KR100554294B1 - 허혈성 질환의 예방 또는 치료제 - Google Patents

Abstract

미드카인 패밀리 단백질을 유효성분으로 하는, 허혈에 의한 세포장해를 치료 또는 예방하기 위한 약제 및 미드카인 패밀리 단백질을 유효성분으로 하는, 허혈성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제공한다. 본 발명으로 인해, 미드카인이 허혈성 질환의 치료 또는 예방에 유효하며, 또한 허혈에 의한 세포장해의 치료 또는 예방에 유효하여, 예를 들면 허혈성 뇌질환의 대표인 뇌경색 발병을 현저하게 방지하는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 치료·예방제는, 뇌허혈성 질환, 예를 들면 뇌경색, 일과성 뇌허혈질환, 두부 외상 이외에, 예를 들면 거미막하출혈 후의 뇌혈관 연축증, 알쯔하이머병, 알쯔하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증 등 및 다른 뇌혈관질환, 파킨슨병, 헌팅톤 무도병, 근위축 퇴행성 질환 등의 치료·예방제로서도 유효하다.

미드카인, 허혈성 질환, 세포장해, 뇌경색, 심근경색,

Description

허혈성 질환의 예방 또는 치료제 {Pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic diseases}

본발명은, 미드카인(midkine: 이하, 'MK'라 함)을 유효성분으로 하는 허혈성 질환의 치료 또는 예방제에 관한 것이다.

허혈(ischemia)이란, 몸의 일부에 있어 혈류가 완전히 차단되거나, 현저하게 감소한 상태로서, 산소부족, 기질공급의 감소, 대사산물의 축적이 동시에 진행되는 병태(病態)로 생각된다. 허혈의 정도는 혈관폐색의 완급, 지속시간, 또는 조직의 감수성, 부혈행로(collateral vessels)의 발달정도에도 관계되지만, 허혈이 발생한 장기 내지 조직에는 기능 장해가 나타나, 오래 지속되면 조직은 위축, 변성, 괴사에 달한다.

예를 들면, 허혈성 뇌혈관장해의 발병 메카니즘은 혈전성(thrombotic), 색전성(embolic), 혈행동태성(hemodynamic)의 3형태로 분류되지만, 어느 쪽이든 뇌의 허혈이 그 기본 병태이고, 뇌의 조직장해의 정도는, 허혈의 정도와 지속시간에 의해 규정된다. 이 때, 중증의 허혈이 생긴 장소는, 급속히 신경세포나 혈관내피세포가 불가역적인 장해를 입어, 전형적인 괴사에 의한 경색소(infarction nidi)가 형성된다. 한편, 허혈변연부(ischemic penumbra)에서는, 혈류는 중간정도로 저하하 고, 신경세포의 기능은 정지하고 있지만, 생존능력은 아직 잃지 않고 있어, 뇌혈관의 반응성이 일부 유지되고 있는 것에 의해, 측부혈행을 통한 혈류의 재개에 의해 기능회복을 기대할 수 있다.

또한, 관상동맥을 침범하여 심근에 허혈을 초래하는 질환군인 허혈성 심질환(isochemic cardiopathy)에서는, 관상동맥 폐색시간의 연장에 따라, 허혈 심근세포 장해의 정도는, 가역성 세포장해에서 불가역성 세포장해로 진행한다.

따라서, 이러한 허혈에 의한 세포상해를 예방하거나, 재생을 촉진하는 약제는 허혈성 뇌질환이나 심장질환의 근본적 치료로 이어진다고 생각된다.

