CN1278184A - 预防或治疗局部缺血性疾病的药剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗或预防由局部缺血导致细胞损伤的药剂,该药剂包含米达克因(midkine)族蛋白质作为活性成分;还提供了用于治疗或预防局部缺血性疾患的药剂,该药剂包含米达克因族蛋白质作为活性成分。米达克因对治疗或预防局部缺血性疾患和由局部缺血导致的细胞损伤是有明显疗效的;例如能够显著地预防脑梗塞的形成,它是缺血性脑疾患的典型代表。本发明的这些治疗和预防药剂对下列脑缺血性疾患是有效的,例如脑梗塞、瞬间性脑缺血性疾病和头外伤,另外对治疗和预防蛛网膜下出血继发的脑血管痉挛、阿耳茨海默氏病、阿耳茨海默型老年性痴呆和脑血管老年性痴呆等以及其他脑血管疾病、帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病和肌萎缩性退化疾患等均是有效的。

Description

预防或治疗局部缺血性疾病的药剂
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗局部缺血性疾病的药剂，含有米达克因(midkine，以下缩写为MK)作为活性成分。
背景技术
局部缺血是这样一种状态，身体局部的血流完全被阻塞或者大为减少，导致缺氧、基质供应减少和代谢产物蓄积。尽管局部缺血的程度取决于血管梗阻敏度、它的持续时间、组织对它的敏感性和侧副血管的发育程度，机能障碍通常发生在局部缺血的器官或组织中，长时间的局部缺血导致受影响组织的萎缩、变性和坏死。
缺血性脑血管损伤的形成机理分为三种类型，栓塞、栓子和血液动力。所有这三种类型的主要病理状态都是脑缺血，其严重性和持续时间定义了脑组织损伤的程度。在严重缺血的部位，神经和内皮细胞迅速受到不可逆损伤，由于坏死形成典型的梗塞病灶。尽管血流适度地下降和缺血半影部的神经细胞功能被暂停了，它们的存活能力并没有丧失，当循环通过侧副血管重新开始时，剩余的脑血管系统能够恢复其功能。
在影响冠状动脉并导致心肌缺血的缺血性心脏病中，缺血性心肌细胞损伤程度随着冠状动脉梗阻的时间延长，从可逆的细胞损害发展到不可逆的细胞损害。
可以想见，预防这种由局部缺血导致的细胞病或者刺激受损害细胞的再生的药物提供了缺血性脑和心脏疾患的基本疗法。
基于这种概念，据报道已经筛选出有效预防和治疗瞬间性脑缺血继发的神经细胞损伤的药物，方法是将缺血脑保护因子候选物质注射到心室或外周血管中，研究该物质在形态上和功能上的作用。例如，prosaposin对蒙古沙土鼠的心室内给药显著减轻了局部缺血后的学习能力丧失，海马CA1区的病理学检查显示，锥体细胞数量比对照组显著增加(Sand，A.等：《生物化学与生物物理学研究通讯》204：994-1000，1994)。象prosaposin一样，心室内注射睫状神经营养因子(CNTF)和白细胞介素6(IL-6)也被证明以剂量依赖的方式显著提高CA1区锥体细胞和突触的数量(Wen，T-C等：《神经科学快报》191：55-58，1995)(Matsuda，S.等：《神经科学快报》204：109-112，1996)。另据报道，心室内注射碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对缺血海马具有明显的保护作用，不过其方式与prosaposin、CNTF和IL-6不同(Wen，T-C等：《神经科学》65：513-521，1995)。不过，这些保护因子对缺血性脑疾患的作用机理尚未被详细阐明。
发明的公开
本发明提供一种新颖的药剂，用于治疗或预防多种由细胞死亡导致的疾病，细胞死亡是由局部缺血或应激反应引起的，该药剂包含一种米达克因(MK)族蛋白质作为活性成分。
更确切地说，本发明提供：(1)一种药剂，用于治疗或预防由局部缺血或应激反应导致的细胞病，该药剂包含一种米达克因(MK)族蛋白质作为活性成分；(2)根据(1)的药剂，其中所述的由局部缺血或应激反应导致的细胞病发生在脑实质；(3)根据(2)的药剂，其中所述的脑实质是海马CA1区中的锥体细胞；(4)一种药剂，用于治疗或预防由细胞病导致的疾病，细胞病是由局部缺血或应激反应引起的，该药剂包含一种米达克因(MK)族蛋白质作为活性成分；(5)根据(4)的药剂，其中所述的由局部缺血引起的疾病是脑梗塞；和(6)根据(4)的药剂，其中所述的由局部缺血引起的疾病是心肌梗塞。
米达克因(MK)是与肝素结合的分泌蛋白，碱性氨基酸和半胱氨酸中含有丰富的MK。它是作为一种在由视黄酸诱发的胚胎肿瘤细胞分化过程中被瞬时表达的基因产物而被发现的(Kadomatsu，K.等：《生物化学与生物物理学研究通讯》151：1312-1318，1988；Tomomura，M.等：《生物化学杂志》265：10765-10770，1990；Tomomura，M.等：《生物化学与生物物理学研究通讯》171：603，1990)。MK与后来被发现的多效蛋白(pleiotrophin)(PTN)具有45％同源性(Merenimies，J.& Rauvala，H.：《生物化学杂志》265：16721-16724，1990)，因此MK和PTN构成MK族(Muramatsu，T.：《Dev.Growth Differ.》36：1-8，1994)。
