KR20200041599A - Sh3bp4 억제를 통한 흑색종 예방 또는 치료제, 및 그 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제는 SH3BP4 유전자의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드이며, 구체적으로 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 또한, 본 명세서는 시험물질에 대한 흑색종 예방 및 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
Description
본 명세서는 에스에이치3 도메인-바인딩 프로테인 4(SH3 domain-binding protein 4, SH3BP4)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물; 및 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
흑색종은 주로 피부 표피의 기저층에 있는 멜라닌 세포가 악성화된 피부암으로 멜라닌 세포가 존재하는 곳 어디든 발생할 수 있는 암이다. 흑색종은 피부암으로 인한 사망의 65%를 차지하고 있는 치명적인 질환으로 전이가 쉽게 발생하며 전이가 이루어지면 5년 생존율이 5% 이하로 떨어지는 예후가 좋지 않은 악성 종양으로 알려져 있다. 지난 30년간 전세계적으로 흑색종의 발생률이 점점 증가하고 있으며 특히, 호주 미국과 같은 백인에게서 발생률이 더 높게 나타난다. 우리나라 역시 중앙 암본부에 의해 발표된 자료에 따르면 흑색종은 전체 암 발병 중 0.2%를 차지하지만 점점 발병률이 증가하고 있는 추세라고 발표되었다. 대부분의 흑색종은 간, 뼈, 뇌로 전이가 되고 피부, 피하조직, 림프절 등이 전이의 원발 부위로 알려져 있다.
RNAi(RNA interference: RNA 간섭)은 타겟 mRNA가 degradation되어 특정 유전자가 down regulation 되는 현상 또는 그 프로세스로 알려져 있다. 이러한, RNAi 현상을 유도하는 RNA로는 siRNA, shRNA 또는 miRNA 등이 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 상기와 같은 흑색종과 관련된 유전자의 연구가 진행되고 있으나, SH3BP4 유전자에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 더해, 상기 SH3BP4 mRNA의 단백질로의 발현을 억제하기 위한 RNAi에 대한 연구 역시 부족한 실정이다.
Young-Mi Kim 외 6인, SH3BP4 is a negative regulator of amino acid-Rag GTPase-mTORC1 signaling, Mol Cell. 2012 June 29; 46(6): 833-846.
본 발명의 일 측면은 흑색종과 SH3BP4 유전자와의 관계를 규명하고자 한다.
본 발명의 일 측면은 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 측면은 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 측면은 흑색종 진단용 조성물 또는 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면은, SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제는 SH3BP4 mRNA의 번역을 억제하는 것인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제는 SH3BP4 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 1과 85% 이상의 상동성을 가지면서 SH3BP4 mRNA에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 1의 서열 및 상기 서열번호 1에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열은 혼성화될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열 또는 서열번호 3과 85% 이상의 상동성을 가지면서 SH3BP4 mRNA에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 3의 서열 및 상기 서열번호 3에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열은 혼성화될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 리포좀에 포집 또는 백터(vector)에 삽입된 형태로 포함되는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 200uM 인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 주사제인 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, (a) 흑색종 세포주를 준비하는 단계; (b) 상기 흑색종 세포주에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c)상기 시험물질이 흑색종 세포주에서 SH3BP4의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 SH3BP4 발현 억제 여부는 SH3BP4 mRNA의 번역 억제 여부인, 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 확인 결과, 상기 시험물질이 SH3BP4의 발현을 억제시키는 경우 흑색종 예방 또는 치료제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 SH3BP4의 발현 억제는 시험물질 미처리 음성 대조군보다 SH3BP4 발현 억제 정도가 1.2배 이상 높은, 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 SH3BP4의 mRNA 또는 SH3BP4 단백질 검출시약을 포함하는 흑색종 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 SH3BP4의 mRNA 또는 SH3BP4 단백질 검출시약을 포함하는 흑색종 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 SH3BP4 유전자와 흑색종이 긴밀한 관련이 있음을 확인하고, 본 발명의 일 측면에 따른 흑색종 예방 또는 치료용 조성물은 예를 들어, SH3BP4 mRNA의 번역을 억제하는 등 SH3BP4의 발현 또는 활성을 억제함으로써 흑색종을 예방 또는 치료하는 우수한 효과가 있다. 또한, 본 발명의 다른 측면에 따른 방법은 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법으로 시험물질이 흑색종 예방 또는 치료물질인지를 빠르고 간단하게 판정할 수 있으며, 본 발명의 또 다른 측면에 따른 흑색종 진단용 조성물 또는 키트는 흑색종 여부를 빠르고 간단하게 판정할 수 있다.
