WO2004061456A2 - Verwendungen von hmgb, hmgn, hmga proteinen - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to the use of nucleic acids, their transcription and / or translation products for angiogenesis, neovascularization, transmyocardial revascularization, dedifferentiation of cells and / or the reprogramming of cells, for tissue regeneration, for influencing tissue aging and for wound healing, and methods for angiogenesis , Vascularization, neovascularization and transmyocardial revascularization as well as for tissue regeneration, wound healing, for influencing tissue aging, procedures for vascularization, in particular in the case of heart attack and healing in tooth and bone implants, procedures for tissue regeneration, procedures for de-differentiation and / or reprogramming of cells
  • Carrier material comprising such a nucleic acid, its transcription and / or translation product and wound covering material comprising a base covering material and said nucleic acids, their transcription and / or transla tion products.
  • the various aspects of the present invention have in common that the processes involved seem to be associated with the (de-) differentiation of cells, which can be used in various medical applications in a useful manner.
  • the blood vessel system of vertebrates, especially mammals and humans, and the skin thereof are particularly affected.
  • the human blood vessel system consists of arteries, arterioles, blood capillaries, end current tracts, venules and veins.
  • Arteries are vessels with the blood flowing in the direction of the heart, and there are two types: arteries of the muscular type and arteries of the elastic type, the latter being large arteries close to the heart.
  • Arteries are generally made up of an internal tunica, which is also referred to as the intima, with a single-layered endothelium facing the lumen, the loose connective tissue subendothelial and the internal elastica membrane, which is clearly pronounced in the muscular type, and the tunica media in the muscular type consists of tightly layered layers of ring-shaped or screw-shaped smooth muscle cells and fine elastic and collagen fibers, whereas the elastic type consists of numerous windowed elastic membranes and embedded smooth muscle cells as well as collagen fibers and the tunica externa, which consists of collagenous connective tissue and elastic fibers and is nourishing Contains vessels as well as vascular nerves.
  • a membrane elastica externa can be formed between the tunica media and the tunica externa.
  • the last sections of the arteries are followed by arterioles that have an endothelium, a lattice fiber network and a single-layer continuous smooth muscle cell layer, whereby the internal elastica membrane that is still present in the arteries is missing, so that myoendothelial contacts are formed.
  • the arterioles then pass into blood capillaries, small vessels with a diameter of 6 to approximately 20 to 30 ⁇ m.
  • the wall of blood capillaries consists of an endothelium, which sits on the inside of a basement membrane spanning lattice fibers. This basement membrane has externally branched cells, so-called pericytes. The pericytes are probably involved in the exchange of material between the capillary blood and the tissue.
  • the blood capillaries then pass into venules and ultimately into veins, i.e. blood vessels with the blood flowing in the direction of the heart.
  • veins i.e. blood vessels with the blood flowing in the direction of the heart.
  • the wall of typical veins contains an internal tunica with many elastic fibers, but no internal elastica membrane, a tunica media with loose bundles of smooth muscles, and an external tunica. In contrast to arteries, the delimitation of these layers in the histological specimen appears blurred.
  • the section of the vascular system which consists of arterioles, capillaries and venules and which determines the microcirculation of the blood is called the end flow path and, in terms of hemodynamics, represents the neutral area between the arterial inflow and the venous outflow of the blood, ie the turning point of the circulation. and gas exchange between blood and tissue and the maintenance of the thermal and ionic environment.
  • the skin is an important organ of the mammalian organism, especially humans.
  • the skin consists of the skin in the narrower sense, i.e. the cutis, to which the epidermis and epidermis and the dermis, also known as Dennis or Korium, and adjoining structures such as hair, nails and glands, as well as a skin element in the broad sense the subcutis or subcutis.
  • the functions perceived by the skin are extremely diverse.
  • the skin serves as a mechanical demarcation from the environment, as a heat protection organ, which is effective due to its excess blood flow in the service of blood distribution and temperature control, but also through the isolating effect of the coat and the fat pad, as well as through the evaporation of sweat, thereby simultaneously regulating the water balance is involved, as a protective organ against bacteria due to their protective acid mantle and against radiation due to pigment formation, and as an energy store due to the fat depot.
  • the skin is an important sensory organ due to the nerve end organs in it. Furthermore, it is an immune organ with a different defense function. As a result, the skin receives a variety of attention, especially in the context of wound healing and skin aging.
  • Wound healing is a dynamic process with a complex interaction between cells, extracellular matrix, plasma proteins and a controlled angiogenesis that is coordinated by a number of cytokines and growth factors. Regardless of the type of wound and the extent of the loss of tissue, wound healing can be roughly divided into the temporally overlapping phases of the inflammatory or exudative phase, the proliferative phase and the differentiation and remodeling phase. The phase classification is based on the fundamental morphological changes in the course of the reparation processes, without reflecting the actual complexity of the processes.
  • the process of wound healing can be quantitatively divided into primary and secondary wound healing, with a further distinction being made between delayed primary healing and chronic wound development in order to take into account the therapeutic problems arising from the extent and type of tissue destruction.
  • Primary wound healing is the case, for example, with smooth, close-lying wound surfaces of a cut without any noteworthy loss of substance and without the incorporation of foreign bodies in a tissue that is well supplied with blood vessels.
  • Primary wound healing is usually given by surgically placed wounds or by occasional wounds from sharp-edged objects. If an infection is to be expected due to the development of the wound, the delayed primary healing occurs. If an infection manifests itself, the wound is classified as secondary healing.
  • a chronic wound can occur in every phase of wound healing and mostly develops from progressive tissue destruction as a result of tissue diseases of different origins, local pressure damage, radiation damage or tumors.
  • wound healing can be based on the distinction between acute wounds and chronic wounds.
  • Acute wounds range from acute traumatic wounds to complex traumatic defects, thermal and chemical injuries / burns and incisions / surgical wounds.
  • wound closure In the case of acute traumatic wounds, if the wound edges can be adapted without tension, if necessary after wound excision, a primary wound closure by means of sutures, staples or wound suture strips takes place. In the case of wounds which present a potential risk of infection, however, the wound is first kept open with sterile, moist bandages until an infection can be ruled out. In the case of secondary healing and more complex wounds, wound closure is much more complex.
  • Chronic wounds are secondary healing wounds that, despite causal and proper local therapy, do not heal within eight weeks. Although chronic wounds can develop from an acute wound at any time, the vast majority of chronic wounds represent the final stage of progressive tissue destruction caused by venous, arterial, or metabolic disorders, Pressure damage, radiation damage or tumors. The different types of chronic wounds are caused by different pathologies, and the wounds are considered biochemically similar. Local factors that affect wound healing include foreign bodies, ischemia, repeated trauma, and infections. Furthermore, systemic factors such as increased age, malnutrition and malnutrition, diabetes and kidney diseases can have an impact on wound healing. The most economically relevant chronic wound healing disorders include, among others, venous leg ulcer, arterial leg ulcer, diabetic ulcer, decubital ulcer and chronic post-traumatic wound.
  • ages describes the changes related to the normal aging processes of the skin, which lead to a thinning of the layers of the skin and to a decrease in the functions of the skin glands. This requires a thin, dry, fine wrinkled skin with increasing age.
  • Age-related wrinkles and wrinkles are the result of a decrease or loss of collagen and elastic fibers in the dermis.
  • the integrity of aged skin is more easily interrupted and it regenerates more slowly, so that the organism is at greater risk of infection.
  • Age-related slowing and reduction of cell renewal is influenced by hormonal changes and hereditary factors, among other things.
  • environmental influences have a decisive influence on this aging process, which they can accelerate and intensify.
  • UV-A rays penetrate into the dermis and destroy the resident skin connective tissue here (Elastosis) This leads to a flabby, very wrinkled, roughly wrinkled skin on the face, but also on the neck.
  • Age spots preferably occur in light-exposed areas such as on the face and on the back of the hand.
  • depigmentation hyperomelanosis guttata
  • the treatment of the various wounds can basically be divided into passive and active wound therapy. So-called skin replacement procedures can also be used as a special form.
  • passive wound therapy on the one hand, inactive, textile bandages are used, which serve as a covering material to protect against infection.
  • interactive wound dressings are often used to create a moist wound environment and thus to accelerate the healing process.
  • hydrocolloids, hydrogels, hydropolymers and foam dressings as well as calcium alginates are used.
  • the disadvantage of this passive wound therapy is that the dressing material does not promote the active healing of problem wounds, especially in chronic wounds, which are often considered to be resistant to therapy.
  • VEGF transforming growth factor beta
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • GM-CF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • XIII coagulation factor XIII
  • the temporary skin replacement can either be of allogeneic biological origin, for example foreign skin such as decellulated human cadaver skin in combination with keratinocyte sheets or split skin, xenogeneic of biological origin, for example equine collagen fibrils or bovine collagen sponges, or a combination of synthetic and biological material, such as, for example, films made of silicone or nylon combined with collagen matrices and / or fibroblasts.
  • the permanent skin replacement can be an autologous skin graft or can be traced back to cell cultures.
  • Botulinum toxin when injected into the areas of the folds of the skin, leads to poisoning and thus to paralysis of the muscle cells, which results in an overall tightening of the skin.
  • another disadvantage is that in about 5% of patients over time the therapy as a result of neutralizing antibodies no longer responds.
  • the present invention has for its object to provide means to promote or inhibit angiogenesis or neovascularization or to promote transmyocardial revascularization and to make the related diseases treatable.
  • the object of the present invention is to provide a means for promoting or initiating wound healing.
  • the present invention is further based on the object of providing means for converting cells, in particular mesenchymal cells, but also epithelial cells, into a state which allows them to differentiate, possibly to differentiate and / or to grow.
  • the object of the present invention is to provide a means for promoting or initiating wound healing. After all, it's one the objects of the present invention to provide an agent which counteracts skin aging.
  • the object is achieved according to the invention in a first aspect through the use, in particular in vitro, of one or more nucleic acid (s), their transcription product (s) and / or their translation product (s) for a process, the process being selected from the group , which includes angiogenesis, neovascularization, transmyocardial revascularization, wound healing, angiogenesis in the wound bed, epithelization and healing in tooth and bone implants,
  • the nucleic acid (s) being selected from the group comprising genes for high mobility group protein.
  • the object is achieved according to the invention in a second aspect by the use of one or more nucleic acids, their transcription product (s) and / or their translation product (s) for producing a medicament for the prevention and or treatment of a disease, the disease being selected from the group associated with deficient or excessive angiogenesis or neovascularization or with wound healing or which requires transmyocardial revascularization,
  • the nucleic acid (s) being selected from the group comprising genes for high mobility group protein.
  • the object is achieved according to the invention in a third aspect, which is preferably an embodiment of the first and second aspects of the present invention, by using one or more nucleic acids, their transcription product (s) and / or their translation product (s) for the production a medicament for the treatment and / or prevention of a disease, the disease being selected from the group consisting of diabetic retinopathy, proliferative retinopathy diabetica, diabetic nephropathy, macular degeneration, arthritis, endometriosis, pannus, histiocytosis, psoriasis, rosacea, broom travel varicose veins, eruptives , Tumor diseases, cavemous hemangioma, lip angioma, hemangiosarcoma, hemorrhoids, atherosclerosis, angina pectoris, ischemia, infarction, basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, melanoma, Kaposi's sarcoma, tumors,
  • the chronic wound is one that is selected from the group consisting of decubitus, leg ulcers, venous leg ulcers, venous leg ulcers, diabetic leg ulcers, decubital ulcers, chronic post-traumatic wound and diabetic Includes foot.
  • the high mobility group protein is selected from the group comprising the HMGA family, the HMGB family and the HMGN family.
  • the high mobility group protein is selected from the HMGB family.
  • the high mobility group protein is selected from the group comprising HMGB1, HMGB2 and HMGB3.
  • the high mobility group protein is HMGB1.
  • the high mobility group protein is selected from the HMGA family.
  • the high mobility group protein is selected from the group comprising HMGAla, HMGAlb, HMGAlc and HMGA2.
  • the high mobility group protein is HMGAla.
  • a high mobility group protein is selected from the HMGA family and a second high mobility group protein is selected from the HMGB family, the protein from the HMGBA family preferably being HMGAla and the protein from the HMGB family is preferably HMGB1.
  • VEGF or a nucleic acid coding therefor is additionally used.
  • the object is achieved in a fourth aspect by a method for influencing angiogenesis or neovascularization or wound healing of tissue, comprising the following steps:
  • nucleic acid s
  • transcription product s
  • translation product s
  • nucleic acid (s) is / are selected from the group comprising genes for high mobility group proteins and optional
  • the tissue or a part thereof is incubated with VEGF and / or a nucleic acid coding therefor.
  • the tissue is explanted tissue or tissue grown in vitro.
  • the nucleic acid (s), its transcription product (s) and or its translation product (s) are such as described in one of the preceding claims.
  • HMGB proteins or the nucleic acids coding therefor are used, a high mobility group protein from the HMGBA family preferably being selected and a second high mobility group protein from is selected from the HMGB family, the protein from the HMGBA family preferably being HMGAla and the protein from the HMGB family being preferably HMGB1.
  • the genes for high mobility Group proteins comprises a nucleic acid whose transcription or translation product is used, the nucleic acid being selected from the group comprising genes for vascular endothelial growth factor
  • a pharmaceutical formulation comprising one or more nucleic acid (s), its transcription product (s) and / or its translation product (s), as disclosed herein, and a pharmaceutically suitable carrier.
  • a carrier material comprising one or more nucleic acid (s), its transcription product (s) and / or its translation product (s), the nucleic acid (s), its transcription product (s) and or their Translation product (s) is such as disclosed herein.
  • the carrier material consists of a material selected from the group consisting of cellulose, agarose, collagen, silicone, silicon, plastics, gels, hydrogels, matrices based on fibrin, kust silk fibers, hydrocolloids, Lipocolloids, polyurethane, polyurethane resin, gypsum, synthetic biomaterials, thermoplastics, zinc glue, upholstery foam, polyisobutylene, buffers, stabilizers, bacteriostatics and humectants.
  • the carrier material serves as an implant or for wound healing.
  • a wound covering material comprising a basic covering material and one or more nucleic acid (s), their transcription product (s) and / or their translation product (s), the nucleic acid (s), their transcription product (s) and / or whose translation product (s) is such as disclosed herein.
  • the cover material is selected from the group consisting of hydrocolloid dressings, calcium alginate dressings, activated carbon compresses / dressings, foam wound dressings, film dressings,
  • Transparent bandages silicone foam dressings, nonwoven wound dressings, hydrocellular wound dressings, hydroselective wound dressings, absorbent wound pads, spray dressings, rayon gauze, cotton gauze, paraffin gauze dressings, silver-coated wound dressings and hydropolymer / foam dressings.
  • the object is achieved in an eighth aspect by a formulation comprising one or more nucleic acid (s), its transcription product (s) and / or its translation product (s), the nucleic acid (s), its transcription product (s) and / or whose translation product (s) is such as disclosed herein and a carrier phase, the carrier phase preferably being selected from the group consisting of creams, fatty ointments, emulsions (oil in water (O / W) ; Water in oil (W / O); water in oil in water (W / O / W)), microemulsions, modified emulsions, nanoparticles / nanoemulsions, liposomes, hydrodispersion gels (hydrogels, alcohol gels, lipogels, surfactant gels), gel cream, Includes lotions, oils / oil baths and sprays.
  • a carrier phase preferably being selected from the group consisting of creams, fatty ointments, emulsions (oil in water
  • the object is achieved according to the invention in a ninth aspect by a method for screening a compound for promoting and / or inhibiting a process, the The process is selected from the group consisting of angiogenesis, neovascularization, transmyocardial revascularization and wound healing, comprising the following steps:
  • the object is achieved according to the invention in a tenth aspect by a method for screening a compound for promoting and / or inhibiting a process, the process being selected from the group comprising angiogenesis, neovascularization, transmyocardial revascularization and wound healing, comprising the following steps:
  • the object is achieved in an eleventh aspect by a method for screening a compound for promoting and or inhibiting a process, the The process is selected from the group consisting of angiogenesis, neovascularization, transmyocardial vascularization and wound healing, comprising the following steps:
  • the object is achieved in a twelfth aspect by a method for screening a compound to promote and / or inhibit a process, the process being selected from the group comprising angiogenesis, neovascularization, transmyocardial vascularization and wound healing, comprising the following steps:
  • test system is an in vitro test system or an in vivo test system.
  • the reaction from the reference connection and / or the candidate connection is a promotion of the process, and preferably the candidate connection is a connection to promote the process when the reaction the candidate compound in the test system is equal to or stronger than the response of the reference compound.
  • the reaction of the reference compound and / or the candidate compound is an inhibition of the process, and preferably the candidate compound is a compound for inhibiting the process if that of the response of the test system caused by the candidate compound is a lower reaction than the response of the test system caused by the reference compound.
  • the reference compound comprises one or more nucleic acid (s), its transcription product (s) and / or its translation product (s), the nucleic acid being selected from the group, the genes for high mobility group proteins, in particular as disclosed herein.
  • the process is the inhibition of angiogenesis.
  • the object is achieved in a thirteenth aspect by using a method according to one of the aspects nine to twelve for screening a compound for the treatment and / or prevention of an achievement, the test system provided being a test system for the respective disease.
  • the disease is selected from the group comprising such diseases that require the promotion or inhibition of angiogenesis or neovascularization or that require transmyocardial revascularization or wound healing.
  • the disease is selected from the group consisting of diabetic retinopathy, proliferative retinopathy diabetica, diabetic nephropathy, macular degeneration, arthritis, endometriosis, psoriasis, rosacea, broom travel varicose veins, eruptive hemangioma, cavernous hemophilia, cavernous hemorrhage, lipoma Hemangiosarcoma, hemorrhoids, atherosclerosis, angina pectoris, ischemia, infarction, basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, melanoma, Kaposi's sarcoma, tumors, gestosis, infertility, acute traumatic wounds, thermal wounds, chemical wounds, including surgical wounds and chronic.
  • diabetic retinopathy proliferative retinopathy diabetica, diabetic nephropathy, macular degeneration, arthritis, endometriosis, psoriasis, rosace
  • the disease is a tumor disease, the tumor disease preferably having necrotic cells, preferably necrotic tumor cells.
  • the object is achieved in a fourteenth aspect by a connection obtainable by a method according to the ninth to twelfth aspects.
  • the object is achieved in a fifteenth aspect by the use of a compound according to the fourteenth aspect for the manufacture of a medicament, preferably for the treatment and / or prevention of a disease, as disclosed herein.
  • the object is achieved in a sixteenth aspect by the use, in particular in vitro, of a nucleic acid, its transcription product and / or its translation product for a process, the process being selected from the group consisting of tissue regeneration, repair of DNA damage and wound healing , Cell mobility, angiogenesis in the wound bed, epithesis, tissue aging, prevention of tissue aging, tissue rejuvenation, vascularization in heart attack and healing in tooth and bone implants, wherein the nucleic acid is selected from the group comprising genes for basic DNA-binding proteins.
  • the object is achieved according to the invention in a seventeenth aspect through the use, in particular in vitro, of a nucleic acid, its transcription product and / or its translation product for a process, the process being selected from the group comprising the dedifferentiation of cells and reprogramming of cells, for tissue build-up and / or tissue regeneration, in particular based on a dedifferentiation and / or differentiation of the tissue to be built up or regenerated,
  • nucleic acid is selected from the group comprising genes for basic DNA-binding proteins.
  • the object is achieved according to the invention in an eighteenth aspect by the use of a nucleic acid, its transcription product and / or its translation product for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease, the disease being selected from the group consisting of the diseases that the Requires repair of DNA damage, diseases that require tissue regeneration, diseases that require wound healing that are associated with tissue aging, diseases that require tooth and bone implants, diseases that are associated with tissue aging, wound healing disorder, skin diseases, Xeroderma pigmentosum which includes dermis, skin cancer, skin cancer after sunburn, skin aging after sunburn, sunburn and heart attack,
  • nucleic acid is selected from the group comprising genes for basic DNA-binding proteins.
  • the object is achieved according to the invention in a nineteenth aspect by the use of a nucleic acid, its transcription product and / or its translation product for producing a cosmetic product, preferably a cosmetic product for tissue regeneration, wound healing, prevention of dermis, prevention of skin cancer, in particular skin cancer after sunburn, skin aging, in particular skin aging after sunburn, prevention of tissue aging and / or tissue rejuvenation,
  • nucleic acid is selected from the group comprising genes for basic DNA protein.
  • the object is achieved in a twentieth aspect by the use of a nucleic acid, its transcription product and or its translation product for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease, the disease being selected from the group consisting of skin diseases, xeroderma pigmentosum and dermis , Skin cancer, skin cancer after sunburn, sunburn, acute wounds and chronic wounds,
  • nucleic acid is selected from the group comprising genes for basic DNA-binding proteins.
  • the acute wound is one selected from the group consisting of acute traumatic wounds, thermal wounds, chemical wounds and surgical wounds.
  • the chronic wound is one selected from the group comprising decubitus, leg ulcers, venous leg ulcers, arterial leg ulcers, diabetic ulcers, decubital ulcers, chronic post-traumatic wound and diabetic foot ,
  • the basic DNA-binding protein is selected from the group comprising high mobility group proteins.
  • the high mobility group protein is selected from the group comprising HMGA, HMGB and HMGN. In one embodiment of the sixteenth to twentieth aspects it is provided that the high mobility group protein is a protein of the HMGA family.
  • the protein is selected from the group comprising HMGAla, HMGAlb and HMGA2.
  • the nucleic acid is selected from the group of nucleic acids, the nucleic acids according to SEQ ID NO. 31 to SEQ LD NO. 64 and their respective derivatives.
  • the translation product is selected from the group consisting of the polypeptides with a sequence according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 30 and their respective derivatives.
  • the protein has a modification, the modification being selected from the group comprising phosphorylation and acetylation.
  • the object is achieved in a twenty-first aspect by a method for tissue regeneration comprising the following steps:
  • nucleic acid is selected from the group comprising genes for basic DNA-binding proteins, and optionally d) obtaining or recovering the regenerated tissue or an intermediate thereof.
  • the method is an in vitro method.
  • the tissue to be regenerated is different or identical to the tissue provided in step a).
  • the tissue to be regenerated and / or the tissue provided in step a) is / are selected independently of one another from the group consisting of skin tissue, fat tissue, knot tissue, muscle tissue, cells of the blood and the blood count and Includes nerve cells.
  • nucleic acid, its transcription product and / or its translation product is such as disclosed herein.
  • the object is achieved in a twenty-second aspect by a method for dedifferentiation and / or reprogramming of cells, comprising the following steps:
  • the nucleic acid being selected from the group comprising genes for basic DNA-binding proteins.
  • the method is an in vitro method.
  • the method further comprises the step:
  • the undifferentiated cell (s) and / or reprogrammed cell (s) and / or the ⁇ ) cell (s) provided according to step a) is / are selected independently of one another from the group which Cells of the epidermis, cells of the skin, cells of the adipose tissue, cells of the cartilage tissue, cells of the muscle tissue, cells of the blood, cells of the hematopoietic tissue and nerve cells.
  • nucleic acid, its transcription product and / or its translation product is such as is disclosed herein.
  • a pharmaceutical formulation comprising a nucleic acid, its transcription product and / or its translation product, as disclosed herein, and a pharmaceutically suitable carrier.
  • a carrier material comprising a nucleic acid, its transcription product and / or its translation product, the nucleic acid, its transcription product and / or its translation product being such as disclosed herein.
  • the carrier material consists of a material which is selected from the group consisting of cellulose, agarose, collagen, silicone, silicon, plastics, gels, hydrogels, matrices Fibrin, kust silk fibers, hydrocolloids, lipocolloids, polyurethane, polyurethane resin, gypsum, synthetic biomaterials, thermoplastics, zinc glue, upholstery foam, polyisobutylene, buffers, stabilizers, bacteriostats and humectants.
  • the carrier material serves as an implant or for wound healing.
  • a wound covering material comprising a basic covering material and a nucleic acid, its transcription product and / or its translation product, the nucleic acid, its transcription product and / or its translation product being such as herein disclosed.
  • the cover material is selected from the group consisting of hydrocolloid dressings, calcium alginate dressings, activated carbon dressings / dressings, foam wound dressings, film dressings, transparent dressings, silicone foam dressings, nonwoven wound dressings, hydrocellular wound dressings, hydroselective wound dressings, absorbent wound pad Spray dressings, artificial silk gauze, cotton gauze, paraffin gauze dressings, silver-coated wound dressings and hydropolymer / foam dressings.
  • a cosmetic formulation comprising a nucleic acid, its transcription product and / or its translation product, the nucleic acid, its transcription product and / or its translation product being such as disclosed herein, and a carrier phase, the carrier phase preferably being selected from the group consisting of creams, fatty ointments, emulsions (oil in water (O / W); water in oil (W / O); water in oil in water (W / O / W )), Microemulsions, modified emulsions, nanoparticles / nanoemulsions, liposomes, hydrodispersion gels (hydrogels, alcohol gels, lipogels, surfactant gels), gel cream, lotions, oils / oil baths and sprays.
  • emulsions oil in water (O / W); water in oil (W / O); water in oil in water (W / O / W )
  • Microemulsions modified emulsions, nanoparticles / nanoemul
  • the object is achieved in a twenty-seventh aspect by a method for screening a compound for promoting and / or inhibiting a process, the process being selected from the group comprising tissue regeneration, repair of DNA damage, wound healing, cell mobility, angiogenesis in the wound bed, epithesis, tissue aging, prevention of tissue aging, tissue rejuvenation, vascularization in heart attack and healing in tooth and bone implants, comprising the following steps:
  • the object is achieved in a twenty-eighth aspect by a method for screening a compound for promoting and / or inhibiting a process, the process being selected from the group consisting of tissue regeneration, repair of DNA damage, wound healing, cell mobility, angiogenesis in the wound bed , Epithesis, tissue aging, prevention of tissue aging, tissue rejuvenation, vascularization in heart attack and healing in tooth and bone implants, comprising the following steps:
  • the object is achieved in a twenty-ninth aspect by a method for screening a compound for promoting and / or inhibiting a process, the process being selected from the group consisting of tissue regeneration, repair of DNA damage, wound healing, cell mobility, angiogenesis in the wound bed , Epithesis, tissue aging, prevention of tissue aging, tissue rejuvenation, vascularization in heart attack and healing in tooth and bone implants, comprising the following steps:
  • the object is achieved in a thirtieth aspect by a method for screening a compound for promoting and / or inhibiting a process, the process being selected from the group consisting of tissue regeneration, repair of DNA damage, wound healing, cell mobility, angiogenesis in the wound bed , Epithesis, tissue aging, prevention of tissue aging, tissue rejuvenation, vascularization in heart attack and healing in tooth and bone implants, comprising the following steps: a) providing a test system for the process;
  • test system is an in vitro test system or an in vivo test system.
  • the reaction from the reference connection and / or the candidate connection is a promotion of the process, and preferably the candidate connection is a connection to promote the process when the reaction the candidate compound in the test system is equal to or stronger than the response of the reference compound.
  • the response from the reference compound and / or the candidate compound is an inhibition of the process, and preferably the candidate compound is a compound to inhibit the process when that of the response of the test system caused by the candidate compound is a lower reaction than the response of the test system caused by the reference compound.
  • the reference compound is a nucleic acid, its transcription product and / or its Translation product, wherein the nucleic acid is selected from the group comprising genes for basic DNA-binding proteins, in particular as disclosed herein.
  • the object is achieved in a thirty-first aspect by using a method according to the twenty-seventh to thirtieth aspect for screening a compound for the treatment and / or prevention of a disease, the test system provided being a test system for the respective disease.
  • the disease is selected from the group that requires repair of DNA damage, requires tissue regeneration, requires wound healing, requires tooth and bone implants, which is associated with tissue aging , Wound healing disorder, skin disorders, xerdoderma pigmentosum, dermis, skin cancer, skin cancer after sunburn, skin aging after sunburn, sunburn and heart attack.
  • a sunscreen comprising at least one nucleic acid, its transcription product and / or its translation product, the nucleic acid being selected from the group comprising genes for basic DNA proteins.
  • the basic DNA proteins are HMG proteins, in particular those as disclosed herein.
  • the object is achieved in a thirty-third aspect by a compound obtainable by a method in accordance with the twenty-seventh to thirtieth aspect or a use in accordance with the thirty-first aspect.
  • the object is achieved in a thirty-fourth aspect by the use of a compound according to the thirty-third aspect for the manufacture of a medicament, preferably for the treatment and or prevention of a disease, as disclosed herein.
  • the object is achieved in a thirty-fifth aspect by a method for treating an organism, characterized in that the organism has an effective amount of a DNA-binding protein, an HMG protein, a nucleic acid coding therefor or a transcription product and / or a translation product, an interacting functional nucleic acid, an interacting peptide or antibody and / or a compound according to the thirty-third aspect is administered.
  • the organism suffers from a disease or there is the possibility of suffering or becoming ill from this disease and the disease is preferably one as disclosed herein.
  • the sunscreen according to the invention is such a means that, by reflection or absorption of radiation, protects the skin from the damaging effect of intense solar radiation with the result of sunburn or erythema
  • the agent according to the invention can be in the form of aqueous, alcoholic, oily solutions, emulsions and lotions, creams, grease sticks, gels, aerosol foam creams and other forms known to those skilled in the art.
  • the sunscreen agents according to the invention can contain light-protection substances and / or reflective compounds.
  • Reflective compounds are, in particular, inorganic substances, such as zinc oxide, iron oxide, titanium dioxide or calcium carbonate.
  • Light stabilizers also known as light filters or UV absorbers, generally act in such a way that UV radiation is converted into harmless heat by radiation-free deactivation.
  • benzophenone derivatives hydroxynaphthoquinones, phenylbenzoxazoles and phenylbenzimidazoles, digalloyltrioleate, aminobenzoic acid esters, salicylic acid esters, alicyclic dienones, zinc acid esters, benzalazine, aromatic urea derivatives, sulfonamides, coumarin derivatives or phenylglyoxylic acid derivatives.
  • Other components can be mink, avocado, almond, sesame, peanut, olive, safflower and / or coconut oils and urocanoic acid. Additional ingredients may include dihydroxy acetone, carotene, walnut shell extract, and other compounds that are particularly useful for promoting skin tanning.
  • the present invention is based on the surprising finding that basic DNA-binding proteins such as the HMG proteins lead to putting a cell into a state which allows dedifferentiation, differentiation and / or redifferentiation or a combination of the processes. Specifically, a dedifferentiation or reprogramming of a cell takes place under the influence of the said proteins, which then allows the cell to differentiate into a state which corresponds to that of the starting cell or that of another cell, ie a cell different from the starting cell. In any case, the cells are put into a reactivated state under the influence of said proteins.
  • the present inventors have found that the said proteins and in particular the HMG proteins are involved in the development of cells and tissues in embryonic and fetal development, whereas they are no longer detectable in most differentiated cells after birth.
  • the mRNA of some HMG proteins can be detected in almost all tissues.
  • expression is limited to mesenchymal derivatives and some epithelial cell tissues.
  • the DNA binding proteins described herein, particularly the HMG proteins described herein, their transcription products, their translation products, functional nucleic acids derived therefrom and their use by the screening methods disclosed herein are compounds identified in a variety of biological processes , which are also referred to collectively as processes. These processes are generally known as such to those skilled in the art.
  • DNA-binding proteins described here in particular the HMG proteins described herein, their transcription products, their translation products, functional derived therefrom
  • Nucleic acids and, using their compounds identified by the screening methods disclosed herein, can be used for the prevention and / or treatment of diseases or pathological conditions or for the production of medicaments for their treatment, in which one or more of the processes mentioned is involved.
  • the diseases disclosed herein are examples of this.
  • translation products, functional nucleic acids derived therefrom and compounds identified using the screening methods disclosed herein are not limited to this.
  • DNA-binding proteins described herein in particular the HMG proteins described herein, their transcription products, their translation products, functional nucleic acids derived therefrom and with their use by the Compounds identified in the screening method disclosed herein can have both an inhibitory and an activating effect, and to the extent that both diseases can be treated in which the said processes are desired and thus should be required or supported by the said compounds, as well as those in which the said Processes are undesirable and should therefore be inhibited by the said compounds.
  • the DNA-binding proteins disclosed herein in particular the HMG protein disclosed herein, the nucleic acid (s) coding for them, and their transcription and Translation product (s) preferably used to promote said processes.
  • the DNA-binding proteins disclosed herein, in particular the HMG protein disclosed herein, the nucleic acid (s) coding for them, and their transcription and translation product (s) also for inhibiting them Processes are used.
  • the DNA-binding proteins disclosed here in particular the HMG protein disclosed herein, the nucleic acid (s) coding for them, and their transcription and translation product (s), as well as their transcription and translation product (s), is typically compensated for, or their active concentration is increased , this additional dose can also lead to an inhibition, for example in the sense of a competitive inhibition.
  • the functional nucleic acids as disclosed herein, in particular the antisense molecules, RNAi, aptamers, Spiegelmers and aptazymes which act against the DNA binding proteins disclosed herein, in particular the HMG proteins disclosed herein, which code for them Nucleic acid (s), as well as their transcription and translation product (s) are directed, preferably lead to an inhibition of the processes that are mediated by them.
  • DNA-binding proteins disclosed herein in particular the HMG protein disclosed herein, the nucleic acid (s) coding for them, and their transcription and translation product (s), antibodies, peptides and compounds which are in the Were identified or obtained within the scope of the screening methods disclosed herein.
  • the antibodies and peptides directed against the DNA-binding proteins disclosed here, in particular the HMG protein disclosed herein, the nucleic acid (s) coding for them, as well as their transcription and translation product (s) are in principle in the same manner and can be used to the same extent as the functional nucleic acids disclosed herein.
  • diseases in which the action of the DNA-binding proteins disclosed herein, in particular the HMG proteins disclosed herein, the nucleic acid (s) coding for them, and their transcription and translation product (s) are to be promoted are, for example, angiogenesis, Heart attack through transmyocardial revascularization, wound healing, angiogenesis around the wound bed, epithesis and healing in tooth and bone implants.
  • the nucleic acid (s) coding for them and their transcription and translation product (s) are to be inhibited are, for example, endometriosis, psoriasis, macular degeneration , in particular age-related macular degeneration, corneal diseases, preferably those of humans and dogs, which are associated with angiogenesis, more preferably the pannus, ie chronic superficial keratitis, histiocytosis, preferably acute forms, preferably those in veterinary medicine.
  • DNA-binding proteins disclosed herein in particular the HMG proteins disclosed herein, the nucleic acid (s) coding for them, and their transcription and translation product (s), the functional nucleic acids, antibodies and peptides directed against them and also the
  • the use of the compounds obtained and / or identified is particularly advantageous if several of the processes involved in a disease are promoted or inhibited by it. Examples include psoriasis, macular degeneration and endometriosis, and the pannus in dogs, in which both inflammatory processes and processes of angiogenesis, caused by the DNA-binding proteins disclosed herein, in particular by the HMG proteins disclosed herein, or the codes for them Nucleic acid (s) are caused, with HMGB protein in particular playing a role here.
  • nucleic acids, peptides and antibodies against or against the transcription product are particularly suitable agents for treatment.
  • the present invention is further based on the surprising finding that members of the HMGA and HMGB families in particular can trigger angiogenesis or neovascularization processes.
  • Angiogenesis is stimulated to an extent comparable to that caused by highly specialized angiogenesis factors such as VEGF.
  • highly specialized angiogenic factors such as VEGF
  • additional effects can be achieved by using HMG proteins, as will be explained below.
  • the present invention is based on the surprising finding that from the group of HMG proteins, in particular HMGB1 and HMGA1, have a strong angiogenic effect and, to this extent, can be used for the treatment of diseases which are related to angiogenesis, as set out here.
  • This use is based on the surprising observation that the angiogenic effects, derived from the rung length of blood vessels, are surprisingly large. In contrast, these effects are not to be expected in the case of HMGB1-induced release of cytokines.
  • necrotic cells in particular necrotic tumor cells, release HMGB1, and to a certain extent also HMGA proteins, and, as extracellular ligands, stimulate endothelial cells for vascular / angiogenesis via the RAGE receptor.
  • This mechanism also means that active substances screened against HMG, in particular HMGB1 and HMGA, here again HMGA1, can be used especially for those tumor diseases which comprise necrotic cells or comprise necrotic tumor cells or the screening methods described here of such molecules will deliver or are able to deliver.
  • nucleic acids for the treatment of tumors, in particular tumors which release HMGB1 and / or in particular The scope also stimulates HMGA proteins and / or as extracellular ligands over the RAGE endothelial cells for vascular / angiogenesis.
  • vasculogenesis ie the formation of new vessels from endothelial progenitor cells that differ in situ
  • angiogenesis ie the formation of new vessels from existing blood vessels.
  • the endothelial cells of mature blood vessels in the adult organism are in a dormant, non-proliferative stage. Only through a certain stimulus, such as B.
  • inflammation, trauma, hypoxia or ischemia they are able to participate in the process of angiogenesis or to stimulate the process of angiogenesis.
  • This is followed by a cascade of various successive processes, which include migration, proliferation and reconnection of endothelial cells.
  • vascular tube is formed.
  • angiogenesis or Neogenesis of vessels that are larger than capillaries also migrate myocytes of the smooth vessel wall muscles, which ensures the stability of the newly formed vessel.
  • Fibroblast Growth Factor FGF
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • transmyocardial laser revascularization TMLR
  • Small channels are created in the heart muscle by laser pulses.
  • the traumatic stimulation of the heart muscle tissue in the vicinity of the channels created in this way leads to angiogenesis in their surroundings, which ultimately leads to improved blood flow to the heart muscle, particularly in the area of the ischemic tissue.
  • Transmyocardial revascularization includes in particular revascularization after myocardial infarction, but also revascularization in earlier stages of heart disease such as ischemia or vascular heart failure.
  • angiogenesis vasculogenesis
  • vascularization vascularization
  • neovascularization vascularization
  • revascularization vascularization
  • Targeted influencing of angiogenesis or neovascularization in the sense of promoting or inhibiting these processes opens up the possibility of treating diseases associated with angiogenesis or neovascularization.
  • diseases can be due to excessive blood vessel formation.
  • An example of this is the prohferative retinopathy diabetica, in which new vessel formation on and in front of the retina can lead to blindness.
  • Another example is the formation of tumors. It is now well known that successful tumor growth requires an adequate supply of nutrients to the cancer cells, which in turn requires an adequate supply of blood vessels to the tumor site. Tumors that are unable to induce an adequate supply of blood vessels are therefore limited in their growth. Conversely, the growth of tumors can be actively limited by preventing the supply of blood vessels.
  • cancer-like diseases have been associated with excessive angiogenesis, for example basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, melanoma, Kaposi's sarcoma and actinic keratomas as a precancer.
  • any type of cancer or tumor can be considered to be associated with excessive angiogenesis.
  • diseases due to excessive angiogenesis are psoriasis and arthritis.
  • diseases should not only be understood to mean diseases or diseases in the classic sense such as, for example, retinopathy, psoriasis or tumors, but in general all conditions whose elimination in the sense of the well-being of a patient is desirable.
  • this also includes artificially induced injury states, such as those that occur, for example, in the context of surgical interventions, for example surgical wounds or wounds that arise from the insertion of prostheses or implants.
  • Angiogenesis also occurs in a controlled manner, coordinated by a number of cytokines and growth factors, in connection with wound healing, a dynamic process with a complex interaction between cells, extracellular matrix, plasma proteins.
  • angiogenesis is to provide supply routes via which cells, nutrients and other substances can be transported into the wound area, these supply routes being able to remain after the healing process has been completed and, if necessary, a reduction in numbers in order to maintain the supply of the healed tissue.
  • wound healing can be roughly divided into the temporally overlapping phases of the inflammatory or exudative phase, the proliferative phase and the differentiation and remodeling phase. The phase division is based on the fundamental morphological changes in the course of the reparation processes, without reflecting the actual complexity of the processes.
  • the process of wound healing can be quantitatively divided into primary and secondary wound healing, with a further distinction being made between delayed primary healing and chronic wound development in order to take into account the therapeutic problems arising from the extent and type of tissue destruction.
  • Primary wound healing is the case, for example, with smooth, closely spaced wound surfaces of a cut without any noteworthy loss of substance and without the incorporation of foreign bodies in a tissue that is well supplied with blood vessels.
  • Primary wound healing is usually given by surgically placed wounds or by occasional wounds from sharp-edged objects. If an infection is to be expected due to the development of the wound, the delayed primary healing occurs. If an infection manifests itself, the wound is classified as secondary healing.
  • a chronic wound can occur in every phase of wound healing and mostly develops from progressive tissue destruction as a result of tissue diseases of different origins, local pressure damage, radiation damage or tumors.
  • wound healing can be based on the distinction between acute wounds and chronic wounds. Acute wounds range from acute traumatic wounds to complex traumatic defects, thermal and chemical injuries / burns and incisions / surgical wounds.
  • wound closure In the case of acute traumatic wounds, if the wound edges can be adapted without tension, if necessary after wound excision, a primary wound closure by means of sutures, staples or wound suture strips takes place. In the case of wounds which present a potential risk of infection, however, the wound is first kept open with sterile, moist bandages until an infection can be ruled out. In the case of secondary healing and more complex wounds, wound closure is much more complex.
  • Chronic wounds are secondary healing wounds that, despite causal and proper local therapy, do not heal within eight weeks. Although chronic wounds can develop from an acute wound at any time, the vast majority of chronic wounds represent the last stage of progressive tissue destruction, which is triggered by venous, arterial or metabolic vascular disorders, pressure damage, radiation damage or tumors. The different types of chronic wounds are caused by different pathologies, the wounds being considered biochemically similar. Local factors that affect wound healing include foreign bodies, ischemia, repeated trauma, and infections. Furthermore, systemic factors such as increased age, Malnutrition, malnutrition, diabetes and kidney diseases all have an impact on wound healing. The most economically relevant chronic wound healing disorders include, among others, venous leg ulcer, arterial leg ulcer, diabetic ulcer, decubital ulcer and chronic post-traumatic wound.
  • a major cause of chronic wounds is an imbalance between repair processes that lead to the formation of new tissue and destructive processes that lead to the removal of the damaged tissue.
  • an increased protease activity for example due to overexpression of matrix metoproteases, can lead to a faulty degradation of the extracellular matrix.
  • matrix metoproteases can lead to a faulty degradation of the extracellular matrix.
