KR20200048742A

KR20200048742A - Hmga1 발현 촉진 물질을 포함하는 피부 장벽기능 강화용 조성물 및 hmga1 촉진 물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20200048742A
Application number: KR1020180131163A
Authority: KR
Inventors: 김규한
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2020-05-08

Abstract

본 명세서에는 HMGA1 발현 또는 활성 촉진 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽기능 강화용 조성물 및 HMGA1 발현 또는 활성 촉진 물질의 스크리닝 방법이 개시된다. 상기 HMGA1 발현 또는 활성 촉진 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 장벽기능을 강화시킬 수 있으며, 피부 보습 또는 항산화 효과를 제공할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 방법에 따르면 HMGA1 유전자의 상대적 발현 촉진 정도를 확인함으로써, 간편하게 피부 장벽기능 강화 물질을 스크리닝할 수 있다.

Description

HMGA1 발현 촉진 물질을 포함하는 피부 장벽기능 강화용 조성물 및 HMGA1 촉진 물질의 스크리닝 방법 {A composition for skin barrier function comprising HMGA1 promoting materials and a method for screening HMGA1 promoting materials}

본 명세서는 피부 장벽기능 강화용 조성물 및 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

피부(skin) 중에서 최외각에 위치한 표피(epidermis)의 가장 중요한 기능은, 외부로부터의 다양한 자극, 예컨대 화학 물질, 대기오염물질, 건조한 환경, 자외선 등의 물리, 화학적 자극인자에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호기능이며, 이러한 보호기능은 각질 형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 때만 유지될 수 있다. 표피 중에서도 가장 바깥에 존재하는 각질층(Stratum corneum, horney layer)은 각질 형성세포로부터 형성되며, 분화가 완결된 각질세포와 그를 둘러싼 지질층으로 구성되어 있다. 각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식(proliferation)하는 기저세포(basal cHMGA1)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적인 세포이며, 일정 기간이 경과하면 오래된 각질세포는 피부에서 탈락되고 새로운 각질세포가 그 기능을 대신하게 되는데, 이러한 반복적인 일련의 변화 과정을 표피세포의 분화 혹은 각화(keratinization)라고 부른다. 그런데 이 각화과정이 비정상적으로 과하게 일어나거나, 기저 세포로부터 새로운 세포가 올라와 각질세포가 되는 현상이 반복적으로 일어나지 않으면 피부는 장벽(skin barrier) 기능을 상실하게 되고 그에 따라 피부의 수분 증발량이 증가하면서 건조해지게 된다.

WO 2004/061456 A2

Dominant negative c-Jun(TMA67) target genes: HMGA1is required for tumor promoter-induced transformation, Oncogene, 2004, No. 23, pp.4466-4476.

일 측면에서, 본 발명의 목적은 피부 각질분화를 조절하는 신규한 피부 장벽기능 강화 물질 판별 마커를 제공하는 것이다.

다른 일 측면에서, 본 발명의 목적은 상기 피부 장벽기능 강화 물질 판별 마커를 이용하여 피부 장벽기능 강화 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.

다른 일 측면에서, 본 발명의 목적은 상기 피부 장벽기능 강화 물질 판별 마커의 발현 또는 활성 촉진 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽기능 강화용 조성물을 제공하고자 한다.

다른 일 측면에서, 본 발명의 목적은 상기 피부 장벽기능 강화 물질 판별 마커를 이용한 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 기초정보 제공방법을 제공하고자 한다.

다른 일 측면에서, 본 발명의 목적은 상기 피부 장벽기능 강화 물질 판별 마커를 이용한 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 조성물 또는 키트를 제공하고자 한다.

