CN103432681A - 包含神经调节蛋白的药物制剂及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含神经调节蛋白(neuregulin，NRG)的装置或制剂，该装置或制剂可向哺乳动物血液中长期注入神经调节蛋白，从而使神经调节蛋白在血液中持续存在。实验证明血液中持续存在的NRG不仅能长时间持续激活其下游信号传导系统，还能显著改善心衰心脏的功能。本发明中向哺乳动物血液长期注入神经调节蛋白的装置具体包括装有NRG溶液的容器及配套注射系统，含NRG溶液的胶囊式渗透压泵，含NRG的制剂具体包括NRG和聚乙二醇(PEG)的耦联物或含NRG的脂质体、微球等。

Description

包含神经调节蛋白的药物制剂及装置

技术领域

本发明涉及生物化学、分子生物学和医学领域。具体而言，本发明涉及释放神经调节蛋白到动物血液中的药物制剂及装置。

发明背景

神经调节蛋白(neuregulin，NRG；heregulin，HRG)，又叫神经胶质生长因子(glial growth factor，GGF)，neu分化因子(new differentiationfactor，NDF)，为分子量在44KD左右的糖蛋白，它们在细胞间传递信号，是酪氨酸激酶受体ErbB家族的配体。神经调节蛋白家族含4个成员：NRG1，NRG2，NRG3，NRG4。(Falls et al.，Exp Cell Res.284：14-30，2003)对后三者的生物学功能相对来讲知之甚少。NRG1在神经系统、心脏和乳腺中起着重要作用，还有证据显示NRG1信号传递在其他一些器官系统的发育、功能以及人类疾病(包括精神分裂症和乳腺癌)的发病机理中起作用。NRG1有很多异构体。对基因突变小鼠(基因敲除小鼠)的研究说明在N末端区或表皮生长因子(EGF)类似区不同的异构体，其在体功能也不一样。本发明是以神经调节蛋白1β(NRG1β)为基础的。

神经调节蛋白1β为一跨膜蛋白(Holmes et al.，Science256，1205-1210，1992)。膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白类似区(Ig-likedomain)和EGF类似区(EGF-like domain)，膜内部分是C末端。在细胞外基质的金属蛋白酶作用下，神经调节蛋白的膜外部分可被酶切下来而呈游离状态，从而有利于和周围细胞表面的ErbB受体结合，激活相应的细胞信号传递。

ErbB受体家族也分为四类，ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4，它们都是跨膜蛋白，分子量在180-185KD附近。除ErbB2外，它们在膜外的N末端都含配体结合区；除ErbB3外，它们在膜内的C末端都含蛋白酪氨酸激酶活性。其中ErbB1是表皮生长因子的受体，ErbB3和ErbB4都是神经调节蛋白的受体。在神经调节蛋白的受体中，只有ErbB2和ErbB4在心脏表达量较高。(Yarden et al.，Nat Rev Mol CellBiol，2：127-137，2001)

当神经调节蛋白与ErbB3或ErbB4的膜外部分结合时，将引起ErbB3、ErbB4与其他ErbB受体(常常包括ErbB2)形成异源二聚体，或ErbB4自身形成同源二聚体，然后导致受体的膜内部分被磷酸化(Yarden et al.，Nat Rev Mol Cell Biol，2：127-137，2001)。磷酸化的膜内部分可进一步与细胞内的多种信号传递蛋白结合，从而激活下游ERK或AKT信号通路，引起一系列细胞反应：包括刺激或抑制细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移、细胞分化或细胞粘连。

神经调节蛋白对心脏的发育尤其重要(WO0037095，CN1276381，WO03099300，WO9426298，US6444642，WO9918976，WO0064400，Zhao et al.，J. Biol. Chem.273，10261-10269，1998)。在胚胎发育早期，神经调节蛋白的表达主要局限于心内膜，随后通过旁分泌途径释放到周围心肌细胞并与细胞膜上的蛋白酪氨酸激酶受体ErbB4膜外部分结合，ErbB4进而与ErbB2形成异源二聚体。ErbB4/ErbB2复合物的形成及激活对早期海绵样心脏形成小梁是必须的。神经调节蛋白、ErbB4和ErbB2三个蛋白基因中的任何一个缺失都会使胚胎没有小梁并在发育早期死于子宫。WO0037095显示一定浓度的神经调节蛋白可持续激活ERK信号通路，促进心肌细胞在的生长及分化，引导心肌细胞和细胞粘连处肌节和细胞骨架的重建，改善心肌细胞的结构，增强心肌细胞的收缩。WO0037095及WO03099300还指出神经调节蛋白可用于检测、诊断和治疗各种心血管疾病。

