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Technisches
Fachgebiet
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Diese
Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prävention oder Behandlung ischämischer
Krankheiten mit Midkine (nachstehend als MK abgekürzt) als
Wirkstoff.
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Hintergrund
des Fachgebiets
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Ischämie ist
ein Zustand, in dem der Blutfluss in örtlich begrenzten Körperteilen
vollständig
blockiert oder erheblich reduziert ist, was Anoxie, verminderte
Bereitstellung von Substraten und Anhäufung von Stoffwechselprodukten
zur Folge hat. Obwohl das Ausmaß der
Ischämie
vom akuten Stadium der Gefäßblockade, ihrer
Dauer, der Gewebsempfindlichkeit ihr gegenüber und dem Entwicklungsgrad
von Kollateralgefäßen abhängt, tritt
in ischämischen
Organen oder Geweben üblicherweise
eine Dysfunktion auf und anhaltende Ischämie führt zu Atrophie, Denaturierung
und Nekrose der betroffenen Gewebe.
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Ischämische cerebrovaskuläre Schadens-Entstehungsmechanismen
werden in drei Typen eingeteilt, thrombotisch, embolisch und hämodynamisch.
Der hauptsächliche
pathologische Zustand für
alle drei Typen ist jedoch die cerebrale Ischämie, deren Schwere und Dauer
das Ausmaß der
cerebralen Gewebsschädigungen
definiert. An der Stelle der schweren Ischämie erleiden Nerven- und Endothelzellen
rasch irreversible Schäden
und formen infolge von Nekrose typische Infarkt-Nidi. Obwohl der
Blutfluss gemäßigt absinkt
und Funktionen von Nervenzellen in der ischämischen Penumbra wiederaufgenommen
werden, ist ihre Überlebenskapazität nicht
verloren und das verbleibende cerebrovasculäre System kann seine Funktionen
wiedererlangen, wenn die Blutzirkulation über kollaterale Gefäße wieder
anfängt.
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Bei
der ischämischen
Kardiopathie, die aus Krankheiten besteht, die die Koronararterie
betreffen und eine myokardiale Ischämie verursachen, schreitet
das Ausmaß des
ischämischen
myokardialen Zellschadens von reversibler Zellschädigung zu
irreversiblem Zellschaden mit der Dauer der Blockade der Koronararterie voran.
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Es
ist denkbar, dass Arzneimittel zur Verhinderung einer solchen, durch
Ischämie
verursachten Cytopathie oder zur Stimulierung der Regeneration geschädigter Zellen
eine grundlegende Therapie von cerebraler Ischämie und Herzerkrankungen bereitstellen
können.
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Basierend
auf diesem Konzept wurden in letzter Zeit, Berichten zufolge, wirksame
Arzneimittel zur Prävention
und Behandlung von Nervenzell-Schädigungen nach einer vorübergehenden
cerebralen Ischämie überprüft, indem
Kandidaten-Substanzen
für ischämische Hirnschutz-Faktoren
in den Ventrikel oder die peripheren Blutgefäße injiziert und die Wirkung
der Substanzen morphologisch und funktionell untersucht wurde. Die
intraventrikuläre
Verabreichung von z. B. Prosaposin an mongolische Wüstenrennmäuse linderte
eine Lernschwäche
nach Ischämie
und die pathologische Betrachtung der hippocampalen CA1-Region zeigte,
verglichen mit der Kontrolle, einen erheblichen Anstieg der Anzahl
an Pyramidalzellen (Sand, A. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun.
204: 994–1000,
1994). Wie für
Prosaposin wurde bewiesen, dass die intraventrikuläre Injektion
von ciliarem neutropem Faktor (CNTF) und Interleukin 6 (II-6) ebenfalls
deutlich die Anzahl der Pyramidalzellen und Synapsen in der CA1-Region
in Dosis abhängiger
Weise erhöhte
(Wen, T-C et al.:Neurosci. Lett. 191: 55–58, 1995) (Matsuda, S. et
al.:Neurosci. Lett. 204: 109–112,
1996). Von der intraventrikulären
Injektion von Haupt-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) wurde außerdem berichtet,
gegen ischämischen
Hippocampus zu schützen,
obgleich nicht in der gleichen Weise wie Prosaposin, CNTF und II-6
(Wen, T-C et al.: Neuroscience, 65: 513–521, 1995). Der Wirkungsmechanismus
dieser Schutzfaktoren für
ischämische
Hirnerkrankungen wurden jedoch nicht im Detail geklärt.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein neues Arzneimittel, das ein Protein
der Midkine (MK)-Familie als Wirkstoff umfasst, zur Behandlung und
zur Prävention
verschiedener, durch Zelltod, verursachter Krankheiten, bereit.
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Diese
Erfindung stellt im besonderen: (1) ein, ein Protein der Midkine
(MK)-Familie als einem Wirkstoff umfassendes Arzneimittel zur Behandlung
und Prävention
von durch Ischämie
verursachter Cytopathie; (2) das Arzneimittel gemäß (1), wobei
die, durch Ischämie
verursachte Cytopathie, im Hirnparenchym stattfindet., (3) das Arzneimittel
gemäß (2), wobei
das Hirnparenchym aus Pyramidalzellen in der hippocampalen CA1-Region
besteht; (4) ein Arzneimittel zur Behandlung und Prävention
von, durch Cythopathie infolge von Ischämie verursachten Krankheiten,
das als Wirkstoff ein Protein der Midkine (MK)-Familie umfasst,
wobei die durch Ischämie
verursachte Krankheit ein Hirninfarkt ist.
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Midkine
(MK) ist ein Heparin-bindendes sekretorisches Protein, reich an
basischen Aminosäuren
und Cysteinen. Es wurde als Genprodukt, das vorrübergehend im, durch Retinolsäure induzierten
Differenzierungsprozess embryonaler Tumorzellen, exprimiert wird,
entdeckt (Kdomatsu, K. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 151:
1312–1318,
1988; Tomomura, M. et al.: J. Biol. Chem. 265: 10765–10770,
1990; Tomomura, M. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 171: 603,
1990). MK teilt mit dem später
entdeckten Pleiotropin (PTN) (Merenimies, J. & Rauvala, H.: J. Biol. Chem. 265:
16721–16724,
1990) 45 % Homologie und MK und PTN bilden somit die MK-Familie
(Muramatsu, T.: Dev. Growth Differ., 36: 1–8, 1994).
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Zur
Funktion von MK wurden viele Daten angesammelt und seine neueren
wichtigen Funktionen werden nun sehr wahrscheinlich entdeckt werden.
Die Hauptfunktionen von MK schließen die folgenden fünf Funktionen
ein: 1) Neurotrope Faktor-Aktivität (MK stimuliert das Überleben
und den Nervenauswuchs von Neurocyten (Muramatsu, H. et al.: Dev.
Biol., 159: 392, 1993; Michikawa, M. et al.: J. Neurosci. Res.,
35: 530, 1993; Kikuchi, S. et al., 160, 1993); 2) Wundheilung (MK
mindert und verhindert Retinaldenaturierung durch anhaltende Bestrahlung
mit weißem
Licht (Unoki, K. et al.: Ophthalmol. Vis., 35: 4063, 1994) und die
Expression von MK wird im frühen
Stadium experimentellen Hirn- und Myokard-Infarkts in Ratten in
der Nähe
von Infarkt-Nidi induziert (Yoshida, Y. et al.: Dev. Brain Res.,
85; 25–30,
1995; Obama, H. et al.: Anticancer Research, 18: 145–152, 1998));
3) Ontogenese (MK wird vorübergehend
mit einem Höchswert
in der mittleren Embryonalphase exprimiert und häuft sich meistens in der späten Phase
in der Niere an); 4) Aktivierung des fibrinolytischen Systems (MK
erhöht
bei einer Konzentration von 10 ng/ml die Plasminogen-Aktivator-Wirksamkeit
von, aus Rinderaorta stammenden vaskulären Endothelzellen, um das
drei- bis fünffache
(Kojima, S. et al.: J. Biol. Chem., 270: 9590, 1995)); und 5) Krebs
(MK wird mit hoher Frequenz im Wilms' Tumor, Brustkrebs, Lungenkrebs, Neuroblastom, Ösophagus-Krebs,
Magenkrebs, Darmkrebs und Leberkrebs exprimiert (Tsutsui, J. et al.:
Cancer Res., 53: 1291, 1933; Garver, R. I., et al.: Cancer, 74:
1584, 1994; Garver, R. I., et al.: Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.,
9:463, 1993; Nakagawa, A. et al.: Cancer Res., 55: 1792, 1995; Aridome,
K. et al.: Jpn. Cancer Res., 86: 655, 1995).
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Wie
vorstehend beschrieben, wird die Expression von MK nahe den Infarkt-Nidi
im frühen
Stadium nach experimentellem Hirninfarkt in Ratten, exprimiert und
es wurde gezeigt, dass es ausschließlich in Astrocyten exprimiert
wurde (Yoshida, A., et al.: Dev. Brain Res., 85: 25–30, 1995).