본 발명의 일 측면은, 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계 및 상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 HMGA1의 상대적 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면은, HMGA1의 발현 또는 활성 촉진 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽기능 강화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면은 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서 HMGA1의 mRNA 또는 단백질 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 기초 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면은, HMGA1의 mRNA 또는 HMGA1 단백질 검출 시약을 포함하는 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 측면은, HMGA1의 mRNA 또는 HMGA1 단백질 검출 시약을 포함하는 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따른 신규한 피부 장벽기능 강화 물질 판별 마커인 HMGA1는 각질 형성 세포의 분화에 따라 그 발현량이 증가한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 기술을 이용하면 피부에 시험물질을 처리하고 HMGA1 유전자의 상대적 발현 촉진 정도를 확인함으로써, 피부 장벽기능 강화 물질을 간편하고 효율적으로 스크리닝할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝된 피부 장벽기능 강화 물질을 통해 피부 장벽기능 강화, 피부 보습 또는 피부 항산화 기능 개선 및 강화에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따르면, 피부에 포함된 HMGA1 유전자의 검출을 통하여 피부 장벽기능 관련 피부 상태를 빠르고 간단하게 진단할 수 있으며, 이를 통해 피부 장벽기능의 문제를 조기에 예측 또는 판단하여 대응할 수 있다.

도 1은 HMGA1 유전자의 발현 억제에 따른 각질형성세포에서의 피부 장벽기능 마커인 필라그린(FLG), 인볼루크린(IVL) 및 로리크린(LOR) 감소를 확인한 도이다. 도 1의 y축은 정규화된 mRNA 발현량을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 명세서에서 "피부"는 생물의 외부를 덮고 있는 기관을 의미하는 것으로서 표피, 진피 및 피하지방층으로 구성되어 있으며 얼굴 또는 몸 전체의 외부를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.

본 명세서에서 "유전자의 발현"이라 함은 전사, 번역 및 번역 후 변형 등을 포함하는 최광의의 개념이다.

본 발명의 일 실시예는 상기 HMGA1를 이용하여 피부 장벽기능 강화 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 방법은 (a) 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및(b) 상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 고 이동성 그룹 AT-후크 1(high mobility group AT-hook 1, HMGA1)의 상대적 발현량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 피부 세포는 인간, 마우스, 기니아 피그, 돼지, 조류 등에서 유래된 피부 세포일 수 있다. 상기 피부 세포는 각질형성세포(keratinocyte)를 포함할 수 있다. 다른 일 측면에서, 상기 피부 세포는 사람의 정상 피부 각질 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예로, 상기 "상대적 발현량"은 시험물질을 처리하기 전의 각질형성세포에서의 HMGA1의 발현량에 대한 시험물질을 처리한 후 각질형성세포에서의 HMGA1의 발현량을 비교하였을 때 발현이 촉진된 정도일 수 있다. 또는, "상대적 발현량"은 시험 물질을 처리한 각질형성세포에서의 HMGA1의 발현량을 시험 물질을 처리하지 않은 각질형성세포에서의 HMGA1의 발현량과 비교하였을 때의 발현이 촉진된 정도일 수 있다. 상기 상대적 발현량은 예컨대, mRNA의 상대적 발현량 또는 단백질의 상대적 발현량을 포함할 수 있다.

상기 관점에서, 일 실시예에 따른 상기 (b) 단계는 각질형성세포에 시험물질의 처리하기 전과 후의 HMGA1 발현량을 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 또는, 일 실시예로서 상기 (b) 단계는 시험물질을 처리한 각질형성세포와 시험물질을 처리하지 않은 각질형성세포의 HMGA1 발현량을 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 일 실시예는 상기 (b) 단계의 상대적 발현량을 측정한 결과 HMGA1의 발현량이 증가한 경우, 상기 시험물질을 피부 장벽기능 강화물질로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 HMGA1(high mobility group AT-hook 1)의 mRNA 서열은 NCBI Reference Sequence : NM_001319077.1이며, 보다 구체적으로 하기의 서열번호 1의 염기 서열로 표시될 수 있다.