下面列举了与本发明有关的一些现有技术文献：

1、cardiac muscle function and manipulation；WO0037095

2、生长因子神经调节蛋白及其类似物的新应用；CN1276381

3、neuregulin based methods and compositions for treating cardiovasculardiseases；WO03099300

4、You-yang Zhao，Douglas R.Sawyer,Ragavendra R.Baliga,Douglas J.Opel，Xinqiang Han，Mark A.Marchionni，and Ralph A.NeuregulinsPromote Survival and Growth of Cardiac Myocytes.Kelly J.Biol.Chem.273，10261-10269(1998)

5、Methods for treating muscle diseases and disorders；WO9426298

6、Methods of increasing myotube formation or survival or muscle cellmitogenesis，differentiation or survival using a neuregulin；US6444642

7、Therapeutic methods comprising use of a neuregulin；WO9918976

8、Methods for treating congestive heart failure；WO0064400

9、William E.Holmes，Mark X.Sliwkowski，Robert W. Akita，William J.Henzel，James Lee，John W.Park，Daniel Yansura,Nasrin Abadi，HelgaRaab，Gai1D.Lewis，H.Michael Shepard，Wun-Jing Kuang，William I.Wood，David V. Goeddel，Richard L. Wandlen.Identification of heregulin，a specific activator ofp185(erbB2).Science256，1205-1210(1992)

10、Douglas L. Falls.Neuregulins：functions，forms，and signalingstrategies.Experimental Cell Research284，14-30(2003)

11、Yosef Yarden，Mark X.Sliwkowski.Untangling the ErbB signallingNetwork.Nature Reviews：Molecular Cell Biology2127-137(2001)。

发明概述

发明人发现给大鼠注射一定量(10μg/kg：蛋白量/体重)的神经调节蛋白能激活体内的ERK和AKT信号通路，进而有利于心力衰竭的恢复。

发明人近来还发现给哺乳动物持续给神经调节蛋白(NRG)，也能激活ERK和AKT信号通路，并能提高哺乳动物心脏的FS和/或EF值，及预防心脏肥大，进而能大大提高心衰心脏的收缩功能，达到比快速给药更好的效果。

因此，我们将神经调节蛋白注入胶囊式渗透压泵、微量注射器、与PEG耦联或包装于脂质体、微球中，然后再植入或注入动物体内，这样就能够持续地释放神经调节蛋白，从而延长蛋白的半衰期，降低蛋白用量，减少病人的用药次数，降低毒副作用，同时又起到比快速注射更好的治疗作用。

本发明的一方面提供一种预防、治疗或延缓哺乳动物疾病或紊乱的装置，该装置包括有效量的神经调节蛋白，其特征在于，该装置是长期释放神经调节蛋白的装置。

本发明的预防、治疗或延缓哺乳动物疾病或紊乱的装置通过向哺乳动物血液中长期释放神经调节蛋白，可激活哺乳动物心肌细胞的MAP激酶信号通路并引起心肌细胞的生长或分化，从而预防、治疗或延缓哺乳动物疾病或紊乱，尤其是哺乳动物心力衰竭。

在一较佳实施方式中，本发明的装置包括容器和/或配套注射系统，该容器例如是泵和/或注射器，如渗透压泵、微量注射泵。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期释放可诱导心肌细胞中ERK和/或AKT信号通路的持续激活。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期释放可提高哺乳动物心脏的EF和/或FS值。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期释放可预防哺乳动物心脏肥大。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期释放可减小哺乳动物左心室的内径。

在本发明进一步较佳实施例中，所述的疾病是心力衰竭。

在本发明中，所述的疾病或紊乱选自心血管疾病、癌症、神经系统疾病、肌肉疾病、肌肉萎缩症(如杜兴肌营养不良、肢带型肌营养不良)、多发性硬化、脊髓损伤、中风、眼或耳疾病、糖尿病、精神分裂症及老年性痴呆症。

在本发明中，所述的神经调节蛋白可为NRG1，NRG2，NRG3，NRG4的功能氨基酸片段，即含EGF类似区的任何氨基酸片段。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期低剂量释放可以减小其对哺乳动物的副作用，其中副作用包括胃肠道紊乱和/或心包液渗漏。

