KR102475128B1 - Entpd4 억제를 통한 흑색종 예방 또는 치료제, 및 그 스크리닝 방법 - Google Patents

Entpd4 억제를 통한 흑색종 예방 또는 치료제, 및 그 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제는 ENTPD4 유전자의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드이며, 구체적으로 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 또한, 본 명세서는 시험물질에 대한 흑색종 예방 및 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

ENTPD4 억제를 통한 흑색종 예방 또는 치료제, 및 그 스크리닝 방법 {A melanoma preventing or treating agent through ENTPD4 inhibition, and screening method thereof}
본 명세서는 엑토뉴클레오사이드 트리포스페이트 디포스포하이드로레이즈(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase, ENTPD4)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물; 및 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
흑색종은 주로 피부 표피의 기저층에 있는 멜라닌 세포가 악성화된 피부암으로 멜라닌 세포가 존재하는 곳 어디든 발생할 수 있는 암이다. 흑색종은 피부암으로 인한 사망의 65%를 차지하고 있는 치명적인 질환으로 전이가 쉽게 발생하며 전이가 이루어지면 5년 생존율이 5%이하로 떨어지는 예후가 좋지 않은 악성 종양으로 알려져 있다. 지난 30년간 전세계적으로 흑색종의 발생률이 점점 증가하고 있으며 특히, 호주 미국과 같은 백인에게서 발생률이 더 높게 나타난다. 우리나라 역시 중앙 암본부에 의해 발표된 자료에 따르면 흑색종은 전체 암 발병 중 0.2%를 차지하지만 점점 발병률이 증가 하고 있는 추세라고 발표되었다. 대부분의 흑색종은 간, 뼈, 뇌로 전이가 되고 피부, 피하조직, 림프절 등이 전이의 원발 부위로 알려져 있다.
RNAi(RNA interference: RNA 간섭)은 타겟 mRNA가 degradation되어 특정 유전자가 down regulation 되는 현상 또는 그 프로세스로 알려져 있다. 이러한, RNAi 현상을 유도하는 RNA로는 siRNA, shRNA 또는 miRNA 등이 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 상기와 같은 흑색종과 관련된 유전자의 연구가 진행되고 있으나, 난소암과 비소세포 폐암에서 과발현되는 특성을 보이고 있는 ENTPD4 유전자에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 더해, 상기 ENTPD4 mRNA의 단백질로의 발현을 억제하기 위한 RNAi에 대한 연구 역시 부족한 실정이다.
미국공개특허 제 2007-0237770호 국제특허공개 제 2013-119964호 일본공개특허 제 2008-237022호 일본공개특허 제 2008-092949호 미국공개특허 제 2013-0190197호
Martin S. Staege et al., Lipases and Related Molecules in Cancer, Cancer Growth and Metastasis, 2010
본 발명의 일 측면은 흑색종과 ENTPD4 유전자와의 관계를 규명하고자 한다.
본 발명의 일 측면은 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 측면은 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 측면은 흑색종 진단용 조성물 또는 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은, ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제는 ENTPD4 mRNA의 번역을 억제하는 것인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제는 ENTPD4 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 1의 서열 및 상기 서열번호 1에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열은 혼성화될 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 3의 서열 및 상기 서열번호 3에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열은 혼성화될 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 리포좀에 포집 또는 백터(vector)에 삽입된 형태로 포함되는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 200uM 인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 주사제인 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법으로서, (a)흑색종 세포주를 준비하는 단계; (b)상기 흑색종 세포주에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c)상기 시험물질이 흑색종 세포주에서 ENTPD4의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (c)단계의 ENTPD4 발현 억제 여부는 ENTPD4 mRNA의 번역 억제 여부인, 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (c)단계의 확인 결과, 상기 시험물질이 ENTPD4의 발현을 억제시키는 경우 흑색종 예방 또는 치료제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 ENTPD4의 발현 억제는 시험물질 미처리 음성대조군의 ENTPD4 발현 억제 대비 2 배 이상인, 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 ENTPD4의 mRNA 또는 ENTPD4 단백질 검출시약을 포함하는 흑색종 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 ENTPD4의 mRNA 또는 ENTPD4 단백질 검출시약을 포함하는 흑색종 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일측면은, ENTPD4 및 ENTPD4유전자와 흑색종이 긴밀한 관련이 있음을 제공한다.