PTN, das zusammen mit MK die Familie bildet, wir ebenso stark im
Hippocampus exprimiert, hauptsächlich
in der CA1-Region und meist in Astrocyten von Ratten, am vierten
Tag nach Entstehung der vorrübergehenden
Ischämie
im Rattenvorderhirn (Takeda, A. et al.: Neuroscience, 68: 57–64, 1995). Üblicherweise
wurde die Aktivierung der die Ischämie begleitenden Astrocyten
als zellschützend
verstanden. MK und PTN können
eine Rolle im Reparatur-Prozess des Zentralnervensystems nach der
Entwicklung einer Ischämie
spielen.
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Die
hier genannten Erfinder nahmen an, dass MK in menschlichen Patienten
mit Hirninfarkt nach Ausbruch der Erkrankung vorübergehend exprimiert werden
könnte
und bestimmten MK-Konzentrationen in Seren von 150 gesunden Personen
und 36 Hirninfarkt-Patienten. Für
die durchschnittliche Serumkonzentration von MK findet man 0,3 ng/ml,
verglichen mit 0,9 ng/ml in Patienten. Außerdem tendierten die MK Konzentrationen in
den, von den Patienten, direkt nach Entwicklung der Krankheit und
von Patienten, die größere Infarktbereiche
aufweisen, gesammelten Serumproben, höher zu sein. Es wird angenommen,
dass diese Phänomene
auf die Zirkulation von, vorübergehend
nahe der ischämischen
Region exprimierten MK, zurückzuführen sind.
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Kürzlich wurde
von der gesteigerten Expression verschiedener neurotroper Faktoren
in, durch Trauma, Ischämie
etc. verursachten Nervenschädigungen,
berichtet (Frautschy, S. A. et al.: Brain Res., 553: 291, 1991;
Haynes, L. W.: Neurobiol., 2: 263, 1988). Diese neurotropen Faktoren
sind wahrscheinlich in Reparaturmechanismen von Nervenschädigungen
involviert und agieren auf Nervenzellen entweder direkt oder indirekt über Gliacyten,
um eine wichtige Rolle in ihrem Überleben
und ihrer Reparatur zu spielen.
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Basierend
auf diesen Berichten, untersuchten die hier genannten Erfinder unter
Verwendung eines experimentellen Modells der cerebralen Ischämie, ob
MK, wie andere neurotrope Faktoren, in Reparaturmechanismen von
Nervenschädigungen
involviert ist. MK wurde mongolischen Wüstenrennmäusen, einem solchen Modell,
intranventrikulär
vor und nach der Operation injiziert um Ischämie zu entwickeln, um die unterdrückenden
Effekte von MK auf die Abstoßung
(Deciduation) von hippocampalen CA1 Nervenzellen morphologisch zu untersuchen.
Weil die Anastamose des inneren Carotis-Arterien- und des Vertebral-Arterien-Systems
in mongolischen Wüstenrennmäusen im
Alter von acht Wochen rückgängig gemacht
wird, kann ein ausgezeichnetes Modell für eine unvollständige Vorderhirn-Ischämie leicht
durch die Blockierung der bilateralen gemeinen Carotis-Arterien
durch Klemmen für
drei bis fünf
Minuten hergestellt werden, sodass eine bestimmte Denaturierung
von Nervenzellen (verzögerter
Tod von Neurocyten) in einer spezifischen Region (hippocampale CA1-Region)
innerhalb von 48 bis 72 Stunden durch auf Ischämie folgende Rückperfusion,
hervorgerufen wird. Daher ist ein vorübergehendes Vorderhirn-Ischämie-Modell
der mongolischen Wüstenrennmäuse nützlich,
um schützende
Faktoren für
das ischämische
Hirn zu untersuchen (Kirino, T. et al.: Brain Res. 237: 57–69, 1982;
Mitani, A. et al.: Neurosci. Lett. 131: 171–174, 1991).
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MK
wurde intraventrikulär
in mongolische Wüstenrennmäuse vor
der ischämischen
Operation injiziiert, um seine schützenden Wirkungen auf das ischämische Hirn
zu untersuchen. Es wurde ein 2 mm tiefes Loch, 2 mm von der Bregma
einer mongolischen Wüstenrennmaus
aus gemacht und MK (0,063, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 und 2,0 μg), PTN (0,5,
1,0 und 2,0 μg)
oder zum Vergleich bFGF (1,0 und 2,0 μg), der bekannt dafür ist, schützende Effekte
auf das ischämische
Hirn zu haben, enthaltende Kochsalzlösung den Tieren intraventrikulär injiziiert.
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Nach
vier Minuten wurden die bilateralen gemeinen Carotis-Arterien abgebunden,
um den Kreislauf für
fünf Minuten
zu blockieren, um so ein vorübergehend
ischämisches
Vorderhirn-Modell herzustellen. 96 Stunden oder sieben Tage nach
Wiederaufnahme der Blutzirkulation, wurde das Hirn ausgeschnitten
und unter Perfusion mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Vom so präparierten
Paraffinblock, wurden 5 μm
dicke Schnitte hergestellt und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, um
die Anzahl lebensfähiger
Neurocyten pro 1 mm der linken hippocampalen CA1-Region zu zählen. Wie
in den Tabellen 1 und 2 gezeigt, wurde die Abstoßung von hippocampalen CA1-Neurocyten
in der MK (0,5 μg
und mehr) verabreichten Gruppe und in der PTN (2,0 μg order mehr) verabreichte
Gruppe signifikant unterdrückt,
verglichen mit der Kontrollgruppe (Injektion von physiologischer Kochsalzlösung) Im
Vergleich zur Kontrollgruppe, unterdrückt bFGF signifikant die Abstoßung von
hippocampalen CA1-Neurocyten bei einer Konzentration von 2,0 μg oder mehr.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die vorherige Verabreichung
von MK oder PTN in den Ventrikel, durch Ischämie und die nachfolgende Perfusion
verursachte Hirnzellschädigungen,
unterdrücken
kann.
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Außerdem wurde
MK mongolischen Wüstenrennmäusen nach
der ischämischen
Operation intraventrikulär
verabreicht, um seine schützenden
Effekte auf das ischämische
Hirn zu untersuchen. Nach der, wie vorstehend beschrieben konstruierten
vorübergehenden
Vorderhirn-Ischämie,
wurde die Blutzirkulation wiederaufgenommen und 48 Stunden später wurde
MK intraventrikulär,
in der gleichen, wie vorstehend beschrieben Weise, injiziert. Am
Tag sieben nach Injektion wurden 5 μm dicke Schnitte ähnlich wie
vorstehend beschrieben hergestellt und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, um
die Anzahl lebensfähiger
Neurocyten pro Millimeter der Region der linken hippocampalen CA1
Nervenzellen zu zählen.
Es wurden etwa 160 lebensfähige
Nervenzellen pro mm des Hippocampus beobachtet (Beispiel 1.2). Diese
Anzahl lebensfähiger
Zellen ist in etwa die gleiche, wie bei Verabreichung von 0,5 μg MK unmittelbar
vor der ischämischen
Operation.
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Gehirnaktivität auf hoher
Ebene, wie Gedächtnis
oder Lernen ist definitiv die Basis geistiger Aktivität beim Menschen.
Deshalb ist die Entwicklung von Medikamenten, die in der Lage sind,
Gedächtnis-
und Lern-Behinderungen zu reduzieren zu einem der meistinteressierenden
Aufgaben der Neurowissenschaft geworden. Viele experimentelle Modelle
für Gedächtnis-
und Lern-Behinderung sind bekannt und die Testverfahren dafür sind extrem
verschieden. Ein solcher Test, der passive Vermeidungs-Lern-Test
wird häufig
mit Mäusen
verwendet.
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Ankommend
bei dieser Erfindung, wurden sich die hier genannten Erfinder klar,
dass die intraventrikuläre
Verabreichung von MK oder PTN innerhalb einer bestimmten Periode
vor oder nach einer vorübergehenden
Vorderhirn-Ischämie-Operation,
verglichen mit der Kontrollgruppe, die Abstoßung von hippocampalen CA1
Neurocyten signifikant unterdrückt.