在本发明进一步较佳实施例中，所述的长期释放包括每天连续释放10分钟到24小时，更佳地每天连续释放至少4小时，最佳地每天连续释放至少6小时。

在本发明进一步较佳实施例中，所述的神经调节蛋白还可用其它影响哺乳动物基因表达的因子如FGF(纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、IGF(胰岛素类似生长因子)、内皮素、LIF(白血病抑制因子)、EGF(表皮生长因子)、PDGF(血小板源生长因子)、TGF(转化生长因子)、IL-11(白细胞介素11)、TNF(肿瘤坏死因子)、干扰素、激素(如脑钠肽家族和胰岛素)、EPO(红细胞生成素)或CSF(集落刺激因子)等配体家族成员来替代。

本发明另一方面是提供一种预防、治疗或延缓哺乳动物疾病或紊乱的药物制剂，该药物制剂包括有效量的神经调节蛋白，其中，该药物制剂是长期释放神经调节蛋白的药物制剂。

本发明的预防、治疗或延缓哺乳动物疾病或紊乱的药物制剂通过向哺乳动物血液中长期释放神经调节蛋白，可激活哺乳动物心肌细胞的MAP激酶信号通路并引起心肌细胞的生长或分化，从而预防、治疗或延缓哺乳动物疾病或紊乱，尤其是哺乳动物心力衰竭。

在一较佳实施方式中，本发明的药物制剂是NRG和聚合物的耦联物、脂质体和/或微球或其它缓慢释放药物的制剂。该聚合物是聚乙二醇和/或聚乙二醇衍生物。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期释放可诱导心肌细胞中ERK和/或AKT信号通路的持续激活。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期释放可提高哺乳动物心脏的EF和/或FS值。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期释放可预防哺乳动物心脏肥大。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期释放可减小哺乳动物左心室的内径。

在本发明进一步较佳实施例中，所述的疾病是心力衰竭。

在本发明，所述的疾病或紊乱选心血管疾病、癌症、神经系统疾病、肌肉疾病、肌肉萎缩症(如杜兴肌营养不良、肢带型肌营养不良)、多发性硬化、脊髓损伤、中风、眼或耳疾病、糖尿病、精神分裂症及老年性痴呆症。

在本发明中，所述的神经调节蛋白可为NRG1，NRG2，NRG3，NRG4的功能氨基酸片段，即含EGF类似区的任何氨基酸片段。

在本发明进一步较佳实施例中，神经调节蛋白的长期低剂量释放可以减小其对哺乳动物的副作用，其中副作用包括胃肠道紊乱和/或心包液渗漏。

在本发明进一步较佳实施例中，所述的长期释放包括每天连续释放10分钟到24小时，更佳地每天连续释放至少4小时，最佳地每天连续释放至少6小时。

在本发明进一步较佳实施例中，所述的神经调节蛋白还可用其它影响哺乳动物基因表达的因子如FGF(纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、IGF(胰岛素类似生长因子)、内皮素、LIF(白血病抑制因子)、EGF(表皮生长因子)、PDGF(血小板源生长因子)、TGF(转化生长因子)、IL-11(白细胞介素11)、TNF(肿瘤坏死因子)、干扰素、激素(如脑钠肽家族和胰岛素)、EPO(红细胞生成素)或CSF(集落刺激因子)等配体家族成员来替代。

附图说明

图1是神经调节蛋白在三种给药条件下诱导的正常大鼠左心室组织AKT、ERK的磷酸化随时间变化的图。其中“vehicle”即赋形剂，“P-AKT”、“P-ERK”和“NRG”分别代表磷酸化的AKT，磷酸化的ERK和神经调节蛋白。“im”、“iv”和“ivgtt”指的是肌肉注射，静脉注射和静脉滴注。

图2是用BaI₂染色检测电泳后各泳道中PEG的结果图。将反应后的PEG和神经调节蛋白混合物通过凝胶过滤柱S100分离，收集各组分电泳后染色。图中“mixture”指PEG和神经调节蛋白反应后的混合物。“M”和“peak1”、“peak2”、“peak3”分别代表蛋白分子量标记和反应混合物经过S100柱分离后的洗脱峰1，2，3。“NRG-mono-PEG”、“NRG-di-PEG”和“NRG-poLy-PEG”分别指的是与一个PEG结合的神经调节蛋白、与两个PEG结合的神经调节蛋白和与多个(至少3个)PEG结合的神经调节蛋白。

图3是用考马氏亮蓝染色检测电泳后各泳道中神经调节蛋白的结果图。其中的缩写标记含义同图2。在M泳道，各条蛋白带的分子量从下往上依次为14.4kD，20.1kD，31.0kD，43.0kD，66.2kD和97.4kD。