도 1은 실험예에 따른 대조군(비교예의 올리고핵산 처리), 실시예 1(서열번호 1의 siRNA 처리) 및 실시예 2(서열번호 3의 siRNA 처리)의 colony 형성을 확인한 사진이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
에스에이치3 도메인-바인딩 프로테인 4(SH3 domain-binding protein 4, SH3BP4)의 mRNA 서열은 NCBI Reference Sequence: NM_014521.2이다.
본 발명의 일 측면은, SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제는 SH3BP4 mRNA의 번역을 억제하는 것인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제는 SH3BP4 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 유도하는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, SH3BP4 유전자의 mRNA 발현을 억제하기 위해 상기 SH3BP4 mRNA의 간섭을 유도하는 RNAi현상을 이용하여 흑색종을 예방 또는 치료할 수 있다.
miRNA는 세포 내에 존재하는 작은 RNA(endogenous small RNA)의 일종으로 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래되어 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)로부터 생성이 된다. miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR의 상보적 서열(sequence)에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하여, 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서(repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져 있다. RNAi 현상을 유도하는 다른 RNA로 19 내지 27 mer 내외의 짧은 RNA인 short interfering RNA(siRNA)가 있으며, 짧은 헤어핀(short hairpin) 구조를 가지는 shRNA가 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 구체적으로 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 1과 85% 이상의 상동성을 가지면서 SH3BP4 mRNA에 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 서열과 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상 또는 98% 이상의 상동성을 가지면서 SH3BP4 mRNA에 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
(서열번호 1) 5'- GCGGUAUGAUUGAUAAUCU -3'
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열 및 상기 서열번호 1에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 구체적으로 siRNA, shRNA 및 miRNA중 어느 하나 일 수 있으며, 서열번호 1의 서열 및 서열번호 2의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1의 서열 및 서열번호 2의 서열은 혼성화될 수 있다.
(서열번호 1) Sense: 5'- GCGGUAUGAUUGAUAAUCU -3'
(서열번호 2) Antisense: 5'- AGAUUAUCAAUCAUACCGC -3'
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 구체적으로 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열 또는 서열번호 3의 서열과 85% 이상의 상동성을 가지면서 SH3BP4 mRNA에 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 서열번호 3의 서열과 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상 또는 98% 이상의 상동성을 가지면서 SH3BP4 mRNA에 결합할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
(서열번호 3) 5'- GCGUAUGACUUCUUACUCA -3'
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 구체적으로 siRNA, shRNA 및 miRNA중 어느 하나 일 수 있으며, 서열번호 3의 서열 및 서열번호 4의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 3의 서열 및 서열번호 4의 서열은 혼성화될 수 있다.
(서열번호 3) Sense: 5'- GCGUAUGACUUCUUACUCA -3'
(서열번호 4) Antisense: 5'- UGAGUAAGAAGUCAUACGC -3'
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 리포좀(liposome)에 포집 또는 벡터에 삽입된 형태로 포함되는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 200uM 인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 uM 이상, 2 uM 이상, 3 uM 이상, 5 uM 이상, 7 uM 이상, 9 uM 이상, 11 uM 이상, 15 uM 이상, 16 uM 이상, 17 uM 이상, 18 uM 이상, 19 uM 이상, 20 uM 이상, 21 uM 이상, 22 uM 이상, 23 uM 이상, 24 uM 이상, 25 uM 이상 또는 50 uM 이상일 수 있으며, 200 uM 이하, 190 uM 이하, 180 uM 이하, 170 uM 이하, 150 uM 이하, 130 uM 이하, 100 uM 이하, 80 uM 이하, 50 uM 이하, 40 uM 이하, 30 uM 이하, 29 uM 이하, 28 uM 이하, 27 uM 이하, 26 uM 이하, 25 uM 이하, 24 uM 이하, 23 uM 이하, 22 uM 이하, 21 uM 이하 또는 20 uM 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 범위 내일 때, SH3BP4의 발현 억제 효과가 우수하며, 흑색종의 예방 또는 치료에 적합하다.