이런 생각에 기인하여, 일과성 뇌허혈 후에 생기는 신경세포상해의 예방 및 치료에 유효한 약제를 탐색할 목적으로, 몽고쥐(Mongolian gerbils)의 불완전 전뇌 허혈 모델을 사용하여, 허혈 뇌보호인자의 후보물질을, 허혈처치 전후에 뇌실내로 주입, 또는 말초투여하여 그 효과를 형태학적 및 기능적으로 검토한 보고가 있다. 예를 들면, 프로사포신(prosaposin)을 몽고쥐 뇌실에 주입하면, 허혈 후의 학습행동장해가 유의적으로 경감되고, 해마 CA1 영역의 병리학적 검색에 있어서도 대조군과 비교하여 CA1 추체세포수의 뚜렷한 증가가 인정된다(Sand, A. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 994-1000, 1994). 모양체 신경영양인자(ciliary neurotropic factor; CNTF)나 인터로이킨 6(interleukin 6; IL-6)도 프로사포신과 마찬가지로, 뇌실내 주입에 의해 용량에 의존하여 유의적으로 해마의 CA1 추체세포수 및 CA1 영역 시냅스(synapse) 수를 개선하는 것이 분명해졌다(Wen, T-C et al. : Neurosci. Lett. 191 : 55-58, 1995) (Matsuda, S. et al: Neurosci. Lett. 204: 109-112, 1996). 염기성 섬유모세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)를, 프로사포신, CNTF 및 IL-6의 경우와 마찬가지로 뇌실내로 주입한 경우에는, 얼마 안 되긴 하지만, 유의적인 허혈 해마 보호효과가 인정된다(Wen,T-C. et al: Neuroscience, 65: 513-521, 1995). 하지만, 이들 허혈 뇌보호인자의 작용 메카니즘의 상세한 것은 아직 명백하지 않다.

본 발명은 미드카인(MK) 패밀리 단백질을 유효성분으로 하는, 허혈 또는 스트레스성 세포사에 기인하는 각종 질환을 치료 또는 예방하기 위한 새로운 약제를 제공한다.

보다 상세하게는, 본 발명은 (1) 미드카인(MK) 패밀리 단백질을 유효성분으로 하는 허혈 또는 스트레스에 의한 세포장해를 치료 또는 예방하기 위한 약제, (2) 허혈 또는 스트레스에 의한 세포장해가 뇌실질(brain parenchyma)의 장해인 (1)에 기재된 약제, (3) 뇌실질의 장해가 해마 CA1 추체세포(pyramidal cells) 장해인 (2)에 기재된 약제, (4) 미드카인(MK) 패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로 하는 허혈 또는 스트레스성 세포장해에 기인하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제, (5) 허혈성 질환이 뇌경색인 (4)에 기재된 약제, (6) 허혈성 질환이 심근경색인 (4)에 기재된 약제를 제공한다.

미드카인(midkine: MK)은, 배성(胚性) 종양세포의 레티노산에 의한 분화유도과정에서, 일과성으로 발현되는 유전자의 산물로서 발견되는, 염기성 아미노산과 시스테인에 풍부한 헤파린 결합성의 분비단백질이다(Kadomatsu, K. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 151: 1312-1318, 1988; Tomomura, M. et al.: J. Biol. Chem. 265: 10765-10770, 1990; Tomomura, M. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 171: 603, 1990). 그 후에 발견된 플레이오테로핀(pleioterophin: PTN)과는 45%의 상동성을 나타내고(Merenimies, J. & Rauvala, H.: J. Biol. Chem. 265: 16721-16724, 1990), MK 패밀리를 형성한다(Muramatsu,T.: Dev. Growth Differ., 36: 1-8, 1994).

MK의 기능에 대해서는, 지금까지 많은 데이타가 집적되어 있고, 앞으로도 새로운 중요한 기능이 발견될 가능성이 지극히 높다. MK의 주요한 기능으로서는, 다음 5개를 들 수 있다. 즉, 1) 신경영양인자 활성: 신경세포의 생존 및 돌기신장을 촉진시킨다(Muramatsu, H. et al.: Dev. Biol., 159: 392, 1993; Michikawa, M. et al.: J. Neurosci. Res.,35: 530, 1993; Kikuchi, S.: et al.:160, 1993), 2) 창상치유: MK는 백색광 연속조사에 의한 망막변성을 경감, 예방하고(Unoki, K. et al.: Opt halmol. vis. Sci., 35: 4063, 1994), 또한 쥐의 실험적 뇌경색 및 심근경색 후의 초기에, 경색소 주변부에 발현유도된다(Yoshida, Y. et al.: Dev. Brain Res ., 85: 25-30, 1995; Obama, H. et al.: Anticancer Reseach, 18: 145-152, 1998 ), 3) 개체발생(ontogenesis): MK는 태생 중기를 정점으로 하는 일과성 발현을 나타내고, 후기에는 거의 신장에 축적된다, 4) 선용계 항진(activation of fibrinolytic system): MK는 10ng/ml의 농도로 소(牛) 대동맥 유래의 혈관 내피세포의 플라스미노겐 활성제 활성을 3∼5배로 증대시킨다(Kojima, S. et al.: J. Biol. Chem., 270: 9590, 1995), 5) 암: 윌름즈종양(Wilms' tumor), 유방암, 폐암, 신경아종, 식도암, 위암, 대장암, 간암에서 MK의 고빈도 발현이 인정된다(Tsutsui, J. et al.: Cancer Res., 53: 1291, 1993; Garver R. I., et al.: Cancer, 74: 1584, 1994; Garver R. I., et al.: Am. J. Respir. Cell Mol Biol., 9: 463, 1993; Nakagawa, A. et al.: Cancer Res., 55: 1792, 1995; Aridome, K. et al.: Jpn. Cancer Res., 86: 655, 1995).