发明详述

神经调节蛋白是具有重要生物学功能的糖蛋白。本发明提供了神经调节蛋白在治疗和预防心血管疾病中的新方式。但是，本发明并不受限于所阐述之原理。

在本发明中，所有术语均具有本领域的技术人员普遍已知的含义。

术语“神经调节蛋白”是指能够激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异二联蛋白酪氨酸激酶的分子，包括神经调节蛋白异构体、神经调节蛋白中的EGF区域、神经调节蛋白突变体，和任何能激活上述受体的神经调节蛋白类的基因产物。作为例子，但非限制性地，本发明的神经调节蛋白是神经调节蛋白β2异构体的一个片段，即177-237位氨基酸片段，其中包含了受体结合区EGF类似区。该片段的氨基酸序列为：SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ。应该理解的是，本发明的神经蛋白包括完整蛋白、其片段和各种突变体、等价物、模拟体等等，也包括上述物质与它种物质的融合体、偶联体或者结合物，包括上述物质的变性或者未变性形式，包括上述物质的各种各样修饰物。在不背离本发明的基础上，对神经调节蛋白进行截短、氨基酸替换或添加等等变化都是在本发明的范围之内。

实施例1神经调节蛋白在不同给药条件下诱导的正常大鼠左心室组织AKT、ERK磷酸化

试验方法：将体重为200±20g的雄性Wistar大鼠分成三个一组，分别后肢肌肉注射(im)、尾静脉注射(iv)或尾静脉滴注(iVgtt，20μl/min，持续2小时左右)赋形剂(10mM Na₂HPO4-NaH₂PO4，150mM NaCl，0.2％HSA(人血清白蛋白)，5％甘露醇，pH6.0，剂量为4ml/kg鼠体重)或10μg/kg神经调节蛋白(NRG1β2之177-237氨基酸片段，泽生科技开发有限公司，批号：200503002)，溶解于赋形剂中，浓度为2.5μg/ml，剂量为4ml/kg鼠体重)，然后分别给药后于20min、1r、2hr、4hr、6hr断颈处死，摘下心脏，剪取左心室，用预冷的生理盐水洗净后将同组三个左心室在裂解液(50mMTris pH7.4，5mM EDTA，150mM NaCl，1％Triton X-100，2mM Na₂VO₄，50mM NaF，2mM PMSF及Cocktail蛋白酶抑制剂混和物(无EDTA，Roche))中剪碎、匀浆，将匀浆液于12,000rpm离心5min，取上清，同上再离心一次，-80℃冻存。用前化冻，再于12,000rpm离心5min，取上清。用BCA方法测定蛋白浓度，取适量样品与2×样品缓冲液(0.125M Tris pH6.8，20％甘油，4％SDS，0.2M DTT，0.012％溴芬蓝)混合，煮3min，然后电泳，转膜，分别用ERK、磷酸化ERK或AKT、磷酸化AKT对应的抗体(Cell signaling公司)来检测样品的ERK、AKT磷酸化状态。

实验结果如图1所示，为神经调节蛋白不同给药方法的正常大鼠左心室AKT、ERK的磷酸化水平随时间变化的情况图。从图中可以看出，与赋形剂相比，三种给药方法下神经调节蛋白都能持续诱导ERK的磷酸化，而神经调节蛋白诱导的AKT磷酸化水平则在给药后20min时较高，1hr时降低，2hr时又开始回升，到4hr时回复到较高水平。特别值得注意的是，尾静脉滴注时神经调节蛋白对ERK、AKT磷酸化的影响跟其他两种注射方法没有明显区别，提示神经调节蛋白的持续低剂量给药方法也是同样有效的。

实施例2不同给药方法时神经调节蛋白恢复冠脉结扎大鼠心功能的情况

实验方法：

1、大鼠冠脉结扎、心超检测及分组

200±20g Wistar雄性大鼠(中国科学院上海实验动物中心)腹腔注射氯胺酮(Ketamine)100mg/kg麻醉后，仰卧固定于鼠板，颈部及胸部去毛后用新洁尔灭消毒。颈部正中切口，钝性分离气管，18G动静脉针留置第3-5气管软骨间，退出针芯，将塑料套管推入气管内1-2cm，固定，以备接小动物呼吸机(SAR-830/P ventilator，潮气量约1ml/100g/次，频率60次/分钟)。胸部左前切口，钝性分离，暴露第4、5肋骨，用弯头纹式止血钳从肋间穿透胸壁并剪断第4肋，接通开启呼吸机，暴露心脏，观察肺充气及心跳情况。撕开心包，将上部脂肪垫上翻，充分暴露左心耳和肺动脉圆锥，于二者之间用6/0医用无损伤缝合线结扎冠状动脉前降支，可看到结扎后心肌局部呈现白色(约8mm×8mm)，活动明显减弱。缝合胸壁，堵住呼吸机回气口使肺充盈，用力挤压胸部排气后，缝合胸部肌肉和皮肤。观察呼吸情况，待自主呼吸后去除呼吸机。