  • the said proteins Compared to the use of individual exogenous growth factors, which mostly induce a specific signal cascade, the said proteins have the decisive advantage that they address a whole range of different proliferation-requiring signal transduction pathways as architectural transcription factors and thus have a broader spectrum of activity. Said proteins can be induced by the synthesis of a number of functional proteins in different cells, such as keratinocytes, fibroblasts and endothelial cells. At a later point, the said proteins also intervene in the signal cascade as the initially acting exogenous growth factors, which, moreover, are believed to often be broken down very quickly due to the high protease content of chronic wound fluid.
  • the treatment of the various wounds can basically be divided into passive and active wound therapy. So-called skin replacement procedures can also be used as a special form.
  • passive wound therapy on the one hand, inactive, textile bandages are used, which serve as a covering material to protect against infection.
  • interactive wound dressings are often used to create a moist wound environment and thus to accelerate the healing process.
  • hydrocolloids, hydrogels, hydropolymers and foam dressings as well as calcium alginates are used.
  • the disadvantage of this passive wound therapy is that it does Dressing material does not promote active healing of problem wounds, especially chronic wounds that are often considered resistant to therapy.
  • the high-molecular compounds used in wound healing such as growth factors, cytokines, coagulation factors and the like, mentioned in the prior art, selectively intervene in the process of wound healing or skin aging. If the basic DNA-binding proteins such as the HMG proteins are used, however, as a result of the central mechanism of action of the said proteins, a holistic regeneration of the tissue or of the individual cells can be realized at the very beginning of the differentiation state.
  • the surprisingly observed effect of the said proteins for purposes of wound healing in the broadest sense, as defined here, is based on the following processes or mechanisms, it being possible to rely on the fact that the said proteins are both proliferative and differentiating Remodeling phase of the wound healing process, including building up the granulation tissue, stimulation of angiogenesis, and proliferation and migration of epithelial cells, intervene and can be used for these processes or in processes which are based on these processes.
  • the said proteins or the nucleic acids coding for them in the case of diseases which are connected with these processes or phases, go back to them and / or go back to them causally or symptomatically.
  • Adequate blood flow to the wound area is also essential for the healing process. If this is severely restricted, an adequate wound metabolism cannot be guaranteed and this can lead to a chronic healing process.
  • the basic DNA-binding proteins and in particular the HMG proteins also promote angiogenesis in the wound bed by inducing the proliferation of endothelial cells. After all, the senescence of cells plays a special role in wound healing disorders. An increasing age of dermal fibroblasts correlates with a reduced potential for proliferation. Fibroblasts in chronic wounds show a worsened response to growth factors, which is probably due to an increasing number of senescent cells.
  • the said proteins have the ability to put these cells back into an active state through their reprogramming or "rejuvenating" properties and to reactivate their proliferation.
  • HMG proteins can increase the mobility of cells, so that the HMG proteins also have a positive effect on the migration of epithelial cells.
  • the basic DNA binding proteins have the functions described herein.
  • HMG proteins are named after their high electrophoretic mobility in polyacrylamide gels. They belong to the chromosomal non-histone proteins and are primarily not defined by their protein function, but from the point of view of chemical and physical properties. All members of these proteins are extractable from chromatin by 0.35 M NaCl, are soluble in 2 to 5% perchloric acid, have a high content of charged amino acids and a molecular weight of less than 30,000 Da.
  • the HMG proteins are divided into three subgroups, taking into account sequence homologies and sequence motifs, namely the HMGB (formerly HMG-1/2) family, the HMGN (formerly HMG-14/17) family and the HMGA (formerly HMG-I / Y / C) family.
  • the members of the HMGN family are expressed in all higher eukaryotes. Their molecular weight is between 10,000 and 20,000 Da. They are the only non-histone proteins that bind to the nucleosome nucleus with a higher affinity with their positively charged nucleosome binding domain (NBD) than to histone-free DNA. This binding domain comprises amino acids 12-41 of the HMGN1 protein and amino acids 17_47 of the HMGN2 protein and was also found in the sequence of other proteins; so contains z. B. NBP45 an NBD motif in its primary sequence.
  • the HMGA family consists of three members, namely HMGAla and HMGAlb, which are both splice variants of a gene and the related protein HMGA2, which is encoded by another gene.
  • the average molecular weight of the proteins of the HMGA family is between 10,000 and 12,000 Da.
  • the members of this protein family are usually found only in undifferentiated embryonic cells, in neoplastic cells and in the exponential one Growth phase of differentiated cells. In contrast, they cannot be detected in differentiated cells of normal tissue or can only be detected in low concentrations.
  • HMGA proteins of this family each have 3 separate DNA binding domains, as well as an acidic protein binding domain.
  • the HMGA proteins bind to the small groove of AT-rich DNA. In the case of genes whose promoter / enhancer sequences are located in the vicinity of such HMGA binding sites, the binding of HMGA can lead to an influence on the transcription.
  • the acetylation of HMGA1 plays a crucial role in the regulation of the enhososome complex for the transcription of the interferon-beta (IFN-beta) gene. Further post-translational modifications of the HMGA proteins are phosphorylation, which is dependent on the cell cycle, and ADP ribosylation.
  • the members of the HMGB family are among the most common HMG proteins.
  • the average molecular weight is a maximum of 25,000 Da.
  • HMGB proteins consist of three domains, with the two conservative, highly sequence-homologous domains representing the non-specific DNA-binding region of the proteins. This functional motif is known as an HMG box. HMGB proteins contain two of these HMG boxes, namely Box A and B. The C-terminal region of the HMGB1 protein forms the protein-binding domain of the HMGB proteins. In addition to the HMGB proteins, there are a large number of other proteins in which HMG boxes can be detected. This group of proteins includes SRY, SOX proteins LEF1 and UBF1 (A. D. Baxevanis and D. Landsman: The HMG-1 box protein family: classification and functional relationships. NAR 23, 2002, 1604-1613). The HMGB proteins are structural components of chromatin and are involved in the transcriptional regulation.
  • HMG proteins both the currently known HMG proteins and those still to be found in the future, can be used in the context of the present invention, in particular after carrying out the experiments described here, in order to determine in individual cases whether the specific HMG protein is the corresponding one according to the invention Properties and thus the behavior in the respective application shows.
  • Approximately 15 HMG proteins are currently known.
  • the proteins of the HMGB family, the HMGA family and / or the proteins of the HMGB family are particularly preferred for the uses and applications described herein, the latter in particular in combination with proteins of the HMGA family. It should be within the scope of the present invention that the proteins of the families mentioned can be used not only at the level of the translation products, but also at the level of the transcription products or of the genes or coding sequences.
  • HMG proteins Aberrant transcripts of the HMG proteins are used.
  • Such truncated HMG proteins are described in the literature, including in international patent application WO 96/25493 or WO 97/23611, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
  • Truncated HMG proteins as can be used in the context of the present invention, preferably have the at least exon 1, preferably at least exons 1 to 3 of the HMGA2 gene and further amino acids which are encoded by sequences which come from the regions of different chromosomal translocation partners of chromosome 12 originate. Both these truncated forms and further modifications of the HMG proteins, such as. B.
  • HMGA2-LPP HMGA2-RAD51L1 (described for example in Tkachenko, A et al., Cancer Res 997; 57 (11): 2276-80; Schoenmakers EF et al; Cancer Res 1999 59 (1): 19-23) HMGA1-LAMA4 (described for example in Schoenmakers EF et al. loc. cit.; Tkachenko, A et al, loc. cit.) and SP100-HMGB1, in particular HMGAla, HMGAlb and HMGA2, can be present in the form of derivatives.
  • Such derivatives can be produced, for example, by post-translational modification, such as, for example, acetylation or phosphorylation, or else can be modified by conjugation to other molecules, it being within the scope of the present invention that, when a plurality of proteins are used simultaneously, they are used independently of one another with the same or different modifications can be provided or not all are modified at the same time.
  • Such other molecules can be selected, for example, from the group comprising sugars, lipids, peptides and small organic molecules with a molecular weight of less than 1000.
  • Preferred HMG proteins that can be used in the various aspects of the present invention are each of the following proteins listed in Table 1 that are identified by SEQ ID NOs. 1 to 30 can be designated. Table 1 gives an overview of the SEQ ID NOs., The amino acid length, the access number of the database entry, if available, and the structure of the exon structure and any additional amino acids that may be attached.
  • nucleic acids used in the various aspects of the present invention are those nucleic acids or their transcription products which code for the HMG proteins as described herein and their derivatives. It is within the scope of the present invention that any nucleic acid is encoded which codes for the above-mentioned HMG proteins. Corresponding nucleic acids can be encompassed by the degeneracy of the genetic code. Particularly preferred nucleic acids are those as described herein with the SEQ ID NOs. be designated. Table 2 gives an overview of various, particularly preferred, nucleic acids coding for the DNA-binding proteins.
  • the said nucleic acids are those which hybridize with the nucleic acids described above or their transcription products and / or their complementary strands, in particular under stringent hybridization conditions.
  • stringent hybridization conditions are, for example, those in 0.1 SSC / 0.1% SDS at 68 ° C. (Perfect Hyb TM Plus (hybridization buffer from Sigma)) or in 5 ⁇ SSC / 50% formamide / 0.02% SDS / 2 % Blocking reagent / 0.1% N-lauroylsarcosine at 42 ° C overnight.
  • nucleic acids which have an identity of at least 65, preferably 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 or 99% to the said nucleic acids.
  • transcription product also means in particular the hnRNA or mRNA or cDNA of the nucleic acids coding for HMG proteins, as described herein.
  • inhibitory sequences such as antisense nucleic acids, ribozymes or RNAi derived from the nucleic acid sequence of genes of HMG proteins are used.
  • Antisense nucleic acids which are generally used as antisense oligonucleotides, have base complementarity with a target RNA, preferably the mRNA of a gene to be expressed, and therefore hybridize with this target RNA, whereby the enzyme RNase H is activated and to one Degradation of the nucleic acids leads.
  • Ribozymes are catalytically active nucleic acids, which preferably consist of RNA and have two subregions.
  • the first section is responsible for catalytic activity, while the second section is responsible for one specific interaction with a target nucleic acid is responsible. If there is an interaction between the target nucleic acid and the second part of the ribozyme, which is typically based on hybridization of essentially complementary base regions, then the catalytic part of the ribozyme can hydrolyze the target nucleic acid either intramolecularly or intermolecularly, if the catalytic action of the ribozyme is a phosphodiesterase activity. As a result, the coding nucleic acid is degraded and ultimately the expression of the target molecule is reduced both at the transcriptional level and at the translation level.
  • RNAi is a double-stranded RNA that mediates RNA interference and is typically about 21 to 23 nucleotides in length.
  • One of the two strands of RNA corresponds to the sequence of a gene to be broken down.
  • an RNAi is introduced into a strand, preferably the mRNA of a gene is complementary, the expression of this gene can thus be reduced.
  • the generation and use of RNAi as a medicament or diagnostic agent is described, for example, in international patent applications WO 00/44895 and WO 01/75164.
  • human HMG proteins and the nucleic acids coding therefor are preferably used. Due to the sequence homology and the high degree of conservation of HMG proteins, however, it is also within the scope of the present invention that the said proteins or nucleic acids coding therefor are those which are from organisms or species other than humans come. Those of other mammals are particularly preferred, and of these in particular those of dogs, cats, mice, rats, horses, cattle and pigs. Further sources for the HMG proteins used according to the invention are those of fish, amphibians, reptiles and birds. Fish, in particular saltwater fish, are particularly preferred. Another preferred source are bony and bonefish.
  • the uses and uses according to the invention of the DNA-binding proteins described here, in particular the HMG proteins described herein and the nucleic acid coding for them, including their transcription and / or translation products, extend to a large number of processes.
  • the processes are preferably those selected from the group, angiogenesis, neovascularization, transmyocardial revascularization, wound healing, tissue regeneration, cell mobility, angiogenesis, in particular angiogenesis in the wound bed, epitelization, tissue aging, vascularization, in particular vascularization in heart attack, healing in tooth and Bone implants, dedifferentiation of cells or tissues, differentiation of cells or tissues and combinations of dedifferentiation and differentiation processes.
  • the DNA-binding proteins described here in particular the HMG proteins described here and the nucleic acids coding for them, have the property of initiating, supporting, maintaining and / or continuing one or more of the abovementioned processes, and it also within the scope of the present invention, the abovementioned processes are carried out by means of antisense molecules, ribozymes or RNAi molecules (also generally referred to as functional nucleic acid) based on the nucleic acid sequences of HMG genes or by means of the screening disclosed herein. Method to inhibit identified compounds.
  • the various processes can be carried out simultaneously, but also at different times and, if necessary, overlapping using the said proteins or the nucleic acids coding for them.
  • the application and use of the DNA-binding proteins described herein, in particular the HMG proteins described herein and the nucleic acids coding for the said proteins and the molecules derived therefrom, in particular antisense molecules, ribozymes, RNAi molecules or the inhibitors identified using the screening methods described herein, in particular as defined herein also refers to those diseases that are causally or symptomatically associated with one or more of the processes described herein, or for the production of corresponding medicaments, pharmaceutical formulations or cosmetic formulations.
  • Said application and use according to the invention can be in vivo and / or in vitro and / or in situ. It is within the scope of the present invention that this application or use is disclosed herein regardless of the underlying mechanism.
  • DNA-binding proteins described herein in particular the HMG proteins described herein and the nucleic acids coding for them, including their transcription and / or translation products including the functional nucleic acids disclosed herein and using the The screening methods disclosed herein identify compounds in combination with known angiogenic factors such as VEGF in or relating to the various aspects, in particular application aspects of the present invention.
  • nucleic acids In view of the complex interplay of the factors of blood circulation, the age of fibroblasts located in the wound area and the epithesis of the wound, the use of nucleic acids, transcription or translation products of proteins of the HMGA family together with nucleic acids, transcription is in one aspect of the invention - Or translation products of proteins of the HMGB family provided.
  • nucleic acids, transcription or translation products of proteins of the HMGA family an essentially embryonally expressed protein family
  • cause a dedifferentiation or "rejuvenation" of cells and tissues which Ultimately, the proliferation potential of fibroblasts and the migration of epithelial cells are increased.
  • Nucleic acids, transcription or translation products of proteins of the HMGB family, in particular of HMGBl essentially trigger a signal chain which leads to angiogenesis or neovascularization HMGA family and the HMGB family lead to a synergistic effect with regard to angiogenesis or neovascularization and wound healing.
  • Preferred diseases or diseases for the therapy and / or prevention of which the DNA-binding proteins described herein, in particular the HMG proteins described herein and the nucleic acids coding therefor, as defined herein, and the functional nucleic acids disclosed herein and those using the herein bindings identified can be used or which can be used for the medicaments or pharmaceutical formulations disclosed herein are, in particular, the following: diabetic retinopathy, proliferative retinopathy diabetica, diabetic nephropathy, macular degeneration, arthritis, psoriasis, endometriosis, rosacea, broom travel varices, eruptive hemangioma, cavernous hemangioma, lip angioma, hemangiosarcoma, hemorrhoids, atherosclerosis, angina pectoris, ischemia, infarction, basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, melanoma, Kaposi's sarcoma, tumors, gestosis,
  • DNA damage has a certain special position within the above-mentioned processes in that cell damage appears to be remedied, which would otherwise result in one organic defect.
  • the normally naturally occurring repair of DNA damage can be appropriately supported or initiated.
  • DNA damage occurs especially after UV exposure, but also after exposure to generally high-energy radiation. This includes, among other things, also radioactive radiation, such as occurs in the context of radiation treatment for tumor diseases.
  • Other fields of application include radiation damage due to an accident when handling radioactive substances.
  • the mechanism of the basic DNA proteins and in particular the HMGA proteins on which this process is based seems to be particularly advantageous in that it does not rely on individual components of the repair system, but rather enables the individual cell to be accessed directly by accessing the chromatin will activate their own repair systems and thus create the basis for a more extensive repair program to remove DNA damage.
  • the corresponding application can be carried out both in vitro and in vivo, with the aim of obtaining or restoring cell material which no longer has the DNA damage or at least to a reduced extent.
  • tissues or organs that are provided, for example, by explantation.
  • tissues or organs intended for implantation can be stimulated using the methods according to the invention for angiogenesis or neovascularization.
  • tissues or organs treated in this way have a higher chance of growing into the recipient organism due to the already induced angiogenesis or neovascularization, and of limiting or healing cell or tissue damage that may have occurred during the explantation phase.
  • tissues or organs grown in vitro are stimulated for angiogenesis or neovascularization.
  • cells or tissues are regenerated which are essentially also used as starting material. If, for example, a defective skin tissue is treated in the course of wound healing, skin tissue regeneration will preferably occur, which, without wishing to be determined below, is essentially due to the effects of the HMG proteins described above.
  • Tissue regeneration or reprogramming of the cells involved can be promoted by administering external stimulants. Such stimulants can be provided, for example, by the tissue into which the cell (s) reprogrammed or reprogrammed is inserted.
  • such stimulants in particular chemical compounds, which act or can act as such, individually or in combination, if appropriate as a corresponding precursor, are brought into contact with the reprogrammed cell in order to Direction in which the cell is to differentiate or transform.
  • the angiogenic or neovascularizing effect, the proliferation-promoting effect of the DNA-binding proteins described herein, in particular the HMG proteins described herein, as already mentioned above, and an acceleration of the wound healing process play a major role.
  • the type of scar formation is particularly advantageous when using the said proteins.
  • fetal wound healing there is an extremely rapid wound healing without scarring compared to postnatal healing.
  • active wound healing takes place, which reflects the process of fetal wound healing, occurs when the said proteins are used according to the invention quick and scar-free wound closure.
  • the effect comes into play that under the influence of the DNA-binding proteins used according to the invention and in particular the HMG-binding proteins described herein, the motility of the cells is increased, so that regrowth and ingrowth of teeth and Bone implants are particularly encouraged.
  • the cells treated with the said proteins are thus subjected to a rejuvenation process or a dedifferentiation process, by means of which the cells are able to renew themselves again.
  • the age-related slowdown and reduction in cell renewal which is influenced, among other things, by hormonal changes and hereditary factors, can be counteracted by the basic DNA-binding proteins used according to the invention or the nucleic acids coding for them.
  • damage caused by exogenous factors, such as. B. free oxygen radicals can be reduced by an active cell regeneration induced by the basic DNA proteins, as described herein, eliminated or prevented in their formation.
  • the basic DNA proteins used according to the invention or the nucleic acids coding for them are used to implement preventive and / or causal and not only primarily symptomatic therapy which may actually counteract skin damage that is already present through cell renewal. Furthermore, in the process of influencing tissue aging with the use of said proteins according to the invention, activation of collagen expression takes place, which counteracts the decrease or loss of collagen and thus the main cause of wrinkles.
  • nucleic acids instead of the DNA-binding proteins and in particular the HMG proteins described herein, also nucleic acids, as described above, which code for them, are introduced into the respective cell or into the tissue.
  • the nucleic acids treated in this way are preferably introduced into an expression vector which allows the expression of the nucleic acid in the respective cell or in the tissue with which it has built up, so that the corresponding DNA-binding proteins and in particular the HMG proteins described herein are expressed intracellularly.
  • the corresponding expression vectors for the respective cells are known to those skilled in the art and are described, for example, in Colosimo A. et al. (2000) Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. Review.
  • Suitable viral vectors for the expression of genes are derived, for example. from inactivated viruses, such as, for example, adenoviruses, adeno-associated viruses, Epstein-Barr viruses, He ⁇ es simplex viruses, papilloma viruses, polyoma viruses, retroviruses, SV40 and vaccinia viruses.
  • Suitable plasmid vectors are typically composed of prokaryotic, eukaryotic and / or viral sequences.
  • Examples include pTK2, pHyg, pRSVneo, pACT, pCAT, pCAT-based, pCI, pSI, pCR2.1, pCR2.1-based, pDEST, and pDEST-based.
  • Methods for introducing the respective DNA into said cells or tissues are also known to those skilled in the art, be it that the introduction takes place in situ, in vivo or in vitro.
  • the corresponding methods include, among others, PO 4 precipitation (CaPO 4 , BES-CaPO 4 , SRPO), cationic polymers, liposomes, molecular conjugates (e.g.
  • DNA-binding proteins described here and in particular the HMG proteins described herein can be replaced by a nucleic acid coding therefor, which lead to the expression of the said proteins in an expression system.
  • Suitable expression systems are u. a., cell disruption, cells, tissues and / or organs.
  • nucleic acid (s) is / are selected from the group comprising genes for HMG proteins,
  • DNA-binding proteins described here in particular the HMG proteins described here or corresponding nucleic acids can be used.
  • tissue regeneration in particular in v / tro methods, for tissue regeneration comprises the following steps:
  • the nucleic acid being selected from the group comprising genes for basic DNA-binding proteins,
  • DNA-binding basic proteins or corresponding nucleic acids described herein can be used.
  • the tissue provided is preferably the type of tissue that is to be regenerated. Nevertheless, in view of the mechanism of action of the basic DNA proteins used according to the invention, it is not absolutely necessary that an identity between the tissue used in this step and that provided tissue actually obtained in the end.
  • tissue used in this step can be used to produce muscle cells under the influence of the HMG genes described herein or the proteins or polypeptides described herein.
  • the present inventor assumes that, as a result of the basic DNA-binding proteins used according to the invention, the cell (s) used as the starting cell (s) is converted into the respective cell type via a stem cell-like state / become.
  • the methods described herein also represent a method for the production of Quast stem cells.
  • a tissue can be provided, for example, by biopsy or explantation.
  • the tissue may be incubated with a nucleic acid, its transcription product and / or its translation product, as described or defined herein, to the tissue or a part thereof in such a way that the translation product or the nucleic acid or its transcription product is incorporated into a tissue or more cells of the tissue are made.
  • the nucleic acid is preferably provided in a form which allows one or more cells of the tissue to be transfected. Suitable measures for this are, for example, adding the nucleic acid or its transcription product in the form of or incubating with the aid of a liposome or another form which allows cells to be transfected with nucleic acids.
  • the translation products in particular the HMG proteins used according to the invention, can be introduced into the cell during the incubation using methods known in the art, for example by electroporation, treatment of the cell membrane by means of a bacteriotoxin, such as streptolysin O or protein transduction Domains and peptide carriers.
  • a bacteriotoxin such as streptolysin O or protein transduction Domains and peptide carriers.
  • the above-described method for regenerating tissue can also be used to repair DNA damage or to support the repair of DNA damage in or of cells, or represents such a process.
  • the repair of DNA damage in the epithelial layer of the skin conditioned or promoted Electroporation in which reversible openings (pores) can be created in a membrane with a short electrical impulse (pulse), was first used in the 1970s to introduce xenomolecules into cells.
  • the resulting membrane pores allow both low-molecular substances (e.g. dyes and peptides) and high-molecular substances (e.g. proteins, DNA and RNA) to be introduced into bacterial cells and eukaryotic cells.
  • this method has a relatively low transport efficiency in relation to other methods, the methods and agents described below will preferably be used in the context of a clinical application.
  • Membranes of eukaryotic cells can be removed using a bacterial toxin, such as.
  • B. Permeabilize streptolysin O The transfer of HMG proteins into eukaryotic cells with the help of streptolysin O (SLO) takes place through variations in the Ca 2+ concentration: in the absence of Ca 2+ ions, the cells are lysed and through the subsequent addition of Ca 2+ -Ions the cell pores can be closed again.
  • SLO streptolysin O
  • the optimal SLO concentration for each cell type is specifically determined in the course of routine tests known to those skilled in the art.
  • the active substances disclosed herein ie the HMG proteins and the nucleic acids coding therefor, as described herein, are introduced into skin cells, for example, in order to, for. B stimulate the growth of autologous keratinocytes cultivated in vitro. In this way, highly proliferative cells can be made available to patients with chronic wounds or burn patients as a transplant.
  • Liposomes were first used in 1961 to study ion transport across the cell membrane and were later discovered to be a useful vehicle for drug delivery. However, while the systemic use of drugs encapsulated in liposomes has so far been unsuccessful, the topical application of liposomes in dermatology opens up new opportunities. In addition, liposome-based cosmetics are now being marketed in the United States and Western Europe. In this respect, liposomes represent particularly preferred forms of administration for the administration of the HMG proteins or the nucleic acids coding for them, in particular in the case of the manufacture of medicaments and products for external application described herein. Liposomes are mycelles, which have the same structure as the double lipid layer of the cell membrane and thus, if added in excess, fuse with the cells.
  • Liposomes Active ingredients previously introduced or encapsulated in the hydrophilic phase of the liposomes can therefore be released in the cell.
  • the quantitative release or release of the active substance in the cell can be controlled to a certain extent via the number of lipid double layers.
  • the installation of z. B. ceramides instead of the phospholipid components, ie structures which resemble those of the membrane structures of keratinocytes, the compatibility between liposomes and the skin can be increased.
  • This method is therefore particularly suitable for a preparation to be applied topically with an active ingredient based on the HMG proteins described here and the nucleic acids coding therefor. Due to the small size of the HMG proteins, in particular the HMGA proteins ( ⁇ 12 kDa), these are also particularly suitable for packaging in liposomes.
  • PTDs Protein transduction domains
  • peptide carriers represent an efficient way of transferring the proteins used according to the invention into cells.
  • PTDs are generally short peptides of 10 - 16 amino acids (mostly positively charged lysine and argmin residues) that are covalently linked to the protein to be transported.
  • PTD-mediated transduction takes place via a hitherto little-known mechanism that is independent of receptors, transporters and endocytosis. With the help of PTDs, proteins with a size of up to 700 kDa have already been introduced into cells.
  • the PTDs are particularly suitable for the transport of active pharmaceutical ingredients such as the HMG proteins used according to the invention and the nucleic acids encoding them, as described herein, since the in vivo transduction of proteins in tissues and cells has already been detected.
  • active pharmaceutical ingredients such as the HMG proteins used according to the invention and the nucleic acids encoding them, as described herein, since the in vivo transduction of proteins in tissues and cells has already been detected.
  • this technology is limited in terms of the functionality of the active substance to be transported, which is to be retained in full.
  • preferred embodiments also resort to non-covalent peptide carriers, such as, for. B. the Chariot reagent (Carlsbad).
  • This protein transport system is based on a short synthetic signal peptide (Pep-1) that complexes with the protein to be transported via noncovalent hydrophobic interactions.
  • the transported protein dissociates from the Pepl peptide and will be transported further to the intended intracellular location by cellular transport mechanisms.
  • Another advantage of this method is the high efficiency of transport - depending on the cell type and protein - 60 - 95%. This method is therefore suitable both for use in the context of the proliferation promotion mediated by the HMG proteins in autologous skin cells cultured in vitro and also in the context of a corresponding preparation to be applied topically with one or more of the active ingredients described herein.
  • the tissue is incubated with the nucleic acid, its transcription product and / or its translation product under conditions which allow it to be absorbed into the cell or tissue.
  • the incubation is preferably carried out at 37 ° C. under physiological conditions.
  • the present invention relates to a method, in particular an in vitro method, for differentiating, dedifferentiating and / or reprogramming cells, comprising the steps:
  • nucleic acid, its transcription product and / or its translation product incubating the cell and the nucleic acid, its transcription product and / or its translation product, wherein the nucleic acid, its transcription product and or its translation product can be selected as explained in connection with the other aspects above.
  • the cell provided can in principle be any cell, in particular a mesenchymal cell such as a fat cell, knobby cell or muscle cell.
  • the present invention relates to a pharmaceutical formulation which comprises one or more nucleic acid (s), its transcription product (s), its translation product (s), the functional nucleic acids and the compounds identified using the screening method according to the invention, as herein and comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical formulation can be one that is designed for the various forms of application. Such forms of application include in particular topical application and subcutaneous application. The same applies to the cosmetic formulation according to the present invention.
  • Suitable pharmaceutical carriers or also cosmetic carriers can be used as suitable pharmaceutical carriers or also cosmetic carriers, as regulated, for example, in the regulation on cosmetic products of June 19, 1995 for the Federal Republic of Germany: buffers, stabilizers, bacteriostatics, alcohols, bases, acids , Starch, humectants, creams, fatty ointments, emulsions (oil in water (O / W); water in oil (W / O); water in oil in water (W / O / W)), microemulsions, modified emulsions, nanoparticles / Nanoemulsions, liposomes, hydrodispersion gels (hydrogels, alcohol gels, lipogels, surfactant gels), gel creams, lotions, oils / oil baths and sprays.
  • buffers stabilizers, bacteriostatics, alcohols, bases, acids , Starch, humectants, creams, fatty ointments, emulsions (oil in water (
  • the pharmaceutical formulations according to the invention can, in addition to the DNA-binding proteins used according to the invention, in particular the HMG proteins described herein or the nucleic acid (s) coding therefor, or the inhibitory nucleic acids derived from the nucleic acid sequence of these proteins, such as antisense nucleic acids, ribozymes or RNAi contain other active ingredients.
  • Pharmaceutical or cosmetic formulations which contain at least one HMG protein or a nucleic acid coding therefor are in particular ointments, creams and gels.
  • the present invention is further based on the surprising finding that the DNA-binding proteins described here, in particular the HMG proteins described herein, show a spontaneous transfer into animal cells, in particular epithelial cells and very particularly preferably into human epithelial cells.
  • the said proteins are preferably located in a carrier medium which supports them spontaneous transfer calls.
  • Such transfer media are, for example, aqueous or alcoholic solutions or suitable emulsions or other phases or phase mixtures.
  • any of the prior art Technique known application methods are used.
  • intradermal, subcutaneous intramuscular or intravenous or intraarterial application can be carried out via injection syringes, or an application can be made directly into the target tissue.
  • Catheter probes or direct application of an exposed target tissue can also be used.
  • the application method used will normally depend on the target tissue.
  • a formulation according to the invention via catheters, cannulas or a combination instrument is preferred which, for example, also enables the administration of laser beams as part of the TMLR.
  • the present invention relates to cells which can be obtained by the method according to the invention and tissues which can be obtained by the method according to the invention.
  • the invention relates to carrier material which comprises one or more nucleic acids, their transcription product (s), their translation product (s), one or more of the functional nucleic acids described herein and / or one or more of those described herein using the invention
  • Compounds identified screening method comprises, wherein the nucleic acid (s), their transcription product (s) and / or their translation product (s) can be those as described herein.
  • the carrier material is used in particular as an implant or as a covering material, preferably for wound healing, but also for any other of the diseases or conditions described here or the other applications described here, with the provision of a surface on or on which the basic DNA-binding Proteins as described herein, covalently or non-covalently linked, are linked.
  • any materials can be used for this purpose, for implant materials or as a covering or carrier material for wound healing or for the other applications described herein, with the provision of a surface on or on which the DNA-binding proteins, in particular HMG proteins, as described herein, are covalently or non-covalently linked, are linked, as known in the art, are already in use, including but not limited to hydrocolloids, hydrogels, hydropolymers, foam dressings, calcium alginates, activated carbon, Foam, foils, silicone foam, fleece fabrics, rayon, cotton gases, rubber, paraffin and paraffin gases.
  • Suitable plastics are polyethylenes, polyvinylenes, polyamides and polyurethanes.
  • the nucleic acids and DNA-binding proteins used in accordance with the invention are preferably absorbed in a non-covalent manner on the carrier material.
  • these are covalently bound and / or under the respective conditions of use the same is released from the actual carrier material. Suitable uses are known to those skilled in the art.
  • a special form of the carrier material is the wound covering material, which consists of a basic covering material and one or more nucleic acid (s), their transcription product (s) and or their Translation product (s) exists, which are designed as described herein.
  • the base cover material can be a carrier material in the sense described here.
  • the present invention relates to a method for screening a compound, the compound serving to promote and / or inhibit a process.
  • the process can be any of the processes, individually or in any combination, as described herein, in particular the process can be selected from the group of tissue regeneration, wound healing, cell mobility, repair of skin damage, angiogenesis, angiogenesis in the wound bed, Epithesis, tissue aging, change in tissue aging, tissue rejuvenation, vascularization, neovascularization, vascularization in heart attack and healing in tooth and bone implants.
  • the process can generally be one which comprises reprogramming, redifferentiation or dedifferentiation, possibly with subsequent re-differentiation.
  • the method according to the invention for screening a compound provides that the following steps are carried out:
  • a test system is preferably one which allows the respective process to be represented, in particular to be represented under the influence of a compound which is suspected of either promoting or inhibiting the process, a so-called candidate compound, and / or under the influence of a reference connection.
  • Such systems are known to those skilled in the art.
  • Such preferably comprises one Test system one or more cells, optionally a tissue or tissue, which contain said cell (s), the behavior of the cells or tissue being examined.
  • the behavior is in particular one or more of the following processes: growth of the cells or the tissue, differentiation of the cell or the tissue, and the various facets or aspects thereof, such as, but not limited to, dedifferentiation and differentiation, preferably again differentiation, migration of cells, release of signaling molecules, angiogenesis or neovascularization of tissues.
  • Such parameters can be, for example, biochemical, genetic, molecular genetic, molecular biological, histological, cytological, physiological and phenotypic parameters.
  • Biochemical parameters can be, for example, metabolic pathways, typical educts as well as products thereof, which are directly or indirectly connected to the processes mentioned.
  • Genetic and molecular genetic parameters are preferably those which are linked to the said processes at the nucleic acid level, both genomic nucleic acid and hnRNA, mRNA and the like.
  • the occurrence of a corresponding nucleic acid is measured as a genetic parameter, the disappearance of a corresponding nucleic acid, or its quantitative change when promoting or inhibiting said processes.
  • Molecular biological parameters can be used to link proteins to the processes in question via their occurrence and disappearance.
  • Physiological parameters can be the behavior, in particular the response behavior, of the cells or the tissue to stimuli, such as biological, chemical or physical stimuli, which depend on the respective test system, ie the cells or the tissue, depending on the process or its promotion or inhibition are answered differently.
  • a reference connection is provided and the reference connection is brought into contact with the test system, ie the reference connection is tested in the test system.
  • This contacting preferably takes place in that the reference compound, preferably in the form of a solution, more preferably in Solution present in a buffer, which is associated with the test system, is preferably added to the culture medium.
  • the reference connection is brought into contact with the test system in a site-specific manner, for example the reference connection is introduced into certain cells of the tissue or else into certain compartments of the cell (s).
  • reference compounds can be injected via microinjection into defined areas or compartments of the cell, as described, for example, in Wang B et al (2001) Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev 60: 433-8.
  • methods are available for treating or modifying reference compounds, for example via amino acid transporters, so that the reference compounds are specific cells, such as, for example, fibroblasts, as described, for example, in Palacin M et al. (1998) Molecular biology of mammalian plasma membrane amino acid transporters.
  • Physiol Rev 78: 969-1054 or specific cell compartments, such as the nucleus, as described, for example, in Chaloin L et al. (1998) Design of carrier peptide-oligonucleotide conjugates with rapid membrane translocation and nuclear localization properties. Biochem Biophys Res Commun 243: 601-608, or the mitochondria, as described for example in Pain D et al. (1991) Machinery for protein import into chloroplasts and mitochondria. Genet Eng (NY) 13: 153-166. Zeil-specific or compartment-specific administration can also be for the candidate compound, as described herein.
  • the reaction caused by the reference connection in the test system is determined.
  • the parameters mentioned above can preferably be used to determine the influence of the reference connection in the test system.
  • the candidate compound is then provided and, like the reference compound, tested in the test system.
  • the reaction caused by the candidate connection in the test system is then determined, it being possible in principle to use the parameters discussed in connection with the reference connection.
  • the reaction of the Test system expressed by the parameters mentioned above, compared under the influence of the reference connection with the behavior of the test system under the influence of the candidate connection in the test system.
  • a candidate connection is referred to as a connection for promoting one or more of said processes if the respective process causes the same reaction or a stronger reaction in the test system than the reference connection under the influence of the candidate connection.
  • a candidate compound is a compound for inhibiting one or more of said processes if the candidate compound causes a reaction in the test system that is less than the corresponding reaction of the reference compound. It is within the scope of the present invention that one and the same candidate compound shows entirely different effects in terms of inhibition or promotion for one process compared to another of the processes mentioned above. It is also within the scope of the present invention that the chronological sequence of testing the reference connection and the candidate connection can also be reversed.
  • a test system for the process is again provided and then a reference connection.
  • the reference connection is then provided with a marking.
  • any markings are suitable, in particular those which comprise or permit radioactive, fluorescent, immunological, enzyme or affinity labeling.
  • Radioactive labels are in particular 1H, 3 H, 35 S, 32 P, 33 P, 125 I, 51 Cr, 13 C and 14 C, fluorescent labels include labels with fluorescein, fluorescamine, isocyanate, luciferase, Rhodamm, Texas Red, Cy3 and Cy5.
  • the immunological labels include the immunoglobulins IgM, IgA, IgD, IgE and IgG, including, but not limited to, IgGl, IgG2a and IgG2b.
  • Enzyme labels include, in particular, alkaline phosphatase and peroxidase.
  • Affinity tags include GST and His-Tag tags, as well as tags about biotin and digoxigenin.
  • the label will be one that does not adversely affect the reaction that the reference compound causes in the test system. A reference compound marked in this way is then, as described above, tested in the test system and the reaction it causes is determined in the test system.
  • a candidate connection is then made available and this also in the Test system tested as described above, the test system containing the reference compound during testing of the response caused by the candidate compound. It is preferred that the testing is carried out under conditions which ensure that the reference compound is still biologically active, ie shows the promoting or inhibiting effect.
  • the reaction of the test system is again determined, it being possible in principle for the biochemical parameters described above to be used.
  • the amount of reference compound released is determined by means of the corresponding label or else the released label as such.
  • the candidate compound is marked.
  • the candidate connection is provided and then the test system is tested and the reaction caused by the candidate connection in the test system is determined with subsequent provision of a reference connection, followed by testing the reference connection in the Test system, wherein the test system contains the candidate compound, in particular under conditions which ensure that the reference compound is physiologically active, and determines the reaction of the test system, in particular the amount of candidate compound released and / or released labeling of the candidate - Connection is determined.
  • the said parameters can be determined, as described above, in order to characterize the reaction of both the reference compound and the candidate compound to the respective process. It is also within the scope of the present invention if the order of addition of candidate compound and reference compound is reversed, regardless of which of the compounds is provided with a label.
  • the reference connection displaces the candidate connection, in the second case the candidate connection displaces the reference connection.
  • the respective other compound is also one Mark carries, hereinafter also referred to as the second mark, wherein the first and the second mark are preferably different from each other.
  • the reference compound is a nucleic acid, or its transcription product or its translation product, if appropriate a combination thereof, the nucleic acid is one selected from the group comprising genes for DNA binding proteins and HMG proteins.
  • DNA-binding proteins and HMG proteins are those as described here, in particular those according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 30 or the nucleic acids coding for proteins according to SEQ ID No. 31 to 64 and those as shown in Tables 1 and 2 respectively.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of DNA-binding proteins, in particular HMG proteins or the nucleic acids coding for them and preferably the molecules which interact with them and which preferably antagonize them in order to inhibit certain biological processes.
  • This inhibition makes it possible to prevent or treat diseases that are causally or symptomatically related to these processes.
  • diseases include, but are not limited to, tumors, tumor diseases, histiocytosis, inflammatory diseases, inflammation and arthritis, which are also referred to herein as "diseases mentioned above”.
  • the diseases mentioned above can be both corresponding human diseases and also act on corresponding diseases of animals, in particular pets, zoo animals, farm animals and act like that.
  • DNA-binding proteins and in particular HMG proteins include all such proteins, in particular the HMG proteins, HMG peptides and fragments thereof described here, and the nucleic acid coding therefor. Unless explicitly stated otherwise herein, proteins also refer to polypeptides and vice versa. In particular, the term HMG proteins also designates HMG peptides and fragments thereof.
  • a further aspect of the present invention relates to means for preventing and / or treating the above diseases.
  • Such agents are preferably those which inhibit or antagonize the action of the DNA-binding proteins, in particular the HMG proteins or the nucleic acids coding for them.
  • Corresponding agents are polypeptides which bind to DNA-binding proteins, in particular the HMG proteins or nucleic acids coding therefor, as well as antibodies which bind to DNA-binding proteins, in particular the HMG proteins or nucleic acids coding therefor.
  • Other means that can be used to prevent or treat these diseases are siRNA or RNAi, aptamers, Spiegelmers, antisense molecules and ribozymes.
  • the present invention also relates to the use of such agents for the manufacture of medicaments, in particular medicaments for the treatment of the abovementioned diseases.
  • Any DNA-binding protein disclosed herein, in particular HMG protein, fragment thereof or a nucleic acid coding for the protein or fragment thereof, as disclosed in particular herein, serves as the target molecule or basis for the production. It is particularly preferred that the protein is HMGBl and parts thereof, in particular the A domain of HMGBl.
  • the agents according to the invention which can be used according to the invention for the production of medicaments for the treatment and / or prevention of the abovementioned diseases, are thus an antibody against DNA-binding proteins, in particular HMG proteins or fragments thereof, peptides which bind to DNA-binding proteins, in particular HMG proteins or fragments thereof, siRNA which is directed against mRNA of DNA-binding proteins, in particular HMG proteins or fragments thereof, antisense molecules which are against those for DNA-binding proteins, in particular HMG -Proteins or Nucleic acids coding fragments thereof, in particular mRNA or hnRNA, are directed, antisense molecules which are directed against nucleic acids coding for DNA-binding, in particular HMG proteins or fragments thereof coding nucleic acids, in particular mRNA or hnRNA, ribozymes which are directed against DNA-binding Proteins, in particular HMG proteins or fragments thereof, encoding nucleic acids, in particular mRNA or hnRNA. Furthermore, the agents
  • Antibodies as used herein are preferably monoclonal antibodies that can be prepared according to the Caesar and Milstein protocol and further developments thereof. Antibodies are also antibody fragments or derivatives, such as, for example, Fab fragments, Fc fragments, but also single-stranded antibodies, as long as they are generally able to specifically bind HMGB. In addition to monoclonal antibodies, polyclonal antibodies can also be used. A polyclonal antibody for basic research that could in principle also be used as a drug is, for example, the anti-HMGBl antibody sc-12523 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). The antibodies used are preferably human or humanized antibodies.
  • Peptides or polypeptides which interact with a DNA-binding protein can be screened using methods known in the art, for example phage display. These techniques are known to those skilled in the art.
  • the generation of such peptides is typically carried out in such a way that a peptide library is created, for example in the form of phages, and this library is brought into contact with a target molecule, ie a DNA-binding protein, in particular an HMG protein , preferably with HMGBl.
  • the binding peptides are then typically removed as a complex together with the target molecule from the non-binding members of the library.
  • binding properties depend at least to a certain extent on the specific test conditions, such as salt content and the like.
  • Binding peptides from the non-binding members of the library or from the target molecule can then be characterized.
  • An amplification step may be required before the characterization, for example by increasing the corresponding phages encoding the peptide or peptides.
  • the characterization preferably comprises the sequencing of the peptides binding to the respective DNA-binding protein, in particular to the respective HMG.