CATTTGCATGGCCCCGCCCCCTGAGTGACACGGCTGGCGCGGGCGGGCCCGTCCCCCCTGCCCCTGGGTC

GCTCTTTTTAAGCTCCCCTGAGCCGGTGCTGCGCTCCTCTAATTGGGACTCCGAGCCGGGGCTATTTCTG

GCGCTGGCGCGGCTCCAAGAAGATCCGCATTTGCTACCAGCGGCGGCCGCGGCGGAGCCAGGCCGGTCCT

CAGCGCCCAGCACCGCCGCTCCCGGCAACCCGGAGCGCGCACCGCAGGCCGGCGGCCGAGCTCGCGCATC

CCAGCCATCACTCTTCCACCTGCTCCTTAGAGAAGGGAAGATGAGTGAGTCGAGCTCGAAGTCCAGCCAG

CCCTTGGCCTCCAAGCAGGAAAAGGACGGCACTGAGAAGCGGGGCCGGGGCAGGCCGCGCAAGCAGCCTC

CGAAGGAGCCCAGCGAAGTGCCAACACCTAAGAGACCTCGGGGCCGACCAAAGGGAAGCAAAAACAAGGG

TGCTGCCAAGACCCGGAAAACCACCACAACTCCAGGAAGGAAACCAAGGGGCAGACCCAAAAAACTGGAG

AAGGAGGAAGAGGAGGGCATCTCGCAGGAGTCCTCGGAGGAGGAGCAGTGACCCATGCGTGCCGCCTGCT

CCTCACTGGAGGAGCAGCTTCCTTCTGGGACTGGACAGCTTTGCTCCGCTCCCACCGCCCCCACCCCTTC

CCCAGGCCCACCATCACCACCGCCTCTGGCCGCCACCCCCATCTTCCACCTGTGCCCTCACCACCACACT

ACACAGCACACCAGCCGCTGCAGGGCTCCCATGGGCTGAGTGGGGAGCAGTTTTCCCCTGGCCTCAGTTC

CCAGCTCCCCCCGCCCACCCACGCATACACACATGCCCTCCTGGACAAGGCTAACATCCCACTTAGCCGC

ACCCTGCACCTGCTGCGTCCCCACTCCCTTGGTGGTGGGGACATTGCTCTCTGGGCTTTTGGTTTGGGGG

CGCCCTCTCTGCTCCTTCACTGTTCCCTCTGGCTTCCCATAGTGGGGCCTGGGAGGGTTCCCCTGGCCTT

AAAAGGGGCCCAAGCCCCATCTCATCCTGGCACGCCCTACTCCACTGCCCTGGCAGCAGCAGGTGTGGCC

AATGGAGGGGGGTGCTGGCCCCCAGGATTCCCCCAGCCAAACTGTCTTTGTCACCACGTGGGGCTCACTT

TTCATCCTTCCCCAACTTCCCTAGTCCCCGTACTAGGTTGGACAGCCCCCTTCGGTTACAGGAAGGCAGG

AGGGGTGAGTCCCCTACTCCCTCTTCACTGTGGCCACAGCCCCCTTGCCCTCCGCCTGGGATCTGAGTAC

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법은 상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 필라그린(Filaggrin), 인볼루크린(Involucrin) 및 로리크린(Loricrin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 상대적 발현량을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 일 실시예로서 상기 필라그린(Filaggrin), 인볼루크린(Involucrin) 및 로리크린(Loricrin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 상대적 발현량이 증가한 경우, 상기 시험 물질을 피부 장벽기능 강화 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

피부 장벽의 최외각을 이루는 각질층은 천연보습인자와 지질 등으로 이루어져 있다. 상기 필라그린(Filaggrin)은 표피 세포에 존재하는 케라틴 섬유에의 부착과 관련된 단백질로서, 표피의 최종 분화를 촉진한다. 전사 후 변형(post-transcriptional modification) 과정을 거쳐 여러 종류의 친수성 아미노산(hydrophilic amino acid)으로 분해되며, 아미노산 풀(pool)이 천연 보습인자(NMF)를 구성하고, 이는 각질층의 수분 유지를 돕는다고 알려져 있다. 또한 필라그린 유전자 돌연변이가 피부 보습 인자들을 감소시키고, 피부 장벽 기능을 손상시키며, 알러젠(allergen)이나 미생물(microbe)에 대한 피부 방어 능력이 감소시키고, T 세포군을 활성화하여 자가면역 메커니즘에 의한 만성 염증(chronic inflammation)을 일으켜 아토피 습진(Atopic eczema)를 유도하는 중요 유전 위험 요소라고도 알려져 있다. 상기 인볼루크린(Involucrin)은 각질형성세포의 가교(crosslink)를 이루는 요소 중의 하나로서 세포질에서 발견이 되며, 트랜스글루타미나제 (transglutaminase)에 의해 막 단백질과 연결되어 있다. 상기 로리크린(Loricrin)은 각화외피(cornified envelope)에서 발견되는 주요 단백질의 하나로, 주로 최종적으로 분화된 표피세포에서 발현된다.