Außerdem
korreliert die Anzahl der hippocampalen Neurocyten, Berichten zufolge,
gut mit der Verbesserung der Antwort-Verzögerungszeit im passiven Vermeidungs-Lern-Test vom
Step-Down-Typ (Araki, H. et al.: Physiol. Behav. 38: 89–94, 1986;
Sano, A. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 994–1000; Wen,
T.-C. et al.: Neuroscience, 65: 513–521; Wen, T.-C. et al.: Neurosci.
Lett. 191: 55–58).
Deshalb kann die Antwort-Verzögerungszeit
durch intraventrikuläre
Injektion von MK oder PTN vor oder nach ischämischer Belastung verbessert
werden.
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Die
Tatsache, dass hippocampale CA1 Neurocyten am leichtesten durch
cerebrale Ischämie
geschädigt
werden können
und die nachfolgende Perfusion die experimentellen Ergebnisse, dass
die Abstoßung
von hippocampalen CA1 Neurocyten in, vor oder nach Ischämie mit
MK oder PTN injizierten Tiergruppen, verglichen mit Kontrollgruppen,
signifikant unterdrückt
wurde und der Bericht, der andeutet, dass MK oder PTN die Antwort-Verzögerungszeit
im passiven Verneidungs-Lern-Test vom Step-Down-Typ verbessert,
all das deutet darauf hin, dass von MK oder PTN erwartet werden
kann, sowohl für
die Prävention,
als auch für
die Behandlung von, durch cerebrale Ischämie und nachfolgende Perfusion
verursachter Neurocyten-Schädigung
und zur Verbesserung geistiger Krankheiten nützlich zu sein, was der endgültige Zweck
dieser Heilmittel ist.
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Außerdem enthüllt nachstehendes
Beispiel 3, dass im Fall einer Nervenzellschädigung, die sowohl durch ischämischen
Stress, als auch durch anderen Stress, wie traumatischen Stress,
verursacht wird, MK als Antwort auf das frühe Stadium solch einer Schädigung nahe
der geschädigten
Stellen exprimiert wird. Deshalb kann MK oder PTN verwendet werden,
um verschiedene craniale Nervererkrankungen zu verhindern oder zu behandeln,
durch direkte Verhinderung der Dysfunktion und dem Zelltod von Neurocyten
insgesamt oder in spezifischen Regionen fundamentaler Ursachen wie
Ischämie,
Trauma, Alterung oder nicht erklärbarer
Ursachen und durch die Stimulation der Regeneration der geschädigten Neurocyten.
Außerdem
kann die Verwendung von MK in Kombination mit anderen neurotropen
Faktoren, wie bFGF, die verschiedene Wirkungsmechanismen besitzen,
einen synergistischen oder zusätzliche
schützende
Effekte produzieren, um den, durch Ischämie oder Stress verursachten
Tod von Neurocyten zu verhindern. Spezifische Krankheiten, die behandelt werden
sollen, können
Hirninfarkt, vorübergehende
cerebrale Ischämie,
auf cerebrovaskulären
Krampf zurückzuführende Encephalopathie,
wie als Folge subarachnoider Hämorrhagie,
senile Demenz und Encephalopathie zum Zeitpunkt der Anabiose nach
Herzstillstand.
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Die
hier genannten Erfinder konstruierten auch ein experimentelles Herzinfarkt-Modell durch Abbinden der
linken absteigenden Koronar-Arterie einer Ratte, um die MK-Expression
in Herzzellen durch immunhistochemische Färbung zu detektieren (Obama,
H., et al.: Anticancer Research, 18: 145–152, 1998). Die Ergebnisse
deuten darauf hin, dass die Expression von MK in den meisten Herzzellen
in einem normalen Herzen nicht beobachtet wurde, aber in Herzzellen
an mehreren, den Ventrikel überziehenden
Stellen beobachtet wurde (4 und 5).
Im Gegenteil dazu wurde eine starke Expression von MK in dem Herzinfarkt-Modell
an der Wand des rechten Ventrikels (RV), dem Septum und dem Endokard
der, dem rechten Ventrikel (LV) zugewandten Wand des linken Ventrikels,
beobachtet (6). Andere Regionen der linken
ventrikulären
Wand, die mit der Region des Zelltods korrespondiert, wurden nicht
gefärbt.
Die Spezifität
dieser MK-Färbung
wurde bekräftigt,
weil die MK-Färbung verschwand,
nachdem MK durch einen Anti-MK-Antikörper absorbiert wurde (7).
So zeigten die hier genannten Erfinder immunhistochemisch die deutliche
Expression von MK bei Herzinfarkt. Überraschenderweise wurde die
bemerkenswert intensive MK-Färbung
nicht nur in dem an die Infarktstelle des linken Ventrikels angrenzenden
Bereich, sondern auch im gesamten RV und den meisten Regionen des
Septums (6) beobachtet.
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Gefärbte und
ungefärbte
Bereiche sind durch eine klare Linie geteilt, die mit der Grenze
zwischen den Bereichen der Koronararterien übereinstimmt. Interessanterweise
unterscheidet sich das Expressionsmuster von MK in einem Herzinfarkt-Modell
von dem von bFGF im gleichen Modell (in der Figur nicht gezeigt).
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Die
detailliertere Untersuchung der MK-Expression in einem Infarkt-Modell
zeigte das Auftreten von MK-Färbung
in dem RV (8) und Septum (9)
(durch einen Pfeil und eine Pfeilspitze angedeutet). Das Septum
wurde extensiv vergrößert und
intensive Färbung
wurde an Kapillaren oder der Penumbra von, das Kapillarendothel überziehenden
Myokardzellen, beobachtet (10). Das
Innere der Myokardzellen ist auch intensiv gefärbt (angezeigt durch ein Sternchen).
Der gefärbte
Bereich war deutlich von der ungefärbten Region durch die Grenze
zwischen dem Septum und LV getrennt (10). Wie
vorstehend beschrieben wurde im LV nur eine schwache und ungleichmäßige MK-Färbung beobachtet,
außer
für Endomyokardzellen
(12).
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Ein
Vergleich der mRNA-Expression im RV und Septum des Infarktmodells
und normalen Ratten durch Northern-Blot-Analyse, machte deutlich,
dass der gesteigerte mRNA Spiegel in Ratten des Infarktmodells nachweisbar
ist. Zusätzlich
zu der 1,0 kB MK-mRNA, wurde eine 1,8 kb Bande, die mit der MK-cDNA
reagiert, detektiert. Diese 1,8 kb Bande könnte eine Isoform von MK-mRNA
sein. Diese Ergebnisse deuten an an, dass die gesteigerte MK Immunreaktivität im Herzen
kurz nach dem Infarkt durch eine stabile Erhöhung der Transkriptionsaktivität von mRNA
verursacht wird.
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Die
MK-Expression wird im, durch Abbinden der linken vorderen Koronararterie
(LAD) einer Ratte verursachten Myokard-Infarkt, beachtlich gesteigert.
Diese Steigerung wird vermehrter MK-mRNA zugeschrieben und wird
im frühen
Stadium, innerhalb von sechs Stunden nach Infarkt, hervorgerufen.
Trotz einer MK-Expression in einem breiten Bereich eines Infarktherzens,
wird seine Expression in, für
den Zelltod bestimmten Regionen, nicht detektiert, was darauf hindeutet,
dass MK an der Reparatur von geschädigtem Herzgewebe beteiligt
ist.
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Unter
Einbeziehung der Tatsache dass, wie vorstehend beschrieben, MK im ödematösen Bereich nahe
nekrotischen Stellen kurz nach einem Hirninfarkt, exprimiert wird,
deutet die Expression von MK auf seine mögliche Beteiligung an der Reparatur
oder dem Heilungsprozess unter verschiedenen pathologischen Bedingungen
hin. In der Tat wurde gezeigt, dass eine vorherige Verabreichung
von MK die, durch kontinuierliches Aussetzen von Lichteinstrahlung,
verursachte retinale Denaturierung verhindert (Unoki, K., et al.,
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35: 4063–4068, 1994).
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Die
bFGF-Expression ist mit dem Myokardinfarkt assoziiert und besitzt
eine herzschützende
Wirkung (Speir, E., et al.: Circ. Res., 71: 215–259, 1992). Die hier genannten
Erfinder konnten jedoch klar zeigen, dass, unter den von uns gewählten experimentellen
Bedingungen, MK stärker
exprimiert wurde als bFGF. MK und bFGF erhöhen gemeinschaftlich die Wirksamkeit
des Plasminogen-Aktivators in Endothelzellen der Aorta (Kojima,
S., et al.: J. Biol. Chem., 270: 9590–9596, 1995). Sie steigern
auch die Proliferation von mesenchymalen Zellen des Zahnes (Mitssiadis,
T. A., et al.: J. Cell Biol., 129: 267–281, 1995). Deshalb können sie
auch gemeinsam bei der Reparatur beschädigter Herzgewebe wirken.