人们已经积累了很多关于MK功能的资料，现在很可能发现更新、更重要的功能。MK的主要功能包括下列五种：1)神经营养因子活性(MK刺激神经细胞的存活和轴突分枝(Muramatsu，H.等：《发展生物学》159：392，1993；Michikawa，M.等：《神经科学研究杂志》35：530，1993；Kikuchi，S.等，160，1993))；2)创伤治愈(MK减轻和预防由长时间白光刺激引起的视黄膜变性(Unoki，K.等：《眼科学与视觉科学》35：4063，1994)，在实验性大鼠脑和心肌梗塞早期的梗塞病灶附近诱发MK表达(Yoshida，Y.等：《脑发育研究》85：25-30，1995；Obama，H.等：《抗癌研究》18：145-152，1998))；3)个体发育(MK被瞬时表达的峰值出现在胚胎中期，后期主要蓄积在肾中)；4)纤溶系统的活化(浓度为10ng/ml的MK使牛主动脉血管内皮细胞的纤溶酶原激活物活性升高三至五倍(Kojima，S.等：《生物化学杂志》270：9590，1995))；和5)癌症(MK频繁地表达在维耳姆斯氏瘤、乳腺癌、肺癌、成神经细胞瘤，食道癌、胃癌、结肠癌和肝细胞瘤中(Tsutsui，J.等：《癌症研究》53：1291，1933；Garver，R.I.等：《癌症》74：1584，1994；Garver，R.I.等：《美国呼吸细胞分子生物学杂志》9：463，1993；Nakagawa，A.等：《癌症研究》55：1792，1995；Aridome，K.等：《日本癌症研究》86：655，1995)。
如上所述，在实验性大鼠脑梗塞后早期的梗塞病灶附近诱发MK的表达，并已证明它仅在星形细胞中被表达(Yoshida，A.等：《脑发育研究》85：25-30，1995)。大鼠前脑发展成瞬间性缺血后的第四天，与MK共同构成一族的PTN也是在海马中被强烈表达的，主要是在CA1区，并集中在星形细胞中(Takeda，A.等：《神经科学》68：57-64，1995)。按照惯例，伴随局部缺血而产生的星形细胞活化被认为起到保护细胞的作用。MK和PTN在发生局部缺血后的中枢神经系统修复过程中可起到一定作用。
本发明人假定MK可能在脑梗塞发作后的患者内被瞬时表达，并测定了150位健康个体和36位脑梗塞患者血清中的MK浓度。健康个体的平均MK血清浓度为0.3ng/ml，患者为0.9ng/ml。而且，从刚发展成疾患之后的患者和梗塞面积更大的患者采集的血清样本中，MK浓度趋向于更高。这些现象被认为是由局部缺血区附近被瞬时表达的MK的循环引起的。
最近报道在由外伤、局部缺血等导致的神经损伤中，各种不同神经营养因子的表达提高了(Frautschy，S.A.等：《脑研究》553：291，1991；Haynes，L.W.：《神经生物学》2：263，1988)。这些神经营养因子可能参与了神经损伤的修复机理，并直接地或间接通过胶质细胞作用于神经细胞，在其存活和修复中起到重要作用。
基于这些报道，本发明人利用脑缺血的实验模型，检查了MK的机理是否象其他神经营养因子一样参与修复神经损伤。将MK从心室内注射到该模型的蒙古沙土鼠中，为了在形态学上检查MK对海马CA1区蜕膜脱落的抑制作用，分别在造模手术之前和之后给药。由于蒙古沙土鼠内部颈动脉和椎骨动脉系统的吻合在八周后回缩，因此易于制备良好的不完全前脑缺血模型，方法是用夹子阻塞两侧共有颈动脉流通三至五分钟，通过局部缺血后的再灌注，导致特定部位(海马CA1区)神经细胞变性(延迟的神经细胞死亡)48至72小时。因此，蒙古沙土鼠的瞬间性前脑缺血模型可用于评估缺血脑的保护因子(Kirino，T.等：《脑研究》237：57-69，1982；Mitani，A.等：《神经科学快报》131：171-174，1991)。
在局部缺血手术前将MK心室内注射到蒙古沙土鼠中，以检查其对缺血脑的保护作用。从蒙古沙土鼠前囟开2mm深的孔，将含有MK(0.063，0.125，0.25，0.5，1.0和2.0μg)、PTN(0.5，1.0和2.0μg)或bFGF(1.0和2.0μg)的生理盐水心室内注射到动物中，bFGF已知对缺血脑具有保护作用，用作对比。四分钟后，结扎两侧共用颈动脉以阻止循环五分钟，造成瞬间性缺血前脑模型。循环重新开始九十六小时或七天后，切除脑，灌注4％多聚甲醛进行固定。从如此制备的石蜡块取5μm厚切片，用苏木精曙红染色，计数每1mm左海马CA1区的可见神经细胞数。如表1和2所示，与对照组(注射生理盐水)相比，MK(0.5μg或以上)给药组和PTN(2.0μg或以上)给药组显著抑制了海马CA1神经细胞的蜕膜脱落。与对照组相比，浓度为2.0μg或以上的bFGF显著抑制了海马CA1神经细胞的蜕膜脱落。这些结果说明，前述MK或PTN的心室内给药能够抑制(预防)由缺血和随后灌注导致的脑细胞损伤。
另外，将MK在局部缺血手术后对蒙古沙土鼠心室内给药，以检查其对缺血脑的保护作用。以上述相同方式建立瞬间性前脑缺血后，重新开始血循环，48小时后，以上述相同方式心室内注射MK。在注射后第七天，类似于上述制备5μm厚切片，用苏木精曙红染色，计数每毫米左海马CA1神经细胞面积的可见神经细胞数。每mm海马观察到大约160个可见神经细胞(实施例1.2)。可见细胞数约等于将0.5μg MK在局部缺血手术前给药。