본 발명의 일측면은 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면은 상기 ENTPD4의 상기 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제는 ENTPD4 mRNA의 번역을 억제하는 것인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면은 상기 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제는 ENTPD4 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물은 ENTPD4의 발현 또는 활성을 억제하는 효과를 가진다.
본 발명에 일측면에 따른 조성물은 흑색종을 예방 또는 치료하는 효과를 가진다.
본 발명의 다른 측면에 따른 방법은 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법으로 시험물질이 흑색종 예방 또는 치료물질인지를 빠르고 간단하게 판정할 수 있다는 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 흑색종 진단용 조성물 또는 키트는 흑색종 여부를 빠르고 간단하게 판정할 수 있다는 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 실험예 1에 따른 양성 반점 및 흑색종 세포에서의 ENTPD4의 발현값을 비교한 그래프이다.
도 2는 실험예 2에 따른 비교예 1 및 실시예 1 내지 2의 colony 형성을 확인한 사진이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
엑토뉴클레오사이드 트리포스페이트 디포스포하이드로레이즈(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase, ENTPD4)의 mRNA 서열은 genbank의 accession number인 NM_004901.4이다.
본 발명의 일측면은, ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제는 ENTPD4 mRNA의 번역을 억제하는 것인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제는 ENTPD4 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 흑색종의 데이터베이스에서 생물정보학적 분석을 통하여 ENTPD4 유전자가 흑색종과 긴밀한 관련이 있음을 확인하였다. 구제적으로, 양성반점과 악성 흑색종에서 ENTPD4 유전자의 mRNA 발현량을 비교한 결과, 악성 흑색종에서 ENTPD4 유전자의 mRNA 발현량이 증가되었음을 확인하였다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 유도하는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일측면에서, ENTPD4 유전자의 mRNA 발현을 억제하기 위해 상기 ENTPD4 mRNA의 간섭을 유도하는 RNAi현상을 이용하여 흑색종을 예방 또는 치료할 수 있다.
miRNA는 세포 내에 존재하는 작은 RNA(endogenous small RNA)의 일종으로 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래되어 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)로부터 생성이 된다. miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR의 상보적 서열(sequence)에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하여, 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서(repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져 있다. RNAi 현상을 유도하는 다른 RNA로 19 내지 27 mer 내외의 짧은 RNA인 short interfering RNA(siRNA)가 있으며, 짧은 헤어핀(short hairpin) 구조를 가지는 shRNA가 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 바람직하게 siRNA, shRNA 및 miRNA중 어느 하나 일 수 있으며, 서열번호 1의 서열 및 상기 서열번호 1에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다.
(서열번호 1) 5'- GAAGCUACAGACACCAAUA -3'
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 바람직하게 siRNA, shRNA 및 miRNA중 어느 하나 일 수 있으며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열은 혼성화될 수 있다.
(서열번호 1)Sense: 5'- GAAGCUACAGACACCAAUA -3'
(서열번호 2)Antisense: 5'- UAUUGGUGUCUGUAGCUUC -3'
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 바람직하게 siRNA, shRNA 및 miRNA중 어느 하나 일 수 있으며, 서열번호 3의 서열 및 상기 서열번호 3에 혼성화 가능한 서열을 포함할 수 있다.
(서열번호 3)5'- CAGAGAUACGAAGACAGAA -3'
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 바람직하게 siRNA, shRNA 및 miRNA중 어느 하나 일 수 있으며, 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열은 혼성화될 수 있다.