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Zusätzlich haben
die hier genannten Erfinder gefunden, dass MK auch schwach in Myokardzellen
und stark im Endokard normaler Herzen exprimiert wird. Diese örtlich beschränkte Expression
von MK ähnelt
der von bFGF (Speir, E., et al.: Circ. Res., 71: 215–259, 1992),
aber ihre erhöhten
Expressionsmuster nach Infarkt, unterscheiden sich voneinander.
Es wird vermutet, dass bFGF an der Förderung der DNA-Synthese, der Überlebensstimulierung,
Verzögerung
der Alterung und der Regulierung der Wanderung und Produktion der
extrazellulären
Matrix in normalen Myokardzellen beteiligt ist (Speir, E., et al.:
Circ. Res., 71: 215–259,
1992). MK könnte ähnliche
Rollen im Herzen spielen. Die MK-Expression wird nach einem Herzinfarkt
in Bereichen, die nicht nur proximal, sondern auch distal zu der
Infarktregion liegen, gesteigert. Diese gesteigerte Expression von
MK wird nicht nur in den Ventrikeln, sondern auch in den Wänden der
Arterie, nachgewiesen.
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Aus
diesen Tatsachen wird offensichtlich, dass MK sowohl in der Entwicklung,
als auch bei der Reparatur des Herzens wichtige Rollen spielt, was
auf die Möglichkeit
hinweist, dass eine Abnormalität
in der Expression von MK oder des Signal-Transduktions-Systems verschiedene Krankheiten,
einschließlich
Herzerkrankungen, verursachen kann. MK ist deshalb vermutlich als
Medikament zur Prävention
oder Behandlung ischämischer
Herzerkrankungen, wie dem Myokardinfarkt, die zu myokardialer Nekrose,
die auf die Blockierung der Koronararterie oder akute Reduktion
der Blutzirkulation, zurückzuführen ist,
nützlich.
Außerdem
können
MK oder PTN als Medikament zur Prävention oder Behandlung einer
Gruppe anderer, durch, auf Ischämie und
Stress, wie ischämische
Colitis oder Verschluss der Mesenterialarterie, verursacht durch
Störungen
der Blutzirkulation im Verdauungstrakt, zurückzuführende Cythopathie verursachte
Erkrankungen, verwendet werden.
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Das
zur Behandlung oder zur Prävention
von Krankheiten, die auf durch Ischämie verursachte Cythopathie
zurückzuführen sind
verwendete MK oder PTN dieser Erfindung, ist vorzugsweise ein humanes
rekombinantes MK oder PTN oder partielle Peptidfragmente davon,
die ihre biologischen Wirkungen aufweisen. Natives MK ist nicht
glykosiliert, daher wird nicht glykosiliertes MK in der vorliegenden
Erfindung bevorzugt. Solch ein MK schließt humanes MK, das aus 121
Aminosäureresten
besteht, ein, aber seine Aminosäuresequenz
ist nicht darauf beschränkt
(Muramatsu, T.: Develop. Growth & Differ.
36: 1–8,
1994).
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Im
MK der Maus wird ein Signalpeptid von einem, aus 139 Aminosäureresten
bestehendem Vorläuferprotein,
abgespalten, um das reife MK zu ergeben (bestehend aus 118 Aminosäureresten
mit einem Molekulargewicht von 13 kDa). 30 dieser Aminosäurereste
sind basische Aminosäuren
und 10 sind Cysteinreste. Fünf,
durch die Cysteinreste gebildete Disulfid-Brücken, formen zwei Domänen an den
N- und C-Enden.
Diese zwei Domänen
unterscheiden sich in ihren biochemischen und biologischen Eigenschaften
und können
vielleicht verschiedene Rollen in der funktionllen Expression in
vivo spielen. Die Heparin bindende Fähigkeit ist an der C-terminalen Seite
höher,
als auf der N-terminalen Seite (Muramatsu, H., et al.: Biochem.
Biophys. Res. Commun., 203: 1131, 1994). Die Fähigkeiten zum Neurit-Auswuchs und Stimulation
der Fibrinolyse sind hauptsächlich
an den C-Terminus gebunden (Muramatsu, H., et al.: Biochem. Biophys.
Res. Commun., 203: 1131, 1994; Kojima, S., et al.: Biochem. Biophys.
Res. Commun., 206: 468, 1995). Deshalb werden auch partielle Polypeptidfragmente,
die dem MK innewohnenden biologischen Wirkungen besitzen, in diese
Erfindung eingeschlossen.
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In
der Aminosäuresequenz
des humanen MK können
spezifische Aminosäure(n)
unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken leicht deletiert,
inseriert oder substituiert werden, um die Wirkungen der Medikamente
dieser Erfindung zu steigern, oder um ihre Sicherheit zu verbessern.
Eine Aminosäure
an einer spezifischen Stelle kann z. B. durch seine gleichwertige
Aminosäure
chemisch substituiert werden. Eine hydrophobe Aminosäure (wie
Ala) kann spezifisch sowohl durch eine andere Aminosäure mit
vergleichbarer Hydrophobizität
(wie Gly), als auch durch eine Aminosäure höherer Hydrophobizität (wie Val,
Leu oder Ile) ersetzt werden. In gleicher Weise kann ein negativ
geladener Aminosäurerest
durch eine andere Aminosäure
(z. B. Ersatz von Asp durch Glu), oder ein positiv geladener Aminosäurerest
durch eine andere Aminosäure
(z. B. Ersatz von Lys gegen Arg) ersetzt werden. Da die C-terminale
Hälfte
von MK, z. B. die Positionen 60–121 (C-Hälfte 60-121) oder die Positionen
62-104 des C-Endes (C-Hälfte
62-104) (Muramatsu, H. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 203:
1131–1139,
1994) die Fähigkeit
zum Neurit-Auswuchs trägt
und die Heparin-Bindungsstelle enthält, können sie zusätzlich nützlich für die Medikamente
dieser Erfindung sein. Es ist auch wünschenswert, eine hydrophobe
Aminosäure
in eine geladene Aminosäure
abzuändern,
solange solch eine Änderung
keine unerwünschte
Wirkung auf die biologische Aktivität von MK hat. Fachleute können die
vorstehenden Modifizierungen durchführen, sodass MK die bevorzugten
biologischen Aktivitäten
besitzt. Wie proteinöse Medikamente
oft, können
MK und PTN aufgrund des Angriffs durch Proteasen und Wechselwirkungen
mit unnötigen
Rezeptoren ihre Effizienz nicht zeigen. Deshalb kann die Stabilität von MK
und PTN in vivo durch Konjugation mit Polyethylenglykol (PEG), Polyvinylpyrroridon,
Dextran etc., erhöht
werden. Die Hybridisierung von II-6 mit PEG verlängerte z. B. denn Aufenthalt
von II-6 im Blutstrom. Diese Erfindung schließt solch chemisch modifiziertes
MK und PTN ein. Der hier verwendete Begriff „Midkine" oder „MK" schließt alle solchen modifizierten
und veränderten
MKs ein, so lange sie die ursprünglichen
biologischen Wirkungen von MK beibehalten. Der hier verwendete Begriff „MK-Familie" umfasst alle, zu
dieser Familie gehörenden,
modifizierten und veränderten
Proteine (MK und PTN), so lange sie ihre innewohnenden biologischen
Aktivitäten
aufweisen.
-
Ein
Protein der MK-Familie der vorliegenden Erfindung kann direkt verabreicht
werden, um einen Hirninfarkt, Myokardinfarkt, ischämische Colitis,
Verschluß der
oberen Mesenterialarterie etc. zu verhindern oder zu behandeln.
Alternativ kann es auch in einem, den Wirkstoff enthaltenden Arzneimittel,
durch bekannte präparative
Methoden formuliert werden. Es kann z. B. in pharmazeutische Präparate,
die für
eine effektive Verabreichung an menschliche Probanden geeignet sind,
formuliert werden. Das schließt
eine Injektion, Präparate für eine Naseninhalation,
perkutane Absorption, orale Verabreichung, etc., vorzugsweise Injektion
ein. Die Präparate
werden zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Medien, wie sterilisiertem
Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Pflanzenöl (z. B.
Sesamöl, Olivenöl etc.),
Farbstoff, Emulgator (z. B. Cholesterin), Dispergiermittel (z. B.