记忆或学习等高水平精神活动无疑是人精神活动的基础。因此，能够减少记忆和学习障碍的药物研制已经成为神经科学最感兴趣的任务之一。已知的记忆或学习障碍的实验模型有很多，其试验方法极为不同。一种经常使用的试验是用小鼠进行的被动性逃避学习试验。
在实现本发明的过程中，本发明人阐明，与对照相比，MK或PTN在瞬间性前脑缺血手术之前或之后一定时期内的心室内给药显著抑制了海马CA1神经细胞的蜕膜脱落。而且据报道，递减型被动性逃避学习试验中海马神经细胞数与反应滞后时间的延长密切相关(Araki，H.等：《生理学与行为》38：89-94，1986；Sano，A.等：《生物化学与生物物理学研究通讯》204：994-1000；Wen，T.-C.等：《神经科学》65：513-521；Wen，T.-C.等：《神经科学快报》191：55-58)。因此，在施以局部缺血之前或之后心室内注射MK或PTN可以改善反应滞后时间。
海马CA1神经细胞最容易受到脑缺血和随后灌注的损伤这一事实，在局部缺血之前或之后注射MK或PTN的动物组与对照组相比，海马CA1神经细胞的蜕膜脱落被显著抑制这一实验结果，以及MK或PTN改善了递减型被动性逃避学习试验的反应滞后时间这一报道，都说明MK或PTN预期可用于预防和治疗由脑缺血和随后灌注导致的神经细胞损伤，用于改善精神疾患，这是这些药物的最终目的。
另外，下列实施例3揭示，在局部缺血应激反应和其他应激反应、如外伤应激反应导致的神经细胞损伤的情况下，MK响应于该损伤早期在损伤部位附近被表达。
因此，MK或PTN通过下列作用可用于预防或治疗各种颅神经疾患，直接预防由基本因素导致的神经细胞全体或特定区域机能障碍、变性和细胞死亡，这些因素例如局部缺血、外伤和衰老，或者没有可说明的因素，并刺激损伤神经细胞的再生。另外，MK与bFGF等其他具有不同作用机理的神经营养因子结合使用，可以产生协同或附加的保护作用，以预防由局部缺血或应激反应导致的神经细胞死亡。所治疗的具体疾患可以包括脑梗塞、瞬间性脑缺血、脑血管痉挛引起的蛛网膜下出血后遗症等脑病、老年性痴呆和心搏停止后回生时发生的脑病。
本发明人通过结扎大鼠左下行冠状动脉，也建立了实验性心梗模型，利用免疫组织化学染色法检测MK在心细胞内的表达(Obama，H.等：《抗癌研究》18：145-152，1998)。结果显示，在大多数正常心脏的心细胞内没有观察到MK的表达，但在若干面对心室位置的心细胞内观察到了MK的表达(图4和5)。相形之下，在心梗模型心脏的右心室(RV)壁、隔膜和面对右心室的左心室(LV)壁心内膜上观察到了强烈的MK表达(图6)。左心室壁上其他对应于细胞死亡区的面积没有被染色。这种MK染色的特异性是得到确认的，因为用抗MK抗体吸收MK后，MK染色消失(图7)。因此，本发明人从免疫组织化学上证实了心梗中独特的MK表达。令人惊奇的是，不仅在邻近左心室梗塞部位的区域，而且在整个RV和隔膜的大部分面积，都观察到了显著加强的MK染色(图6)。
用一条清楚的线划分染色区和未染色区，这条线相当于冠状动脉区之间的界线。有趣的是，心梗模型中MK的表达模式与同一模型中bFGF的表达模式不同(图中没有表示)。
对梗塞模型中MK表达的更深入检查揭示了RV(图8)和隔膜(图9)中MK染色的外观(用箭状物和箭头表示)。隔膜被放大了，在毛细管或面对毛细管内皮(图10)的心肌细胞半影观察到了强烈的染色。心肌细胞内部也被强烈地染色了(用星号表示)。通过隔膜与LV之间的界线明显区分开染色区和未染色区(图10)。如上所述，除了心内膜心肌细胞以外，在LV中仅观察到轻微和不均匀的MK染色(图12)。
用RNA印迹分析法比较梗塞模型和正常大鼠的RV和隔膜中的mRNA表达，结果揭示，在梗塞模型大鼠中可检测到mRNA水平升高。除了1.0kb MK mRNA以外，还检测到一条与MK cDNA反应的1.8kb带。该1.8kb带可能是MK mRNA的异构形式(isoform)。这些结果说明，mRNA转录活性的稳定上升导致在发生梗塞后不久的心脏内MK免疫反应性升高。
在结扎大鼠左前冠状动脉(LAD)导致的心肌梗塞中，MK表达显著增强。这种增强归因于MK mRNA的升高，发生在早期、梗塞后的六个小时内。尽管大面积梗塞心脏都有MK表达，不过在细胞死亡区没有检测到其表达，这说明MK参与受损心组织的修复。
如上所述，MK在脑梗塞后不久的坏死部位附近的水肿区被表达，考虑到这一事实，MK的表达说明了它可能参与不同病理学条件下的修复或愈合过程。实际上已经证实，MK预先给药可预防由连续接受光刺激导致的视网膜变性(Unoki，K.等：《眼科学研究与视觉科学》35：4063-4068，1994)。
bFGF表达与心肌梗塞有关，具有心保护作用(Speir，E.等：《循环研究》71：215-259，1992)。不过，本发明人能清楚地证明，在我们选择的实验条件下，MK比bFGF被更多地表达。MK和bFGF共同提高主动脉内皮细胞纤溶酶原激活物的活性(Kojima，S.等：《生物化学杂志》270：9590-9596，1995)。它们也增强牙间质细胞的增殖(Mitssiadis，T.A.等：《细胞生物学杂志》129：267-281，1995)。因此，它们也可以在修复受损心组织中一齐发挥作用。