结扎后第14天心脏超声仪(Philips Sonos7500S4探头)检测，选用EF值在30-50％之间的大鼠随机分组，每组12只。

2、冠脉结扎大鼠给药、心超检测

结扎后第15天称重、给药。“对照组”尾静脉注射赋形剂，给药体积为0.4ml/100g，每天1次，连续给药5天，停药2天，再连续给药5天；“给药组”尾静脉注射神经调节蛋白，剂量为10μg/kg，给药体积也为0.4ml/100g，每日1次，连续给药5天，停药2天，再连续给药5天；“静脉滴注给药组”分组后第5天，做胶囊式渗透压泵(ALZET2ML1)植入手术，泵中充入神经调节蛋白溶液2ml(含神经调节蛋白250μg，如果大鼠体重按照250g计算，给药速度接近6μg/kg×h，达峰血药浓度与给大鼠尾静脉注射0.7μg/kg神经调节蛋白后相当)。给药7天后，心超检查。次日用生理记录仪(ABinstruments powerlab4-25)做血流动力学检查、心脏解剖学检查。

2.1、胶囊式渗透压泵(ALZET2ML1)装药并植入体内

在无菌操作台内给每支(250μg)神经调节蛋白先注入1ml无菌注射用水，再注入1ml无菌生理盐水，溶解后用无菌注射器抽取神经调节蛋白溶液，给注射器换上钝头注射针头，排净气泡。取下胶囊式渗透压泵的流量调节器并将泵直立，将注射针头从泵的顶端小孔处插入至最底部，缓慢推入神经调节蛋白溶液，直至有溶液溢出小孔，拔出注射针头，擦净泵外周溶液。把流量调节器上方的半透明盖子去掉，露出一小段不锈钢管，将长5cm的PE60管与之连紧。注射器吸取神经调节蛋白溶液，排净气泡，针头与PE60管相连，充入药物溶液至流量调节器满为止。将流量调节器未与PE60管连接的一端插入泵中，至流量调节器的白色边缘与泵贴紧为止，拔掉注射器及针头。将连接好的泵浸入37℃的无菌生理盐水中过夜，用前取出。

用氯胺酮麻醉大鼠，取仰卧位，颈部备皮并消毒，用灭菌铺巾覆盖大鼠身体。在颈前偏右侧纵向切口，小心分离颈外静脉，在远心端结扎，穿双线，用眼科剪在颈外静脉上做一斜剪口，再用显微镊撑开切口，将连接了胶囊式渗透压泵的PE60管插入约2cm，近心端扎紧，远心端多处扎紧固定PE60管。然后自切口处向颈后外侧钝性分离一窦道至背部肩胛处，再钝性分离一空间，将胶囊式渗透压泵自窦道塞入背部肩胛处的空间内。缝合切口，并开始计时。待大鼠苏醒后送其回鼠房，让其自由进食水。

实验结果

表1为用不同方法注射神经调节蛋白后冠脉结扎大鼠心脏的心超数据。从表中可看出，静脉滴注给药时冠脉结扎大鼠心脏的射血分数(EF)比对照组增加了59.18％，比静脉注射组增加了34.81％；静脉滴注时心脏的收缩分数(FS)则比对照组升高了73.79％，比静脉注射组升高了44.00％；而静脉滴注时心脏左心室舒张末期直径(LVEDD)却比对照组减小了9.98％，比静脉注射组减小了6.03％；静脉滴注时左心室收缩末期直径(LVESD)比对照组减小了21.37％，比静脉注射组减小了15.15％。由此可见通过静脉滴注给大鼠神经调节蛋白后，不仅心衰大鼠的心功能相对于其它两组大大改善，而且心室的内部直径还有明显减小，提示这种给药方法还能较大程度地防止心脏肥大。

