His Gly His Ser His Gly Lys Gly Cys Gly 100 105 110 Lys <210> 24 <211> 342 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 atggccaaca aagcaccttc tcagatggag cgcagcataa ccaccatcat cgacaccttc 60 catcaatact ctaggaagga aggacaccct gacaccctga gcaagaagga attcagacaa 120 atggtggaag cacagttggc aacctttatg aagaaagaga agagaaatga agccctcata 180 aatgacatca tggaggacct ggacacaaac caggacaatc agctgagctt tgaggagtgt 240 atgatgctga tggcaaagtt gatctttgcc tgtcatgaga agctgcatga gaacaaccca 300 cgtgggcatg gccacagtca tggcaaaggc tgtgggaagt aa 342 <210> 25 <211> 113 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 25 Met Ala Ala Lys Thr Gly Ser Gln Leu Glu Arg Ser Ile Ser Thr Ile 1 5 10 15 Ile Asn Val Phe His Gln Tyr Ser Arg Lys Tyr Gly His Pro Asp Thr 20 25 30 Leu Asn Lys Ala Glu Phe Lys Glu Met Val Asn Lys Asp Leu Pro Asn 35 40 45 Phe Leu Lys Arg Glu Lys Arg Asn Glu Asn Leu Leu Arg Asp Ile Met 50 55 60 Glu Asp Leu Asp Thr Asn Gln Asp Asn Gln Leu Ser Phe Glu Glu Cys 65 70 75 80 Met Met Leu Met Gly Lys Leu Ile Phe Ala Cys His Glu Lys Leu His 85 90 95 Glu Asn Asn Pro Arg Gly His Asp His Arg His Gly Lys Gly Cys Gly 100 105 110 Lys <210> 26 <211> 342 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 26 atggctgcca aaacaggatc tcagctggag cgcagcataa gcaccatcat caatgttttc 60 catcagtact ctaggaagta tggacatcct gacaccctga acaaggcgga attcaaagaa 120 atggtgaata aggacttgcc aaattttctg aagagggaga aaagaaatga aaatctccta 180 agagacatca tggaggacct ggacacaaac caggacaatc aactgtcctt tgaggagtgt 240 atgatgctga tgggaaagtt gatctttgcc tgtcatgaga agctgcatga gaacaaccca 300 cgtgggcatg accacaggca cggcaaaggc tgtgggaagt aa 342 <210> 27 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile 1 5 10 15 Asn Thr Pro His Glu His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp 20 25 30 Thr Leu Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln 35 40 45 Asn Phe Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His Ile 50 55 60 Met Glu Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu Glu 65 70 75 80 Phe Ile Met Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met 85 90 95 His Glu Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly 100 105 110 Glu Gly Thr Pro 115 <210> 28 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 atgacttgca aaatgtcgca gctggaacgc aacatagaga ccatcatcaa caccttccac 60 caatactctg tgaagctggg gcacccagac accctgaacc agggggaatt caaagagctg 120 gtgcgaaaag atctgcaaaa ttttctcaag aaggagaata agaatgaaaa ggtcatagaa 180 cacatcatgg aggacctgga cacaaatgca gacaagcagc tgagcttcga ggagttcatc 240 atgctgatgg cgaggctaac ctgggcctcc cacgagaaga tgcacgaggg tgacgagggc 300 cctggccacc accataagcc aggcctcggg gagggcaccc cctaa 345 <210> 29 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 29 atgcagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctgt gggttccagg ttccactggt 60 gac 63 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 30 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 31 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 31 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp 210 215 220 <210> 32 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 32 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

Claims (3)

1. 하기 (a) 및 (b) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 하기 (a) 및 (b)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물로 충전된 용기로부터, 상기 용기에 동원되어 있는 골수유래세포를 포함하는 세포 집단을 회수하는 방법:
   (a) 세포 또는 조직 추출액으로서, 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조된 것이고, 상기 세포 또는 조직이 생체 피부조직 또는 혈액인 세포 또는 조직 추출액;
   (b) 세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획으로서, (i) 상기 (a)에 규정된 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정, (ii) 공정 (i)에서 얻어진 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정, 및 (iii) 고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정을 포함하는 방법으로 제조되는, 세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획.
2. 하기 (a) 및 (b) 중 어느 하나에 기재된 물질, 또는 하기 (a) 및 (b)에 기재된 물질 중 2가지 이상의 물질의 혼합물로 충전된 용기로부터, 상기 용기에 동원되어 있는 골수유래세포를 포함하는 세포 집단을 회수하는 공정, 및
   (1) 상기 세포집단을 배양용기에 부착배양하여 부착성 세포를 분리하는 것,또는 (2) 상기 세포집단으로부터 세포 표면 마커 CD44, PDGFRα, 및 PDGFRβ 중 적어도 하나를 갖는 세포집단을 분리하는 것에 의해, 상기 회수된 세포 집단으로부터 골수유래세포를 분리하는 공정을 포함하는 골수유래세포를 수집하는 방법:
   (a) 세포 또는 조직 추출액으로서, 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정을 포함한 방법으로 제조된 것이고, 상기 세포 또는 조직이 생체 피부조직 또는 혈액인 세포 또는 조직 추출액;
   (b) 세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획으로서, (i) 상기 (a)에 규정된 세포 또는 조직을 용매에 침지하는 공정, (ii) 공정 (i)에서 얻어진 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정, 및 (iii) 고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정을 포함하는 방법으로 제조되는, 세포 또는 조직 추출액의 헤파린 결합 분획.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 세포 또는 조직 추출액이 피부 추출액 또는 말초혈 추출액인 것인 방법.

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