另外，本发明人发现，MK也在心肌细胞内被微弱表达，在正常心脏心内膜内被高度表达。MK的这种局部表达类似于bFGF(Speir，E.等：《循环研究》71：215-259，1992)，但是它们在梗塞后表达的提高模式彼此不同。在正常心肌细胞内，bFGF被认为是参与促进DNA的合成、刺激存活、延缓衰老和调节细胞外基质的移行和产生(Speir，E.等：《循环研究》71：215-259，1992)。MK也可能在心脏内起到类似作用。心梗后MK的表达不仅在邻近梗塞区域、而且在梗塞区域远侧的面积都被增强了。不仅在心室内，而且在心房壁，都检测到了这种增强的MK表达。
从这些事实可以明显看出，MK在心脏的启动和修复中都起到重要作用，这说明了MK表达或信号转导系统的异常可能导致多种疾患，包括心脏病。因此，MK被认为可作为用于预防或治疗缺血性心脏病的药物，例如引起心肌坏死的心肌梗塞，由冠状动脉梗阻或血液循环的急性减少所引起。而且，MK或PTN作为药物，可用于预防或治疗一组由细胞病导致的其他局部缺血和应激反应疾患，例如由消化道循环障碍导致的缺血性结肠炎或肠系膜动脉闭塞。
本发明的用于治疗或预防由局部缺血导致的细胞病疾患的MK或PTN优选地是一种人重组MK或PTN，或具有其生物活性的部分肽片段。天然MK是没有被糖基化的；因此未糖基化的MK是本发明所优选的。该MK包括由121个氨基酸残基组成的人MK，但是它的氨基酸序列并不限于此(Muramatsu，T.：《Develop.Growth & Differ.》36：1-8，1994)。
在小鼠MK中，一种信号肽从由139个氨基酸残基组成的前体蛋白中断开，得到成熟的MK(由118个氨基酸残基组成，分子量为13kDa)。这些氨基酸残基中有三十个是碱性氨基酸，10个是半胱氨酸残基。由半胱氨酸残基形成的五个二硫键构成N端和C端两个结构域。这两个结构域的生物化学性质和生物学性质是不同的，可能在体内功能表达上起到不同作用。C端侧的肝素结合能力高于N端侧(Muramatsu，H.等：《生物化学与生物物理学研究通讯》203：1131，1994)。轴突分枝和纤维蛋白溶解刺激能力主要结合在C端(Muramatsu，H.等：《生物化学与生物物理学研究通讯》203：1131，1994；Kojima，S.等：《生物化学与生物物理学研究通讯》206：468，1995)。因此，MK固有的具有生物活性的部分多肽片段也包括在本发明内。
利用重组DNA技术，人MK氨基酸序列中的特定氨基酸能够容易地被删除、插入或取代，以增强本发明药物的活性或提高其安全性。例如，特定部位的氨基酸可以用其等价氨基酸在化学上取代。具体地说，疏水性氨基酸(例如Ala)既可以用另一种疏水性相当的氨基酸(例如Gly)取代，也可以用疏水性较高的氨基酸(例如Val、Leu或Ile)取代。同样，带负电的氨基酸残基可以用另一种氨基酸取代(例如用Glu替换Asp)，或者带正电的氨基酸残基可以用另一种氨基酸取代(例如用Arg替换Lys)。另外，由于MK的C端一半具有轴突分枝能力，并含有肝素结合部位，例如从C端计算的第60-121位(C-半侧60-121)或第62-104位(C-半侧62-104)(Muramatsu，H.等：《生物化学与生物物理学研究通讯》203：1131-1139，1994)，因此它们可用于本发明的药物。而且，希望疏水性氨基酸转变为带电氨基酸，只要这种转变不会对MK的生物活性产生不利影响。本领域技术人员能够进行上述修饰，以使MK具有优选的生物活性。由于蛋白酶的攻击和不必要受体的干扰，MK和PTN不能表现出它们的功效，象蛋白质药物通常也不能表现一样。因此，通过与聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖等缀合，可以提高MK和PTN的体内稳定性。例如，与PEG杂化的IL-6成功地延长了IL-6在血流中的停留。本发明也包括这种化学修饰的MK和PTN。
本文所用的术语“米达克因”或“MK”包括所有这些被修饰和被转变的MK，只要它们保留了MK的原有生物活性。本文所用的术语“MK族”包括属于该族的所有这些被修饰和被转变的蛋白质(MK和PTN)，只要它们具有固有的生物活性。
本发明的MK族蛋白质可以直接给药，用于预防或治疗脑梗塞、心肌梗塞、缺血性结肠炎、上部肠系膜动脉闭塞等。或者，也可以利用已知的药物制备方法配制成包含该活性成分的药剂。例如，可以配制成适用于对人有效给药的药物制剂，包括注射剂、鼻吸入制剂、经皮吸收剂、口服剂等，优选为注射剂。将制剂与药学上可接受的载体或介质一起给药，例如无菌水、生理盐水、植物油(例如芝麻油、橄榄油等)、着色剂、乳化剂(例如胆固醇)、分散剂(例如阿拉伯胶)、表面活性剂(例如聚氧乙烯氢化蓖麻油表面活性剂)、加溶剂(例如磷酸钠)、稳定剂(例如糖、糖醇和白蛋白)、防腐剂(对羟基苯甲酸酯)等。所提供的注射剂可以是冷冻干燥物、水溶液和密封在渗透压泵中的产物的形式。本发明的药物制剂含有MK或PTN，它直接作用于脑实质和心肌细胞，发挥其功效。因此，不象常用的脑代谢刺激剂和脑循环改善剂等针对疾病的(nosotrophic)药物那样，本发明制剂可用于治疗各种颅神经疾患，通过直接预防由基本因素(例如局部缺血、外伤和衰老，或者没有可说明的因素)导致的神经细胞全体或特定区域机能障碍、变性和坏死，以及通过刺激损伤神经细胞的再生进行治疗。
