JP2006517537A - Ｄｎａ結合タンパク質の使用 - Google Patents

Ｄｎａ結合タンパク質の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、特定のプロセスのための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。前記プロセスは、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生、創傷治癒、創床血管形成、上皮化、及び歯や骨の移植における治癒から成る群から選択される。核酸は、ＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択される。

Description

本発明は、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生、細胞の脱分化及び／又は細胞の再プログラム化のため、組織再生のため、組織老化に影響を及ぼすため、及び創傷治癒のための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用；血管新生、血管形成、新血管形成及び経心筋的血管再生のための方法、組織再生及び創傷治癒のための方法、及び組織老化に影響を及ぼすための方法；血管形成、特に、心筋梗塞の際、及び歯や骨の移植における治癒の際の血管形成のための方法；組織再生のための方法；細胞の脱分化及び／又は再プログラム化のための方法；このような核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を含む担体材料；及び被覆基材と核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とを含む創傷被覆材料に関する。
本発明の各種様相は、本発明に関与するプロセスが各種医療用途に適した細胞の（脱）分化に関連しているように思われる点で共通している。特に本発明は、脊椎動物（好ましくは哺乳動物及びヒト）の血管系、及びそれらの皮膚に適用される。
ヒトの血管系は、動脈、細動脈、毛細血管、末端血管床（terminal vascular beds）、細静脈及び静脈から成る。動脈は、心臓から血液を送り出す血管で、次の二種類、即ち筋性動脈と弾性動脈とに区分されるが、弾性動脈の方が心臓に近接している。通常、動脈は、内膜、中膜及び外膜から構成されており、内膜（脈管内膜とも呼ばれる）は、管腔に面する単層の内皮細胞と、緩い結合組織性の内皮下層と、内弾性膜（筋性動脈でよく発達している）とを有し、中膜は、筋性動脈の場合、高密度で円形或いはらせん形状に配置された平滑筋細胞層と微細膠原線維とから構成され、また、弾性動脈の場合、多くの窓のような穴及びそこに埋め込まれた平滑筋細胞を有する多数の弾性膜と膠原線維とから構成されており、外膜は、膠原結合組織と、弾性線維と、栄養管と、神経管とから構成されている。中膜と外膜との間に外弾性板が形成されている場合がある。
動脈は、内皮と、格子線維網と、単層接触平滑筋層とから成る細動脈を最終血管部分として有するが、細動脈には動脈内に存在する内弾性板が存在せず、細動脈は心筋内皮と接触している。
細動脈は、毛細血管、即ち、直径が約６〜約２０〜３０μｍの小さい血管になる。毛細血管の壁は格子線維で囲まれた基底膜から成る内皮によって構成されている。この基底膜の外部は、分枝状細胞、いわゆる周皮細胞によって覆われている。周皮細胞は、毛細血管血液と組織との間の物質移動に関与する可能性が最も高い。
次いで、毛細血管は細静脈になり、最後には静脈、即ち、心臓に血液を送る血管になる。通常、静脈の壁は、多数の弾性線維を有する内膜と、平滑筋束が緩く配置された中膜と、外膜とから成るが、静脈壁には内弾性板は存在しない。動脈の場合とは対照的に、組織プレパラートにおいてこれらの層の境界は不鮮明である。
血液の微小循環を定める、細動脈、毛細血管及び細静脈から成る血管系の一部を末端血管床と称する。末端血管床は血液の動脈流入と静脈流出との間の血行力学の観点からは中立的部分であり、よって、循環系のターニングポイントである。この部分においては、血液と組織との間で物質やガスの交換が行われると共に、熱環境及びイオン環境が維持される。
皮膚は、哺乳類の体、特に人体においても重要な器官である。皮膚は、狭義での皮膚、即ち、真皮と、広義での皮膚の要素としての皮下組織（subcutis）とから成り、真皮の外側には表皮及びｃｕｔｉｓ（ｃｏｒｉｕｍとも称する）があり、それに付属器（毛や爪、腺等）が続く。皮膚の機能は非常に多岐に亘る。環境に対する機械的バリアとして機能する一方、皮膚は、血流が非常に多いことや、毛や脂肪体の断熱作用、更に、水分代謝の調節にも関与する汗の蒸発によって、血液分布や温度調節に有効な熱防御器官としても機能する。また、酸性被覆（acidic coverage）による細菌に対する防御器官としての機能だけでなく、色素形成による放射線に対する防御器官としての機能や、脂肪蓄積によるエネルギー貯蔵器官としての機能も有する。更に、皮膚は、そこへ埋め込まれた末端器官によって重要な感覚器官としても機能する。更に、皮膚は、様々な防御機能を有する免疫器官でもある。このため、皮膚は、特に創傷治癒や皮膚老化に関して大いに注目されている。
創傷治癒とは、細胞と、細胞外基質と、原形質膜と、各種サイトカインや成長因子によって調整、制御された血管新生との複雑な相互作用を伴う動的プロセスである。創傷の種類や組織損失の程度とは関係なく、創傷治癒は、時間的に重なる段階（炎症期や浸出期等）、増殖期、分化期及び再構築期にグループ分けすることができる。このグループ分けは、原則として修復プロセス時の形態学的変化に基づくものであり、修復プロセスの真の複雑さを反映していない。
創傷治癒のプロセスは、計量可能な側面から一次創傷治癒と二次創傷治癒とに分けることができるが、組織損傷の程度や種類に起因するであろう治療上の問題を考える上で、このプロセスを更に遷延一次治癒と慢性創傷とに分けることができる。一次創傷治癒は、例えば、切創表面が滑らかに密着しており、組織の損失が少なく、血管に富んだ組織内に異物の蓄積がない場合に起こる。一次創傷治癒は、通常、手術創傷や先の鋭い物によって偶発的に生じる創傷に関連して起こる。創傷が生じた過程によって、感染を考慮に入れる必要がある場合、遷延一次治癒となろう。感染が起こった場合、創傷治癒は二次治癒として分類される。二次治癒は、大きな欠損が生じたために肉芽組織を形成する必要がある場合、或いは感染によって傷口を直ぐに閉じることができない場合に行う。８週間以内に創傷治癒過程が完了しない場合、慢性創傷と呼ばれる。慢性創傷はどの創傷治癒段階においても生じ得るが、通常、起源の異なる組織疾患や、局所圧迫損傷、放射線損傷、腫瘍に起因する組織破壊の進行によって生じる。
創傷治癒は更に、急性創傷と慢性創傷との区別に基づいて分類され得る。急性創傷の範囲は、急性外傷性創傷から、複合外傷性欠損、熱的及び化学的創傷、火傷及び切開、手術創傷に及ぶ。
急性外傷性創傷の場合、任意に創傷を切除した後、張力を加えずに傷口を合わせることができれば、創傷の一次閉鎖は縫合、クリップ或いは傷用ストリップ類によって行うことができる。感染を示す可能性のある創傷の場合、先ず、感染が排除されるまで創傷を滅菌湿潤ドレッシング材によって開いたままにする。二次治癒や複合創傷においては、創傷の閉鎖はより複雑になる。
熱的乃至化学的創傷、即ち、加熱、冷却、組織損傷放射線、酸或いは塩基によって生じる創傷の場合、損傷パターンに応じて治療がなされる。例えば、重度の熱傷患者の場合、先ず、壊死部切除術を行い、次いで皮膚移植によって外科的交換を行う。創傷に対して移植ができない場合、或いは熱傷の程度によって十分なドナー部位が得られない場合には、いわゆる同種異系(allo)或いは異種(xeno)移植を用いる。十分なドナー部位がある場合、永久自家皮膚移植を用いることができる。具体的な形態の一種に自家角化細胞移植がある。
慢性創傷とは、原因療法や適切な局所療法にもかかわらず、８週間以内に治癒しない二次治癒創傷である。慢性創傷は急性創傷からどの段階でも生じ得るが、慢性創傷は主に、静脈、動脈或いは代謝起因の血管疾患、圧迫損傷、放射線損傷及び腫瘍によって引き起こされる組織損傷進行の最後の段階を示す。各種慢性創傷はそれぞれ異なる病態によって引き起こされるが、生化学的観点で言えば、このような創傷は同類と見なされる。創傷治癒に影響を及ぼす局所因子としては、異物や虚血、反復外傷、感染等が挙げられる。また、創傷治癒に影響を及ぼし得る全身性因子としては、加齢や栄養不良、栄養失調、糖尿病、腎疾患等が挙げられる。経済的に見て最も本発明に適応する慢性創傷治癒障害としては、静脈性下腿潰瘍や動脈性下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡潰瘍、慢性外傷後創傷等が挙げられる。
急性創傷や慢性創傷は別として、皮膚老化は皮膚の本質的変化の一種であり、時間によって生じる老化と環境因子によって生じる老化とに分けられる。「時間による老化」とは、皮膚層の薄化や皮膚腺の機能低下を引き起こす通常の皮膚老化プロセスによって生じる変化を意味する。これによって、加齢に従い、皮膚は薄くなり、乾燥し、細かい皺が形成される。加齢に起因する小皺や皺はそれぞれ真皮内のコラーゲンや弾性線維の減少及び損失によって生じる。また、老化した皮膚の完全性はより簡単に阻害され、その再生に時間がかかるため、生体は高い感染の危険にさらされる。加齢による細胞再生の遅延や低下は、ホルモンの変化や遺伝的因子等に影響される。しかし、この老化プロセスの加速や促進に大きな影響を及ぼすのは環境因子である。
環境因子によって生じる老化においては、生涯に亘る紫外線量は重要な因子であり、よって、このような老化は「光老化」とも呼ばれる。しかし、ニコチン乱用による皮膚内の血流低下等の他の因子によっても、このような老化プロセスが促進される。太陽光のＵＶ−Ｂ部分は主に表皮細胞の損傷を引き起こして皮膚癌の前駆症（いわゆる光線性角化症）や皮膚癌（基底細胞腫、扁平上皮癌、黒色腫）を生じさせ、一方、ＵＶ−Ａ線は真皮に到達し皮膚の結合組織を破壊する（弾力線維症）。この結果、顔と首において皮膚がたるみ、皺が目立つようになり、ひだが形成される。紫外線への恒久的な曝露によって、いわゆる老斑も生じるが、これは好ましくは顔及び手の甲の光曝露部分で発生する。このような色素沈着過度とは対照的に、光によって色素沈着不足（滴状メラニン減少症（hypomelanosis guttata））が生じることもある。これらの現象は慢性光損傷と称され、不可逆的プロセスと見なされる。
各種創傷の治療は、基本的に、受動的創傷治療と能動的創傷治療とに分類することができる。具体的な形態として、皮膚置換法も用いることができる。感染に対する防御用の単なる被覆材としての不活性繊維ドレッシング材を受動的創傷治療に用いる。不活性ドレッシング材とは対照的に、相互作用的創傷被覆は、湿潤な創傷環境を生み出すことによって治癒プロセスを促進することを目的としていることが多い。これに関連して、ハイドロコロイドやハイドロゲル、ハイドロポリマー、発泡体ドレッシング材、アルギン酸カルシウム等が用いられる。このような受動的創傷治療の不都合な点は、問題のある創傷、特に抗治療的であるとされることの多い慢性創傷の能動的治癒がドレッシング材によって促進されないということである。
従来技術においては、血管新生及び／又は能動的創傷治療に用いることができ、創傷治癒プロセスの個々の標的分子をターゲットとする様々な成長因子が記載されている。このような成長因子としては、ＶＥＧＦやトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インターロイキン１β、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＦ）及び血液凝固因子ＸＩＩＩ等が挙げられる。これらの化合物に対する期待は未だ実現されていないが、これは少なくとも一部創傷治癒プロセスの複雑さに起因するものである。
創傷を被覆するための皮膚置換法に関しては、一時的皮膚置換と永久的皮膚置換とに区別される。一時的皮膚置換としては、同種異系生物起源の場合、例えば、死体から採取した脱細分化ヒト真皮等の外来皮膚と角化細胞或いは分層皮膚のシートとを併用する場合、或いは異種生物起源の場合、例えば、ウマコラーゲン線維、ウシコラーゲンスポンジ、或いは合成材料と生体物質との組合せ（シリコーン或いはナイロンとコラーゲン基質及び／又は線維芽細胞とを組み合わせたシート等）を用いる場合が挙げられる。永久的皮膚置換としては、自家皮膚移植の場合、或いは細胞培養に基づく場合が挙げられる。
様々な生理的プロセスが一方では創傷治癒に、他方では皮膚老化に関与しており、皮膚老化に対抗するための様々な治療的及び美容的アプローチが、いわゆる老化防止製品を用いてなされている。スティフトゥング・ワレンテスト（Stiftung Warentest）によって行われた研究によると（テスト（test）Ｓｐｅｚｉａｌ Ｋｏｓｍｅｔｉｋ ２００２、１７〜１９頁、特別版）、市販製品の大部分は、特に皺を滑らかにするという点では、効果が全くないか或いは非常に低いとのことである。老化防止製品に関しては、老化プロセスを遅らせることをターゲットとした戦略のみが有効である。従って、皮膚を外部の環境因子（ＵＶ−Ｂ線や大気汚染等）から防御するために、ビタミン類や酸化防止剤が用いられている。それとは別に、皺や他の小さな皮膚損傷は美容整形によって治療されている。しかし、美容整形の場合、かなりの設備が必要となる。皺取りのために現在用いられている他の技法として、ボツリヌス毒素の注入がある。ボツリヌス毒素は中毒を引き起こすため、毒素を注入した皺部分の筋細胞を麻痺させ、皮膚を持ち上げる。原因不明の副作用とは別に、この治療の更なる不都合な点としては、毒素注入の際或いはそれ以降、約５％の患者において、中和抗体の形成により治療がもはや有効でなくなるということである。
本発明の課題は、血管新生や新血管形成を促進或いは阻害するか、又は経心筋的血管再生を促進することによってこのようなプロセスに関する疾患を治療するための手段を提供することである。更なる様相においては、本発明の課題は、創傷治癒を促進或いは開始するための手段を提供することである。
更に、本発明の課題は、細胞、特に間葉細胞及び上皮細胞を分化、任意的には脱分化及び／又は増殖させることができる状態に該細胞を移行させるための手段を提供することである。更なる様相において、本発明の課題は、創傷治癒を促進或いは開始するための手段を提供することである。最後に、本発明の課題は、皮膚老化に抵抗するための手段を提供することである。
本発明の第１の様相において、課題の解決は、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生、創傷治癒、創傷後血管形成、上皮化、及び歯や骨の移植における治癒から成る群から選択されるプロセスにおける一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用であって、核酸は、ＨＭＧタンパク質（high mobility group proteins）の遺伝子から成る群から選択される使用によってなされる。
本発明の第２の様相において、課題の解決は、不十分な或いは過剰な血管新生や新血管形成、或いは創傷治癒に関連するか、或いは経心筋的血管再生を必要とする疾患の群から選択される疾患の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、核酸は、ＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択される使用によってなされる。
好ましくは第１及び第２の様相の実施形態である、本発明の第３の様相において、課題の解決は、疾患の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、前記疾患が、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑変性症、関節炎、子宮内膜症、パンヌス、組織球増殖症、乾癬、酒さ、小静脈瘤、発疹性血管腫、腫瘍疾患、海綿腫、唇血管腫、血管肉腫、痔核、動脈硬化、狭心症、虚血、梗塞、基底細胞腫、扁平上皮癌、黒色腫、カポジ肉腫、腫瘍、妊娠中毒症、不妊症、急性外傷性創傷、熱的創傷、化学的創傷、手術創傷及び慢性創傷から成る群から選択されることを特徴とする使用によってなされる。
第１、第２及び第３の様相の一実施形態においては、慢性創傷は、褥瘡、下腿潰瘍、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡潰瘍、慢性外傷後創傷及び糖尿病性足潰瘍から成る群から選択される。
第１、第２及び第３の様相の一実施形態においては、ＨＭＧタンパク質は、ＨＭＧＡファミリー、ＨＭＧＢファミリー及びＨＭＧＮファミリーから成る群から選択される。
第１、第２及び第３の様相の一実施形態においては、ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＢファミリーから選択される。
第１、第２及び第３の様相の好ましい実施形態においては、ＨＭＧタンパク質は、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２及びＨＭＧＢ３から成る群から選択される。
第１、第２及び第３の様相のより好ましい実施形態においては、ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＢ１である。
第１、第２及び第３の様相の一実施形態においては、ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡファミリーから選択される。
第１、第２及び第３の様相の好ましい実施形態においては、ＨＭＧタンパク質は、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂ、ＨＭＧＡ１ｃ及びＨＭＧＡ２から成る群から選択される。
第１、第２及び第３の様相のより好ましい実施形態においては、ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡ１ａである。
第１、第２及び第３の様相の一実施形態においては、第１のＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡファミリーから選択され且つ第２のＨＭＧタンパク質はＨＭＧＢファミリーから選択され、好ましくはＨＭＧＡファミリーのタンパク質はＨＭＧＡ１ａであり、好ましくはＨＭＧＢファミリーのタンパク質はＨＭＧＢ１である。
第１、第２及び第３の様相の一実施形態においては、ＶＥＧＦ及び／又はこれをコードする核酸を更に用いる。
本発明の第４の様相において、課題の解決は、組織の血管新生、新血管形成或いは創傷治癒に影響を及ぼすための方法であって、
ａ）組織或いはその一部を用意する工程と、
ｂ）一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を添加する工程と、
ｃ）前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と共に前記組織をインキュベートする工程とを含む方法において、前記核酸はＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択され、任意的に
ｄ）前記組織或いはその中間体を取得或いは回収する工程を含む、方法によってなされる。
第４の様相の一実施形態においては、前記組織或いはその一部は、ＶＥＧＦ及び／又はこれをコードする核酸と共にインキュベートする。
第４の様相の一実施形態においては、前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。
第４の様相の一実施形態においては、前記組織は外植組織或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養組織である。
第４の様相の一実施形態においては、前記核酸、その転写物及びその翻訳物は、先の各様相及び各実施形態のいずれかに記載のものである。
第４の様相の一実施形態においては、二種以上のＨＭＧＢタンパク質或いはそれらをコードする核酸を用い、好ましくは第１のＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡファミリーから選択されると共に第２のＨＭＧタンパク質はＨＭＧＢファミリーから選択され、ＨＭＧＡファミリーのタンパク質はＨＭＧＡ１ａが好ましく、ＨＭＧＢファミリーのタンパク質はＨＭＧＢ１が好ましい。
第１、第２、第３及び第４の様相の一実施形態においては、ＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択される前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を用いることに加え、血管内皮成長因子の遺伝子から成る群から選択される新たな核酸、その転写物或いはその翻訳物を用いる。
本発明の第５の様相において、課題の解決は、本明細書に記載の一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物によってなされる。
本発明の第６の様相において、課題の解決は、本明細書に記載の一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を含む担体材料によってなされる。
第６の様相の一実施形態においては、前記担体材料は、セルロース、アガロース、コラーゲン、シリコーン、ケイ素、プラスチック、ゲル、ハイドロゲル、フィブリン系マトリックス、人工連続フィラメント糸、ハイドロコロイド、脂肪コロイド（lipocolloids）、ポリウレタン、ポリウレタン樹脂、プラスター、合成生体材料、熱可塑性プラスチック、亜鉛膠（zinc glue）、ポリエステルフォーム、ポリイソブチレン、緩衝剤、安定剤、静菌剤、及び保湿剤から成る群から選択される材料から構成される。
第６の様相の一実施形態においては、前記担体材料はインプラントとして、或いは創傷治癒のために用いる。
本発明の第７の様相において、課題の解決は、被覆基材と、本明細書に記載の一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とを含む創傷被覆材料によってなされる。
第７の様相の一実施形態においては、前記被覆材料は、ハイドロコロイドドレッシング材、アルギン酸カルシウムドレッシング材、活性炭製圧定布及びオーバーレイ、発泡プラスチック製オーバーレイ、フィルムドレッシング材、透明ドレッシング材、発泡シリコーンドレッシング材、フリースオーバーレイ、ハイドロセルラードレッシング材、ハイドロセレクティブ創傷オーバーレイ、吸収創傷パッド、スプレードレッシング材、人工連続フィラメント製ガーゼ、綿ガーゼ、パラフィンガーゼ、銀被覆創傷ドレッシング材、及びハイドロポリマー／発泡体ドレッシング材から成る群から選択される。
本発明の第８の様相において、課題の解決は、一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と担体相とを含む組成物であって、前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は本明細書に記載のものであり、前記担体相は、好ましくは、クリーム、脂肪性軟膏、エマルジョン（水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｗ／Ｏ）型、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型）、マイクロエマルジョン、変性エマルジョン、ナノ粒子／ナノエマルジョン、リポソーム、ハイドロディスパージョンゲル（ハイドロゲル、アルコールゲル、リポゲル、テンサイドゲル（tenside gels））、ゲル−クリーム、ローション、オイル／オイルバス、及びスプレーから成る群から選択される、組成物によってなされる。
本発明の第９の様相において、課題の解決は、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生及び創傷治癒から成る群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
ｂ）候補化合物を用意する工程と、
ｃ）前記候補化合物を試験し、前記試験系において候補化合物が起こす反応を決定する工程とを含む、方法によってなされる。
本発明の第１０の様相において、課題の解決は、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生及び創傷治癒から成る群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
ｂ）参照化合物を用意する工程と、
ｃ）前記試験系において前記参照化合物を試験し、該系において参照化合物が起こす反応を決定する工程と、
ｄ）候補化合物を用意する工程と、
ｅ）前記試験系において前記候補化合物を試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する工程と、
ｆ）前記試験系における参照化合物の反応と候補化合物の反応とを比較する工程とを含む、方法によってなされる。
本発明の第１１の様相において、課題の解決は、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生及び創傷治癒から成る群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
ｂ）マーカーを有する参照化合物を用意する工程と、
ｃ）前記試験系において前記参照化合物を試験し、該系において参照化合物が起こす反応を決定する工程と、
ｄ）候補化合物を用意する工程と、
ｅ）前記参照化合物を含む試験系において前記候補化合物を試験し、試験系の反応を決定し、遊離した参照化合物の量及び／又は参照化合物から放出されたマーカーの量を測定する工程とを含む、方法によってなされる。
本発明の第１２の様相において、課題の解決は、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生及び創傷治癒から成る群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
ｂ）マーカーを有する候補化合物を用意する工程と、
ｃ）前記試験系において前記候補化合物を試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する工程と、
ｄ）参照化合物を用意する工程と、