(서열번호 3)Sense: 5'- CAGAGAUACGAAGACAGAA -3'
(서열번호 4)Antisense: 5'- UUCUGUCUUCGUAUCUCUG -3'
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 리포좀(liposome)에 포집 또는 벡터에 삽입된 형태로 포함되는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 200uM 인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 uM 이상, 2 uM 이상, 3 uM 이상, 5 uM 이상, 7 uM 이상, 9 uM 이상, 11 uM 이상, 15 uM 이상, 16 uM 이상, 17 uM 이상, 18 uM 이상, 19 uM 이상, 20 uM 이상, 21 uM 이상, 22 uM 이상, 23 uM 이상, 24 uM 이상, 25 uM 이상 또는 50 uM 이상일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 200 uM 이하, 190 uM 이하, 180 uM 이하, 170 uM 이하, 150 uM 이하, 130 uM 이하, 100 uM 이하, 80 uM 이하, 50 uM 이하, 40 uM 이하, 30 uM 이하, 29 uM 이하, 28 uM 이하, 27 uM 이하, 26 uM 이하, 25 uM 이하, 24 uM 이하, 23 uM 이하, 22 uM 이하, 21 uM 이하 또는 20 uM 이하일 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드의 농도가 상기 범위 내 일때, ENTPD4의 발현 억제 효과가 우수하며, 흑색종의 예방 또는 치료에 적합하다.
그러므로, 본 발명의 일측면에 따른 조성물은 흑색종을 예방 또는 치료하는 효과를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일측면으로, 상기 조성물은 본 발명의 일측면에 따른 ENTPD4 의 발현 또는 활성 억제제를 조성물 총 중량에 대하여 0.00001~30.0 중량%의 양으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에 따른 조성물은 피부외용제 조성물일 수 있으며, 화장품 조성물 또는 약학 조성물을 포함한다.
상기 화장품 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸 조성물의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 화장품 조성물은 상기한 물질 이외에 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 화장품 조성물은 비타민, 고분자 펩티드,고분자 다당 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장품 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로0.01~5 중량%, 구체적으로 0.01~3 중량%일 수 있다.
또한, 본 발명은 일 실시예로서 본 발명의 일측면 따른 ENTPD4 의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 흑색종 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 주사제인 흑색종 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 피부 외용 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 사용 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면은, 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법으로서, (a)흑색종 세포주를 준비하는 단계; (b)상기 흑색종 세포주에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (c)상기 시험물질이 흑색종 세포주에서 ENTPD4의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (c)단계의 ENTPD4 발현 억제 여부는 ENTPD4 mRNA의 번역 억제 여부인, 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 (c)단계의 확인 결과, 상기 시험물질이 ENTPD4의 발현을 억제시키는 경우 흑색종 예방 또는 치료제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 ENTPD4의 발현 억제는 시험물질 미처리 음성 대조군의 ENTPD4 발현 억제 대비 2 배 이상인, 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 (b) 단계에서 시험물질은 세포의 리포좀(liposome) 또는 백터(vector)에 트렌스펙션시킬 수 있으며, 세포는 흑색종 세포일 수 있다. 상기 트랜스펙션은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 또는 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은, 흑색종을 진단할 수 있는 바이오 마커를 제공한다. 구체적으로 본 발명의 또 다른 측면에서, ENTPD4의 mRNA 또는 ENTPD4 단백질 검출 시약을 포함하는 흑색종 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 ENTPD4 단백질 검출 시약은 ENTPD4 에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