  • the length of the peptides is basically not limited. Typically, however, peptides with a length of 8 to 20 amino acids are obtained or used in such processes.
  • the size of the libraries is 10 2 to 10 18 , preferably 10 8 to 10 15 different peptides.
  • polypeptides that bind to target molecules are the anticalins, as described, for example, in German patent application DE 19742 706.
  • Small molecules can also be used which antagonize the action of the DNA-binding proteins, in particular the HMG proteins or the nucleic acid coding for them.
  • Such small molecules can be identified, for example, by a screening method, in particular a screening of libraries of small molecules.
  • the target molecule is brought into contact with a library and those members of the library that bind to it are determined, if necessary separated from the other members of the library or from the target and optionally further characterized. Again, the characterization of the small molecule will be done according to procedures known to those skilled in the art, e.g. the compound is identified and the molecular structure determined.
  • These libraries have as few as two and as many as several 100,000 members.
  • Aptamers are D-nucleic acids, either single-stranded or double-stranded, that specifically bind to a target molecule.
  • the production of aptamers is described, for example, in European Patent EP 0 533 838. The procedure is as follows:
  • a mixture of nucleic acids ie potential aptamers, is provided, each nucleic acid consisting of a segment of at least eight successive, randomized nucleotides and this mixture with the target, in the present case thus with DNA-binding proteins, in particular HMG proteins, nucleic acids coding for them, interaction partners of DNA-binding proteins, HMG interaction partners, in particular the natural ones Interaction partners and / or nucleic acids coding for them is brought into contact, nucleic acids which bind to the target are separated from the rest of the candidate mixture, if appropriate on the basis of an increased affinity compared to the candidate mixture, and the resultant nucleic acids are isolated to the target, if necessary with a higher affinity or force, binding nucleic acids are amplified.
  • aptamers which bind specifically to the respective target or target molecule are obtained at the end of the method. It is within the scope of the present invention that these aptamers can be stabilized, for example by introducing certain chemical groups, as is known to those skilled in the field of aptamer development. Aptamers are currently used therapeutically. It is also within the scope of the present invention that the aptamers thus produced are used for target validation and as lead substances for the development of medicaments, in particular of small molecules.
  • the production or production of Spiegelmers is based on a fundamentally similar principle.
  • the DNA-binding proteins in particular the HMG proteins, the nucleic acids coding for them, the interaction partners of DNA-binding proteins, HMG- Interaction partners, in particular the natural interaction partners, and / or the nucleic acids coding for them can be developed as the target molecule.
  • the production of Spiegelmeres is described, for example, in international patent application WO 98/08856.
  • Spiegelmers are L-nuclear acid, ie they consist of L-nucleotides, and are essentially characterized by the fact that they have a very high stability in biological systems and at the same time, like the aptamers, can specifically interact with or bind to a target molecule.
  • the procedure is more precisely such that a heterogeneous population of D-nucleic acids is generated, the population is in contact with the optical antipode of the target molecule, in the present case thus with the D-enantiomer of the naturally occurring L-enantiomer, and then those D- Nucleic acids are separated which have not interacted with the optical antipode of the target molecule, the D-nucleic acids which have interacted with the optical antipode of the target molecule are determined, if necessary separated and sequenced and then L-nucleic acids are synthesized, the sequence of which is identical to that previously determined for the D nucleic acids. Similar to the process for the production of aptamers, it is also possible here through repeating the steps several times, ie to enrich or generate suitable nucleic acids.
  • Another class of compounds which can be produced or developed using the DNA-binding proteins, in particular the HMG proteins and the nucleic acids coding therefor, are ribozymes, antisense oligonucleotides and RNAi.
  • Ribozymes are catalytically active nucleic acids, which are preferably made up of RNA and consist of two parts. The first part is responsible for catalytic activity, whereas the second part is responsible for a specific interaction with a target nucleic acid. If there is an interaction between the target nucleic acid and the second part of the ribozyme, typically by hybridization of base regions that are essentially complementary to one another, the catalytic part of the ribozyme can hydrolyze the target nucleic acid either intramolecularly or intermolecularly, the latter being preferred in the event that the catalytic action of the ribozyme is a phosphodiesterase activity.
  • the coding nucleic acid is degraded, possibly further, with the titer of the target molecule being reduced both intracellularly and extracellularly at the nucleic acid and protein levels, thus providing a therapeutic approach for diseases of the endometrium.
  • Ribozymes their use and construction principles are known to those skilled in the art and are described, for example, in Doherty and Doudna (Ribozyme structures and mechanisms. Annu Rev Biophys Biomol Struct 2001; 30: 457-75) and Lewin and Hauswirth (Ribozyme gene therapy: applications for molecular medicine. Trends Mol Med 2001, 7: 221-8).
  • antisense oligonucleotides for the production of a medicament or diagnostic agent is based on a basically similar mechanism of action.
  • antisense As a result of base complementarity, oligonucleotides typically hybridize with a target RNA, normally with mRNA, and thereby activate RNAaseH. RNAaseH is activated by both phosphodiester and phosphorothioate-coupled DNA. However, phosphodiester-coupled DNA is rapidly degraded by cellular nucleases with the exception of phosphorothioate-coupled DNA. These resistant, non-naturally occurring DNA derivatives do not inhibit RNAaseH when hybridized to RNA.
  • antisense polynucleotides are only effective as a DNA-RNA hybrid complex.
  • antisense oligonucleotides can be found, inter alia, in US Pat. No. 5,849,902 or US Pat. No. 5,989,912.
  • the essential concept of the antisense oligonucleotides is to provide a complementary nucleic acid against certain RNA.
  • suitable antisense oligonucleotides can be produced by base complementarity, which lead to a degradation of the coding nucleic acid, in particular the mRNA.
  • RNAi is a double-stranded RNA that mediates RNA interference and is typically about 21 to 23 nucleotides in length. One of the two strands of RNA corresponds to a sequence of a gene to be degraded.
  • RNAi as a medicament or diagnostic agent is described, for example, in international patent applications WO 00/44895 and WO 01/75164.
  • ribozymes, antisense oligonucleotides and RNAi it is therefore within the scope of the present invention, in addition to the DNA-binding proteins, in particular the HMG proteins, in particular HMGBl, and their, in particular, natural interaction partners, the nucleic acids coding therefor, in particular the mRNA, for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of the abovementioned diseases, namely tumors, tumor diseases, histiocytosis, inflammatory diseases, inflammation and arthritis, or for the manufacture thereof a diagnostic agent for the diagnosis of the aforementioned diseases and the monitoring of the course of the disease or the therapy used, either directly or as a target molecule.
  • the DNA-binding proteins in particular the HMG proteins, in particular HMGBl, and their, in particular, natural interaction partners
  • the nucleic acids coding therefor, in particular the mRNA for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of the abovementioned diseases, namely tumors, tumor diseases,
  • the aforementioned classes of compounds i.e. H. Antibodies, peptides, anticalins, small molecules, aptamers, Spiegelmers, ribozymes, antisense oligonucleotides and RNAi, which are directed against the DNA-binding proteins, in particular the HMG proteins, fragments thereof or nucleic acids coding therefor, and preferably the effect of these proteins or antagonize the nucleic acids coding therefor, are used for the production of medicaments for the treatment and / or prevention, in particular of tumors, tumor diseases, histiocytosis, inflammatory diseases, inflammation and arthritis.
  • H. Antibodies, peptides, anticalins, small molecules, aptamers, Spiegelmers, ribozymes, antisense oligonucleotides and RNAi which are directed against the DNA-binding proteins, in particular the HMG proteins, fragments thereof or nucleic acids coding therefor, and preferably the effect of these proteins or antagonize the nucle
  • these drugs or agents can be used not only for the treatment of the abovementioned diseases, but also for diagnostic purposes, and consequently the abovementioned agents can also be used as diagnostics or diagnostic agents, preferably for tumors, tumor diseases, histiocytosis, inflammatory diseases, inflammation and arthritis.
  • the pharmaceutical or diagnostic compositions containing these agents comprise, in addition to one or more of the compounds mentioned above or produced as disclosed herein, other pharmaceutically or diagnostically active compounds or agents, and preferably at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • Such carriers can be, for example, liquid or solid, for example a solution, a buffer, an alcoholic solution and the like.
  • starch and the like can be considered as suitable solid carriers. It is known to the experts in the field of pharmaceutical dosage forms how the corresponding compounds of the different classes have to be formulated in order to be able to be administered by the respectively desired route of administration, for example orally, parenterally, subcutaneously, intravenously and the like.
  • the cell surface receptor RAGE or fragments thereof can also be used for these purposes, ie as an agent for the preparation of a diagnostic agent for tumors, tumor diseases, histiocytosis, inflammatory diseases, inflammation and arthritis or a medicament for the treatment and / / or prevention of tumors, tumor diseases, histiocytosis, inflammatory diseases, inflammation and arthritis can be used.
  • the receptor or the fragments derived therefrom, can antagonize the action of the HMG proteins, in particular the HMGB1 protein, as a result of preferably competitive inhibition, without wishing to be bound to this in the following.
  • DNA-binding proteins in particular HMG proteins, in particular HMGBl
  • RAGE receptor for advanced glycation end products
  • Taguchi et al. Taguchi, A, Blood, DC, del Toro, G., Canet, A., Lee, DC, Qu, W., Tanji, N., Lu, Y., Lalla, E., Fu, C, Hofmann, MA, Kislinger, T., Ingram, M., Lu, A., Tanaka, H., Hori, O., Ogawa, S. Stern, DM, Schmidt, AM (2000). Nature 405: 354-360 ).
  • HMG proteins also referred to herein, are especially those disclosed herein, but are not limited to them.
  • DNA-binding proteins is used synonymously with the term basic DNA proteins.
  • FIG. 2 shows a diagram with rung lengths from spheroids after treatment with VEGF or HMGA1 protein
  • FIG. 4 shows an immunofluorescence image of Heia cells, some of which have fluorescent-labeled HMGAlb protein in the cell nuclei;
  • FIG. 5 shows an immunofluorescence image of fibroblasts which have partially fluorescent-labeled HMGAlb protein in the cell nuclei
  • FIGS. 4 and 5 shows a fluorescence image of cells which have taken up pure fluorescein as a negative control to the images shown in FIGS. 4 and 5;
  • FIG. 7 shows a light micrograph of a piece of skin treated with HMGA protein, from which various skin cell types such as keratinocytes and fibroblasts grow.
  • Fig. 8 is a light micrograph of a frozen section through the skin of the rat to demonstrate the transfer of labeled HMGAlb protein after streptolysin O treatment.
  • the cells in particular primary human fibroblasts, primary human chondrocytes, primary human keratinocytes, murine keratinocytes (MSC-P5, Cell Lines Service and Cellbank, Heidelberg) and human HeLa cells (ECACC N 85060701) are spread evenly on 6-well plates with 2.5 ml each of Medium 199 (Gibco-BRL; with 5% fetal calf serum) distributed per well and incubated overnight up to a cell density of approx. 50 - 70% at 37 ° C and 5% CO 2 fumigation.
  • a cell-free space is created in the middle of the wells using a cell scraper to simulate an artificial wound.
  • the cells are washed twice with lxPBS in order to remove medium residues which contain Ca 2+ ions.
  • the cells are lysed by streptolysin O (Streptolysin O Reagent, Sigma-RBI) in Ca 2+ -free PBS buffer (biochrom).
  • streptolysin O Streptolysin O Reagent, Sigma-RBI
  • Ca 2+ -free PBS buffer biochrom
  • 1 ml of the PBS / streptolysin mixture with the desired concentration of the HMG protein to be tested (e.g. 100 ng / ml, 200 ng / ml and 10000 ng / ml HMGAla) per well is applied to the fibroblasts or epithelial cells or keratocytes given.
  • 3 ml of ice-cold medium 199 (with 5% fetal calf serum and 1.8 mM Ca 2+ ) are added in order to close the cells again.
  • the cells are incubated for 2 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 fumigation.
  • the various batches are then replaced by 2.5 ml of Irish medium and continue to be incubated as before until evaluation.
  • the cells are assessed microscopically with regard to their morphology and the colonization of the cell-free space. Furthermore, the methanol is fixed Cells with subsequent Giemsa staining (2% Giemsa solution) to determine the number of mitoses compared to the total number of cells.
  • the cells were incubated in Leighton tubes with coverslips (each with 1 ml of medium 199 overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 ).
  • the cells were washed twice with 1 ml PBS at room temperature. 200 ⁇ l of serum-free medium and 6 ⁇ g of labeled HMGA protein or, as a negative control, 6 ⁇ g of fluorescein solution were then added to the cells. The mixture was incubated for 1 h protected from light at 37 ° C. under 5% CO 2 . After the incubation, 250 ⁇ l of medium were added and a further incubation of 2 h 30 min was carried out. Then the coverslips are briefly washed in PBS and covered to OT. The evaluation took place after approx. 4 h.
  • hot cells and fibroblasts were incubated in Leighton tubes, each with 1 ml medium 199 o / n at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the hela cells were cultivated in medium with 20% fetal calf serum, the fibroblasts with 5% calf serum.
  • the cells are washed twice with PBS.
  • the streptolysin O thawed at RT was diluted with PBS to a concentration of 0.1 U / ml.
  • 350 ⁇ l of the diluted streptolysin O and 6 ⁇ g of labeled HMGAlb protein or, as a negative control, 6 ⁇ g of FLUOS solution were then added to the Heia cells and the fibroblasts.
  • the mixture was incubated for 15 min at RT with protection.
  • the cells were closed again by adding 1 ml of ice-cold medium 199 (with 20% fetal calf serum for the Heia cells and 5% calf serum for the fibroblasts). After an incubation of 1 h 30 min at 37 ° C and 5% CO 2 , the coverslips are briefly washed in PBS and then covered to OT. The evaluation took place after approx. 2 h.
  • the skin samples are taken sterile and stored in Hanks solution (biochrom) for transport and until the start of the experiment.
  • Hanks solution biologicalchrom
  • the skin is cut into pieces of approximately 0.5-1 mm in size and distributed on Sarsted tubes.
  • the skin pieces are washed three times in lxPBS by centrifugation for 5 min at 120 ⁇ g and RT until all medium residues have been washed out. After the last centrifugation step, the supernatant is completely removed and the skin pieces for 15 min at RT in 1 ml SLO / PBS solution (0.1 U SLO / 1 ml PBS) and 100 ng / ml of the respective HMG protein (HMGAla, HMGAlb , HMGA2) incubated per batch.
  • the freshly removed rat skin was cut into small pieces in medium 199 with 20% fetal calf serum using sterile preparation cutlery, which corresponded to a size of approx. 1-2 mm 2 .
  • the skin fragments were washed four times with PBS in order to remove all medium or Ca 2+ residues.
  • the skin pieces were then transferred to an Eppendorf cup and 350 ⁇ l of the diluted streptolysin O (0.1 U / ml) and 6 ⁇ g of labeled HMGAlb protein or, as a negative control, 6 ⁇ g of FLUOS solution were added to the skin pieces.
  • the mixture was incubated for 15 minutes at RT, protected from light.
  • the cells were closed again by adding 1 ml of ice-cold medium 199 (with 20% fetal calf serum). After an incubation of 1 h 30 min at 37 ° C and 5% CO 2 , frozen sections are made from the skin pieces, which were covered with antifade. The evaluation under the fluorescence microscope was carried out after approx. 2-3 h.
  • the labeling was carried out using the fluorescein labeling kit from Röche.
  • HMGAlb 100 ⁇ g HMG protein, in particular HMGAlb protein, were lyophilized per batch and resuspended in 100 ⁇ l PBS buffer. 1 ⁇ l of FLUOS solution (2 mg / ml) were added to the dissolved HMGAlb and the mixture was protected from light and incubated at RT for 2 h while stirring.
  • the labeling was verified by means of HPLC (comparison of the peaks of FLUOS solution / labeled HMGA, in particular HMGAlb and PA gel).
  • the labeled protein showed a clear band under UV light, which could be confirmed by means of Coomassie staining approx. 60 ⁇ g / ml HMGA, especially HMGAlb labeled with fluorescein.
  • the first emigrated cells were observed after about 2 weeks. To verify the cells, an immunohistochemistry was carried out using the anti human CD 31 endothelial cell antibody. This confirmed that these are human endothelial cells.
  • the proliferation test was carried out using the Cell Proliferation ELISA, BrdU Kit from Röche.
  • the cultivation was carried out as described in Example 2. After distribution of the optimal cell number of the endothelial cells into the corresponding wells of a 96 well plate, the mixture was cultivated for 24 h at 37 ° C. and 5% CO 2 . Various HMGBl concentrations (1 ⁇ g, 0.1 ⁇ g and 10 ng) were then added. 3 parallel batches were carried out for each HMGBl concentration. After a further 24 h of cultivation, BrdU was added. The further steps were carried out as described in Example 3 under "Optimization of the Cell Number".
  • human endothelial cells were cultivated with the appropriate endothelial growth medium at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the endothelial cells used for the experiments came from the 2nd or 3rd passage. After the cultivation, the cells trypsinized and resuspended in the corresponding growth medium with a 20% methocel fraction. After an incubation of approx. 4 h, the cells formed spontaneous three-dimensional cell spheres (spheroids), which were then embedded in a collagen gel. The following HMGBl concentrations were added to this gel for the corresponding growth test: 2 ⁇ g / ml; 0.4 ⁇ g / ml and 0.08 ⁇ g / ml.
  • the endothelial growth factor VEGF in a concentration of 25 ng / ml served as reference or no growth factor was added to the mixture as a negative control. After an incubation period of 2 weeks, the approaches were recorded under an inverted microscope with a digital camera. The images were imported and analyzed directly in the image analysis software analySIS from Soft Imaging System.
  • the additive rung length i.e. H. the total length of the shoot originating from a spheroid can be determined.
  • a significant proangiogenic effect of HMGBl was found at a concentration of 2 ⁇ g / ml. In comparison to the negative control, a clear sprout could be observed here.
  • the combination VEGF / HMGB1 showed a stronger sprouting than just HMGBl. The result is shown graphically in FIG. 1.
  • human endothelial cells were cultivated with the appropriate endothelial growth medium at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the endothelial cells used for the experiments came from the 2nd or 3rd passage. After cultivation, the cells were trypsinized and resuspended in the corresponding growth medium with a 20% share of Methocel. After an incubation of approx. 4 h, the cells formed spontaneous three-dimensional cell spheres (spheroids), which were then embedded in a collagen gel. For the corresponding growth test, an HMGA1 concentration of 2 ⁇ g / ml was added to this gel.
  • the endothelial growth factor VEGF in a concentration of 25 ng / ml served as reference or no growth factor was added to the mixture as a negative control. After a The incubation time of 2 weeks was recorded under an inverted microscope with a digital camera. The images were imported and analyzed directly in the image analysis software analySIS from Soft Imaging System.
  • the additive rung length i.e. H. the total length of the shoot originating from a spheroid can be determined.
  • a proangiogenic effect of both HMGAla and HMGAlb at a concentration of 2 g / ml could be determined.
  • HMGA la an increase in sprouting could be shown compared to VEGF without HMG protein. The results are shown graphically in FIG. 2.
  • HMGAla proteins Compared to the skin cells of the negative control (treatment only with streptolysin O), a significant increase in the rate of prohferation was found in the cells treated with the HMGAla proteins. In accordance with the increased rate of proliferation, a significant increase in the cell division rate could also be determined when the number of cells in the mitosis was counted in relation to the total number of cells, as is also shown in FIG. 3. In addition, the cells treated with HMGA proteins had an increased motility, which z. B. could be determined based on the ingrowth of the cells in the cell-free space.
  • the uptake of the labeled HMGAlb proteins could be shown after an incubation time of approximately 2 h both in the nuclei of the Heia cells (FIG. 2) and in those of fibroblasts (FIG. 5).
  • the observation of the cells immediately after the treatment with SLO showed no positivity of the cell nucleus, ie the uptake of the HMGAlb proteins in the cell nucleus takes time about 2 h.
  • a ratio of HMGAlb-positive cell nuclei in comparison to HMGAlb-negative cells of 16 to 32 was determined for the hela cells.
  • Example 8 Transfer of HMGA proteins in human and rat skin samples by streptolysin O.
  • HMGA proteins HMGAla, HMGAlb and HMGA2
  • HMGAla, HMGAlb and HMGA2 Different skin cell types (e.g. keratinocytes, fibroblasts) grew out of the analyzed skin samples (see FIG. 7), which despite the streptolysin treatment showed a high cell division rate and cell vitality.
  • the skin samples treated with HMGA proteins in addition to the increased rate of proliferation, also showed a clear increase in the motility of the cells; which confirms the transferability of the therapeutic concept disclosed herein from cell cultures to tissue.
  • Example 11 Expression profile analysis using microarrays to determine the mode of action of HMGA1b proteins on tissue regeneration
  • Microarrays Human 3 OK Array (A / B / C) from MWG-Biotech) were used to analyze the molecular genetic mode of action of the HMGAlb proteins in tissue regeneration in order to analyze the expression pattern of the skin samples treated with HMGAlb proteins compared to untreated skin samples ,
  • a human skin sample was cut into pieces of approx. 0.5-1 mm in size and distributed on Sarsted tubes.
  • the skin pieces were washed three times in IxPBS by centrifugation for 5 min at 120 ⁇ g and RT until all medium residues were washed out. After the last centrifugation step, the supernatant was completely removed and the skin fragments for 15 min at RT in 1 ml SLO / PBS solution (Ol U SLO / l ml PBS) and 1000 ng / ml of the HMGAlb protein per batch or without protein ( Negative control) incubated.
  • RNA was isolated from the skin samples using the RNeasy RNA Isolation Kit (Qiagen) according to the manufacturer's protocol "Isolation of total RNA from Heart, Muscle, and Skin Tissue" and an additional DNase digestion for 2x15 min at 25 ° C
  • Synthesis of the ss cDNA was carried out according to the standard protocol for Superscript (Invitrogen).
  • the fluorescent labeling of the cDNA was carried out with Cy3-UTP and Cy5-UTP via “direct labeling” of the ss cDNA.
  • the labeled cDNA was denatured for 3 min at 95 ° C, incubated for 3 min on ice and any precipitates that precipitated were dissolved at 42 ° C.
  • the hybridization was carried out according to the microarray manufacturer (MWG Biotech) using a microarray gene frame at 42 ° C for 16-24 hours.
  • the subsequent washing steps in 2xSSC, 0.1% SDS (wash buffer), lxSSC (wash buffer 2) and 0.5xSSC (Wash buffer3) were carried out according to the manufacturer.
  • the evaluation was carried out with an Affymetrix 428 array scanner.
  • Example 12 Expression profile analysis using microarrays to determine the mode of action of HMGA proteins on the repair of DNA damage
  • arrays (Atlas Arrays 1.2 from Clontech, # 7850-1, comprising 1176 gene sequences of the human genome) were used to determine the expression pattern of the keratinocytes treated with HMGA proteins in comparison to untreated keratinocytes.
  • RNA was isolated from the cells using the RNeasy RNA Isolation Kit (Qiagen) according to the manufacturer's protocol "Isolation of total RNA from Heart, Muscle, and Skin Tissue" and an additional Dnase digestion for 2x15 min at 25 ° C
  • Synthesis of ss cDNA was carried out according to the standard protocol for Superscript (Invitrogen), the cDNA was radioactively labeled (P) and then used for hybridization.
  • HMGAla The proteins HMGAla, HMGAlb and HMGA2 were used in an amount of 6 ⁇ g each. It was found that the administration of recombinant human HMGA proteins upregulated genes, the proteins of which are associated with the repair of DNA damage. Examples are shown in Tab. 3.
  • ATM is a protein kinase that is activated in double-strand breaks. ATM phosphorylates other key proteins in response to double-strand breaks (Yosef Shiloh: ATM and related proteins kinases: safeguarding genome integrity. Nature Review Cancer 2003: 3, 155-168.).
  • TOP1 is topoisomerase 1, which is involved in DNA repair processes (Pastor N, Cortes F: DNA topoisomerase activities in Chinese hamster radiosensitive mutants after X-ray treatment. Cell Biol In72002: 26, 547-555.)
  • Example 13 Spontaneous transfer of fluorescence-labeled HMGAlb and HMGA2 proteins into human epithelial cells
  • HMGA proteins in particular HMGAlb and HMGA2
  • the spontaneous uptake of the labeled HMGA proteins was shown after an incubation time of approx. 4 h in the nuclei of the cells.
  • the examination of the cells immediately after the treatment showed no positivity of the cell nucleus, ie the uptake of the HMGA proteins in the cell nucleus takes approximately 4 hours.
  • the comparison to the negative control, ie the uptake of the pure fluorescein showed no corpus, but only a greenish diffuse staining of the cytoplasm.
  • 50-100% of the cells show the nuclear fluorescent staining. Since this staining is only visible when the protein concentration is relatively high, it can be assumed that all cells absorb HMGA proteins.
  • HMGBl protein is expressed much more strongly in the capillaries of the blood vessels of the affected areas than in the control tissues.
  • Positivity was found predominantly in the cytoplasm of the endothelial cells concerned and here again particularly strongly in those areas of the capillaries in which there is proliferation activity in psoriasis.
  • Monocytes present in 2/3 tissue pairs in the psoriasis areas also stained strongly cytoplasmically positive.
  • HMGBl protein inhibitors as disclosed herein is a suitable means of treating this disease.
  • Example 16 Immunohistochemical detection of HMGBl protein in malignant histiocytosis in dogs
  • Malignant histiocytosis is a relatively rare disease in the dog with an extremely poor prognosis. An accumulation is observed in the Bemer mountain dog. The disease includes characterized by the proliferation of macrophages. Tissue samples from five dogs were examined here. A strong immune response of the macrophages was found in all samples examined and was significantly stronger than in control tissue. The protein was found mainly in the cytoplama of the macrophages.
  • HMGBl protein inhibitors as disclosed herein is a suitable means of treating this disease.
  • Example 17 Immunohistochemical detection of HMGBl protein in chronic superficial keratititis of the dog's cornea
  • Chronic superficial keratitis of the dog comea is a tissue change in which inflammatory processes and neoangiogenesis play a role. As a result of the disease, the affected animals may go blind. Cytological specimens from sick animals were made and evaluated immunohistochemically. The lymphocytes were found to be clearly positive for HMGBl.
  • HMGBl protein inhibitors as disclosed herein is a suitable means of treating this disease.
  • HMGBl human recombinant HMGBl
  • concentrations 80ng / ml, 200ng / ml and 400ng / ml
  • the cells were harvested 10 hours after the addition and RNA isolation (for RNA preparation, Northern blot hybridization see p Flohr et al., Anticancer Res. 2001; 21: 3881-3886).
  • the quantification was carried out by means of Northern blot analysis using a cDNA sequence of the open reading frame of human VEGF A. Compared to the control, which contains no protein, there is a concentration-dependent increase in VEGF A expression by a factor of 1.6, 2 , 8 and 3.2 (average values of duplicate determinations).
  • HMGBl protein inhibitors as disclosed herein is a suitable means for reducing VEGF A-mediated angiogenesis and thus a tried and tested means for treating tumors.
  • HMGBl or a nucleic acid coding therefor can be used as an effector for an increased expression of VEGF A and thus as a means for the treatment of diseases in which VEGF A is given.
  • Example 18 Proliferation and migration of keratinocytes by HMGBl
  • HMGBl Human recombinant HMGBl
  • the example shows the suitability of HMGBl for the proliferation and migration of keratinocytes.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung, insbesondere in vitro, einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) für einen Prozess, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung, Wundheilung, Angiogenese im Wundbett, Epithelisierung und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, wobei die Nukleinsäure(n) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Gene für High Mobility Group-Proteine umfasst.

Description

Verwendungen von DNA-bindenden Proteinen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleinsäuren, deren Transkriptionsund/oder Translationsprodukte für Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung, Ent-Differenzierung von Zellen und/oder die Reprogrammierung von Zellen, für Geweberegeneration, für Beeinflussung der Gewebealterung und für die Wundheilung, Verfahren zur Angiogenese, Vaskularisierung, Neovaskularisierung und transmyokardialen Revaskularisierung sowie zur Geweberegeneration, Wundheilung, zur Beeinflussung der Gewebealterung, Verfahren zur Vaskularisierung, insbesondere bei Herzinfarkt und Einheilen bei Zahn- und Knochemmplantaten, Verfahren zur Regeneration von Gewebe, Verfahren zur Ent-Differenzierung und/oder Reprogrammierung von Zellen, Trägermaterial umfassend eine derartige Nukleinsäure, deren Transkriptions- und/oder Translationsprodukt sowie Wundabdeckungsmaterial umfassend ein Basisdeckmaterial sowie besagte Nukleinsäuren, deren Transkriptions- und/oder Translationsprodukte.
Den verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung ist gemein, dass die daran beteiligten Prozesse mit der (Ent-)Differenzierung von Zellen einherzugehen scheinen, die in verschiedenen medizinischen Anwendungen in nutzbringender Weise verwendet werden können. Besonders betroffen sind dabei das Blutgefäßsystem von Wirbeltieren, insbesondere von Säugtieren und dem Menschen, und die Haut derselben.
Das Blutgefäßsystem des Menschen besteht aus Arterien, Arteriolen, Blutkapillaren, Endstrombahnen, Venolen und Venen. Arterien sind Gefäße mit vom Herzen begleitender Strömungsrichtung des Bluts, wobei zwei Typen unterschieden werden: Arterien des muskulären Typs und Arterien des elastischen Typs, wobei letztere große herznahe Arterien darstellen. Arterien sind generell aufgebaut aus einer Tunica interna, die auch als Intima bezeichnet wird, mit einschichtigem, dem Lumen zugewandten Endothel, dem lockerem bindegewebigen Stramm subendotheliale und der Membrana elastica interna, die beim muskulären Typ deutlich ausgeprägt ist, weiterhin der Tunica media, die beim muskulären Typ aus dichtgefügten Lagen ring- oder schraubenförmig angeordneter glatter Muskelzellen und feinen elastischen und kollagenen Fasern besteht, beim elastischen Typ dagegen aus zahlreichen gefensterten elastischen Membranen und eingelagerten glatten Muskelzellen sowie Kollagenfasern und der Tunica externa, die aus kollagenem Bindegewebe und elastischen Fasern besteht und ernährende Gefäße sowie Gefäßnerven enthält. Zwischen der Tunica media und der Tunica externa kann eine Membrana elastica externa ausgebildet sein.
Als letzte Geiaßabschnitte der Arterien schließen sich Arteriolen an, die ein Endothel, ein Gitterfasernetz und eine einschichtige durchgehende glatte Muskelzellschicht besitzen, wobei die in Arterien noch vorhandene Membrana elastica interna fehlt, so dass myoendotheliale Kontakte entstehen.
Die Arteriolen gehen dann in Blutkapillaren über, kleine Gefäße mit einem Durchmesser von 6 bis ungefähr 20 bis 30 μm. Die Wand von Blutkapillargefäßen besteht aus einem Endothel, das einer von Gitterfasern umspannenden Basarmembran innen aufsitzt. Dieser Basalmembran liegen außen verzweigte Zellen, sogenannte Pericyten, an. Die Pericyten sind wahrscheinlich am Stoffaustausch zwischen dem Kapillarblut und dem Gewebe beteiligt.
Die Blutkapillaren gehen dann in Venolen und letztlich in Venen über, also Blutgefäße mit zum Herzen führender Strömungsrichtung des Blutes. Die Wand typischer Venen enthält eine Tunica interna mit vielen elastischen Fasern, jedoch keine Membrana elastica interna, weiterhin eine Tunica media mit lockergefügten Bündeln glatter Muskulatur sowie eine Tunica externa. Im Gegensatz zu Arterien erscheint die Begrenzung dieser Schichten im histologischen Präparat unscharf.
Der aus Arteriolen, Kapillaren und Venolen bestehende, die Mikrozirkulation des Blutes bestimmende Abschnitt des Gefäßsystems wird Endstrombahn genannt und stellt in hämodynamischer Hinsicht den neutralen Bereich zwischen arteriellem Zufluss und venösem Abfluss des Blutes, also den Wendepunkt des Kreislaufs dar. In diesem Bereich finden Stoff- und Gasaustausch zwischen Blut und Gewebe sowie die Aufrechterhaltung des thermalen und Ionenmilieus statt.
Die Haut ist ein wichtiges Organ des Säugetierorganismus, insbesondere auch des Menschen. Die Haut besteht aus der Haut im engeren Sinne, d. h. der Cutis, an der sich die Oberhaut oder Epidermis und die Lederhaut, auch als Dennis oder Korium bezeichnet, anschließen sowie daran befindliche Anhangsgebilde wie Haare, Nägel und Drüsen, sowie als Hautelement im weiten Sinne die Unterhaut oder Subcutis. Die von der Haut wahrgenommenen Funktionen sind ausgesprochen vielfältig. So dient sie als mechanische Abgrenzung gegen die Umwelt, als Wärmeschutzorgan, das durch seine Überschussdurchblutung im Dienste der Blutverteilung und der Temperaturregelung wirksam ist, aber auch durch Isolatorwirkung des Haarkleides und des Fettpolsters sowie durch Verdunstung von Schweiß, womit sie gleichzeitig an der Regulation des Wasserhaushaltes beteiligt ist, als Schutzorgan gegen Bakterien infolge ihres Säureschutzmantels sowie gegen Strahlen infolge Pigmentbildung, und als Energiespeicher bedingt durch das Fettdepot. Darüber hinaus ist die Haut durch die in ihr befindlichen Nervenendorgane ein wichtiges Sinnesorgan. Weiterhin ist sie ein Immunorgan mit differenter Abwehrfunktion. Infolgedessen erfährt die Haut vielfältige Aufmerksamkeit, insbesondere im Rahmen der Wundheilung sowie der Hautalterung.
Die Wundheilung ist ein dynamischer Prozess mit komplexer Wechselwirkung zwischen Zellen, extrazellulärer Matrix, Plasmaproteinen und einer kontrollierten Angiogenese, die durch eine Reihe von Cytokinen und Wachstumsfaktoren koordiniert ist. Unabhängig von der Art der Wunde und dem Ausmaß des Gewebeverlustes lässt sich die Wundheilung grob in die sich zeitlich überlappenden Phasen der inflammatorischen bzw. exsudativen Phase, der proliferativen Phase sowie der Differenzierungs- und Umbauphase einteilen. Die Phaseneinteilung orientiert sich aber an den grundsätzlichen morphologischen Veränderungen im Laufe der Reparationsprozesse, ohne die eigentlich Komplexität der Vorgänge widerzuspiegeln.
Der Prozess der Wundheilung lässt sich quantitativ in eine primäre und sekundäre Wundheilung einteilen, wobei um der therapeutischen Problematik, die sich aus dem Umfang und der Art der Gewebezerstörung ergibt, Rechnung zu tragen, weiter in die verzögerte Primärheilung sowie den chronischen Wundverlauf unterschieden wird. Eine primäre Wundheilung ist zum Beispiel bei glatten, dicht aneinanderliegenden Wundflächen einer Schnittwunde ohne nennenswerten Substanzverlust und ohne Einlagerung von Fremdkörpern in einem gut mit Blutgefäßen versorgten Geweben der Fall. Eine primäre Wundheilung ist üblicherweise bei chirurgisch gesetzten Wunden oder bei Gelegenheitswunden durch scharfkantige Gegenstände gegeben. Ist aufgrund der Wundentstehung mit einer Infektion zu rechnen, tritt die verzögerte Primärheilung ein. Manifestiert sich eine Infektion, so wird die Wunde als sekundärheilend eingestuft. Eine Sekundärheilung ist bei größeren Defekten, bei denen ein Granulationsgewebe aufgebaut werden muss oder wenn eine Infektion die direkte Vereinigung der Wundränder nicht zulässt, gegeben. Ist die Heilung einer Wunde nicht innerhalb von acht Wochen abgeschlossen, so spricht man von einem chronischen Heilungsverlauf. Eine chronische Wunde kann in jeder Wundheilungsphase entstehen und entwickelt sich meistens aus fortschreitender Gewebezerstörung infolge von Gewebserkrankungen unterschiedlicher Genese, lokalen Druckschäden, Strahlenschäden oder Tumoren.
Eine weitere Unterscheidung der Wundheilung kann basieren auf der Unterscheidung in akute Wunden und chronische Wunden. Zu den akuten Wunden zählen die akuten traumatisch bedingten Wunden bis hin zu komplexen traumatischen Defekten, die thermischen und chemischen Verletzungen/Verbrennungen und Inzisionen/OP-Wunden.
Bei akuten traumatisch bedingten Wunden erfolgt für den Fall, dass sich die Wundränder spannungsfrei adaptieren lassen, gegebenenfalls nach erfolgter Wundexzision, ein primärer Wundverschluss durch Naht, Klammern oder Wundnahtstreifen. Bei Wunden, die eine potentielle Infektionsgefahrdung aufweisen, wird die Wunde dagegen zunächst mit sterilen feuchten Verbänden offen gehalten, bis eine Infektion ausgeschlossen werden kann. Bei sekundär heilenden und komplexeren Wunden ist der Wundverschluss wesentlich vielschichtiger.
Bei thermischen und chemischen Wunden, d. h. solchen, die durch Einwirkung von Hitze und Kälte oder gewebeschädigenden Strahlen, Säuren oder Laugen entstehen, erfolgt die Behandlung entsprechend dem Schädigungsmuster. Bei schwer verbrannten Patienten erfolgt zum Beispiel zunächst eine Nekrektomie mit einem anschließenden chirurgischen Ersatz durch ein Hauttransplantat. Dabei werden für den Fall, dass die Wunde nicht transplantierbar ist oder durch die ausgedehnten Verbrennungen nicht mehr genügend Spenderstellen zur Verfügung stehen, sogenannte Allo- und Xenotransplantate verwendet. Bei ausreichend vorhandenen Spenderarealen kann auf permanente autologe Hauttransplantation zurückgegriffen werden. Eine Sonderform ist dabei die autologe Keratinocyten-Transplantation.
Chronische Wunden sind sekundär heilende Wunden, die trotz kausaler und sachgerechter lokaler Therapie innerhalb von acht Wochen nicht abheilen. Obgleich sich chronische Wunden jederzeit aus einer akuten Wunde entwickeln können, stellen die überwiegenden Fälle von chronischen Wunden das letzte Stadium einer fortschreitenden Gewebezerstörung dar, die ausgelöst wird durch venöse, arterielle oder stoffwechselbedingte Gefäßleiden, Druckschädigungen, Strahlenschäden oder Tumoren. Die verschiedenen Typen chronischer Wunden werden durch unterschiedliche Pathologien hervorgerufen, wobei die Wunden biochemisch betrachte als ähnlich gelten. Zu den lokalen Faktoren, die die Wundheilung beeinträchtigen, zählen unter anderem Fremdkörper, Ischämie, wiederholte Traumata und Infektionen. Des Weiteren können systemische Faktoren wie beispielsweise erhöhtes Alter, Unter- und Fehlernährung, Diabetes sowie Nierenerkrankungen einen Einfluss auf die Wundheilung haben. Zu den volkswirtschaftlich relevantesten chronischen Wundheilungsstörungen zählen, unter anderem, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum, das diabetische Ulcus, das Dekubitalulcus und die chronische posttraumatische Wunde.
Neben akuten und chronischen Wunden tritt als wesentliche Veränderung der Haut die Hautalterung auf, die grundsätzlich in das Zeitaltern und das Umweltaltern unterteilt werden kann. Der Begriff Zeitaltern beschreibt die auf die normalen Alterungsvorgänge der Haut bezogenen Veränderungen, die zu einer Verdünnung der Schichten der Haut und zu einem Nachlassen der Funktionen der Hautdrüsen fuhren. Dies bedingt mit zunehmendem Alter eine dünne, trockene, feinrunzelige Haut. Altersbedingte Fältchen und Falten sind die Folge einer Abnahme bzw. eines Verlustes des Kollagens und der elastischen Fasern in der Lederhaut. Des Weiteren wird die Integrität von gealterter Haut leichter unterbrochen und diese regeneriert langsamer, so dass der Organismus einem größeren Infektionsrisiko ausgesetzt ist. Eine altersbedingte Verlangsamung und Verminderung der Zellerneuerung wird unter anderem durch hormoneile Veränderungen und erbliche Faktoren beeinflusst. Umwelteinflüsse haben jedoch einen entscheidenden Einfluss auf diesen Alterungsprozess, den sie beschleunigen und verstärken können.
Bei der Umweltalterung kommt insbesondere dem Ausmaß an lebenslanger UV-Strahlung eine große Bedeutung zu, so dass man hier auch von „photoaging" spricht. Aber auch andere Faktoren, wie eine eingeschränkte Durchblutung der Haut durch Nikotinabusus, begünstigt die Alterungsvorgänge. Während der UV-B-Anteil des Sonnenlichts in erster Linie Schäden an den Zellen der Oberhaut auslöst und damit zu Hautkrebsvorstufen (sog. aktinischen Keratosen) und Hautkrebs (Basalzellkarzinome, Plattenepithelkarzinome, Melanome) führt, dringen UV-AStrahlen bis in die Lederhaut und zerstören hier das ansässige Hautbindegewebe (Elastose). Dies fuhrt im Gesicht, aber auch im Nacken zu einer schlaffen, stark runzeligen, in grobe Falten gelegten Haut. Eine weitere Folge einer Dauer-UV-Belastung sind die sog. Altersflecken, die bevorzugt an lichtexponierten Stellen wie im Gesicht und an den Handrücken auftreten. Im Gegensatz zu dieser Hyperpigmentierung kann der Lichteinfiuss auch zu Depigmentierung (Hypomelanosis guttata) fuhren. Zusammenfassend werden diese Phänomene als chronischer Lichtschaden bezeichnet, der als ein irreversibler Prozess eingestuft wird.
Die Behandlung der verschiedenen Wunden kann grundsätzlich in eine passive und eine aktive Wundtherapie eingeteilt werden. Als Sonderform können auch sog. Hautersatzverfahren verwendet werden. Bei der passiven Wundtherapie werden zum einen inaktive, textile Verbandsstoffe verwendet, die als reines Abdeckungsmaterial dem Infektionsschutz dienen. Interaktive Wundauflagen dienen im Unterschied zu den inaktiven Verbandsstoffen häufig dazu, ein feuchtes Wundmilieu zu schaffen und damit den Heilungsprozess zu beschleunigen. Dabei werden, unter anderem, Hydrokolloide, Hydrogele, Hydropolymere und Schaumverbände sowie Kalziumalginate verwendet. Der Nachteil dieser passiven Wundtherapie liegt darin, dass das Verbandsmaterial die aktive Heilung von Problemwunden nicht befördert, insbesondere bei chronischen Wunden, die häufig als therapieresistent gelten.