ｅ）前記候補化合物を含む試験系において前記参照化合物を試験し、試験系の反応を決定し、遊離した候補化合物の量及び／又は候補化合物から放出されたマーカーの量を測定する工程とを含む、方法によってなされる。
第９、第１０、第１１及び第１２の様相の一実施形態においては、前記試験系はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系或いはｉｎ ｖｉｖｏ試験系である。
第９、第１０、第１１及び第１２の様相の一実施形態においては、前記参照化合物及び／又は候補化合物の反応は前記プロセスの促進であり、好ましくは、試験系における候補化合物の反応が参照化合物の反応と同等か或いはそれよりも顕著である場合、候補化合物が前記プロセスを促進する化合物である。
第９、第１０、第１１及び第１２の様相の一実施形態においては、前記参照化合物及び／又は候補化合物の反応は前記プロセスの阻害であり、好ましくは、候補化合物が起こす試験系の反応が試験系において参照化合物が起こす反応よりも顕著でない場合、候補化合物が前記プロセスを阻害する化合物である。
第９、第１０、第１１及び第１２の様相の一実施形態においては、前記参照化合物は、一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を含み、前記核酸はＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択されるものであり、好ましくは本明細書に記載のものである。
第９、第１０、第１１及び第１２の様相の一実施形態においては、前記プロセスは血管新生の阻害である。
本発明の第１３の様相において、課題の解決は、疾患の治療及び／又は予防のための化合物をスクリーニングするための第９〜第１２の様相のいずれかに記載の方法の使用であって、用意される試験系は該疾患のための試験系である、使用によってなされる。
第１３の様相の一実施形態においては、前記疾患は、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生或いは創傷治癒の促進或いは阻害を必要とする疾患から成る群から選択される。
第１３の様相の好ましい実施形態においては、前記疾患は、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑変性症、関節炎、子宮内膜症、パンヌス、組織球増殖症、乾癬、酒さ、小静脈瘤、発疹性血管腫、腫瘍疾患、海綿腫、唇血管腫、血管肉腫、痔核、動脈硬化、狭心症、虚血、梗塞、基底細胞腫、扁平上皮癌、黒色腫、カポジ肉腫、腫瘍、妊娠中毒症、不妊症、急性外傷性創傷、熱的創傷、化学的創傷、手術創傷及び慢性創傷から成る群から選択される。
第１３の様相の一実施形態においては、前記疾患は腫瘍疾患であって、好ましくは、前記腫瘍疾患は壊死細胞、好ましくは壊死腫瘍細胞を含む。
本発明の第１４の様相において、課題の解決は、第９〜第１２の様相のいずれかに記載の方法によって得られる化合物によってなされる。
本発明の第１５の様相において、課題の解決は、医薬、好ましくは本明細書に記載の疾患を治療及び／又は予防するための医薬を製造するための第１４の様相に記載の化合物の使用によってなされる。
本発明の第１６の様相において、課題の解決は、組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、心筋梗塞後の血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスのための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用であって、前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される、使用によってなされる。
本発明の第１７の様相において、課題の解決は、組織発達及び／又は組織再生、特に、発達或いは再生される組織の脱分化及び／又は分化に基づく組織発達及び／又は組織再生のための細胞の脱分化及び細胞の再プログラム化から成る群から選択されるプロセスのための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用であって、前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される、使用によってなされる。
本発明の第１８の様相において、課題の解決は、ＤＮＡ損傷の修復を必要とする疾患、組織再生を必要とする疾患、創傷治癒を必要とする疾患、組織老化に伴う疾患、歯や骨の移植を必要とする疾患、組織老化に伴う疾患、創傷治癒障害、皮膚疾患、色素性乾皮症、レザースキン（Leaderhaut, leather skin）、皮膚癌、火傷後の皮膚癌、火傷後の皮膚老化、火傷、及び心筋梗塞から成る群から選択される疾患の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される、使用によってなされる。
本発明の第１９の様相において、課題の解決は、化粧品、好ましくは、組織再生、創傷治癒、レザースキンの防止、皮膚癌、特に日焼け（サンバーン）後の皮膚癌の防止、皮膚老化、特にサンバーン後の皮膚老化防止、組織老化抑制及び／又は組織若返りのための化粧品を製造するための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、前記核酸は塩基性ＤＮＡタンパク質の遺伝子から成る群から選択される、使用によってなされる。
本発明の第２０の様相において、課題の解決は、皮膚疾患、色素性乾皮症、レザースキン、皮膚癌、サンバーン後の皮膚癌、サンバーン、急性創傷及び慢性創傷からなる群から選択される疾患の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される、使用によってなされる。
第２０の様相の一実施形態においては、前記急性創傷は、急性外傷性創傷、熱的創傷、化学的創傷及び手術創傷から成る群から選択される。
第２０の様相の一実施形態においては、前記慢性創傷は、褥瘡、下腿潰瘍、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡潰瘍、慢性外傷後創傷及び糖尿病性足潰瘍から成る群から選択される。
第１６〜第２０の様相の一実施形態においては、前記塩基性ＤＮＡ結合タンパク質はＨＭＧタンパク質からなる群から選択される。
第１６〜第２０の様相の一実施形態においては、前記ＨＭＧタンパク質は、ＨＭＧＡ、ＨＭＧＢ及びＨＭＧＮから成る群から選択される。
第１６〜第２０の様相の一実施形態においては、前記ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡファミリーのタンパク質である。
第１６〜第２０の様相の好ましい実施形態においては、前記タンパク質は、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂ及びＨＭＧＡ２から成る群から選択される。
第１６〜第２０の様相の一実施形態においては、前記核酸は、配列番号３１〜６４の核酸及びそれぞれの誘導体から成る群から選択される。
第１６〜第２０の様相の一実施形態においては、前記翻訳物は、配列番号１〜３０の配列を有するポリペプチド及びそれぞれの誘導体から成る群から選択される。
第１６〜第２０の様相の好ましい実施形態においては、前記タンパク質は変性を有しており、変性はリン酸化及びアセチル化から成る群から選択される。
本発明の第２１の様相において、課題の解決は、組織を再生するための方法であって、
ａ）組織或いはその一部を用意する工程と、
ｂ）核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を添加する工程と、
ｃ）前記組織と前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とをインキュベートする工程とを含む方法において、前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択され、任意的に
ｄ）再生した組織或いはその中間体を取得或いは回収する工程を含む、方法によってなされる。
第２１の様相の一実施形態においては、前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。
第２１の様相の一実施形態においては、再生しようとする組織は工程ａ）で用意される組織と異なるか或いは同一である。
第２１の様相の一実施形態においては、再生しようとする組織及び／又は工程ａ）で用意される組織は、互いに独立的に、皮膚組織、脂肪組織、軟骨組織、筋肉組織、血液細胞、造血細胞、及び神経細胞から成る群から選択される。
第２１の様相の一実施形態においては、前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は、本明細書に記載のものである。
本発明の第２２の様相において、課題の解決は、細胞を脱分化及び／又は再プログラム化するための方法であって、
ａ）一種以上の細胞を用意する工程と、
ｂ）核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を添加する工程と、
ｃ）前記細胞と前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とをインキュベートする工程とを含む方法において、核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される、方法によってなされる。
第２２の様相の一実施形態においては、前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。
第２２の様相の一実施形態においては、前記方法は更に、
ｄ）脱分化した細胞及び／又は再プログラム化された細胞を取得する工程を含む。
第２２の様相の一実施形態においては、脱分化した細胞及び／又は再プログラム化された細胞及び／又は工程ａ）で用意された細胞は、独立的に、表皮細胞、皮膚細胞、脂肪組織細胞、軟骨組織細胞、筋肉組織細胞、血液細胞、造血組織細胞及び神経細胞から成る群から選択される。
第２２の様相の一実施形態においては、前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は本明細書に記載のものである。
本発明の第２３の様相において、課題の解決は、本明細書に記載の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と薬学的に適切な担体とを含有する医薬組成物によってなされる。
本発明の第２４の様相において、課題の解決は、核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を含む担体材料であって、前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は本明細書に記載のものである、担体材料によってなされる。
第２４の様相の一実施形態においては、前記担体材料は、セルロース、アガロース、コラーゲン、シリコーン、ケイ素、プラスチック、ゲル、ハイドロゲル、フィブリン系マトリックス、人工連続フィラメント糸、ハイドロコロイド、脂肪コロイド、ポリウレタン、ポリウレタン樹脂、プラスター、合成生体材料、熱可塑性プラスチック、亜鉛膠、ポリエステルフォーム、ポリイソブチレン、緩衝剤、安定剤、静菌剤、及び保湿剤から成る群から選択される材料を含む。
第２４の様相の一実施形態においては、前記担体材料はインプラントとして、或いは創傷治癒のために用いる。
本発明の第２５の様相において、課題の解決は、被覆基材と核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とを含む創傷被覆材料であって、前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は本明細書に開示のものである、創傷被覆材料によってなされる。
第２５の様相の一実施形態においては、前記被覆材料は、ハイドロコロイドドレッシング材、アルギン酸カルシウムドレッシング材、活性炭製圧定布及びオーバーレイ、発泡プラスチック製オーバーレイ、フィルムドレッシング材、透明ドレッシング材、発泡シリコーンドレッシング材、フリースオーバーレイ、ハイドロセルラードレッシング材、ハイドロセレクティブ創傷オーバーレイ、吸収創傷パッド、スプレードレッシング材、人工連続フィラメント製ガーゼ、綿ガーゼ、パラフィンガーゼ、銀被覆創傷ドレッシング材、及びハイドロポリマー／発泡体ドレッシング材から成る群から選択される。
本発明の第２６の様相において、課題の解決は、核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と担体相とを含む化粧料組成物であって、前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は本明細書に開示のものであり、前記担体相は、好ましくは、クリーム、脂肪性軟膏、エマルジョン（水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｗ／Ｏ）型、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型）、マイクロエマルジョン、変性エマルジョン、ナノ粒子／ナノエマルジョン、リポソーム、ハイドロディスパージョンゲル（ハイドロゲル、アルコールゲル、リポゲル、テンサイドゲル）、ゲル−クリーム、ローション、オイル／オイルバス、及びスプレーから成る群から選択される、化粧料組成物によってなされる。
本発明の第２７の様相において、課題の解決は、組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、心筋梗塞後の血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
ｂ）候補化合物を用意する工程と、
ｃ）前記試験系において前記候補化合物を試験し、候補化合物が起こす反応を決定する工程とを含む、方法によってなされる。
本発明の第２８の様相において、課題の解決は、組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
ｂ）参照化合物を用意する工程と、
ｃ）前記試験系において前記参照化合物を試験し、該系において参照化合物が起こす反応を決定する工程と、
ｄ）候補化合物を用意する工程と、
ｅ）前記試験系において前記候補化合物を試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する工程と、
ｆ）前記試験系における参照化合物の反応と候補化合物の反応とを比較する工程とを含む、方法によってなされる。
本発明の第２９の様相において、課題の解決は、組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、心筋梗塞後の血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
ｂ）標識を有する参照化合物を用意する工程と、
ｃ）前記試験系において前記参照化合物を試験し、該系において参照化合物が起こす反応を決定する工程と、
ｄ）候補化合物を用意する工程と、
ｅ）前記参照化合物を含む試験系において前記候補化合物を試験し、試験系の反応を決定し、遊離した参照化合物の量及び／又は参照化合物から放出された標識の量を測定する工程とを含む、方法によってなされる。
本発明の第３０の様相において、課題の解決は、組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、心筋梗塞後の血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
ｂ）標識を有する候補化合物を用意する工程と、
ｃ）前記試験系において前記候補化合物を試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する工程と、
ｄ）参照化合物を用意する工程と、
ｅ）前記候補化合物を含む試験系において前記参照化合物を試験し、試験系の反応を決定し、遊離した候補化合物の量及び／又は候補化合物から放出された標識の量を測定する工程とを含む、方法によってなされる。
第２７〜第３０の様相の一実施形態においては、前記試験系はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系或いはｉｎ ｖｉｖｏ試験系である。
第２７〜第３０の様相の一実施形態においては、前記参照化合物及び／又は候補化合物の反応は前記プロセスの促進であり、好ましくは、試験系における候補化合物の反応が参照化合物の反応と同等か或いはそれよりも顕著である場合、候補化合物が前記プロセスを促進する化合物である。
第２７〜第３０の様相の一実施形態においては、前記参照化合物及び／又は候補化合物の反応は前記プロセスの阻害であり、好ましくは、候補化合物が起こす試験系の反応が参照化合物が起こす試験系の反応よりも顕著でない場合、候補化合物が前記プロセスを阻害する化合物である。
第２７〜第３０の様相の一実施形態においては、前記参照化合物は、核酸、その転写物及び／又はその翻訳物であり、前記核酸は、塩基性ＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に開示のものの遺伝子から成る群から選択される。
本発明の第３１の様相において、課題の解決は、疾患の治療及び／又は予防のための化合物をスクリーニングするための第２７〜第３０の様相のいずれかに記載の方法の使用であって、用意される試験系は前記疾患のための試験系である、使用によってなされる。
第３１の様相の一実施形態においては、前記疾患は、ＤＮＡ損傷の修復を必要とする疾患、組織再生を必要とする疾患、創傷治癒を必要とする疾患、歯や骨の移植を必要とする疾患、組織老化に伴う疾患、創傷治癒障害、皮膚疾患、色素性乾皮症、レザースキン、皮膚癌、日焼け（サンバーン）後の皮膚、サンバーン後の皮膚老化、サンバーン、及び心筋梗塞から成る群から選択される。
本発明の第３２の様相において、課題の解決は、少なくとも核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を含み、前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される、日焼け防止剤によってなされる。
第３２の様相の一実施形態においては、前記塩基性ＤＮＡタンパク質は、ＨＭＧタンパク質、特に本明細書に記載のものである。
本発明の第３３の様相において、課題の解決は、第２７〜第３０の様相のいずれかに記載の方法或いは第３１の様相に記載の使用によって得られる化合物によってなされる。
本発明の第３４の様相において、課題の解決は、医薬、好ましくは本明細書に開示された疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための第３３の様相に記載の化合物の使用によってなされる。
本発明の第３５の様相において、課題の解決は、生体を治療するための方法であって、有効量のＤＮＡ結合タンパク質、ＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸、或いはその転写物及び／又はその翻訳物、それらと相互作用する機能性核酸、それらと相互作用するペプチド、或いはそれらと相互作用する抗体、及び／又は第３３の様相に記載の化合物を生体に投与することを特徴とする、方法によってなされる。
第３５の様相の一実施形態においては、前記生体は、疾患、好ましくは本明細書に記載の疾患に罹患しているか、前記疾患に罹患する可能性があるか或いはその疾患により症状を発する可能性がある。
本発明において、課題の解決は、添付の特許請求の範囲の独立請求項の内容によってもなされ、特に好ましい実施形態は従属請求項から得ることができる。
日焼け防止剤に関する本発明の様相によると、日焼け防止剤は、太陽光の強烈な光線の反射や吸収によってサンバーンや紅斑の損傷を生じさせる衝撃から防御するように作用することを意図している。本発明の日焼け防止剤は、水性やアルコール性や油状の溶液やエマルジョンやローション、クリーム、ファットスティック、ゲル、エアロゾル、発泡クリーム、その他当業者に知られた形態をとり得る。本発明の日焼け防止剤は、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質及びそれらをコードする核酸だけでなく、吸収光遮断剤及び／又は反射剤を含んでもよい。反射剤としては、特に、酸化亜鉛や酸化鉄、二酸化チタン、炭酸カルシウム等の無機化合物が挙げられる。光吸収化合物（光フィルター或いは紫外線吸収剤とも称する）は、通常、紫外線を無放射失活によって無害な熱へ変換させるように機能する。次の化合物及び化合物クラス、即ち、ベンゾフェノンン誘導体、ヒドロキシナフトキノン、フェニルベンズオキサゾールやフェニルベンズイミダゾール、ジガロイルトリオレエート、アミノ安息香酸エステル、サリチル酸エステル、脂環式ジエノン、ベンザルアジン、芳香族尿素誘導体、スルホンアミド、クマリン誘導体、及びフェニルグリオキシル酸誘導体の一種以上を用いるのが好ましい。他の成分としては、ミンク油、アボカド油、アーモンド油、ゴマ油、ピーナッツ油、オリーブ油、サフラワー油及び／又はココナッツ油、ウロカニン酸を挙げることができる。更なる成分としては、ジヒドロキシアセトン、カロチン、クルミ殻エキス、及び肌のタンニング増加に特に適した他の化合物等を挙げることができる。
本発明は、塩基性ＤＮＡ結合タンパク質（ＨＭＧタンパク質等）が、細胞を次の状態、即ち、脱分化、分化及び／又は分化の変化、或いはこれらのプロセスの組合せを可能とする状態に移行させるのに好適であるという驚くべき知見に基づく。より詳細には、前記タンパク質の影響下で細胞の脱分化或いは再プログラム化が生じ、次いで、この細胞が、開始細胞の状態或いは開始細胞とは異なる細胞の状態に相当する分化状態へと任意的に分化する。いずれの場合でも、前記タンパク質の影響下で細胞は反応状態に移行する。本発明の各種用途及び方法の基礎となるこのメカニズムは、前記タンパク質（いわゆるマスタータンパク質）が各種遺伝子を制御し、細胞の機能的条件を制御するという観察に従うものである。前記タンパク質は転写因子複合体のモジュレーターであるため、原則として、それらの標的遺伝子の発現に対し正及び負に作用し得る。このような作用においては、前記タンパク質の各プロモーターへの結合は、配列特異的ではなくより構造特異的であって、前記タンパク質はＤＮＡを屈曲させ、転写因子の結合が仲介されるように、或いは転写因子がＤＮＡの屈曲部分と結合する能力を失うようにする。上述の特性によって、前記タンパク質は構築転写因子（architectural transcription factors）とも称される。また、本発明者らは、前記タンパク質、特にＨＭＧタンパク質が、胚・胎児発生期の細胞及び組織の発達に関与する一方、出生後には、分化した細胞の大部分においてこのタンパク質が検出できないことを見出した。胚形成初期には、ＨＭＧタンパク質の中には、そのｍＲＮＡを殆ど全ての組織で検出することができるものもある。胚形成後期においては、ＨＭＧタンパク質の発現は間葉派生体の一部及び上皮細胞組織の一部に制限される。
本明細書に開示のように、上述のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、その転写物、その翻訳物、それらに由来する機能性核酸、及び本明細書に開示のスクリーニング方法の適用によって特定される化合物は、様々な生物学的プロセス（本明細書においては「プロセス」と総称する）に関与する。これらのプロセス自体は当業者に知られている。より詳細には、これらのプロセスの一種以上が脊椎動物の疾患や病態へ関与すること、特に哺乳類やヒトの疾患や病態へ関与することは当業者に知られている。よって、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、その転写物、その翻訳物、それらに由来する機能性核酸、及び本明細書に開示のスクリーニング方法の適用によって特定される化合物を、前記プロセスの一種以上が関与する疾患や病態の予防及び／又は治療のため、及びその医薬の製造のために使用することも本発明に包含される。本明細書に開示の疾患（障害ともいう）は、前記疾患の例である。しかし、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、その転写物、その翻訳物、それらに由来する機能性核酸、及び本明細書に開示のスクリーニング方法の適用によって特定される化合物の用途は、これらに限定されない。
また、本発明においては、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、その転写物、その翻訳物、それらに由来する機能性核酸、及び本明細書に開示のスクリーニング方法の適用によって特定される化合物が、阻害及び活性化の双方に作用し得ること、よって、前記プロセスが望ましいとされる疾患でも前記化合物によって該プロセスを促進或いは支援して治療でき、前記プロセスが望ましくないとされる疾患でも前記化合物の阻害作用を利用して疾患を治療できることは当業者には明白である。これに関連して、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質やそれらをコードする核酸、その転写因子、その翻訳因子を前記プロセスの促進に用いることが好ましい。しかし、本発明においては、本明細書に開示のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に開示のＨＭＧタンパク質やそれらをコードする核酸、その転写物、その翻訳物を前記プロセスの阻害にも用いることができる。本明細書に開示のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に開示のＨＭＧタンパク質やそれらをコードする核酸、その転写物、その翻訳物の投与の際、その不足分を補償する或いはこれらの活性濃度を上昇させることになり、そのような追加的投与によって阻害、例えば競合的阻害を生じさせることもあり得る。これとは対照的に、本明細書に開示のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に開示のＨＭＧタンパク質やそれらをコードする核酸、その転写物、及びその翻訳物を指向する本明細書に記載の機能性核酸、特にアンチセンス分子、ＲＮＡｉ、アプタマー、スピゲルマー、アプタザイムを、前記タンパク質等によって仲介されるプロセスの阻害に用いることが好ましい。このことは、本明細書に開示のスクリーニング方法によって特定或いは取得される、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に開示のＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸、その転写物、及びその翻訳物を指向する抗体、ペプチド及び化合物についても当てはまる。一般に、本明細書に開示のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に開示のＨＭＧタンパク質やそれらをコードする核酸、その転写物、その翻訳物を指向する抗体及びペプチドは、本明細書に開示の機能性核酸と同様に且つ同程度に用いることができる。