이하, 실험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실험예1] 흑색종과 ENTPD4 유전자의 관계규명-악성 흑색종(malignant melanoma)에서 증가되는 ENTPD4 유전자의 mRNA 발현
본 발명자들은 ENTPD4 유전자의 mRNA 발현이 양성 반점(benign nevi)보다 악성 흑색종(maliganant melanoma)에서 증가되어 있는지 확인하기 위하여 아래의 database를 이용하여 분석하였다.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/GDSbrowser?acc=GDS1375
해당 데이터베이스는 18개의 양성반점(nevi)와 45개의 흑색종(melanoma) 샘플로부터 RNA를 추출하여 Affymetrix Human Genome U133A Array 를 통하여 mRNA들의 발현 profiling을 포함하고 있다. 해당 인터넷 사이트에서 ENTPD4의 발현값을 추출하고 양성 반점(benign nevi)과 흑색종(melanoma) 군에서 그 발현 값의 차이가 있는지를 조사하여 본 결과, 도 1과 같았으며 유의성 있게 ENTPD4의 발현이 melanoma에서 증가되어 있음을 확인하였다. 따라서, ENTPD4의 발현이 많을 수록 흑색종 발생할 확률이 높음을 알 수 있으며, ENTPD4의 발현을 억제한다면 흑색종을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
[실험예2] ENTPD4 억제제에 의한 흑색종의 colony 형성 감소
ENTPD4의 loss-of-functional study를 위하여 ENTPD4 mRNA 서열에 특이적인 siRNA를 이용하였는데, 사용한 ENTPD4 siRNA 서열은 다음과 같다. 상기 서열은 Bioneer 社에서 구입하였다.
실시예 1 : ENTPD4 siRNA #1 서열
Sense: 5'- GAAGCUACAGACACCAAUA -3'(서열번호 1)
Antisense: 5'- UAUUGGUGUCUGUAGCUUC -3' (서열번호 2)
실시예 2 : ENTPD4 siRNA #2 서열
Sense: 5'- CAGAGAUACGAAGACAGAA -3' (서열번호 3)
Antisense: 5'- UUCUGUCUUCGUAUCUCUG -3'(서열번호 4)
흑색종 세포주인 SK-MEL-28를 100파이 dish에 약 1000개 정도를 깔은 뒤, 다음날 ENTPD4 siRNA를 농도가 20uM가 되도록 리포좀(liposome)을 이용하여 트랜스펙션하여 세포 안으로 이동시켰다. 상기 리포좀은 Lipofectaminer® RNAiMAX Reagent (Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다.
대조군으로 본 발명의 siRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산을 Lipofectaminer® RNAiMAX Reagent (Thermo Fisher Scientific) 시약을 이용하여 트랜스펙션시킨 샘플(비교예 1)를 이용하였다.
비교예 1 :본 발명의 siRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산서열
Sense: 5' CCUACGCCACCAAUUUCGU -3' (서열번호 5)
Ansisense: 5' ACGAAAUUGGUGGCGUAGG -3' (서열번호 6)
트랜스펙션 후 세포는 37℃℃ 5% CO2 인큐베이터에서 약 7일간 배양하였다. 해당 디쉬(dish)에서 콜로니(colony)들이 얼마나 자랐는지 확인해보기 위해 크리스탈 바이올렛 염색(crystal violet staining)을 실시하였다. 위 실험은 다음과 같이 진행되었다. 100% 메탄올 시약으로 10분간 인큐베이션시켜 고정(fixing) 과정을 진행한 뒤, 25% 메탄올 용액에 0.5% crystal violet을 녹인 용액(solution)으로 10분간 인큐베이션한다. 물로 여러 번 워싱(washing) 과정을 거친 뒤 충분히 건조시켜 본 실험을 완료한다. 이 실험의 결과 si-ENTPD4를 트렌스펙션한 샘플군인 실시예 1 및 실시예 2에서 siRNA 서열과는 전혀 중복되지 않는 올리고핵산서열을 트렌스펙션한 비교예 1에 비해 colony의 형성이 훨씬 많이 되지 않음을 관찰할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일측면에 따른 올리고뉴클레오티드는 흑색종 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 영양화장수
하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조할 수 있다.