上述疾患可以利用基因疗法进行治疗，利用MK或PTN基因的启动子区域，增强MK或PTN在局部缺血性疾病部位内的表达。
本发明药剂可以注射给药，每日剂量例如约为0.001至100μg/kg的MK或PTN蛋白，分一至六次动脉内、静脉内、肌内、皮下、心室内或脊柱内注射。也可以通过向心室内和脑膜内插入导管，将该药剂直接给药。或者，可以将其加入到渗透压泵中，通过植入体内的该泵连续给药。
据报道，通过颈动脉注入甘露糖醇、尿素等的高渗溶液，可瞬时提高血-脑屏障的透过性(《美国国家科学院院报》76：481-485，1979)，以及某些物质(即烷基甘油)促进其他药物的脑内传递。本发明的药剂也能用这些技术给药。而且，已经报道了通过某些机理脑内摄取阳离子化的白蛋白的可能性(《临床研究杂志》70：289-295，1982)。MK或PTN蛋白可以在用这样一种方法进行化学修饰后给药。
附图的简要说明
图1代表用干冰处理后两天的脑细胞显微照片(x10)。A表示干冰处理导致梗塞面积内的细胞，其周围用苏木精曙红染色(H-E染色)。B表示H-E染色的、严重损伤的梗塞面积图象。C表示用抗MK抗体染色的类似于B的面积图象。
图2代表用干冰处理后两天的脑细胞显微照片。D是梗塞面积附近与抗MK抗体反应的细胞放大视图(x50)。E表示用TUNEL法进行编程性细胞死亡染色(使用TaKaRa原位编程性细胞死亡检测试剂盒)的类似于D的面积。观察到TUNEL反应阳性细胞在核断裂后导致编程性细胞死亡。
图3代表头外伤模型大鼠的脑细胞照片。A、C和E用H-E染色。B、D和F是对应于A、C和E的用抗MK抗体染色的图象。A和B的放大率是25倍，C、D、E和F的放大率是100倍。
图4是表示MK在正常心脏内的分布的显微照片。
图5是表示MK在正常心脏内的分布的显微照片。
图6是表示在左前下行冠状动脉梗阻后，MK在大鼠心脏内的分布的显微照片。
图7是表示在左前下行冠状动脉梗阻后，MK在大鼠心脏对照物内的分布的显微照片。
图8是表示在心肌梗塞形成后六小时，MK在大鼠心脏右心室壁上的分布的显微照片。
图9是表示在心肌梗塞形成后六小时，MK在大鼠心脏隔膜内的分布的显微照片。
图10是表示在心肌梗塞形成后六小时，MK在大鼠心脏隔膜与心室壁分界区域内和具有梗塞部位的左心室壁内的分布的显微照片。
图11是表示在心肌梗塞形成后六小时，MK在大鼠心脏隔膜内的分布的显微照片。
图12是表示在心肌梗塞形成后六小时，MK在大鼠心脏左心室壁内的分布的显微照片。
图13是表示在心肌梗塞形成后六小时，MK在大鼠心脏左心室心内膜内的分布的显微照片。
图14表示心肌梗塞患者血清内MK浓度的定期测量结果。
图15表示脑梗塞患者血清内MK浓度的定期测量结果。
实施发明的最佳方式
实施例1：用瞬间性前脑缺血模型评估缺血脑保护性物质
1.1：局部缺血手术前缺血脑保护性物质的给药
1.1.1：MK对缺血脑的保护作用
按照日本特许出愿公报(JP-A)平9-95454实施例1所述的方法制备人的重组MK，用在实施例1.1.2和实施例1.2中。将每组6至16只雄性蒙古沙土鼠(六至八周龄，重60至80g)置于氟烷(日本药典中的卤烷)麻醉的饲喂系统“HONEY MATIC M-3”(KIMURA MEDICALINSTRUMENT LTD.)中，在容器中装入适量吸入麻醉剂氟烷进行麻醉。将蒙古沙土鼠固定在手术台上，手术台配有吹入器(NARISHIGESCIENTIFIC INSTRUMENT LAB.：TYPE SR-5N，No.97024)支架。沿中线切开头部，用牙钻在离对着左眼球侧的前囟2mm处开一个适当大小的孔，用于插入注射器。通过这个孔，用微量调节注射器(HAMILTONMICROLITER #701)向心室内注射2μl MK的0.5mg/ml、1mg/ml或2mg/ml溶液(0.5μg，1.0μg，2.0μg)(在生理盐水中)。准备盐水(日本药典，生理盐水，Otsuka生理盐水注射液，Otsuka Pharmaceutical)给药组和假手术组(Sham-op)作为对照组。将这些溶液注入心室内后，离开动物4分钟，再缝合手术部位。沿中线切开胸部，暴露右和左共用颈动脉。两侧动脉用“第23号动脉Kremmer直线”结扎，以中止血流5分钟，然后允许血液再次循环起来。在施加局部缺血过程中，脑温和体温保持恒定(37±2℃)。从麻醉状态恢复后，将动物个体分开，放入看护笼中。饲喂动物，并允许自由饮水和进食。96小时后，灌注含有0.2％肝素(NovoHeparin Injection 100；Japan Hoechet Marion Russell，LTD.)和4％低聚甲醛的盐水，对动物进行固定。用剪刀剪下头部，切除脑，浸入4％低聚甲醛固定液中一天。将含有背侧海马的组织脱水和穿透，埋在石蜡中。
发明人从石蜡块中制备了5μm切片，相当于从海马尖开始0.5至1.0mm或从矢状缝后面开始1.4至1.9mm，用苏木精曙红染色(H-E染色)。利用该组织制剂，用单侧型曲线计测量五次海马CA1的长度，计算平均值。在200倍放大率下计数海马区内左海马的锥体细胞(神经细胞)，结果除以上述平均值，计算每mm海马CA1的可见神经细胞数。结果如表所示。
                              表1
  剂量(μg)   动物数     CA1神经细胞数(细胞/mm)±S.E.