Gummi arabicum), oberflächenaktivem
Mittel (z. B. hydriertes Polyoxyethylen-Castoröl Tensid), Lösungsmittel
(z. B. Natriumphosphat), Stabilisator (z. B. Zucker, Zuckeralkohol
und Albumin), Konservierungsmittel (Paraben) etc. verabreicht. Injizierbare
Präparate
können
in Form von Lyophilisaten, wässriger
Lösung
und Produkten, die in einer osmotische Pumpe versiegelt sind, geliefert
werden. Arzneimittel dieser Erfindung enthalten MK oder PTN, die
direkt mit dem Hirnparenchym und den Myokardzellen agieren, um ihre
Wirksamkeit zu zeigen. So können
die Präparate
dieser Erfindung im Gegensatz zu nosotropen Medikamenten, so wie
konventionell verwendeten Stimulatoren des Hirnstoffwechsels und
die Hirndurchblutung verbessernden Mitteln, verwendet werden, um
verschiedene craniale Nervenerkrankungen durch direkte Verhinderung
der Dysfunktion, Denaturierung und Nekrose von Nervenzellen insgesamt
oder in spezifischen Regionen, die auf grundlegende Ursachen wie
Ischämie,
Trauma und Alterung oder nicht erklärbare Ursachen zurückzuführen sind
und durch Stimulierung der Regeneration von geschädigten Nervenzellen,
behandelt werden.
-
Die
vorstehenden Erkrankungen können
durch Gentherapie, durch die Steigerung der Expression von MK- oder
PTN-Protein an ischämisch
erkrankten Stellen unter Verwendung der Promor-Region des MK- oder PTN-Gens,
behandelt werden.
-
Die
Arzneimittel dieser Erfindung können
injiziert werden, z. B. bei einer Tagesdosis von etwa 0,001 bis
100 μg/kg
MK- oder PTN-Protein, eingeteilt in eine bis sechs Dosen, intraarteriell,
intravenös,
intramuskulär,
subkutan, intraventrikulär
oder intraspinal. Die Zusammensetzung kann auch direkt in den Ventrikel
und die Meninx mittels eines dort eingesetzten Katheters zugeführt werden.
Alternativ kann es in eine osmotische Druckpumpe aufgenommen werden
und kontinuierlich mittels der in den Körper implantierten Pumpe verabreicht
werden.
-
Es
wurde berichtet, dass die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke vorübergehend
durch Infusion einer hypotonen Lösung
aus Mannitol, Harnstoff etc. über
die Karotisarterie aufgehoben wird (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:
481–485,
1979) und dass einige Substanzen (das heißt Alkyglycerol) den intracerebralen
Transfer von anderen Medikamenten fördern. Das Arzneimittel dieser
Erfindung kann ebenfalls unter Verwendung dieser Techniken verabreicht
werden. Außerdem
wurde von der Möglichkeit
der intracerebralen Aufnahme von kationisiertem Albumin durch einige Mechanismen
berichtet (J. Clin. Invest. 70: 289–295, 1982). MK- oder PTN-Proteine
können,
nach chemischer Modifikation durch eine solche Methode verabreicht
werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
Mikrofotografien (×10)
von Hirnzellen zwei Tage nach dem sie mit Trockeneis behandelt wurden.
A zeigt die Zellen in dem Infarktbereich durch die Trockeneisbehandlung
und seine mit Hämatoxylin-Eosin
gefärbte
Umgebung (H-E Färbung).
B zeigt ein Bild eines H-E gefärbten,
stark geschädigten
Infarktbereichs. C zeigt ein Bild eines ähnlichen Bereichs wie B, gefärbt mit
einem Anti-MK-Antikörper.
-
2 zeigt
eine Mikrofotografie von Hirnzellen zwei Tage nach Behandlung mit
Trockeneis. D ist ein vergrößertes (×50) Bild
von Zellen nahe des Infarktbereichs, die mit einem Anti-MK-Antikörper reagieren.
E zeigt einen ähnlichen
Bereich wie D, Apoptose-gefärbt
durch die TUNEL-Methode (unter Verwendung eines TaKaRa In situ Apoptose
Detektions Kits). Es werden auf die TUNEL-Reaktion positive Zellen
beobachtet, die mit Apoptose enden, gefolgt von Fragmentierung des
Nukleus.
-
3 zeigt
Fotos von Hirnzellen einer Kopftrauma-Modellratte. A, C und E sind
mit H-E gefärbt.
B, D und F sind Bilder, die A, C und E entsprechen, gefärbt mit
einem Anti-MK-Antikörper.
Die Vergrößerungen
sind 25-fach für
A und B und 100-fach für
C, D, E und F.
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4 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK in einem normalen
Herzen zeigt.
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5 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK in einem normalen
Herzen zeigt.
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6 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK in einem Rattenherzen
nach der Obstruktion der linken vorderen absteigenden Koronararterie
zeigt.
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7 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK in einer Kontrolle
des Rattenherzens nach der Obstruktion der linken vorderen absteigenden
Koronararterie zeigt.
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8 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK an der rechten ventrikulären Wand
eines Rattenherzens zeigt, sechs Stunden nach der Erzeugung eines
Myokardinfarkts.
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9 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK im Septum eines
Rattenherzens sechs Stunden nach der Erzeugung des Myokardinfarkts,
zeigt.
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10 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK im Grenzbereich
des Septums und der ventrikulären
Wand und der linken ventrikulären
Wand mit der Infarktstelle eines Rattenherzens sechs Stunden nach
der Erzeugung eines Myokardinfarkts, zeigt.
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11 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK im Septum eines
Rattenherzens sechs Stunden nach der Erzeugung eines Myokardinfarkts
zeigt.
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12 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK in der linken ventrikulären Wand
eines Rattenherzens, sechs Stunden nach der Erzeugung eines Myokardinfarkts
zeigt.
-
13 ist
eine Mikrofotografie, die die Verteilung von MK im Endokard des
linken Ventrikels eines Rattenherzens, sechs Stunden nach der Erzeugung
eines Myokardinfarkts zeigt.
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14 ist
eine graphische Darstellung, die das Ergebnis periodischer Messungen
der MK-Konzentration im Serum eines Myokardinfarkt-Patienten zeigt.
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15 ist
eine graphische Darstellung, die das Ergebnis periodischer Messungen
der MK-Konzentration im Serum eines Hirninfarkt-Patienten zeigt.
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Die beste
Methode zur Ausführung
der Erfindung
-
Beispiel 1 Bewertung von
Faktoren, die das ischämische
Hirn schützen
in einem vorübergehenden
Vorderhirn-Ischämie-Modell
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1.1 Verabreichung von
Faktoren, die das ischämische
Hirn schützen
vor einer ischämische
Operation
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1.1.1 Schutz des ischämischen
Hirns durch MK
-
Rekombinantes
humanes MK wurde nach der in Beispiel 1 der ungeprüften veröffentlichten
japanischen Patentanmeldung (JP-A), Nr. Hei 9-95454 beschriebenen
Methode hergestellt und in Beispiel 1.1.2 und Beispiel 1.2. verwendet.
Sechs bis 16 männliche
mongolische Wüstenrennmäuse (sechs
bis acht Wochen alt, 60 bis 80 g schwer) für jede Gruppe wurden in ein „HONEYMATIC
M-3" (KIMURA MEDICAL
INSTRUMENT LTD.), ein Betäubungsmittel-Fütterungssytem
für Fluothan
(Halothan in der japanischen Pharmakopöe) gesetzt und durch angemessene Befüllung des
Behälters
mit einem Inhalations-Anästhetikum,
Fluothan, anästhesiert.
Eine mongolische Wüstenrennmaus
wurde auf einem, mit einer Einblaseapparatur NARISHIGE SCIENTIFIC
INSTRUMENT LAB.:TYP SR-5N, Nr. 97924) ausgestattetem Operationstisch
fixiert. Nachdem der Kopf einem Mittellinien-Einschnitt unterworfen wurde, wurde
ein Loch zur Einsetzung einer Spritze geeigneter Größe durch
einen Dentalbohrer, 2 mm von der Stelle der Bregma in Richtung des
linken Augapfels, erzeugt. Durch dieses Loch wurden mit einer Mikrospritze
(HAMILTON MIKROLITER #701) 2 μl
MK-Lösung
0,5 mg/ml, 1 mg/ml oder 2 mg/ml (0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg) (in physiologischer Kochsalzlösung) in
den Ventrikel injiziert. Eine Kochsalzlösung (japanische Pharmakopöe, physiologisches
Kochsalz, Otsuka physiologische Kochsalzinjektion, Otsuka Arzneimittel)
verabreichte Gruppe und die Imitations-Operationsgruppe (Sham-op)
wurden als Kontrollgruppen bereitgestellt. Nachdem diese Lösungen in
den Ventrikel injiziert wurden, wurden die Tiere für 4 Minuten
liegen gelassen und die Operationsstelle genäht. Der Brustkorb wurde einem
Mittellinienschnitt unterworfen, um sowohl die rechte, wie auch
die linke gemeine Arteria carotis bloß zu legen. Beide Arterien
wurden mit „ Nr.