实施例3微量注射泵持续给药神经调节蛋白增强心衰大鼠心功能

实验方法：将心衰大鼠分成A、B、C、D、E和F六组，每组15只。A组每天静脉注射一次4ml/kg(药液体积/鼠体重)赋形剂，注射10天；B组每天静脉注射一次1oμg/kg(蛋白重量/鼠体重)神经调节蛋白(2.5μg/ml)，注射10天；C组每天用微量注射泵以1.25μg/kg/h(蛋白重量/鼠体重/时间)的速度静脉灌注神经调节蛋白(0.625μg/ml)4小时，注射10天；D组每天用微量注射泵以2.5μg/kg/h(蛋白重量/鼠体重/时间)的速度静脉灌注神经调节蛋白(1.25μg/ml)4小时，注射10天；E组每天用微量注射泵以0.625μg/kg/h(蛋白重量/鼠体重/时间)的速度静脉灌注神经调节蛋白(0.625μg/ml)8小时，注射10天；F组每天用微量注射泵以1.25μg/kg/h(蛋白重量/鼠体重/时间)的速度静脉灌注神经调节蛋白(1.25μg/ml)8小时，注射10天。注射10天后心超检测各组的心功能情况。

如表2示，相对于赋形剂组，静脉注射神经调节蛋白(B组)将心衰大鼠EF值提高了20.29％，微量注射泵静脉灌注4小时每天(C组、D组)和静脉注射的效果相似，而微量注射泵静脉灌注8小时每天(E组、F组)则将心衰大鼠的EF值提高了约37.1％。同时，于赋形剂组相比，静脉注射神经调节蛋白(B组)将心衰大鼠的FS值提高了23.61％，微量注射泵静脉灌注4小时每天(C组、D组)和静脉注射对FS值的影响相似，而微量注射泵静脉灌注8小时每天(E组、F组)则将心衰大鼠的EF值提高了约45.49％。令人惊讶的是，虽然E组心衰大鼠的给药量仅为F组的一半，但给药后两组大鼠的EF值或FS值几乎相同。这些结果表明给心衰大鼠每天持续静脉灌注神经调节蛋白8小时以上时能显著提高大鼠的心功能。

实施例4微量注射泵持续给药神经调节蛋白增强心衰大鼠心功能

实验方法：将心衰大鼠分成A、B、C、D、E和F六组，每组15只。A组每天静脉注射一次4ml/kg(药液体积/鼠体重)赋形剂，注射10天；B组每天静脉注射一次10μg/kg(蛋白重量/鼠体重)神经调节蛋白(2.5μg/ml)，注射10天；C组每天皮下注射(HI)一次10μg/kg(蛋白重量/鼠体重)神经调节蛋白(2.5μg/ml)，注射10天；D组每天用微量注射泵以2.5μg/kg/n(蛋白重量/鼠体重/时间)的速度皮下灌注神经调节蛋白(1.25μg/ml)4小时，注射10天；E组每天用微量注射泵以1.67μg/kg/h(蛋白重量/鼠体重/时间)的速度皮下灌注神经调节蛋白(1.11μg/ml)6小时，注射10天；F组每天用微量注射泵以1.25μg/kg/h(蛋白重量/鼠体重/时间)的速度皮下灌注神经调节蛋白(1.25μg/ml)8小时，注射10天。注射10天后心超检测各组的心功能情况。

如表3示，相对于赋形剂组，静脉注射神经调节蛋白(B组)将心衰大鼠EF值提高了10.43％，皮下注射神经调节蛋白(C组)将心衰大鼠EF值提高了7.12％，而皮下微量注射泵灌注神经调节蛋白4小时每天(D组)则能增强EF值12.47％，皮下微量注射泵灌注神经调节蛋白6小时每天(E组)则能增强EF值达22.90％，皮下微量注射泵灌注神经调节蛋白8小时每天(F组)则能增强EF值20.10％。同时，与赋形剂组相比，静脉注射神经调节蛋白(B组)将心衰大鼠FS值提高了11.24％，皮下注射神经调节蛋白(C组)将心衰大鼠FS值提高了7.10％，而皮下微量注射泵灌注神经调节蛋白4小时每天(D组)则能增强FS值14.20％，皮下微量注射泵灌注神经调节蛋白6小时每天(E组)则能增强FS值达26.63％，皮下微量注射泵灌注神经调节蛋白8小时每天(F组)则能增强FS值26.04％。结果表明当用微量注射泵每天皮下持续灌注神经调节蛋白6小时以上时能显著地增强心衰大鼠的心功能。

实施例5神经调节蛋白的PEG耦联和耦联后的神经调节蛋白活性

实验方法

A神经调节蛋白的PEG(polyethylene glycerol)耦联和耦联神经调节蛋白(NRG)的分离

将PEG(mPEG-SPA-5000，NEKTAR)与20mM PBS(pH8.0)缓冲液中1mg/ml的神经调节蛋白(PEG：NRG＝1：1，摩尔比)快速混合并于室温缓慢搅拌30分钟，然后加入过量的冰醋酸终止耦联反应。将反应混合物加入凝胶过滤柱(S100，Pharmacia)以分离各组分。收集各吸收峰处溶液并电泳。电泳后的凝胶先后用BaI₂或考马氏亮蓝染色以检测PEG或神经调节蛋白。