Sham-op组生理盐水给药组MK给药组MK给药组MK给药组     --0.51.02.0   46454     237.5±34.59*9.6±10.31232.4±17.75*221.6±11.04*236.2±40.02*
*p＜0.05(多Dunnett比较)
如表1清楚地所示，以0.5μg或以上的单剂量给药的MK显著预防了海马CA1区内的延迟神经细胞死亡。
1.1.2：MK的缺血脑保护作用与其他缺血脑保护因子的比较
每种缺血脑保护因子以每次2μl剂量心室内给药。两侧共用颈动脉分别用Sugita脑动脉瘤夹(标准型；MIZUHO)结扎。一周后灌注，对脑进行固定。除了这三项变化以外，进行本实验的方式同1.1.1。从R & DSystems(Funakoshi)购买重组人多效蛋白(PTN)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。它们的剂量，PTN是2μg、1μg和0.5μg，bFGF是2μg和1μg。结果如表2所示。
                               表2
  剂量(μg)   动物数     CA1神经细胞数(细胞/mm)±S.E.
Sham-op组生理盐水给药组MK给药组   --0.0630.1250.250.51.02.0   416610156810     237.5±34.5915.7±24.4312.6±6.4183.4±111.928.3±57.70199.5±99.03*208.5±80.18***219.4±73.87***
PTN给药组   0.51.02.0   222     26.1±4.0343.8±0.78179.4±33.02*
bFGF给药组   1.02.0   37     28.8±28.8998.3±74.66*
*p＜0.05，***p＜0.001(多Dunnett比较)
本例也假定MK发挥统计学上显著的缺血脑保护作用的剂量是0.5μg或以上，这与1.1.1所得大致相同。尽管在0.125μg的剂量下，比生理盐水给药组有更多的神经细胞存活，不过在统计学上差异是不显著的。PTN发挥统计学上显著的缺血脑保护作用所需的剂量大约是2μg，这约是MK的四倍。据报道对保护缺血脑有效的bFGF(Nakata，N.等：《脑研究》605：354-356，1993)在2μg剂量下发挥统计学上显著的缺血脑保护作用，但是在该剂量下的可见神经细胞数小于在相等剂量MK下得到的细胞数的大约一半。从这些结果可以明显看出，MK作为由局部缺血导致的颅神经细胞死亡的抑制剂显示出对蒙古沙土鼠瞬间性缺血前脑模型的缺血脑保护作用，该作用相当于用已知缺血脑保护因子所得的作用，例如prosaposin、睫状神经营养因子(CNTF)和白细胞介素6(lL-6)。
1.2：继发局部缺血手术再灌注的预定时间后使用缺血脑保护因子
除了在局部缺血手术继发再灌注的48小时后使用MK以外，本实验的进行方式完全同1.1.2。当用2μg MK给药时，48小时后的可见海马CA1神经细胞数为160个细胞/mm海马。这大致等于1.1.2中0.5μg剂量下所得的数字。该结果揭示，MK在继发瞬间性脑缺血再灌注后一定时间内给药能够有效保护缺血的脑。
如上所证实，MK族蛋白质发挥缺血脑保护作用的机理可能不同于已知蛋白质缺血脑保护因子。最近已有报道，由外伤、局部缺血等导致的神经损伤引起各种神经营养因子的表达和增加。人们假定，这些神经营养因子参与了神经损伤的修复机理，并直接地或间接通过胶质细胞作用于神经细胞，在其存活和恢复中起到重要作用。因此，结合使用MK和其他神经营养因子预期能够达到协同或附加作用。
实施例2：MK在干冰脑损伤(冷损伤)模型内的表达
使用十只雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)(体重160g)。腹膜内注射4％水合氯醛(10ml/kg)进行麻醉。用剪刀剪开头皮，将7mm×10mm大小(约2mm厚)的干冰压在头盖骨上10秒钟。然后缝合头皮，再次饲喂动物，允许自由饮水和进食。在干冰处理后的第1、2、4、7和14天，两只大鼠通过腹膜内注射4％水合氯醛(10ml/kg)进行麻醉，灌注含有0.2％肝素(Novo Heparin Injection 100；Japan Hoechet Marion Russell，LTD.)和4％低聚甲醛固定液的生理盐水(日本药典，生理盐水，Otsuka生理盐水注射液，Otsuka Pharmaceutical)进行固定。完全固定后，动物斩首。用剪刀取出脑，泡在4％低聚甲醛固定液中。固定24小时后，充分固化的脑用双缘剃刀(FEATHER)从前端分成四片。将可以观察到梗塞面积的组织切片脱水、穿透，用自动包埋机埋入石蜡中。由该石蜡块制备5μm厚切片。将这些石蜡切片进行1)苏木精曙红染色(H-E染色)，2)抗MK抗体染色(兔抗小鼠MK多克隆抗体)，和3)编程性细胞死亡检测。