Im Stand der Technik sind verschiedene Wachstumsfaktoren beschrieben, die im Rahmen der Angiogenese und/oder der aktiven Wundtherapie verwendet werden und die an einzelnen Zielmolekülen der Wundheilung angreifen. Dazu zählen, unter anderem, VEGF, transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF beta), von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Interleukin 1 beta, Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CF) und Gerinnungsfaktor XIII. Die in diese Verbindungen gesetzten Hoffnungen wurden jedoch oftmals nicht erfüllt, was zumindest zum Teil in der Komplexität des Wundheilungsprozesses begründet liegt.
Bei den Hautersatzverfahren zur Abdeckung von Wunden wird zwischen temporärem und permanentem Hautersatz unterschieden. Der temporäre Hautersatz kann entweder allogenen biologischen Ursprungs sein, beispielsweise Fremdhaut wie dezellulierte humane Leicheniederhaut in Kombination mit Keratinocytensheets oder Spalthaut, xenogen biologischen Ursprungs sein, beispielsweise equine Kollagenfibrillen oder bovine Kollagenschwämme, oder eine Kombination aus synthetischem und biologischem Material darstellen, wie beispielsweise Folien aus Silikon oder Nylon kombiniert mit Kollagenmatrizes und/oder Fibroblasten. Der permanente Hautersatz kann dabei ein autologes Hauttransplantat sein oder auf Zellkulturen zurückgehen.
Infolge der unterschiedlichen physiologischen Vorgänge bei der Wundheilung einerseits und Hautalterung andererseits werden zur Bekämpfung der Hautalterung durch sog. Anti-Aging- Produkte andere therapeutische bzw. kosmetische Ansätze verfolgt. Nach einer Studie der Stiftung Warentest (test Spezial Kosmetik 2002, Seite 17-19, Sonderheft) weisen die meisten auf dem Markt erhältlichen Präparate keine oder nur eine geringe Effizienz auf, insbesondere was die Glättung der Falten anbelangt. Dabei sind bei Anti-Aging-Produkte faktisch nur jene Strategien wirksam, die auf eine Verlangsamung der Alterungsprozesse abzielen. Entsprechend werden Vitamine und Antioxidanzien eingesetzt, um die Haut vor externen, umweltbedingten Faktoren, wie zum Beispiel UV-B-Strahlung oder Luftverschmutzung, zu schützen. Daneben wird den Falten und anderen kleineren Hautfehlem durch kosmetischen Operationen entgegengewirkt. Dies ist jedoch mit einem nicht unerheblichen apparativen Aufwand verbunden. Eine weitere Technik, die derzeit zur Beseitigung von Falten angewandt wird, ist die Injektion von Botuhntoxin. Botulintoxin führt, in die Bereiche der Falten der Haut injiziert, zu einer Vergiftung und somit zur Lähmung der Muskelzellen, wodurch insgesamt eine Straffung der Haut erreicht wird. Neben den ungeklärten Nebenwirkungen dieser Behandlung ist ein weiterer Nachteil der, dass bei etwa 5 % der Patienten mit der Zeit die Therapie in Folge neutralisierender Antikörper nicht mehr anspricht.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel bereitzustellen, um Angiogenese oder Neovaskularisierung zu fördern oder zu inhibieren oder transmyokardiale Revaskularisierung zu fördern und die damit im Zusammenhang stehenden Erkrankungen behandelbar zu machen. In einem weiteren Aspekt liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur Förderung bzw. Initiierung der Wundheilung bereitzustellen.
Der vorliegenden Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, Mittel bereitzustellen, um Zellen, insbesondere mesenchymale Zellen, aber auch epitheliale Zellen, in einen Zustand zu überfuhren, der diesen erlaubt, sich zu differenzieren, ggf. sich zu dedifferenzieren und/oder zu wachsen. In einem weiteren Aspekt liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur Förderung bzw. Initiierung der Wundheilung bereitzustellen. Schließlich ist es eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung ein Mittel bereitzustellen, welches der Hautalterung entgegenwirkt.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem ersten Aspekt durch die Verwendung, insbesondere in vitro, einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) für einen Prozess, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung, Wundheilung, Angiogenese im Wundbett, Epithelisierung und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst,
wobei die Nukleinsäure(n) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Gene für High Mobility Group Protein umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem zweiten Aspekt durch die Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) zur Herstellung eines Medikamentes für die Prävention undoder Behandlung einer Krankheit, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die mit mangelnder oder übermäßiger Angiogenese oder Neovaskularisierung oder mit Wundheilung im Zusammenhang steht oder transmyokardiale Revaskularisierung erforderlich macht,
wobei die Nukleinsäure(n) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Gene für High Mobility Group Protein umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem dritten Aspekt, der bevorzugterweise eine Ausführungsform des ersten und zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist, durch die Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung und/oder Prävention einer Krankheit, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die diabetische Retinopathie, proliferative Retinopathia diabetica, diabetische Nephropathie, Makuladegeneration, Arthritis, Endometriose, Pannus, Histiozytosen, Psoriasis, Rosacea, Besenreisevarizen, eruptives Hämangiom, Tumorerkrankungen, kavemöses Hämangiom, Lippenangiom, Hämangiosarkom, Hämorrhoiden, Artheriosklerose, Angina pectoris, Ischämie, Infarkt, Basalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Melanom, Kaposi-Sarkom, Tumore, Gestose, Unfruchtbarkeit, akute traumatisch bedingte Wunden, thermische Wunden, chemische Wunden, OP- unden und chronische Wunden umfasst.
In einer Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die chronische Wunde eine solche ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Decubitus, Ulcus cruris, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum, diabetischen Ulcus, Decubitalulcus, chronische posttraumatische Wunde und diabetischer Fuß umfasst.
In einer Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das High Mobility Group-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die die HMGA-Familie, die HMGB-Familie und die HMGN-Familie umfasst.
In einer Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das High Mobility Group-Protein aus der HMGB-Familie ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das High Mobility Group-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die HMGB1, HMGB2 und HMGB3 umfasst.
In einer bevorzugteren Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das High Mobility Group-Protein HMGB1 ist.
In einer Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das High Mobility Group-Protein aus der HMGA-Familie ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das High Mobility Group-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die HMGAla, HMGAlb, HMGAlc und HMGA2 umfasst.
In einer bevorzugteren Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das High Mobility Group-Protein HMGAla ist. In einer Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass ein High Mobility Group Protein aus der HMGA-Familie ausgewählt ist, und ein zweites High Mobility Group Protein aus der HMGB-Familie ausgewählt ist, wobei das Protein aus der HMGBA-Familie bevorzugterweise HMGAla und das Protein aus der HMGB-Familie bevorzugterweise HMGB1 ist.
In einer Ausführungsform des ersten bis dritten Aspektes ist vorgesehen, dass zusätzlich VEGF oder eine dafür codierende Nukleinsäure verwendet wird.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem vierten Aspekt durch ein Verfahren zur Beeinflussung der Angiogenese oder Neovaskularisierung oder der Wundheilung von Gewebe umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Gewebes oder eines Teils davon,
b) Zugäbe einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriρtionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) und
c) Inkubieren des Gewebes und der Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(en) und/oder deren Translationsprodukt(en),
wobei die Nukleinsäure(n) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Gene für High Mobility Group-Proteine umfasst, und optional
d) Erhalten oder Wiedergewinnen des Gewebes oder einer Zwischenstufe davon.
In einer Ausführungsform des vierten Aspektes ist vorgesehen, dass das Gewebe oder ein Teil davon mit VEGF und/oder einer dafür codierenden Nukleinsäure inkubiert wird.
In einer Ausfuhrungsform des vierten Aspektes ist vorgesehen, dass es ein in vztro-Verfahren ist.
In einer Ausfuhrungsform des vierten Aspektes ist vorgesehen, dass das Gewebe explantiertes Gewebe oder in vitro gezüchtetes Gewebe ist. In einer Ausführungsform des vierten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und oder deren Translationsprodukt(e) ein(e) solche(s) ist/sind, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
In einer Ausführungsform des vierten Aspektes ist vorgesehen, dass zwei oder mehrere der HMGB-Proteine oder der dafür codierenden Nukleinsäuren verwendet werden, wobei bevorzugterweise ein High Mobility Group-Protein aus der HMGBA-Familie ausgewählt ist, und ein zweites High Mobility Group-Protein aus der HMGB-Familie ausgewählt ist, wobei das Protein aus der HMGBA-Familie bevorzugterweise HMGAla und das Protein aus der HMGB- Familie bevorzugterweise HMGB1 ist.
In einer Ausführungsform des ersten bis vierten Aspektes ist vorgesehen, dass zusätzlich zu der/den Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(en) und/oder deren Translationsproduk(en), wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für High Mobility Group-Proteine umfasst, eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt oder Tranlationsprodukt verwendet wird, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für Vascular Endothelial Growth Factor umfasst
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem fünften Aspekt durch eine pharmazeutische Formulierung umfassend eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e), wie hierin offenbart, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem sechsten Aspekt durch ein Trägermaterial umfassend eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e), wobei die Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und oder deren Translationsprodukt(e) ein(e) solche(s) ist/sind, wie hierin offenbart.
In einer Ausführungsform des sechsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Trägermaterial aus einem Material besteht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Zellulose, Agarose, Kollagen, Silikon, Silicium, Kunststoffe, Gele, Hydrogele, Matrices basierend auf Fibrin, Kustseidenfasern, Hydrokolloide, Lipokolloide, Polyurethan, Polyurethanharz, Gips, synthetische Biomaterialien, thermoplastische Kunststoffe, Zinkleim, Polsterschaum, Polyisobutylen, Puffer, Stabilisatoren, Bakteriostatika und Feuchthaltemittel umfasst.
In einer Ausführungsform des sechsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Trägermaterial als Implantat oder zur Wundheilung dient.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem siebten Aspekt durch ein Wundabdeckungsmaterial umfassend ein Basisdeckmaterial und eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e), wobei die Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) ein(e) solche(s) ist/sind, wie hierin offenbart.
In einer Ausführungsform des siebten Aspektes ist vorgesehen, dass das Deckmaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, die Hydrokolloid-Verbände, Calciumalginat-Verbände, Aktivkohlekompressen/auflagen, Schaumstoffwundauflagen, Folienverbände,
Transparentverbände, Silikonschaumverbände, Vliesstoffwundauflagen, Hydrozelluläre Wundverbände, Hydroselektive Wundauflagen, Absorbierende Wundkissen, Sprühverbände, Kunstseidengaze, Baumwollgaze, Paraffingazeverbände, silberbeschichtete Wundverbände und Hydropolymer-/Schaumverbände umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem achten Aspekt durch eine Formulierung umfassend eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e), wobei die Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) ein(e) solche(s) ist/sind, wie hierin offenbart, und eine Trägeφhase, wobei die Trägeφhase bevorzugterweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cremes, Fettsalben, Emulsionen (Öl in Wasser (O/W); Wasser in Öl (W/O); Wasser in Öl in Wasser (W/O/W)), Mikroemulsionen, modifizierte Emulsionen, Nanopartikel/Nanoemulsionen, Liposomen, Hydrodispersionsgele (Hydrogele, Alkoholgele, Lipogele, Tensidgele), Gel-Creme, Lotionen, Öle/Ölbäder und Sprays umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem neunten Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung und Wundheilung umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung; und
c) Testen der Kandidaten- Verbindung und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem verursachten Reaktion.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem zehnten Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung und Wundheilung umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Referenz- Verbindung;
c) Testen der Referenzverbindung im Testsystem und Bestimmen der von der Referenz- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung;
e) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion; und
f) Vergleich der Reaktion von der Referenz- Verbindung im Testsystem mit der Reaktion von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem elften Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Vaskularisierung und Wundheilung umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Referenz-Verbindung, wobei die Referenz-Verbindung eine Markierung trägt;
c) Testen der Referenz- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Referenz- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen der Kandidaten- Verbindung; und
e) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem, wobei das Testsystem die Referenz-Verbindung enthält, und Bestimmen der Reaktion des Testsystems, wobei die Menge an freigesetzter Referenz- Verbindung und/oder freigesetzter Markierung der Referenz- Verbindung bestimmt wird.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem zwölften Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Vaskularisierung und Wundheilung umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung, wobei die Kandidaten- Verbindung eine Markierung trägt;
c) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen einer Referenz- Verbindung; und e) Testen der Referenz- Verbindung in dem Testsystem, wobei das Testsystem die Kandidaten- Verbindung enthält, und Bestimmen der Reaktion des Testsystems, wobei die Menge an freigesetzter Kandidaten- Verbindung und/oder freigesetzter Markierung der Kandidaten-Verbindung bestimmt wird.
In einer Ausführungsform des neunten bis zwölften Aspektes ist vorgesehen, dass das Testsystem ein in vitro Testsystem oder ein in vivo Testsystem ist.
In einer Ausführungsform des neunten bis zwölften Aspektes ist vorgesehen, dass die Reaktion von der Referenz-Verbindung und/oder der Kandidaten-Verbindung eine Förderung des Prozesses ist, und wobei bevorzugterweise die Kandidaten- Verbindung eine Verbindung zur Förderung des Prozesses ist, wenn die Reaktion der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem gleich oder stärker ist als die Reaktion der Referenz- Verbindung.
In einer Ausführungsform des neunten bis zwölften Aspektes ist vorgesehen, dass die Reaktion von der Referenz- Verbindung und/oder der Kandidaten- Verbindung eine Inhibierung des Prozesses ist, und wobei bevorzugterweise die Kandidaten- Verbindung eine Verbindung zum Inhibieren des Prozesses ist, wenn die von der Kandidaten- Verbindung verursachte Reaktion des Testsystems eine geringere Reaktion ist als die von der Referenz- Verbindung verursachte Reaktion des Testsystems.
In einer Ausführungsform des neunten bis zwölften Aspektes ist vorgesehen, dass die Referenz- Verbindung eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) umfasst, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für High Mobility Group-Proteine umfasst, insbesondere wie hierin offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform des neunten bis zwölften Aspektes ist vorgesehen, dass der Prozess die Inhibierung der Angiogenese ist.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem dreizehnten Aspekt durch die Verwendung eines Verfahrens nach einem der Aspekte neun bis zwölf zum Screenen einer Verbindung zur Behandlung und/oder Prävention einer Erl rankung, wobei das bereitgestellte Testsystem ein Testsystem für die jeweilige Krankheit ist. In einer Ausführungsform des dreizehnten Aspektes ist vorgesehen, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die solche Krankheiten umfasst, die Förderung oder Inhibierung von Angiogenese oder Neovaskularisierung erforderlich machen oder transmyokardiale Revaskularisierung oder Wundheilung erforderlich machen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des dreizehnten Aspektes ist vorgesehen, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die diabetische Retinopathie, proliferative Retinopathia diabetica, diabetische Nephropathie, Makuladegeneration, Arthritis, Endometriose, Psoriasis, Rosacea, Besenreisevarizen, eruptives Hämangiom, kavernöses Hämangiom, Lippenangiom, Hämangiosarkom, Hämorrhoiden, Artheriosklerose, Angina pectoris, Ischämie, Infarkt, Basalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Melanom, Kaposi-Sarkom, Tumore, Gestose, Unfruchtbarkeit, akute traumatisch bedingte Wunden, thermische Wunden, chemische Wunden, OP- Wunden und chronische Wunden umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des dreizehnten Aspektes ist vorgesehen, dass die Erkrankung eine Tumorerkrankung ist, wobei bevorzugterweise die Tumorerkrankung nekrotische Zellen, bevorzugterweise nekrotische Tumorzellen aufweist.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem vierzehnten Aspekt durch eine Verbindung erhältlich nach einem Verfahren nach dem neunten bis zwölften Aspekt.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem fünfzehnten Aspekt durch die Verwendung einer Verbindung gemäß dem vierzehnten Aspekt zur Herstellung eines Medikamentes, bevorzugterweise zur Behandlung und/oder Prävention einer Krankheit, wie hierin offenbart.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem sechszehnten Aspekt durch die Verwendung, insbesondere in vitro, einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt für einen Prozess, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA-Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-bindende Proteine umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem siebzehnten Aspekt durch die Verwendung, insbesondere in vitro, einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt für einen Prozess, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Entdifferenzierung von Zellen und Reprogrammierung von Zellen umfasst, für Gewebeaufbau und/oder Geweberegeneration, insbesondere beruhend auf der Grundlage einer Entdifferenzierung und/oder Differenzierung des aufzubauenden oder zu regenerierenden Gewebes,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-bindende Proteine umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem achtzehnten Aspekt durch die Verwendung einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt zur Herstellung eines Medikamentes für die Prävention und/oder Behandlung einer Krankheit, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die Krankheiten, die die Reparatur von DNA- Schäden erforderlich machen, Krankheiten, die die Geweberegeneration erforderlich machen, Krankheiten, die die Wundheilung erforderlich machen, die mit Gewebealterung einhergeht, Krankheiten, die Zahn- und Knochenimplantate erforderlich machen, Krankheiten, die mit Gewebealterung einhergehen, Wundheilungsstörung, Hauterkrankungen, Xeroderma pigmentosum, Lederhaut, Hautkrebs, Hautkrebs nach Sonnenbrand, Hautalterung nach Sonnenbrand, Sonnenbrand und Herzinfarkt umfasst,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-bindende Proteine umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem neunzehnten Aspekt durch die Verwendung einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt zur Herstellung eines kosmetischen Produktes, bevorzugterweise eines kosmetischen Produktes für die Geweberegeneration, Wundheilung, Prävention von Lederhaut, Prävention von Hautkrebs, insbesondere Hautkrebs nach Sonnenbrand, Hautalterung, insbesondere Hautalterung nach Sonnenbrand, Gewebealterungsverhinderung und/oder Gewebeverjüngung,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-Protein umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem zwanzigsten Aspekt durch die Verwendung einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und oder deren Translationsprodukt für die Herstellung eines Medikamentes Prävention und/oder Behandlung einer Krankheit, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die Hauterkrankungen, Xeroderma pigmentosum, Lederhaut, Hautkrebs, Hautkrebs nach Sonnenbrand, Sonnenbrand, akute Wunden und chronische Wunden umfasst,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-bindende Proteine umfasst.
In einer Ausführungsform des zwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die akute Wunde eine solche ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die akute traumatisch bedingte Wunden, thermische Wunden, chemische Wunden und OP- Wunden umfasst.
In einer Ausführungsform des zwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die chronische Wunde eine solche ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Decubitus, Ulcus cruris, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum, diabetische Ulcus, Decubitalulcus, chronische posttraumatische Wunde und diabetischer Fuß umfasst.
In einer Ausführungsform des sechszehnten bis zwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das basische DNA-bindende Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die High Mobility Group- Proteine umfasst.
In einer Ausführungsform des sechszehnten bis zwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das High Mobility Group-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die HMGA, HMGB und HMGN umfasst. In einer Ausführungsform des sechszehnten bis zwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das High Mobility Group-Protein ein Protein der HMGA-Familie ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des sechszehnten bis zwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die HMGAla, HMGAlb und HMGA2 umfasst.
In einer Ausführungsform des sechszehnten bis zwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäuren, die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 31 bis SEQ LD NO. 64 und deren jeweiligen Derivate umfasst.
In einer Ausführungsform des sechszehnten bis zwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Translationsprodukt aus der Gruppe ausgewählt ist, die Polypeptide mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 30 und deren jeweilige Derivate umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des sechszehnten bis zwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Protein eine Modifikation aufweist, wobei die Modifikation aus der Gruppe ausgewählt ist, die Phosphorylierung und Acetylierung umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem einundzwanzigsten Aspekt durch ein Verfahren zur Regeneration von Gewebe umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Gewebes oder eines Teils davon,
b) Zugabe einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt und
c) Inkubieren des Gewebes und der Nukleinsäuren, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA- bindende Proteine umfasst, und optional d) Erhalten oder Wiedergewinnen des regenerierten Gewebes oder einer Zwischenstufe davon.
In einer Ausführungsform des einundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Verfahren ein in vitro- Verfahren ist.
In einer Ausführungsform des einundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das zu regenerierende Gewebe verschieden oder identisch ist von dem in Schritt a) bereitgestellten Gewebe.
In einer Ausführungsform des einundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das zu regenerierende Gewebe und/oder das in Schritt a) bereitgestellte Gewebe unabhängig voneinander ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Hautgewebe, Fettgewebe, Knoφelgewebe, Muskelgewebe, Zellen des Blutes und des Blutbildes und Nervenzellen umfasst.
In einer Ausführungsform des einundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie hierin offenbart.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem zweiundzwanzigsten Aspekt durch ein Verfahren zur Entdifferenzierung und/oder Reprogrammierung von Zellen umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen einer oder mehrerer Zellen,
b) Zugabe einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, und
c) Inkubieren der Zelle und der Nukleinsäuren, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA- bindende Proteine umfasst. In einer Ausführungsform des zweiundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Verfahren ein in vitro- Verfahren ist.
In einer Ausführungsform des zweiundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Verfahren weiterhin den Schritt umfasst:
d) Erhalten einer entdifferenzierten und/oder reprogrammierten Zelle.
In einer Ausführungsform des zweiundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die entdifferenzierte Zelle(n) und/oder reprogrammierte Zelle(n) und/oder die gemäß Schritt a) bereitgestellte^) Zelle(n) unabhängig voneinander ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Zellen der Epidermis, Zellen der Haut, Zellen des Fettgewebes, Zellen des Knoφelgewebes, Zellen des Muskelgewebes, Zellen des Blutes, Zellen des blutbildenden Gewebes und Nervenzellen umfasst.
In einer Ausführungsform des zweiundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie hierin offenbart.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem dreiundzwanzigsten Aspekt durch eine pharmazeutische Formulierung umfassend eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, wie hierin offenbart, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem vierundzwanzigsten Aspekt durch ein Trägermaterial umfassend eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, wobei die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie hierin offenbart.
In einer Ausführungsform des vierundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Trägermaterial aus einem Material besteht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Zellulose, Agarose, Kollagen, Silikon, Silicium, Kunststoffe, Gele, Hydrogele, Matrices basierend auf Fibrin, Kustseidenfasern, Hydrokolloide, Lipokolloide, Polyurethan, Polyurethanharz, Gips, synthetische Biomaterialien, thermoplastische Kunststoffe, Zinkleim, Polsterschaum, Polyisobutylen, Puffer, Stabilisatoren, Bakteriostatika und Feuchthaltemittel umfasst.
In einer Ausführungsform des vierundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Trägermaterial als Implantat oder zur Wundheilung dient.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem fünfundzwanzigsten Aspekt durch ein Wundabdeckungsmaterial umfassend ein Basisdeckmaterial und eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, wobei die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie hierin offenbart.
In einer Ausführungsform des fünfundzwanzigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Deckmaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, die Hydrokolloid-Verbände, Calciumalginat- Verbände, Aktivkohlekompressen/auflagen, Schaumstoffwundauflagen, Folienverbände, Transparentverbände, Silikonschaumverbände, Vliesstoffwundauflagen, hydrozelluläre Wundverbände, Hydroselektive Wundauflagen, absorbierende Wundkissen, Sprühverbände, Kunstseidengaze, Baumwollgaze, Paraffingazeverbände, silberbeschichtete Wundverbände und Hydropolymer-/Schaumverbände umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem sechsundzwanzigsten Aspekt durch eine kosmetische Formulierung umfassend eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, wobei die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie hierin offenbart, und eine Trägeφhase, wobei die Trägeφhase bevorzugterweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cremes, Fettsalben, Emulsionen (Öl in Wasser (O/W); Wasser in Öl (W/O); Wasser in Öl in Wasser (W/O/W)), Mikroemulsionen, modifizierte Emulsionen, Nanopartikel/Nanoemulsionen, Liposomen, Hydrodispersionsgele (Hydrogele, Alkoholgele, Lipogele, Tensidgele), Gel-Creme, Lotionen, Öle/Ölbäder und Sprays unfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem siebenundzwanzigsten Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA- Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung; und
c) Testen der Kandidaten-Verbindung und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem verursachten Reaktion.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem achtundzwanzigsten Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA-Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Referenz- Verbindung;
c) Testen der Refere zverbindung im Testsystem und Bestimmen der von der Referenz- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung;
e) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion; und f) Vergleich der Reaktion von der Referenz- Verbindung im Testsystem mit der Reaktion von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem neunundzwanzigsten Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA-Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Referenz-Verbindung, wobei die Referenz-Verbindung eine Markierung trägt;
c) Testen der Referenz- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Referenz- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen der Kandidaten- Verbindung; und
e) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem, wobei das Testsystem die Referenz- Verbindung enthält, und Bestimmen der Reaktion des Testsystems, wobei die Menge an freigesetzter Referenz- Verbindung und/oder freigesetzter Markierung der Referenz- Verbindung bestimmt wird.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem dreißigsten Aspekt durch ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA-Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Kandidaten-Verbindung, wobei die Kandidaten- Verbindung eine Markierung trägt;
c) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen einer Referenz- Verbindung; und
e) Testen der Referenz- Verbindung in dem Testsystem, wobei das Testsystem die Kandidaten- Verbindung enthält, und Bestimmen der Reaktion des Testsystems, wobei die Menge an freigesetzter Kandidaten- Verbindung und/oder freigesetzter Markierung der Kandidaten- Verbindung bestimmt wird.
In einer Ausführungsform des siebenundzwanzigsten bis dreißigsten Aspektes ist vorgesehen, dass das Testsystem ein in vitro Testsystem oder ein in vivo Testsystem ist.
In einer Ausführungsform des siebenundzwanzigsten bis dreißigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die Reaktion von der Referenz- Verbindung und/oder der Kandidaten- Verbindung eine Förderung des Prozesses ist, und wobei bevorzugterweise die Kandidaten- Verbindung eine Verbindung zur Förderung des Prozesses ist, wenn die Reaktion der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem gleich oder stärker ist als die Reaktion der Referenz- Verbindung.
In einer Ausführungsform des siebenundzwanzigsten bis dreißigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die Reaktion von der Referenz- Verbindung und/oder der Kandidaten- Verbindung eine Inhibierung des Prozesses ist, und wobei bevorzugterweise die Kandidaten- Verbindung eine Verbindung zum Inhibieren des Prozesses ist, wenn die von der Kandidaten- Verbindung verursachte Reaktion des Testsystems eine geringere Reaktion ist als die von der Referenz- Verbindung verursachte Reaktion des Testsystems.
In einer Ausführungsform des siebenundzwanzigsten bis dreißigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die Referenz- Verbindung eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt ist, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-bindenden Proteine umfasst, insbesondere wie hierin offenbart.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem einunddreißigsten Aspekt durch die Verwendung eines Verfahrens gemäß dem siebenundzwanzigsten bis dreißigsten Aspekt zum Screenen einer Verbindung zur Behandlung und/oder Prävention einer Erkrankung, wobei das bereitgestellte Testsystem ein Testsystem für die jeweilige Krankheit ist.
In einer Ausführungsform des einunddreißigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die die Reparatur von DNA-Schäden erforderlich macht, die Geweberegeneration erforderlich macht, die Wundheilung erforderlich macht, die Zahn- und Knochenimplantate erforderlich macht, die mit Gewebealterung einhergeht, Wundheilungsstörung, Hauterkrankungen, Xerdoderma pigmentosum, Lederhaut, Hautkrebs, Hautkrebs nach Sonnenbrand, Hautalterung nach Sonnenbrand, Sonnenbrand und Herzinfarkt umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem zweiunddreißigsten Aspekt durch ein Sonnenschutzmittel umfassend zumindest eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-Proteine umfasst.
In einer Ausführungsform des zweiunddreißigsten Aspektes ist vorgesehen, dass die basischen DNA-Proteine HMG-Proteine, insbesondere solche sind, wie sie hierin offenbart sind.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem dreiunddreißigsten Aspekt durch eine Verbindung erhältlich nach einem Verfahren gemäß dem siebenundzwanzigsten bis dreißigsten Aspekt oder einer Verwendung nach dem einunddreißigsten Aspekt.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem vierunddreißigsten Aspekt durch die Verwendung einer Verbindung gemäß dem dreiunddreißigsten Aspekt zur Herstellung eines Medikamentes, bevorzugterweise zur Behandlung und oder Prävention einer Krankheit, wie hierin offenbart. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst in einem fünfunddreißigsten Aspekt durch ein Verfahren zur Behandlung eines Organismus, dadurch gekennzeichnet, dass dem Organismus eine wirksame Menge eines DNA-bindenden Proteins, eines HMG-Proteins, einer dafür codierenden Nukleinsäure oder eines Transkriptionsproduktes und/oder eines Translationsproduktes, einer damit wechselwirkenden funktionalen Nukleinsäure, eines damit wechselwirkenden Peptides oder Antiköφers und/oder eine Verbindung gemäß dem dreiunddreißigsten Aspekt verabreicht wird.
In einer Ausführungsform des fünfunddreißigsten Aspektes ist vorgesehen, dass der Organismus an einer Krankheit leidet oder die Möglichkeit besteht an dieser Krankheit zu leiden oder zu erkranken und die Krankheit bevorzugterweise eine solche ist, wie hierin offenbart.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auch durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen Ansprüche gelöst, wobei sich besonders bevorzugte Ausführungsformen aus den Unteransprüchen ergeben.
Entsprechend dem Aspekt der vorliegenden Erfindung betreffend das erfindungsgemäßen Sonnenschutzmittel ist in einer Ausführungsform vorgesehen, dass es sich dabei um ein solches Mittel handelt, das durch Reflexion oder Absoφtion von Strahlung die Haut vor der schädigenden Einwirkung intensiver Sonnenstrahlung mit der Folge von Sonnenbrand bzw. Erythemen schützt. Das erfindungsgemäße Mittel kann dabei in Form von wässrigen, alkoholischen, öligen Lösungen, Emulsionen und Lotionen, Cremen, Fettstiften, Gelen, Aerosol- Schaumcremes und weiteren, den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten Formen vorliegen. Neben den hierin beschriebenen basischen DNA-bindenden Proteinen bzw. der dafür codierenden Nukleinsäure(n) können die erfindungsgemäßen Sonnenschutzmittel absorbierenden Lichtschutzstoffe und/oder reflektierende Verbindungen enthalten. Reflektierende Verbindungen sind insbesondere anorganische Substanzen, wie beispielsweise Zinkoxid, Eisenoxid, Titandioxid oder Calciumcarbonat. Lichtschutzstoffe, auch als Lichtfilter oder UV-Absorber bezeichnet, wirken im Allgemeinen so, dass die UV-Strahlung durch strahlungslose Desaktivierung in unschädliche Wärme umgewandelt wird. Bevorzugt sind dabei eine oder mehrere der folgenden Verbindungen bzw. Verbindungsgruppen: Benzophenon-Derivate, Hydroxynaphthochinone, Phenylbenzoxazole und Phenylbenzimidazole, Digalloyltrioleat, Aminobenzoesäureester, Salicylsäureester, alicyclische Dienone, Zinksäureester, Benzalazin, aromatische Harnstoffderivate, Sulfonamide, Cumarinderivate oder Phenylglyoxylsäure- Derivate. Weitere Bestandteile können sein Nerz-, Avocado-, Mandel-, Sesam-, Erdnuss-, Oliven-, Saflor-, und/oder Kokosöle sowie Urocansäure. Zusätzliche Bestandteile können, unter anderem, Dihydroxiaceton, Carotin, Walnuss-Schalen-Extrakt und weitere Verbindungen sein, die insbesondere geeignet sind, die Hautbräunung zu fördern.
Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass basische DNA- bindende Proteine wie die HMG-Proteine dazu führen, eine Zelle in einen Zustand zu versetzen, der eine Entdifferenzierung, eine Differeinzierung und/oder Um-Differenzierung oder eine Kombination der Vorgänge erlaubt. Konkret erfolgt unter dem Einfluss der besagten Proteine eine Entdifferenzierung oder Reprogrammierung einer Zelle, die sodann erlaubt, dass sich die Zelle ggf. in einen Zustand differenziert, der dem der Ausgangszelle oder dem einer anderen, d. h. von der Ausgangszelle verschiedenen Zelle entspricht. In einem jeden Fall werden die Zellen unter dem Einfluss der besagten Proteine in einen reaktivierten Zustand versetzt. Dieser den verschiedenen Anwendungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Mechanismus ist dabei in Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass die besagten Proteine als sog. Masteφroteine eine Vielzahl von Genen kontrollieren und den funktionalen Zustand der Zelle bestimmen. Als Modulatoren von Transkriptionsfaktorkomplexen können sie grundsätzlich sowohl positiv als auch negativ auf die Expression ihrer Zielgene einwirken. Dazu binden sie mehr Struktur- als sequenzspezifisch an die entsprechenden Promotoren und biegen die DNA, so dass entweder die Bindung der Transkriptionsfaktoren vermittelt wird oder die Transkriptionsfaktoren ihre Fähigkeit verlieren, in diesem Bereich mit der DNA zu assoziieren. Aufgrund dieser Eigenschaft werden die besagten Proteine auch als architektonische Transkriptionsfaktoren bezeichnet. Weiterhin haben die vorliegenden Erfinder festgestellt, dass die besagten Proteine und insbesondere die HMG-Proteine in der Embryonal- und Fetalentwicklung am Zeil- und Gewebeaufbau beteiligt sind, während sie in den meisten differenzierten Zellen nach der Geburt nicht mehr nachweisbar sind. Während der frühen Embryogenese kann die mRNA einiger HMG-Proteine in nahezu allen Geweben detektiert werden. In der späteren Embryo genese ist die Expression auf mesenchymale Derivate und einige epitheliale Zellgewebe beschränkt. Wie hierin offenbart, sind die hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin beschriebenen HMG-Proteine, deren Transkriptionsprodukte, deren Translationsprodukte, davon abgeleitete funktionale Nukleinsäuren und unter deren Anwendung durch die hierein offenbarten Screening-Verfahren identifizierten Verbindungen in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, die hierin auch zusammenfassend als Prozesse bezeichnet werden, beteiligt. Diese Prozesse sind den Fachleuten auf dem Gebiet grundsätzlich als solches bekannt.
Insbesondere ist den Fachleuten auch die Beteiligung einer oder mehrerer dieser Prozesse an
Erkrankungen oder pathologischen Zuständen von Wirbeltieren, insbesondere von Säugetieren und dem Menschen bekannt. Es ist somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin beschriebenen HMG-Proteine, deren Transkriptionsprodukte, deren Translationsprodukte, davon abgeleitete funktionale
Nukleinsäuren und unter deren Anwendung durch die hierein offenbarten Screening-Verfahren identifizierten Verbindungen zur Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen bzw. zur Herstellung von Medikamenten zu deren Behandlung verwendet werden können, bei denen einer oder mehrerer der besagten Prozesse beteiligt ist.
Die hierin offenbarten Erkrankungen, hierin auch als Krankheiten bezeichnet, stellen Beispiele hierfür dar. Die Anwendung der hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin beschriebenen HMG-Proteine, deren Transkriptionsprodukte, deren
Translationsprodukte, davon abgeleitete funktionale Nukleinsäuren und unter deren Anwendung durch die hierein offenbarten Screening-Verfahren identifizierten Verbindungen ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung und für die Fachleute ohne weiteres zu erkennen, dass die hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin beschriebenen HMG-Proteine, deren Transkriptionsprodukte, deren Translationsprodukte, davon abgeleitete funktionale Nukleinsäuren und unter deren Anwendung durch die hierein offenbarten Screening-Verfahren identifizierten Verbindungen, sowohl inhibitorisch als auch aktivieren wirken können und insoweit sowohl Erkrankungen behandelt werden können, bei denen die besagten Prozesse erwünscht sind und somit durch die besagten Verbindungen gefordert oder unterstützt werden sollen, als auch solche, bei denen die besagten Prozesse unerwünscht sind und somit durch die besagten Verbindungen inhibiert werden sollen. In diesem Zusammenhang werden die hierin offenbarten DNA- bindenden Proteine, insbesondere die hierin offenbarten HMG-Protein, die für sie codierenden Nukleinsäure(n), sowie deren Transkriptions- und Translationsprodukt(e) bevorzugt zur Förderung der besagten Prozesse verwendet. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die hierin offenbarten DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin offenbarten HMG-Protein, die für sie codierenden Nukleinsäure(n), sowie deren Transkriptions- und Translationsprodukt(e) auch für eine Inhibierung dieser Prozesse eingesetzt werden. Wird mit der Gabe der die hierin offenbarten DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin offenbarten HMG-Protein, der für sie codierenden Nukleinsäure(n), sowie deren Transkriptions- und Translationsprodukt(e) typischerweise ein Mangel derselben kompensiert bzw. deren aktive Konzentration erhöht, kann diese zusätzliche Gabe auch zu einer Inhibierung, beispielsweise im Sinne einer kompetitiven Hemmung führen. Im Gegensatz dazu werden die funktionalen Nukleinsäuren, wie sie hierin offenbart sind, insbesondere die Antisense-Moleküle, RNAi, Aptamere, Spiegelmere und Aptazyme, die gegen die hierin offenbarten DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin offenbarten HMG-Protein, die für sie codierenden Nukleinsäure(n), sowie deren Transkriptionsund Translationsprodukt(e) gerichtet sind, bevorzugterweise zu einer Inhibierung der Prozesse, die durch diese vermittelt werden, führen. Gleiches gilt auch für die gegen die hierin offenbarten DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin offenbarten HMG-Protein, die für sie codierenden Nukleinsäure(n), sowie deren Transkriptions- und Translationsprodukt(e), gerichteten Antiköφer, Peptide und Verbindungen, die im Rahmen der hierin offenbarten Screening-Verfahren identifiziert oder erhalten wurden. Generell gilt, dass die gegen die hierin offenbarten DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin offenbarten HMG-Protein, die für sie codierenden Nukleinsäure(n), sowie deren Transkriptions- und Translationsprodukt(e) gerichteten Antiköφer und Peptide grundsätzlich in gleicher Art und Weise und im gleichen Umfang verwendet werden können, wie die hierin offenbarten funktionalen Nukleinsäuren.
Beispiele für Erkrankungen, bei denen die Wirkung der hierin offenbarten DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin offenbarten HMG-Protein, die für sie codierenden Nukleinsäure(n), sowie deren Transkriptions- und Translationsprodukt(e) gefördert werden sollen, sind beispielsweise Angiogenese, Herzinfarkt durch transmyokardiale Revaskularisierung, Wundheilung, Angiogenese um Wundbett, EpitheHsierung und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten. Erkrankungen, bei denen die Wirkung der hierin offenbarten DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin offenbarten HMG-Protein, der für sie codierenden Nukleinsäure(n) sowie deren Transkriptions- und Translationsprodukt(e) inhibiert werden sollen, sind beispielsweise Endometriose, Psoriasis, Makuladegenration, insbesondere altersbedingte Makuladegeneration, Cornea-Erkrankungen, bevorzugterweise solches des Menschen und des Hundes, die mit einer Angiogenese einhergehen, bevorzugtererweise der Pannus, d.h. eine chronische superfizielle Keratitis, Histiozytosen, bevorzugterweise akute Formen, bevorzugtererweise solche in der Veterinärmedizin.
Die Verwendung der hierin offenbarten DNA-bindenden Proteine, insbesondere der hierin offenbarten HMG-Proteine, der für sie codierenden Nukleinsäure(n), sowie deren Transkriptions- und Translationsprodukt(e), der gegen sie gerichteten funktionalen Nukleinsäuren, Antiköφer und Peptide sowie der unter deren Verwendung erhaltenen und/oder identifizierten Verbindungen ist besonders dann mit Vorteilen verbunden, wenn an einer Erkrankung mehrere der Prozesse beteiligt sind, die durch diese gefördert bzw. inhibiert werden. Beispielhaft seien hier Psoriasis, Makuladegenration und Endometriose sowie der Pannus beim Hund genannt, bei denen sowohl inflammatorische Prozesse als auch Prozesse der Angiogenese, die durch die hierin offenbarten DNA-bindenden Proteine, insbesondere durch die hierin offenbarten HMG-Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäure(n) (mit)verursacht werden, wobei hier insbesondere HMGB-Protein eine Rolle spielt. Infolgedessen sind insbesondere funktionale Nukleinsäuren, Peptide und Antiköφer dagegen bzw. gegen das Transkriptionsprodukt geeignete Mittel zur Behandlung. Gleiches gilt für Verbindungen, die die Wirkung von HMGB-Protein bzw. der dafür codierenden Nukleinsäure inhibieren, die beispielsweise durch ein erfindungsgemäßes Screening-Verfahren identifiziert werden können.
Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf der überraschenden Erkenntnis, dass insbesondere Angehörige der HMGA- und der HMGB-Familie Angiogenese- oder Neovaskularisierungsprozesse auslösen können. Dabei wird Angiogenese in einem Ausmaß angeregt, dass mit dem durch hochspezialisierte Angiogenesefaktoren wie VEGF bewirkten vergleichbar ist. Im Gegensatz zur Verwendung hochspezialisierter angiogenetischer Faktoren wie VEGF sind durch die Verwendung von HMG-Proteinen noch weitere Effekte zu erzielen, wie nachfolgend dargelegt wird.
Weiterhin liegt der vorliegenden Erfindung die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass aus der Gruppe der HMG-Proteine insbesondere HMGB1 sowie HMGA1 eine starke angiogene Wirkung zeigen und insoweit zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Angiogenese im Zusammenhang stehen, wie hierin ausgeführt, verwendet werden können. Dieser Verwendung liegt die überraschende Beobachtung zugrunde, dass die angiogenen Effekte, abgeleitet aus der Sprossenlänge von Blutgefäßen, überraschend groß sind. Diese Effekte sind im Gegensatz dazu bei einer HMGB1 -induzierten Freisetzung von Cytokinen nicht zu erwarten.
Darüberhinaus haben die vorliegenden Erfinder überraschend festgestellt, dass nekrotische Zellen, insbesondere nekrotische Tumorzellen HMGB1 ausschütten, und im bestimmten Umfang auch HMGA-Proteine, und als extrazelluläre Liganden über den Rezeptor RAGE Endothelzellen zur Vaskular-/Angiogenese anregen. Aus diesem Mechanismus ergibt sich im übrigen, dass gegen HMG, insbesondere HMGB1 und HMGA, hier wiederum HMGA1, gescreente Wirkstoffe besonders für jene Tumorerkrankungen verwendet werden können, die nekrotische Zellen umfassen bzw. nekrotische Tumorzellen umfassen bzw. die hierin beschriebenen Screening- Verfahren derartige Moleküle liefern werden bzw. zu liefern in der Lage sind. Weiterhing ergibt sich aus diesem Mechanismus, dass gegen die vorstehend genannten Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren gerichtete funktionale Nukleinsäuren, Antiköφer oder Peptide als Mittel zur Behandlung von Tumoren, insbesondere von solchen Tumoren verwendet werden können, die HMGB1 ausschütten und/oder im bestimmten Umfang auch HMGA-Proteine und/oder als extrazelluläre Liganden über den RAGE Endothelzellen zur Vaskular-/Angiogenese anregen.