本明細書に開示のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に開示のＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸、その転写物、及びその翻訳物の促進作用が期待される疾患の例としては、血管新生や、経心筋的血管再生による心筋梗塞、創傷治癒、創傷後血管新生、上皮化、歯や骨の移植における治癒が挙げられる。ＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に開示のＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸、その転写物、及びその翻訳物の阻害作用が期待される疾患としては、子宮内膜症や乾癬、黄斑変性、特に年齢依存型黄斑変性、角膜疾患、好ましくはヒトやイヌの角膜疾患、血管新生に伴う疾患、好ましくはパンヌス（即ち、慢性表在性角膜炎）、組織球増殖症、好ましくはそれらの急性型疾患、より好ましくは獣医学分野のそれらの疾患が挙げられる。
本明細書に開示のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸、その転写物、及びその翻訳物の使用、前記タンパク質等に対する機能性核酸、抗体及びペプチドの使用、また、前記タンパク質等を用いることによって取得及び／又は特定された化合物の使用は、前記プロセスの数種が前記疾患に関与し、前記タンパク質等によって促進、阻害される場合、特に有利である。疾患の例としては、乾癬、黄斑変性、子宮内膜症、及びイヌのパンヌスが挙げられる。これら疾患は、炎症性プロセス及び血管新生プロセスの双方が関与し、本明細書に開示のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に開示のＨＭＧタンパク質、及びそれらをコードする核酸によって（も）引き起こされ、特にＨＭＧＢタンパク質が重要な役割を果たす。故に、前記タンパク質等或いは各転写物に対する機能性核酸、ペプチド及び抗体は、治療のための好適な手段である。このことは、ＨＭＧＢタンパク質及びそれらをコードする核酸の作用を阻害する化合物についても当てはまる。これら化合物は、例えば、本発明のスクリーニング方法によって特定し得る。
本発明は、ＨＭＧＡファミリー及びＨＭＧＢファミリーのメンバーが血管新生或いは新血管形成プロセスを引き起こし得るという驚くべき知見にも基づく。血管新生は、血管新生に非常に特化した因子（ＶＥＧＦ等）に匹敵する程度に促進される。ＶＥＧＦ等の非常に特化した血管新生因子を用いた場合とは対照的に、ＨＭＧタンパク質を用いると、後述のように更なる効果を得ることができる。
更に、本発明は、ＨＭＧタンパク質の中でも特にＨＭＧＢ１及びＨＭＧＡ１が強い血管新生作用を示し、従ってこれらを、本明細書に開示したような血管新生に関与する疾患の治療に使用できるという驚くべき知見に基づく。この使用は、血管の芽の長さで表される血管新生作用が驚く程に大きいという驚くべき知見に基づく。上述の場合とは対照的に、このような作用はＨＭＧＢ１誘発によるサイトカインの放出では期待できない。
また、本発明者らは、驚くべきことに、壊死細胞、特に壊死腫瘍細胞が、細胞外リガンドとしてＲＡＧＥレセプターを用いて血管発生／血管新生のための内皮細胞を刺激する、ＨＭＧＢ１とある程度のＨＭＧＡタンパク質とを放出することを見出した。このメカニズムから、ＨＭＧ、特にＨＭＧＢ１及びＨＭＧＡ、より詳細にはＨＭＧＡ１に対してスクリーニングされた医薬が、特に、壊死細胞や壊死腫瘍細胞を伴う腫瘍疾患の治療に用い得ること、そして、本明細書に記載のスクリーニング方法によってこのような分子が得られる、或いは得ることが可能であるということが分かる。更に、このメカニズムから、前記タンパク質及びそれらをコードする核酸を指向する機能性核酸、抗体或いはペプチドが、腫瘍を治療する手段、特にＨＭＧＢ１及び／又はある程度のＨＭＧＡタンパク質を放出し、及び／又は、細胞外リガンドとして、血管発生や血管新生の内皮細胞をＲＡＧＥを用いて刺激する腫瘍を治療するための手段として用い得ることが分かる。
新しい血管の形成は、創傷治癒や腫瘍増殖、新血管形成、心筋組織における低酸素症や虚血の治療等の様々なプロセスにとって重要である。このようなプロセスには、大別して二種類のメカニズムが関与している。一方は血管発生、即ち、内皮前駆細胞のｉｎ ｓｉｔｕ分化によって血管が新しく形成されることであり、他方は血管新生、即ち、既存の血管から血管が新しく形成されることである。成体の成熟血管の内皮細胞は休止、非増殖期にある。内皮細胞は、例えば、感染、外傷、低酸素症或いは虚血によって刺激されているときだけ、血管新生プロセスに参加し血管新生プロセスを刺激する位置にいる。次いで、内皮細胞の移動や増殖、新しい結合等を含む様々なプロセスが互いに引き続くカスケードが生じる。その結果、新しい三次元血管が形成される。更に、血管新生時及び毛細血管より大きい血管の新生時に、血管平滑筋の筋細胞が成長し、新しく形成された血管の安定性が得られる。
特に、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）や血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の成長因子は、血管新生に関与する様々な成長因子やサイトカインの中でも重要なものとして考慮すべきである。これらの成長因子は内皮細胞の強力なマイトジェンとして知られている。これらの成長因子及び分子を投与することによって、別個の成長因子が刺激され、治療しようとする部分への血流が確実に改善される。
臨床的に重要な血管新生は、いわゆる経心筋的レーザ血管再生（ＴＭＬＲ）のプロセスにて発生する。このプロセスにおいては、レーザパルスによって心筋に小さなチャネルが形成される。こうして形成されたチャネル周辺の心筋組織に外傷性刺激を与えた場合、その周辺に血管新生が起こり、最終的に心筋の血流、特に虚血組織部分の血流が改善される。経心筋的血管再生には、特に心筋梗塞後の血管再生と、虚血や血管関連心不全等の心疾患初期の血管再生とが含まれる。本発明においては、次の「血管新生」、「血管発生」、「新血管形成」及び「血管再生」という用語は同義語として用いるが、いずれの場合も、観察される作用、即ち、根本的な分子或いは細胞メカニズムとは独立した血管形成に着目している。
上述のプロセスを促進或いは阻害するという点において、特異的に作用する血管新生や新血管形成は、血管新生や新血管形成に関連する疾患の治療を可能とする。
このような血管新生や新血管形成は、例えば、血液供給が不十分なために虚血状態が存在する疾患、例えば、冠動脈狭窄や動脈硬化の場合に適用される。この場合、血管新生や新血管形成によって新しい血管を誘導することによって、血液供給のための代替血管が提供され、このような疾患の緩和に寄与する。血液供給が不十分なために生じる疾患の更なる例としては、腫瘍（growths）や治癒不良、慢性創傷、妊娠合併症（妊娠中毒症や不妊症等）が挙げられる。
血管の過剰形成に基づく疾患の場合もある。その一例として、網膜上或いは網膜前への新しい血管形成が失明をもたらし得ることに関連する、増殖性糖尿病性網膜症が挙げられる。別の例として腫瘍の形成が挙げられる。ところで、腫瘍が十分に成長するには、腫瘍細胞への十分な栄養の供給、即ち、腫瘍部位への十分な血管の供給が必要であることはよく知られている。よって、十分な血管の供給が誘導できない腫瘍の場合、その成長は制限される。一方、血管の供給を停止することによって積極的に腫瘍を制限することができる。特に皮膚に関しては、非常に多くの癌類似疾患（基底細胞腫や、扁平上皮癌、黒色腫、カポジ肉腫、癌前駆症としての光線性角化症等）が過剰な血管新生に関連している。原則として、いずれの種類の癌や腫瘍も、過剰な血管新生に伴うものとして見なすことができる。過剰な血管新生によって生じる疾患の更なる例としては、乾癬や関節炎が挙げられる。
本発明において、「障害」とは、伝統的な意味での障害や疾患（網膜症や乾癬、腫瘍等）だけを含めるのではなく、通常、障害や疾患をなくすることが患者の快適性を向上させる上で望ましいような病態をも意味する。この「障害」には、特に人工的に発生する創傷、例えば手術に関連して起こる創傷（手術創傷やプロテーゼ或いはインプラントの移植によって生じる創傷等）が含まれる。
細胞と、細胞外基質と、血漿タンパク質との複雑な相互作用を伴う動的プロセスである創傷治癒に関連して、血管新生は、各種サイトカインや成長因子による統制下で起こる。血管新生の役割は、栄養分や他の物質を創傷部位の細胞へ輸送するための供給路を提供することであるが、この供給路は治癒プロセス終了後もそのままにしてもよく、任意的には、治癒組織の供給が維持できる程度に数を減らしてもよい。創傷の種類や組織損失の程度とは関係なく、創傷治癒は、時間的に重なる段階（炎症期や浸出期）、増殖期、そして分化期及び再構築期にグループ分けすることができる。このグループ分けは、修復プロセス時の形態学的変化に基づくものであり、実際には修復プロセスの複雑さを反映していない。
創傷治癒のプロセスは、一次創傷治癒と二次創傷治癒とに分けることができるが、組織損傷の程度や種類に起因するであろう治療上の問題を考慮するために、このプロセスを更に遷延一次治癒と慢性創傷とに分けることができる。一次創傷治癒は、例えば、切創表面が滑らかに密接しており、大きな組織損失がなく、血管が十分に供給された組織内に異物の混入がない場合に行われる。一次創傷治癒は、通常、手術創傷や先の鋭い物によって時折生じる創傷に関連して行われる。創傷が生じた過程によって、感染を考慮に入れる必要がある場合、遷延一次治癒を行う。感染が起こった場合、創傷治癒は二次治癒として分類される。二次治癒は、大きな欠損が生じたために肉芽組織を形成する必要がある場合、或いは感染によって傷口を直ちに閉じることができない場合に行う。８週間以内に創傷治癒が完了しない場合、慢性治療過程と呼ばれる。慢性創傷は、どの創傷治癒段階でも生じ得るが、通常、起源の異なる組織疾患や、局所圧迫損傷、放射線損傷、腫瘍に起因する組織破壊の進行によって生じる。
創傷治癒は更に、急性創傷と慢性創傷との区別に基づいて分類され得る。急性創傷の範囲は、急性外傷性創傷から、複合外傷性欠損、熱的及び化学的創傷、火傷及び切開、手術創傷に及ぶ。
急性外傷性創傷においては、任意に創傷を切除した後、張っぱらずに傷口を合わせることができれる場合、創傷の一次閉鎖は縫合、ステープル或いは傷テープによって行う。感染の潜在的危険性を示す創傷の場合、先ず、感染が排除されるまで創傷を滅菌湿潤ドレッシング材によって開いたままにする。二次治癒及びより複雑な創傷においては、創傷の閉鎖はより複雑になる。
熱的及び化学的創傷、例えば、加熱や冷却の影響、組織損傷放射線、酸或いは塩基によって生じる創傷の場合、損傷パターンに応じて治療がなされる。例えば、重度の熱傷患者の場合、先ず、壊死部切除術を行い、次いで皮膚移植によって外科的交換を行う。創傷に対して移植ができない場合、或いは熱傷の程度によって十分なドナー部位が得られない場合には、いわゆる同種異系移植或いは異種移植を用いる。十分なドナー部位がある場合、永久自家皮膚移植を用いることができる。具体的な形態の一種に自家角化細胞移植がある。
慢性創傷とは、原因治療や適切な局所治療にもかかわらず、８週間以内に治癒しない二次治癒創傷である。慢性創傷は急性創傷からどの段階でも生じ得るが、慢性創傷の殆どは、静脈、動脈或いは代謝起因の血管障害、圧迫損傷、放射線損傷及び腫瘍によって引き起こされる組織破壊進行の最後の段階にある。各種慢性創傷はそれぞれ異なる病態によって引き起こされるが、生化学的観点で言えば、このような創傷は同類と見なされる。創傷治癒に影響を及ぼす局所因子としては、異物や虚血、反復外傷、感染等が挙げられる。また、創傷治癒に影響を及ぼし得る全身性因子としては、加齢や栄養不良、栄養失調、糖尿病、腎疾患等が挙げられる。経済的に見て最も本発明の適応が望まれる慢性創傷治癒障害としては、静脈性下腿潰瘍や動脈性下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡潰瘍、慢性外傷後創傷等が挙げられる。
慢性損傷の重要な原因として、新しい組織の形成をもたらす修復プロセスと損傷組織の除去をもたらす破壊プロセスとのアンバランスが挙げられる。例えば、マトリックスメタロプロテアーゼの過剰発現等のプロテアーゼ活性の増加によって細胞外基質の制限分解が生じ得る。細胞外基質の合成と分解とのアンバランス、及びこれによってもたらされる創傷バランスの破壊プロセス方向へのシフトは、塩基性ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質の増殖促進作用等によって取り除くことができる。通常特定のシグナルカスケードを誘導する単一外因性成長因子を用いる場合と比べて、前記タンパク質は、該タンパク質が構築転写因子として各種増殖促進シグナル伝達経路に作用し、広範囲の活性を示す限り有利である。前記タンパク質は、様々な細胞（角化細胞や線維芽細胞、内皮細胞等）内で各種機能性タンパク質の合成を誘導する。また、高プロテアーゼ含量の慢性創傷滲出物によって急速に分解されることの多い初期作用外因性成長因子の場合と比べて、前記タンパク質は、より後の段階でシグナルカスケードと相互作用する。
各種創傷の治療は、基本的に、受動的創傷治療と能動的創傷治療とに分類することができる。具体的な形態として、皮膚置換法も適用することができる。受動的創傷治療においては、感染に対する防御用の単なる被覆材としての不活性繊維ドレッシング材を用いる。不活性ドレッシング材とは対照的に、相互作用的創傷カバーの場合、通常、湿潤な創傷環境を生み出すことによって治癒プロセスを促進している。これに関連して、ハイドロコロイドやハイドロゲル、ハイドロポリマー、発泡体ドレッシング材、アルギン酸カルシウム等が用いられる。このような受動的創傷治療の不都合な点は、問題のある創傷、特に抗治療的であるとされることの多い慢性創傷の能動的治癒がドレッシング材によって促進されないということである。
従来技術に記載の創傷治癒に用いられる高分子化合物、例えば、成長因子やサイトカイン、血液凝固因子等は、創傷治癒や皮膚老化のプロセスに対して選択的に介入する。しかし、ＨＭＧタンパク質等の塩基性ＤＮＡ結合タンパク質を用いると、分化状態のごく初期における前記タンパク質の中心的作用モードによって、組織や個々の細胞の包括的再生がもたらされ得る。本明細書に記載の広義の創傷治癒の観点から見て驚くべき前記タンパク質の作用が観察されたが、この作用は次のプロセス及びメカニズムに基づくものである。即ち、創傷治癒プロセス（肉芽組織の発達、血管新生の刺激、及び上皮細胞の増殖や移動を含む）の増殖段階、分化段階及び再構築段階のいずれにおいて前記タンパク質が相互作用し、前記タンパク質がこのようなプロセス及び該プロセスに基づく方法に用い得ることが意図されている。従って、前記タンパク質及びそれらをコードする核酸は、このようなプロセスやフェーズに関連する疾患、該プロセスやフェーズに伴う疾患、該プロセスやフェーズを利用する疾患、及び／又は原因的或いは対症的に該プロセスやフェーズに基づく疾患に用いることができる。
また、創傷部位の血流が十分かどうかは、治癒プロセスにおいて非常に重要である。血流がかなり低下している場合、十分な創傷代謝が得られず、慢性治療過程となることがある。塩基性ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質は、内皮細胞の増殖を誘導することによって創傷部位の血管新生も促進する。最終的に、細胞の老化が創傷治癒障害において特定の役割を果たす。皮膚線維芽細胞の老化は増殖作用の低下と相関している。慢性創傷の場合、成長因子に対する線維芽細胞の反応が低下するが、これは老化細胞の増加による可能性が高い。前記タンパク質によって、このような老化細胞を再び活性状態に移行させることができ、また、細胞を再プログラム化或いは若返りさせる能力によって細胞増殖を再活性化することができる。
最終的に、上皮化がかなり遅れている場合には、更なる慢性創傷治癒障害が起こっており、創傷治癒を完了することができない。その一要因としては、潰瘍周縁部で上皮細胞の移動が制限されていることが挙げられる。本発明者らは、ＨＭＧタンパク質が細胞の移動度を上昇させて、上皮細胞の移動に対しても正の作用を示し得ることを示した。
本発明で用いる塩基性ＤＮＡ結合タンパク質は、本明細書に記載の機能を有する。
ＨＭＧタンパク質は、そのアクリルアミドゲル内での高い電気泳動移動度によって名付けられた。ＨＭＧタンパク質は、染色体性非ヒストンタンパク質に属しており、主に、タンパク質機能ではなく、その化学的及び物理的特性によって定義されている。ＨＭＧタンパク質のメンバーは全て、０．３５ＭＮａＣｌを用いてクロマチンから抽出することができ、２〜５％過塩素酸に溶解することができ、荷電アミノ酸含有量が高く、分子量が３００００Ｄａ未満である。ＨＭＧタンパク質は、その配列相同性及び配列モチーフを考慮し、次の三種類のサブグループ、即ち、ＨＭＧＢ（旧ＨＭＧＢ−１／２）ファミリー、ＨＭＧＮ（旧ＨＭＧ−１４／１７）ファミリー、及びＨＭＧＡ（旧ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ／Ｃ）ファミリーに分類される。
ＨＭＧＮファミリーのメンバーは、高等真核生物全てにおいて発現される。該メンバーの分子量は１００００Ｄａ〜２００００Ｄａである。該メンバーは、その正に帯電したヌクレオソーム結合ドメイン（ＮＢＤ）によって、非ヒストンＤＮＡよりも高い親和力でヌクレオソームコアに結合する唯一の非ヒストンタンパク質である。この結合ドメインは、ＨＭＧＮ１タンパク質のアミノ酸１２〜４１とＨＭＧＮ２タンパク質のアミノ酸１７〜４７とを含み、他のタンパク質の配列においても見出されている。例えば、ＮＢＰ４５はその一次配列内にＮＢＤモチーフを含む。
ＨＭＧＡファミリーは、次の三種類のメンバー、即ち、ＨＭＧＡ１ａとＨＭＧＡ１ｂ（これらは一遺伝子由来の二種のスプライスバリアントである）、及び別の遺伝子によってコードされる関連タンパク質であるＨＭＧＡ２とから構成される。ＨＭＧＡファミリータンパク質の平均分子量は１００００Ｄａ〜１２０００Ｄａである。通常、このタンパク質ファミリーのメンバーは、未分化胚細胞内、新生細胞内、及び分化細胞の指数増殖期にのみ見出される。一方、該メンバーは、正常組織の分化細胞内では殆ど検出できないか、或いは検出できたとしてもその濃度は非常に低い。
このメンバーのタンパク質は各々、三種類のＤＮＡ結合ドメインと酸性タンパク質結合ドメインとを有する。ＨＭＧＡタンパク質は、ＡＴリッチＤＮＡの小さなグローブ（grove）に結合する。そのプロモーター／エンハンサー配列がＨＭＧＡ結合部位付近に局在しているような遺伝子におけるＨＭＧＡの結合が、転写に影響を及ぼす場合がある。例えば、ＨＭＧＡ１のアセチル化は、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）遺伝子転写のためにエンハンセオソーム複合体を制御する上で重要な役割を果たす。また、ＨＭＧＡタンパク質の翻訳後修飾は、ＡＤＰリボシル化及び細胞周期に依存するリン酸化である。
ＨＭＧＢファミリーのメンバーは、ＨＭＧタンパク質の中で最も種類の多いものである。その平均分子量は最大で２５０００Ｄａである。
ＨＭＧＢタンパク質は三種類のドメインから構成されており、その内、高い配列相同性を有する二種類の保存ドメインは該タンパク質の非特異的ＤＮＡ結合領域を示す。この機能的モチーフはＨＭＧボックスと称される。ＨＭＧＢタンパク質は、このようなＨＭＧボックスの内の二種、即ち、ボックスＡ及びボックスＢを含む。ＨＭＧＢ１タンパク質Ｃ末端部分は、ＨＭＧＢタンパク質のタンパク質結合ドメインを形成する。ＨＭＧＢタンパク質の他にも、ＨＭＧボックスが検出可能なタンパク質は多岐にわたって存在する。このようなタンパク質群には、ＳＲＹ、ＳＯＸタンパク質、ＬＥＦ１、及びＵＢＦ１が含まれる（Ａ．Ｄ．バクセヴァニス（Baxevanis）及びＤ．ランズマン（Landsmann）：ＨＭＧ−１ボックスタンパク質ファミリー：分類及び機能的関係 ＮＡＲ２３、２００２年、１６０４〜１６１３）。ＨＭＧタンパク質はクロマチンの構造成分であり、転写制御に関与している。
原則として、ＨＭＧタンパク質は全て、既知のものであろうと将来見出されるはずのものであろうと、本発明において適用することができ、特に、本明細書に記載の実験を行った後、個々のケースにおいて特定のＨＭＧタンパク質が本発明に応じたそれぞれの特性を示し、それぞれの用途に関連する挙動を示すかどうかを決定するために適用できる。
現在、約１５種類のＨＭＧタンパク質が知られている。ＨＭＧＢファミリーのタンパク質、ＨＭＧＡファミリーのタンパク質、及び／又は特にＨＭＧＡファミリーとの組合せたＨＭＧＢファミリーのタンパク質は、本明細書に記載の用途及び使用に対して特に好ましい。前記ファミリーのタンパク質を、翻訳物のレベルにおいてだけでなく、転写物のレベル、或いは遺伝子やコード配列のレベルにおいて使用できることも本発明に包含される。
ＨＭＧタンパク質の異常転写物（aberrant transcripts）を使用することも本発明に包含される。このような切断型（truncated）ＨＭＧタンパク質は、例えば、国際特許出願ＷＯ９６／２５４９３号或いはＷＯ９７／２３６１１号に記載されているが、この出願の開示内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
好ましくは、本発明において用いることのできる切断型ＨＭＧタンパク質は、ＨＭＧＡ２遺伝子の少なくともエキソン１、好ましくは、少なくともエキソン１〜３を示すと共に、染色体１２の異なる染色体転座パートナー領域に由来する配列によってコードされるアミノ酸を示す。このような切断型ＨＭＧタンパク質、及び他のＨＭＧタンパク質誘導体、例えば、ＨＭＧＡ２−ＬＰＰ、ＨＭＧＡ２−ＲＡＤ５１Ｌ１（例えば、トカチェンコ（Tkachenko）、Ａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ９９７；５７（１１）：２２７６〜８０；シェーンメーカーズ（Schoenmakers）ＥＦら；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１９９９ ５９（１）：１９〜２３に記載）、ＨＭＧＡ１−ＬＡＭＡ４（例えば、シェーンメーカーズ（Schoenmakers）ＥＦら、前掲；トカチェンコ（Tkachenko）、Ａら、前掲に記載）、及びＳＰ１００−ＨＭＧＢ１、特にＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂ及びＨＭＧＡ２は、誘導体として存在し得る。このような誘導体は、例えば、翻訳後修飾（アセチル化やリン酸化等）によって形成することができるが、他の分子との結合によっても形成することができる。本発明においては、数種類のタンパク質を同時に用いる場合、該タンパク質は、互いに独立して同一或いは異なる修飾を有していてもよく、該タンパク質の全てが同時に修飾されていなくてもよいし、該タンパク質のいずれかが同時に修飾されていてもよい。このような他の分子は、例えば、糖類、脂質、ペプチド、及び分子量が１０００未満の有機小分子から成る群から選択することができる。
本発明の各種様相において用いることのできる好ましいＨＭＧタンパク質は、次表１に記載した配列番号１〜３０のものである。表１には、配列番号、アミノ酸長、及び知り得る限りにおいてデータバンク登録番号を総括的に示すと共に、エキソン構造の設計、更に添加アミノ酸があれば、それについても示す。
本発明の各種様相において用いる核酸は、本明細書に記載のＨＭＧタンパク質をコードする核酸、及びその転写物、或いはそれらの誘導体である。上述のＨＭＧタンパク質をコードするものであれば、いずれの核酸も本発明に包含される。それぞれの核酸は遺伝暗号の縮重によって構成され得る。特に好ましい核酸は、後述の配列番号によって参照されるものである。表２には各種ＤＮＡ結合タンパク質及びそれらをコードする核酸を総括的に示すが、これらは特に好ましいものである。また、本発明における前記核酸には、前記核酸及びその転写因子、及び／又はそれらの相補鎖と、特にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするものも包含される。このようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えば、０．１×ＳＳＣ／０．１ ＳＤＳ（Ｐｅｒｆｅｃｔ ＨｙｂＴＭ Ｐｌｕｓ（シグマ社のハイブリダイゼーションバッファー））中６８℃で行う条件、或いは５×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド／０．０２％ＳＤＳ／２％ブロッキング試薬／０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン中４２℃で一晩行う条件である。
また、前記核酸に対する同一性（identity）が少なくとも６５％、好ましくは、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、或いは９９％である核酸も含まれる。本明細書に記載の転写物は、具体的には、本明細書に記載のＨＭＧタンパク質をコードする核酸に対するｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡである。