그러므로, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 흑색종을 예방 또는 치료하는 효과를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면으로, 상기 조성물은 본 발명의 일 측면에 따른 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제를 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 내지 30.0 중량%의 양으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따른 조성물은 피부외용제 조성물일 수 있으며, 화장품 조성물 또는 약학 조성물을 포함한다.
상기 화장품 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 화장품 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 구체적으로는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 화장품 조성물은 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장품 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
또한, 본 발명은 일 실시예로서 본 발명의 일 측면 따른 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 주사제인 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 피부 외용 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 사용 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면은, 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법으로서, (a) 흑색종 세포주를 준비하는 단계; (b) 상기 흑색종 세포주에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 흑색종 세포주에서 SH3BP4의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 SH3BP4 발현 억제 여부는 SH3BP4 mRNA의 번역 억제 여부인, 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계의 확인 결과, 상기 시험물질이 SH3BP4의 발현을 억제시키는 경우 흑색종 예방 또는 치료제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 SH3BP4의 발현 억제는 시험물질 미처리 음성 대조군보다 SH3BP4 발현 억제 정도가 1.2 배 이상 높은, 스크리닝 방법을 제공하며, 구체적으로, 상기 SH3BP4의 발현 억제는 시험물질 미처리 음성 대조군의 SH3BP4 발현 억제 대비 1.2 배 이상, 1.3 배 이상, 1.4 배 이상, 1.5 배 이상, 1.6 배 이상, 1.7 배 이상, 1.8 배 이상, 1.9 배 이상 또는 2 배 이상일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 시험물질은 세포의 리포좀(liposome) 또는 백터(vector)에 트렌스펙션시킬 수 있으며, 세포는 흑색종 세포일 수 있다. 상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 또는 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은, 흑색종을 진단할 수 있는 바이오 마커를 제공한다. 구체적으로 본 발명의 또 다른 측면에서, SH3BP4의 mRNA 또는 SH3BP4 단백질 검출 시약을 포함하는 흑색종 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 SH3BP4 단백질 검출 시약은 SH3BP4 에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
이하, 제조예, 실시예, 비교예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 제조예, 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[
제조예
]
SH3BP4의
발현 또는 활성을 억제하는
SH3BP4
mRNA
서열에 특이적인
siRNA
제조
SH3BP4의 loss-of-functional study를 위하여 SH3BP4 mRNA 서열에 특이적인 siRNA를 이용하였는데, 이 때 참고한 데이터베이스는 다음과 같다.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/23677
https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SH3BP4&keywords=SH3BP4
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_014521.2
상기 SH3BP4 siRNA 서열은 하기와 같으며, 하기 서열은 Life technologies 社에서 구입하였다.
실시예 1 : SH3BP4 siRNA #1 서열
Sense: 5'- GCGGUAUGAUUGAUAAUCU -3'(서열번호 1)
Antisense: 5'- AGAUUAUCAAUCAUACCGC -3' (서열번호 2)
실시예 2 : SH3BP4 siRNA #2 서열
Sense: 5'- GCGUAUGACUUCUUACUCA -3' (서열번호 3)
Antisense: 5'- UGAGUAAGAAGUCAUACGC -3'(서열번호 4)
[
실험예
]
SH3BP4
억제제에 의한 흑색종의 colony 형성 감소
상기 제조예의 SH3BP4 siRNA(실시예 1 및 2)에 의한 흑색종 예방 및 치료 효과를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 흑색종 세포주인 WM266-4 melanoma를 100파이 dish에 약 1000개 정도를 깔은 뒤, 다음날 상기 실시예 1 및 2의 SH3BP4 siRNA 각각을 농도가 20uM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 상기 리포좀은 Lipofectaminer® RNAiMAX Reagent (Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다.