Die Bildung neuer Blutgefäße ist bei einer Vielzahl von Vorgängen, beispielsweise bei der Wundheilung, dem Tumorwachstum und der Neovaskularisierung zur Behandlung von Hypoxien und Ischämie in myokardialem Gewebe von Bedeutung. Dabei werden zwei unterschiedliche Mechanismen unterschieden, die an diesen Vorgängen grundsätzlich beteiligt zu sein scheinen: einerseits die Vaskulogenese, d. h. die Gefäßneubildung aus sich in situ differenzierenden endothelialen Vorläuferzellen und andererseits die Angiogenese, d. h. die Neubildung von Gefäßen aus bestehenden Blutgefäßen. Die Endothelzellen ausgereifter Blutgefäße des erwachsenen Organismus befinden sich in einem ruhenden, nicht proliferativen Stadium. Erst durch einen bestimmten Stimulus, wie z. B. Entzündung, Trauma, Hypoxie oder Ischämie werden sie in die Lage versetzt, am Prozess der Angiogenese mitzuwirken bzw. den Prozess der Angiogenese zu stimulieren. Anschließend kommt es zu einer Kaskade verschiedener aufeinanderfolgender Prozesse, die unter anderen die Wanderung, Proliferation und erneute Verbindung von Endothelzellen beinhaltet. Als Ergebnis davon kommt es zur Bildung eines neuen, dreidimensionalen „Gefäßschlauches". Bei der Angiogenese bzw. Neogenese von Gefäßen, die größer als Kapillaren sind, wandern zusätzlich Myozyten der glatten Gefäßwandmuskulatur ein, wodurch die Stabilität des neugebildeten Gefäßes gewährleistet wird.
Von der großen Anzahl der bei der Angiogenese beteiligten Wachstumsfaktoren und Cytokinen sind insbesondere die Wachstumsfaktoren Fibroblast Growth Factor (FGF) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) als die entscheidenden zu bewerten. Sie sind als potente mitogen wirksame Faktoren der Endothelzellen bekannt. Durch die Applikation von Wachstumsfaktoren bzw. Molekülen, welche wiederum stimulatorisch auf bestimmte Wachstumsfaktoren wirken, wird eine verbesserte Durchblutung des zu behandelnden Areals gewährleistet.
Eine klinisch wichtige Form der Angiogenese findet im Rahmen der sogenannten transmyokardialen Laser-Revaskularisation (TMLR) statt. Dabei werden durch Laserimpulse kleine Kanäle im Herzmuskel erzeugt. Vermutlich durch die traumatische Stimulierung des Herzmuskelgewebes in der Nähe der so erzeugten Kanäle kommt es in deren Umgebung zu Angiogenese, was letztlich zu einer verbesserten Durchblutung des Herzmuskels insbesondere im Bereich des ischämischen Gewebes führt. Transmyokardiale Revaskularisierung umfasst insbesondere Revaskularisierung nach Herzinfarkt, aber auch Revaskularisierung bei früheren Stadien von Herzkrankheiten wie Ischämie oder gefäßbedingter Herzinsuffizienz. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollen die Begriffe Angiogenese, Vaskulogenese, Vaskularisierung, Neovaskularisierung und Revaskularisierung synonym verwendet werden, wobei in jedem Fall auf den auftretenden Effekt abgestellt wird, dass - unabhängig vom zugrundeliegenden molekularen oder zellulären Mechanismus - Blutgefäßbildung stattfindet.
Eine gezielte Beeinflussung von Angiogenese oder Neovaskularisierung im Sinne einer Förderung oder auch Inhibierung dieser Prozesse eröffnet die Möglichkeit, mit Angiogenese oder Neovaskularisierung im Zusammenhang stehende Krankheiten zu behandeln.
Dies betrifft beispielsweise Krankheiten, bei denen aufgrund unzureichender Blutversorgung ischämische Zustände vorliegen, beispielsweise bei Herzkranzgefäßverengung oder Arteriosklerose. In solchen Fällen könnte die Induktion neuer Blutgefäße durch Angiogenese oder Neovaskularisierung alternative Gefäße zur Versorgung mit Blut bereitstellen und somit zu einer Linderung der Krankheit beitragen. Weitere Beispiele für Krankheiten, die durch unzurreichende Blutversorgung bedingt sind, sind Geschwüre, schlecht heilende oder chronische Wunden, Schwangerschaftsstörungen wie Gestose bis hin zur Unfruchtbarkeit.
In anderen Fällen können Krankheiten auf der übermäßigen Bildung von Blutgefäßen beruhen. Ein Beispiel hierfür ist die prohferative Retinopathia diabetica, bei der Gefäßneubildungen auf und vor der Netzhaut bis zur Erblindung führen können. Ein anderes Beispiel ist die Bildung von Tumoren. Es ist inzwischen hinlänglich bekannt, dass erfolgreiches Tumorwachstum eine ausreichende Versorgung der Krebszellen mit Nährstoffen erfordert, was wiederum eine ausreichende Versorgung des Tumorortes mit Blutgefäßen voraussetzt. Tumore, die nicht in der Lage sind, eine ausreichende Versorgung mit Blutgefäßen zu induzieren, sind deswegen in ihrem Wachstum begrenzt. Umgekehrt kann das Wachstum von Tumoren aktiv dadurch begrenzt werden, dass die Versorgung mit Blutgefäßen unterbunden wird. Gerade im Bereich der Haut wurden viele Arten von krebsartigen Erkrankungen mit übermäßiger Angiogenese in Verbindung gebracht, beispielsweise Basalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Melanome, Kaposi-Sarkom sowie aktinische Keratome als Krebsvorstufe. Prinzipiell kann aber jede Art von Krebs oder Tumor als mit übermäßiger Angiogenese einhergehend betrachtet werden. Weitere Beispiele für durch übermäßige Angiogenese bedingte Krankheiten sind Psoriasis sowie Arthritis.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollen unter Krankheiten nicht nur Krankheiten oder Erkrankungen im klassischen Sinne wie beispielsweise Retinopathie, Psoriasis oder Tumore verstanden werden, sondern allgemein alle Zustände, deren Aufhebung im Sinne des Wohlbefindens eines Patienten wünschenswert ist. Dazu zählen insbesondere auch künstlich herbeigeführte Verletzungszustände, wie sie beispielsweise im Rahmen chirurgischer Eingriffe auftreten, beispielsweise OP- Wunden oder Wunden, die durch Einsetzung von Prothesen oder Implantaten entstehen. Angiogenese tritt auch in einer kontrollierten, durch eine Reihe von Cytokinen und Wachstumsfaktoren koordinierten Weise im Zusammenhang mit Wundheilung auf, einem dynamischen Prozess mit komplexer Wechselwirkung zwischen Zellen, extrazellulärer Matrix, Plasmaproteinen. Dabei kommt der Angiogenese die Aufgabe zu, Versorgungswege bereitzustellen, über die Zellen, Nährstoffe und andere Substanzen in das Wundgebiet transportiert werden können, wobei diese Versorgungswege nach abgeschlossenem Heilungsprozeß und gegebenenfalls zahlenmäßiger Reduktion zur Aufrechterhaltung der Versorgung des geheilten Gewebes bestehen bleiben können. Unabhängig von der Art der Wunde und dem Ausmaß des Gewebeverlustes lässt sich die Wundheilung grob in die sich zeitlich überlappenden Phasen der inflammatorischen bzw. exsudativen Phase, der proliferativen Phase sowie der Differenzierungs- und Umbauphase einteilen. Die Phaseneinteilung orientiert sich aber an den grundsätzlichen moφhologischen Veränderungen im Laufe der Reparationsprozesse, ohne die eigentlich Komplexität der Vorgänge widerzuspiegeln.
Der Prozess der Wundheilung lässt sich quantitativ in eine primäre und sekundäre Wundheilung einteilen, wobei um der therapeutischen Problematik, die sich aus dem Umfang und der Art der Gewebezerstörung ergibt, Rechnung zu tragen, weiter in die verzögerte Primärheilung sowie den chronischen Wundverlauf unterschieden wird. Eine primäre Wundheilung ist zum Beispiel bei glatten, dicht aneinanderliegenden Wundflächen einer Schnittwunde ohne nennenswerten Substanzverlust und ohne Einlagerung von Fremdköφern in einem gut mit Blutgefäßen versorgten Geweben der Fall. Eine primäre Wundheilung ist üblicherweise bei chirurgisch gesetzten Wunden oder bei Gelegenheitswunden durch scharfkantige Gegenstände gegeben. Ist aufgrund der Wundentstehung mit einer Infektion zu rechnen, tritt die verzögerte Primärheilung ein. Manifestiert sich eine Infektion, so wird die Wunde als sekundärheilend eingestuft. Eine Sekundärheilung ist bei größeren Defekten, bei denen ein Granulationsgewebe aufgebaut werden muss oder wenn eine Infektion die direkte Vereinigung der Wundränder nicht zulässt, gegeben. Ist die Heilung einer Wunde nicht innerhalb von acht Wochen abgeschlossen, so spricht man von einem chronischen Heilungsverlauf. Eine chronische Wunde kann in jeder Wundheilungsphase entstehen und entwickelt sich meistens aus fortschreitender Gewebezerstörung infolge von Gewebserkrankungen unterschiedlicher Genese, lokalen Druckschäden, Strahlenschäden oder Tumoren. Eine weitere Unterscheidung. der Wundheilung kann basieren auf der Unterscheidung in akute Wunden und chronische Wunden. Zu den akuten Wunden zählen die akuten traumatisch bedingten Wunden bis hin zu komplexen traumatischen Defekten, die thermischen und chemischen Verletzungen/Verbrennungen und Inzisionen/OP- Wunden.
Bei akuten traumatisch bedingten Wunden erfolgt für den Fall, dass sich die Wundränder spannungsfrei adaptieren lassen, gegebenenfalls nach erfolgter Wundexzision, ein primärer Wundverschluss durch Naht, Klammern oder Wundnahtstreifen. Bei Wunden, die eine potentielle Infektionsgefahrdung aufweisen, wird die Wunde dagegen zunächst mit sterilen feuchten Verbänden offen gehalten, bis eine Infektion ausgeschlossen werden kann. Bei sekundär heilenden und komplexeren Wunden ist der Wundverschluss wesentlich vielschichtiger.
Bei thermischen und chemischen Wunden, d. h. solchen, die durch Einwirkung von Hitze und Kälte oder gewebeschädigenden Strahlen, Säuren oder Laugen entstehen, erfolgt die Behandlung entsprechend dem Schädigungsmuster. Bei schwer verbrannten Patienten erfolgt zum Beispiel zunächst eine Nekrektomie mit einem anschließenden chirurgischen Ersatz durch ein Hauttransplantat. Dabei werden für den Fall, dass die Wunde nicht transplantierbar ist oder durch die ausgedehnten Verbrennungen nicht mehr genügend Spenderstellen zur Verfügung stehen, sogenannte Allo- und Xenotransplantate verwendet. Bei ausreichend vorhandenen Spenderarealen kann auf permanente autologe Hauttransplantation zurückgegriffen werden. Eine Sonderform ist dabei die autologe Keratinocyten-Transplantation.
Chronische Wunden sind sekundär heilende Wunden, die trotz kausaler und sachgerechter lokaler Therapie innerhalb von acht Wochen nicht abheilen. Obgleich sich chronische Wunden jederzeit aus einer akuten Wunde entwickeln können, stellen die überwiegenden Fälle von chronischen Wunden das letzte Stadium einer fortschreitenden Gewebezerstörung dar, die ausgelöst wird durch venöse, arterielle oder stoffwechselbedingte Gefäßleiden, Druckschädigungen, Strahlenschäden oder Tumoren. Die verschiedenen Typen chronischer Wunden werden durch unterschiedliche Pathologien hervorgerufen, wobei die Wunden biochemisch betrachtet als ähnlich gelten. Zu den lokalen Faktoren, die die Wundheilung beeinträchtigen, zählen unter anderem Fremdköφer, Ischämie, wiederholte Traumata und Infektionen. Des Weiteren können systemische Faktoren wie beispielsweise erhöhtes Alter, Unter- und Fehlernährung, Diabetes sowie Nierenerkrankungen einen Einfluss auf die Wundheilung haben. Zu den volkswirtschaftlich relevantesten chronischen Wundheilungsstörungen zählen, unter anderem, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum, das diabetische Ulcus, das Dekubitalulcus und die chronische posttraumatische Wunde.
Eine wesentliche Ursache chronischer Wunden ist ein Ungleichgewicht zwischen Reparatuφrozessen, die zur Bildung von neuem Gewebe führen und destruktiven Prozessen, die zur Entfernung des geschädigten Gewebes führen. Beispielsweise kann eine erhöhte Proteaseaktivität, zum Beispiel durch Überexpression von MatrixmetaUoproteasen zu einer fehlgesteuerten Degradierung der extrazellulären Matrix führen. Durch die u. a. proliferationsfördernde Wirkung der basischen DNA-bindenden Proteine und insbesondere der HMG-Proteine kann das Ungleichgewicht zwischen der Synthese und Degradierung der extrazellulären Matrix und daraus resultierende Verschiebung des Wundgleichgewichts in Richtung destruktiver Prozesse aufgehoben werden. Gegenüber dem Einsatz einzelner exogener Wachstumsfaktoren, die meistens eine spezifische Signalkaskade induzieren, besitzen die besagten Proteine den entscheidenden Vorteil, dass sie als architektonische Transkriptionsfaktoren eine ganze Reihe unterschiedlicher proliferationsfordernder Signaltransduktionswege ansprechen und somit ein breiteres Wirkungsspektrum aufweisen. Die besagten Proteine können durch die Synthese einer Reihe von funktioneilen Proteinen in unterschiedlichen Zellen, wie zum Beispiel Keratinocyten, Fibroblasten und Endothelzellen, induzieren. Die besagten Proteine greifen darüber hinaus an einem späteren Punkt in die Signalkaskaden ein als die initial wirkenden exogenen Wachstumsfaktoren, die häufig vermutlich durch den hohen Proteasegehalt chronischer Wundflüssigkeit im Übrigen sehr schnell abgebaut werden.
Die Behandlung der verschiedenen Wunden kann grundsätzlich in eine passive und eine aktive Wundtherapie eingeteilt werden. Als Sonderform können auch sog. Hautersatzverfahren verwendet werden. Bei der passiven Wundtherapie werden zum einen inaktive, textile Verbandsstoffe verwendet, die als reines Abdeckungsmaterial dem Infektionsschutz dienen. Interaktive Wundauflagen dienen im Unterschied zu den inaktiven Verbandsstoffen häufig dazu, ein feuchtes Wundmilieu zu schaffen und damit den Heilungsprozess zu beschleunigen. Dabei werden, unter anderem, Hydrokolloide, Hydrogele, Hydropolymere und Schaumverbände sowie Kalziumalginate verwendet. Der Nachteil dieser passiven Wundtherapie liegt darin, dass das Verbandsmaterial die aktive Heilung von Problemwunden nicht befördert, insbesondere bei chronischen Wunden, die häufig als therapieresistent gelten.
Die im Stand der Technik angeführten, zur Wundheilung verwendeten hochmolekularen Verbindungen, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, Cytokine, Gerinnungsfaktoren und dergleichen, greifen selektiv in das Geschehen der Wundheilung bzw. Hautalterung ein. Bei einer Verwendung der basischen DNA-bindenden Proteine wie der HMG-Proteine kann jedoch infolge des zentralen Wirkmechanismus der besagten Proteine sehr zu Beginn des Differenzierungszustandes eine ganzheitliche Regeneration des Gewebes bzw. der einzelnen Zellen realisiert werden. Die überraschend beobachtete Wirkung der besagten Proteine zu Zwecken der Wundheilung im weitesten Sinne, wie sie hierin definiert ist, beruht dabei auf den folgenden Abläufen bzw. Mechanismen, wobei darauf abgestellt werden kann, dass die besagten Proteine sowohl in der proliferativen wie der Differenzierungs- und Umbauphase des Wundheilungsprozesses, einschließlich Aufbauen des Granulationsgewebes, Stimulation der Angiogenese sowie Proliferation und Migration von Epithelzellen, eingreifen und für diese Prozesse oder in Verfahren, die auf diesen Prozessen beruhen, verwendet werden können. Entsprechend ergibt sich eine Verwendung der besagten Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren bei Krankheiten, die mit diesen Prozessen bzw. Phasen verbunden sind, einhergehen, darauf zurückgreifen und/oder auf diese kausal oder symptomatisch zurückgehen.
Für den Heilungsprozess ist weiterhin eine ausreichende Durchblutung des Wundbereichs von essentieller Bedeutung. Ist dieser stark eingeschränkt, kann ein ausreichender Wundstoffwechsel nicht gewährleistet werden und dies zu einem chronischen Heilungsverlauf führen. Die basischen DNA-bindenden Proteine und insbesondere die HMG-Proteine fördern durch die Induktion der Proliferation von Endothelzellen auch die Angiogenese im Wundbett. Schließlich spielt bei Wundheilungsstörungen die Seneszenz von Zellen eine besondere Rolle. Ein zunehmendes Alter von dermalen Fibroblasten korreliert mit einem reduzierten Potential zur Proliferation. Fibroblasten in chronischen Wunden weisen eine verschlechterte Reaktion auf Wachstumsfaktoren auf, die vermutlich auf eine steigende Anzahl an seneszenten Zellen zurücl zuführen ist. Die besagten Proteine besitzen die Fähigkeit, diese Zellen durch ihre reprogrammierende oder „verjüngende" Eigenschaften wieder in einen aktiven Zustand zu versetzen und ihre Proliferation zu reaktivieren. Schließlich stellt eine stark eingeschränkte EpitheHsierung eine weitere Störung im Heilungsprozess von chronischen Wunden dar, wodurch die Heilung nicht zum Abschluss gebracht werden kann. Ein Faktor ist dabei die eingeschränkte Migration von Epithelzellen am unmittelbaren Ulcusrand. Die vorliegenden Erfinder haben gezeigt, dass HMG-Proteine die Mobilität von Zellen erhöhen können, so dass auch im Hinblich auf die Migration von Epithelzellen eine positive Wirkung durch die HMG-Proteine auftritt.
Wie hierin verwendet kommt den basischen DNA-bindenden Proteinen die hierin beschriebenen Funktionen zu.
Namensgebend für HMG-Proteine ist ihre hohe elektrophoretische Mobilität in Polyacrylamidgelen. Sie gehören zu den chromosomalen Nicht-Histon-Proteinen und sind primär nicht über ihre Proteinfunktion, sondern unter den Gesichtspunkten chemischer und physikalischer Eigenschaften definiert. Alle Mitglieder dieser Proteine sind aus Chromatin durch 0,35 M NaCl extrahierbar, sind in 2 bis 5 %iger Perchlorsäure löslich, weisen einen hohen Gehalt von geladenen Aminosäuren und ein Molekulargewicht von unter 30.000 Da auf. Die HMG-Proteine werden unter Berücksichtigung von Sequenzhomologien und Sequenzmotiven in drei Subgruppen unterteilt, nämlich die HMGB (früher HMG-l/2)-Familie, die HMGN (früher HMG-14/17)-Familie und die HMGA (früher HMG-I/-Y/-C)-Familie.
Die Mitglieder der HMGN-Familie werden in allen höheren Eukaryonten exprimiert. Ihr Molekulargewicht liegt zwischen 10.000 und 20.000 Da. Sie sind die einzigen Nicht-Histon Proteine, die mit einer höheren Affinität mit ihrer positiv geladenen Nukleosomen-Bindungs- Domäne (NBD), an den Nukleosomen-Kern als an Histon-freie DNA binden. Diese Bindungsdomäne umfaßt die Aminosäuren 12-41 des HMGN1 Proteins und die Aminosäuren 17_47 des HMGN2 Proteins und wurde auch in der Sequenz anderer Proteine gefunden; so enthält z. B. NBP45 ein NBD-Motiv in seiner primären Sequenz.
Die HMGA-Familie besteht aus drei Mitgliedern, nämlich HMGAla und HMGAlb, die beide Splicevarianten eines Gens darstellen und dem verwandten, von einem anderen Gen codierten Protein HMGA2. Das durchschnittliche Molekulargewicht der Proteine der HMGA-Familie liegt zwischen 10.000 und 12.000 Da. Die Mitglieder dieser Proteinfamilie findet man zumeist nur in undifferenzierten embryonalen Zellen, in neoplastischen Zellen sowie in der exponentiellen Wachstumsphase differenzierter Zellen. Im Unterschied dazu sind sie in differenzierten Zellen des Normalgewebes nicht oder nur in geringen Konzentrationen nachweisbar.
Proteine dieser Familie besitzen jeweils 3 separate DNA-Bindungsdomänen, sowie eine saure Proteinbindungsdomäne. Die HMGA-Proteine binden an die kleine Furche AT-reicher DNA. Bei Genen, deren Promotor/Enhancer-Sequenzen in der Nähe solcher HMGA-Bindungsstellen lokalisiert sind, kann die Bindung von HMGA zu einer Beeinflussung der Transkription führen. So spielt die Acetylierung von HMGA1 eine entscheidene Rolle bei der Regulierung des Enhanceosomkomplexes zur Transkription des Interferon-Beta (IFN-beta)-Gens. Weitere posttranslationale Modifikationen der HMGA-Proteine sind die Phosphorylierung, welche abhängig vom Zellzyklus ist bzw. die ADP-Ribosylation.
Die Mitglieder der HMGB-Familie gehören zu den häufigsten HMG-Proteinen. Das durchschnittliche Molekulargewicht beträgt maximal 25.000 Da.
HMGB-Proteine bestehen aus drei Domänen, wobei die zwei konservativen, stark sequenzhomologen Domänen die unspezifische DNA-bindende Region der Proteine darstellen. Dieses funktioneile Motiv bezeichnet man als HMG-Box. HMGB-Proteine enthalten zwei dieser HMG-Boxen, nämlich Box A und B. Der C-terminale Bereich des HMGB1 -Proteins bildet die Protein-bindende Domäne der HMGB-Proteine. Neben den HMGB-Proteinen gibt es eine große Anzahl anderer Proteine, bei denen sich HMG-Boxen nachweisen lassen. Zu dieser Gruppe von Proteinen gehören SRY, SOX-Proteine LEF1 und UBF1 (A. D. Baxevanis und D. Landsman: The HMG-1 box protein family: classification and fünctional relationships. NAR 23, 2002, 1604-1613). Die HMGB-Proteine stellen strukturelle Komponenten des Chromatins dar und sind an der transkriptioneilen Regulation beteiligt.
Grundsätzlich sind alle HMG-Proteine, sowohl die derzeit bekannten als auch zukünftig noch aufzufindenden HMG-Proteine, im Rahmen der vorliegenden Erfindung anwendbar, insbesondere nach Durchführung der hierin beschriebenen Experimente, um im Einzelfall zu bestimmen, ob das konkrete HMG-Protein die entsprechenden erfmdungsgemäßen Eigenschaften und damit das Verhalten in der jeweiligen Anwendung zeigt. Derzeit sind ca. 15 HMG-Proteine bekannt. Besonders bevorzugt für die hierin beschriebenen Verwendungen und Anwendungen sind dabei die Proteine der HMGB-Familie, der HMGA- Familie und/oder die Proteine der HMGB-Familie, letztere insbesondere in Kombination mit Proteinen der HMGA-Familie. Dabei soll es im Rahmen der vorliegenden Erfindung sein, dass die Proteine der genannten Familien nicht nur auf der Ebene der Translationsprodukte, sondern auch auf der Ebene der Transkriptionsprodukte oder der Gene bzw. codierenden Sequenzen verwendet werden können.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass aberante Transkripte der HMG-Proteine verwendet werden. Derartige trunkierte HMG-Proteine sind in der Literatur beschrieben, unter anderem auch in der internationalen Patentanmeldung WO 96/25493 oder WO 97/23611, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Bevorzugterweise weisen trunkierte HMG-Proteine, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, die mindestens Exon 1, bevorzugterweise mindestens Exons 1 bis 3 des HMGA2-Gens sowie weitergehende Aminosäuren, die kodiert werden von Sequenzen, die aus den Regionen unterschiedlicher chromosomaler Translokationspartner des Chromosomes 12 stammen, auf. Sowohl diese trunkierten Formen als auch weitere Abwandlungen der HMG-Proteine, wie z. B. HMGA2-LPP; HMGA2-RAD51L1 (beschrieben beispielsweise in Tkachenko, A et al., Cancer Res 997; 57 (11): 2276 - 80; Schoenmakers EF et al; Cancer Res 1999 59(1): 19-23) HMGA1-LAMA4 (beschrieben beispielsweise in Schoenmakers EF et al. aaO; Tkachenko, A et al, aaO) und SP100-HMGB1, insbesondere HMGAla, HMGAlb sowie HMGA2 können in Form von Derivaten vorliegen. Derartige Derivate können beispielsweise durch posttranslationale Modifikation, wie beispielsweise Acetylierung oder Phosphorylierung herstellbar sein, oder aber auch durch Konjugation an andere Moleküle modifiziert sein, wobei es im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist, dass bei gleichzeitiger Verwendung mehrerer Proteine diese unabhängig voneinander mit gleichen oder verschiedenen Modifikationen versehen sein können oder nicht alle gleichzeitig modifiziert sind. Derartige andere Moleküle können beispielsweise ans der Gruppe ausgewählt sein, die Zucker, Lipide, Peptide und kleine organische Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 umfasst. Bevorzugte HMG-Proteine, die im Rahmen der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind ein jedes einzelne der folgenden, in Tabelle 1 angegebenen Proteine, die mit den SEQ ID NOs. 1 bis 30 bezeichnet werden. Tabelle 1 gibt dabei einen Überblick unter Angabe der SEQ ID NOs., der Aminosäurelänge, der Zugangsnummer des Datenbankeintrages, sofern vorhanden, sowie des Aufbaus der Exonstruktur und daran angefügter, gegebenenfalls vorhandener zusätzlicher Aminosäuren.
Tabelle 1 : Bevorzugte HMG-Proteine
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Die im Rahmen der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuren sind dabei solche Nukleinsäuren bzw. deren Transkriptionsprodukte, die für die HMG-Proteine, wie sie hierin beschrieben sind, codieren und deren Derivate. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine jegliche Nukleinsäure umfasst ist, die für die vorstehend genannten HMG-Proteine codiert. Entsprechende Nukleinsäuren können durch die Degeneriertheit des genetischen Codes umfasst werden. Besonders bevorzugte Nukleinsäuren sind dabei jene, wie sie hierin mit den SEQ ID NOs. bezeichnet werden. Tabelle 2 gibt einen Überblick über verschiedene, besonders bevorzugte, für die DNA-bindenden Proteine codierenden Nukleinsäuren. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die besagten Nukleinsäuren solche sind, die mit den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren bzw. ihren Transkriptionsprodukten und/oder deren Komplementärsträngen hybridisieren, insbesondere unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Derartige stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise solche, die in 0,l SSC/0,l % SDS bei 68°C (Perfect Hyb™ Plus (Hybridisierungspuffer der Firma Sigma)) oder in 5χSSC/50 % Formamid/0,02 % SDS/2 % Blocking Reagenz/0, 1 % N-Lauroylsarcosin bei 42°C über Nacht durchgeführt werden.
Weiterhin umfasst sind solche Nukleinsäuren, die eine Identität von mindestens 65, bevorzugterweise 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 oder 99 % zu den besagten Nukleinsäuren aufweisen. Unter Transkriptionsprodukt wird hierin insbesondere auch die hnRNA oder mRNA bzw. cDNA der für HMG-Proteine codierenden Nukleinsäuren, wie hierin beschrieben, verstanden.
Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass von der Nukleinsäuresequenz von Genen von HMG-Proteinen abgeleitete inhibitorische Sequenzen wie Antisense-Nukleinsäuren, Ribozymen oder RNAi verwendet werden. Antisense-Nukleinsäuren, die in der Regel als Antisense-Oligonukleotide eingesetzt werden, weisen Basenkomplementarität mit einer Ziel- RNA, bevorzugterweise der mRNA eines zu exprimierenden Gens auf, und hybridisieren deswegen mit dieser Ziel-RNA, wodurch das Enzym RNase H aktiviert wird_und zu einem Abbau der Nukleinsäuren führt. Ribozyme sind katalytisch aktive Nukleinsäuren, die bevorzugterweise aus RNA bestehen und zwei Teilbereiche aufweisen. Dabei ist der erste Teilbereich für eine katalytische Aktivität verantwortlich, während der zweite Teil für eine spezifische Wechselwirkung mit einer Ziel-Nukleinsäure verantwortlich ist. Wenn es zur Ausbildung einer Wechselwirkung zwischen der Ziel-Nukleinsäure und dem zweiten Teil der Ribozyms kommt, die typischerweise auf einer Hybridisierung von zueinander im wesentlichen komplementären Basenbereichen beruht, dann kann der katalytische Teil des Ribozyms entweder intramolekular oder intermolekular die Ziel-Nukleinsäure hydrolysieren, falls die katalytische Wirkung des Ribozyms eine Phosphodiesterase-Aktivität ist. Als Folge davon kommt es zur einem Abbau der codierenden Nukleinsäure und letztlich zu einer Verringerung der Expression des Zielmoleküls sowohl auf Transkriptionsebene als auch auf Translationsebene. RNAi ist eine doppelsträngige RNA, die RNA-Interferenz vermittelt und typischerweise eine Länge von etwa 21 bis 23 Nukleotiden aufweist. Einer der beiden Stränge der RNA entspricht dabei der Sequenz eines abzubauenden Gens. Bei Einführung einer RNAi in einem Strang komplementär ist zu bevorzugterweise der mRNA eines Gens, kann die Expression dieses Gens somit verringert werden. Die Erzeugung und Verwendung von RNAi als Medikament bzw. diagnostisches Mittel ist beispielsweise beschrieben in den internationalen Patentanmeldungen WO 00/44895 und WO 01/75164.
Tabelle 2 Bevorzugte, für die DNA-bindenden Proteine codierenden Nukleinsäuren
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Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass bevorzugterweise humane HMG-Proteine sowie die dafür codierenden Nukleinsäuren verwendet werden. Infolge der Sequenzhomologie und des hohen Grades an Konservierung von HMG-Proteinen ist es jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass es sich bei den besagten Proteinen bzw. dafür codierenden Nukleinsäuren um solche handelt, die von anderen Organismen oder Arten als dem Menschen stammen. Dabei sind insbesondere jene von anderen Säugetieren bevorzugt und hiervon wiederum ganz besonders jene von Hund, Katze, Maus, Ratte, Pferd, Rind und Schwein. Weitere Quellen für die erfindungsgemäß verwendeten HMG-Proteine sind solche von Fischen, Amphibien, Reptilien und Vögeln. Besonders bevorzugt sind dabei Fische, insbesondere Salzwasserfische. Eine weitere bevorzugte Quelle sind Knoφel- und Knochenfische.
Die erfindungsgemäßen Anwendungen und Verwendungen der hierin beschriebenen DNA- bindenden Proteine, insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine und der für sie codierenden Nukleinsäure, einschließlich deren Transkriptions- und/oder Translationsprodukte, erstreckt sich dabei auf eine Vielzahl von Prozessen. Bevorzugterweise sind die Prozesse jene, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung, Wundheilung, Geweberegeneration, Zellmobilität, Angiogenese, insbesondere Angiogenese im Wundbett, Epitelisierung, Gewebealterung, Vaskularisierung, insbesondere Vaskularisierung bei Herzinfarkt, Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten, Ent-Differenzierung von Zellen bzw. Geweben, Differenzierung von Zellen bzw. Geweben und Kombinationen von Ent-Differenzierungs- und Differenzierungvorgängen umfasst. Die hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine und die für sie codierenden Nukleinsäuren weisen die Eigenschaft auf, einen oder mehrere der vorstehend genannten Prozesse zu initiieren, zu unterstützen, aufrecht zu erhalten und/oder fortzuführen, wobei es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt, die vorstehend genannten Prozesse durch auf der Grundlage der Nukleinsäuresequenzen von HMG-Genen erstellten Antisense-Molekülen, Ribozymen oder RNAi-Molekülen (hierin auch allgemein als funktionale Nukleinsäure bezeichnet) oder durch auf der Grundlage der hierin offenbarten Screening-Verfahren identifizierten Verbindungen zu inhibieren. Die verschiedenen Prozesse können dabei gleichzeitig, aber auch zeitlich versetzt und gegebenenfalls überlappend unter Verwendung der besagten Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren durchgeführt werden. Ohne im folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, scheint es so, dass den hierin offenbarten Prozessen und bevorzugt den vorstehend genannten Prozessen gemein ist, dass die Grundlagen hierfür in einer Aktivierung der an den verschiedenen Prozessen beteiligten Zellen begründet liegen. Grundsätzlich sind all jene Vorgänge mit den besagten Proteinen sowie der für sie codierenden Nukleinsäuren, wie hierin definiert, adressierbar im Sinne von initiierbar, anregbar, unterstützbar, aufrechterhaltbar und/oder verstärkbar. Die erfindungsgemäße Anwendung und Verwendung der hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine und der für die besagten Proteine codierenden Nukleinsäuren sowie der davon abgeleiteten Moleküle, insbesondere antisense-Moleküle, Ribozyme, RNAi-Moleküle bzw. der unter Anwendung der hierin beschriebenen Screening- Verfahren identifizierten Inhibitoren, insbesondere wie hierin definiert, erstreckt sich dabei auch auf jene Krankheiten, die mit einem oder mehreren der hierin beschriebenen Prozesse kausal oder symptomatisch verbunden sind, bzw. für die Herstellung entsprechender Medikamente, pharmazeutischer Formulierungen oder kosmetischer Formulierungen. Die besagte erfindungsgemäße Anwendung und Verwendung kann dabei eine in vivo und/oder in vitro und/oder in situ Verwendung sein. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass diese Anwendung bzw. Verwendung unabhängig vom zugrundeliegenden Mechanismus hierin offenbart ist. Weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung der hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine und der für sie codierenden Nukleinsäuren, einschließlich deren Transkriptions- und/oder Translationsprodukten einschließlich der hierin offenbarten funktionalen Nukleinsäuren und der unter Anwendung der hierin offenbarten Screening-Verfahren identifizierten Verbindungen, in Kombination mit bekannten angiogenetischen Faktoren wie beispielsweise VEGF in den bzw. betreffend die verschiedenen Aspekte, insbesondere Anwendungsaspekte der vorliegenden Erfindung.
Mit Hinblick das komplexe Zusammenspiel der oben beschriebenen Faktoren der Durchblutung, des Alters von im Wundbereich befindlichen Fibroblasten und der EpitheHsierung der Wunde ist in einem Aspekt der Erfindung die Verwendung von Nukleinsäuren, Transkriptions- oder Translationsprodukten von Proteinen der HMGA-Familie zusammen mit Nukleinsäuren, Transkriptions- oder Translationsprodukten von Proteinen der HMGB-Familie vorgesehen. Ohne durch die Theorie festgelegt sein zu wollen, gehen die vorliegenden Erfinder davon aus, dass Nukleinsäuren, Transkriptions- oder Translationsprodukten von Proteinen der HMGA-Familie, einer im wesentlichen embryonal exprimierten Proteinfamilie, eine Entdifferenzierung oder „Verjüngung" von Zellen und Geweben bewirken, die letztendlich auch das Proliferationspotential von Fibroblasten und die Migration von Epithelzellen erhöht. Nukleinsäuren, Transkriptions- oder Translationsprodukten von Proteinen der HMGB-Familie, insbesondere von HMGBl, lösen im wesentlichen eine Signalkette aus, die zur Angiogenese oder Neovaskularisierung führt. Diese unterschiedlichen Wirkungen von Angehörigen der HMGA-Familie und der HMGB-Familie führen zu einem synergistischen Effekt hinsichtlich Angiogenese oder Neovaskularisierung und Wundheilung.
Bevorzugte Erkrankungen bzw. Krankheiten, zu deren Therapie und/oder Prävention die hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine und die dafür codierenden Nukleinsäuren, wie hierin definiert, sowie die hierin offenbarten funktionalen Nukleinsäuren und die unter Anwendung der hierin offenbarten Screening- Verfahren identifizierten Bindungen verwendet werden können bzw. die für die hierin offenbarten Medikamente oder pharmazeutischen Formulierungen verwendbar sind, sind insbesondere die folgenden: diabetische Retinopathie, proliferative Retinopathia diabetica, diabetische Nephropathie, Makuladegeneration, Arthritis, Psoriasis, Endometriose, Rosacea, Besenreisevarizen, eruptives Hämangiom, kavernöses Hämangiom, Lippenangiom, Hämangiosarkom, Hämorrhoiden, Artheriosklerose, Angina pectoris, Ischämie, Infarkt, Basalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Melanom, Kaposi-Sarkom, Tumore, Gestose, Unfruchtbarkeit, Coraea-Erkrankungen, insbesondere Comea-Erkrankung beim Menschen und beim Hund, insbesondere eine solche, die mit einer Angiogenese einhergehen, Pannus (chronische superfizielle Keratitis), Histiozytosen, bevorzugterweise akute Formen, bevorzugtererweise in der Veterinärmedizin, primäre und sekundäre Wundheilung, gestörte primäre und sekundäre Wundheilung, chronische Wundheilung, akute Wunden und chronische Wunden, traumatisch bedingte Wunden, komplexe traumatische Defekte, thermische Verletzungen, thermische Verbrennungen, chemische Verletzungen, chemische Verbrennungen, lnzisionen, OP-Wunden, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum, diabetisches Ulcus, Dekubitalulcus, chronisch posttraumatische Wunden, chronischer Lichtschaden, Sonnenbrand (Dermatitits solaris) Hautkrebs, Hautkrebs nach Sonnenbrand, Hautalterung nach Sonnenbrand, Lederhaut, Xeroderma pigmentosum, Verbrennungen durch thermische Strahlung, insbesondere duirch UV-Strahlung sowie eine jede dieser Erkrankungen bei besonderen Patientengruppen, wobei die Patientengruppen insbesondere ältere Personen, Personen mit Unterernährung, Personen mit Fehlernährung, Personen mit Diabetes, Personen mit Hautpigmentmangel, Personen mit Hypopigmentierung, Personen mit Hypeφigmentierung, Personen die einer Strahlentherapie unterzogen werden oder wurden und oder Personen mit Nierenerkrankungen sind. Ohne im Folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, scheint es so, dass der vorstehende Prozess der Reparatur von DNA-Schäden insoweit eine gewisse Sonderstellung innerhalb der vorstehend genannten Prozesse einnimmt, als dass dadurch Zellschäden behoben zu werden scheinen, die ansonsten in der Folge zu einem organischen Defekt führen können. Unter dem Einfluss der hierin beschriebenen basischen DNA-bindenden Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäure(n), kann somit die in der Regel natürlicherweise auftretende Reparatur von DNA- Schäden entsprechend unterstützt oder initiiert werden. Derartige DNA-Schäden entstehen insbesondere nach UV-Exposition, jedoch auch nach Exposition mit allgemein energiereicher Strahlung. Dazu gehört, unter anderem, auch radioaktive Strahlung, wie sie beispielsweise im Rahmen einer Strahlenbehandlung bei Tumorerkrankungen auftritt. Weitere Anwendungsfelder sind beispielsweise Strahlenschäden infolge eines Unfalls beim Umgang mit radioaktiven Substanzen. Der diesem Prozess zugrunde liegende Mechanismus der basischen DNA-Proteine und insbesondere der HMGA-Proteine scheint insoweit besonders vorteilhaft zu sein, als dass nicht auf einzelne Komponenten des Reparatursystems zurückgegriffen wird, sondern die einzelne Zelle vielmehr durch direkten Zugriff auf das Chromatin in den Stand versetzt wird, ihre eigenen Reparatursysteme zu aktivieren und somit die Grundlage für ein umfangreicheres Reparatuφrogramm zur Beseitigung von DNA-Schäden schafft. Die entsprechende Anwendung kann dabei sowohl in vitro als auch in vivo erfolgen, mit dem Ziel, Zellmaterial zu erhalten bzw. wiederherzustellen, welches die DNA-Schäden nicht mehr oder aber zumindest im verringerten Umfang aufweist.
Bei der Angiogenese oder Neovaskularisierung ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass diese sich auf Gewebe oder Organe beziehen, die beispielsweise durch Explantation bereitgestellt werden. So können beispielsweise zur Implanatation vorgesehene Gewebe oder Organe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Angiogenese oder Neovaskularisierung angeregt werden. Nach der Implantation haben solchermaßen behandelte Gewebe oder Organe höhere Chancen, aufgrund der bereits induzierten Angiogenese oder Neovaskularisierung in den Empfängerorganismus einzuwachsen und Zeil- oder Gewebeschäden, die während der Explantationsphase entstanden sein können, zu begrenzen oder zu heilen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es auch vorgesehen, dass in vitro- gezüchtete Gewebe oder Organe zur Angiogenese oder Neovaskularisierung angeregt werden. Bei der Zeil- oder Geweberegeneration ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass solche Zellen oder Gewebe regeneriert werden, die im wesentlichen auch als Ausgangsmaterial verwendet werden. Wird beispielsweise im Rahmen der Wundheilung ein defektes Hautgewebe behandelt, wird es bevorzugterweise zur Regeneration von Hautgewebe kommen, was, ohne im Folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, im wesentlichen in den vorstehend beschriebenen Wirkungen der HMG-Proteine begründet liegt. Die Geweberegeneration oder Umprogrammierung der dabei beteiligten Zellen kann durch die Gabe externer Stimulanzien gefördert werden. Derartige Stimulanzien können beispielsweise durch das Gewebe bereitgestellt werden, in das die erfindungsgemäß re- oder umprogrammierte Zelle(n) eingebracht wird/werden. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass derartige Stimulanzien, insbesondere chemische Verbindungen, die als solche wirken oder wirken können, einzeln oder in Kombination, gegebenenfalls als entsprechende Vorstufe, mit der re- oder umprogrammierten Zelle in Kontakt gebracht werden, um die Richtung, in die sich die Zelle differenzieren oder umwandeln soll, zu beeinflussen.