从图2所示BaI₂染色的胶可看出，反应混合物中含未耦联的PEG，NRG-monoPEG(NRG与一个PEG耦联)，NRG-diPEG(NRG与两个PEG耦联)和NRG-polyPEG(NRG与多个PEG耦联)。经过凝胶过滤柱分离，混合物被分离为NRG-polyPEG和NRG-diPEG(峰1)，NRG-monoPEG和PEG(峰2)。

图3中考马氏亮蓝染色的胶证实了峰1和峰2包含PEG耦联的神经调节蛋白，而峰3中只含神经调节蛋白。

B PEG耦联神经调节蛋白活性的测定

收集MCF-7细胞，计数，离心沉淀细胞后重悬于DMEM(含10％血清，9μg/ml胰岛素)中，细胞浓度为5×10⁴个/ml。于96孔板中每孔加入100μl细胞悬液后在37。℃培养过夜，随后用PBS洗细胞3次后加入无血清DMEM再于37℃培养24小时。

将H4抗体(人ErbB2单克隆抗体)用包被缓冲液(50mMNa₂CO₃-NaHCO₃，pH9.6)稀释到6μg/ml，再给96孔板中每孔加50μl，随后将板置于4℃过夜以包被抗体。

吸去饥饿培养的MCF-7细胞之培养液，给每孔分别加入100μl含不同浓度NRG、NRG-monoPEG或NRG-diPEG的培养液，另外两孔仅加培养液做空白对照。将板置于37℃保温20分钟后吸去培养液，用PBS清洗细胞一次后每孔加入100μl裂解液(50mM Hepes，pH8.0，150mM NaCl，2mM钒酸纳，0.01％thimerosal，1％Triton X-100和Cocktail蛋白酶抑制剂药片(Roche))后在4℃裂解30分钟。轻摇96孔板使细胞裂解完全后收集每孔细胞裂解液于一Eppendorf管中并于15000rpm离心15分钟。

将H4抗体包被的96孔板用清洗液(10mM PBS，pH7.4，0.05％Tween20)洗5次后每孔加入200μl含5％脱脂牛奶的清洗液，将板置于37℃保温2小时后再用清洗液洗板3次。

细胞培养板每孔90μl细胞裂解液被转移到抗体包被的96孔板之相应孔中，将包被板于37℃保温1小时再用清洗液洗5次，随后每孔加入100μl与抗磷酸化酪氨酸单抗耦联的辣根过氧化物酶(Santa CruzBiotechnology)并子37℃保温1小时。用清洗液洗5次，每孔加入100μl新鲜配制的辣根过氧化物酶底物溶液[50mM柠檬酸，100mM Na₂PO₄，pH5.0，0.2mg/ml3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，0.003％H₂O₂]并于37(℃保温10分钟。以最后每孔加入50μl2N H₂SO₄终止辣根过氧化物酶活性。用酶标仪(BIO-RAD Model550)读取每孔在450nm的OD值。EC50是达到最高OD值一半时神经调节蛋白的浓度。EC50值越低，神经调节蛋白的活性越高。

NRG，NRG-monoPEG和NRG-diPEG的EC50值见表3.

表4NRG、NRG-monoPEG和NRG-diPEG的EC50值

由表4可清楚地看出，NRG-monoPEG的EC50值和NRG的相同，而NRG-diPEG的EC50值比NRG的高40％，说明NRG-monoPEG的体外活性与NRG相同，而NRG-diPEG的活性比NRG低40％。

实施例6NRG持续低剂量给药能降低NRG的负作用

实验方法：将健康猕猴分为两组，每组24只，雌雄各半，体重5-7kg。通过微量注射泵给猴子静脉注射NRG。I组猕猴每天以1μg/kcg/hr的速度灌注NRG12小时，连续14天。II组猕猴每天以1μg/kg/hr的速度灌注NRG24小时，连续14天。I组猕猴用药结束后未观测到明显负作用。在II组猕猴的心脏中，均检测到3-5ml的心包渗漏液。

给两组健康人群每天注射等量的NRG，连续10天。给I组的8人以0.3μg/kg/hr的速度每天注射NRG4小时。I组受试者中在10天中平均每人经历胃肠道紊乱2次。给II组的6人以0.6μg/kg/hr的速度每天注射NRG2小时，连续10天。II组受试者中在10天中平均每人经历胃肠道紊乱5次。