图1是用干冰处理后两天的、用H-E或抗MK抗体染色的脑细胞显微照片(x10)。A代表干冰引起的梗塞病灶及其附近的细胞，B代表严重损伤的梗塞病灶，C代表用抗MK抗体染色的类似于B的面积。C(抗MK抗体染色)中，在梗塞面积附近观察到高水平的MK表达。
图2是用干冰处理后两天的、用抗MK抗体染色或染色用于进行编程性细胞死亡检测的脑细胞显微照片(x10)。D代表梗塞面积附近与抗MK抗体反应的细胞放大视图(x50)。E代表类似于D的梗塞面积附近的细胞显微照片，用TUNEL法进行检查(使用TaKaRa原位编程性细胞死亡检测试剂盒)，以测定是否导致编程性细胞死亡。可以检测到核断裂和TUNEL反应阳性的细胞。如图2所示，梗塞病灶染色越微弱，细胞受到的损害越大。
实施例3：MK在大鼠脑损伤模型内的表达
实施例2检查了由局部缺血导致的脑梗塞模型内的MK表达。本例中，制备由机械应力导致的梗塞模型，以检查其中的MK表达。使用十只雄性SD大鼠(体重320g)。腹膜内注射4％水合氯醛(10ml/kg)进行麻醉。切除脑皮质制备脑损伤模型。用剪刀剪开头皮，在沿冠状缝对着左眼3mm处和沿矢状缝对着枕部3mm处切除直径4mm、厚3mm的脑皮质部分。使用Dispopunch(一次性皮肤环钻)(Stiefel Laboratries)进行切除。确认切除完全后，缝合头皮，再次饲喂动物，允许自由饮水和进食。在制备脑损伤模型后的第1、2、4、7和14天，从两只大鼠制备5μm厚切片，方法类似于实施例2。制备石蜡切片，用H-E和抗小鼠MK抗体染色。制备脑损伤模型后第1天所得结果如图3所示；符号A、C和E代表H-E染色，符号B、D和F代表抗MK抗体染色。实验人员证实，MK非常迅速地对机械损伤作出反应。H-E染色的组织图象A、C和E表示，机械损伤对脑细胞造成巨大损害。抗MK抗体染色的组织图象B、D和F显示了很多抗体染色阳性的细胞，它们主要存在于痔面积附近和脑细胞高度损害的面积内，后者面积相当于A、C和E中的染色面积。这些结果清楚地证明，即使在神经细胞受到由局部缺血应激反应和机械应激反应导致的损伤的情况下，MK响应于损伤早期，在损伤面积附近被表达。
实施例4：MK在心肌梗塞模型内的表达
4.1：心肌梗塞模型的制备
按照Fine，G.等的方法(Fine，G.，Morales，A.和Scerpella，J.R.：《病理学文献》82：4-8，1966)，结扎左前下行冠状动脉(LAD)，在Wistar大鼠(7周龄，雄性)左心室壁上制备实验性心肌梗塞。结扎后六小时，处死大鼠，立即切除心脏进行分析。为了确认心肌细胞的活力(Fishbein，M.C.等：《美国心脏杂志》101：593-600，1981)，发明人用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，测量了心肌梗塞的面积和大小。
4.2：MK、抗MK抗体和抗bFGF抗体
按照Take，M.等的方法(Take，M.等：《生物化学杂志》116：1063-1068，1994)，制备MK和亲和纯化的兔抗小鼠MK抗体。亲和纯化的抗MK抗体的特异性几乎与Muramatsu等所述抗体相同(Muramatsu，H.等：《发展生物学》159：392-402，1993)。在蛋白质印迹分析中，该抗体与MK反应，但不与PTN反应。MAb52(Wako Pure Chemicals)用作小鼠抗人bFGF单克隆抗体。该抗体识别大鼠bFGF(Takami，K.等：《实验脑研究》90：1-10，1992)。
4.3：免疫组织化学分析
取大鼠心室区的水平截面，在心室温下固定在中性缓冲液-福尔马林固定液中，埋入石蜡中，切成5μm厚切片。脱石蜡后，将切片在含有0.3％过氧化氢溶液的100％甲醇中培养30分钟，以阻滞内源性过氧化酶。向切片中加入牛血清白蛋白(1％)，切片继续培养30分钟。为了检测MK，将这些切片与亲和纯化的兔抗MK多克隆抗体(8μg/ml)在4℃下培养过夜。将切片与生物素化的山羊抗兔IgG抗体(Vector LaboratoriesCorp.，California)培养30分钟，然后与生物素化的碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白复合体(Dako，Giostrup，Denmark)培养30分钟。为了检测bFGF，将切片与小鼠抗bFGF单克隆抗体(5μg/ml)在4℃下培养过夜，然后与生物素化的兔抗小鼠抗体(Vector Laboratories Corp.，California)培养30分钟，进一步与生物素化的碱性磷酸酶-链霉抗生物素蛋白复合体(Dako，Giostrup，Denmark)培养30分钟。用固红TR/萘酚(Sigma，St.Louis，MO)目测检验免疫反应。用苏木精进行复染色。MK免疫染色的特异性的测定方法是，使重组MK吸收抗MK抗体，对所得复合体进行肝素-琼脂糖亲和色谱(Yasuhara，O.等：《生物化学与生物物理学研究通讯》192：246-251，1993)。