23 artery Kremmer straight" abgebunden,
um den Blutfluss für
5 Minuten zu stoppen, danach ließ man das Blut wieder zirkulieren.
Während
der ischämischen
Belastung, wurden die Hirn- und Körpertemperatur konstant gehalten
(37 ± 0,2 °C). Das Einzelwesen
wurde gekennzeichnet und nach dem Erwachen aus der Narkose im Pflegekäfig untergebracht.
Die Tiere wurden gefüttert
und hatten freien Zugang zu Wasser und Futter. Nach 96 Stunden wurden
die Tiere durch Perfusion mit 0,2 % Heparin (Novo Heparin Injection
100; Japan Hoechet Marion Russell, LTD.) und 4 % Paraformaldehyd-Lösung enthaltender
Kochsalzlösung,
fixiert. Das Hirn wurde vom enthaupteten Kopf unter Verwendung von
Scheren ausgeschnitten und in 4 % Paraformaldehyd-Fixativ für einen
Tag eingetaucht. Dorsalen Hippocampus enthaltende Gewebe wurden
getrocknet und durchgebrochen, dann in Paraffin eingebettet.
-
Die
Erfinder stellten von diesem Paraffinblock 5 μm Schnitte her, entsprechend
von 0,5 bis 1,0 mm von der Spitze des Hippocampus oder 1,4 bis 1,9
mm hinter der sagittalen Naht und färbten mit Hämatoxylin-Eosin (H-E-Färbung).
Unter Verwendung dieses Gewebepräparats
wurde die Länge
der hippocampalen CA1, unter Verwendung eines Kurvimeters vom einseitigen
Typ fünfmal
gemessen und der Durchschnittswert daraus wurde berechnet. Pyramidalzellen
(Neurocyten) des linken Hippocampus in der hippocampalen Region
wurden unter 200-facher Vergrößerung gezählt und
das Ergebnis wurde durch den vorstehend beschriebenen Durchschnittswert
geteilt, um die Anzahl der lebensfähigen Neurocyten pro mm der
hippocampalen CA1 zu berechnen. Die Ergebnisse werden in Tabelle
1 gezeigt.
-
-
Wie
in Tabelle 1 deutlich gezeigt, verhinderte MK, verabreicht in einer
Einzel-Dosis von 0,5 μg
oder mehr den verzögerten
Tod von Neurocyten in der hippocampus-CA1-Region erheblich.
-
1.1.2 Vergleich der schützenden
Wirkung von MK auf das ischämische
Hirn mit der anderer Hirn-Schutzfaktoren
-
Jeder
schützende
Faktor für
das ischämische
Hirn wurde intraventrikulär
bei einer Dosis von je 2 μl verabreicht.
Die bilaterale gemeine Karotisarterie wurde jeweils unter Verwendung
von Sugita Hirn-Aneurysma-Klemmen (Standard-Typ; MIZUHO) an zwei
Stellen abgebunden. Das Hirn wurde eine Woche später durch Perfusion fixiert.
Mit Ausnahme dieser drei Modifikationen, wurde das Experiment in
der gleichen Weise wie in 1.1.1. durchgeführt. Rekombinantes humanes
Pleiotropin (PTN) und rekombinanter humaner Haupt-Fibroblasten-Wachstumsfaktor
(bFGF) wurden von R & D
Systems (Funakoshi) käuflich
erworben. Ihre Dosen waren 2 μg,
1 μg und
0,5 μg für PTN und
2 μg und
1 μg für bFGF.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
-
-
Die
Dosis, bei der MK eine statistisch signifikante schützende Wirkung
auf das ischämische
Hirn ausübt, wird auch in diesem Beispiel als 0,5 μg oder mehr
angenommen, was circa die gleiche ist, wie die in 1.1.1. erhaltene.
Obwohl mehr Neurocyten bei einer Dosis von 0,125 μg überlebten,
als in der Gruppe, der physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde, war
der Unterschied statistisch nicht signifikant. Die PTN-Dosis, die benötigt wurde,
um eine statistisch signifikante Schutzwirkung auf das ischämische Hirn
auszuüben,
betrug etwa 2 μg,
was etwa viermal höher
ist als für
MK. bFGF, welches Berichten zufolge effektiv das ischämische Hirn
schützt
(Nakata, N. et al.: Brain Res., 605: 354–356, 1993), übte eine
statistisch signifikante Schutzwirkung auf ein ischämisches
Hirn bei einer Dosis von 2 μg
aus, aber die Anzahl überlebensfähiger Neurocyten bei
dieser Dosis war weniger als etwa der bei der gleichen Dosis MK
beobachteten. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass MK, als
einem Unterdrücker
des, durch Ischämie
verursachten Todes cranialer Nervenzellen, in einem Modell der mongolischen
Wüstenrennmaus
für vorübergehende
Vorderhirn-Ischämie
eine Schutzwirkung auf das ischämische
Hirn zeigt, die vergleichbar zu der unter Verwendung bekannter ischämischer
Hirnschutzfaktoren, wie Prosaposin, ciliarem neurotropen Faktor
(CNTF) oder Interleukin 6 (II-6) erhaltenen, ist.
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1.2 Verabreichung von
Schutzfaktoren für
das ischämische
Hirn nach vorbestimmter Rückperfusionsdauer nach
ischämischer
Operation.
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Mit
Ausnahme der Verabreichung von MK 48 Stunden nach Rückperfusion
nach einer ischämischen Operation,
wurde das Experiment genau in der gleichen Weise wie 1.1.2. durchgeführt. Wenn
2 μg MK
verabreicht wurde, betrug die Anzahl lebensfähiger hippocampaler CA1 Neurocyten
nach 48 Stunden 160 Zellen/mm Hippocampus. Dies war annähernd gleich
wie die Zahl bei einer Dosis von 0,5 μg in 1.1.2. Dieses Ergebnis
zeigte, dass die Verabreichung von MK innerhalb einer bestimmten
Zeit nach Rückperfusion
nach einer vorübergehenden
Hirn-Ischämie
ein ischämisches
Hirn effektiv schützen
kann.
-
Wie
vorstehend gezeigt, können
die Proteine der MK-Familie vielleicht, das ischämische Hirn schützende Wirkungen
ausüben,
basierend auf einem anderen Wirkungsmechanismus, als dem von den
bekannten proteinösen
Schutzfaktoren für
das ischämisches
Hirn. Von der Expression und dem Anstieg verschiedener neurotroper
Faktoren auf Nervernschädigungen,
infolge Trauma, Ischämie
etc., wurde kürzlich
berichtet. Es wird angenommen, dass diese neurotropen Faktoren an
Reparaturmechanismen einer Nervenschädigung beteiligt sind und auf
Neurocyten direkt oder indirekt über
Gliacyten wirken, um wichtige Rollen in ihrem Überleben und Wiederherstellung
zu spielen. Deshalb können
synergistische oder zusätzliche
Effekte durch die Verwendung von MK in Kombination mit anderen neurotropen
Faktoren erwartet werden.
-
Beispiel 2 Expression
von MK in einem Trockeneis-Hirnschädigung (Kälteschaden)-Modell
-
Es
wurden zehn männliche
Sprague-Dawley-Ratten (SD-Ratten) (Körpergewicht, 160 g) verwendet. Sie
wurden durch intraperitoneale Injektion von 4 % Chloralhydrat (10
ml/kg) narkotisiert. Die Kopfhaut wurde mit Scheren eingeschnitten
und in ein 7 mm × 10
mm großes
Stück (etwa
2 mm dick) geschnittenes Trockeneis wurde für 10 Sekunden auf den Schädel gedrückt. Die
Kopfhaut wurde dann vernäht
und die Tiere wieder gefüttert
und freier Zugang zu Wasser und Futter erlaubt. An den Tagen 1,
2, 4, 7 und 14 nach der Trockeneis-Behandlung, wurden zwei Ratten
durch intraperitoneale Injektion von 4 % Chloralhydrat (10 ml/kg)
anästhesiert und
durch Perfusion von physiologischer, 0,2 % Heparin (Novo Heoarininjektion
100, Japan Hoechst Marion Russel) und 4 % Paraformaldehyd-Fixativ
enthaltender Kochsalzlösung
(Japanische Pharmakopöe,
physiologisches Kochsalz, Otsuka physiologische Kochsalzinjektion,
Otsuka Arzneimittel), fixiert. Nach gründlicher Fixierung wurden die
Tiere enthauptet. Ihre Hirne wurden unter Verwendung von Scheren
entnommen und mit 4 % Paraformaldehyd-Fixativ durchtränkt. Nach
24 stündiger
Fixierung, wurde das ausreichend erstarrte Hirn unter Verwendung
eines zweischneidigen Rasiermessers (FEATHER) in vier Stücke von
der Stirnseite geteilt. Die Gewebestücke, in denen der Infarktbereich
beobachtet werden konnte, wurden getrocknet, durchgebrochen und
unter Verwendung eines automatischen Einbettungsgeräts in Paraffin
gebettet. Von diesem Paraffinblock wurden 5 μm Schnitte hergestellt. Diese
Paraffin-Scheiben wurden 1) einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H-E-Färbung),
2) einer Anti-MK-Antikörper-Färbung (Kaninchen
Anti-Maus MK polyclonaler Antikörper) und
3) einem Apoptose-Nachweis unterworfen.