Bei der Wundheilung spielen der angiogenetische bzw. neovaskularisierende Effekt, der proliferationsfördernde Effekt der hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine, wie bereits vorstehend erwähnt, sowie eine Beschleunigung des Wundheilungsprozesses eine große Rolle. Von besonderem Vorteil ist bei Verwendung der besagten Proteine, die Art der Narbenbildung. Bei fetaler Wundheilung erfolgt eine ausgesprochen schnelle Wundheilung ohne Narbenbildung verglichen mit der postnatalen Heilung. Mit Blick darauf, dass unter Verwendung der besagten Proteine, insbesondere bei einer Kombination von Proteinen aus der HMGB- und aus der HMGA-Familie, eine aktive Wundheilung erfolgt, die den Prozess der fetalen Wundheilung widerspiegelt, tritt bei der erfindungsgemäßen Verwendung der besagten Proteine ein schneller und narbenfreier Wundverschluss auf. Ein wichtiger Aspekt bei einem jeden der Prozesse, bei denen die besagten Proteine erfindungsgemäß verwendet werden, ist dabei die Tatsache, dass das Risiko für Hautirritationen sowie allergische Reaktionen als äußerst gering eingestuft werden kann, da es sich bei den HMG-Proteinen um natürliche, köφereigene Substanzen handelt. Darüber hinaus sind die besagten Proteine von Mensch und Tier durch eine hohe Konservierung nahezu identisch, so dass die Resultate aus in vzvo-Experimenten am Versuchstier eine hohe Übertragbarkeit am Menschen aufweisen. Es ist auch im Rahmen der Wundheilung, dass unter erfindungsgemäßer Anwendung der hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren die Transplantation eines Hautersatzes möglich wird, wobei es sich bei dem Hautersatz um einen solchen handelt, der ausgehend von autologen Hautzellen und ggf. deren Vermehrung erzeugt wird unter Verwendung der besagten Proteine als in vitro- Stimulationsfaktoren. Die hierzu erforderlichen autologen Hautzellen können beispielsweise aus Biopsien stammen. Typische Anwendungen sind dabei großflächige Verbrennungen oder Therapie-resistente chronische Ulzera. Auch hier, wie bei allen autologen Hautersatzverfahren, ist besonders vorteilhaft, dass keine Abstoßungsreaktion des Immunsystems hervorgerufen wird.
Mit der vorstehend beschriebenen komplexen Wirkungsweise der erfindungsgemäß verwendeten DNA-bindenden Proteine und insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren im Sinne der Gewährleistung einer ausreichenden Durchblutung des Wundbereiches erklärt sich auch deren Verwendung bei der Vaskularisierung bei Herzinfarkt. Unter dem Einfluss der erfindungsgemäß verwendeten DNA-bindenden Proteine und insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine kommt es zur Induktion der Proliferation von Endothelzellen, die die Angiogenese im Wundbett fordern und insoweit eine Versorgung des Herzmuskels mit Blutgefäßen gewährleisten. Gleiches gilt auch für die Anwendung im Rahmen der Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten. Dabei kommen auch die proliferationsfördernde Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten DNA-bindenden Proteine und insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren einschließlich des Angiogenese-Effektes, wie er vorstehend beschrieben wurde, zum Tragen. Schließlich kommt insbesondere bei diesem Anwendungsaspekt die Wirkung zum Tragen, dass unter dem Einfluss der erfindungsgemäß verwendeten DNA-bindenden Proteine und insbesondere der hierin beschriebenen HMG-bindenden Proteine die Zellen in ihrer Motilität erhöht werden, so dass ein Um- und Einwachsen von Zahn- und Knochenimplantaten besonders gefördert wird.
Eine vorteilhafte Anwendung der hierin beschriebenen basischen DNA-Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren findet sich auch bei der Beeinflussung der Gewebealterung, die unter dem Einfluss der besagten Proteine verlangsamt bzw. aufgehoben wird. Eine weitere Anwendung findet sich dabei bei der Gewebeverjüngung, wobei es zwischen Verhinderung der Gewebealterung und Gewebeverjüngung Überlappungen hinsichtlich der zugrundeliegenden biologischen Prozesse gibt, die jedoch durch die basischen DNA-bindenden Proteine bzw. durch die dafür codierenden Nukleinsäuren, wie hierin beschrieben, beeinflussbar sind. Ohne im Folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, scheint dieser Effekt auf der Eigenschaft der besagten DNA-bindenden Proteine zu beruhen, die Zelle in einen Zustand zu versetzen, der dem einer jungen differenzierten bzw. fetalen Hautzelle sehr ähnlich ist. Damit werden die mit den besagten Proteinen behandelten Zellen einem Verjüngungsprozess bzw. einem Entdifferenzierungsprozess unterzogen, durch den die Zellen wieder in der Lage sind, sich zu erneuern. Vor allem die altersbedingte Verlangsamung und Verminderung der Zellerneuerung, die unter anderem durch hormonelle Veränderungen und erbliche Faktoren beeinflusst wird, kann durch die erfindungsgemäß verwendeten basischen DNA-bindenden Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren entgegengewirkt werden. Aber auch Schäden, die durch exogene Faktoren, wie z. B. freie Sauerstoffradikale, erzeugt werden, können durch eine durch die basischen DNA-Proteine, wie hierin beschrieben, induzierte aktive Zellregeneration vermindert, beseitigt oder in ihrer Entstehung verhindert werden. Insoweit wird mit den erfindungsgemäß verwendeten basischen DNA-Proteinen bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren eine präventive und/oder kausale und nicht nur primär eine symptomatische Therapie realisiert, die faktisch bereits vorhandenen Hautschäden durch Zellerneuerung entgegenzuwirken mag. Weiterhin erfolgt bei dem Prozess der Beeinflussung der Gewebealterung unter erfindungsgemäßer Verwendung der besagten Proteine eine Aktivierung der Kollagenexpression, wodurch der Abnahme bzw. dem Verlust von Kollagen und somit der Hauptursache von Falten entgegengewirkt wird.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass anstelle der DNA-bindenden Proteine und insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine auch Nukleinsäuren, wie vorstehend beschrieben, die für diese codieren, in die jeweilige Zelle bzw. in das Gewebe eingeführt werden. Die solchermaßen behandelten Nukleinsäuren sind bevorzugterweise in einen Expressionsvektor eingebracht, der die Expression der Nukleinsäure in der jeweiligen Zelle bzw. dem von dieser mit aufgebautem Gewebe erlaubt, so dass intrazellulär die entsprechenden DNA- bindenden Proteine und insbesondere der hierin beschriebenen HMG-Proteine exprimiert werden. Die entsprechenden Expressionsvektoren für die jeweiligen Zellen sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in Colosimo A. et al. (2000) Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. Review. Biotechniques 29:314-331 bzw. Sambrook, L, Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) A Laboratory Manual. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Geeignete virale Vektoren zur Expression von Genen leiten sich bspw. aus inaktivierten Viren ab, wie bspw. Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Epstein-Barr- Viren, Heφes-Simplex-Viren, Papilloma- Viren, Polyoma- Viren, Retroviren, SV40 und Vaccinia- Viren. Geeignete Plasmid- Vektoren sind typischerweise aus prokaryotischen, eukaryotischen und/oder viralen Sequenzen zusammengesetzt. Beispiele hierfür sind insbesondere pTK2, pHyg , pRSVneo, pACT, pCAT, pCAT-basierte, pCI, pSI, pCR2.1, pCR2.1 -basierte, pDEST, und pDEST-basierte. Den Fachleuten auf diesem Gebiet sind ebenfalls Verfahren bekannt, um die jeweilige DNA in die besagten Zellen bzw. Gewebe einzuführen, sei es dass die Einführung in situ, in vivo oder in vitro erfolgt. Zu den entsprechenden Verfahren gehören, unter anderem, PO4-Präzipitation (CaPO4, BES-CaPO4, SRPO ), kationische Polymere, Liposome, Molekulare Konjugate (z. B. Polylysin), Gramicidin S-DNA-Lipid Komplexe, Elektroporation, biolistische Genkanone (engl. „biolistic gene gun"), Mikroinjektion, rekornbinante Viren und nackte DNA, wie beispielsweise beschrieben in Colosimo A. et al. (2000) Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. Review. Biotechniques 29:314-331 sowie Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) A Laboratory Manual. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Die gleiche Vorgehensweise kann auch verwendet werden, wenn es gilt, funktionale Nukleinsäuren, wie hierin definiert, vor einem zellulären Hintergrund, d. h. in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ zu expremieren, insbesondere dann, wenn die funktionale Nukleinsäure die Expression, d. h. die Transkription bzw. die Translation der hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine und insbesondere der hierin beschriebenen HMG- Proteine inhibiert.
Es ist somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Verwendung der hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine und insbesondere der hierin beschriebenen HMG- Proteine, ersetzt werden kann durch eine dafür codierende Nukleinsäure, die zur Expression der besagten Proteine in einem Expressionssystem führen. Geeignete Expressionssysteme sind, u. a., Zellaufschlüsse, Zellen, Gewebe und/oder Organe.
Im erfindungsgemäßen Verfahren, insbesondere in vitro- Verfahren, zur Angiogenese oder Neovaskularisierung von Gewebe umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Gewebes oder eines Teils davon, b) Zugabe einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(en) und/oder deren Translationsprodukt(en) und
c) Inkubieren des Gewebes und der Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(en) und/oder deren Translationsprodukt(en),
wobei die Nukleinsäure(n) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Gene für HMG- Proteine umfasst,
können die hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin beschriebenen HMG-Proteine bzw. entsprechende Nukleinsäuren verwendet werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, insbesondere in v/tro-Verfahren, zur Regeneration von Gewebe umfasst die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Gewebes oder eines Teils davon,
b) Zugabe einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt und
c) Inkubieren des Gewebes und der Nukleinsäuren, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA- bindende Proteine umfasst,
können die hierin beschriebenen DNA-bindenden basischen Proteine bzw. entsprechende Nukleinsäuren verwendet werden.
Bevorzugterweise handelt es sich bei dem bereitgestellten Gewebe um die Art von Gewebe, welches es zu regenerieren gilt. Gleichwohl ist es mit Blick auf den Wirkmechanismus der erfindungsgemäß verwendeten basischen DNA-Proteine nicht unbedingt erforderlich, dass eine Identität zwischen dem in diesem Schritt verwendeten, bereitgestellten Gewebe und dem tatsächlich am Ende erhaltenen Gewebe besteht. So können beispielsweise aus Fettzellen Knoφelzellen oder aus Knoφelzellen Muskelzellen unter dem Einfluss der hierin beschriebenen HMG-Gene bzw. der hierin beschriebenen Proteine bzw. Polypeptide erzeugt werden. Ohne im folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, geht der vorliegende Erfinder davon aus, dass infolge der erfindungsgemäß verwendeten basischen DNA-bindenden Proteine die als Ausgangszelle(n) verwendeten Zelle(n) über einen Stammzell-ähnlichen Zustand in die jeweilige Zellart überführt wird/werden. Insoweit stellen die hierin beschriebenen Verfahren auch ein Verfahren zur Erzeugung von Quast-Stammzellen dar.
Die Bereitstellung eines Gewebes kann dabei beispielsweise durch Biopsie oder Explantation erfolgen.
Das Itikubieren des Gewebes mit einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt, wie hierin beschrieben bzw. definiert, zu dem Gewebe oder einem Teil davon kann dabei so vorgenommen werden, dass eine Aufnahme des Translationsproduktes bzw. der Nukleinsäure oder deren Transkriptionsprodukt in eine oder mehrere Zellen des Gewebes erfolgt. Bevorzugterweise wird die Nukleinsäure hierzu in einer Form bereitgestellt, die eine Transfizierung einer oder mehrerer Zellen des Gewebes erlaubt. Geeignete Maßnahmen hierzu sind beispielsweise das Zugeben der Nukleinsäure bzw. deren Transkriptionsprodukt in Form eines bzw. das Inkubieren mit Hilfe eines Liposoms oder einer anderen Form, welche die Transfektion von Zellen mit Nukleinsäuren erlaubt. Die Translationsprodukte, insbesondere die erfindungsgemäß verwendeten HMG-Proteine können im Rahmen der Inkubation in die Zelle eingeführt werden unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren, so beispielsweise durch Elektroporation, Behandlung der Zellmembran mittels eines Bakteriotoxins, wie beispielsweise Streptolysin O oder Protein-Transduktions-Domänen und Peptid-Carrier.
Das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zur Regeneration von Gewebe kann auch zur Reparatur von DNA-Schäden bzw. zur Unterstützung der Reparatur von DNA-Schäden in oder von Zellen verwendet werden bzw. stellt ein solches dar. Dabei wird insbesondere die Reparatur von DNA-Schäden in der Epithelschicht der Haut bedingt bzw. gefördert. Die Elektroporation, bei der mit einem kurzen elektrischen Stromstoß (Puls) reversible Öffnungen (Poren) in einer Membran erzeugt werden können, wurde in den 70er ahren erstmalig zum Einbringen von Xenomolekülen in Zellen genutzt. Durch die entstandenen Membranporen können sowohl niedermolekulare Substanzen (z. B. Farbstoffe und Peptide) als auch hochmolekulare Stoffe (z. B. Proteine, DNA und RNA) in Bakterienzellen sowie eukaryotischen Zellen eingeschleust werden. Da diese Methode jedoch im Verhältnis zu anderen Methoden eine relativ geringe Transporteffizienz aufweist, wird man im Rahmen bevorzugterweise einer klinischen Anwendung bevorzugterweise auf die im Folgenden beschriebenen Methoden und Agenzien zurückgreifen.
Membranen eukaryotischer Zellen lassen sich mittels eines Bakterientoxins, wie z. B. Streptolysin O permeabilisieren. Der Transfer von HMG-Proteinen in eukaryotische Zellen mit Hilfe von Streptolysin O (SLO) erfolgt durch Variationen in der Ca2+-Konzentration: in Abwesenheit von Ca2+-Ionen erfolgt die Lyse der Zellen und durch die nachfolgende Zugabe von Ca2+-Ionen können die Zellenporen wieder verschlossen werden. Um eine Reversibilität des Lysevorganges zu gewährleisten, wird die optimale SLO-Konzentartion für jeden Zelltyp im Rahmen von den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Routineversuchen spezifisch ermittelt. Mit Hilfe dieser Methode werden die hierin offenbarten Wirkstoffe, d. h. die HMG-Proteine und die dafür codierenden Nukleinsäuren, wie hierin beschrieben, in beispielsweise Haut-Zellen geschleust, um z. B das Wachstum von in vitro kultivierten autologen Keratinozyten zu stimulieren. Hochproliferative Zellen können auf diese Weise Patienten mit chronischen Wunden bzw. Verbrennungspatienten als Transplantat zur Verfügung gestellt werden.
Liposomen wurden erstmals 1961 für Studien zum Ionentransport durch die Zellmembran eingesetzt und wurde später als ein nützliches Transportmittel für Medikamentenwirkstoffe entdeckt. Während jedoch die systemische Anwendung von in Liposomen eingekapselten Medikamenten bislang nur wenige Erfolge brachte, eröffnet die topische Applikation von Liposomen in der Dermatologie neue Chancen. Darüber hinaus werden inzwischen auch Kosmetika auf Liposomenbasis in den vereinigten Staaten und Westeuropa vermarktet. Insoweit stellen Liposomen besonders bevorzugte Applikationsformen für die Verabreichung der HMG- Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren dar, insbesondere im Falle der hierin beschriebenen Herstellung von Medikamenten und Produkten zur äußerlichen Auftragung. Liposomen sind Mycellen, die in ihrem Aufbau der Doppellipidschicht der Zellmembran gleichen und somit, wenn man sie im Überschuss zugibt, mit den Zellen verschmelzen. Vorher in die hydrophile Phase der Liposomen eingebrachte bzw. verkapselte Wirkstoffe können daher in der Zelle freigegeben werden. Die Klassifikation von Liposomen basiert auf ihrer Größe und auf der Anzahl der Lipiddoppelschichten. Es gibt große Vesikel (von 0,1 bis >10 μ.m) mit mehreren Lipiddoppelschichten (multilammellar large vesicles = MLV), große Vesikel (>0,06 μm) mit einer Lipiddoppelschicht (large unilamellar vesicles) und kleine Vesikel (0,02 - 0,05 μm) mit einer Lipiddoppelschicht (small unilamellar vesicles). Über die Anzahl der Lipiddoppellayer kann bis zu einem gewissen Grad die quantitative Freilassung oder Freisetzung des Wirkstoffes in der Zelle gesteuert werden. Des weiteren kann über den Einbau von z. B. Ceramiden anstelle der Phospholipidkomponenten, d. h. Strukturen, die denen der Membranstrukturen von Keratinozyten ähneln, die Kompatibilität zwischen Liposomen und der Haut erhöht werden. Diese Methode eignet sich daher besonders für ein topisch zu applizierendes Präparat mit einem Wirkstoff auf der Basis der hierin beschriebenen HMG-Proteine und der dafür codierenden Nukleinsäuren. Aufgrund der geringen Größe der HMG-Proteine, insbesondere der HMGA- Proteine (<12 kDa), eignen sich diese darüber hinaus besonders gut für eine Veφackung in Liposomen.
Protein Transduktions Domänen (PTD) und Peptid-Carrier stellen eine effiziente Möglichkeit dar, um die erfindungsgemäß verwendeten Proteine in Zellen zu schleusen. PTDs sind im Allgemeinen kurze Peptide von 10 - 16 Aminosäuren (meist positiv geladene Lysin und Argminreste), die kovalent mit dem zu transportierenden Protein verbunden sind. Die PTD- vermittelte Transduktion erfolgt über einen bislang wenig bekannten Mechanismus, der unabhängig von Rezeptoren, Transportern und der Endocytose ist. Mit Hilfe der PTDs konnten bereits Proteine mit einer Größe von bis zu 700 kDa in Zellen geschleust werden. Desweiteren sind die PTDs insbesondere für den Transport von Medikamentenwirkstoffen wie den erfindungsgemäß verwendeten HMG-Proteinen und den sie codierenden Nukleinsäuren, wie hierin beschrieben, geeignet, da bereits die in vzvo-Transduktion von Proteinen in Geweben und Zellen nachgewiesen werden konnte. Durch die kovalente Bindung der PTDs an die zu übertragenden Proteine ist diese Technologie jedoch hinsichtlich einer vollständig zu erhaltenden Funktionalität des zu transportierenden Wirkstoffes bedingt limitiert. Bevorzugterweise wird auch deshalb in bevorzugten Ausführungsformen auf nicht-kovalente Peptid Carrier zurückgegriffen, wie z. B. dem Chariot Reagenz (Carlsbad). Dieses Protein Transport System beruht auf einem kurzen synthetischen Signalpeptid (Pep-1), das sich mit dem zu transportierenden Protein über nichtkovalente hydrophobe Interaktionen komplexiert. Innerhalb der Zelle dissoziert das transportierte Protein von dem Pepl-Peptid und wird durch zelluläre Transportmechanismen weiter zu der vorhergesehenen intrazellulären Lokalisation transportiert werden. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die hohe Effizienz des Transportes von -je nach Zelltyp und Protein - 60 - 95 %. Diese Methode eignet sich damit sowohl für den Einsatz im Rahmen der durch die HMG-Proteine vermittelten ProliferationsfÖrderung bei in vitro kultivierten autologen Haut-Zellen als auch im Rahmen eines topisch zu applizierenden entsprechenden Präparates mit einem oder mehreren der hierin beschriebenen Wirkstoffen.
Die Inkubation des Gewebes mit der Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt erfolgt dabei unter Bedingungen, die eine Aufnahme derselben in die Zelle bzw. das Gewebe erlaubt. Bevorzugterweise erfolgt die Inkubation bei 37°C unter physiologischen Bedingungen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, insbesondere ein in vitro- Verfahren, zur Differenzierung, Entdifferenzierung und/oder Reprogrammierung von Zellen umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen einer oder mehrerer Zellen,
b) Zugäbe einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt, und
c) Inkubieren der Zelle und der Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt, wobei die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und oder deren Translationsprodukt wie im Zusammenhang mit den anderen Aspekten oben ausgeführt ausgewählt sein kann/können.
Auch hier gilt hinsichtlich der Durchführung der einzelnen Schritte das im Zusammenhang mit dem hierin beschriebenen Verfahren zur Regeneration von Gewebe Gesagte sinngemäß. Obwohl nicht darauf beschränkt kann die bereitgestellte Zelle grundsätzlich eine jede, insbesondere mesenchymale Zelle wie beispielsweise eine Fettzelle, Knoφelzelle oder Muskelzelle sein. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Formulierung, welche eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e), deren Translationsprodukt(e), die funktionalen Nukleinsäuren und die unter Anwendung der erfϊndungsgernäßen Screening-Verfahren identifizierten Verbindungen, wie hierin beschrieben und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst. Eine pharmazeutische Formulierung kann dabei eine solche sein, die für die verschiedenen Formen der Applikation ausgebildet ist. Derartige Applikationsformen schließen insbesondere die topische Applikation und die subkutane Applikation ein. Gleiches gilt für die kosmetische Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung. Als geeignete pharmazeutische Träger oder auch kosmetische Träger, wie beispielsweise in der Verordnung über kosmetische Mittel vom 19. Juni 1995 für die Bundsrepublik Deutschland geregelt, können die folgenden einzelnen oder in beliebiger Kombination verwendet werden: Puffer, Stabilisatoren, Bakteriostatika, Alkohole, Basen, Säuren, Stärke, Feuchthaltemittel, Cremes, Fettsalben, Emulsionen (Öl in Wasser (O/W); Wasser in Öl (W/O); Wasser in Öl in Wasser (W/O/W)), Mikroemulsionen, modifizierte Emulsionen, Nanopartikel/Nanoemulsionen, Liposomen, Hydrodispersionsgele (Hydrogele, Alkoholgele, Lipogele, Tensidgele), Gel-Creme, Lotionen, Öle/Ölbäder und Sprays.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen können dabei neben den erfindungsgemäß verwendeten DNA-bindenden Proteine, insbesondere den hierin beschriebenen HMG-Proteinen bzw. der/den dafür codierenden Nukleinsäure(n) oder den von der Nukleinsäuresequenz dieser Proteine abgeleiteten inhibitorisch wirkenden Nukleinsäuren wie Antisense-Nukleinsäuren, Ribozyme oder RNAi noch weitere Wirkstoffe enthalten. Pharmazeutische oder kosmetische Formulierungen, die mindestens ein HMG-Protein bzw. eine dafür codierende Nukleinsäure enthalten, sind insbesondere Salben, Cremes und Gele.
Der vorliegenden Erfindung liegt weiterhin die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass die hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere die hierin beschriebenen HMG- Proteine, einen spontanen Transfer in tierische Zellen, insbesondere Epithelzelle und ganz besonders bevorzugt in menschliche Epithelzellen zeigen. Infolge dessen ist es möglich, die besagten Proteine direkt auf eine mit Zellen bedeckte Oberfläche, insbesondere auf die zu behandelnden Zellen, aufzutragen, die sodann die besagten Proteine spontan aufnehmen. Bevorzugterweise befinden sich dabei die Proteine in einem Trägermedium, welches diesen spontanen Transfer fordert. Derartige Transfermedien sind beispielsweise wässrige oder alkoholische Lösungen oder geeignete Emulsionen oder andere Phasen oder Phasengemische. Dieses überraschende Verhalten der hierin beschriebenen DNA-bindenden Proteine, insbesondere der HMG-Proteine erlaubt deren direkte Verwendung in pharmazeutischen und/oder kosmetischen Formulierungen, wobei keine besonderen weiteren Maßnahmen, wie beispielsweise die Verwendung von Streptolysin zur Aufnahme der Proteine in die zu behandelnde Zelle, erforderlich sind.
Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(en) und/oder deren Translationsprodukt(en) sowie der hierin offenbarten funktionalen Nukleinsäuren und der unter Anwendung der erfindungsgemäßen Screening-Verfahren identifizierten Verbindungen oder damit erstellten pharmazeutischen Formulierungen können jegliche im Stand der Technik bekannte Applikationsmethoden eingesetzt werden. Beispielsweise kann über Injektionsspritzen eine intradermale, subkutane intramuskuläre oder intravenöse bzw. intraarterielle Applikation vorgenommen werden, bzw. eine Applikation kann direkt in das Zielgewebe erfolgen. Ebenfalls verwendet werden können Kathetersonden oder eine direkte Auftragung eines freigelegten Zielgewebes. Die jeweils verwendete Applikationsmethode wird sich normalerweise nach dem Zielgewebe richten. Soll beispielsweise eine Revaskularisierung von Herzmuskelgewebe erreicht werden, wird eine Applizierung einer erfindungsgemäßen Formulierung über Katheter, Kanülen oder ein Kombinationsinstrument bevorzugt sein, das beispielsweise im Rahmen der TMLR auch die Verabreichung von Laserstrahlen ermöglicht. Soll beispielsweise Hautgewebe erreicht werden, beispielsweise zur Förderung der Angiogenese beispielsweise im Sinne einer Verbesserung von Wundheilung durch die erf dungsgemäßen Nukleinsäuren deren Transkriptions- oder Translationsprodukte bzw. zur Inhibierung von Angiogenese beispielsweise im Falle von Hämangiomen oder Besemeisevarizen durch von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren abgeleiteten inhibitorischen Molekülen wie Antisense- Nukleinsäuren, Ribozymen oder RNAi oder im Rahmen von Screening-Verfahren gefundenen inhibitorischen Substanzen, dann kann beispielweise eine intradermale oder subkutane Verabreichung oder auch eine topische Auftragung in Form von Cremes angezeigt sein. Es liegt innerhalb des Könnens des Fachmanns, geeignete Verabreichungsmethoden auszuwählen. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Zellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind sowie Gewebe, die durch das erfmdungsgemäße Verfahren erhältlich sind.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Trägermaterial, welches eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriρtionsprodukt(e), deren Translationsprodukt(e), eine oder mehrere der hierin beschriebenen funktionalen Nukleinsäuren und/oder eine oder mehrere der hierin unter Anwendung der erfindungsgemäßen Screening-Verfahren identifizierten Verbindungen umfasst, wobei die Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) solche, wie sie hierin beschrieben sind, darstellen können. Das Trägermaterial wird insbesondere als Implantat oder als Abdeckmaterial, bevorzugt zur Wundheilung aber auch für eine jegliche andere der hierin beschriebenen Erkrankungen oder Zustände oder die anderen, hierin beschriebenen Anwendungen, die mit der Bereitstellung einer Oberfläche, an bzw. auf der die basische DNA-bindenden Proteine, wie hierin beschrieben, kovalent oder nicht-kovalent gebunden sind oder werden, verbunden sind, verwendet. Grundsätzlich sind jegliche Materialien hierzu verwendbar, die für Implantatmaterialien oder als Abdeckmittel bzw. Trägermaterial für die Wundheilung oder die anderen, hierin beschriebenen Anwendungen, die mit der Bereitstellung einer Oberfläche, an bzw. auf der die DNA-bindenden Proteine, insbesondere HMG-Proteine, wie sie hierin beschrieben sind, kovalent oder nicht- kovalent gebunden sind oder werden, verbunden sind, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, bereits verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt Hydrokolloide, Hydrogele, Hydropolymere, Schaumverbände, Kalziumalginate, Aktivkohle, Schaumstoff, Folien, Silikonschaum, Fleecestoffe, Kunstseide, Baumwollgase, Kautschuk, Paraffin und Paraffingase. Geeignete Kunststoffe sind dabei Polyethylene, Polyvinylene, Polyamide und Polyurethane. Die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren und DNA-bindenden Proteine, insbesondere HMG-Proteine sind bevorzugterweise an dem Trägermaterial in nicht-kovalenter Art und Weise absorbiert. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass diese kovalent gebunden sind und/oder unter den jeweiligen Anwendungsbedmgungen eine Freisetzung derselben von dem eigentlichen Trägermaterial erfolgt. Geeignete Anwendungsmöglichkeiten sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Eine besondere Form des Trägermaterials ist das Wundabdeckungsmaterial, welches aus einem Basisdeckmaterial und einer oder mehreren Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(en) und oder deren Translationsprodukt(en) besteht, wobei diese wie hierin beschrieben ausgestaltet sind. In diesem Falle kann das Basisdeckmaterial ein Trägermaterial im hierin beschriebenen Sinne darstellen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung, wobei die Verbindung der Förderung und/oder der Inhibierung eines Prozesses dient. Der Prozess kann dabei ein jeder der Prozesse, einzeln oder in beliebigen Kombinationen, sein, wie sie hierin beschrieben sind, insbesondere kann der Prozess ausgewählt sein aus der Gruppe, die Geweberegeneration, Wundheilung, Zellmobilität, Reparatur von Hautschäden, Angiogenese, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Veränderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung, Neovaskularisierung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst. Weiterhin kann der Prozess ganz allgemein ein solcher sein, welcher die Umprogrammierung, Umdifferenzierung oder Entdifferenzierung, gegebenenfalls mit anschließender erneuter Differenzierung, umfasst. Ohne im Folgenden hierauf festgelegt sein zu wollen, ist es den Prozessen, wie sie hierin beschrieben sind, scheinbar zu eigen, dass diese mit dem Übergang zumindest einer Zelle in einen Quasi-Stammzell-Charakter verbunden sind, auf der Grundlage dessen bzw. ausgehend von welchem eine erneute Differenzierung der Zelle erfolgt.
Im einfachsten Falle sieht das erfindungsgemäße Verfahren zum Screenen einer Verbindung vor, dass die folgenden Schritte realisiert werden:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung; und
c) Testen der Kandidaten-Verbindung und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung in dem System verursachten Reaktion.
Bei einem Testsystem handelt es sich bevorzugterweise um ein solches, welches erlaubt, den jeweiligen Prozess darzustellen, insbesondere darzustellen unter dem Einfluss einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie den Prozess entweder fördert oder inhibiert, einer sogenannten Kandidaten- Verbindung, und/oder unter dem Einfluss einer Referenz- Verbindung. Derartige Systeme sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Bevorzugterweise umfasst ein derartiges Testsystem eine oder mehrere Zellen, gegebenenfalls ein Gewebe oder Gewebe, die die besagte(n) Zelle(n) enthalten, wobei das Verhalten der Zellen bzw. des Gewebes untersucht wird. Das Verhalten ist dabei insbesondere einer oder mehrere der folgenden Prozesse: Wachstum der Zellen bzw. des Gewebes, Differenzierung der Zelle bzw. des Gewebes, und die verschiedenen Facetten oder Aspekte davon, wie beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, Ent-Differenzierung und Differenzierung, bevorzugterweise erneute Differenzierung, Wanderung von Zellen, Ausschüttung von Signalmolekülen, Angiogenese oder Neovaskularisierung von Geweben. Neben dem direkten Wachstum können dabei auch andere Phänomene oder Parameter verwendet werden, um eine Reaktion des Testsystems zu beschreiben. Derartige Parameter können beispielsweise biochemische, genetische, molekulargenetische, molekularbiologische, histologische, zytologische, physiologische und phänotypische Parameter sein. Biochemische Parameter können beispielsweise Stoffwechselwege, typische Edukte ebenso wie Produkte davon sein, die mit den besagten Prozessen direkt oder indirekt verbunden sind. Genetische und molekulargenetische Parameter sind dabei bevorzugt solche, die auf der Ebene der Nukleinsäure, sowohl genomische Nukleinsäure als auch hnRNA, mRNA und dergleichen, mit den besagten Prozessen verbunden sind. Dabei kann es im Rahmen der vorliegenden Erfindung sein, dass als genetischer Parameter das Auftreten einer entsprechenden Nukleinsäure gemessen wird, das Verschwinden einer entsprechenden Nukleinsäure, oder deren quantitative Veränderung bei der Förderung bzw. Inhibierung der besagten Prozesse. Mit molekularbiologischen Parametern können u.a. Proteine über deren Auftreten und Verschwinden mit den besagten Prozessen verbunden sein. Physiologische Parameter können dabei das Verhalten, insbesondere das Ansprechverhalten, der Zellen bzw. des Gewebes sein auf Reize, wie beispielsweise biologische, chemische oder physikalische Reize, die von dem jeweiligen Testsystem, d. h. den Zellen bzw. dem Gewebe in Abhängigkeit von dem Prozess bzw. dessen Förderung oder Inhibierung unterschiedlich beantwortet werden.
In einer Ausführungsform ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung derartiger Prozesse vorgesehen, dass neben einem entsprechenden Testsystem für den Prozess eine Referenz- Verbindung bereitgestellt wird und die Referenz- Verbindung mit dem Testsystem in Kontakt gebracht wird, d. h. die Referenz- Verbindung im Testsystem getestet wird. Dieses Kontaktieren erfolgt bevorzugterweise dadurch, dass die Referenz- Verbindung, bevorzugterweise in Form einer Lösung, bevorzugtererweise in Lösung in einem Puffer vorliegend, mit dem Testsystem in Verbindung gebracht wird, bevorzugterweise dem Kulturmedium hinzugesetzt wird. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Inkontaktbringen der Referenz-Verbindung mit dem Testsystem ortsspezifisch erfolgt, beispielsweise die Referenz- Verbindung in bestimmte Zellen des Gewebes oder aber auch in bestimmte Kompartimente der Zelle(n) eingebracht wird. Die Zeil-spezifische ebenso wie die Kompartiment-spezifische Verabreichung derartiger Referenz- Verbindungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet grundsätzlich bekannt. Es können z.B. Referenz-Verbindungen über Mikroinjektion, in definierte Bereiche bzw. Kompartimente der Zelle injiziert werden wie beispielsweise beschrieben in Wang B et al (2001) Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev 60:433-8. Zudem stehen Verfahren zur Verfügung, Referenz- Verbindungen z.B. über Aminosäuretransporter zu behandeln oder zu modifizieren, so dass die Referenz-Verbindungen spezifische Zellen, wie z.B. Fibroblasten, wie beispielsweise beschrieben in Palacin M et al. (1998) Molecular biology of mammalian plasma membrane amino acid transporters. Physiol Rev 78:969-1054, oder spezifische Zellkompartimente, wie z.B. den Nukleus, wie beispielsweise beschrieben in Chaloin L et al. (1998) Design of carrier peptide-oligonucleotide conjugates with rapid membrane translocation and nuclear localization properties. Biochem Biophys Res Commun 243:601-608, oder die Mitochondrien, wie beispielsweise beschrieben in Pain D et al. (1991) Machinery for protein import into chloroplasts and mitochondria. Genet Eng (N Y) 13:153-166., erreichen. Die Zeil-spezifische oder die Kompartiment-spezifische Verabreichung kann auch für die Kandidaten- Verbindung, wie hierin beschrieben, erfolgen.
In einem nächsten Schritt erfolgt eine Bestimmung der von der Referenz- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion. Dabei können wiederum bevorzugterweise die vorstehend genannten Parameter verwendet werden, um den Einfluss der Referenz- Verbindung im Testsystem zu bestimmen. In einem weiteren Schritt dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines der besagten Prozesse wird sodann die Kandidaten-Verbindung bereitgestellt und diese, ähnlich wie die Referenz- Verbindung, in dem Testsystem getestet. Anschließend erfolgt die Bestimmung der von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion, wobei grundsätzlich die im Zusammenhang mit der Referenz- Verbindung besprochenen Parameter herangezogen werden können. Schließlich wird die Reaktion des Testsystems, ausgedrückt durch die vorstehend genannten Parameter, unter dem Einfluss der Referenz- Verbindung mit dem Verhalten des Testsystems unter dem Einfluss der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verglichen. Dabei wird eine Kandidaten- Verbindung als eine Verbindung zur Förderung eines oder mehrerer der besagten Prozesse bezeichnet, wenn der jeweilige Prozess unter dem Einfluss der Kandidaten-Verbindung die gleiche Reaktion oder eine stärkere Reaktion in dem Testsystem hervorruft als die Referenz- Verbindung. Umgekehrt ist eine Kandidaten- Verbindung eine Verbindung zur Inhibierung eines oder mehrerer der besagten Prozesse, wenn die Kandidaten- Verbindung im Testsystem eine Reaktion hervorruft, die geringer ist als die entsprechende Reaktion der Referenz- Verbindung. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass ein und dieselbe Kandidaten-Verbindung durchaus unterschiedliche Wirkungen im Sinne von Inhibierung bzw. Förderung für einen Prozess gegenüber einem anderen der vorstehend genannten Prozesse zeigt. Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die zeitliche Abfolge des Testens der Referenz- Verbindung und der Kandidaten- Verbindung auch umgekehrt werden kann.
In einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines der besagten Prozesse wird wiederum ein Testsystem für den Prozess bereitgestellt und anschließend eine Referenz-Verbindung. In dieser Ausführungsform ist die Referenz-Verbindung sodann mit einer Markierung versehen. Grundsätzlich sind jegliche Markierungen geeignet, insbesondere solche, welche eine radioaktive, fluoreszierende, immunologische, Enzym- oder Affmitäts-Markierung umfasst bzw. eine solche erlaubt. Radioaktive Markierungen sind dabei insbesondere 1H, 3H, 35S, 32P, 33P, 125I, 51Cr, 13C und 14C, Fluoreszenzmarkierungen umfassen dabei Markierungen mit Fluorescein, Fluorescamin, Isocyanat, Luciferase, Rhodamm, Texas Red, Cy3 und Cy5. Zu den immunologischen Markierungen gehören neben diversen Immunogenen u.a. die Immunglobuline IgM, IgA, IgD, IgE und IgG, inklusive, aber nicht darauf beschränkt, IgGl, IgG2a und IgG2b. Enzym-Markierungen umfassen insbesondere die alkalische Phosphatase und die Peroxidase. Zu den Affinitätmarkierungen gehören GST- und His-Tag-Markierungen sowie Markierungen über Biotin und Digoxigenin. Bevorzugterweise wird die Markierung eine solche sein, welche die Reaktion, die die Referenz- Verbindung im Testsystem verursacht, nicht nachteilig beeinflusst. Eine solchermaßen markierte Referenz-Verbindung wird sodann, wie vorstehend beschrieben, im Testsystem getestet und die von ihr verursachte Reaktion im Testsystem bestimmt. In einem weiteren Schritt wird sodann eine Kandidaten- Verbindung bereitgestellt und auch diese im Testsystem wie vorstehend geschildert getestet, wobei das Testsystem die Referenz-Verbindung während des Testens der durch die Kandidaten- Verbindung verursachten Reaktion enthält. Dabei ist bevorzugt, dass das Testen unter Bedingungen erfolgt, die gewährleisten, dass die Referenz- Verbindung nach wie vor biologisch aktiv ist, d. h. die fördernde bzw. inhibierende Wirkung zeigt. Nach Zugabe der Kandidaten- Verbindung wird die Reaktion des Testsystems wiederum bestimmt, wobei es grundsätzlich möglich ist, dass die vorstehend beschriebenen biochemischen Parameter herangezogen werden. Bevorzugterweise wird in Ergänzung dazu oder alternativ dazu die Menge an freigesetzter Referenz- Verbindung mittels der entsprechenden Markierung oder aber die freigesetzte Markierung als solches bestimmt.
In einem noch weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines der besagten Prozesse ist vorgesehen, dass eine Markierung der Kandidaten- Verbindung erfolgt. In einer Ausführungsform ist dabei vorgesehen, dass die Kandidaten-Verbindung bereitgestellt wird und anschließend das Testsystem getestet wird und die von der Kandidaten-Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion bestimmt wird mit anschließender Bereitstellung einer Referenz- Verbindung, gefolgt vom Testen der Referenz- Verbindung in dem Testsystem, wobei das Testsystem die Kandidaten- Verbindung enthält, insbesondere unter Bedingungen, die gewährleisten, dass die Referenz- Verbindung physiologisch aktiv ist, und die Reaktion des Testsystems bestimmt, wobei insbesondere die Menge an freigesetzter Kandidaten-Verbindung und/oder freigesetzter Markierung der Kandidaten- Verbindung bestimmt wird. Alternativ, aber auch in Ergänzung dazu, können die besagten Parameter bestimmt werden, wie vorstehend beschrieben, um die Reaktion sowohl der Referenz- Verbindung als auch der Kandidaten- Verbindung auf den jeweiligen Prozess zu charakterisieren. Es ist dabei auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wenn die Reihenfolge der Zugabe von Kandidaten-Verbindung und Referenz- Verbindung, unabhängig davon, welche der Verbindungen mit einer Markierung versehen ist, umgekehrt wird. Im ersten der beiden vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen verdrängt die Referenz- Verbindung die Kandidaten- Verbindung, im zweiten Falle verdrängt die Kandidaten- Verbindung die Referenz- Verbindung. Schließlich ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass bei den verschiedenen Aspekten der erfindungsgemäßen Screening-Verfahren, bei denen eine Markierung entweder der Kandidaten- Verbindung oder der Referenz- Verbindung vorliegt, hierin auch als erste Markierung bezeichnet, auch die jeweils andere Verbindung eine Markierung trägt, im folgenden auch als zweite Markierung bezeichnet, wobei die erste und die zweite Markierung bevorzugterweise voneinander verschieden sind.
Im Rahmen einer jeglichen der erfindungsgemäßen Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines der besagten Prozesse ist dabei vorgesehen, dass die Referenz- Verbindung eine Nukleinsäure, oder deren Transkriptionsprodukt oder deren Translationsprodukt, gegebenenfalls eine Kombination derselben, ist, wobei die Nukleinsäure eine solche ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Gene für DNA-bindende Proteine und HMG-Proteine umfasst. Besonders bevorzugte DNA-bindende Proteine und HMG-Proteine sind dabei jene, wie sie hierin beschrieben sind, insbesondere jene gemäß SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 30 bzw. die für Proteine codierenden Nukleinsäuren gemäß SEQ ID No. 31 bis 64 und jene, wie sie in den Tabellen 1 bzw.2 dargestellt sind.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass im Rahmen der verschiedenen Anwendungen bzw. Verwendungen ein einzelnes der hierin beschriebenen DNA-bindende Proteine und HMG-Proteine und oder eine einzelne dafür oder für eines der hierin beschriebenen DNA-bindende Proteine und HMG-Proteine codierende Nukleinsäure verwendet wird. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine Mischung aus zwei oder mehreren der besagten Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren verwendet werden. Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Begriffe Protein und Peptid bzw. Polypeptid hierin synonym verwendet werden.