また、ＨＭＧタンパク質の遺伝子の核酸配列に由来する抑制配列、例えば、アンチセンス核酸、リボザイム或いはＲＮＡｉを使用することも本発明に包含される。通常アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いるアンチセンス核酸は、標的ＲＮＡ（好ましくは、発現しようとする遺伝子のｍＲＮＡ）に対し塩基相補性を示し、このため、前記標的ＲＮＡとハイブリダイズし、これによってＲＮアーゼＨ酵素が活性化され、核酸の分解がもたらされる。リボザイムは、触媒的に活性な核酸であり、ＲＮＡから構成されていることが好ましく、二種類のサブ部分を有する。第一のサブ部分は触媒活性に関与し、第二のサブ部分は標的核酸との特異的相互作用に関与する。標的核酸とリボザイムの第二のサブ部分との間に相互作用（通常、本質的に相補塩基から成るストレッチのハイブリダイゼーションに基づく）があった場合、リボザイムの触媒作用がホスホジエステラーゼ活性であれば、リボザイムの触媒部分は標的核酸を分子内或いは分子間で加水分解することができる。その結果、ＨＭＧタンパク質コード核酸は分解し、最終的に、標的分子の発現は転写レベル及び翻訳レベルの双方において低下する。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ干渉を仲介する二本鎖ＲＮＡであり、通常、約２１〜２３ヌクレオチド長である。該ＲＮＡの二本鎖の内の一方が、分解しようとする遺伝子の配列に相当する。その一方の鎖が好ましくはある遺伝子のｍＲＮＡと相補的であるＲＮＡｉを導入することによって、該遺伝子の発現を低下させることができる。医薬や診断手段としてのＲＮＡｉ分子の産生及び使用については、例えば、国際特許出願ＷＯ００／４４８９５号及びＷＯ０１／７５１６４号に記載されている。
本発明においては、ヒトＨＭＧタンパク質及びこれをコードする核酸を用いることが好ましい。しかし、本発明においては、ＨＭＧタンパク質の配列相同性や高い保存度の理由から、前記タンパク質及びこれをコードする核酸は、ヒトとは異なる生物や種由来のものである。特に、他の哺乳類由来のもの、好ましくは、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウマ、ウシ及びブタ由来のものである。本発明において用いるＨＭＧタンパク質の他の源としては、魚類や両生類、爬虫類、鳥類が挙げられる。魚類、特に塩水魚が好ましい。更に好ましい源としては、軟骨魚やソトイワシ（bone fish）が挙げられる。
本発明においては、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の用途及び使用は様々なプロセスに及ぶ。好ましくは、このようなプロセスは、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生、創傷治癒、組織再生、細胞移動、血管新生、特に創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、血管形成、特に心筋梗塞に関連する血管形成、歯や骨の移植における治癒、細胞や組織の脱分化、細胞や組織の分化、及び脱分化プロセスと分化プロセスの組合せから成る群から選択されるものである。本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、及びそれらをコードする核酸は、前記プロセスの一種以上を開始、支持、維持及び／又は継続することができる。本発明において、前記プロセスは、ＨＭＧ遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるアンチセンス分子、リボザイム或いはＲＮＡｉ分子（本明細書では通常、機能性核酸と称する）によって、或いは本明細書に開示のスクリーニング方法に基づいて特定される化合物によって阻害される。上述の各種プロセスは、前記タンパク質及びそれらをコードする核酸を用いて、同時に、或いは時系列的に、また任意で重複的に行うことができる。本明細書に開示のプロセス、特に上述の各種プロセスは、このような種々のプロセスに関与する細胞の活性化に基づいているという共通の特徴を有すると思われるが、必ずしもこの考え方に固執するものではない。基本的に、上述のプロセスは全て、前記タンパク質及びそれらをコードする核酸によって開始、誘発、支持、維持及び／又は増幅可能であるという意味で、該タンパク質及び核酸による対処が可能である。本発明においては、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、それらに由来する分子、特にアンチセンス分子やリボザイム、ＲＮＡｉ分子、及び本明細書に開示のスクリーニング方法の適用によって特定される阻害剤の用途及び使用は、本明細書に記載のプロセスの一種以上と原因的或いは対症的に関与する疾患にも及び、各医薬、医薬組成物、或いは化粧料組成物の製造に用いることができる。本発明における前記使用及び用途は、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｓｉｔｕでの使用とすることができる。本発明において開示されるこの用途及び使用は、基礎となるメカニズムによって限定されるものではない。また、本発明及びその各種様相、特に本発明の使用に関する様相においては、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質（特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質）それらをコードする核酸（その転写物及び／又はその翻訳物や本明細書に開示の機能性核酸を含む）、及び本明細書に開示のスクリーニング方法によって特定される化合物を、ＶＥＧＦ等の既知の血管新生因子と組合せて用いることもできる。
血流や、創傷部位に存在する線維芽細胞の老化、創傷の上皮化等の上述の因子の複雑な相互作用に関し、本発明の一様相においては、ＨＭＧＡファミリーのタンパク質の核酸、転写物或いは翻訳物を、ＨＭＧＢファミリーのタンパク質の核酸、転写物或いは翻訳物と共に用いることを意図している。如何なる理論によっても拘束されることを意図するものではないが、本発明者らは、基本的に血管新生で発現されるタンパク質ファミリーであるＨＭＧＡファミリーのタンパク質の核酸、転写物或いは翻訳物が、細胞や組織の脱分化或いは若返りをもたらし、これによって最終的には線維芽細胞の増殖能力や上皮細胞の移動も向上すると考えている。ＨＭＧＢファミリー、特にＨＭＧＢ１のタンパク質の核酸、転写物或いは翻訳物は、基本的に、血管新生や新血管形成をもたらすシグナルカスケードを引き起こす。ＨＭＧＡファミリー及びＨＭＧＢファミリーのメンバーによるこれらの様々な作用によって、血管新生や新血管形成、創傷治癒に関する相乗効果がもたらされる。
本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、それらをコードする本明細書に記載の核酸、本明細書に開示の機能性核酸、及び本明細書に開示のスクリーニング方法によって特定される化合物を用いて、また、本明細書に開示の医薬或いは医薬組成物を用いて治療及び／又は予防する疾患や障害の好ましい例としては、特に、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑変性症、関節炎、乾癬、子宮内膜症、酒さ、小静脈瘤、発疹性血管腫、海綿腫、唇血管腫、血管肉腫、痔核、動脈硬化、狭心症、虚血、梗塞、基底細胞腫、扁平上皮癌、黒色腫、カポジ肉腫、腫瘍、妊娠中毒症、不妊症、角膜疾患、特にヒトやイヌの角膜疾患、特に血管新生に伴う疾患、パンヌス（慢性表在性角膜炎）、組織球増殖症、好ましくはこれらの急性型疾患、より好ましくは獣医学分野におけるこれらの疾患、一次及び二次創傷治癒、一次及び二次創傷治癒障害、慢性創傷治癒、急性創傷及び慢性創傷、外傷性創傷、複合外傷性欠損、熱的創傷、熱傷、化学的創傷、化学火傷、切創、手術創傷、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡潰瘍、慢性外傷後創傷、慢性光損傷、サンバーン（日光皮膚炎）、皮膚癌、サンバーン後皮膚癌、サンバーン後皮膚老化、真皮、色素性乾皮症、熱放射（特に紫外線放射）による火傷の他、高齢患者、栄養不良患者、栄養失調患者、糖尿病患者、皮膚色素沈着欠乏の患者、色素脱失の患者、色素過剰の患者、放射線治療を受けた患者、或いは放射線治療を受けている患者、及び／又は腎疾患の患者から成る特定の患者グループにおける上述の疾患の内のいずれかが挙げられる。
必ずしもこの考え方に固執するものではないが、治療を行わなければ生体の障害をもたらしてしまう細胞損傷が治癒できると考えられる限り、上述のＤＮＡ損傷修復プロセスは、前記プロセスから成る群の内の特定のプロセスであると思われる。本明細書に記載の塩基性ＤＮＡ結合タンパク質及びそれらをコードする核酸の影響下で、ＤＮＡ損傷の自然治癒は通常支持或いは開始される。このようなＤＮＡ損傷は、特に紫外線への曝露後に生じるが、一般には高エネルギー放射線への曝露後にも生じる。このような例としては、腫瘍疾患の放射線治療の際に行う放射線照射等が挙げられる。他の適用分野としては、放射性物質取扱い時の事故による放射線損傷等が挙げられる。このプロセスの根底にある塩基性ＤＮＡタンパク質、特にＨＭＧＡタンパク質のメカニズムは、修復系の個々の化合物を利用せずに、クロマチンへの直接のアクセスによって細胞がそれ自身の修復系を活性化することでき、ＤＮＡ損傷を除去するための包括的修復プログラムの基礎が得られる限り、特に有利であると思われる。各適用は、ＤＮＡ損傷が全くないか、あったとしてもごく僅かである細胞物質を取得、修復することを目的として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ或いはｉｎ ｖｉｖｏにおいて行うことができる。
本発明において、血管新生や新血管形成は、外移植によって用意することのできる組織や器官に関連する。例えば、本発明の方法を用いて、移植用の組織や器官を血管新生や新血管形成のために刺激することができる。移植後、こうして処理された器官や組織では既に血管新生や新血管形成が誘導されているため、この器官や組織がレシピエント体内で成長し、また、外移植時に生じたであろう細胞損傷や組織損傷を抑制或いは治癒する可能性が高い。また、本発明においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した組織や器官も血管新生や新血管形成のために刺激する。
本発明においては、再生された細胞や組織を基本的に材料としても用いることができる。例えば、創傷治癒において欠損皮膚組織を治療する場合、皮膚組織の再生は基本的には上述のＨＭＧタンパク質の作用により引き起こされるのが好ましいが、必ずしもこの考え方に固執するものではない。この皮膚再生に関与する組織再生や細胞の再プログラム化は、外因性刺激剤の投与によって促進することができる。このような刺激剤は、例えば、本発明の再プログラム化された細胞を移植した組織によって用意することができる。しかし、本発明においては、このような刺激剤、特に化学剤（そのままで有効であるか或いは有効となり得る）を単独で或いは組合せて（任意的にはそれぞれ前駆体分子の形態で）再プログラム化された細胞に接触させ、細胞が分化或いは変化する方向に対して影響を及ぼすようにする。
本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質の上述した血管新生や新血管形成作用、増殖促進作用は、創傷治癒プロセスの促進と共に、創傷治癒において重要な役割を果たす。前記タンパク質の使用は、瘢痕形成の種類に関しては特に有利である。出生後治癒と比べて、胎児創傷治癒は、瘢痕の形成も無く、非常に迅速に行える創傷治癒である。前記タンパク質、特にＨＭＧＢファミリー由来のタンパク質とＨＭＧＡファミリー由来のタンパク質の組合せを用いた場合に、胎児創傷治癒のプロセスを反映した能動的創傷治癒が起こるという事実に関連して、本発明において前記タンパク質を用いた場合、迅速で瘢痕形成の無い創傷閉鎖を行うことができる。本発明において前記タンパク質を用いることに関連する上述のプロセスの各々における重要な様相は、ＨＭＧタンパク質が天然の内因性物質であるため、皮膚刺激作用及びアレルギー反応の危険性が非常に低いと推定できるという事実である。更に、ヒトと動物の前記タンパク質は、高い保存性に起因して殆ど同一であるため、試験動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を非常に高い信頼度でヒトに用いることができる。また、創傷治癒においては、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、及びそれらをコードする核酸を本発明において用いると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激因子として用いた前記タンパク質によって（自家皮膚細胞から出発し任意の増殖を経て）産生された代用皮膚の移植が可能となる。このような目的に必要な自家皮膚細胞としては、例えば、生検試料に由来するものを用いることができる。典型的な適用分野は、広範な火傷や抗治療慢性潰瘍である。自家代用皮膚を用いる方法と同様に、上述の条件下で免疫系の拒絶反応が起こらない点で特に有利である。
本発明で用いられるＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、及びそれらをコードする核酸の上述の複合作用モードによって、創傷部位では十分な血流が得られ、また、心筋梗塞における血管形成にこれらを用いることについての説明が与えられる。本明細書に記載され、本発明で用いられるＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質の影響下で、創傷部位での血管新生を促進し心筋に血管を供給する内皮細胞の増殖が誘導される。このことは、歯や骨の移植における治癒に関連する用途にも当てはまる。これに関連して、ＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、及びそれらをコードする核酸の増殖促進作用も、上述の血管新生作用を示す。更に、本明細書に記載され、本発明で用いられるＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧ結合タンパク質の影響下で細胞の移動度が上昇するという作用は、特にこの適用分野において有用である。
塩基性ＤＮＡタンパク質及びそれらをコードする本明細書に記載の核酸を組織老化の分野に適用することも有利であり、前記タンパク質の影響下で組織老化の進行が遅くなるか或いは見られなくなる。更に組織の若返りにも適用されるが、組織老化と組織若返りとの間には、その根底にあるプロセスが本明細書に記載の塩基性ＤＮＡ結合タンパク質及びそれらをコードする核酸によって影響を受け得るという点で重なる部分がある。この効果は、前記ＤＮＡ結合タンパク質の特徴、即ち、若い分化した細胞や胎児皮膚細胞の状態に非常によく似た状態へ細胞を移行させる特徴に基づくと思われるが、必ずしもこの考え方に固執するものではない。このように、前記タンパク質によって処理された細胞は、若返りプロセス及び脱分化プロセスを経て、再び再生することができる。特に、ホルモンの変化や遺伝的要因等に影響を受ける年齢起因の細胞再生の遅延や低下に対しては、塩基性ＤＮＡ結合タンパク質及びそれらをコードする核酸によって対抗することができる。また、本明細書に記載の塩基性ＤＮＡタンパク質により誘導される能動的細胞再生によって、外因性因子（遊離酸素ラジカル等）によって生じた損傷を低下、除去することができ、また損傷の発生を防ぐことができる。従って、本発明で用いられる塩基性ＤＮＡタンパク質及びそれらをコードする核酸は、既存の皮膚損傷に対して細胞再生により対抗するのに事実上好適な初期対症療法だけでなく、予防療法及び／又は原因療法を可能にする。更に、本発明において前記タンパク質を用いた場合、組織老化に影響を及ぼすプロセスにおいてコラーゲンの発現が活性化され、これによってコラーゲンの低下や損失（即ち、皺の一主要因）に対して対抗することができる。
本発明においては、ＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質の代わりに、それらをコードする上述の核酸を各細胞や各組織に導入することもできる。こうして処理された核酸は、対応するＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質が分子内で発現するように、各細胞やそれから形成された組織内で核酸の発現を可能にする発現ベクターに組み込むことが好ましい。個々の細胞用の各発現ベクターについては当業者に知られており、例えば、コロシモ（Colosimo）Ａ．ら（２０００年）哺乳類細胞内での外来遺伝子の伝達及び発現、Ｒｅｖｉｅｗ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：３１４〜３３１、及びサンブルック（Sambrook）、Ｊ．、フリッシュ（Fritsch）、Ｅ．Ｆ．、マニアティス（Maniatis）、Ｔ．（１９８９年）実験室マニュアル、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに記載されている。遺伝子発現用の好適なウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、レトロウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス等の不活化ウイルス由来のものが挙げられる。好適なプラスミドベクターは通常、原核、真核及び／又はウイルス配列から成る。その例としては、特にｐＴＫ２やｐＨｙｇ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＡＣＴ、ｐＣＡＴ、ｐＣＡＴ系ベクター、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ２．１系ベクター、ｐＤＥＳＴ、ｐＤＥＳＴ系ベクターが挙げられる。また、前記細胞や組織に各ＤＮＡを導入するための方法についても当業者には知られており、この導入はｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｖｏ、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。各方法には、例えば、コロシモ（Colosimo）Ａ．ら（２０００年）哺乳類細胞内での外来遺伝子の伝達及び発現、Ｒｅｖｉｅｗ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：３１４〜３３１、及びサンブルック（Sambrook）、Ｊ．、フリッシュ（Fritsch）、Ｅ．Ｆ．、マニアティス（Maniatis）、Ｔ．（１９８９年）実験室マニュアル、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに記載された、ＰＯ４沈殿（ＣａＰＯ４、ＢＥＳ−ＣａＰＯ４、ＳＲＰＯ４）、カチオンポリマー、リポソーム、分子複合体（ポリリシン等）、グラミシジンＳ−ＤＮＡ−脂質複合体、エレクトロポレーション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、組換えウイルス、及びネイキッドＤＮＡ等が含まれる。
同様のアプローチは、細胞的背景（細胞や、組織、器官等）内で本明細書に記載の機能性核酸を発現させることが望ましい場合、特に機能性核酸が、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質の発現（即ち、転写や翻訳）を阻害する場合に用いることができる。
よって、本発明においては、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質の代わりに、それらをコードする核酸、即ち、発現系で各タンパク質の発現をもたらす核酸を用いることができる。好適な発現系としては、細胞溶解物、細胞、組織及び／又は器官等が挙げられる。
組織の血管新生或いは新血管形成のための本発明の方法、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、
ａ）組織或いはその一部を用意する工程と、
ｂ）一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を添加する工程と、
ｃ）前記組織と前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とをインキュベートする工程とを含み、前記核酸はＨＭＧタンパク質の遺伝子からなる群から選択されるが、該方法においては、ＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、及び各核酸を用いることができる。
組織の再生のための本発明の方法、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ法においては、
ａ）組織或いはその一部を用意する工程と、
ｂ）核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を添加する工程と、
ｃ）前記組織と前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とをインキュベートする工程とを含み、前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択されるが、該方法においては、本明細書に記載のＤＮＡ結合塩基性タンパク質及び各核酸を用いることができる。
用意する組織は、再生しようとする種類のものであることが好ましい。但し、本発明で用いる塩基性ＤＮＡタンパク質の作用モードの点では、この工程で用意、使用する組織が最終的に実際に得られる組織と同一である必要はない。例えば、本明細書に記載のＨＭＧ遺伝子、タンパク質、ポリペプチドの影響下で、脂肪細胞から軟骨細胞を、或いは軟骨細胞から筋細胞を産生することが可能である。本発明者らは、本発明で用いるＤＮＡ結合タンパク質によって、出発細胞としての細胞が幹細胞様状態を経て各細胞型になると考えているが、必ずしもこの考え方に固執するものではない。本明細書に記載の方法は、幹細胞様細胞（quasi stem cells）を再生するための方法でもある。
組織の用意は、例えば、生検或いは搾取作用によって行うことができる。
組織を本明細書に記載の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と共にインキュベートしその組織或いはその一部に導入する場合、翻訳物、核酸、或いは転写物が組織内の一種以上の細胞に取り込まれるように行うことができる。このような目的に対し、核酸は、組織の一種以上の細胞のトランスフェクションを可能とする形態で用意することが好ましい。このような目的に対する好適な手段としては、例えば、核酸やその転写物をリポソームとして添加することや、核酸とその転写物を、リポソーム或いは細胞のトランスフェクションを可能とする異なる形態、及び他の核酸と共にインキュベートすることが挙げられる。翻訳物、特に本発明で用いるＨＭＧタンパク質をインキュベーションの際に細胞へ導入する場合、従来技術で知られた方法、例えば、エレクトロポレーションや、細菌毒素（ストレプトリシンＯ）或いはタンパク質伝達ドメイン及びペプチド担体を用いた細胞の処理等を用いて行うことができる。
上述の本発明の組織再生のための方法は、細胞内のＤＮＡ損傷或いは細胞のＤＮＡ損傷を修復するため、また、ＤＮＡ損傷修復を支援するためにも用いることができる。これに関連して、特に上皮層でのＤＮＡ損傷の修復が引き起こされる或いは促進される。
エレクトロポレーション、即ち、短い電気パルスによって膜に可逆的開口部（孔）を形成する方法は、細胞に外来分子を導入するため７０年代に初めて用いられた。低分子物質（色素やペプチド等）及び高分子化合物（タンパク質やＤＮＡ、ＲＮＡ等）のいずれも、形成された膜孔を通して細菌細胞及び真核細胞へ導入することができる。この方法は、他の方法と比べて比較的輸送効率が低いため、臨床適用においては次の方法や剤を用いるのが好ましいであろう。
真核細胞の膜は、ストレプトリシンＯ等の細菌毒素を用いて透過性にすることができる。ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）を用いた真核細胞へのＨＭＧタンパク質の移動は、Ｃａ２＋濃度を変化させることによって行う。Ｃａ２イオンの非存在下で細胞は溶解するが、続いてＣａ２＋イオンを添加することによって細胞孔を再び閉じることができる。この溶解プロセスの可逆性を確保するため、当業者に知られた通常の実験の際に、各細胞型にとって最適のＳＬＯ濃度を決定する。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した自家角化細胞の増殖を刺激するため、この方法を用いて、本明細書に開示の医薬、即ち、本明細書に記載のＨＭＧタンパク質及びそれらをコードする核酸を、例えば皮膚細胞へ導入する。高増殖性細胞を、慢性創傷の患者、例えば火傷患者に対し移植片として提供することができる。
リポソームは、細胞膜を介するイオン輸送の研究のため１９６１年に初めて用いられ、その後、医薬輸送の好適な手段であることが見出された。リポソームでカプセル化した医薬の全身投与については殆ど成功しなかったが、リポソームの局所適用によって皮膚科学の分野に新しい可能性がもたらされた。また、リポソームベースの化粧品も、米国及び西欧では市場に出回っている。従って、リポソームは、ＨＭＧタンパク質或いはそれらをコードする核酸の投与、特に本明細書に記載の医薬及び外用品の製造に好適な適用形態を示している。
リポソームは、細胞膜の脂質二重層と類似のデザインを有し、細胞に対して過剰に添加した際には細胞と融合するミセルである。従って、リポソームの親水相へ予め添加された医薬やカプセル化された医薬は細胞内へ放出され得る。リポソームは、そのサイズ及び脂質二重層の数に基づいて分類される。数個の脂質二重層を有する大型ベシクル（０．１〜＞１０μｍ）（多層状大型ベシクル：ＭＬＶ）、１個の脂質二重層を有する大型ベシクル（≧０．０６μｍ）（単層状大型ベシクル）、及び１個の脂質二重層を有する小型ベシクル（０．０２〜０．０５μｍ）（単層状小型ベシクル）が存在する。脂質二重層の数によって、細胞内への医薬の定量的な放出や送達をある程度制御することができる。また、リポソームと皮膚との間の適合性は、例えば、リン脂質成分ではなくセラミド（即ち、角化細胞の膜構造に類似した構造体）を配合することによって向上させることができる。よって、この方法は、本明細書に記載のＨＭＧタンパク質及びそれらをコードする核酸をベースとした医薬を含み、局所的に適用しようとする組成物の場合、特に好適である。ＨＭＧタンパク質はサイズが小さく、特にＨＭＧＡタンパク質は小さい（＜１２ｋＤａ）ため、より一層リポソームへのパッケージングに適している。
タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）及びペプチド担体によって、本発明で用いるタンパク質を細胞内へ効率よく導入することができる。ＰＴＤは、一般に１０〜１６アミノ酸（通常、正に帯電したリシン及びアルギニン残基）から成る短いペプチドであり、輸送しようとするタンパク質と共有結合する。ＰＴＤ仲介による伝達は、レセプター、トランスポーター及びエンドサイトーシスとは無関係の、現在殆ど知られていないメカニズムによって起こる。ＰＴＤによって、サイズが最大７００ｋＤａのタンパク質を細胞内へ導入することが可能である。また、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ伝達は既に組織や細胞内で検出可能であるため、ＰＴＤは、本発明で用いる本明細書に記載のＨＭＧタンパク質及びそれらをコードする核酸等の医薬の作用物質の輸送に特に適している。しかし、ＰＴＤは移動させようとするタンパク質と共有結合するため、輸送しようとする医薬の機能性を維持しなければならないという点では、この技術は制限される。この理由からも、好ましくは、チャリオット試薬（chariot reagent）（カールズバッド）等の非共有結合ペプチド担体を好ましい実施形態で用いる。このタンパク質輸送系は、短い合成シグナルペプチド（Ｐｅｐ−１）に基づくものであり、このペプチドは輸送しようとするタンパク質と非共有結合性疎水的相互作用によって複合体を形成する。細胞内では、輸送されたタンパク質はＰｅｐ−１ペプチドから解離し、細胞輸送メカニズムによって細胞内の目的位置まで輸送される。この方法の更に有利な点は、輸送効率が高いことであり、輸送効率は、細胞型やタンパク質にもよるが６０％と９５％との間である。よって、この方法は、ＨＭＧタンパク質によって仲介されるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養自家皮膚細胞の増殖促進に関連して用いるのに適しており、また、本明細書に記載の医薬を一種以上含み局所的に投与される組成物に関連して用いるのに適している。
核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と共に組織をインキュベートする場合、これらを細胞や組織内に取り込むことができる条件下で行う。好ましくは、３７℃、生理学的条件下でインキュベーションを行う。
更なる様相において、本発明は、
ａ）一種以上の細胞を用意する工程と、
ｂ）核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を用意する工程と、
ｃ）前記細胞と前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とをインキュベートする工程とを含み、前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は、上述の他の様相のいずれかに関連して記載したのと同様に具体化され得る、細胞の分化、脱分化及び／又は再プログラム化のための方法、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。
本明細書に記載の組織再生方法の個々の工程を行うことに関連して上述したことは、この方法にも適用される。用意することのできる細胞は任意の細胞であり、特に脂肪細胞や軟骨細胞、筋細胞等の間葉細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
更なる様相において、本発明は、一種以上の核酸、それらの転写物、それらの翻訳物、機能性核酸、及び本明細書に記載の本発明のスクリーニング方法の適用によって特定される化合物と、薬学的に好適な担体とを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、各種適用形態に具体化される組成物であり得る。このような適用形態としては、特に局所適用や皮下適用が挙げられる。同じことが本発明の化粧料組成物に対しても当てはまる。好適な薬学的担体及び化粧用担体としては、例えば、１９９５年６月１９日付の化粧品に関する規制で定義されたドイツ連邦共和国において有効なもの（effective for）が挙げられる。さらに、バッファーや、安定剤、静菌剤、アルコール、塩基、酸、デンプン、保湿剤、クリーム、脂肪性軟膏、エマルジョン（水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｗ／Ｏ）型、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型）、マイクロエマルジョン、変性エマルジョン、ナノ粒子／ナノエマルジョン、リポソーム、ハイドロディスパージョンゲル（ハイドロゲル、アルコールゲル、リポゲル、テンサイドゲル）、ゲル−クリーム、ローション、オイル／オイルバス、スプレーが挙げられ、これらは単独で或いは組合せて用いることができる。
本発明の医薬組成物は、本発明で用いるＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、これをコードする核酸、或いはこのようなタンパク質の核酸配列に由来する阻害性核酸（アンチセンス核酸や、リボザイム、ＲＮＡｉ等）だけでなく、他の薬剤を含んでもよい。少なくとも一種のＨＭＧタンパク質或いはそれをコードする核酸を含む医薬組成物或いは化粧料組成物の形態としては、軟膏、クリーム及びゲルが好ましい。
本発明は更に、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質が、動物細胞、特に上皮細胞、より詳細にはヒト上皮細胞内へ自発的に移動するという驚くべき知見に基づく。このため、前記タンパク質を細胞被覆表面、特に処理しようとする細胞上へ直接適用し、次いでこの細胞が前記タンパク質を取り込むということが可能である。この自発的移動を促進するキャリア媒体に前記タンパク質を含ませることが好ましい。このような移動媒体としては、例えば、水溶液やアルコール溶液、好適なエマルジョン、他の相、相混合物等が挙げられる。本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質はこのような驚くべき挙動を示すため、医薬組成物及び／又は化粧料組成物に該タンパク質を直接用いることができ、よって、処理しようとする細胞内へ該タンパク質を取り込むためにストレプトリシンを用いる等の具体策を更に講じる必要はなくなる。
本発明に記載の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物、本明細書に開示の機能性核酸、本発明のスクリーニング方法の適用によって特定される化合物、及びそれらによって調製される医薬組成物を用いて、従来技術で知られた適用方法のいずれも行うことができる。例えば、皮内、皮下、筋肉内、静脈内及び動脈内適用については、注射器を用いて行うことができ、また、適用は標的組織に対して直接行うことができる。また、自由に接触可能な標的組織に対しては、カテーテルプローブや直接適用を用いることもできる。通常、用いる適用方法は標的組織に応じて決定する。例えば、心筋組織の血管再生を目的とする場合には、カテーテル、ニードル、或いはＴＭＬＲに関連するレーザパルスの適用等も可能とする複合機器によって本発明の組成物を適用するのが好ましい。例えば、創傷治癒を促進するように本発明に記載の核酸、その転写物或いはその翻訳物を用いて血管新生を促進する皮膚組織である場合、或いは、血管腫や小静脈瘤等の場合に本発明に記載の核酸由来の阻害性分子（アンチセンス核酸や、リボザイム、ＲＮＡｉ等）や上述のスクリーニング方法で特定される阻害性物質によって血管新生を阻害する対象が皮膚組織である場合には、例えばクリームの形態で皮内投与、皮下投与或いは局所投与を行うのが適切であろう。好適な投与方法の選択は当業者の技量内で行う。
更なる様相において、本発明は、本発明の方法によって得られる細胞、及び本発明の方法によって得られる組織に関する。
更なる様相において、本発明は、一種以上の核酸、その転写物、その翻訳物、本明細書に記載の機能性核酸の一種以上、及び／又は本発明のスクリーニング方法の適用によって特定される化合物の一種以上を含む担体材料であって、前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物が本明細書に記載のものであってもよい、担体材料に関する。この担体材料は、特にインプラントや被覆材料として用いられ、好ましくは、創傷治癒のため、本明細書に記載の他の疾患や病態の各々のため、また、本明細書に記載の他の用途、即ち、本明細書に記載の塩基性ＤＮＡ結合タンパク質が共有結合或いは非共有結合する表面の提供を含む用途のためにも用いられる。原則として、インプラント材料や被覆材料、担体材料として用いられるいずれの材料も、創傷治癒のため、或いは本明細書に記載の他の用途、即ち、ＤＮＡ結合タンパク質、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質が共有結合或いは非共有結合する表面の提供に関し、当該技術分野で知られた用途のために用いることができる。そのような材料の例として、ハイドロコロイドやハイドロゲル、ハイドロポリマー、発泡体ドレッシング材、アルギン酸カルシウム、活性炭、発泡プラスチック、シート、発泡シリコーン、フリース材料、人工連続フィラメント、綿ガーゼ、ゴム、パラフィン、及びパラフィンガーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。好適なプラスチックとしては、ポリエチレンや、ポリビニレン、ポリアミド、ポリウレタンが挙げられる。本発明で用いる核酸やＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質は、非共有結合的に担体材料によって吸収されるのが好ましい。しかし、本発明においては、各適用条件によっては、これら材料が共有結合である及び／又は実際の担体材料からの前記タンパク質が放出したものであることもできる。好適な潜在的適用は当業者には知られている。担体材料の具体的な形態の一種として、被覆基材と、本明細書に具体的に記載された、一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とから成る創傷被覆材料が挙げられる。この場合、被覆基材は、本明細書に記載の意味において担体材料を形成し得る。
更なる様相において、本発明は、特定のプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法に関する。前記プロセスは、本明細書に記載の各プロセスのいずれであってもよく、また、単独プロセス或いはプロセスの組合せであってもよい。より詳細には、前記プロセスは、組織再生、創傷治癒、細胞移動、皮膚損傷の修復、血管新生、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の変化、組織若返り、血管形成、新血管形成、心筋梗塞に関する血管形成、及び歯や骨の移植における治癒から成る群から選択することができる。また、一般に、前記プロセスは、再プログラム化、再分化或いは脱分化を含み、任意的にその後の新しい分化を伴うプロセスのいずれであってもよい。本明細書に記載のプロセスは、少なくとも一種の細胞の新しい分化の発生に基づく或いはそれに起因する幹細胞様状態へ該細胞を移行させることに関連すると思われるが、必ずしもこの考え方に固執するものではない。
本発明の化合物スクリーニング方法は、その最も簡単な形態において、
ａ）前記プロセスのための試験系を用意する工程と、
ｂ）候補化合物を用意する工程と、
ｃ）前記候補化合物を試験し、前記試験系において候補化合物が起こす反応を決定する工程とを含む。
前記試験系は、各プロセスを示すことが可能な系であることが好ましく、特に、前記プロセスを促進或いは阻害すると考えられる化合物（いわゆる候補化合物）の影響下でのプロセス、及び／又は参照化合物の影響下でのプロセスを示すことが可能な系であることが好ましい。このような系は当業者には知られている。この試験系は、一種以上の細胞と、任意的には前記細胞を含む組織とを含み、前記細胞及び組織それぞれの挙動が解析されることが好ましい。これに関連して、前記挙動は次のプロセス、即ち、細胞及び組織それぞれの増殖、細胞及び組織それぞれの分化、及びそれらの様々な局面や様相（例えば、脱分化や分化、好ましくは新しい分化、細胞の運動性、シグナル分子の放出、組織の血管新生や新血管形成等が挙げられるが、これらに限定されない）の内の一種以上である。試験系の反応を説明するために、直接の増殖だけでなく他の現象やパラメータを用いることができる。このようなパラメータとしては、例えば、生化学的パラメータや遺伝学的パラメータ、分子遺伝学的パラメータ、分子生物学的パラメータ、組織学的パラメータ、細胞学的パラメータ、生理学的パラメータ、表現型的パラメータが挙げられる。生化学的パラメータとしては、例えば、代謝経路や出発剤、前記プロセスに直接的或いは間接的に関連するその生成物（products thereof）が挙げられる。遺伝学的及び分子遺伝学的パラメータとしては、核酸やゲノム核酸、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のレベルで前記プロセスに関与するものが好ましい。本発明においては、前記プロセスが促進或いは阻害される際の各核酸の存在、各核酸の消失、或いは各核酸の定量的変化は遺伝学的パラメータとなり得る。分子パラメータは、前記プロセスにおける前記タンパク質の出現及び消失等に関連し得る。生理学的パラメータとしては、細胞や組織の挙動、特に、刺激（例えば、生物学的、化学的或いは物理的刺激）に呼応する細胞や組織の挙動を挙げることができるが、前記プロセスが促進される場合と阻害される場合とでは、各細胞系（即ち、細胞や組織）の刺激に対する反応の仕方が異なる。
このようなプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための本発明方法の一実施形態においては、該プロセスのための各試験系とは別に参照化合物を用意し、この参照化合物を試験系に接触させること、即ち、この参照化合物を試験系において試験することが意図されている。この接触は、参照化合物（好ましくは溶液中、より好ましくはバッファー中に存在する）が試験化合物に接するように行うのが好ましく、そこへ培地を添加するのが好ましい。また、本発明においては、参照化合物は部位特異的に試験系に接触するが、例えば、参照化合物は組織の別個の細胞内、或いは該細胞の別個の区画内へ取り込まれる。このような参照化合物の細胞特異的送達や区画特異的送達については、基本的に当業者に知られている。例えば、ワン（Wang）Ｂら（２００１年）ウシ接合体前核への哺乳類人工染色体のマイクロインジェクション後のレポーター遺伝子の発現、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．６０：４３３〜８に記載されているように、マイクロインジェクションによって参照化合物を細胞の所定の部位や区画へ注入することができる。更に、参照化合物を処理するための方法については、例えば、アミノ酸トランスポーターを用いる処理方法や、参照化合物が別個の細胞（線維芽細胞等）に到達するよう該化合物を変性することによる処理方法（例えば、パラシン（Palacin）Ｍら、（１９９８年）哺乳類原形質膜アミノ酸トランスポーターの分子生物学、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７８：９６９〜１０５４に記載）、参照化合物が特定の細胞区画（核等）に到達するように該化合物を変性することによる処理方法（例えば、シャロイン（Chaloin）Ｌら、（１９９８年）迅速な膜転移及び核局在化特性によるキャリアペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の設計、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４３：６０１〜６０８に記載）、参照化合物がミトコンドリアに到達するように該化合物を変性することによる処理方法（例えば、ペイン（Pain）Ｄら、（１９９１年）葉緑体及びミトコンドリアへのタンパク質移入のための機械、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．（Ｎ Ｙ）１３：１５３〜１６６に記載）が挙げられる。細胞特異的送達や区画特異的送達については、本明細書に記載の候補化合物に対しても行うことができる。
次の工程では、試験系において参照化合物が起こす反応を決定する。これに関しては、試験系における参照化合物の影響を決定するために上述のパラメータを用いることが好ましい。前記プロセスの一種を促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための本発明方法の本実施形態の更なる工程においては、候補化合物を用意し、参照化合物の場合と同様に試験系において試験する。次いで、試験系において候補化合物が起こす反応を決定するが、この際、基本的には参照化合物に対して用いた上述のパラメータを用いる。最後に、上述のパラメータで示される参照化合物の影響下での試験系の反応と候補化合物の影響下での試験系の反応との比較を試験系内で行う。試験系において候補化合物の影響下で前記プロセスの一種以上がもたらす反応が、参照化合物の影響下での反応と同等か或いはそれより顕著な場合、候補化合物を該プロセスを促進する化合物と見なす。一方、試験系において候補化合物が起こす反応が参照化合物の場合の反応と比べて顕著でない場合、候補化合物は前記プロセスの一種以上を阻害する化合物となる。本発明においては、同一の候補化合物であっても、プロセスの阻害や促進という意味では前記プロセスの内の一プロセスと別のプロセスに対して異なる作用を示すことがある。また、本発明においては、参照化合物と候補化合物を試験する順序を逆にしてもよい。
前記プロセスの一種を促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための本発明方法の更なる様相においては、再度前記プロセスのための試験系を用意し、次いで、参照化合物を用意する。この実施形態においては、参照化合物を標識する。原則としていずれの標識も好適であるが、特に放射性標識、蛍光標識、免疫学的標識、酵素標識或いはアフィニティー標識を有し、このような標識を可能にするものが好適である。放射性標識としては、特に１Ｈや３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、５１Ｃｒ、１３Ｃ、１４Ｃが挙げられ、蛍光標識としては、フルオレセインやフルオレサミン、イソシアネート、ルシフェラーゼ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５を用いた標識が挙げられる。免疫学的標識としては、各種免疫原や免疫グロブリンＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１やＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ等が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。酵素標識としては、特にアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼが挙げられる。アフィニティー標識としては、ＧＳＴ標識やＨｉｓタグ標識、そしてビオチンやジゴキシゲニンによる標識が挙げられる。標識としては、試験系において参照化合物により生じる反応に干渉しないものが好ましい。次いで、このように標識した参照化合物を上述のように試験系において試験し、該系において生じた反応を決定する。更なる工程においては、次に候補化合物を用意し、これも上述のように試験系において試験するが、候補化合物が起こす反応を試験する際、試験系には参照化合物が含まれる。この試験は、参照化合物が確実に生物学的に活性である（即ち、促進作用或いは阻害作用を示す）ような条件下で行うことが好ましい。候補化合物を添加した後、試験系の反応を再度決定するが、この際、原則として上述の生化学的パラメータを用いることが可能である。好ましくは、放出された標識自体の量或いは各標識によって、遊離した参照化合物の量を追加的或いは選択的に測定する。
前記プロセスの一種を促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための本発明方法の更なる様相においては、候補化合物を標識することが意図されている。一実施形態においては、候補化合物を用意した後、試験系において試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する。次いで、参照化合物を用意した後、試験系において参照化合物を試験するが、この際、試験系は、特に参照化合物が生理学的に活性であることを可能にする条件下で、候補化合物を含んでいる。そして、試験系の反応を決定し、放出された候補化合物の量及び／又は候補化合物の放出された標識の量を測定する。或いは、これに加えて、各プロセスにおける参照化合物及び候補化合物双方の反応を特徴付けるために、前記パラメータを上述のように用いることができる。また、本発明においては、候補化合物や参照化合物を標識することとは関係無く、これらの化合物を添加する順序を逆にしてもよい。上述の二種類の手順の内、第一の手順においては、参照化合物が候補化合物と競合しており、第二の手順においては、候補化合物が参照化合物と競合している。最後に、本発明のスクリーニング方法の各種様相においては、候補化合物或いは参照化合物の一方が標識（以下第一の標識とも称する）を有しているが、更に他方が標識（以下第二の標識とも称する）を有することもでき、第一と第二の標識は互いに異なっているのが好ましい。
前記プロセスの一種を促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための本発明方法のいずれにおいても、参照化合物は、核酸、その転写物或いはその翻訳物、また、任意的にはそれらの組合せであり、前記核酸は、ＤＮＡ結合タンパク質及びＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択されることが意図されている。特に好ましいＤＮＡ結合タンパク質やＨＭＧタンパク質としては、本明細書に記載のもの、特に表１に記載の配列番号１〜３０のものが挙げられ、タンパク質をコードする核酸としては、表２に記載の配列番号３１〜６４のものが挙げられる。
本発明において、各種用途及び使用の際には、ＤＮＡ結合タンパク質及びＨＭＧタンパク質の一種、及び／又は本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質及びＨＭＧタンパク質の一種をコードする核酸の一種を用いる。しかし、本発明においては、前記各種タンパク質や前記タンパク質をコードする各種核酸の内の二種以上の混合物を用いることもできる。また、本明細書において用いられている次の「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」という用語は互いに置き換え可能である。
本発明の更なる様相は、別個の生物学的プロセスを阻害するための、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質の使用、該タンパク質をコードする核酸の使用、好ましくは該タンパク質と相互作用する（好ましくは、該タンパク質に拮抗する）分子の使用に関する。この阻害に基づき、これらのプロセスに関連する疾患の予防や治療を原因的或いは対症的に行うことができる。このような疾患としては、腫瘍、腫瘍疾患、組織球増殖症、炎症性疾患、炎症及び関節炎が挙げられる（以下、これらの疾患を「前記疾患」とも称する）が、これらに限定されない。前記疾患は、ヒトの各疾患であってもよく、動物、特にペットや動物園の動物、家畜等の各疾患であってもよい。この様相及び他の様相に記載のＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質としては、このようなタンパク質全てが挙げられ、特に本明細書に記載のＨＭＧタンパク質、ＨＭＧペプチド及びその断片、また、それらをコードする核酸が挙げられる。本明細書において別に明記していなければ、「タンパク質」はポリペプチドのことも指し、逆の場合も同様である。特に、「ＨＭＧタンパク質」にはＨＭＧペプチド及びその断片も含まれる。
この因果関係のため、本発明の更なる様相は、前記疾患のいずれかを予防及び／又は治療するための剤に関する。このような剤としては、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、及びそれらをコードする核酸の作用を阻害或いは拮抗するものが好ましい。このような剤は、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、或いはそれらをコードする核酸に結合するポリペプチドや、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、或いはそれらをコードする核酸に結合する抗体である。このような疾患の予防や治療に使用できる他の剤としては、ｓｉＲＮＡやＲＮＡｉ、アプタマー、スピゲルマー、アンチセンス分子、リボザイムが挙げられる。本発明は、医薬、特に前記疾患のいずれかの治療のための医薬を製造するためのこのような剤の使用に関する。
上述の剤は当業者によって製造することができる。ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、その断片、或いは該タンパク質をコードする核酸やその断片、特に本明細書に開示のもののいずれもこのような製造の基礎となる。前記タンパク質は、ＨＭＧＢ１及びその一部、特にＨＭＧＢ１のＡドメインであることが特に好ましい。前記疾患のいずれかの治療及び／又は予防のための医薬を製造するために本発明で用いることのできる剤としては、ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質或いはその断片）に対する抗体や、ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質或いはその断片）に結合するペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質或いはその断片）のｍＲＮＡを指向するｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質或いはその断片）をコードする核酸に対するアンチセンス分子が挙げられる。前記核酸は、具体的にはｍＲＮＡやｈｎＲＮＡの他、ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質或いはその断片）をコードを指向するリボザイムが挙げられ、中でもｍＲＮＡやｈｎＲＮＡである。更に、上述の剤としては、ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質或いはその断片）或いはそれらをコードする核酸を思考するアプタマーやスピゲルマーが挙げられる。