상기한 것처럼, MK는 쥐의 실험적 뇌경색 후의 초기에, 경색소 주변부로 발현유도되지만, 그 발현부위는 성상세포에 국한되어 발현하고 있는 것이 밝혀져 있다(Yoshida, Y. et al.: Dev. Brain Res., 85: 25-30, 1995). 한편, MK와 패밀리를 형성하는 PTN에서도, 쥐 일과성 전뇌 허혈 후 4일 째에 해마, 즉 CA1 영역을 중심으로 하여 PTN이 강하게 발현되고 있고, 그 대부분은 성상세포에 발현되고 있다(Takeda, A. et al.: Neuroscience, 68: 57-64, 1995). 종래, 허혈에 수반되는 성상세포의 활성화는, 세포보호적으로 작용하는 것으로 이해되고 있다. 이러한 것으로부터, MK 및 PTN은 허혈 발생 후의 중추신경계의 회복과정에서 일정한 역할을 담당하고 있는 것으로 생각된다.

본 발명자들은 인간 뇌경색 환자에 있어서도, 발병 후에 일과성의 MK가 발현하고 있는 것은 아닌가라고 상정하여, 건강한 보통사람 150명과 뇌경색 환자 36명의 혈청 중의 MK농도를 측정하였다. 그 결과, 건강한 보통사람의 혈청 중의 MK 농도의 평균치는 0.3ng/ml인데 비하여, 환자의 MK 농도의 평균치는 0.9ng/ml이었다. 그리고, 발병 직후의 검사체일수록, 또한 경색부위가 클수록 MK 농도는 높은 경향이 있었다. 이 현상은 허혈 영역주변에서 일과성으로 발현된 MK가 혈액 중을 순환 하고 있기 때문이 아닌가라고 생각된다.

최근, 외상·허혈 등의 신경손상에 있어서 여러 가지 신경영양인자의 발현·증가가 보고되어 있다(Frautschy, S A. et al.: Brain Res., 553: 291, 1991; Hay nes, L W.: Mol. Neurobiol., 2: 263, 1988). 이들 신경영양인자는, 신경손상 후의 회복 메카니즘에 관계하여, 직접적으로 또는 신경교세포 등을 통해 간접적으로 신경세포에 작용하여, 그 생존 ·회복에 있어 중요한 역활을 하고 있는 것으로 추측된다.

이러한 것으로부터, 본 발명자들은 MK가 다른 신경영양인자처럼 신경손상의 회복 메카니즘에 관련되어 있는지를, 뇌 허혈모델을 사용하여 그 평가를 시도했다. 그 하나로서, 허혈처치 전 또는 허혈처치 후의 몽고쥐의 뇌실내로 MK를 주입하여, MK에 의한 해마 CA1 신경세포의 탈락 억제 효과를 형태학적으로 조사했다. 몽고쥐에서는 내경동맥계(internal carotid artery system)와 추골동맥계(vertebral artery system)의 문합(anastomosis)이 생후 8주 이후 퇴축하기 때문에, 양측 총경동맥을 클립으로 3∼5분간 폐색하는 것에 의해, 고도의 불완전 전뇌 허혈을 용이하게 제작할 수 있고, 허혈 후의 재관류에 의해, 48시간~72시간에 걸쳐서, 특정한 부위(해마 CA1 영역)에 일정한 신경세포 변성(지발성 신경세포사)이 야기된다. 따라서, 몽고쥐 일과성 전뇌 허혈 모델은, 생체 내에서의 허혈 뇌보호인자의 평가계로서 유용하다(Kirino, T et al.: Brain, Res. 237: 57-69, 1982; Mitani, A. et al.: Neurosci. Lett. 131: 171-174, 1991).