Ein weitere Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von DNA-bindenden Proteinen, insbesondere HMG-Proteinen bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren und bevorzugterweise der mit ihnen in Wechselwirkung tretenden Moleküle, die bevorzugterweise diese antagonisieren, um bestimmte biologische Prozesse zu inhibieren. Aufgrund dieser Inhibierung ist die Prävention oder Behandlung von Krankheiten möglich, die mit diesen Prozessen kausal oder symptomatisch in Beziehung stehen. Derartige Krankheiten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Tumoren, Tumorerkrankungen, Histiozytose, entzündliche Erkrankungen, Entzündungen und Arthritis, die hierin auch als „vorstehend genannte Erkrankungen" bezeichnet werden. Bei den vorstehend genannten Erkrankungen kann es sich dabei sowohl um entsprechende Erkrankungen des Menschen als auch um entsprechende Erkrankungen von Tieren handeln, insbesondere von Haustieren, Zootieren, Nutztieren und dergleichen handeln. DNA-bindende Proteine und insbesondere HMG-Proteine, wie mit diesem und anderen Aspekten diskutiert, umfassen alle derartigen Proteine, insbesondere die hierin beschriebenen HMG-Proteine, HMG-Peptide und Fragmente davon sowie die jeweils dafür codierende Nukleinsäure. Sofern nicht explizit hierin anders angegeben, bezeichnen Proteine auch Polypeptide und umgekehrt. Insbesondere bezeichnet der Begriff HMG-Proteine auch HMG-Peptide und Fragmente davon.
Infolge dieser kausalen Zusammenhänge betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung Mittel zur Prävention und/oder Behandlung der vorstehenden Erkrankungen. Derartige Mittel sind bevorzugterweise solche, die die Wirkung der DNA-bindenden Proteine, insbesondere der HMG-Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren inhibieren bzw. antagonisieren. Entsprechende Mittel sind Polypeptide, die an DNA-bindenden Proteine, insbesondere der HMG-Proteine oder dafür codierende Nukleinsäuren binden, ebenso wie Antiköφer, die an DNA-bindenden Proteine, insbesondere der HMG-Proteine oder dafür codierende Nukleinsäuren binden. Weitere Mittel, die zur Prävention oder Behandlung dieser Erkrankungen eingesetzt werden können, sind siRNA oder RNAi, Aptamere, Spiegelmere, Antisense-Moleküle und Ribozyme. Insoweit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung derartiger Mittel zur Herstellung von Medikamenten, insbesondere Medikamenten zur Behandlung der vorstehend genannten Erkrankungen.
Die vorstehend genannten Mittel können von den Fachleuten auf dem Gebiet im Rahmen ihrer Kenntnisse hergestellt werden. Als Zielmolekül bzw. Grundlage für die Herstellung dient dabei ein jegliches hierin offenbartes DNA-bindende Protein, insbesondere HMG-Protein, Fragment davon oder eine für das Protein oder Fragment davon codierende Nukleinsäure, wie insbesondere hierin auch offenbart. Dabei ist besonders bevorzugt, dass es sich bei dem Protein um HMGBl handelt sowie Teile davon, insbesondere die A-Domäne von HMGBl. Bei den erfindungsgemäßen Mitteln, die erfindungsgemäß zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und/oder Prävention der vorstehend genannten Erkrankungen verwendet werden können, handelt es sich somit um einen Antiköφer gegen DNA-bindende Proteine, insbesondere HMG-Proteine oder Fragmente davon, Peptide, die an DNA-bindenden Proteinen, insbesondere HMG-Proteine oder Fragmente davon binden, siRNA, die gegen mRNA von DNA-bindenden Proteinen, insbesondere HMG-Proteinen oder Fragmenten davon gerichtet ist, Antisense- Moleküle, die gegen die für DNA-bindende Proteine, insbesondere HMG-Proteine oder Fragmente davon codierenden Nukleinsäuren, insbesondere mRNA oder hnRNA, gerichtet sind, Antisense-Moleküle, die gegen für DNA-bindende Proteine, insbesondere HMG-Proteine oder Fragmente davon codierenden Nukleinsäuren, insbesondere mRNA oder hnRNA, gerichtet sind, Ribozyme, die gegen DNA-bindende Proteine, insbesondere HMG-Proteine oder Fragmente davon codierenden Nukleinsäuren, insbesondere mRNA oder hnRNA, gerichtet sind. Weiterhin sind die Mittel Aptamere und Spiegelmere, die gegen ein DNA-bindendes Protein, insbesondere ein HMG-Protein oder ein Fragment davon oder gegen eine dafür codierende Nukleinsäure gerichtet sind.
Antiköφer, wie hierin verwendet, sind bevorzugterweise monoklonale Antiköφer, die gemäß dem Protokoll von Cäsar und Milstein und Weiterentwicklungen davon hergestellt werden können. Antiköφer sind dabei auch Antiköφerfragmente oder -derivate, wie bspw. Fab- Fragmente, Fc-Fragmente aber auch einzelsträngige Antiköφer, solange diese generell in der Lage sind, HMGB spezifisch zu binden. Neben monoklonalen Antiköφern können auch polyklonale Antiköφer verwendet werden. Ein polyklonaler Antiköφer für die Grundlagenforschung, der grundsätzlich auch als Medikament verwendet werden könnte, ist bspw. der gegen HMGBl gerichtete Antiköφer sc- 12523 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Bevorzugterweise sind die verwendeten Antiköφer humane oder humanisierte Antiköφer.
Peptide oder Polypeptide, die mit einem DNA-bindenden Protein, insbesondere einem HMG- Protein oder einer dafür codierenden Nukleinsäure in Wechselwirkung treten, können mit im Stand der Technik bekannten Verfahren wie beispielsweise Phage-Display gescreent werden. Diese Techniken sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Dabei wird bei der Erzeugung derartiger Peptide typischerweise so vorgegangen, dass eine Peptid-Bibliothek angelegt wird, bspw. in Form von Phagen, und diese Bibliothek in Kontakt gebracht wird mit einem Zielmolekül, d. h. einem einem DNA-bindenden Protein, insbesondere einem HMG-Protein, bevorzugterweise mit HMGBl. Die bindenden Peptide werden sodann typischerweise als Komplex zusammen mit dem Zielmolekül von den nicht bindenden Mitgliedern der Bibliothek entfernt. Es ist dabei im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute auf diesem Gebiet, dass die Bindungseigenschaften zumindest bis zu einem bestimmten Umfang von den jeweils konkret vorliegenden Versuchsbedingungen, wie bspw. Salzgehalt und dergleichen, abhängen. Nach Abtrennen der mit einer höheren oder stärkeren Affinität oder Kraft an das Zielmolekül bindenden Peptide von den nicht-bindenden Mitgliedern der Bibliothek bzw. vom Zielmolekül können diese sodann charakterisiert werden. Gegebenenfalls ist vor der Charakterisierung ein Amplifikationsschritt, bspw. durch Vermehrung der entsprechenden, das Peptid bzw. die Peptide codierende Phagen erforderlich. Die Charakterisierung umfasst bevorzugter Weise die Sequenzierung der an das jeweilige DNA-bindende Protein, insbesondere an das jeweilige HMG bindenden Peptide. Die Peptide sind dabei hinsichtlich Ihrer Länge grundsätzHch nicht beschränkt. Typischerweise werden in derartigen Verfahren jedoch Peptide mit einer Länge von 8 bis 20 Aminosäuren erhalten bzw. verwendet. Die Größe der Bibliotheken beträgt 102 bis 1018, bevorzugter Weise 108 bis 1015 verschiedene Peptide.
Eine spezielle Form von an Zielmolekülen bindenden Polypeptiden stellen die Anticaline dar, wie sie beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung DE 19742 706 beschrieben sind.
Weiterhin können auch kleine Moleküle verwendet werden, die die Wirkung der DNA- bindenden Proteine, insbesondere der HMG-Proteine bzw. der für sie codierenden Nukleinsäure antagonisieren. Derartige kleine Moleküle können beispielsweise durch ein Screeningverfahren, insbesondere ein Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle identifiziert werden. Dabei wird das Zielmolekül mit einer Bibliothek in Kontakt gebracht und jene Mitglieder der Bibliothek, die daran binden, ermittelt, gegebenenfalls von den anderen Mitgliedern der Bibliothek bzw. vom Target abgetrennt und optional weiter charakterisiert. Auch hier wird die Charakterisierung des kleinen Moleküls nach den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten Verfahrensweisen erfolgen, so z.B. die Verbindung identifiziert und die Molekularstruktur bestimmt werden. Diese Bibliotheken umfassen dabei so wenig wie zwei und soviel wie bis zu mehrere 100 000 Mitglieder. Aptamere, wie hierin verwendet, sind D-Nukleinsäuren, entweder einzelsträngig oder doppelsträngig, die spezifisch an ein Zielmolekül binden. Die Herstellung von Aptameren ist bspw. beschrieben im Europäischen Patent EP 0 533 838. Dabei wird wie folgt vorgegangen:
Bei dem Verfahren zur Erzeugung der Aptameren wird eine Mischung aus Nukleinsäuren, d. h. potentiellen Aptameren bereitgestellt, wobei eine jede Nukleinsäure aus einem Segment aus wenigstens acht aufeinanderfolgenden, randomisierten Nukleotiden besteht und diese Mischung mit dem Target, im vorliegenden Falle somit mit DNA-bindenden Proteinen, insbesondere HMG-Proteinen, für sie codierenden Nukleinsäuren, Wechselwirkungspartnern von DNA- bindenden Proteinen, HMG-Wechselwirkungspartnern, insbesondere den natürlichen Wechselwirkungspartnern und/oder für sie codierenden Nukleinsäuren in Kontakt gebracht wird, wobei Nukleinsäuren, die an das Target binden, ggf. auf der Grundlage einer erhöhten Affinität, verglichen mit der Kandidatenmischung, vom Rest der Kandidatenmischung abgetrennt werden und die solchermaßen erhaltenen an das Target, ggf. mit einer höheren Affinität oder Kraft, bindenden Nukleinsäuren amplifiziert werden. Diese Schritte werden mehrfach wiederholt, so dass am Ende des Verfahrens spezifisch an das jeweilige Target oder Zielmolekül bindende Nukleinsäuren, sogenannte Aptamere, erhalten werden. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass diese Aptamere stabilisiert werden können, bspw. durch Einführung bestimmter chemischer Gruppen, wie den Fachleuten auf dem Gebiet der Aptamer-Entwicklung bekannt. Aptamere werden derzeit bereits therapeutisch eingesetzt. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die solchermaßen hergestellten Aptamere für die Targetvalidierung und als Leitsubstanzen für die Entwicklung von Medikamenten, insbesondere von kleinen Molekülen, verwendet werden.
Auf einem grundsätzlich ähnlichen Prinzip beruht die Herstellung oder Erzeugung von Spiegelmeren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf der Grundlage der DNA- bindenden Proteine, insbesondere der HMG-Proteine, der für sie codierenden Nukleinsäuren, der Wechselwirkungspartnern von DNA-bindenden Proteinen, HMG-Wechselwirkungspartner, insbesondere der natürlichen Wechselwirkungspartner, und/oder der für sie codierenden Nukleinsäuren als Zielmolekül entwickelt werden können. Die Herstellung von Spiegelmeren ist bspw. beschrieben in der internationalen Patentanmeldung WO 98/08856. Spiegelmere sind L- Nuklemsäure, d.h. bestehen aus L-Nukleotiden, und zeichnen sich im wesentlichen dadurch aus, dass sie in biologischen Systemen eine sehr hohe Stabilität aufweisen und gleichzeitig, vergleichbar den Aptameren, mit einem Zielmolekül spezifisch wechselwirken bzw. an dieses binden können. Dabei wird genauer so vorgegangen, dass eine heterogene Population aus D- Nukleinsäuren erzeugt wird, die Population mit dem optischen Antipoden des Zielmoleküls in Kontakt wird, im vorliegenden Falle somit mit dem D-Enantiomer des natürlicher Weise auftretenden L-Enantiomers, sodann jene D-Nukleinsäuren abgetrennt werden, die nicht mit der optischen Antipode des Zielmoleküls in Wechselwirkung getreten sind, die D-Nukleinsäuren, die mit der optischen Antipode des Zielmoleküls in Wechselwirkung getreten sind, bestimmt, ggf. abgetrennt und sequenziert werden und anschließend L-Nukleinsäuren synthetisiert werden, die in ihrer Sequenz mit derjenigen zuvor für die D-Nukleinsäuren ermittelten Sequenzen identisch sind. Ähnlich dem Verfahren zur Herstellung von Aptameren ist es auch hier möglich, durch mehrfaches Wiederholen der Schritte geeignete Nukleinsäuren, d.h. Spiegelmere anzureichern bzw. zu erzeugen.
Eine weitere Klasse von Verbindungen, die unter Verwendung der DNA-bindenden Proteine, insbesondere der HMG-Proteine und der dafür codierenden Nukleinsäuren hergestellt bzw. entwickelt werden können, sind Ribozyme, Antisense-Oligonukleotide und RNAi.
All diesen Klassen ist dabei gemein, dass sie nicht auf der Ebene des Translationsproduktes, d.h. auf der Ebene der DNA-bindenden Proteine, insbesondere der HMG-Proteine und Wechselwirkungspartner davon, insbesondere HMGBl, ihre Wirkung entfalten, sondern auf der Ebene der für das jeweilige Protein codierenden Nukleinsäure, insbesondere der für HMGBl codierenden mRNA.
Bei Ribozymen handelt es sich um katalytisch aktive Nukleinsäuren, die bevorzugter Weise aus RNA aufgebaut sind und aus zwei Teilbereichen bestehen. Der erste Teilbereich ist für eine katalytische Aktivität verantwortlich, wohingegen der zweite Teil für eine spezifische Wechselwirkung mit einer Ziel-Nukleinsäure verantwortlich ist. Kommt es zur Ausbildung einer Wechselwirkung zwischen der Ziel-Nukleinsäure und dem zweiten Teil des Ribozyms, typischer Weise durch Hybridisierung von zueinander im wesentlichen komplementären Basenbereichen, kann der katalytische Teil des Ribozyms entweder intramolekular oder intermolekular, wobei letzteres bevorzugt ist, die Ziel-Nukleinsäure hydrolysieren für den Fall, dass die katalytische Wirkung des Ribozyms eine Phosphodiesterase- Aktivität ist. In der Folge kommt es zu einem - ggf. weiteren - Abbau der codierenden Nukleinsäure, wobei der Titer des Zielmoleküls sowohl auf der Nukleinsäure- als auch der Proteinebene sowohl intrazellulär als auch extrazellulär verringert wird und somit eine therapeutischer Ansatz bei Erkrankungen des Endometriums bereitgestellt wird. Ribozyme, deren Verwendung sowie Konstruktionsprinzipien sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und bspw. beschrieben in Doherty und Doudna (Ribozyme structures and mechanisms. Annu Rev Biophys Biomol Struct 2001;30:457-75) und Lewin und Hauswirth (Ribozyme gene therapy: applications for molecular medicine. Trends Mol Med 2001, 7:221-8).
Auf einem grundsätzlich ähnlichen Wirkmechanismus beruht die Verwendung von Antisense- Oligonukleotiden zur Herstellung eines Medikamentes bzw. diagnostischen Mittels. Antisense- Oligonukleotide hybridisieren infolge Basenkomplementarität typischerweise mit einer Ziel- RNA, normaler Weise mit mRNA und aktivieren dadurch RNAaseH. RNAaseH wird sowohl durch Phosphodiester als auch Phosphorothioat-gekoppelte DNA aktiviert. Phosphodiester- gekoppelte DNA wird jedoch schnell durch zelluläre Nukleasen mit Ausnahme von Phosphorothioat-gekoppelter DNA abgebaut. Diese resistenten, nicht-natürlicher Weise auftretende DNA-Derivate inhibieren RNAaseH nicht, wenn sie mit RNA hybridisiert sind. Mit anderen Worten, Antisense-Polynukleotide sind nur als DNA-RNA-Hybridkomplex wirksam. Beispiele für derartige Antisense-Oligonukleotide finden sich, u.a. in US-Patent US 5,849,902 oder US 5,989,912. Prinzipiell besteht das wesentliche Konzept der Antisense-Oligonukleotide darin, gegen bestimmte RNA eine komplementäre Nukleinsäure bereitzustellen. Mit anderen Worten, ausgehend von der Kenntnis der Nukleinsäuresequenz der HMG-Proteine und ihrer Wechselwirkungspartner, insbesondere der jeweiligen mRNA, können durch Basenkomplementarität geeignete Antisense-Oligonukleotide hergestellt werden, die zu einem Abbau der codierenden Nukleinsäure, insbesondere der mRNA, führen.
Eine weitere Klasse von Verbindungen, die als Medikament bzw. diagnostisches Mittel grundsätzlich geeignet wären, ist die sogenannte RNAi. RNAi ist eine doppelsträngige RNA, die RNA-Interferenz vermittelt und typischerweise eine Länge von etwa 21 bis 23 Nukleotiden aufweist. Dabei entspricht einer der beiden Stränge der RNA einer Sequenz eines abzubauenden Genes. Mit anderen Worten, ausgehend von der Kenntnis der für die DNA-bindenden Proteine, insbesondere für die HMG-Proteine und/oder deren Wechselwirkungspartner codierenden Nukleinsäure, insbesondere der mRNA, kann eine doppelsträngige RNA hergestellt werden, wobei einer der beiden RNA-Stränge komplementär zu der besagten, für die DNA-bindenden Proteine, insbesondere für die HMG und/oder deren Wechselwirkungspartner codierenden Nukleinsäure ist, bevorzugter Weise zur mRNA, und diese dann zum Abbau der entsprechenden codierenden Nukleinsäure führt und damit einhergehend zu einer Verringerung des Titers der jeweiligen Proteine. Die Erzeugung und Verwendung von RNAi als Medikament bzw. diagnostisches Mittel ist bspw. beschrieben in den Internationalen Patentanmeldungen WO 00/44895 und WO 01/75164.
Mit Blick auf die Wirkmechanismen der vorstehend beschriebenen Klassen, Ribozymen, Antisense-Oligonukleotiden sowie RNAi, ist es somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung, neben den DNA-bindenden Proteinen, insbesondere die HMG-Proteinen, insbesondere HMGBl, und deren insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartnern auch die dafür codierenden Nukleinsäuren, insbesondere die mRNA, zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung und/oder Prävention der vorstehend genannten Erkrankungen, nämlich Tumoren, Tumorerlσankungen, Histiozytose, entzündliche Erkrankungen, Entzündungen und Arthritis, bzw. für die Herstellung eines diagnostischen Mittels für die Diagnose der vorstehend genannten Erkrankungen und dem Überwachen des Verlaufes der Erkrankung bzw. der angesetzten Therapie, entweder direkt oder als Zielmolekül, zu verwenden.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die vorstehend genannten Klassen von Verbindungen, d. h. Antiköφer, Peptide, Antikaline, kleine Moleküle, Aptamere, Spiegelmere, Ribozyme, Antisense-Oligonukleotide sowie RNAi, die gegen die DNA-bindenden Proteine, insbesondere die HMG-Proteine, Fragmenten davon oder dafür codierenden Nukleinsäuren gerichtet sind und bevorzugterweise die Wirkung dieser Proteine bzw. der dafür codierenden Nukleinsäuren antagonisieren, für die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und/oder Prävention insbesondere von Tumoren, Tumorerkrankungen, Histiozytose, entzündliche Erkrankungen, Entzündungen und Arthritis verwendet werden. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass diese Medikamente bzw. Mittel nicht nur für die Behandlung der vorstehend genannten Erkrankungen, sondern auch für diagnostische Zwecke verwendet werden können, mithin die vorstehend genannte Mittel auch als Diagnostika oder diagnostische Mittel verwendet werden können, bevorzugterweise für Tumoren, Tumorerkrankungen, Histiozytose, entzündliche Erkrankungen, Entzündungen und Arthritis.
Die diese Mittel enthaltenden pharmazeutischen oder diagnostischen Zusammensetzungen umfassen in einer Ausführungsform neben einer oder mehreren der vorstehend genannten bzw., wie hierin offenbart, erzeugten Verbindungen noch andere pharmazeutisch oder diagnostisch wirksame Verbindungen oder Mittel, sowie bevorzugterweise zumindest einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Derartige Träger können bspw. flüssig oder fest sein, bspw. eine Lösung, ein Puffer, eine alkoholische Lösung und dergleichen. Als geeignete feste Träger kommen bspw. Stärke und dergleichen in Betracht. Es ist den Fachleuten auf dem Gebiet der pharmazeutischen Darreichungsformen bekannt, wie die entsprechenden Verbindungen der verschiedenen Klassen formuliert werden müssen, um auf dem jeweils angestrebten Darreichungsweg, bspw. oral, parenteral, subcutan, intravenös und dergleichen mehr, verabreicht werden zu können. Neben den vorstehend beschriebenen Mitteln, die DNA-bindende Proteine, insbesondere HMG- Proteine, Fragmente davon oder dafür codierende Nukleinsäuren antagonisieren, d. h. kleine Moleküle, Peptide, Anticaline, Antiköφer, Aptamere, Spiegelmere, Ribozyme, Antisense- Oligonukleotide (hierin auch als Antisense-Moleküle bezeichnet) sowie RNAi, kann auch der Zeiloberflächenrezeptor RAGE oder Fragmente davon zu diesen Zwecken verwendet werden, d. h. als Mittel für die Herstellung eines diagnostischen Mittels für Tumoren, Tumorerkrankungen, Histiozytose, entzündliche Erkrankungen, Entzündungen und Arthritis oder eines Medikamentes für die Behandlung und/oder Prävention von Tumoren, Tumorerkrankungen, Histiozytose, entzündliche Erkrankungen, Entzündungen und Arthritis verwendet werden. Der Rezeptor, bzw. die davon abgeleiteten Fragmente, können, ohne im Folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, infolge bevorzugterweise kompetitiver Inhibierung die Wirkung der HMG-Proteine, insbesondere des HMGBl -Proteins antagonisieren. Daraus ergibt sich die erfindungsgemäße Verwendung des Zelloberflächenrezeptors RAGE bzw. seiner Fragmente bzw. der für ihn codierenden Nukleinsäuren zur Herstellung eines Medikamentes oder Diagnostikums für die Behandlung der vorstehend genannten Erkrankungen.
Dieser Wirkmechanismus beruht darauf, dass DNA-bindende Proteine, insbesondere HMG- Proteine, insbesondere HMGBl, extrazellulär ein Ligand des Zelloberflächemezeptors RAGE ist (receptor for advanced glycation end products), der beispielsweise bei Taguchi et al. beschrieben ist (Taguchi, A, Blood, D.C., del Toro, G., Canet, A., Lee, D.C., Qu, W., Tanji, N., Lu, Y., Lalla, E., Fu, C, Hofmann, M.A., Kislinger, T., Ingram, M., Lu, A., Tanaka, H., Hori, O., Ogawa, S. Stern, D.M., Schmidt, A.M. (2000). Nature 405: 354-360).
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die HMG-Proteine, auch die hierin Bezug genommen wird, insbesondere jene sind, die hierin offenbart sind, jedoch sind sie nicht auf diese beschränkt. Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Begriff DNA- bindende Proteine synonym mit dem Begriff basische DNA-Proteine verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren, Beispiele sowie des Sequenzprotokolls erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Ausgestaltungsformen und Vorteile ergeben. Dabei zeigt Fig. 1 ein Diagramm mit Sprossenlängen aus Sphäroiden nach Behandlung mit VEGF oder HMGBl-Protein;
Fig. 2 ein Diagramm mit Sprossenlängen aus Sphäroiden nach Behandlung mit VEGF oder HMGAl-Protein;
Fig. 3 eine Erhöhung der Anzahl mitotisch aktiver Hautzellen unter dem Einfluss von HMGAla;
Fig. 4 eine Immunfluoreszenzaufhahme von Heia-Zellen, die zum Teil fluoreszenzmarkiertes HMGAlb-Protein in den Zellkernen aufweisen;
Fig. 5 eine Immunfluoreszenzaufnahme von Fibroblasten, die zum Teil fluoreszenzmarkiertes HMGAlb-Protein in den Zellkernen aufweisen;
Fig. 6 eine Fluoreszenzaufhahme von Zellen, die reines Fluoreszein aufgenommen haben als Negativkontrolle zu den in Fig. 4 und 5 dargestellten Aufnahmen;
Fig. 7 eine lichtmikroskopische Aufnahme eines mit HMGA-Protein behandelten Hautstückchens, aus dem verschiedene Hautzelltypen wie Keratinocyten und Fibroblasten auswachsen; und
Fig. 8 eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Gefrierschnittes durch die Haut der Ratte zum Beleg des Transfers von markiertem HMGAlb-Protein nach Streptolysin O-Behandlung.
Beispiel 1: Material und Methoden
Die folgenden Materialien und Methoden wurden im Rahmen der weiteren Beispiele verwendet, sofern nicht im Einzelfall davon abweichend angegeben.
Der Transfer von Proteinen in eukaryotische Zellen mit Hilfe von Streptolysin O (SLO) erfolgt durch Variationen in der Ca2+ -Konzentration: in Abwesenheit von Ca2+-Ionen erfolgt die Lyse der Zellen und durch nachfolgende Zugabe von Ca2+-Ionen können die Zellen wieder verschlossen werden.
Kultivierung der Zellen
Als Vorbereitung werden die Zellen, insbesondere primäre humane Fibroblasten, primäre human Chondrozyten, primäre humane Keratinozyten, murine Keratinozyten (MSC-P5, Cell Lines Service and Cellbank, Heidelberg) und humane HeLa-Zellen (ECACC N 85060701) gleichmäßig auf 6- Well Platten mit je 2,5 ml Medium 199 (Gibco-BRL; mit 5 % fetalem Kälberserum) pro Well verteilt und über Nacht bis zu einer Zelldichte von ca. 50 - 70 % bei 37°C und 5 % CO2 Begasung inkubiert. Als alternative Variation zum intakten Monolayer wird bei einigen Testreihen vor Versuchsbeginn in der Mitte der Wells mittels eines Zellschabers ein zellfreier Raum erzeugt, um eine künstliche Wunde zu simulieren.
Verfahren zum Einschleusen von HMGAla in Monolayerzellkulturen mittels Streptolysin O
Vor der Lyse werden die Zellen zweimal mit lxPBS gewaschen, um Mediumrückstände, die Ca2+-Ionen enthalten, zu entfernen. Die Lyse der Zellen durch Streptolysin O (Streptolysin O Reagent, Sigma-RBI) erfolgt in Ca2+-freiem PBS-Puffer (Biochrom). Als optimale Streptolysin- Konzentration, bei der die Mehrzahl der Zellen reversibel verschließbare Poren erhalten, konnte in Vorversuchen mittels Trypan-Blau Färbung (Sigma-RBI) eine Konzentration von 0,1 U SLO/1 ml PBS für Fibroblasten ebenso wie für Keratinozyten der menschlichen Haut ermittelt werden. Pro Well werden 1 ml des PBS/Streptolysin-Gemisches mit der gewünschten Konzentration des auszutestenden HMG-Proteins (z. B. lOO ng/ml, 200 ng/ml und lOOO ng/ml HMGAla) auf die Fibroblasten bzw. Epithelzellen bzw. Keratmozyten gegeben. Nach einer Inkubation von 15 min bei RT erfolgt die Zugabe von 3 ml eiskaltem Medium 199 (mit 5 % fetalem Kälberserum und 1,8 mM Ca2+), um die Zellen wieder zu verschließen. Die Zellen werden für 2 Stunden bei 37°C und 5 % CO2 Begasung inkubiert. Anschließend werden die verschiedenen Ansätze durch 2,5 ml irisches Medium ersetzt und weiterhin bis zur Auswertung wie zuvor inkubiert.
Zur Auswertung werden die Zellen mikroskopisch hinsichtlich ihrer Moφhologie und der Besiedelung des zellfreien Raums beurteilt. Desweiteren erfolgt eine Methanol-Fixierung der Zellen mit anschließender Giemsafärbung (2 %ige Giemsalösung), um die Anzahl der Mitosen gegenüber der Gesamtzellzahl zu bestimmen.
Verfahren zur spontanen Aufnahme von fluoreszenzmarkiertem HMGA-Proteinen in Monolaverzellkulturen
Vorbereitend wurden die Zellen in Leighton-Tubes mit eingelegten Deckgläsern (mit je 1 ml Medium 199 über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert).
Um sicherzustellen, daß keine Mediumreste mehr vorhanden sind, wurden die Zellen zweimal mit 1 ml PBS bei Raumteperatur gewaschen. Anschließend wurden 200 μl serumfreies Medium und je 6 μg markiertes HMGA-Protein bzw. als Negativkontrolle 6 μg Fluorescein-Lösung zu den Zellen gegeben. Der Ansatz wurde 1 h lichtgeschützt bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte die Zugabe von 250 μl Medium und eine weitere Inkubation von 2 h 30 min. Danach werden die Deckgläschen in PBS kurz gewaschen und auf OT eingedeckt. Die Auswertung erfolgte nach ca. 4 h.
Verfahren zum Einschleusen von fluoreszenzmarkiertem HMGAlb in Monolaverzellkulturen mittels Streptolysin Q
Vorbereitend wurden Heiazeilen und Fibroblasten in Leighton-Tubes mit je 1 ml Medium 199 o/n bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Helazellen wurden in Medium mit 20 % fetalem Kälberserum, die Fibroblasten mit 5 %igem Kälberserum kultiviert.
Um sicherzustellen, daß keine Mediumreste mehr vorhanden sind, werden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Das bei RT aufgetaute Streptolysin O wurde mit PBS auf eine Konzentration von 0,1 U/ml verdünnt. AnschHeßend wurden 350 μl des verdünnten Streptolysins O und 6 μg markiertes HMGAlb-Protein bzw. als Negativkontrolle 6 μg FLUOS- Lösung zu den Heia-Zellen und den Fibroblasten gegeben. Der Ansatz wurde 15 min Hchtgeschützt bei RT inkubiert. Durch die Zugabe von 1 ml eiskaltem Medium 199 (mit 20 % fetalem Kälberserum für die Heia-Zellen und 5 %igem Kälberserum für die Fibroblasten) wurden die Zellen wieder verschlossen. Nach einer Inkubation von 1 h 30 min bei 37°C und 5 % CO2 werden die Deckgläschen in PBS kurz gewaschen und danach auf OT eingedeckt. Die Auswertung erfolgte nach ca. 2 h.
Verfahren zum Einschleusen von HMGA-Proteinen in Gewebesτücke der Haut
Die Hautproben werden steril entnommen und für den Transport und bis zum Versuchsbeginn in Hanks-Lösung (Biochrom) gelagert. Für den Versuch wird die Haut in ca. 0,5 - 1 mm große Stücke geschnitten und auf Sarstedtröhrchen verteilt. Durch Zentrifugation für 5 min bei 120χg und RT werden die Hautstücke dreimal in lxPBS gewaschen, bis alle Mediumreste ausgewaschen sind. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wird der Überstand vollständig entfernt und die Hautstückchen für 15 min bei RT in 1 ml SLO/PBS-Lösung (0,1 U SLO/1 ml PBS) und lOOO ng/ml des jeweiligen HMG-Proteins (HMGAla, HMGAlb, HMGA2) pro Ansatz inkubiert. Zum Beenden der Lyse erfolgt die Zugabe von je 3 ml eiskaltem Medium 199 (mit 20 % fetalem Kälberserum und 1,8 mM Ca2+) und eine Inkubation der Ansätze für 2 Stunden bei 37°C und 5 % CO Begasung. Abschließend werden die Hautstückchen auf sterile Deckgläschen verteilt, invertiert in Feuchtkammern überführt, mit je 5 ml 20 %igem Medium 199 bedeckt und weiterhin bei 37°C und 5 % CO2 Begasung inkubiert. Zur Auswertung werden die Hautstückchen täglich mikroskopiert und das Auswachsen der verschiedenen Hautzelltypen dokumentiert.
Verfahren zum Einschleusen von fluoreszenzmarkiertem HMGAlb in Gewebestücke der Haut
Die frisch entnommene Rattenhaut wurde in Medium 199 mit 20 %igem fetalem Kälberserum mittels sterilem Präparierbesteck in kleine Stücke, die einer Größe von ca. 1 - 2 mm2 entsprachen, klein geschnitten. Die Hautstückchen wurden viermal mit PBS gewaschen, um so sämtliche Medium bzw. Ca2+-Rückstände zu beseitigen. Anschließend wurden die Hautstückchen in ein Eppendorfcup überführt und 350 μl des verdünnten Streptolysins O (0,1 U/ml) und 6 μg markiertes HMGAlb-Protein bzw. als Negativkontrolle 6 μg FLUOS- Lösung zu den Hautstücken gegeben. Der Ansatz wurde 15 min lichtgeschützt bei RT inkubiert. Durch die Zugabe von 1 ml eiskaltem Medium 199 (mit 20 % fetalem Kälberserum) wurden die Zellen wieder verschlossen. Nach einer Inkubation von 1 h 30 min bei 37°C und 5 % CO2 werden von den Hautstücken Gefrierschnitte angefertigt, die mit Antifade eingedeckt wurden. Die Auswertung unter dem Fluoreszenz-Mikroskop erfolgte nach ca. 2 - 3 h.
Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von HMG-Proteinen
Die Markierung erfolgte nach dem Fluorescein Labeling Kit der Firma Röche.
Es wurden pro Ansatz 100 μg HMG-Protein, insbesondere HMGAlb Protein lyophilisiert und in 100 μl PBS-Puffer resuspendiert. Zu dem gelösten HMGAlb wurden 1 μl FLUOS-Lösung (2 mg/ml) gegeben und der Ansatz wurde lichtgeschützt, unter Rühren 2 h bei RT inkubiert.
Sephadex-G-25-Säulen wurden mit 5 ml Blockierungslösung und 30 ml PBS äquilibriert. Anschließend wurde der Reaktionsansatz auf die Säule übertragen und das markierte Protein mit 3,5 ml PBS eluiert. Das markierte Protein war jeweils in den ersten beiden Pools von jeweils 10 Tropfen (ca. 0,5 ml) enthalten.
Eine Verifizierung der Markierung erfolgte mittels HPLC (Vergleich der Peaks von FLUOS- Lösung/markiertes HMGA, insbesondere HMGAlb und PA-Gel. Dabei zeigte das markierte Protein bei UV-Licht eine deutliche Bande, was mittels Coomassie-Färbung bestätigt werden konnte. Es wurden ca. 60 μg/ml HMGA, insbesondere HMGAlb mit Fluorescein markiert.
Beispiel 2: Kultivierung von Endothelzellen
Methode:
Für die Kultivierung von humanen Endothelzellen wurden Arterienpräparate der Arteria carotis verwendet. Nach der Entnahme wurden die Gewebsstücke bis zur Präparation in Hanks-Lösung gelagert. Die Präparation erfolgte in Hanks-Lösung, indem die Intima vorsichtig von der Media getrennt wurde. Anschließend wurden die ca. 1 mm großen Gewebsstückchen auf Deckgläschen gelegt und umgekehrt in der Zellkulturflasche kultiviert. Die Vorkultivierung erfolgt in 1 ml endothelialem Wachstumsmedium mit den dazugehörigen Wachstumsfaktoren bei 37°C und 5 % CO2. Nach dem Erreichen einer konfluenten Zelldichte wurden die Zellen mit PBS gewaschen, trypsiniert und 1 :3 geteilt. Ergebnisse:
Nach ca. 2 Wochen konnten erste ausgewanderte Zellen beobachtet werden. Zur Verifizierung der Zellen wurde eine Immunhistochemie mit dem anti human CD 31 endothelial cell Antiköφer durchgeführt. Dadurch konnte bestätigt werden, dass es sich hierbei um humane Endothelzellen handelt.
Beispiel 3: Proliferationstest endothelialer Zellen durch die Applikation von HMGBl
Optimierung der Zellzahl
Methode:
Der Proliferationstest wurde mit dem Cell Proliferation ELISA, BrdU Kit der Firma Röche durchgeführt.
Zur Ermittlung der optimalen Zellzahl wurden verschiedene Verdünnungen der Endothelzellen (105 - 102 Zellen/100 μl) in 96 well Platten für 2 Tage bei 37°C und 5 % CO2 in dem entsprechenden Wachstumsmedium kultiviert. Als Kontrolle diente das entsprechende Wachstumsmedium. Anschließend wurde pro Napf 10 μl BrdU (Konzentration: 10 μM) zugegeben und der Ansatz für 2h 30 min bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Nachdem das Medium abgesaugt wurde, erfolgte die Fixierung der Zellen mit 200 μl/Napf Fixierungslösung durch eine Inkubation von 30 min bei RT. Danach wurden 100 μl/Napf anti-BrdU- Antiköφer zugegeben und 90 min bei RT inkubiert. Zur Entfernung des nicht gebundenen Antiköφers wurde der Ansatz dreimal mit 200 μl Waschlösung gewaschen. Um die Proliferation mittels kolorimetrischer Bestimmung zu messen, wurde zu dem Ansatz 100 μl/Napf Substrat gegeben, nach ca. 5 min mit 25 μl/Napf 1 M H2SO4 gestoppt und die Absoφtion von 450 nm zu 750 nm mittels anfhos readers 2001 gemessen. Es wurden pro Verdünnung drei Ansätze durchgeführt. Ergebnisse:
Nach Berechnung des Mittelwertes der Parallelansätze wurden die verschiedenen Verdünnungen der Endothelzellen mittels Microsoft Excel graphisch dargestellt und ausgewertet. Dabei ergab sich eine optimale Zellzahl von 5.000-7.500 Zellen/100 μl.
Applikation von HMGBl zu Endothelzellen
Methode:
Die Kultivierung erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben. Nach Verteilung der optimalen Zellzahl der Endothelzellen in die entsprechenden Näpfe einer 96 Napf-Platte wurde der Ansatz für 24 h bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Danach erfolgte die Zugabe von verschiedenen HMGBl - Konzentrationen (1 μg, 0,1 μg und 10 ng). Es wurden pro HMGBl -Konzentration 3 Parallelansätze durchgeführt. Nach einer Kultivierung von weiteren 24 h erfolgte die Zugabe von BrdU. Die weiteren Schritte wurden wie in Beispiel 3 unter „Optimierung der Zellzahl" beschrieben durchgeführt.
Ergebnisse:
Es konnte bei den Endothelzellen, denen HMGBl appHziert wurde, eine erhöhte ProHferationsrate im Vergleich zur Negativkontrolle festgestellt werden. Dabei konnte eine Korrelation zwischen der ProHferationsrate und der applizierten HMGBl -Konzentration gezeigt werden. Allgemein konnte bei den Zellen, denen HMGBl appHziert wurde, eine erhöhte Mitoserate makroskopisch festgestellt werden.
Beispiel 4: Untersuchungen zur proangiogenen Wirkung von HMGBl im Sphäroidmodell
Methode:
Vorbereitend wurden humane Endothelzellen mit dem entsprechenden endothelialen Wachstumsmedium bei 37° C und 5 % CO2 kultiviert. Die für die Versuche verwendeten Endothelzellen stammten aus der 2. bzw. 3. Passage. Nach der Kultivierung wurden die Zellen trypsiniert und in dem entsprechenden Wachstumsmedium mit einem 20%igen Anteil Methocel resuspendiert. Nach einer Inkubation von ca. 4 h bildeten die Zellen spontane dreidimensionale Zellkugeln (Sphäroide), die dann in ein Kollagengel eingebettet wurden. Für den entsprechenden Wachstumstest wurden diesem Gel folgende HMGBl -Konzentrationen zugegeben: 2 μg/ml; 0,4 μg/ml und 0,08 μg/ml. Als Referenz diente der endotheliale Wachstumsfaktor VEGF in einer Konzentration von 25 ng/ml bzw. wurde als Negativkontrolle kein Wachstumsfaktor zu dem Ansatz gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2 Wochen wurden die Ansätze unter einem inversen Mikroskop mit einer Digitalkamera erfasst. Die Aufnahmen wurden direkt in die Bildanalyse-Software analySIS von Soft Imaging System eingelesen und ausgewertet.
Ergebnisse:
Mittels der Bildanalyse-Software konnte die additive Sprosslänge, d. h. die Gesamtlänge der von einem Sphäroid ausgehenden Sprossung ermittelt werden. Dabei konnte eine signifikante proangiogene Wirkung von HMGBl bei einer Konzentration von 2 μg/ml ermittelt werden. Im Vergleich zur Negativkontrolle konnte hier ein deutliches Sprossen beobachtet werden. Des Weiteren zeigte die Kombination VEGF/HMGB1 ein stärkeres Aussprossen als nur HMGBl. Das Ergebnis ist graphisch in Fig. 1 dargestellt.
Beispiel 5: Untersuchungen zur proangiogenen Wirkung von HMGA1 im Sphäroidmodell
Methode:
Vorbereitend wurden humane Endothelzellen mit dem entsprechenden endothelialen Wachstumsmedium bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Die für die Versuche verwendeten Endothelzellen stammten aus der 2. bzw. 3. Passage. Nach der Kultivierung wurden die Zellen trypsiniert und in dem entsprechenden Wachstumsmedium mit einem 20%igen Anteil Methocel resuspendiert. Nach einer Inkubation von ca. 4 h bildeten die Zellen spontane dreidimensionale Zellkugeln (Sphäroide), die dann in ein Kollagengel eingebettet wurden. Für den entsprechenden Wachstumstest wurden diesem Gel eine HMGA1 -Konzentration von 2 μg/ml zugegeben. Als Referenz diente der endotheliale Wachstumsfaktor VEGF in einer Konzentration von 25 ng/ml bzw. wurde als Negativkontrolle kein Wachstumsfaktor zu dem Ansatz gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2 Wochen wurden die Ansätze unter einem inversen Mikroskop mit einer Digitalkamera erfaßt. Die Aufnahmen wurden direkt in die Bildanalyse-Software analySIS von Soft Imaging System eingelesen und ausgewertet.
Ergebnisse:
Mittels der Bildanalyse-Software konnte die additive Sprossenlänge, d. h. die Gesamtlänge der von einem Sphäroid ausgehenden Sprossung ermittelt werden. Dabei konnte eine proangiogene Wirkung sowohl von HMGAla als auch HMGAlb bei einer Konzentration von 2 g/ml ermittelt werden. In der Kombination HMGA la konnte eine Steigerung des Aussprossens gezeigt werden im Vergleich zu VEGF ohne HMG-Protein. Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 2 dargestellt.
Beispiel 6: Transfer von HMGAla-Proteinen in Fibroblasten-Monolayerkulturen der humanen Haut durch Streptolysin O
Im Vergleich zu den Hautzellen der Negativkontrolle (Behandlung nur mit Streptolysin O) konnte bei den mit den HMGAla-Proteinen behandelten Zellen eine signifikante Erhöhung der ProHferationsrate festgestellt werden. Entsprechend der erhöhten ProHferationsrate konnte auch bei Auszählung der Anzahl der Zellen, die sich in der Mitose befinden, im Verhältnis zu der Gesamtzellzahl ein signifikanter Anstieg in der Zellteilungsrate ermittelt werden, wie dies auch in Fig. 3 dargestellt ist. Darüber hinaus wiesen die mit HMGA-Proteinen behandelten Zellen eine erhöhte Motilität auf, was z. B. anhand des Einwuchses der Zellen in den zellfreien Raum ermittelt werden konnte.