本発明で用いる抗体は、シーザー（Cesar）とミルシュタイン（Milstein）のプロトコル及びそれを更に改良した方法に従って産生することができるモノクローナル抗体であることが好ましい。原則としてＨＭＧＢに特異的に結合することができるのであれば、用いる抗体は、抗体の断片や誘導体、例えば、Ｆａｂ断片やＦｃ断片であってもよく、また、一本鎖抗体であってもよい。モノクローナル抗体だけでなく、ポリクローナル抗体を用いることもできる。原則として医薬としても用いることのできる基礎研究用ポリクローナル抗体としては、例えば、ＨＭＧＢ１を指向する抗体ｓｃ−１２５２３（サンタクルーズ・バイオテクノロジー、米国サンタクルーズ）が挙げられる。用いる抗体はヒト抗体或いはヒト化抗体が好ましい。
ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質、或いはそれらをコードする核酸）と相互作用するペプチドやポリペプチドは、従来技術で知られた方法、例えばファージディスプレイ法を用いてスクリーニングすることができる。このような技法は当業者に知られている。このようなペプチドの産生に関しては、通常、ペプチドライブラリーを、例えばファージの形態で作成し、このライブラリーを標的分子（即ち、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、好ましくはＨＭＧＢ１）に接触させる。次いで、結合ペプチドを、通常、標的分子との複合体の状態でライブラリーの非結合メンバーから分離する。結合特性が実験条件（塩濃度等）に少なくともある程度依存することは当業者であれば容易に分かることである。高い親和性或いはより大きな力で標的分子に結合しているペプチドをライブラリーの非結合メンバーそして標的分子から分離した後、該ペプチドの特徴付けを行うことができる。任意的には、特徴付けの前に、例えば対応するペプチドをコードするファージを増殖することによる増幅工程が必要となる。特徴付けには、各ＤＮＡ結合タンパク質（特に各ＨＭＧ）に結合するペプチドの配列決定が含まれることが好ましい。原則として、ペプチドの長さは限定されない。しかし、上述の方法においては、通常、８〜２０アミノ酸長のペプチドを使用或いは取得する。ライブラリーは、１０２〜１０１８種のペプチド、好ましくは１０８〜１０１５種のペプチドを含む。
標的分子結合ポリペプチドの具体的な形態としては、例えば、ドイツ特許出願ＤＥ１９７４２７０６号に記載のアンチカリンが挙げられる。
更に、ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸）の作用に拮抗する小分子も用いることができる。このような小分子は、例えば、スクリーニング方法、特に小分子ライブラリーのスクリーニングによって特定することができる。これに関連して、標的分子をライブラリーに接触させ、標的分子に結合するライブラリーのメンバーを決定し、任意的にはこれらのメンバーをライブラリーの他のメンバーそして標的分子から分離し、また、更に任意的にはその特徴付けも行う。この場合にも、小分子の特徴付けは当業者に知られた手法によって行うが、例えば、化合物を特定し、分子構造を決定する。このようなライブラリーに含まれるメンバー数は、最低２であり、多くとも数十万である。本明細書に記載のアプタマーは一本鎖或いは二本鎖のＤ核酸であり、標的分子に特異的に結合する。アプタマーの産生については、例えば、ヨーロッパ特許ＥＰ０５３３８３８号に記載されている。アプタマーの産生については次の通りである。
アプタマーの産生方法において、核酸（無作為に選ばれた少なくとも８個の連続するヌクレオチドのセグメントから成る）の混合物、即ち、潜在的なアプタマーを用意し、この混合物をＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸、ＤＮＡ結合タンパク質の相互作用パートナー、ＨＭＧ相互作用パートナー、特に天然相互作用パートナー及び／又はそれらをコードする核酸に接触させ、標的に結合する核酸（任意的に、この結合は高い親和性に基づく）を候補混合物と比較し、候補混合物から分離し、こうして得られた標的に結合する核酸（任意的に、この結合は高い親和性或いはより大きな力による）を増幅する。上述のステップを数回繰り返し、この方法の終了後、対応する標的に特異的に結合する核酸、いわゆるアプタマーが得られるようにする。本発明においては、例えば、アプタマー開発分野の当業者に知られているように別個の化学基を導入することによって、このようなアプタマーを安定化させることができる。アプタマーは既に治療に用いられている。また、本発明においては、こうして産生したアプタマーを標的の確認のために用い、更に医薬、特に小分子の開発用リード化合物として用いることもできる。
スピゲルマーの製造や産生は基本的に同様の原理に基づくものであり、本発明において、スピゲルマーは、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸、ＤＮＡ結合タンパク質の相互作用パートナー、ＨＭＧの相互作用パートナー、特に天然相互作用パートナー及び／又はそれらをコードする核酸を標的分子として用いて産生することができる。スピゲルマーの産生については、例えば、国際特許出願ＷＯ９８／０８８５６号に記載されている。スピゲルマーはＬ核酸であって、即ち、Ｌヌクレオチドによって構成されており、その基本的な特徴は、生物系で非常に高い安定性を示すことである。このため、アプタマーの場合と同様に、標的分子と特異的に相互作用し結合する。より詳細には、Ｄ核酸の異種集団を作製し、この集団を標的分子の光学対掌体、この場合、天然ＬエナンチオマーのＤエナンチオマーに接触させた後、標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ核酸を分離し、標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ核酸を特定し、任意的には分離、配列決定を行い、次いで、先に特定したＤ核酸と配列が同一のＬ核酸を合成する。アプタマーの製造プロセスと同様に、上述の工程を数回繰り返すことによって、適切な核酸、即ち、スピゲルマーを濃縮、産生することができる。
ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質）及びそれらをコードする核酸を用いて製造或いは開発できる他の化合物クラスとしては、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉが挙げられる。
これらのクラスは全て、翻訳物のレベル、即ち、ＤＮＡ結合タンパク質（特にＨＭＧタンパク質やその相互作用パートナー、特にＨＭＧＢ１）のレベルにおいて有効ではなく、各タンパク質をコードする核酸、特にＨＭＧＢ１をコードするｍＲＮＡのレベルにおいて有効であるという点で共通している。
リボザイムは触媒活性を有する核酸であり、ＲＮＡから構成されていることが好ましく、二種類の部分を有する。第一の部分は触媒活性に関与し、第二の部分は標的核酸との特異的相互作用に関与する。標的核酸とリボザイムの第二の部分の相互作用（通常、基本的に互いに相補的な塩基領域のハイブリダイゼーションによる）が起こり、リボザイムの触媒部分は標的核酸を分子内或いは分子間で加水分解するが、リボザイムの触媒活性がホスホジエステラーゼ活性の場合には、分子間加水分解が好ましい。次いで、任意的ではあるが、コード核酸の分解が起こり、この際、標的分子の力価が核酸レベル及びタンパク質レベルにおいて細胞内外で低下し、子宮内膜の処置に対する治療的アプローチが提供される。リボザイム、その使用及びその構造原理については、当業者に知られており、例えば、ドハーティー（Doherty）及びダウドナ（Doudna）（リボザイムの構造及びメカニズム（Ribozyme structures and mechanisms）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２００１年；３０：４５７〜７５）やリューイン（Lewin）及びハウスワース（Hauswirth）（リボザイム遺伝子治療：分子医学への応用（Ribozyme gene therapy: applications for molecular medicine）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２００１年、７：２２１〜８）に記載されている。
医薬や診断剤の製造のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、ほぼ同様の作用モードに基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、塩基相補性によって、標的ＲＮＡ（通常はｍＲＮＡ）とハイブリダイズし、ＲＮＡアーゼＨを活性化する。ＲＮＡアーゼＨは、ホスホジエステル結合ＤＮＡ及びホスホロチオエート結合ＤＮＡの双方によって活性化される。ホスホジエステル結合ＤＮＡは細胞ヌクレアーゼによって急速に分解するが、ホスホロチオエート結合ＤＮＡは分解しない。このような抵抗性非天然ＤＮＡ誘導体は、ＲＮＡにハイブリダイズするとＲＮＡアーゼＨを阻害しなくなる。換言すると、アンチセンスポリヌクレオチドはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体としてのみ活性である。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、例えば、米国特許第５，８４９，９０２号或いは米国特許第５，９８９，９１２号に記載されている。原則として、アンチセンスオリゴヌクレオチドの基本概念は、個別のＲＮＡに相補的な核酸を提供することにある。換言すると、ＨＭＧタンパク質及びその相互作用パートナー、特に各ｍＲＮＡの核酸配列についての知識を基に、コード核酸、特にｍＲＮＡの分解をもたらすアンチセンスオリゴヌクレオチドを塩基相補性によって産生することができる。
原則として医薬や診断剤に好適な他の化合物クラスとしては、いわゆるＲＮＡｉが挙げられる。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ干渉を仲介する二本鎖ＲＮＡであり、通常、約２１〜２３ヌクレオチド長である。ＲＮＡｉにおいては、前記二本鎖の内の一方が分解しようとする遺伝子の配列に相当する。換言すると、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質及び／又はそれらの相互作用パートナーをコード核酸（特にｍＲＮＡ）配列についての知識を基に、二本鎖ＲＮＡ（ここで、ＲＮＡ鎖の一方は、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧ及び／又はそれらの相互作用パートナーをコードする前記核酸、特にｍＲＮＡと相補的である）を製造することができ、これに引き続き、各コード核酸の分解がもたらされ、それと同時に各タンパク質の力価が低下する。医薬や診断剤としてのＲＮＡｉの作製及び使用については、例えば、国際特許出願ＷＯ００／４４８９５号やＷＯ０１／７５１６４号に記載されている。
上述の化合物クラス、即ち、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びＲＮＡｉの作用モードに関して、本発明においては、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、より詳細にはＨＭＧＢ１、及び特に天然の相互作用パートナーだけではなく、そのコード核酸、特にｍＲＮＡも、前記疾患（即ち、腫瘍や腫瘍疾患、組織球増殖症、炎症性疾患、炎症、関節炎）の治療及び／又は予防のための医薬の製造のため、前記疾患診断用の診断剤の製造のため、また、前記疾患やその治療の進行をモニタリングするために、直接的に或いは標的分子として用いることができる。
本発明においては、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、それらの断片、或いはそれらをコードする核酸を指向し、好ましくは、これらタンパク質やそれらをコードする核酸の作用に拮抗する上述の化合物クラス（即ち、抗やペプチド、アンチカリン、小分子、アプタマー、スピゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ）を、治療及び／又は予防のための医薬の製造、特に腫瘍や腫瘍疾患、組織球増殖症、炎症性疾患、炎症、関節炎の治療及び／又は予防のための医薬の製造のために用いることができる。
本発明においては、上述の医薬や剤は、前記疾患の治療用だけでなく、診断目的にも用いることができる。即ち、上述の剤は診断薬或いは診断剤、好ましくは、腫瘍や腫瘍疾患、組織球増殖症、炎症性疾患、炎症、関節炎のための診断薬或いは診断剤として用いることもできる。
一実施形態においては、上述の剤を含む医薬組成物或いは診断用組成物は、上述の各化合物及び本明細書の記載に従って生成される各化合物の内の一種以上だけでなく、薬学的或いは診断的に活性な他の化合物や剤と、好ましくは少なくとも一種の薬学的に許容し得る担体とを含有する。このような担体としては、例えば、液体や固体、例えば、溶液、バッファー、アルコール溶液等が挙げられる。好適な固体担体としては、例えば、デンプン等が挙げられる。上述の各種化合物クラスを、所望の投与経路（例えば、経口投与や非経口投与、皮下投与、静脈内投与等）によって投与できるよう、どのように調製すべきかについては、医薬組成物分野の当業者には公知である。
ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、その断片及びそれらをコードする核酸に拮抗する上述の剤（即ち、小分子やペプチド、アンチカリン、抗体、アプタマー、スピゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド（本明細書においてはアンチセンス分子とも称する）、ＲＮＡｉ）だけではなく、細胞表面レセプターＲＡＧＥ或いはその断片も、このような目的、即ち、腫瘍や腫瘍疾患、組織球増殖症、炎症性疾患、炎症、関節炎の診断剤を製造するための剤として、或いは、腫瘍や腫瘍疾患、組織球増殖症、炎症性疾患、炎症、関節炎の治療及び／又は予防のための医薬を製造するための剤として用いることができる。該レセプター或いはそれに由来する断片は、ＨＭＧタンパク質の作用、特にＨＭＧＢ１タンパク質の作用に拮抗する（好ましくは、競合的阻害によって拮抗する）こともあり得るが、必ずしもこの考え方に固執するものではない。前記疾患治療用の医薬や診断剤を製造するために本発明で細胞表面レセプターＲＡＧＥ、その断片、或いはそれらをコードする核酸を用いることは、上述のことに由来する（results therefrom）。
この作用モードは、ＤＮＡ結合タンパク質、特にＨＭＧタンパク質、より詳細にはＨＭＧＢ１が、細胞表面レセプターＲＡＧＥ（後期糖化最終産物のレセプター）に対する細胞外リガンドであるという事実に基づくものであり、例えば、タグチら（タグチ，Ａ．、ブラッド（Blood），Ｄ．Ｃ．、デル トロ（del Toro），Ｇ．、カネット（Canet），Ａ．、リー（Lee），Ｄ．Ｃ．、クー（Qu），Ｗ．、タンジ，Ｎ．、ルー（Lu），Ｙ．、ララ（Lalla），Ｅ．、フー（Fu），Ｃ．、ホフマン（Hofmann），Ｍ．Ａ．、キスリンガー（Kislinger），Ｔ．、イングラム（Ingram），Ｍ．、ルー（Lu），Ａ．、タナカ，Ｈ．、ホリ，Ｏ．、オガワ，Ｓ．スターン（Stern），Ｄ．Ｍ．、シュミット（Schmidt），Ａ．Ｍ．（２０００年）、Ｎａｔｕｒｅ ４０５：３５４〜３６０）によって記載されている。
本発明において、「ＨＭＧタンパク質」とは特に本明細書に開示されたものを意味するが、これらに限定されない。また、本発明においては、「ＤＮＡ結合タンパク質」という用語は「塩基性ＤＮＡタンパク質」と置き換え可能である。
以下、図面、実施例及び配列プロトコルを参照しつつ本発明を説明するが、これらによって、更なる特徴や実施形態、利点が分かるであろう。
実施例１：材料及び方法
特段の記載のない限り、以下の各実験においては次の材料及び方法を用いた。
ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）を用いた真核細胞へのタンパク質の導入は、Ｃａ２＋イオン濃度を変化させて行った。Ｃａ２＋イオン非存在下において真核細胞を溶解し、Ｃａ２＋イオンを添加することにより細胞を再度閉じるのが好適である。
細胞培養
準備段階として、細胞、具体的には一次培養ヒト繊維芽細胞、一次培養ヒト軟骨細胞、一次培養ヒト角化細胞、マウス角化細胞(ＭＳＣ−Ｐ５、細胞株サービス及び細胞バンク（Cell Lines Service and Cellbank）、ハイデルベルグ）及びヒトＨｅＬａ細胞（ＥＣＡＣＣ Ｎ ８５０６０７０１）を６ウェルプレートの各ウェル中の２．５ｍＬの培地１９９（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ;５％ウシ胎児血清添加）に均一に播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で細胞密度が５０〜７０％になるまで一晩インキュベートする。そのまま単層で用いるのとは別に、幾つかの試験においては実験の開始に先立ち、傷の状態を人工的に作るため、スクレーパを用いてウェルの中央部の細胞を取り除いて無細胞領域を創製した。
ストレプトリシンＯを用いた単層細胞培養物へのＨＭＧＡ１ａの導入方法
溶解に先立ち細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、Ｃａ２＋イオンを含有する培地残留物を除去する。ストレプトリシンＯ（ストレプトリシンＯ試薬、シグマ−ＲＢＩ）を用いた細胞溶解はＣａ２＋無添加ＰＢＳバッファ（バイオクロム（Biochrom））中で行う。最適ストレプトリシン濃度（殆どの細胞が可逆的に細胞を閉じる濃度）は、事前の実験にてトリパンブルー染色（シグマ−ＲＢＩ）により測定したところ、繊維芽細胞及びヒトの皮膚の角化細胞の場合は０．１Ｕ ＳＬＯ／１ｍＬ ＰＢＳである。各ウェルにおいて、所望の濃度（１００ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ及び１０００ｎｇ／ｍＬ ＨＭＧＡ１ａ等）の試験対象のＨＭＧタンパク質を含有するＰＢＳ／ストレプトリシン混合物（１ｍＬ）をそれぞれ繊維芽細胞、上皮細胞及び角化細胞に添加する。室温で１５分間インキュベートした後、３ｍＬの氷冷培地１９９（５％ウシ胎児血清及び１．８ｍＭＣａ２＋添加）を添加して細胞を再び閉じる。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２時間インキュベートする。次いで、新鮮培地２．５ｍＬに交換し、解析を行うまで上と同様にインキュベートする。
解析においては、無細胞領域の形態及びコロニー形成について顕微鏡にて観察する。更に、細胞をメタノール固定後、ギムザ染色（２％ギムザ溶液）を行って細胞全数あたりの分裂数を測定する。
単層細胞培養物に蛍光標識ＨＭＧＡタンパク質を自発的に取込ませる方法
準備段階として、各細胞をレイトン管内でカバーガラスを挿入した状態でインキュベートした（各々に対し１ｍＬの培地１９９を添加して３７℃、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートした）。
培地を確実に取り除くため、室温で細胞を１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄する。次いで、２００μＬの無血清培地と６μｇの標識ＨＭＧＡタンパク質或いは６μｇのフルオレセイン溶液（陰性対照）を細胞に添加する。反応物を３７℃、５％ＣＯ２下、暗所で１時間インキュベートする。インキュベート後、２５０μＬの培地を添加し、更に２時間半インキュベートする。次いで、カバーグラスをＰＢＳで簡単に洗浄し顕微鏡のスライドに載せる。解析は約４時間後に行う。
ストレプトリシンＯを用いた単層細胞培養物への蛍光標識ＨＭＧＡ１ｂの導入方法
初めに、ＨｅＬａ細胞及び繊維芽細胞をレイトン管内で各々１ｍＬの培地１９９を用いて３７℃、５％ＣＯ２下一晩インキュベートする。ＨｅＬａ細胞は２０％ウシ胎児血清を含有する培地で、繊維芽細胞は５％ウシ血清を含有する培地で培養する。
培地を確実に取り除くため、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。室温のストレプトリシンＯをＰＢＳに希釈し、終濃度を０．１Ｕ／ｍＬとする。次いで、３５０μＬの希釈したストレプトリシンＯ及び６μｇの標識ＨＭＧＡ１ｂタンパク質或いは６μｇのＦＬＵＯＳ溶液（陰性対照）をＨｅＬａ細胞及び繊維芽細胞に添加する。反応物を暗所において室温で１５分間インキュベートする。１ｍＬの氷冷培地１９９（ＨｅＬａ細胞の場合は２０％ウシ胎児血清添加、繊維芽細胞の場合は５％ウシ血清添加）を添加すると、細胞は再び閉じる。３７℃、５％ＣＯ２で１時間半インキュベートした後、カバーグラスを簡単にＰＢＳで洗浄し、顕微鏡のスライドに載せる。解析は約２時間後に行う。
皮膚組織片へのＨＭＧＡタンパク質導入方法
皮膚試料を滅菌下で採取し、Ｈａｎｋ'ｓ氏液（バイオクロム（Biochrom））に入れて輸送し実験開始まで保存する。皮膚は０．５〜１ｍｍ片に切断しザルスタットチューブに分配し実験に用いる。皮膚片を１×ＰＢＳで３回洗浄するが、洗浄は、全ての培地が洗浄除去されるまで室温で５分間遠心分離（１２０×ｇ）して行う。最後の遠心分離段階の後、上清を完全に取り除き、皮膚片を室温で１５分間インキュベートする。インキュベートは、一反応物あたり、１０００ｎｇ／ｍＬの各ＨＭＧタンパク質（ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂ、ＨＭＧＡ２）を含有する１ｍＬのＳＬＯ／ＰＢＳ溶液（０．１ Ｕ ＳＬＯ／１ｍＬ ＰＢＳ）中で行う。溶解を終了させるため、３ｍＬの氷冷培地１９９（２０％ウシ胎児血清及び１．８ｍＭＣａ２＋添加）を添加し、反応物を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２時間インキュベートする。次に、皮膚片を殺菌カバーグラス上に載せ、逆さにして高湿度チャンバに移し、各々を５ｍＬの２０％培地１９９で覆って、更に３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートする。皮膚片は毎日顕微鏡で観察し、解析のため、種々の皮膚細胞種の成長を記録した。
皮膚組織片への蛍光標識ＨＭＧＡ１ｂの導入方法
新たに用意したラットの皮膚を約１〜２ｍｍ２の小片に切断する。切断は、殺菌器具を用いて２０％ウシ胎児血清を含有する培地１９９中で行う。全ての培地とＣａ２＋残留物を取り除くため皮膚片をＰＢＳで４回洗浄する。次に、皮膚片をエッペンドルフカップに移し、３５０μＬの希釈ストレプトリシンＯ（０．１ Ｕ／ｍＬ）と６μgの標識ＨＭＧＡ１ｂタンパク質或いは６μｇのＦＬＵＯＳ溶液（陰性対照）を皮膚片に添加する。反応物を暗所において室温で１５分間インキュベートする。細胞は、１ｍＬの氷冷培地１９９（２０％ウシ胎児血清添加）を添加することにより、再度閉じる。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１時間３０分インキュベートした後、アンチフェード（Antifade）に包埋した皮膚の凍結切片試料を調製する。
解析は、約２〜３時間後に蛍光顕微鏡下で行う。
ＨＭＧタンパク質の蛍光標識方法
標識は、ロシュ社のフルオレセイン標識キットを用いて行う。
各反応に対し、１００μｇのＨＭＧタンパク質、具体的にはＨＭＧＡ１ｂタンパク質を凍結乾燥後、１００μＬのＰＢＳバッファーに浮遊させる。ＨＭＧＡ１ｂ溶解物に対し１μＬのＦＬＵＯＳ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、暗所において攪拌下室温で２時間インキュベートする。
セファデックス（Sephadex）−Ｇ−２５カラムを５ｍＬのブロッキング溶液及び３０ｍＬのＰＢＳで平衡化する。次に、反応物をカラムに移し標識タンパク質を３．５ｍＬのＰＢＳで溶出させる。標識タンパク質は、１〜２番目の画分（各画分は１０滴分（約０．５ｍＬ））に含まれている。
標識は、ＨＰＬＣ（ＦＬＵＯＳ溶液／標識ＨＭＧＡ（特にＨＭＧＡ１ｂ）のピークを比較）及びＰＡゲルを用いて測定する。標識タンパク質を観察したところ、紫外光下で際立ったピークが見られ、クーマシー染色で確認した。約６０μg／ｍＬのＨＭＧＡ、具体的にはＨＭＧＡ１ｂがフルオレセインに標識されている。
実施例２：内皮細胞の培養
方法：
ヒト内皮細胞の培養には、頚動脈から得た動脈調整物を用いた。組織片は除去後、調製までＨａｎｋ'ｓ氏液中で保管した。調製は、Ｈａｎｋ'ｓ氏液中で、内膜と中膜を注意深く分離することにより行った。次に、約１ｍｍの大きさの組織片をカバーグラスに載せ、逆さにして細胞培養フラスコ中で培養した。前培養は、対応する各成長因子を含有する１ｍＬの内皮成長培地中で、３７℃、５％ＣＯ２下で行った。細胞は、細胞密度がコンフルーエンシーに達した後、ＰＢＳで一回洗浄し、トリプシン処理をして１：３に分けた。
結果：
約２週間後、最初に移動した細胞を観察できた。細胞は、確認のため、抗ヒトＣＤ３１内皮細胞抗体を用いた免疫組織化学分析に付した。この細胞はヒト内皮細胞であることが確認された。
実施例３：ＨＭＧＢ１を用いた内皮細胞の増殖試験
細胞数の最適化
方法：
増殖試験は、ロシュの細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵキットを用いて行った。
最適な細胞数を決定するため、種々の内皮細胞希釈物（１０５〜１０２個／１００μＬ）を９６ウェルプレートに調製し、対応する増殖培地中で３７℃、５％ＣＯ２で２日間培養した。対応する増殖培地を対照として用いた。次に、１０μＬのＢｒｄＵ（濃度：１０μＭ）を各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間３０分インキュベートした。培地除去後、２００μＬ／ウェルの固定溶液を用いて室温で３０分間インキュベートすることにより細胞を固定した。次に、１００μＬ／ウェルの抗ＢｒｄＵ抗体を添加し、室温で９０分間インキュベートした。未結合抗体を取り除くため、反応物を２００μＬの洗浄液を用いて３回洗浄した。比色分析により増殖を測定するため、１００μＬ／ウェルの基質を添加し、約５分後に２５μＬ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて停止させ、４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの吸光度をＡｎｔｈｏｓリーダーズ２００１を用いて測定した。各希釈物に対し３連で試験した。