상기 HMGA1와 피부 장벽기능과의 관계는 아직까지 알려진바 없었으나, 본 발명의 발명자들은 연구를 통하여 피부 각질형성세포(keratinocyte)가 분화함에 따라 상기 HMGA1 유전자의 발현이 증가함을 밝혀냈다. 또한, 일 실시예로서 분화된 각질형성세포에서 HMGA1를 제거(knock-down)시킬 경우, 피부 장벽기능 마커들, 예를 들어 필라그린(Filaggrin), 인볼루크린(Involucrin), 로리크린(Loricrin) 등의 발현량이 감소된다. 이는 상기 HMGA1이 피부 장벽기능 강화물질 판별 마커로서 기능할 수 있음을 의미한다.

본 발명의 일 실시예로서 상기 피부 장벽기능 강화물질로 판정하는 단계는 " 상대적 발현량"이 약 1.1 내지 2배 이상 증가한 경우, 피부 장벽기능 강화물질로 판정하는 것을 포함할 수 있다. 즉, 시험물질을 처리하기 전의 각질형성세포에서의 HMGA1의 발현 정도에 대한 시험물질을 처리한 후 각질형성세포에서의 HMGA1의 발현 정도를 비교하였을 때 발현이 약 1.1 내지 2배 이상 증가한 경우, 피부 장벽기능 강화물질로 판정할 수 있다. 또는, 시험 물질을 처리한 각질형성세포에서의 HMGA1의 발현 정도를 시험 물질을 처리하지 않은 각질형성세포에서의 HMGA1의 발현 정도와 비교하였을 때의 발현이 약 1.1 내지 2배 이상 증가한 경우, 피부 장벽기능 강화물질로 판정할 수 있다. 예를 들어, 상기 HMGA1의 상대적 발현량의 증가정도는 1.1 배 이상, 1.2배 이상, 1.3 배 이상, 1.4배 이상, 1.5 배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 발현 정도는 통계적 유의성을 확보한 상태에서 측정된 결과이다. 통계적 유의성이라는 개념은 생물학적 통계분석법을 통하여 유의적인 차이를 보이는 경우로, 정량적인 경우 p value가 0.05 미만으로 차이가 나는 경우를 포함한다.

일 실시예에 따른 상기 (a) 단계에서, 상기 시험물질은 세포의 리포좀(liposome) 또는 백터(vector)에 트렌스펙션시킬 수 있으며, 세포는 각질형성세포, 즉 케라티노사이트(keratinocyte)일 수 있다. 상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 또는 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 일 실시예로서, 상기 HMGA1의 발현 정도는, 공지의 기술, 예컨대, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 엘라이자(ELISA), 웨스턴블럿 또는 이뮨 블럿(immune blot)을 이용하여 확인할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 실시예로서 피부 장벽 기능의 저하는 피부 세포 분화가 잘 이루어지지 않는 것일 수 있으며, 이는 피부 각질층이 정상적인 기능을 할 수 없고, 항산화능이 저하된 것을 의미할 수 있다. 이 경우 피부의 수분 보유력이 떨어질 수 있으며, 피부 염증 및 피부 건조가 나타날 수 있다. 따라서 상기 피부 세포 분화를 촉진하는 물질은 피부 보습, 피부 장벽 기능 강화 및 아토피 증상을 경감 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 피부 장벽기능 강화 물질은 피부 보습 물질, 피부 항산화 물질 등을 의미하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예는, HMGA1의 발현 또는 활성 촉진 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽기능 강화용 조성물을 제공할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 HMGA1의 발현 또는 활성 촉진 물질은 HMGA1 mRNA의 번역을 촉진하는 물질을 포함할 수 있다. 다른 일 실시예에 있어서, 상기 HMGA1의 발현 또는 활성 촉진 물질은 상술된 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 피부 장벽기능 강화 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 조성물은 상기 HMGA1 의 발현 또는 활성 촉진 물질을 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 내지 30 중량%로 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 상기 일 실시예들에 따른 HMGA1의 발현 또는 활성을 촉진함으로써 각질 형성 세포의 분화를 조절하여 피부의 정상적인 피부 장벽 기능을 회복하도록 할 수 있다. 이에, 일 실시예로서 상기 조성물은 피부 보습 및 항산화 중 하나 이상의 용도를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있으며, 보다 구체적으로 화장품 조성물 또는 약학 조성물을 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 화장품 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

일 실시예로서, 상기 화장품 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 화장품 조성물은 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 또한 상기 화장품 조성물은 일 실시예로서, 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.