Beispiel 7: Transfer von markierten HMGAlb-Proteinen in mit SLO behandelte Zellen
Die Aufnahme der markierten HMGAlb Proteine konnte nach einer Inkubationszeit von ca. 2 h sowohl in den Kernen der Heia-Zellen (Fig. 2) als auch in denen von Fibroblasten (Fig. 5) gezeigt werden. Die Betrachtung der Zellen unmittelbar nach der Behandlung mit SLO zeigte keine Positivität der Zellkerne, d. h. die Aufnahme der HMGAlb-Proteine in den Zellkern dauert ca. 2 h. Es wurde beispielhaft für die Helazellen ein Verhältnis von HMGAlb-positiven Zellkernen im Vergleich zu HMGAlb-negativen von 16 zu 32 ermittelt.
Der Vergleich zur Negativkontrolle, d. h. die Aufnahme des reinen Fluoresceins, ergab keine Kempositivtät, sondern nur eine grünliche diffuse Färbung des Cytoplasmas, wie dies auch in Fig. 6 dargestellt ist.
Beispiel 8: Transfer von HMGA-Proteinen in Hautproben von Mensch und Ratte durch Streptolysin O
Bei dem Transfer der HMGA-Proteine (HMGAla, HMGAlb und HMGA2) in die Zellen von Hautproben von Mensch und Ratte konnte eine erhöhte Proliferation bei den mit HMGA- Proteinen behandelten Hautstücken im Vergleich zu den Negativkontrollen ermittelt werden. Aus den analysierten Hauφroben wuchsen verschiedene Hautzelltypen (z. B. Keratinozyten, Fibroblasten) aus (siehe Fig. 7), die trotz der Streptolysinbehandlung eine hohe Zellteilungsrate und Zellvitalität aufwiesen. Darüber hinaus war bei den mit HMGA-Proteinen behandelten Hautproben neben der erhöhten ProHferationsrate auch ein deutlicher Anstieg in der Motilität der Zellen zu verzeichnen; was die Übertragbarkeit des hierin offenbarten therapeutischen Konzeptes von Zellkulturen auf Gewebe bestätigt.
Beispiel 9: Transfer von markierten HMGAl b-Proteinen in die Haut der Ratte durch Streptolysin O
Die Auswertung der Gefrierschnitte ergab, wie Fig. 8 gezeigt, eine starke Kempositivität bezüglich HMGAl sowohl des Plattenepithels als auch teilweise des Bindegewebes. Auch hier zeigte sich, wie zuvor in der Zellkultur beobachtet, daß eine Kempositivität erst nach einer Inkubationszeit von ca. 2 h beobachtet werden kann. Dies bestätigt wiederum, daß der Kerntransport der HMG-Proteine ca. 2 h beträgt.
Ein Vergleich zur Negativkontrolle zeigte eine grünliche diffuse Färbung des Cytoplasmas, wobei alle Zellkerne negativ gefärbt waren. Beispiel 10: Fluoresceinmarkierung des HMGAlb-Proteins
Eine Verifizierung der Markierung erfolgte mittels HPLC (Vergleich der Peaks von FLUOS- Lösung/markiertes HMGAlb) und PA-Gel. Dabei zeigte das markierte Protein bei UV-Licht eine deutliche Bande, welches mittels Coomassie-Färbung bestätigt werden konnte. Es wurden ca. 60 μg/ml HMGAlb mit Fluorescein markiert.
Beispiel 11: Expressionsprofilanalyse mittels Mikroarrays zur Bestimmung der Wirkungsweise von HMGAl b-Proteinen auf die Geweberegeneration
Zur Analyse der molekulargenetischen Wirkungsweise der HMGAlb-Proteine bei der Geweberegeneration wurden Microarrays (Human 3 OK Array (A/B/C) von MWG-Biotech) eingesetzt, um das Expressionsmuster der mit HMGAlb-Proteinen behandelten Hautproben im Vergleich zu unbehandelten Hautproben zu analysieren.
Hierzu wurde eine humane Hautprobe in ca. 0,5 - 1 mm große Stücke geschnitten und auf Sarstedtröhrchen verteilt. Durch Zentrifugation für 5 min bei 120xg und RT wurden die Hautstücke dreimal in IxPBS gewaschen, bis alle Mediumreste ausgewaschen waren. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde der Überstand vollständig entfernt und die Hautstückchen für 15 min bei RT in 1 ml SLO/PBS-Lösung (O.l U SLO/l ml PBS) und 1000 ng/ml des HMGAlb-Proteins pro Ansatz bzw. ohne Protein (Negativkontrolle) inkubiert. Zum Beenden der Lyse erfolgte die Zugabe von je 3 ml eiskaltem Medium 199 (mit 20 % fetalem Kälberserum und 1,8 mM Ca2+) und eine Inkubation der Ansätze für 12 Stunden bei 37°C und 5 % CO2 Begasung.
Die Isolierung der RNA aus den Hautproben erfolgte über das RNeasy RNA Isolierungs Kit (Qiagen) nach dem Protokoll „Isolation of total RNA from Heart, Muscle, and Skin Tissue" des Herstellers und einem zusätzlichen DNase Verdau für 2x15 min bei 25°C. Die Synthese der ss cDNA wurde nach dem Standardprotokoll für Superscript (Invitrogen) durchgeführt. Die Fluoreszenzmarkierung der cDNA erfolgte mit Cy3-UTP und Cy5-UTP über „Direct-labeling" der ss cDNA. Zur Hybridisierung wurde die markierte cDNA für 3 min bei 95 °C denaturiert, 3 min auf Eis inkubiert und ggf. ausfallende Präzipitate bei 42°C gelöst. Die Hybridisierung erfolgte nach Angaben des Microarray Herstellers (MWG Biotech) mit Hilfe eines Microarray Gene Frames bei 42°C für 16 - 24 Stunden Die anschließenden Waschschritte in 2xSSC, 0,1 % SDS (Waschpufferl), lxSSC (Waschpuffer2) und 0,5xSSC (Waschpuffer3) erfolgten nach Angaben des Herstellers. Die Auswertung wurde mit einem Affymetrix 428 Array Scanner dmchgeführt.
Über die Analyse der erhaltenen Expressionsmuster konnten wichtige Informationen über die Wirkungsweise der HMGA-Proteine bzw. des HMGAlb-Proteins bei der Proliferation und Reaktivierung von Haut-Zellen gewonnen werden. Das Ergebnis der Auswertung zeigte die Wirkung der Zugabe des HMGAlb-Proteins auf die Genexpression des Zielgewebes über die Interaktion des HMGAlb-Proteins mit seinen Partnern auf Protein-DNA sowie Protein-Protein Ebene. Über diese Mechanismen der Interaktionen des Proteins wird das Expressionsmuster einer Reihe von Genen, die an der Wundheilung sowie der Regeneration der Haut beteiligt sind, reguliert. Über den Nachweis der Re-Expression fetaler Genen in adultem Gewebe konnte die bedeutende Rolle der HMGA-Proteine bzw. des HMGAlb-Proteins bei der Geweberegeneration der Haut sowohl auf dem Gebiet der Wundheilung als auch für das Anti-Aging, d. h. für die Gewebeverjüngung verifiziert werden.
Beispiel 12: Expressionsprofilanalyse mittels Mikroarrays zur Bestimmung der Wirkungsweise von HMGA-Proteinen auf die Reparatur von DNA-Schäden
Zur Analyse der molekulargenetischen Wirkungsweise der HMGA-Proteine bei der Reparatur von DNA-Schäden wurden Arrays (Atlas- Arrays 1.2 von Clontech, # 7850-1, 1176 Gensequenzen des menschlichen Genoms umfassend) eingesetzt, um das Expressionsmuster der mit HMGA-Proteinen behandelten Keratinozyten im Vergleich zu unbehandelten Keratinozyten zu analysieren.
Die Isolierung der RNA aus den Zellen erfolgte über das RNeasy RNA Isolierungs Kit (Qiagen) nach dem Protokoll „Isolation of total RNA from Heart, Muscle, and Skin Tissue" des Herstellers und einem zusätzlichen Dnase Verdau für 2x15 min bei 25°C. Die Synthese der ss cDNA wurde nach dem Standardprotokoll für Superscript (Invitrogen) durchgeführt, die cDNA radioaktiv ( P) markiert und dann zur Hybridisierung eingesetzt.
Eingesetzt wurden die Proteine HMGAla, HMGAlb und HMGA2 in einer Menge von jeweils 6 μg. Es zeigte sich, daß durch die Gabe von rekombinanten, humanen HMGA-Proteinen Gene heraufreguliert wurden, deren Proteine in Zusammenhang mit der Reparatur von DNA-Schäden stehen. Beispiele zeigt die Tab.3. ATM ist eine Proteinkinase, die bei Doppelstrangbrüchen aktiviert wird. ATM phosphoryliert weitere Schlüsselproteine als Antwort auf Doppelstrangbrüche (Yosef Shiloh: ATM and related proteins kinases: safeguarding genome integrity. Nature Review Cancer 2003: 3, 155-168.). TOP1 ist Topoisomerase 1, die in DNA- Reparaturprozesse involviert ist (Pastor N, Cortes F: DNA topoisomerase activities in Chinese hamster radiosensitive mutants after X-ray treatment. Cell Biol In72002: 26, 547-555.)
Tab. 3: Heraufregulation von Genen, deren Proteine in Zusammenhang mit der
Reparatur von DNA-Schäden stehen, als Folge der Gabe von HMGA-Proteinen. Angegeben ist jeweils der Mittelwert (Dreifach-Ansätze) des Quotienten aus der Expression im behandelten Ansatz durch die Expression im unbehandelten Ansatz.
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Beispiel 13: Spontaner Transfer von Flureszenz-markierten HMGAlb und HMGA2- Proteinen in menschliche Epithelzellen
Die spontane Aufnahme der markierten HMGA Proteine, insbesondere HMGAlb und HMGA2 konnte nach einer Inkubationszeit von ca. 4 h in den Kernen der Zellen gezeigt werden. Die Betrachtung der Zellen unmittelbar nach der Behandlung zeigte keine Positivität der Zellkerne, d. h. die Aufnahme der HMGA-Proteine in den Zellkern dauert ca. 4 h. Der Vergleich zur Negativkontrolle, d. h. die Aufnahme des reinen Fluoresceins, ergab keine Kempositivtät, sondern nur eine grünliche diffuse Färbung des Cytoplasmas. Abhängig von dem einzelnen Experiment, wie in Beispiel 1 allgemein beschreiben, zeigen 50-100 % der Zellen die nukleare Fluoreszenzfärbung. Da diese Färbung erst bei relativ hohen Proteinkonzentration sichtbar ist, kann davon ausgegangen werden, dass alle Zellen HMGA-Proteine aufnehmen.
Über die Analyse der erhaltenen Expressionsmuster konnten wichtige Informationen über die Wirkungsweise der HMGA-Proteine bzw. des HMGAlb-Proteins bei der Proliferation und Reaktivierung von Haut-Zellen gewonnen werden. Das Ergebnis der Auswertung zeigte die Wirkung der Zugabe des HMGAlb-Proteins auf die Genexpression des Zielgewebes über die Interaktion des HMGAlb-Proteins mit seinen Partnern auf Protein-DNA sowie Protein-Protein Ebene. Über diese Mechanismen der Interaktionen des Proteins wird das Expressionsmuster einer Reihe von Genen, die an der Wundheilung sowie der Regeneration der Haut beteiligt sind, reguliert. Über den Nachweis der Re-Expression fetaler Genen in adultem Gewebe konnte die bedeutende Rolle der HMGA-Proteine bzw. des HMGAlb-Proteins bei der Geweberegeneration der Haut sowohl auf dem Gebiet der Wundheilung als auch für das Anti-Aging, d. h. für die Gewebeverjüngung verifiziert werden.
Beispiel 14: Immunhistochemie mit einem gegen das HMGBl gerichteten Antikörper
Alle immunhistochemischen Untersuchungen an Paraffinschnitten (5μm) von menschlichen menschlichen Geweben und Gewebeproben des Hundes wurden mit einem polyklonalen Antiköφer (sc-12523, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) aus der Ziege durchgeführt, der gegen ein Peptid aus einer internen Region des menschlichen HMGBl -Proteins gerichtet ist. Der verwendete Antiköφer detektiert das HMGBl- und in schwächerem Maße das HMGB2- Protein. Beispiel 15: Immunhistochemischer Nachweis von HMGBl-Protein an von Psoriasis betroffenen Hautarealen und Vergleich mit nicht-betroffenen Arealen der Patienten
Das überraschende Ergebnis der immunhistochemischen Untersuchung an von Psoriasis betroffenen Hautarealen und Vergleich mit nicht-betroffenen Arealen der Patienten (drei Gewebepaare) besteht darin, dass das HMGBl-Protein in den Kapillaren der Blutgefäße der betroffenen Areale wesentlich stärker exprimiert wird als in den Kontrollgeweben. Positivität fand sich dabei überwiegend im Zytoplasma der betroffenen Endothelzellen und hier wiederum besonders stark in solchen Bereichen der Kapillaren, bei denen eine Proliferationsaktivität bei der Psoriasis stattfindet. Bei 2/3 Gewebepaare vorhandene Monozyten in den Psoriasis-Arealen färbten sich ebenfalls stark zytoplasmatisch positiv.
Infolgedessen ist die Verwendung von Inhibitoren zum HMGBl-Protein, wie sie hierin offenbart sind, ein geeignetes Mittel zur Behandlung dieser Erkrankung.
Beispiel 16: Immunhistochemischer Nachweis von HMGBl-Protein bei der malignen Histiozytose des Hundes
Die maligne Histiozytose ist eine relativ seltene Erkrankung des Hundes mit extrem schlechter Prognose. Eine Häufung wird beim Bemer Sennenhund beobachtet. Die Erkrankung ist u.a. charakterisiert durch die Proliferation von Makrophagen. Untersucht wurden hier Gewebeproben von fünf Hunden. Eine starke Immunreaktion der Makrophagen fand sich bei allen untersuchten Proben und war deutlich stärker als bei Kontrollgewebe. Das Protein fand sich vorwiegend im Zytoplama der Makrophagen.
Infolgedessen ist die Verwendung von Inhibitoren zum HMGBl-Protein, wie sie hierin offenbart sind, ein geeignetes Mittel zur Behandlung dieser Erkrankung. Beispiel 17: Immunhistochemischer Nachweis von HMGBl-Protein bei der chronischen superfizialen Keratititis der Hunde-Cornea
Bei der chronischen superfizialen Keratititis der Hunde-Comea handelt es sich um eine Gewebeveränderung, bei der inflammatorische Vorgänge und die Neoangiogenese eine Rolle spielen. Als Folge der Erkrankung kann es zu einer Erblindung der betroffenen Tiere kommen. Es wurden zytologische Präparate von erkrankten Tieren angefertigt und immunhistochemisch ausgewertet. Dabei fand sich eine deutliche Positivität der Lymphozyten für HMGBl.
Infolgedessen ist die Verwendung von Inhibitoren zum HMGBl-Protein, wie sie hierin offenbart sind, ein geeignetes Mittel zur Behandlung dieser Erkrankung.
Beispiel 18: Regulation von VEGF1 in Endothelzellen durch HMGBl
Die Präparation und Kultur menschlicher Endothelzellen erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben. Nach Zugabe von menschlichem rekombinanten HMGBl (rHMGBl) in den folgenden Konzentrationen: 80ng/ml, 200ng/ml und 400ng/ml, erfolgte 10 Stunden nach Zugabe die Ernte der Zellen und RNA-Isolierung ( zur RNA-Präparation, Northern-Blot Hybridisierung s. Flohr et al., Anticancer Res. 2001; 21: 3881-3886 ). Die Quantifizierung erfolgte mittels Northern-Blot- Analyse unter Verwendung einer cDNA Sequenz des open reading frame des menschlichen VEGF A. Gegenüber der Kontrolle, die kein Protein enthält, kommt es zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der VEGF A Expression um die Faktoren 1,6, 2,8 und 3,2 (Durchschnittswerte von Doppelbestimmungen).
Infolgedessen ist die Verwendung von Inhibitoren zum HMGBl-Protein, wie sie hierin offenbart sind, ein geeignetes Mittel zur Verringerung der durch VEGF A vermittelten Angiogenese und damit ein probates Mittel zur Behandlung von Tumoren. Umgekehrt kann HMGBl bzw. eine dafür codierende Nukleinsäure als Effektor für eine gesteigerte Expression von VEGF A und damit als Mittel für die Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, bei denen VEGF A gegeben wird. Beispiel 18: Proliferation und Migration von Keratinocyten durch HMGBl
Die Präparation und Kultur menschlicher Hautexplantate in vitro erfolgte wie in Beispiel lbeschrieben. Es wurden je vier Parallelkulturen von zwei Spender angelegt. Fünf Explantate pro Kulturansatz. Die Zugabe von menschlichem rekombinanten HMGBl (rHMGBl) erfolgte in einer Konzentration von 200ng/ml. Die mikroskopische Bestimmung der Zellzahl erfolgte 8 Tage nach Kulturansatz durch Zählung der aus den Explantaten ausgewanderten Keratinozyten ( moφhologische Differenzierung Keratinozyten vs. Fibroblasten ). Gegenüber der Kontrolle eine durchschnittliche Erhöhung der Anzahl der Keratinozyten um 28%.
Das Beispiel belegt die Eignung von HMGBl zur Proliferation und Migration von Keratinozyten.
Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen, den Zeichnungen sowie dem Sequenzprotokoll, das Teil der Beschreibung sein soll, offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausfünrungsfbrmen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung, insbesondere in vitro, einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) für einen Prozess, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Grappe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung, Wundheilung, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst,
wobei die Nukleinsäure(n) eine solche ist, die für HMGBl oder einen Teil davon codiert.
2. Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) zur Herstellung eines Medikamentes für die Prävention und/oder Behandlung einer Krankheit, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Grappe, die mit mangelnder oder übermäßiger Angiogenese oder Neovaskularisierung oder mit Wundheilung im Zusammenhang steht oder transmyokardiale Revaskularisierung erforderlich macht,
wobei die Nukleinsäure eine solche ist, die für HMGBl oder einen Teil davon codiert.
3. Verwendung, insbesondere in vitro, einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) für einen Prozess, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung, Wundheilung, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst,
wobei die Nukleinsäure(n) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Gene für High Mobility Group Protein umfasst.
4. Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) zur Herstellung eines Medikamentes für die Prävention und/oder Behandlung einer Krankheit, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die mit mangelnder oder übermäßiger Angiogenese oder Neovaskularisierung oder mit Wundheilung im Zusammenhang steht oder transmyokardiale Revaskularisierung erforderlich macht, wobei die Nukleinsäure(n) ausgewählt ist/sind aus der Grappe, die Gene für High Mobility Group Protein umfasst.
5. Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) zur Herstellung eines Medikamentes für die Prävention und/oder Krankheit, insbesondere nach Ansprach 2 und/oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Grappe, die diabetische Retinopathie, prohferative Retinopathia diabetica, diabetische Nephropathie, Makuladegeneration, Arthritis, Endometriose, Pannus, Histiozytosen, Psoriasis, Rosacea, Besenreisevarizen, eruptives Hämangiom, Tumorerkrankungen, kavemöses Hämangiom, Lippenangiom, Hämangiosarkom, Hämorrhoiden, Artheriosklerose, Angina pectoris, Ischämie, Infarkt, Basalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Melanom, Kaposi-Sarkom, Tumore, Gestose, Unfruchtbarkeit, akute traumatisch bedingte Wunden, thermische Wunden, chemische Wunden, OP- Wunden und chronische Wunden umfasst.
6. Verwendung nach Ansprach 5, dadurch gekennzeichnet, dass die chronische Wunde eine solche ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Decubitus, Ulcus cruris, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum, diabetischen Ulcus, Decubitalulcus, chronische posttraumatische Wunde und diabetischer Fuß umfasst.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das High Mobility Group-Protein ausgewählt ist aus der Grappe, die die HMGA-Familie, die HMGB- Familie und die HMGN-Familie umfasst.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das High Mobility Group-Protein aus der HMGB-Familie ausgewählt ist.
9. Verwendung nach Ansprach 8, dadurch gekennzeichnet, dass das High Mobility Group- Protein ausgewählt ist aus der Grappe, die HMGBl, HMGB2 und HMGB3 umfasst.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das High Mobility Group- Protein HMGBl ist.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das High Mobility Group-Protein aus der HMGA-Familie ausgewählt ist.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das High Mobility Group- Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die HMGAla, HMGAlb, HMGAlc und HMGA2 umfasst.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das High Mobility Group- Protein HMGAla ist.
14. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein High Mobility Group Protein aus der HMGA-Familie ausgewählt ist, und ein zweites High Mobility Group Protein aus der HMGB-Familie ausgewählt ist, wobei das Protein aus der HMGBA-Familie bevorzugterweise HMGAla und das Protein aus der HMGB-Familie bevorzugterweise HMGBl ist.
15. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich VEGF oder eine dafür codierende Nukleinsäure verwendet wird.
16. Verfahren zur Beeinflussung der Angiogenese oder Neovaskularisierung oder der Wundheilung von Gewebe umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Gewebes oder eines Teils davon,
b) Zugabe einer oder mehrerer Nukleinsäure(n), deren Transkriρtionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) und
c) Inkubieren des Gewebes und der Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(en) und oder deren Translationsprodukt(en),
wobei die Nukleinsäure(n) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Gene für High Mobility Group-Proteine umfasst, und optional d) Erhalten oder Wiedergewinnen des Gewebes oder einer Zwischenstufe davon.
17. Verfahren nach Ansprach 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe oder ein Teil davon mit VEGF und/oder einer dafür codierenden Nukleinsäure inkubiert wird.
18. Verfahren nach Ansprach 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass es ein in vitro- Verfahren ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe explantiertes Gewebe oder in vitro gezüchtetes Gewebe ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) ein(e) solche(s) ist/sind, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehrere der HMGB-Proteine oder der dafür codierenden Nukleinsäuren verwendet werden, wobei bevorzugterweise ein High Mobility Group-Protein aus der HMGBA-Familie ausgewählt ist, und ein zweites High Mobility Group-Protein aus der HMGB-Familie ausgewählt ist, wobei das Protein aus der HMGBA-Familie bevorzugterweise HMGAla und das Protein aus der HMGB-Familie bevorzugterweise HMGBl ist.
22. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu der/den Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(en) und/oder deren Translationsproduk(en), wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für High Mobility Group-Proteine umfasst, eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt oder Tranlationsprodukt verwendet wird, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für Vascular Endothelial Growth Factor umfasst
23. Pharmazeutische Formulierung umfassend eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Translcriptionsprodulct(e) und/oder deren Translationsprodukt(e), wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
24. Trägermaterial umfassend eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e), wobei die Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) ein(e) solche(s) ist/sind, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
25. Trägermaterial nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial aus einem Material besteht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Zellulose, Agarose, Kollagen, Silikon, Silicium, Kunststoffe, Gele, Hydrogele, Matrices basierend auf Fibrin, Kustseidenfasern, Hydrokolloide, Lipokolloide, Polyurethan, Polyurethanharz, Gips, synthetische Biomaterialien, thermoplastische Kunststoffe, Zinkleim, Polsterschaum, Polyisobutylen, Puffer, Stabilisatoren, Bakteriostatika und Feuchthaltemittel umfasst.
26. Trägermaterial nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial als Implantat oder zur Wundheilung dient.
27. Wundabdeckungsmaterial umfassend ein Basisdeckmaterial und eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e), wobei die Nukleinsäuτe(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) ein(e) solche(s) ist sind, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
28. Wundabdeckungsmaterial nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Deckmaterial aus der Grappe ausgewählt ist, die Hydrokolloid- Verbände, Calciumalginat- Verbände, Aktivkohlekompressen/auflagen, Schaumstoffwundauflagen, Folienverbände, Transparentverbände, Silikonschaumverbände, Vliesstoffwundauflagen, Hydrozelluläre Wundverbände, Hydroselektive Wundauflagen, Absorbierende Wundkissen, Sprühverbände, Kunstseidengaze, Baumwollgaze, Paraffingazeverbände, silberbeschichtete Wundverbände und Hydropolymer-/Schaumverbände umfasst.
29. Formulierung umfassend eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e), wobei die Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) ein(e) solche(s) ist/sind, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben, und eine Trägeφhase, wobei die Trägeφhase bevorzugterweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cremes, Fettsalben, Emulsionen (Öl in Wasser (O/W); Wasser in Öl (W/O); Wasser in Öl in Wasser (W/O/W)), Mikroemulsionen, modifizierte Emulsionen, Nanopartikel/Nanoemulsionen, Liposomen, Hydrodispersionsgele (Hydrogele, Alkoholgele, Lipogele, Tensidgele), Gel-Creme, Lotionen, Öle/Ölbäder und Sprays umfasst.
30. Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung und Wundheilung umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung; und
c) Testen der Kandidaten-Verbindung und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem verursachten Reaktion.
31. Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Revaskularisierung und Wundheilung umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Referenz- Verbindung;
c) Testen der Referenzverbindung im Testsystem und Bestimmen der von der Referenz- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung;
e) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion; und f) Vergleich der Reaktion von der Referenz- Verbindung im Testsystem mit der Reaktion von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem.
32. Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Vaskularisierung und Wundheilung umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Referenz- Verbindung, wobei die Referenz- Verbindung eine Markierung trägt;
c) Testen der Referenz- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Referenz- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen der Kandidaten- Verbindung; und
e) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem, wobei das Testsystem die Referenz- Verbindung enthält, und Bestimmen der Reaktion des Testsystems, wobei die Menge an freigesetzter Referenz- Verbindung und/oder freigesetzter Markierung der Referenz- Verbindung bestimmt wird.
33. Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Angiogenese, Neovaskularisierung, transmyokardiale Vaskularisierung und Wundheilung umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung, wobei die Kandidaten- Verbindung eine Markierung trägt; c) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen einer Referenz- Verbindung; und
e) Testen der Referenz- Verbindung in dem Testsystem, wobei das Testsystem die Kandidaten- Verbindung enthält, und Bestimmen der Reaktion des Testsystems, wobei die Menge an freigesetzter Kandidaten- Verbindung und/oder freigesetzter Markierung der Kandidaten- Verbindung bestimmt wird.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Testsystem ein in vitro Testsystem oder ein in vivo Testsystem ist.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion von der Referenz-Verbindung und/oder der Kandidaten- Verbindung eine Förderung des Prozesses ist, und wobei bevorzugterweise die Kandidaten-Verbindung eine Verbindung zur Förderung des Prozesses ist, wenn die Reaktion der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem gleich oder stärker ist als die Reaktion der Referenz- Verbindung.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion von der Referenz-Verbindung und/oder der Kandidaten- Verbindung eine Inhibierung des Prozesses ist, und wobei bevorzugterweise die Kandidaten- Verbindung eine Verbindung zum Inhibieren des Prozesses ist, wenn die von der Kandidaten- Verbindung verursachte Reaktion des Testsystems eine geringere Reaktion ist als die von der Referenz-Verbindung verursachte Reaktion des Testsystems.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenz- Verbindung eine oder mehrere Nukleinsäure(n), deren Transkriptionsprodukt(e) und/oder deren Translationsprodukt(e) umfasst, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Grappe, die Gene für High Mobility Group-Proteine umfasst, insbesondere wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 36, wobei der Prozess die Inhibierung der Angiogenese ist.
39. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 30 bis 38 zum Screenen einer Verbindung zur Behandlung und/oder Prävention einer Erkrankung, wobei das bereitgestellte Testsystem ein Testsystem für die jeweilige Krankheit ist.
40. Verwendung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die solche Krankheiten umfasst, die Förderung oder Inhibierung von Angiogenese oder Neovaskularisierung erforderlich machen oder transmyokardiale Revaskularisierung oder Wundheilung erforderlich machen.
41. Verwendung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Grappe, die diabetische Retinopathie, prohferative Retinopathia diabetica, diabetische Nephropathie, Makuladegeneration, Arthritis, Psoriasis, Rosacea, Besenreisevarizen, eruptives Hämangiom, kavemöses Hämangiom, Lippenangiom, Hämangiosarkom, Hämorrhoiden, Artheriosklerose, Angina pectoris, Ischämie, Infarkt, Basalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Melanom, Kaposi-Sarkom, Tumore, Gestose, Unfruchtbarkeit, akute traumatisch bedingte Wunden, thermische Wunden, chemische Wunden, OP- Wunden und chronische Wunden umfasst.
42. Verwendung nach einem der Ansprüche 39 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine Tumorerkrankung ist, wobei bevorzugterweise die Tumorerkrankung nekrotische Zellen, bevorzugterweise nekrotische Tumorzellen aufweist.
43. Verbindung erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 30 bis 38.
44. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 43 zur Herstellung eines Medikamentes, bevorzugterweise zur Behandlung und/oder Prävention einer Krankheit, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
45. Verwendung, insbesondere in vitro, einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt für einen Prozess, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA-Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-bindende Proteine umfasst.
46. Verwendung, insbesondere in vitro, einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt für einen Prozess, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Entdifferenzierung von Zellen und Reprogrammierung von Zellen umfasst, für Gewebeaufbau und/oder Geweberegeneration, insbesondere beruhend auf der Grundlage einer Entdifferenzierung und/oder Differenzierung des aufzubauenden oder zu regenerierenden Gewebes,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-bindende Proteine umfasst.
47. Verwendung einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt zur Herstellung eines Medikamentes für die Prävention und/oder Behandlung einer Krankheit, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die Krankheiten, die die Reparatur von DNA-Schäden erforderlich machen, Krankheiten, die die Geweberegeneration erforderlich machen, Krankheiten, die die Wundheilung erforderlich machen, die mit Gewebealterung einhergeht, Krankheiten, die Zahn- und Knochenimplantate erforderhch machen, Krankheiten, die mit Gewebealterang einhergehen, Wundheilungsstörung, Hauterkrankungen, Xeroderma pigmentosum, Lederhaut, Hautkrebs, Hautkrebs nach Sonnenbrand, Hautalterung nach Sonnenbrand, Sonnenbrand und Herzinfarkt umfasst,
wobei die Nuldeinsäure ausgewählt ist aus der Grappe, die Gene für basische DNA-bindende Proteine umfasst.
48. Verwendung einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt zur Herstellung eines kosmetischen Produktes, bevorzugterweise eines kosmetischen Produktes für die Geweberegeneration, Wundheilung, Prävention von Lederhaut, Prävention von Hautkrebs, insbesondere Hautkrebs nach Sonnenbrand, Hautalterung, insbesondere Hautalterung nach Sonnenbrand, Gewebealterungsverhinderung und/oder Ge web e verj üngung,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Grappe, die Gene für basische DNA-Protein umfasst.
49. Verwendung einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt für die Herstellung eines Medikamentes Prävention und/oder Behandlung einer Krankheit, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die Hauterkrankungen, Xeroderma pigmentosum, Lederhaut, Hautkrebs, Hautkrebs nach Sonnenbrand, Sonnenbrand, akute Wunden und chronische Wunden umfasst,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA-bindende Proteine umfasst.
50. Verwendung nach Ansprach 49, dadurch gekennzeichnet, dass die akute Wunde eine solche ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die akute traumatisch bedingte Wunden, thermische Wunden, chemische Wunden und OP- Wunden umfasst.
51. Verwendung nach Ansprach 49, dadurch gekennzeichnet, dass die chronische Wunde eine solche ist, die aus der Grappe ausgewählt ist, die Decubitus, Ulcus cruris, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum, diabetische Ulcus, Decubitalulcus, chronische posttraumatische Wunde und diabetischer Fuß umfasst.
52. Verwendung nach einem der Ansprüche 45 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass das basische DNA-bindende Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die High Mobility Group- Proteine umfasst.
53. Verwendung nach einem der Ansprüche 45 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass das High Mobility Group-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die HMGA, HMGB und HMGN umfasst.
54. Verwendung nach einem der Ansprüche 45 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass das High Mobility Group-Protein ein Protein der HMGA-Familie ist.
55. Verwendung nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe, die HMGAla, HMGAlb und HMGA2 umfasst.
56. Verwendung nach einem der Ansprüche 45 bis 55, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Grappe der Nukleinsäuren, die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 31 bis SEQ ID NO. 64 und deren jeweiligen Derivate umfasst.
57. Verwendung nach einem der Ansprüche 45 bis 56, dadurch gekennzeichnet, dass das Translationsprodukt aus der Gruppe ausgewählt ist, die Polypeptide mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 30 und deren jeweilige Derivate umfasst.
58. Verwendung nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein eine Modifikation aufweist, wobei die Modifikation aus der Grappe ausgewählt ist, die Phosphorylierung und Acetylierung umfasst.
59. Verfahren zur Regeneration von Gewebe umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Gewebes oder eines Teils davon,
b) Zugabe einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt und
c) Inkubieren des Gewebes und der Nukleinsäuren, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Gene für basische DNA- bindende Proteine umfasst, und optional d) Erhalten oder Wiedergewinnen des regenerierten Gewebes oder einer Zwischenstufe davon.
60. Verfahren nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein in vitro- Verfahren ist.
61. Verfahren nach Ansprach 59 oder 60, dadurch gekennzeichnet, dass das zu regenerierende Gewebe verschieden oder identisch ist von dem in Schritt a) bereitgestellten Gewebe.
62. Verfahren nach einem der Ansprüche 59 bis 61, dadurch gekennzeichnet, dass das zu regenerierende Gewebe und oder das in Schritt a) bereitgestellte Gewebe unabhängig voneinander ausgewählt ist/sind aus der Gruppe, die Hautgewebe, Fettgewebe, Knoφelgewebe, Muskelgewebe, Zellen des Blutes und des Blutbildes und Nervenzellen umfasst.
63. Verfahren nach einem der Ansprüche 59 bis 62, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
64. Verfahren zur Entdifferenzierung und/oder Reprogrammierung von Zellen umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen einer oder mehrerer Zellen,
b) Zugabe einer Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, und
c) Inkubieren der Zelle und der Nukleinsäuren, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt,
wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Grappe, die Gene für basische DNA- bindende Proteine umfasst.
65. Verfahren nach Ansprach 64, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein in vitro- Verfahren ist.
66. Verfahren nach Anspruch 64 oder 65, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren weiterhin den Schritt umfasst:
d) Erhalten einer entdifferenzierten und/oder reprogrammierten Zelle.
67. Verfahren nach einem der Ansprüche 64 bis 66, dadurch gekennzeichnet, dass die entdifferenzierte Zelle(n) und/oder reprogrammierte Zelle(n) und/oder die gemäß Schritt a) bereitgestellte^) Zelle(n) unabhängig voneinander ausgewählt ist/sind aus der Grappe, die Zellen der Epidermis, Zellen der Haut, Zellen des Fettgewebes, Zellen des Knoφelgewebes, Zellen des Muskelgewebes, Zellen des Blutes, Zellen des blutbildenden Gewebes und Nervenzellen umfasst.
68. Verfahren nach einem der Ansprüche 64 bis 67, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
69. Pharmazeutische Formulierung umfassend eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
70. Trägermaterial umfassend eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, wobei die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
71. Trägermaterial nach Anspruch 70, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial aus einem Material besteht, das aus der Grappe ausgewählt ist, die Zellulose, Agarose, Kollagen, Silikon, Silicium, Kunststoffe, Gele, Hydrogele, Matrices basierend auf Fibrin, Kustseidenfasern, Hydrokolloide, Lipokolloide, Polyurethan, Polyurethanharz, Gips, synthetische Biomaterialien, thermoplastische Kunststoffe, Zinkleim, Polsterschaum, Polyisobutylen, Puffer, Stabilisatoren, Bakteriostatika und Feuchthaltemittel umfasst.
72. Trägermaterial nach Anspruch 70 oder 71, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial als Implantat oder zur Wundheilung dient.
73. Wundabdeckungsmaterial umfassend ein Basisdeckmaterial und eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, wobei die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
74. Wundabdeckungsmaterial nach Ansprach 73, dadurch gekennzeichnet, dass das Deckmaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, die Hydrokolloid- Verbände, Calciumalginat- Verbände, Aktivkohlekompressen/auflagen, Schaumstoffwundauflagen, Folienverbände, Transparentverbände, Silikonschaumverbände, Vliesstoffwundauflagen, hydrozelluläre Wundverbände, Hydroselektive Wundauflagen, absorbierende Wundkissen, Sprühverbände, Kunstseidengaze, Baumwollgaze, Paraffingazeverbände, silberbeschichtete Wundverbände und Hydropolymer-/Schaumverbände umfasst.
75. Kosmetische Formulierung umfassend eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt, wobei die Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und /oder deren Translationsprodukt ein(e) solche(s) ist, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben, und eine Trägeφhase, wobei die Trägeφhase bevorzugterweise aus der Grappe ausgewählt ist, die Cremes, Fettsalben, Emulsionen (Öl in Wasser (O/W); Wasser in Öl (W/O); Wasser in Öl in Wasser (W/O/W)), Mikroemulsionen, modifizierte Emulsionen, Nanopartikel/Nanoemulsionen, Liposomen, Hydrodispersionsgele (Hydrogele, Alkoholgele, Lipogele, Tensidgele), Gel-Creme, Lotionen, Öle/Ölbäder und Sprays unfasst.
76. Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA-Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterang, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Kandidaten-Verbindung; und
c) Testen der Kandidaten-Verbindung und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem verursachten Reaktion.
77. Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Grappe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA-Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Referenz-Verbindung;
c) Testen der Referenzverbindung im Testsystem und Bestimmen der von der Referenz- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung;
e) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion; und
f) Vergleich der Reaktion von der Referenz-Verbindung im Testsystem mit der Reaktion von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem.
78. Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Gruppe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA-Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Referenz-Verbindung, wobei die Referenz-Verbindung eine Markierung trägt;
c) Testen der Referenz- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Referenz- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen der Kandidaten-Verbindung; und
e) Testen der Kandidaten-Verbindung in dem Testsystem, wobei das Testsystem die Referenz- Verbindung enthält, und Bestimmen der Reaktion des Testsystems, wobei die Menge an freigesetzter Referenz- Verbindung und/oder freigesetzter Markierung der Referenz- Verbindung bestimmt wird.
79. Verfahren zum Screenen einer Verbindung zur Förderung und/oder Inhibierung eines Prozesses, wobei der Prozess ausgewählt ist aus der Grappe, die Geweberegeneration, Reparatur von DNA-Schäden, Wundheilung, Zellmobilität, Angiogenese im Wundbett, EpitheHsierung, Gewebealterung, Verhinderung der Gewebealterung, Gewebeverjüngung, Vaskularisierung bei Herzinfarkt und Einheilung bei Zahn- und Knochenimplantaten umfasst, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Testsystems für den Prozess;
b) Bereitstellen einer Kandidaten-Verbindung, wobei die Kandidaten-Verbindung eine Markierung trägt; c) Testen der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem und Bestimmen der von der Kandidaten- Verbindung im Testsystem verursachten Reaktion;
d) Bereitstellen einer Referenz- Verbindung; und
e) Testen der Referenz- Verbindung in dem Testsystem, wobei das Testsystem die Kandidaten- Verbindung enthält, und Bestimmen der Reaktion des Testsystems, wobei die Menge an freigesetzter Kandidaten- Verbindung und/oder freigesetzter Markierung der Kandidaten- Verbindung bestimmt wird.
80. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 79, dadurch gekennzeichnet, dass das Testsystem ein in vitro Testsystem oder ein in vivo Testsystem ist.
81. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 80, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion von der Referenz- Verbindung und/oder der Kandidaten- Verbindung eine Förderung des Prozesses ist, und wobei bevorzugterweise die Kandidaten- Verbindung eine Verbindung zur Förderung des Prozesses ist, wenn die Reaktion der Kandidaten- Verbindung in dem Testsystem gleich oder stärker ist als die Reaktion der Referenz- Verbindung.
82. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 80, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion von der Referenz- Verbindung und/oder der Kandidaten-Verbindung eine Inhibierung des Prozesses ist, und wobei bevorzugterweise die Kandidaten-Verbindung eine Verbindung zum Inhibieren des Prozesses ist, wenn die von der Kandidaten-Verbindung verursachte Reaktion des Testsystems eine geringere Reaktion ist als die von der Referenz- Verbindung verursachte Reaktion des Testsystems.
83. Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 80, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenz- Verbindung eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und oder deren Translationsprodukt ist, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Grappe, die Gene für basische DNA- bindenden Proteine umfasst, insbesondere wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
84. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 76 bis 83 zum Screenen einer Verbindung zur Behandlung und/oder Prävention einer Erkrankung, wobei das bereitgestellte Testsystem ein Testsystem für die jeweilige Krankheit ist.
85. Verwendung nach Anspruch 84, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Grappe, die die Reparatur von DNA-Schäden erforderlich macht, die Geweberegeneration erforderlich macht, die Wundheilung erforderlich macht, die Zahn- und Knochenimplantate erforderlich macht, die mit Gewebealterung einhergeht, Wundheilungsstörung, Hauterkrankungen, Xerdoderma pigmentosum, Lederhaut, Hautkrebs, Hautkrebs nach Sonnenbrand, Hautalterung nach Sonnenbrand, Sonnenbrand und Herzinfarkt umfasst.
86. Sonnenschutzmittel umfassend zumindest eine Nukleinsäure, deren Transkriptionsprodukt und/oder deren Translationsprodukt, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Grappe, die Gene für basische DNA-Proteine umfasst.
87. Sonnenschutzmittel nach Ansprach 86, dadaurch gekennzeichnet, dass die basischen DNA-Proteine HMG-Proteine, insbesondere solche sind, die in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben sind.
89. Verbindung erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 76 bis 83 oder einer Verwendung nach Anspruch 84 oder 85.
90. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 89 zur Herstellung eines Medikamentes, bevorzugterweise zur Behandlung und/oder Prävention einer Krankheit, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben.
91. Verfahren zur Behandlung eines Organismus, dadurch gekennzeichnet, dass dem Organismus eine wirksame Menge eines DNA-bindenden Proteins, eines HMG-Proteins, einer dafür codierenden Nukleinsäure oder eines Transkriptionsproduktes und/oder eines Translationsproduktes, einer damit wechselwirkenden funktionalen Nukleinsäure, eines damit wechselwirkenden Peptides oder Antiköφers und/oder einer Verbindung nach Anspruch 89 verabreicht wird.
92. Verfahren nach Ansprach 91, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus an einer Krankheit leidet oder die Möglichkeit besteht an dieser Krankheit zu leiden oder zu erkranken und die Krankheit bevorzugterweise eine solche ist, wie sie in einem der vorangehenden Ansprüche beschrieben ist.
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