結果：
平行して行った各試験の平均値を計算した後、種々の内皮細胞希釈物を図に記入し、マイクロソフトエクセルを用いて解析した。この結果、最適な細胞数は５０００〜７５００個／１００μＬであることが分かった。
ＨＭＧＢ１の内皮細胞への投与
方法:
実施例２に記載のように培養を行った。最適細胞数の内皮細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに分配後、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次に、種々の濃度（１μg、０．１μｇ、１０ｎｇ）のＨＭＧＢ１を添加した。各ＨＭＧＢ１濃度あたり３連で行った。更に２４時間培養後、ＢｒｄＵを添加した。次いで、実施例３「細胞数の最適化」と同様に処理した。
結果：
増殖率は、陰性対照に比べ、ＨＭＧＢ１を投与した内皮細胞の方が高かった。増殖率とＨＭＧＢ１投与濃度の間には相関が見られた。一般に、ＨＭＧＢ１を投与した細胞の方が、顕微鏡で観察できる有糸分裂速度はより大きかった。
実施例４：球形細胞モデルを用いたＨＭＧＢ１の血管新生促進作用の研究
方法：
準備段階として、ヒト内皮細胞を、対応する内皮成長因子を用いて３７℃、５％ＣＯ２で培養して調製した。実験に用いる内皮細胞を２代目及び３代目から採取した。培養後、細胞をトリプシン処理し、ｍｅｔｈｏｃｅｌ含量２０％の対応する成長培地に浮遊させた。約４時間インキュベートした後、細胞は、自然に３次元の球形の細胞（球形細胞）となった。これをコラーゲンゲルに包埋した。２μg／ｍＬ、０．４μg／ｍＬ及び０．０８μg／ｍＬの濃度のＨＭＧＢ１をゲルに添加し各増殖試験を行った。参照として内皮成長因子ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を用い、成長因子を添加しないものを陰性対照とした。インキュベーションを２週間行った後、デジタルカメラを備えた逆さの顕微鏡を用いて細胞を分析した。画像は直接走査してソフトイメージングシステムの画像解析ソフトウェアａｎａｌｙＳＩＳに送り、解析した。
結果：
芽長さ増加分、即ち球形細胞から伸びた芽の長さを画像解析ソフトウェアにより解析した。ＨＭＧＢ１の血管新生促進作用は、２μg／ｍＬの濃度において観察された。陰性対照と比較して、明確な芽形成が観察された。更に、ＨＭＧＢ１単独の場合よりも、ＶＥＧＦ／ＨＭＧＢ１の組合せの方がより際立った芽形成を示した。結果を図１に示す。
実施例５：球形細胞モデルを用いたＨＭＧＡ１の血管新生促進作用の研究
方法：
準備段階において、ヒト内皮細胞を３７℃、５％ＣＯ２で対応する内皮増殖培地を用いて培養した。実験に用いる内皮細胞は２代目及び３代目から採取した。培養後、細胞をトリプシン処理し、ｍｅｔｈｏｃｅｌ含量２０％の対応する成長培地に浮遊させた。約４時間インキュベートした後、細胞は、自然に３次元の球形の細胞（球形細胞）となった。これをコラーゲンゲルに包埋した。各増殖試験において、２μg／ｍＬのＨＭＧＡ１をこのゲルに添加した。参照として２５ｎｇ／ｍＬの内皮成長因子ＶＥＧＦを用い、成長因子を添加しないものを陰性対照とした。インキュベーションを２週間行った後、デジタルカメラを備えた逆さの顕微鏡を用いて細胞を分析した。画像は直接走査してソフトイメージングシステムの画像解析ソフトウェアａｎａｌｙＳＩＳに送り、解析した。
結果：
累積芽長、即ち球形細胞からの芽形成の全長を画像解析ソフトウェアにより解析した。ＨＭＧＡ１ａとＨＭＧＡ１ｂの両者とも２μg／ｍＬの濃度で血管新生促進作用が観察された。組合せた場合、ＨＭＧＡ１ａは、ＨＭＧタンパク質無添加のＶＥＧＦに比べ高い芽形成を示した。結果を図２に示す。
実施例６：ストレプトリシンＯを用いたヒト皮膚繊維芽細胞単層培養物へのＨＭＧＡ１ａタンパク質の導入
陰性対照（ストレプトリシンＯのみで処理）の皮膚細胞に比べ、ＨＭＧＡ１ａタンパク質処理細胞の増殖率は極めて大きかった。細胞全数に対する有糸分裂細胞の個数を計数したところ、図３に示すように増殖率が高い程細胞分裂率も大きかった。更に、ＨＭＧＡタンパク質処理細胞はより高い運動性を示した。この運動性は、例えば無細胞領域への細胞の内部成長により測定できる。
実施例７：ＳＬＯ処理細胞への標識ＨＭＧＡ１ｂタンパク質の導入
約２時間インキュベーション後にＨｅＬａ細胞の核（図４）及び繊維芽細胞の核（図５）への標識ＨＭＧＡ１ｂタンパク質の取込みが見られた。ＳＬＯ処理直後の細胞を観察した時には、陽性信号は観察されなかった。即ち、核へのＨＭＧＡ１ｂタンパク質の取込みには約２時間かかった。例えばＨｅＬａ細胞の場合には、ＨＭＧＡ１ｂ陽性細胞核とＨＭＧＡ１ｂ陰性細胞核の比は１６：３２であった。
フルオレセインだけを取込む陰性対照では陽性核の信号は得られず、図６に示すように細胞質の曖昧な緑色の染色だけが見られた。
実施例８：ストレプトリシンＯによるヒト及びラットの皮膚試料へのＨＭＧＡタンパク質の導入
ヒト及びラットの皮膚試料細胞に各ＨＭＧＡタンパク質（ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂ、ＨＭＧＡ２）を取込ませたところ、陰性対照に比べ頻繁な増殖が各ＨＭＧＡタンパク質処理皮膚片において見られた。分析対象の皮膚試料（図７参照）から種々の皮膚細胞（角化細胞、繊維芽細胞等）が生長し、これらの分裂指数及び細胞生残性（vitality）はストレプトリシン処理をしたにも関わらず高かった。更に、ＨＭＧＡタンパク質処理皮膚試料では、増殖率の向上とは別に細胞運動性が大きく向上したが、このことから本明細書に記載される治療用途という概念は、細胞培養物から組織まで適用できるということが分かる。
実施例９：ストレプトリシンＯを用いたラット皮膚への標識ＨＭＧＡ１ｂタンパク質の導入
凍結試料を解析した結果、図８に示すように鱗状上皮と結合組織の一部とにＨＭＧＡ１に関連した強い核陽性信号がある。また、細胞培養物にも見られたように、核陽性信号は約２時間のインキュベーション後にのみ観察された。このことから、再び、ＨＭＧタンパク質の輸送には約２時間かかることがわかる。
陰性対照と比較したところ、細胞質が曖昧に緑色に染色され、細胞核は全て染色陰性だったことが分かった。
実施例１０：ＨＭＧＡ１ｂタンパク質のフルオレセイン標識
標識は、ＨＰＬＣ（ＦＬＵＯＳ溶液／標識ＨＭＧＡ１ｂのピークの比較）及びＰＡゲルを用いて測定した。標識タンパク質は紫外光下で際立ったピークを示し、これをクーマシー染色で確認した。６０μg／ｍＬのＨＭＧＡ１ｂがフルオレセインに標識されていた。
実施例１１：組織再生に関するＨＭＧＡ１ｂタンパク質の作用モードを決定するためのマイクロアレイを用いた発現プロファイル解析
組織再生におけるＨＭＧＡ１ｂタンパク質の作用の分子遺伝的モードを解析するため、マイクロアレイ（ヒト３０Ｋアレイ（Ａ／Ｂ／Ｃ）、ＭＷＧ−バイオテク）を用いて、ＨＭＧＡ１ｂタンパク質処理皮膚試料と未処理皮膚試料の発現パターンを比較し解析した。
この目的のため、ヒト皮膚試料を０．５〜１ｍｍ片に切断し、ザルスタットチューブに分け入れた。皮膚片を１×ＰＢＳで３回洗浄したが、洗浄は、全ての培地が洗浄除去されるまで室温で５分間遠心分離（１２０×ｇ）して行った。最後の遠心分離段階の後、上清を完全に取り除き、皮膚片を室温で１５分間インキュベートした。インキュベートは、一反応あたり、１０００ｎｇ／ｍＬのＨＭＧＡ１ｂタンパク質を含有する１ｍＬ ＳＬＯ／ＰＢＳ溶液（０．１ Ｕ ＳＬＯ／１ｍＬ ＰＢＳ）中で行った。このタンパク質を含有しないものを陰性対照として用いた。溶解を終了させるため、３ｍＬの氷冷培地１９９（２０％ウシ胎児血清及び１．８ｍＭＣａ２＋添加）を添加し、反応物を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１２時間インキュベートした。
皮膚試料からのＲＮＡの単離は、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡアイソレーションキット（キアゲン）を用い、このメーカーのプロトコル「心臓、筋肉及び皮膚組織からの全ＲＮＡの単離（Isolation of total RNA from Heart, Muscle, and Skin Tissue）」に従い、更にＤＮａｓｅによる消化を２５℃で２×１５分間行い実施した。ｓｓ ｃＤＮＡの合成は、スーパースクリプト（インビトロジェン）の標準プロトコルに従い行った。ｃＤＮＡの蛍光標識はＣｙ３−ＵＴＰ及びＣｙ５−ＵＴＰを用いｓｓ ｃＤＮＡの「直接標識」により行った。
ハイブリダイゼーションのため、標識ｃＤＮＡを９５℃で３分間変性し、氷上で３分間インキュベートした。更に、任意的に析出物を４２℃で溶解させた。ハイブリダイゼーションは、マイクロアレイジーンフレーム（Microarray Gene Frame）を用い、マイクロアレイのメーカー（ＭＷＧ バイオテク）の指示に従い４２℃で１６〜２４時間行った。次に、メーカーの指示に従い２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（洗浄バッファー１）、１×ＳＳＣ（洗浄バッファー２）及び０．５×ＳＳＣ（洗浄バッファ３）で洗浄した。解析は、アフィメトリックス４２８アレイスキャナー（Affymetrix 428 Array Scanner）を用いて行った。
発現パターンの解析により、皮膚細胞の増殖及び再賦活化におけるＨＭＧＡタンパク質、ＨＭＧＡ１ｂタンパク質の作用モードについての重要な情報を得ることができた。解析結果から、ＨＭＧＡ１ｂタンパク質添加により、タンパク質−ＤＮＡレベル或いはタンパク質−タンパク質レベルでＨＭＧＡ１ｂタンパク質がそのパートナーと相互作用することによって目的組織の遺伝子発現に対しＨＭＧＡ１ｂタンパク質が作用することが分かる。創傷治癒及び皮膚再生に関与する種々の遺伝子の発現パターンは、このタンパク質の相互作用メカニズムに調節されている。成体組織における胎児遺伝子（fetal genes）の再発現を検出することにより皮膚の組織再生や創傷治癒或いは老化防止（即ち組織の若返り）におけるＨＭＧＡタンパク質及びＨＭＧＡ１ｂタンパク質の重要な役割を検証できた。
実施例１２：損傷ＤＮＡの修復に対する各ＨＭＧＡタンパク質の作用モードを測定するための、マイクロアレイを用いた発現プロファイル解析
アレイを用いて損傷ＤＮＡの修復に関する各ＨＭＧＡタンパク質の作用の分子遺伝的モードを解析し（クロンテックのＡｔｌａｓ−Ａｒｒａｙｓ１．２、＃７８５０〜１、ヒトゲノムの１１７６遺伝子配列を含む）、ＨＭＧＡタンパク質で処理した角化細胞と未処理の角化細胞の発現パターンを比較分析した。
細胞からのＲＮＡの単離は、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡアイソレーションキット（キアゲン）を用い、このメーカーのプロトコル「心臓、筋肉及び皮膚組織からの全ＲＮＡの単離」に従い、更にＤＮａｓｅによる消化を２５℃で２×１５分間行い実施した。ｓｓ ｃＤＮＡの合成は、スーパースクリプト（インビトロジェン）の標準プロトコルに従い行い、ｃＤＮＡは放射性標識（３２Ｐ）してからハイブリダイゼーションに用いた。
ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂ、ＨＭＧＡ２の各タンパク質は６μｇ用いた。組換えヒトＨＭＧＡタンパク質の投与により損傷ＤＮＡの修復に関与するタンパク質の遺伝子がアップレギュレートされることが分かった。試料を表３に示す。ＡＴＭは、２重鎖切断により活性化されるタンパク質キナーゼである。ＡＴＭは、２重鎖切断に応答する更に重要なタンパク質をリン酸化する（ヨセフ・シロー（Yosef Shiloh）：ＡＴＭ及び関連タンパク質キナーゼ：ゲノム一体性をセーフガードする（ATM and related protein kinases: safeguarding genome integrity）、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ ２００３：３、１５５〜１６８）。ＴＯＰ１は、ＤＮＡ修復プロセスに関与するトポイソメラーゼ１である（パスター（Pastor）Ｎ、コルテス（Cortes）Ｆ：Ｘ線治療後のチャイニーズハムスター放射線感受性変異体におけるＤＮＡトポイソメラーゼ作用（DNA topoisomerase activities in Chinese hamster radiosensitive mutants after X-ray treatment）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎ７ ２００２：２６、５４７〜５５５）。
実施例１３：蛍光標識されたＨＭＧＡ１ｂタンパク質及びＨＭＧＡ２タンパク質のヒト上皮細胞への自発的移動
約４時間のインキュベーション後に、細胞の核への標識ＨＭＧＡタンパク質、とりわけＨＭＧＡ１ｂ、ＨＭＧＡ２の自発的取込みが見られた。処理直後では、細胞核には陽性信号は見られなかった。即ち、細胞核へのこれらＨＭＧＡタンパク質の取込みには約４時間かかった。
陰性対照、即ちフルオレセインだけの取込みと比較すると、核陽性信号はなく、細胞質の緑色の曖昧な染色だけが見られた。個々の実験により異なるが、実施例１に一般的に記述したように、５０〜１００％の細胞が核の蛍光染色を示した。この染色は比較的高いタンパク質濃度でのみ視認可能であるので、全ての細胞がＨＭＧＡタンパク質を取込むと考えられる。
得られた発現パターンを解析することにより、皮膚細胞の増殖及び再賦活化におけるＨＭＧＡタンパク質、ＨＭＧＡ１ｂタンパク質の作用モードについての重要な情報を得ることができた。解析結果から、ＨＭＧＡ１ｂタンパク質添加により、タンパク質−ＤＮＡレベル或いはタンパク質−タンパク質レベルでＨＭＧＡ１ｂタンパク質がそのパートナーと相互作用することによって目的組織の遺伝子発現に対しＨＭＧＡ１ｂタンパク質が作用することが分かる。創傷治癒及び皮膚再生に関与する種々の遺伝子の発現パターンは、このタンパク質の相互作用メカニズムに制御されている。成体組織における胎児遺伝子の再発現を検出することにより皮膚の組織再生や創傷治癒或いは老化防止（即ち組織の若返り）におけるＨＭＧＡタンパク質及びＨＭＧＡ１ｂタンパク質の重要な役割が検証された。
実施例１４：抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた免疫組織化学測定
ヒト組織及びイヌ組織の試料のパラフィン切片（５μｍ）について、ヤギから得たポリクローナル抗体（ｓｃ−１２５２３、サンタクルーズ・バイオテクノロジー、米国サンタクルーズ）を用いて免疫組織化学研究を行った。この抗体は、ヒトＨＭＧＢ１タンパク質の内部領域のペプチドを標的とするものである。用いた抗体はＨＭＧＢ１を検出する。ＨＭＧＢ２タンパク質も検出するがその程度は低い。
実施例１５：乾癬患者の皮膚試料におけるＨＭＧＢ１の免疫組織化学的検出及び同患者の非罹患部分との比較
乾癬患者の皮膚部分を同一患者の非罹患部分と比較した免疫組織化学的研究（３組の組織で比較）により、対照の組織に比べて非常に高いＨＭＧＢ１タンパク質の発現が罹患部分の毛細血管において見られるという驚くべき結果が得られた。陽性信号は主に、罹患部分の内非細胞の細胞質において観察され、特に乾癬部分の毛細血管の増殖活性のある領域において顕著であった。３組の内の２組の組織においては、乾癬部分に存在する単球も、細胞質において高い染色陽性を示した。
従って、本明細書に記載のＨＭＧＢ１タンパク質の阻害剤の使用は、この疾病の好適な治療手段である。
実施例１６：イヌの悪性組織球増殖症におけるＨＭＧＢ１タンパク質の免疫組織化学的検出
悪性組織球増殖症は、イヌには比較的稀な疾病であり予後不良を伴う。ベルンナー・ゼネフント種において発症率が高い。この疾病の特徴の中でも特筆すべきはマクロファージの増殖である。ここでは５匹のイヌから得た組織試料を試験した。全ての被検試料においてマクロファージの強い免疫応答が見られ、それは対照組織と比較して非常に顕著であった。このタンパク質は主に、マクロファージの細胞質に存在していた。
このため、本明細書に記載のＨＭＧＢ１タンパク質阻害剤の使用はこの疾病の好適な治療手段である。
実施例１７：イヌ角膜の慢性表層性角膜炎におけるＨＭＧＢ１タンパク質の免疫組織化学的検出
イヌ角膜の慢性表層性角膜炎とは、炎症プロセス及び新血管形成を惹き起こす組織の変化である。動物は、この疾病にかかると失明する虞がある。罹患した動物から細胞学的調製物を調製し、免疫組織化学測定により分析した。ＨＭＧＢ１を示す際立った陽性信号がリンパ球で得られた。
従って、本明細書に記載のＨＭＧＢ１タンパク質阻害剤の使用は、この疾病の好適な治療手段である。
実施例１８：ＨＭＧＢ１による内皮細胞内のＶＥＧＦ１の調節
ヒト内皮細胞の調製及び培養を実施例２と同様に行った。８０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ及び４００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＨＭＧＢ１（ｒＨＭＧＢ１）を添加し、添加１０時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを単離した（ＲＮＡ調製については、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、フロー（Flohr）ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１；２１：３８８１〜３８８６を参照）。定量は、ヒトＶＥＧＦ ＡのオープンリーディングフレームのｃＤＮＡ配列を用いてノーザンブロット解析により行った。タンパク質を含有しない対照と比較したところ、ＶＥＧＦ Ａの発現は１．６倍、２．８倍及び３．２倍（２測定値の平均値）となり濃度依存的に増加した。
従って、本明細書に記載のＨＭＧＢ１タンパク質阻害剤の使用は、ＶＥＧＦ Ａ媒介血管新生を減少させる好適な手段であり、ひいては腫瘍の適切な治療手段である。これに反し、ＨＭＧＢ１及びこれをコードする核酸は、ＶＥＧＦ Ａ発現増加エフェクタとして投与でき、従ってＶＥＧＦ Ａを投与する疾病治療における剤として使用できる。
実施例１９：ＨＭＧＢ１による角化細胞の増殖及び移動
ヒト皮膚の生体外移植片を実施例１と同様に調製し培養した。２人のドナーから得た４個の試料を平行して培養した。培養反応物１個あたり５個の移植片を得た。組換えヒトＨＭＧＢ１（ｒＨＭＧＢ１）（２００ｎｇ／ｍＬ）を添加した。顕微鏡観察による細胞数測定は、培養開始から８日後に、移植片から増殖した角化細胞を計数することにより行った（角化細胞と繊維芽細胞の形態相違）。角化細胞数は、対照よりも平均２８％増加していた。
この実施例によって、ＨＭＧＢ１は、角化細胞の増殖及び移動に有用であることがわかる。
以上の明細書、特許請求の範囲、図面、及び明細書の一部である配列プロトコルに開示した本発明の特徴は、種々の実施形態において本発明を具現化するために個別で或いは組合せて用いることができる。
ＶＥＧＦ或いはＨＭＧＢ１タンパク質で処理後の球形細胞から発生した芽の長さを示すグラフである。 ＶＥＧＦ或いはＨＭＧＡ１タンパク質で処理後の球形細胞から発生した芽の長さを示すグラフである。 ＨＭＧＡ１ａの影響下での有糸分裂活性の皮膚細胞の量の増加を示す。 ＨｅＬａ細胞の免疫蛍光写真であり、一部の細胞は、細胞核内で蛍光標識ＨＭＧＡ１ｂタンパク質を示している。 線維芽細胞の免疫蛍光写真であり、一部の細胞は、細胞核内で蛍光標識ＨＭＧＡ１ｂタンパク質を示している。 図４及び図５に示す写真に対する陰性対照として、フルオレセインだけを導入した細胞の蛍光写真である。 ＨＭＧＡタンパク質処理皮膚片の光学顕微鏡写真であり、各種皮膚細胞型（角化細胞や線維芽細胞等）が成長している状態を示す。 ストレプトリシンＯ処理後に標識ＨＭＧＡ１ｂタンパク質がラット皮膚内へ移動することを示す凍結切片の光学顕微鏡写真である。

Claims (91)

  1. 血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生、創傷治癒、創傷後血管形成、上皮化、及び歯や骨の移植における治癒から成る群から選択されるプロセスにおける一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用であって、
    核酸は、ＨＭＧＢ１或いはその一部をコードする核酸である使用。
  2. 不十分な或いは過剰な血管新生や新血管形成、或いは創傷治癒に関連するか、或いは経心筋的血管再生を必要とする疾患の群から選択される疾患の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、
    核酸は、ＨＭＧＢ１或いはその一部をコードする核酸である使用。
  3. 血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生、創傷治癒、創傷後血管形成、上皮化、及び歯や骨の移植における治癒から成る群から選択されるプロセスのための一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用であって、
    核酸は、ＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択される使用。
  4. 不十分な或いは過剰な血管新生や新血管形成、或いは創傷治癒に関連するか、或いは経心筋的血管再生を必要とする疾患の群から選択される疾患の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、
    核酸は、ＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択される使用。
  5. 疾患の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用、特に請求項２及び／又は請求項４に記載の使用であって、前記疾患が、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑変性症、関節炎、子宮内膜症、パンヌス、組織球増殖症、乾癬、酒さ、小静脈瘤、発疹性血管腫、腫瘍疾患、海綿腫、唇血管腫、血管肉腫、痔核、動脈硬化、狭心症、虚血、梗塞、基底細胞腫、扁平上皮癌、黒色腫、カポジ肉腫、腫瘍、妊娠中毒症、不妊症、急性外傷性創傷、熱的創傷、化学的創傷、手術創傷及び慢性創傷から成る群から選択されることを特徴とする使用。
  6. 慢性創傷は、褥瘡、下腿潰瘍、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡潰瘍、慢性外傷後創傷及び糖尿病性足潰瘍から成る群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の使用。
  7. ＨＭＧタンパク質は、ＨＭＧＡファミリー、ＨＭＧＢファミリー及びＨＭＧＮファミリーから成る群から選択されることを特徴とする、請求項３〜６のいずれかに記載の使用。
  8. ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＢファミリーから選択されることを特徴とする、請求項３〜７のいずれかに記載の使用。
  9. ＨＭＧタンパク質は、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２及びＨＭＧＢ３から成る群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
  10. ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＢ１であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
  11. ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡファミリーから選択されることを特徴とする、請求項３〜７のいずれかに記載の使用。
  12. ＨＭＧタンパク質は、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂ、ＨＭＧＡ１ｃ及びＨＭＧＡ２から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
  13. ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡ１ａであることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
  14. 第１のＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡファミリーから選択され且つ第２のＨＭＧタンパク質はＨＭＧＢファミリーから選択され、好ましくはＨＭＧＡファミリーのタンパク質はＨＭＧＡ１ａであり、好ましくはＨＭＧＢファミリーのタンパク質はＨＭＧＢ１であることを特徴とする、先の各請求項のいずれかに記載の使用。
  15. ＶＥＧＦ及び／又はこれをコードする核酸を更に用いることを特徴とする、先の各請求項のいずれかに記載の使用。
  16. 組織の血管新生、新血管形成或いは創傷治癒に影響を及ぼすための方法であって、
    ａ）組織或いはその一部を用意する工程と、
    ｂ）一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を添加する工程と、
    ｃ）前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と共に前記組織をインキュベートする工程とを含む方法において、前記核酸はＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択され、任意的に
    ｄ）前記組織或いはその中間体を取得或いは回収する工程を含む方法。