일 실시예로서 상기 약학적 조성물은 피부 장벽 기능 약화에 의한 질병의 예방 또는 치료용일 수 있으며, 예를 들면 건조 피부, 아토피 등의 예방 또는 치료용일 수 있다.

또한, 일 실시예로서 상기 약학 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다. 일 실시예로서 상기 약학 조성물은 주사제, 피부 외용 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 사용 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예는 상기 HMGA1를 피부 장벽기능 관련 피부 상태 정도를 진단할 수 있는 바이오 마커로서 제공할 수 있으므로, 본 발명의 다른 일 실시예는 이를 이용하여 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 조성물 또는 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 키트를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 일 실시예는 이를 이용한 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 기초 정보 제공 방법 또는 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단방법을 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예는 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서 HMGA1의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 HMGA1 발현량은 HMGA1의 mRNA 또는 HMGA1 단백질 발현량인 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 기초 정보 제공 방법 또는 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단방법을 제공할 수 있다.

일 실시예로서 상기 방법들은 상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서의 HMGA1 발현량을 정상대조군 피부세포에서의 HMGA1 발현량과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때, 일 실시예로서 상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포 및 정상대조군 피부세포는 각질형성세포(keratinocyte)일 수 있다.

또한, 일 실시예로서 상기 방법들은 상기 시험대상으로부터 분리된 피부 세포에서의 HMGA1 발현량이 정상대조군 피부세포에서의 HMGA1 발현량보다 낮을 경우 피부 장벽 기능관련 피부 상태에 이상이 있는 것으로 정보를 제공하거나, 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서의 HMGA1 발현량이 정상대조군 피부세포에서의 HMGA1 발현량보다 약 1.1 내지 2배 이상 낮은 경우, 피부 장벽기능 관련 피부 상태에 이상이 있는 것으로 판단할 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어, 상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서의 HMGA1의 발현량이 정상대조군 피부세포에 비하여, 1.1 배 이상, 1.2배 이상, 1.3 배 이상, 1.4배 이상, 1.5 배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 낮은 경우, 피부 장벽기능 관련 피부 상태에 이상이 있는 것으로 판단할 수 있다. 상기 발현량은 통계적 유의성을 확보한 상태에서 측정된 결과이다. 통계적 유의성이라는 개념은 생물학적 통계분석법을 통하여 유의적인 차이를 보이는 경우로, 정량적인 경우 p value가 0.05 미만으로 차이가 나는 경우를 포함한다.

본 발명의 일 실시예는 상기 HMGA1의 mRNA 또는 HMGA1 단백질 검출 시약을 포함하는 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

또다른 본 발명의 일 실시예는 상기 HMGA1의 mRNA 또는 HMGA1 단백질 검출 시약을 포함하는 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 키트를 제공할 수 있으며, 상기 키트는 상술된 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 기초 정보 제공 방법 또는 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단방법이 기재되어 있는 지시서를 더 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 조성물 또는 피부 장벽기능 관련 피부 상태 진단용 키트에 포함되는 HMGA1 mRNA 검출 시약은 HMGA1에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 HMGA1 단백질 검출 시약은 HMGA1에 특이적으로 결합하는 항체 및 프로브 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "프로브(probe)"란 유전자의 표적 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 또는 폴리뉴클레오티드와 이에 결합된 표지 물질을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "프라이머(primer)"란 유전자의 표적 부위에 해당하는 특정 영역을 PCR을 이용하여 증폭하기 위하여 사용하는 유전자 특정 영역의 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 변이체를 의미한다. 상기 프라이머는 특정 영역 말단과 완전히 상보적일 것을 요구하지 않으며, 상기 말단에 혼성화되어 이중사슬 구조를 형성할 정도로 상보적이라면 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "혼성화(hybridization)"란 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.

혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 뿐 아니라 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.

본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"란 복수개의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하는 것으로, 통상적인 의미의 수십개의 뉴클레오티드의 중합체인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 광의의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여, 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[ 실험예 ] HMGA1 발현 억제에 의한 피부 장벽마커의 발현 감소 확인

각질형성세포에서 HMGA1의 발현 억제시 피부 장벽마커가 감소함을 확인하기 위하여, 하기의 실험을 실시하였다.

먼저, 인간 1차 각질형성세포(Human primary keratinocyte)를 론자사(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)에서 구입하여 60파이 디쉬에 분주한 뒤, 각질형성배지(Keratinocyte Growth Medium, KGM-Gold^TM, http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-cHMGA1s/human-cHMGA1s-and-media/keratinocytes-and-media/kgm-gold-keratinocyte-growth-medium.aspx)에서 배양하였다. 그 후, 상기 각질형성세포에서 HMGA1 의 발현을 억제(knock down)시키기 위해서 HMGA1 mRNA 서열에 특이적인 siRNA를 이용하였는데, 이 때 참고한 데이터베이스는 다음과 같다.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3159

https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=HMGA1&keywords=HMGA1

상기 두 종류의 HMGA1 siRNA(Life technology 사의 RNAiMAX) 서열은 하기와 같으며, 하기 서열을 각각 상기 각질형성세포에 도입하였다.

(실시예 1) si-HMGA1 #1

Sense : 5'- CCUCAAAUGCAGUAUUUUU - 3'(서열번호 2)

Antisense : 5'- AAAAAUACUGCAUUUGAGG - 3'(서열번호 3)

(실시예 2) si-HMGA1 #2

Sense : 5'- CAGGCAAUGGCCUAAACUU - 3'(서열번호 4)

Antisense : 5'- AAGUUUAGGCCAUUGCCUG - 3'(서열번호 5)

그 다음, 상기 siRNA가 도입된 각질형성세포를 분화시켰는데, 구체적으로, 컨플루언시(Confluency)가 100%가 되기 까지는 세포증식(proliferating)이 일어나는 단계이므로, 100%가 될 때를 '0 day'로 하여, '0 day'가 되었을 때 1.2 mM CaCl₂가 포함된 KGM-Gold? 각질형성배지로 옮겨 배양하기 시작하고 이때부터 분화를 유도하였다.

분화를 시작한 후 6 day째 되는 날, 상기 각질형성세포에서 RNA를 추출하였다. 트리졸(Trizol, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 1ml을 이용하여 상기 세포를 녹인 뒤, 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리하였으며, 이소프로판올(isopropanol) 0.35ml를 넣어 핵산의 펠렛을 형성시키고, 70% EtOH로 세척한 후 펠렛을 물에 녹여 RNA를 분리하였다. 약 1μg의 RNA를 올리고 디티(oligo dT) 및 역전사 효소(reverse transcripase)를 이용하여 cDNA로 만든 뒤, HMGA1 mRNA에 특이적인 프라이머(Life technology사의 taqman probe ID: Hs00852949_g1), 필라그린(FLG) mRNA(Genebank Accession No.: NM_002016)에 특이적인 프라이머 (Life technology사의 taqman probe ID: Hs00856927_g1), 피부 장벽기능 마커 유전자인 인볼루크린(IVL) mRNA(Genebank Accession No.: NM_005547)에 특이적인 프라이머 (Life technology사의 taqman probe ID: Hs00846307_s1), 로리크린(LOR) mRNA(Genebank Accession No.: NM_000427)에 특이적인 프라이머(Life technology사의 taqman probe ID: Hs01894962_s1)를 이용하여 Applied biosystems사의 taqman 방식의 RT-qPCR을 실시하여 정량분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

상기 PCR은 하기의 온도사이클에 따라 총 45사이클로 진행하였다.