结果如图4至13所示。
图4至7是表示左前下行冠状动脉闭塞后大鼠心脏内MK的可染色性增强的显微照片。图4和5代表正常的、免疫组织化学染色的大鼠心脏，其中MK在某些面对心室的心肌细胞内被表达。在其他隔膜的心肌细胞内检测到弱免疫反应。不过，大多数心肌细胞几乎不表达MK。图6是表示心肌梗塞形成后六小时的大鼠心脏的显微照片。在隔膜(SE)、右心室壁(RV)和左心室壁(LV)的心内膜内(箭状物所示面积)检测到强烈的MK染色。左心室壁与隔膜之间的免疫染色差异是非常明显的。染色区和非染色区被一条清楚的界限分开，该界限相当于向这些区域供应养分的各冠状动脉的分界区。LV的细胞死亡区内的心肌细胞没有被染色。梗塞部位心脏内所观察到的MK表达模式与同一心脏内bFGF的表达模式不同。图7是表示用中和抗MK抗体染色的对照物的显微照片。由于细胞在用中和抗MK抗体处理后没有被染色，确认MK被这种方法特异性地染色。图中所示的条在图4、6和7中代表1500μm，在图5中代表150μm。
图8至13是表示心肌梗塞形成后六小时的大鼠心脏内详细MK表达的显微照片。在右心室壁(图8)、隔膜(图9和11)、隔膜、梗塞面积的心室壁与左心室壁之间的界限区(图10)、左心室壁(图12)、和左心室内的心内膜(图13)内检测到了MK的免疫组织化学染色。在心肌细胞(图11和13中星号所示部分)和面对内皮细胞的心肌细胞或内皮细胞本身的半影(箭状物和箭头所示部分)内观察到了MK的免疫反应。在高倍放大的隔膜显微照片(图11)中，面对血管的心肌细胞或血管内皮细胞的半影内的MK被强烈地染色了。心肌细胞内部(图13)也被强烈地或适度地染色了(星号所示部分)。隔膜与LV之间的界限清楚地分开了非染色区和染色区(图10)。图中所示的条在图8、9和10中代表200μm，在图11、12和3中代表50μm。
实施例5：梗塞患者血清中MK的测量
利用JP-A平10-160735所述的EIA系统，发明人测定了心肌梗塞患者和脑梗塞患者血清中的MK浓度。将每份从患者收集来的血清样本以3000rpm离心15分钟(在室温下)。这些血清贮藏在-80℃下。图14表示定期测量心肌梗塞患者血清中的MK浓度的样本。在心肌梗塞形成后较早阶段，MK被表达。其在血液中的浓度升高并在形成后12小时达到峰值。24小时后降至形成后六小时的相同水平，31小时后降至约0.16ng/ml，这是正常受试者的平均水平。这种心肌梗塞形成后血液中MK浓度的变化大概是MK所独有的。这种心肌梗塞与MK之间、包括MK在早期梗塞半影内的表达之间的相互关系，说明MK参与了心肌的修复机理。图15表示脑梗塞患者血清中的MK浓度。在脑梗塞的情况下，也发现患者血液中的MK浓度非常高，患者的血样是在脑梗塞形成后早期收集来的，例如图15A、D、E和F。这些资料是研究的兴趣所在，事实是在个体水平上，脑梗塞形成后早期的梗塞面积附近检测到了大量MK。
工业实用性
根据本发明的midkine族蛋白质或其部分肽对治疗或预防由局部缺血导致的细胞病、或由所述细胞病引起的局部缺血性疾病是有效的。例如，这些蛋白质作为药物是有效的，用于治疗或预防脑血管疾患，例如蛛网膜下出血继发的脑血管痉挛、阿耳茨海默氏病、阿耳茨海默型老年性痴呆、脑血管老年性痴呆等，以及脑梗塞、瞬间性局部缺血性疾病和头外伤，和其他脑血管疾病，例如帕金森氏病、杭廷顿氏舞蹈病、肌萎缩性退化疾患等。而且，这些蛋白质预期作为药物，用于治疗或预防局部缺血性疾病，例如心肌梗塞或心绞痛；缺血性结肠炎；上部肠系膜动脉梗阻等。
另外，这些蛋白质预期能够用在基因疗法中，活化MK和PTN的基因启动子，以在缺血部位表达MK和PTN。

Claims (6)

1、一种药剂，用于治疗或预防由局部缺血或应激反应导致的细胞病，该药剂包含一种米达克因(MK)族蛋白质作为活性成分。
2、根据权利要求1的药剂，其中所述的由局部缺血或应激反应导致的细胞病发生在脑实质。
3、根据权利要求2的药剂，其中所述的脑实质是海马CA1区中的锥体细胞。
4、一种药剂，用于治疗或预防由细胞病导致的疾病，该细胞病是由局部缺血或应激反应引起的，该药剂包含一种米达克因(MK)族蛋白质作为活性成分。
5、根据权利要求4的药剂，其中所述的由局部缺血引起的疾病是脑梗塞。
6、根据权利要求4的药剂，其中所述的由局部缺血引起的疾病是心肌梗塞。
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