结果表明：NRG持续短时间、低剂量皮下或静脉给药能减少长时间、高剂量给药带来的负作用，如胃肠道紊乱、心包液渗漏等，提示在注重持续给药提高心功能的同时，还要最大限度地缩短每天连续给药的时间、给药速度以减少负作用，力求在改善心功能较大的情况下尽可能减少负作用。

实施例7NRG持续给药能调节大鼠左心室的基因表达

心衰大鼠通过装胶囊式渗透压泵静脉灌注NRG后剪取左心室，提取mRNA，用基因芯片检测左心室基因表达相对于对照的变化。

与灌注赋形剂的心衰大鼠(赋形剂组)比较，灌注NRG的心衰大鼠(NRG组)的基因表达图谱明显不同。在持续灌注NRG后，心衰大鼠左心室中胸腺素β类似蛋白(thymosin beta like protein)的mRNA水平上升到赋形剂组的3.1倍；Defensinβ1的mRNA水平提高到赋形剂组的2.87倍；生长相关蛋白(growth associated protein)的mRNA水平为赋形剂组的2.16倍；胸腺素β4(thymosin beta4)、Lamininγ1、myocardin、PI3Kγ调节亚单位(PI3K gamma regulatory subunit)的mRNA水平则为赋形剂组的2倍左右；而弹性蛋白(Elastin)和PI3Kγ的mRNA水平与赋形剂组基本相同。这些结果说明NRG改变了心衰心脏中蛋白表达的图谱。

对本发明可以进行许多修改和变化，而不背离其精神和范围，这对本领域的技术人员将是显而易见的。这里所述的具体实施方案仅通过实施例加以提供，本发明仅由所附权利要求以及与之等效的全部范畴所限定。此处引用的全部出版物和专利文献在此并入参考文献，这与指明每一出版物和专利文献特异的和分别地并入参考文献相同。

Claims (16)

1.一种预防、治疗或延缓哺乳动物疾病的缓释装置，其中含有有效量的神经调节蛋白，并且将所述神经调节蛋白持续释放到该哺乳动物体内，以达到比快速注射相同剂量神经调节蛋白更优的预防、治疗或延缓该哺乳动物疾病的效果，其中所述持续释放是指每天持续释放至少4小时。

2.如权利要求1所述的装置，其包含一个渗透压泵。

3.如权利要求1所述的装置，其包含一个微量注射泵。

4.如权利要求1所述的装置，其中所述持续释放是指每天连续释放至少6小时。

5.如权利要求1所述的装置，其中所述持续释放是指每天连续释放至少8小时。

6.如权利要求1所述的装置，其中所述疾病选自心血管疾病、癌症、神经系统疾病、肌肉疾病、肌肉萎缩症(如杜兴肌营养不良、肢带型肌营养不良)、多发性硬化、脊髓损伤、中风、眼或耳疾病、糖尿病、精神分裂症及老年性痴呆症。

7.如权利要求1所述的装置，其中所述疾病是心力衰竭。

8.如权利要求1所述的装置，其中所述神经调节蛋白可为NRG1，NRG2，NRG3或NRG4的功能氨基酸片段，即含神经调节蛋白家族EGF类似区的任何氨基酸片段。

9.一种预防、治疗或延缓哺乳动物疾病的缓释组合物，其中含有有效量的神经调节蛋白，并且将所述神经调节蛋白持续释放到该哺乳动物体内，以达到比快速注射相同剂量神经调节蛋白更优的预防、治疗或延缓该哺乳动物疾病的效果，其中所述持续释放是指每天持续释放至少4小时。

10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于所述神经调节蛋白是与聚合物耦联的或被脂质体或微球所包含的。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述聚合物是聚乙二醇和/或聚乙二醇衍生物。

12.如权利要求9所述的组合物，其中所述持续释放是指每天连续释放至少6小时。

13.如权利要求9所述的组合物，其中所述持续释放是指每天连续释放至少8小时。

14.如权利要求9所述的组合物，其所述疾病选自心血管疾病、癌症、神经系统疾病、肌肉疾病、肌肉萎缩症(如杜兴肌营养不良、肢带型肌营养不良)、多发性硬化、脊髓损伤、中风、眼或耳疾病、糖尿病、精神分裂症及老年性痴呆症。

15.如权利要求9所述的组合物，其所述疾病是心力衰竭。

16.如权利要求9所述的组合物，其中所述神经调节蛋白可为NRG1，NRG2，NRG3或NRG4的功能氨基酸片段，即含神经调节蛋白家族EGF类似区的任何氨基酸片段。

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