- 전변성(Pre-denaturation): 95℃, 10min,

- 변성(Denaturation): 95℃, 10sec,

- 어닐링(Annealing) 및 신장(Extension): 60℃, 1min

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 각질형성세포에서 HMGA1을 제거한 경우(si-HMGA1 #1, si-HMGA1 #2) 피부 장벽기능 마커 유전자인 필라그린, 인볼루크린 및 로리크린의 유전자 발현량도 감소하였음을 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[ 제형예 1] 영양화장수

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량%)
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
HMGA1 발현 또는 활성 촉진 물질	0.01
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[ 제형예 2] 영양로션

하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양로션을 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량%)
정제수	잔량
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	5.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
HMGA1 발현 또는 활성 촉진 물질	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.5
방부제	적량
향	적량
색소	적량
트리에탄올아민	0.1
계	100

[ 제형예 3] 영양크림

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량%)
글리세린	3.5
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
HMGA1 발현 또는 활성 촉진 물질	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[ 제형예 4] 주사제

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조할 수 있다.

원료명	중량비(1ml 당)
염화나트륨	9.0mg
소듐 카르복시메틸셀룰로오즈	30.0mg
Tween 20	1.0mg
HMGA1 발현 또는 활성 촉진 물질	1.0mg
주사용 증류수	잔량

[ 제형예 5] 연고

하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량%)
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
HMGA1 발현 또는 활성 촉진 물질	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
밀납	4.0
정제수	잔량
계	100

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> A composition for skin barrier function comprising HMGA1 promoting materials and a method for screening HMGA1 promoting materials <130> 18p479/ind <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1330 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGA1 mRNA sequence <400> 1 catttgcatg gccccgcccc ctgagtgaca cggctggcgc gggcgggccc gtcccccctg 60 cccctgggtc gctcttttta agctcccctg agccggtgct gcgctcctct aattgggact 120 ccgagccggg gctatttctg gcgctggcgc ggctccaaga agatccgcat ttgctaccag 180 cggcggccgc ggcggagcca ggccggtcct cagcgcccag caccgccgct cccggcaacc 240 cggagcgcgc accgcaggcc ggcggccgag ctcgcgcatc ccagccatca ctcttccacc 300 tgctccttag agaagggaag atgagtgagt cgagctcgaa gtccagccag cccttggcct 360 ccaagcagga aaaggacggc actgagaagc ggggccgggg caggccgcgc aagcagcctc 420 cgaaggagcc cagcgaagtg ccaacaccta agagacctcg gggccgacca aagggaagca 480 aaaacaaggg tgctgccaag acccggaaaa ccaccacaac tccaggaagg aaaccaaggg 540 gcagacccaa aaaactggag aaggaggaag aggagggcat ctcgcaggag tcctcggagg 600 aggagcagtg acccatgcgt gccgcctgct cctcactgga ggagcagctt ccttctggga 660 ctggacagct ttgctccgct cccaccgccc ccaccccttc cccaggccca ccatcaccac 720 cgcctctggc cgccaccccc atcttccacc tgtgccctca ccaccacact acacagcaca 780 ccagccgctg cagggctccc atgggctgag tggggagcag ttttcccctg gcctcagttc 840 ccagctcccc ccgcccaccc acgcatacac acatgccctc ctggacaagg ctaacatccc 900 acttagccgc accctgcacc tgctgcgtcc ccactccctt ggtggtgggg acattgctct 960 ctgggctttt ggtttggggg cgccctctct gctccttcac tgttccctct ggcttcccat 1020 agtggggcct gggagggttc ccctggcctt aaaaggggcc caagccccat ctcatcctgg 1080 cacgccctac tccactgccc tggcagcagc aggtgtggcc aatggagggg ggtgctggcc 1140 cccaggattc ccccagccaa actgtctttg tcaccacgtg gggctcactt ttcatccttc 1200 cccaacttcc ctagtccccg tactaggttg gacagccccc ttcggttaca ggaaggcagg 1260 aggggtgagt cccctactcc ctcttcactg tggccacagc ccccttgccc tccgcctggg 1320 atctgagtac 1330 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-HMGA1 #1 Sense <400> 2 ccucaaaugc aguauuuuu 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-HMGA1 #1 Antisense <400> 3 aaaaauacug cauuugagg 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-HMGA1 #2 Sense <400> 4 caggcaaugg ccuaaacuu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-HMGA1 #2 Antisense <400> 5 aaguuuaggc cauugccug 19