대조군으로 본 발명의 siRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산으로, Silencer? Select Negative Control No. 1 siRNA(카탈로그 번호 4390843)(제조사: Life technologies) 을 이용하여 트랜스펙션시킨 샘플(비교예)를 이용하였다.
트랜스펙션 후 세포는 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 약 10일간 배양하였다. 해당 디쉬(dish)에서 콜로니(colony)들이 얼마나 자랐는지 확인해보기 위해 크리스탈 바이올렛 염색(crystal violet staining)을 실시하였다. 구체적으로, 100% 메탄올 시약으로 10분간 인큐베이션시켜 고정(fixing) 과정을 진행한 뒤, 25% 메탄올 용액에 0.5% crystal violet을 녹인 용액(solution)으로 10분간 인큐베이션하였다. 물로 여러 번 워싱(washing) 과정을 거친 뒤 충분히 건조시켜 본 실험을 완료하였으며, 그 결과는 도 1과 같다.
도 1에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1 및 2의 siRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 비교예의 올리고핵산서열을 트렌스펙션한 대조군에 비해, 상기 실시예 1 및 2의 SH3BP4 siRNA 각각을 트렌스펙션한 실험군에서 colony의 형성이 훨씬 많이 되지 않음을 관찰할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 올리고뉴클레오티드는 흑색종 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 영양화장수
하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조할 수 있다.
| 원료명 | 함량(중량%) |
| 글리세린 | 3.0 |
| 부틸렌글리콜 | 3.0 |
| 프로필렌글리콜 | 3.0 |
| 카르복시비닐폴리머 | 0.1 |
| 실시예 1 또는 2를 포함하는 리포좀 | 0.01 |
| 밀납 | 4.0 |
| 폴리솔베이트 60 | 1.5 |
| 카프릴릭/카프릭 리글리세라이드 | 5.0 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 솔비타세스퀴올레이트 | 1.5 |
| 세테아릴 알코올 | 1.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.2 |
| 방부제, 향료 | 적량 |
| 정제수 | 잔량 |
| 계 | 100 |
[제형예 2] 영양로션
하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양로션을 제조할 수 있다.
| 원료명 | 함량(중량%) |
| 정제수 | 잔량 |
| 글리세린 | 3.0 |
| 부틸렌글리콜 | 3.0 |
| 유동파라핀 | 5.0 |
| 베타글루칸 | 7.0 |
| 카보머 | 0.1 |
| 실시예 1 또는 2를 포함하는 리포좀 | 0.01 |
| 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 | 3.0 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 세테아릴 글루코사이드 | 1.5 |
| 소르비탄 스테아레이트 | 0.4 |
| 폴리솔베이트 60 | 1.5 |
| 방부제 | 적량 |
| 향 | 적량 |
| 색소 | 적량 |
| 트리에탄올아민 | 0.1 |
| 계 | 100 |
[제형예 3] 영양크림
하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조할 수 있다.
| 원료명 | 함량(중량%) |
| 글리세린 | 3.5 |
| 부틸렌글리콜 | 3.0 |
| 유동파라핀 | 7.0 |
| 베타글루칸 | 7.0 |
| 카보머 | 0.1 |
| 실시예 1 또는 2를 포함하는 리포좀 | 0.01 |
| 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 | 3.0 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 세테아릴 글루코사이드 | 1.5 |
| 소르비탄 스테아레이트 | 0.4 |
| 폴리솔베이트 60 | 1.2 |
| 트리에탄올아민 | 0.1 |
| 방부제, 향료 | 적량 |
| 정제수 | 잔량 |
| 계 | 100 |
[제형예 4] 주사제
하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조할 수 있다.
| 원료명 | 중량비(1ml 당) |
| 염화나트륨 | 9.0mg |
| 소듐 카르복시메틸셀룰로오즈 | 30.0mg |
| Tween 20 | 1.0mg |
| 실시예 1 또는 2를 포함하는 리포좀 | 1.0mg |
| 주사용 증류수 | 잔량 |
[제형예 5] 연고
하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.