원료명 함량 함량(중량%)
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
프로필렌글리콜 3.0
카르복시비닐폴리머 0.1
실시예 1 또는 2를 포함하는 리포좀 0.01
밀납 4.0
폴리솔베이트 60 1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드 5.0
스쿠알란 5.0
솔비타세스퀴올레이트 1.5
세테아릴 알코올 1.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 향료 적량
정제수 잔량
계 100
[제형예 2] 영양로션
하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양로션을 제조할 수 있다.
원료명 함량 함량(중량%)
정제수 잔량
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
유동파라핀 5.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
실시예 1 또는 2를 포함하는 리포좀 0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 5.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
폴리솔베이트 60 1.5
방부제 적량
향 적량
색소 적량
트리에탄올아민 0.1
계 100
[제형예 3] 영양크림
하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조할 수 있다.
원료명 함량 함량(중량%)
글리세린 3.5
부틸렌글리콜 3.0
유동파라핀 7.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
실시예 1 또는 2를 포함하는 리포좀 0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 5.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
폴리솔베이트 60 1.2
트리에탄올아민 0.1
방부제, 향료 적량
정제수 잔량
계 100
[제형예 4] 주사제
하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조할 수 있다.
원료명 함량 중량비(1ml 당)
염화나트륨 9.0mg
소듐 카르복시메틸셀룰로오즈 30.0mg
Tween 20 1.0mg
실시예 1 또는 2를 포함하는 리포좀 1.0mg
주사용 증류수 잔량
[제형예 5] 연고
하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.
원료명 함량 함량(중량%)
글리세린 8.0
부틸렌글리콜 4.0
유동파라핀 15.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
실시예 1 또는 2 0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 1.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
세테아릴 알코올 1.0
방부제 적량
향 적량
색소 적량
밀납 4.0
정제수 잔량
계 100
<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> A melanoma preventing or treating agent through ENTPD4 inhibition, and screening method thereof <130> 15P667IND <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of siRNA <400> 1 gaagcuacag acaccaaua 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense sequence of siRNA <400> 2 uauugguguc uguagcuuc 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of siRNA <400> 3 cagagauacg aagacagaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense sequence of siRNA <400> 4 uucugucuuc guaucucug 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of control group <400> 5 ccuacgccac caauuucgu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense sequence of control group <400> 6 acgaaauugg uggcguagg 19

Claims (17)

  1. 엑토뉴클레오사이드 트리포스페이트 디포스포하이드로레이즈(ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase, ENTPD4)의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하고,
    상기 ENTPD4의 발현 또는 활성 억제제는 ENTPD4 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드이고,
    상기 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하고, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열은 혼성화되고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열은 혼성화된, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 리포좀에 포집된 형태 또는 백터에 삽입된 형태로 포함되는, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 상기 리포좀에 대하여 농도가 1 내지 200uM 인, 흑색종 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 조성물은 주사제인 흑색종 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법으로서,
    (a)흑색종 세포주를 준비하는 단계;
    (b)상기 흑색종 세포주에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
    (c)상기 시험물질이 흑색종 세포주에서 ENTPD4의 발현을 억제하는지 여부를 확인하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 흑색종 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 (c)단계의 ENTPD4 발현 억제 여부는 ENTPD4 mRNA의 번역 억제 여부인, 스크리닝 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 (c)단계의 확인 결과, 상기 시험물질이 ENTPD4의 발현을 억제시키는 경우 흑색종 예방 또는 치료제로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 ENTPD4의 발현 억제는 시험물질 미처리 음성 대조군의 ENTPD4 발현 억제 대비 2 배 이상인, 스크리닝 방법.
  16. ENTPD4의 mRNA 또는 ENTPD4 단백질 검출 시약을 포함하는 흑색종 진단용 조성물.
  17. ENTPD4의 mRNA 또는 ENTPD4 단백질 검출 시약을 포함하는 흑색종 진단용 키트.
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