-
1 ist
eine Mikrofotografie (×10)
von Hirnzellen zwei Tage nach der Behandlung mit Trockeneis, gefärbt mit
H-E oder dem Anti-MK-Antikörper.
A stellt durch Trockeneis hergestellte Infarkt-Nidi und Zellen nahe
daran, dar, B stellt beträchtlich
geschädigte
Infarkt-Nidi dar und C stellt einen ähnlichen Bereich wie B dar,
gefärbt
mit dem Anti-MK-Antikörper.
In C (Anti-Mk-Antikörper-Färbung),
wird ein hoher Spiegel der MK-Expression nahe des Infarktbereichs
beobachtet.
-
2 ist
eine Mikrofotografie (×10)
von Hirnzellen zwei Tage nach der Trockeneisbehandlung, gefärbt mit
dem Anti-MK-Antikörper
oder gefärbt
für den
Nachweis von Apoptose. D stellt ein vergrößertes (×50) Bild von Zellen nahe des
Infarktbereichs dar, die mit dem Anti-MK-Antikörper reagierten. E stellt eine
Mikrofotografie von Zellen nahe des Infarktbereichs ähnlich wie
D dar, die durch die TUNEL Methode (unter Verwendung eines TaKaRa
In situ Apoptose Nachweis Kits) untersucht wurden, um zu bestimmen,
ob sie Apoptose verursachten. Zellen mit Kernfragmentierung und
positiv gegenüber
der TUNEL-Reaktion, können
detektiert werden. Wie in 2 gezeigt,
erlitten die Zellen höhere
Schäden,
je schwächer
die Infarkt-Nidi gefärbt
wurden.
-
Beispiel 3 Expression
von MK im Hirnschädigungs-Rattenmodell
-
In
Beispiel 2 wurde die MK-Expression in einem Modell von durch Ischämie verursachtem
Hirninfarkt, untersucht. In diesem Beispiel wurde ein Modell eines,
durch mechanischen Stress verursachten Infarkt vorbereitet, um hierin
die MK-Expression
zu untersuchen. Es wurden zehn männliche
SD-Ratten (Körpergewicht, 320
g) verwendet. Sie wurden durch intraperitoneale Injektion von 4
% Chloralhydrat (10 ml/kg) anästhesiert. Die
Großhirnrinde
wurde abgetragen, um ein Hirnschädigungs-Modell
vorzubereiten. Die Kopfhaut wurde mit Scheren eingeschnitten und
ein im Durchmesser 4 mm, 3 mm dickes Stück der Großhirnrinde wurde bei 3 mm in
Richtung des linken Auges entlang der koronalen Naht und weiter
3 mm in Richtung des Hinterkopfes entlang der sagittalen Naht, abgetragen.
Ein Einwegstanzer (wegwerfbarer Hautbohrer) (Siefel Laboratorien)
wurde für
die Abtragung verwendet. Nachdem die vollständige Abtragung abgesichert
war, wurde die Kopfhaut genäht
und die Tiere wurden wieder gefüttert
mit freiem Zugang zu Wasser und Futter. An jedem der Tage 1, 2, 4,
7 und 14 nach der Präparation
des Hirnschädigungs-Modells,
wurden 5 μm
dicke Schnitte von zwei Ratten in ähnlicher Weise wie in Beispiel
2 hergestellt. Ihre Paraffinschnitte wurden angefertigt und mit
H-E und Anti-Maus-MK-Antikörper
gefärbt.
Die an Tag 1 nach der Hirnpräparation
erhaltenen Ergebnisse, werden in 3 gezeigt;
die Felder A, C und E zeigen H-E-Färbung und
die Felder B, D und F stellen Anti-MK-Antikörper-Färbung dar. Die Felder bekräftigen,
dass MK sehr schnell auf mechanische Schäden reagiert. Die Bilder A,
C und E der H-E-gefärbten
Gewebe deuten darauf hin, dass Hirnzellen großen Schaden durch mechanische
Schädigungen
erlitten. Die Bilder B, D und F der mit dem Anti-MK-Antikörper gefärbten Geweben,
zeigt viele auf die Antikörperfärbung positive
Zellen, hauptsächlich
neben der hämorrhoidalen
Region und in dem Bereich, wo die Hirnzellen stark geschädigt waren,
was mit dem, in A, C und E gefärbten
Bereich korrespondiert. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass sogar
im Falle des Schaden erleidenden Neurocyten, infolge von sowohl
ischämischem,
als auch mechanischem Stress, MK in einem frühen Stadium antwortet und nahe
des geschädigten
Bereichs exprimiert wird.
-
Beispiel 4 Expression
von MK im Myokard-Infarkt-Modell
-
4.1 Herstellung eines
Myokard-Infarkt-Modells
-
Es
wurde ein myokardialer Infarkt an der linken ventrikulären Wand
von Wistar-Ratten
(7 Wochen alt, männlich)
nach der Methode von Fine, G. et al. (Fine, G., Morales, A. und
Scerpella, J. R.: Arch. Path. 82: 4–8, 1966) durch Abbinden der
linken vorderen, absteigenden Coronararterie (LAD), hergestellt.
Sechs Stunden nach dem Abbinden, wurden die Ratten eingeschläfert und
das Herz sofort für
die Analyse ausgeschnitten. Um die Lebensfähigkeit der myokardialen Zellen
zu bekräftigen
(Fishbein, M. C. et al.: Am. Heart J. 101: 593–600, 1981), maßen die
Erfinder den Bereich und die Größe des myokardialen
Infarkts durch Färbung
mit Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC).
-
4.2 MK, Anti-MK-Antikörper und
Anti-bFGF-Antikörper
-
MK
und ein Affinitäts-gereinigter
Kaninchen-Anti-Maus-MK-Antikörper
wurden nach der Methode von Take, M. et al. (Take, M. et al.:J.
Biochem. 116: 1063-1068, 1994) hergestellt. Die Spezifität des Affinitäts-gereinigten
Anti-MK-Antikörper
war fast die gleiche, wie die des in Muramatsu et al. (Muramatsu,
H. et al.: Dev. Biol. 159: 392–402,
1993) beschriebenen Antikörpers.
Dieser Antikörper
reagierte mit MK, aber nicht mit PTN in der Western-Blot-Analyse.
Mab52 (Wako Pure Chemikalien) wurde als Maus-Anti-Mensch bFGF monoclonaler
Antikörper
verwendet. Dieser Antikörper
erkennt den Ratten bFGF (Takami, K. et al.: Exp. Brain Res. 90: 1–10, 1992).
-
4.3 Immunhistochemische
Analyse
-
Es
wurde ein horizontaler Ausschnitt der ventrikulären Region des Rattenherzens
herausgenommen, in einer neutralen Puffer-Formalin-Fixierlösung bei
Raumtemperatur fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5 μm dicke Schnitte
geschnitten. Nachdem die Schnitte entparaffinisiert waren, wurden
sie in einer, 0,3 Wasserstoffperoxid enthaltenden 100 % Methanol-Lösung für 30 Min.
inkubiert, um endogene Peroxidase zu blockieren. Bovines Serumalbumin
(1 %) wurde zu den Schnitten gegeben und man ließ die Reaktion für 30 Min.
ablaufen. Um MK nachzuweisen, wurden diese Schnitte mit dem Affinitäts-gereinigten
Kaninchen-Anti-MK
polyclonalen Antikörper
(8 μg/ml)
bei 4 °C über Nacht
inkubiert. Diese Schnitte wurden mit einem biotinylierten Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Vector
Laboratorien Korp., Kalifornien) für 30 Min. und dann mit einem
biotinylierten alkalische Phosphatase-Streptavidin-Komplex (Dako,
Giostrup, Dänemark)
für 30
Min. inkubiert. Um bFGF nachzuweisen, wurden die Schnitte mit dem
monoclonalen Maus-Anti-bFGF Antikörper (5 μg/ml) bei 4 °C über Nacht inkubiert, dann mit
einem biotinylierten Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper (Vector Laboratorien, Korp.,
Kalifornien) für
30 Min. und weiter mit einem biotinylierten alkalische Phosphatase-Strepavidin-Komplex (Dako,
Giostrup, Dänemark)
für 30
Min. Die Immunreaktion wurde mit einem Fast Red TR/Naphthol (Sigma, St.