Claims

피부 장벽기능 강화 물질을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 피부세포에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 고 이동성 그룹 AT-후크 1 (high mobility group AT-hook 1, HMGA1)의 상대적 발현량을 측정하는 단계;
를 포함하는 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 피부세포는 각질형성세포(keratinocyte)를 포함하는, 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계는 상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 HMGA1 mRNA의 상대적 발현량을 측정하는 것을 포함하는, 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 피부세포에 시험물질의 처리하기 전과 후의 HMGA1 발현량을 비교하는 단계를 포함하는, 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 시험물질을 처리한 피부세포와 시험물질을 처리하지 않은 각질형성세포의 HMGA1 발현량을 비교하는 단계를 포함하는, 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계의 상대적 발현량을 측정한 결과 HMGA1의 발현량이 증가한 경우, 상기 시험물질을 피부 장벽기능 강화물질로 판정하는 단계를 더 포함하는 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 시험물질을 처리한 피부세포에서 필라그린(Filaggrin), 인볼루크린(Involucrin) 및 로리크린(Loricrin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 상대적 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법.
제7항에 있어서,
상기 필라그린(Filaggrin), 인볼루크린(Involucrin) 및 로리크린(Loricrin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 상대적 발현량이 증가한 경우, 상기 시험 물질을 피부 장벽기능 강화 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 장벽기능 강화 물질은 피부 보습 물질 및 피부 항산화 물질 중 하나 이상을 포함하는, 피부 장벽기능 강화 물질 스크리닝 방법.
HMGA1의 발현 또는 활성 촉진 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽기능 강화용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 HMGA1의 발현 또는 활성 촉진 물질은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 스크리닝된 피부 장벽기능 강화 물질을 포함하는, 피부 장벽기능 강화용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 조성물은 HMGA1 발현 또는 활성 촉진 물질을 조성물 총 중량을 기준으로, 0.00001 내지 30 중량%로 포함하는, 피부 장벽기능 강화용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 피부 장벽기능 강화용은 피부 보습 및 항산화 중 하나 이상의 용도를 포함하는, 피부 장벽기능 강화용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 조성물은 피부 화장료 조성물인, 피부 장벽기능 강화용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 조성물은 약학적 조성물인, 피부 장벽기능 강화용 조성물.
제15항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 피부 장벽 기능 약화에 의한 질병의 예방 또는 치료용인, 피부 장벽기능 강화용 조성물.
시험대상으로부터 분리된 피부세포에서 HMGA1의 발현량을 측정하는 단계를 포함하고,
상기 HMGA1 발현량은 HMGA1의 mRNA 또는 HMGA1 단백질 발현량인,
피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 기초 정보 제공 방법.
제17항에 있어서,
상기 시험대상으로부터 분리된 피부세포에서의 HMGA1 발현량을 정상대조군 피부세포에서의 HMGA1 발현량과 비교하는 단계를 더 포함하는, 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 기초 정보 제공 방법.
제17항에 있어서, 상기 시험대상으로부터 분리된 피부 세포에서의 HMGA1 발현량이 정상대조군 피부세포에서의 HMGA1 발현량보다 낮을 경우 피부 장벽 기능관련 피부 상태에 이상이 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함하는, 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 기초 정보 제공 방법.
HMGA1의 mRNA 또는 HMGA1 단백질 검출 시약을 포함하는 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 키트.
제20항에 있어서,
상기 HMGA1의 mRNA 검출 시약은 HMGA1 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 키트.
제20항에 있어서,
상기 HMGA1의 단백질 검출 시약은 HMGA1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 키트.
제20항에 있어서,
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법이 기재되어 있는 지시서를 더 포함하는 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 키트.
HMGA1의 mRNA 또는 HMGA1 단백질 검출 시약을 포함하는 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 조성물.
제24항에 있어서,
상기 HMGA1의 mRNA 검출 시약은 HMGA1 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 조성물.
제24항에 있어서,
상기 HMGA1의 단백질 검출 시약은 HMGA1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 프로브 중 하나 이상을 포함하는 피부 장벽 기능관련 피부 상태 진단용 조성물.