| 원료명 | 함량(중량%) |
| 글리세린 | 8.0 |
| 부틸렌글리콜 | 4.0 |
| 유동파라핀 | 15.0 |
| 베타글루칸 | 7.0 |
| 카보머 | 0.1 |
| 실시예 1 또는 2 | 0.01 |
| 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 | 3.0 |
| 스쿠알란 | 1.0 |
| 세테아릴 글루코사이드 | 1.5 |
| 소르비탄 스테아레이트 | 0.4 |
| 세테아릴 알코올 | 1.0 |
| 방부제 | 적량 |
| 향 | 적량 |
| 색소 | 적량 |
| 밀납 | 4.0 |
| 정제수 | 잔량 |
| 계 | 100 |
<110> AMOREPACIFIC CORPORATION
<120> A melanoma preventing or treating agent through SH3BP4
inhibition, and screening method thereof
<130> 18p432ind
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH3BP4 siRNA #1 sense
<400> 1
gcgguaugau ugauaaucu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH3BP4 siRNA #1 antisense
<400> 2
agauuaucaa ucauaccgc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH3BP4 siRNA #2 sense
<400> 3
gcguaugacu ucuuacuca 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH3BP4 siRNA #2 antisense
<400> 4
ugaguaagaa gucauacgc 19
Claims (19)
- 에스에이치3 도메인-바인딩 프로테인 4(SH3 domain-binding protein 4, SH3BP4)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제는 SH3BP4 mRNA의 번역을 억제하는 것인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 SH3BP4의 발현 또는 활성 억제제는 SH3BP4 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열 또는 서열번호 1의 서열과 85% 이상의 상동성을 가지면서 SH3BP4 mRNA에 결합할 수 있는 서열을 포함하는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 1의 서열 및 상기 서열번호 1의 서열에 혼성화 가능한 서열을 포함하는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 1의 서열 및 서열번호 2의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1의 서열 및 서열번호 2의 서열은 혼성화된, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열 또는 서열번호 3의 서열과 85% 이상의 상동성을 가지면서 SH3BP4 mRNA에 결합할 수 있는 서열을 포함하는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 3의 서열 및 상기 서열번호 3의 서열에 혼성화 가능한 서열을 포함하는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 3의 서열 및 서열번호 4의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 3의 서열 및 서열번호 4의 서열은 혼성화된, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 리포좀에 포집된 형태 또는 백터에 삽입된 형태로 포함되는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 200uM 인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 조성물은 주사제인 흑색종 예방 또는 치료용 조성물. - (a) 흑색종 세포주를 준비하는 단계;
(b) 상기 흑색종 세포주에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 시험물질이 흑색종 세포주에서 SH3BP4의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법. - 제14항에 있어서,
상기 (c)단계의 SH3BP4 발현 억제 여부는 SH3BP4 mRNA의 번역 억제 여부인, 스크리닝 방법. - 제 14항에 있어서,
상기 (c)단계의 확인 결과, 상기 시험물질이 SH3BP4의 발현을 억제시키는 경우 흑색종 예방 또는 치료제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법. - 제 16항에 있어서,
상기 SH3BP4의 발현 억제는 시험물질 미처리 음성 대조군보다 SH3BP4 발현 억제 정도가 1.2 배 이상 높은, 스크리닝 방법. - SH3BP4의 mRNA 또는 SH3BP4 단백질 검출 시약을 포함하는 흑색종 진단용 조성물.
- SH3BP4의 mRNA 또는 SH3BP4 단백질 검출 시약을 포함하는 흑색종 진단용 키트.
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|---|---|---|---|---|
| KR20140141200A (ko) | 2013-05-31 | 2014-12-10 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Rsk2 억제제를 포함하는 피부암 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
-
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Young-Mi Kim 외 6인, SH3BP4 is a negative regulator of amino acid-Rag GTPase-mTORC1 signaling, Mol Cell. 2012 June 29; 46(6): 833-846. |
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