Louis, MO) sichtbar gemacht. Eine Gegenfärbung wurde mit Hämatoxylin
durchgeführt.
Die Spezifität
der MK-Immunofärbung wurde
bestimmt, indem rekombinatem MK ermöglicht wurde, den Anti-MK-Antikörper zu absorbieren
und der resultierende Komplex einer Heparin-Sepharose-Aftinitäts-Chromatographie (Yasuhara, O
et al.; Biochem. Biophys. Res. Commun., 192: 246–251, 1993) unterworfen wurde.
-
Die
Ergebnisse werden in den 4 bis 13 gezeigt.
-
Die 4 bis 7 sind
Mikrofotografien, die eine gesteigerte Anfärbbarkeit von MK in Rattenherzen nach
dem Verschluss der linken vorderen absteigenden Koronararterie zeigen.
Die 4 und 5 stellen ein normales, immunhistochemisch
gefärbtes
Rattenherz dar, in dem MK in einigen den Ventrikel überziehenden
Myokardzellen exprimiert wird. Eine schwache Immunreaktion wird
in anderen Myokardzellen des Septums nachgewiesen. Die meisten Myokardzellen
exprimieren jedoch fast kein MK. 6 ist eine
Mikrofotografie, die ein Rattenherz sechs Stunden nach der Erzeugung
eines Myokardinfarkts zeigt. Im Septum (SE), der rechten ventrikulären Wand
(RV) und dem Endokard (durch einen Pfeil angezeigter Bereich) der
linken ventrikulären
Wand (LV) wird starke MK-Färbung
nachgewiesen. Der Unterschied in der Immunfärbung zwischen der linken ventrikulären Wand
und dem Septum ist sehr deutlich. Gefärbte und nicht gefärbte Bereiche
werden durch eine einzelne deutliche, dem Grenzbereich jeder Koronararterie,
die Nährstoffe
an diese Regionen liefert, entsprechenden Grenze, geteilt. Myokardzellen
in der Region des Zelltodes von LV werden nicht gefärbt. Das
Muster der MK-Expression im, eine Infarktstelle aufweisenden Herzen
unterschied sich vom bFGF im gleichen Herzen. 7 ist
eine Mikrofotografie, die eine Kontrollfärbung mit einem neutralisierenden
Anti-MK-Antikörper
zeigt. Da Zellen nach Behandlung mit dem neutralisierenden Anti-MK-Antikörper nicht
angefärbt
wurden, wurde bestätigt,
dass MK spezifisch durch diese Methode gefärbt wird. Die in den Figuren
gezeigten Balken stellen 1500 μm
in den 4, 6 und 7 und 150 μm in 5 dar.
-
Die 8 bis 13 sind
Mikrofotografien, die die detaillierte MK-Expression in einem Rattenherzen sechs
Stunden nach der Bildung eines Myokardinfarkts zeigt. Immunhistochemische
Färbung
von MK wurde in der rechten ventrikulären Wand (8),
dem Septum (9 und 11), dem
Grenzbereich zwischen dem Septum, der ventrikulären Wand, die Infarktbereiche
besitzt und der linken ventrikulären
Wand (10), der linken ventrikulären Wand
(12) und dem Endokard im linken Ventrikel (13)
nachgewiesen. Eine Immunreaktion von MK wurde in Myokardzellen (Teile
werden mit Sternchen in den 11 und 13 angezeigt)
und der Penumbra der Myokardzellen, auskleidenden Endothelzellen
oder Endothelzellen selbst (Teile angezeigt durch Pfeil und einen
Pfeilkopf) beobachtet. In einer stark vergrößerten Mikrofotografie des
Septums (11), wurde MK in der Penumbra
Myokardzellen, die Blutgefäße auskleiden
oder vaskulären
Endothelzellen intensiv angefärbt.
Das Innere von Myokardzellen (13) wird
auch intensiv oder mäßig gefärbt (Anteile mit
Asterisks angezeigt). Die Grenze zwischen dem Septum und LV trennt
gefärbte
und nicht gefärbte
Bereiche deutlich (10). Die in den Figuren gezeigten
Balken stellen 200 μm
in den 8, 9 und 10 und 50 μm in den 11, 12 und 13 dar.
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Beispiel 5 Messung von
MK im Serum von Infarktpatienten
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Unter
Verwendung eines, in JP-A Hei 10-160735 beschriebenen EIA-Systems,
bestimmten die Erfinder die MK-Konzentration in Seren von Patienten
mit Myokardinfarkten und Hirninfarkten. Jede von Patienten gesammelte
Serumprobe wurde bei 3000 UpM für
15 Min. (bei Raumtemperatur) zentrifugiert. Diese Seren wurden bei –80 °C gelagert. 14 zeigt
ein Beispiel einer regelmäßig bestimmten
MK-Konzentration im Serum eines Patienten mit Myokardinfarkt. MK
wurde in dem relativ späten
Stadium nach der Entstehung des Myokardinfarkts exprimiert. Seine
Konzentration in Blut stieg an und erreichte einen Höchstwert
12 Stunden nach der Entstehung. Er fiel nach 24 Stunden auf den
gleichen Spiegel wie sechs Stunden nach der Entstehung ab und, nach
31 Stunden auf etwa 0,16 ng/ml, was der Durchschnittsspiegel normaler
Personen ist. Dieser Wechsel in der MK-Konzentration im Blut nach der Entstehung
eines Myokardinfarkts ist vielleicht einmalig für MK. So ein Zusammenhang von
Myokardinfarkt mit MK, einschließlich der MK-Expression in
der Infarkt-Penumbra im frühen
Stadium, zeigt die Beteiligung von MK im Reparaturmechanismus des
Herzmuskels. 15 zeigt die MK-Konzentration in
Seren von Hirninfarkt-Patienten. In Fällen von Hirninfarkt wurde
MK ebenso in einer sehr hohen Konzentration im Blut von Patienten,
deren Blut vermutlich in einem frühen Stadium der Entstehung
eines Hirninfarkts gesammelt wurden, gefunden, wie in den 15A, D, E und F. Diese Daten werden für die Studie
der Tatsache, dass eine große
Menge an MK nahe des Bereichs mit Hirninfarkt in einem frühen Stadium
nach der Entstehung nachgewiesen wird, auf der Ebene der Einzelperson,
als interessant erachtet.
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Industrielle Anwendbarkeit
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Die
Proteine der Midkine-Familie oder Teilpeptide davon, sind nach dieser
Erfindung sehr wirksam in der Behandlung oder Prävention von Cytopathie, die
durch Ischämie
oder ischämische
Erkrankungen, die auf diese Cythopathie zurückzuführen sind, verursacht wird.
Diese Proteine sind zum Beispiel als Medikamente sowohl zur Behandlung
oder Prävention
von cerebrovaskulären
Erkrankungen, wie cerebrovaskulärem Krampf
nach subarachoidaler Hämorrhagie,
Alzheimerscher Krankheit, seniler Demenz von Alzheimer-Typ, cerebrovaskulärer seniler
Demenz etc., als auch von Hirninfarkt, vorübergehenden ischämischen
Erkrankungen und Kopftrauma und anderen cerebrovaskulären Krankheiten,
wie Parkinsonsche Krankheit, Chorea Huntington, amyotrope Regressionserkrankungen
etc., wirksam. Außerdem
wird von diesen Proteinen erwartet, dass sie als Medikamente zur
Behandlung und Prävention
ischämischer
Erkrankungen wie dem Myokardinfarkt, Anstrengungs-Angina; ischämischer
Colitis; Obstruktion der oberen Mesenterialarterie etc. verwendet werden.
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Zusätzlich kann
von diesen Proteinen erwartet werden, dass sie in der Gentherapie
durch die Aktivierung von Promotoren für die Gene von MK und PTN verwendet
werden können,
um die Proteine MK und PTN an ischämischen Stellen zu exprimieren.