  17. 前記組織或いはその一部は、ＶＥＧＦ及び／又はこれをコードする核酸と共にインキュベートすることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法であることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 前記組織は外植組織或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養組織であることを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記核酸、その転写物及びその翻訳物は、先の各請求項のいずれかに記載のものであることを特徴とする、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 二種以上のＨＭＧＢタンパク質或いはそれらをコードする核酸を用い、好ましくは第１のＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡファミリーから選択されると共に第２のＨＭＧタンパク質はＨＭＧＢファミリーから選択され、ＨＭＧＡファミリーのタンパク質はＨＭＧＡ１ａが好ましく、ＨＭＧＢファミリーのタンパク質はＨＭＧＢ１が好ましいことを特徴とする、請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. ＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択される前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を用いることに加え、血管内皮成長因子の遺伝子から成る群から選択される新たな核酸、その転写物或いはその翻訳物を用いることを特徴とする、先の各請求項のいずれかに記載の使用。
  23. 先の各請求項のいずれかに記載の一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物。
  24. 先の各請求項のいずれかに記載の一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を含む担体材料。
  25. 前記担体材料は、セルロース、アガロース、コラーゲン、シリコーン、ケイ素、プラスチック、ゲル、ハイドロゲル、フィブリン系マトリックス、人工連続フィラメント糸、ハイドロコロイド、脂肪コロイド、ポリウレタン、ポリウレタン樹脂、プラスター、合成生体材料、熱可塑性プラスチック、亜鉛膠（zinc glue）、ポリエステルフォーム、ポリイソブチレン、緩衝剤、安定剤、静菌剤、及び保湿剤から成る群から選択される材料から構成されることを特徴とする、請求項２４に記載の担体材料。
  26. 前記担体材料はインプラントとして、或いは創傷治癒のために用いることを特徴とする、請求項２４又は２５に記載の担体材料。
  27. 被覆基材と、先の各請求項のいずれかに記載の一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とを含む創傷被覆材料。
  28. 前記被覆材料は、ハイドロコロイドドレッシング材、アルギン酸カルシウムドレッシング材、活性炭製圧定布及びオーバーレイ、発泡プラスチック製オーバーレイ、フィルムドレッシング材、透明ドレッシング材、発泡シリコーンドレッシング材、フリースオーバーレイ、ハイドロセルラードレッシング材、ハイドロセレクティブ創傷オーバーレイ、吸収創傷パッド、スプレードレッシング材、人工連続フィラメント製ガーゼ、綿ガーゼ、パラフィンガーゼ、銀被覆創傷ドレッシング材、及びハイドロポリマー／発泡体ドレッシング材から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の創傷被覆材料。
  29. 一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と担体相とを含む組成物であって、前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は先の各請求項のいずれかに記載のものであり、前記担体相は、好ましくは、クリーム、脂肪性軟膏、エマルジョン（水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｗ／Ｏ）型、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型）、マイクロエマルジョン、変性エマルジョン、ナノ粒子／ナノエマルジョン、リポソーム、ハイドロディスパージョンゲル（ハイドロゲル、アルコールゲル、リポゲル、テンサイドゲル）、ゲル−クリーム、ローション、オイル／オイルバス、及びスプレーから成る群から選択される組成物。
  30. 血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生及び創傷治癒から成る群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
    ｂ）候補化合物を用意する工程と、
    ｃ）前記候補化合物を試験し、前記試験系において候補化合物が起こす反応を決定する工程とを含む方法。
  31. 血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生及び創傷治癒から成る群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
    ｂ）参照化合物を用意する工程と、
    ｃ）前記試験系において前記参照化合物を試験し、該系において参照化合物が起こす反応を決定する工程と、
    ｄ）候補化合物を用意する工程と、
    ｅ）前記試験系において前記候補化合物を試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する工程と、
    ｆ）前記試験系における参照化合物の反応と候補化合物の反応とを比較する工程とを含む方法。
  32. 血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生及び創傷治癒から成る群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
    ｂ）マーカーを有する参照化合物を用意する工程と、
    ｃ）前記試験系において前記参照化合物を試験し、該系において参照化合物が起こす反応を決定する工程と、
    ｄ）候補化合物を用意する工程と、
    ｅ）前記参照化合物を含む試験系において前記候補化合物を試験し、試験系の反応を決定し、遊離した参照化合物の量及び／又は参照化合物から放出されたマーカーの量を測定する工程とを含む方法。
  33. 血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生及び創傷治癒から成る群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
    ｂ）マーカーを有する候補化合物を用意する工程と、
    ｃ）前記試験系において前記候補化合物を試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する工程と、
    ｄ）参照化合物を用意する工程と、
    ｅ）前記候補化合物を含む試験系において前記参照化合物を試験し、試験系の反応を決定し、遊離した候補化合物の量及び／又は候補化合物から放出されたマーカーの量を測定する工程とを含む方法。
  34. 前記試験系はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系或いはｉｎ ｖｉｖｏ試験系であることを特徴とする、請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
  35. 前記参照化合物及び／又は候補化合物の反応は前記プロセスの促進であり、好ましくは、試験系における候補化合物の反応が参照化合物の反応と同等か或いはそれよりも顕著である場合、候補化合物が前記プロセスを促進する化合物であることを特徴とする、請求項３０〜３４のいずれかに記載の方法。
  36. 前記参照化合物及び／又は候補化合物の反応は前記プロセスの阻害であり、好ましくは、候補化合物が起こす試験系の反応が試験系において参照化合物が起こす反応よりも顕著でない場合、候補化合物が前記プロセスを阻害する化合物であることを特徴とする、請求項３０〜３４のいずれかに記載の方法。
  37. 前記参照化合物は、一種以上の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を含み、前記核酸はＨＭＧタンパク質の遺伝子から成る群から選択されるものであり、好ましくは先の各請求項のいずれかに記載のものであることを特徴とする、請求項３０〜３６のいずれかに記載の方法。
  38. 前記プロセスは血管新生の阻害であることを特徴とする、請求項３０〜３６のいずれかに記載の方法。
  39. 疾患の治療及び／又は予防のための化合物をスクリーニングするための請求項３０〜３８のいずれかに記載の方法の使用であって、用意される試験系は該疾患のための試験系である使用。
  40. 前記疾患は、血管新生、新血管形成、経心筋的血管再生或いは創傷治癒の促進或いは阻害を必要とする疾患から成る群から選択されることを特徴とする、請求項３９に記載の使用。
  41. 前記疾患は、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、黄斑変性症、関節炎、子宮内膜症、パンヌス、組織球増殖症、乾癬、酒さ、小静脈瘤、発疹性血管腫、腫瘍疾患、海綿腫、唇血管腫、血管肉腫、痔核、動脈硬化、狭心症、虚血、梗塞、基底細胞腫、扁平上皮癌、黒色腫、カポジ肉腫、腫瘍、妊娠中毒症、不妊症、急性外傷性創傷、熱的創傷、化学的創傷、手術創傷及び慢性創傷から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４０に記載の使用。
  42. 前記疾患は腫瘍疾患であって、好ましくは、前記腫瘍疾患は壊死細胞、好ましくは壊死腫瘍細胞を含むことを特徴とする、請求項３９〜４１のいずれかに記載の使用。
  43. 請求項３０〜３８のいずれかに記載の方法によって得られる化合物。
  44. 医薬、好ましくは先の各請求項のいずれかに記載の疾患を治療及び／又は予防するための医薬を製造するための、請求項４３に記載の化合物の使用。
  45. 組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、心筋梗塞後の血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスのための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用であって、
    前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される使用。
  46. 組織発達及び／又は組織再生、特に、発達或いは再生される組織の脱分化及び／又は分化に基づく組織発達及び／又は組織再生のための細胞の脱分化及び細胞の再プログラム化から成る群から選択されるプロセスのための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用、特にｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用であって、
    前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される使用。
  47. ＤＮＡ損傷の修復を必要とする疾患、組織再生を必要とする疾患、創傷治癒を必要とする疾患、組織老化に伴う疾患、歯や骨の移植を必要とする疾患、組織老化に伴う疾患、創傷治癒障害、皮膚疾患、色素性乾皮症、レザースキン、皮膚癌、火傷後の皮膚癌、火傷後の皮膚老化、火傷、及び心筋梗塞から成る群から選択される疾患の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、
    前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される使用。
  48. 化粧品、好ましくは、組織再生、創傷治癒、レザースキンの防止、皮膚癌、特に日焼け（サンバーン）後の皮膚癌の防止、皮膚老化、特にサンバーン後の皮膚老化防止、組織老化抑制及び／又は組織若返りのための化粧品を製造するための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、前記核酸は塩基性ＤＮＡタンパク質の遺伝子から成る群から選択される使用。
  49. 皮膚疾患、色素性乾皮症、レザースキン、皮膚癌、サンバーン後の皮膚癌、サンバーン、急性創傷及び慢性創傷からなる群から選択される疾患の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための核酸、その転写物及び／又はその翻訳物の使用であって、
    前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される使用。
  50. 前記急性創傷は、急性外傷性創傷、熱的創傷、化学的創傷及び手術創傷から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４９に記載の使用。
  51. 前記慢性創傷は、褥瘡、下腿潰瘍、静脈性下腿潰瘍、動脈性下腿潰瘍、糖尿病性潰瘍、褥瘡潰瘍、慢性外傷後創傷及び糖尿病性足潰瘍から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４９に記載の使用。
  52. 前記塩基性ＤＮＡ結合タンパク質はＨＭＧタンパク質からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４５〜５１のいずれかに記載の使用。
  53. 前記ＨＭＧタンパク質は、ＨＭＧＡ、ＨＭＧＢ及びＨＭＧＮから成る群から選択されることを特徴とする、請求項４５〜５２のいずれかに記載の使用。
  54. 前記ＨＭＧタンパク質はＨＭＧＡファミリーのタンパク質であることを特徴とする、請求項４５〜５３のいずれかに記載の使用。
  55. 前記タンパク質は、ＨＭＧＡ１ａ、ＨＭＧＡ１ｂ及びＨＭＧＡ２から成る群から選択されることを特徴とする、請求項５４に記載の使用。
  56. 前記核酸は、配列番号３１〜６４の核酸及びそれぞれの誘導体から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４５〜５５のいずれかに記載の使用。
  57. 前記翻訳物は、配列番号１〜３０の配列を有するポリペプチド及びそれぞれの誘導体から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４５〜５６のいずれかに記載の使用。
  58. 前記タンパク質は変性を有しており、変性はリン酸化及びアセチル化から成る群から選択されることを特徴とする、請求項５７に記載の使用。
  59. 組織を再生するための方法であって、
    ａ）組織或いはその一部を用意する工程と、
    ｂ）核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を添加する工程と、
    ｃ）前記組織と前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とをインキュベートする工程とを含む方法において、前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択され、任意的に
    ｄ）再生した組織或いはその中間体を取得或いは回収する工程を含む方法。
  60. 前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法であることを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
  61. 再生しようとする組織は工程ａ）で用意される組織と異なるか或いは同一であることを特徴とする、請求項５９又は６０に記載の方法。
  62. 再生しようとする組織及び／又は工程ａ）で用意される組織は、互いに独立的に、皮膚組織、脂肪組織、軟骨組織、筋肉組織、血液細胞、造血細胞、及び神経細胞から成る群から選択されることを特徴とする、請求項５９〜６１のいずれかに記載の方法。
  63. 前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は、先の各請求項のいずれかに記載のものであることを特徴とする、請求項５９〜６２のいずれかに記載の方法。
  64. 細胞を脱分化及び／又は再プログラム化するための方法であって、
    ａ）一種以上の細胞を用意する工程と、
    ｂ）核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を添加する工程と、
    ｃ）前記細胞と前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とをインキュベートする工程とを含む方法において、核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される方法。
  65. 前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法であることを特徴とする、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記方法は更に、
    ｄ）脱分化した細胞及び／又は再プログラム化された細胞を取得する工程
    を含むことを特徴とする、請求項６４又は６５に記載の方法。
  67. 脱分化した細胞及び／又は再プログラム化された細胞及び／又は工程ａ）で用意された細胞は、独立的に、表皮細胞、皮膚細胞、脂肪組織細胞、軟骨組織細胞、筋肉組織細胞、血液細胞、造血組織細胞及び神経細胞から成る群から選択されることを特徴とする、請求項６４〜６６のいずれかに記載の方法。
  68. 前記核酸、その転写物及び／又はその翻訳物は、先の各請求項のいずれかに記載のものであることを特徴とする、請求項６４〜６７のいずれかに記載の方法。
  69. 先の各請求項のいずれかに記載の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と薬学的に適切な担体とを含有する医薬組成物。
  70. 先の各請求項のいずれかに記載の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を含む担体材料。
  71. 前記担体材料は、セルロース、アガロース、コラーゲン、シリコーン、ケイ素、プラスチック、ゲル、ハイドロゲル、フィブリン系マトリックス、人工連続フィラメント糸、ハイドロコロイド、脂肪コロイド、ポリウレタン、ポリウレタン樹脂、プラスター、合成生体材料、熱可塑性プラスチック、亜鉛膠、ポリエステルフォーム、ポリイソブチレン、緩衝剤、安定剤、静菌剤、及び保湿剤から成る群から選択される材料を含むことを特徴とする、請求項７０に記載の担体材料。
  72. 前記担体材料はインプラントとして、或いは創傷治癒のために用いることを特徴とする、請求項７０又は７１に記載の担体材料。
  73. 被覆基材と、先の各請求項のいずれかに記載の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物とを含む創傷被覆材料。
  74. 前記被覆材料は、ハイドロコロイドドレッシング材、アルギン酸カルシウムドレッシング材、活性炭製圧定布及びオーバーレイ、発泡プラスチック製オーバーレイ、フィルムドレッシング材、透明ドレッシング材、発泡シリコーンドレッシング材、フリースオーバーレイ、ハイドロセルラードレッシング材、ハイドロセレクティブ創傷オーバーレイ、吸収創傷パッド、スプレードレッシング材、人工連続フィラメント製ガーゼ、綿ガーゼ、パラフィンガーゼ、銀被覆創傷ドレッシング材、及びハイドロポリマー／発泡体ドレッシング材から成る群から選択されることを特徴とする、請求項７３に記載の創傷被覆材料。
  75. 先の各請求項のいずれかに記載の核酸、その転写物及び／又はその翻訳物と担体相とを含む化粧料組成物であって、前記担体相は、好ましくは、クリーム、脂肪性軟膏、エマルジョン（水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｗ／Ｏ）型、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型）、マイクロエマルジョン、変性エマルジョン、ナノ粒子／ナノエマルジョン、リポソーム、ハイドロディスパージョンゲル（ハイドロゲル、アルコールゲル、リポゲル、テンサイドゲル）、ゲル−クリーム、ローション、オイル／オイルバス、及びスプレーから成る群から選択される化粧料組成物。
  76. 組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、心筋梗塞後の血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
    ｂ）候補化合物を用意する工程と、
    ｃ）前記候補化合物を試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する工程とを含む方法。
  77. 組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
    ｂ）参照化合物を用意する工程と、
    ｃ）前記試験系において前記参照化合物を試験し、該系において参照化合物が起こす反応を決定する工程と、
    ｄ）候補化合物を用意する工程と、
    ｅ）前記試験系において前記候補化合物を試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する工程と、
    ｆ）前記試験系における参照化合物の反応と候補化合物の反応とを比較する工程とを含む方法。
  78. 組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、心筋梗塞後の血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
    ｂ）標識を有する参照化合物を用意する工程と、
    ｃ）前記試験系において前記参照化合物を試験し、該系において参照化合物が起こす反応を決定する工程と、
    ｄ）候補化合物を用意する工程と、
    ｅ）前記参照化合物を含む試験系において前記候補化合物を試験し、試験系の反応を決定し、遊離した参照化合物の量及び／又は参照化合物から放出された標識の量を測定する工程とを含む方法。
  79. 組織再生、ＤＮＡ損傷の修復、創傷治癒、細胞移動、創傷部位での血管新生、上皮化、組織老化、組織老化の防止、組織の若返り、心筋梗塞後の血管形成、及び歯や骨の移植における治癒からなる群から選択されるプロセスを促進及び／又は阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）該プロセスのための試験系を用意する工程と、
    ｂ）標識を有する候補化合物を用意する工程と、
    ｃ）前記試験系において前記候補化合物を試験し、該系において候補化合物が起こす反応を決定する工程と、
    ｄ）参照化合物を用意する工程と、
    ｅ）前記候補化合物を含む試験系において前記参照化合物を試験し、試験系の反応を決定し、遊離した候補化合物の量及び／又は候補化合物から放出された標識の量を測定する工程とを含む方法。
  80. 前記試験系はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系或いはｉｎ ｖｉｖｏ試験系であることを特徴とする、請求項７６〜７９のいずれかに記載の方法。
  81. 前記参照化合物及び／又は候補化合物の反応は前記プロセスの促進であり、好ましくは、試験系における候補化合物の反応が参照化合物の反応と同等か或いはそれよりも顕著である場合、候補化合物が前記プロセスを促進する化合物であることを特徴とする、請求項７６〜８０のいずれかに記載の方法。
  82. 前記参照化合物及び／又は候補化合物の反応は前記プロセスの阻害であり、好ましくは、候補化合物が起こす試験系の反応が参照化合物が起こす試験系の反応よりも顕著でない場合、候補化合物が前記プロセスを阻害する化合物であることを特徴とする、請求項７６〜８０のいずれかに記載の方法。
  83. 前記参照化合物は、核酸、その転写物及び／又はその翻訳物であり、前記核酸は、塩基性ＤＮＡ結合タンパク質、特に先の各請求項のいずれかに記載のものの遺伝子から成る群から選択されることを特徴とする、請求項７６〜８０のいずれかに記載の方法。
  84. 疾患の治療及び／又は予防のための化合物をスクリーニングするための請求項７６〜８３のいずれかに記載の方法の使用であって、用意される試験系は前記疾患のための試験系である使用。
  85. 前記疾患は、ＤＮＡ損傷の修復を必要とする疾患、組織再生を必要とする疾患、創傷治癒を必要とする疾患、歯や骨の移植を必要とする疾患、組織老化に伴う疾患、創傷治癒障害、皮膚疾患、色素性乾皮症、レザースキン、皮膚癌、日焼け（サンバーン）後の皮膚、サンバーン後の皮膚老化、サンバーン、及び心筋梗塞から成る群から選択されることを特徴とする、請求項８４に記載の使用。
  86. 少なくとも核酸、その転写物及び／又はその翻訳物を含み、前記核酸は塩基性ＤＮＡ結合タンパク質の遺伝子から成る群から選択される日焼け防止剤。
  87. 前記塩基性ＤＮＡタンパク質は、ＨＭＧタンパク質、特に先の各請求項のいずれかに記載のものであることを特徴とする、請求項８６に記載の日焼け防止剤。
  88. 請求項７６〜８３のいずれかに記載の方法或いは請求項８４又は８５に記載の使用によって得られる化合物。
  89. 医薬、好ましくは先の各請求項のいずれかに記載の疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための請求項８８に記載の化合物の使用。
  90. 生体を治療するための方法であって、有効量のＤＮＡ結合タンパク質、ＨＭＧタンパク質、それらをコードする核酸、或いはその転写物及び／又はその翻訳物、それらと相互作用する機能性核酸、それらと相互作用するペプチド、或いはそれらと相互作用する抗体、及び／又は請求項８９に記載の化合物を生体に投与することを特徴とする方法。
  91. 前記生体は、疾患、好ましくは先の各請求項のいずれかに記載の疾患に罹患しているか、前記疾患に罹患する可能性があるか或いはその疾患により症状を発する可能性があることを特徴とする、請求項９０に記載の方法。
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