허혈처치 전의 몽고쥐의 뇌실 내로 MK를 투여하여 MK의 허혈 뇌보호효과를 조사하였다. 몽고쥐의 뇌 브레그마(bregma)의 위치로부터 외측 2mm, 깊이 2mm의 구멍을 뚫어, 생리식염수에 용해한 MK를 미량 주사기로 0.063, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0㎍, PTN을 0.5, 1.0, 2.0㎍, 그리고, 비교를 위해 허혈 뇌보호효과를 갖는다는 bFGF 1.0, 2.0㎍을 각각 몽고쥐의 뇌실내로 주입했다. 4분 경과 후에 양측의 총경동맥을 결찰하고, 5분간 혈류를 차단하여 일과성의 전뇌 허혈을 제작했다. 그 후 혈류를 재개하고, 96시간 후 또는 7일 후에 뇌를 꺼내, 4% 파라포름알데히드로 관류고정(fix under perfusion)하였다. 이 파라핀 블록으로부터, 5㎛의 절편을 제작하고 헤마톡시린-에오신 염색하여 좌측 해마 CA1 신경세포의 해마영역 1mm당 생존 신경세포수를 세었다. 그 결과, 표 1 또는 표 2에 나타난 바와 같이, MK를 주입한 군은 대조군(생리식염수 주입군)에 대하여 0.5㎍ 이상으로, 또한 PTN을 주입한 군은 2.0㎍ 이상으로, 각각 해마 CA1 신경세포의 탈락을 유의적으로 억제하고 있는 것이 인정되었다.

bFGF의 경우는 대조군에 대하여 2.0㎍ 이상으로, 해마 CA1 신경세포의 탈락을 유의적으로 억제하고 있는 것이 인정되었다. 즉, MK 또는 PTN을 미리 뇌실내로 투여해 두면, 그 후의 허혈 및 수반되는 재관류에 기인하는 뇌세포 상해를 억제(예방)하는 것이 가능하다고 생각된다.

또한, 허혈처치 후의 몽고쥐의 뇌실내로 MK를 투여하여, MK의 허혈 뇌보호효과를 조사했다. 상기와 마찬가지 방법으로, 일과성 전뇌 허혈을 제작한 후, 혈류를 재개하여, 48시간 후에 상기와 마찬가지로, MK를 뇌실내로 주입하였다. 주입 후 7일째에 상기와 마찬가지로 5㎛의 절편을 제작하고, 헤마톡시린-에오신 염색하여 좌 측 해마 CA1 신경세포의 해마영역 1mm당 생존 신경세포수를 세었다. 그 결과, 해마 1mm당 약 160개의 생존 신경세포가 관찰되었다(실시예 1, 2). 이 생존 신경세포수는 허혈처치 직전에, MK를 0.5㎍ 투여한 경우와 거의 동수이다.

그런데, 기억 ·학습이라는 고차원적 정신기능은 인간에 있어서의 정신활동의 기초로 되어 있다는 것은 확실하다. 그러한 이유로, 기억 ·학습의 장해를 개선시킬 수 있는 약물의 개발은 신경과학의 가장 흥미 있는 과제의 하나로 되어 있다. 학습·기억 장해 모델은 종래부터 다수 알려져 있고 그 시험법도 대단히 다양하다. 그 중에서 수동회피시험(passive avoidance learning test)은 마우스에서 잘 사용되고 있다.

본 발명에서, 일과성 전뇌 허혈 처치 전 또는 그 후의 일정시간내에, MK 또는 PTN을 뇌실내로 투여한 경우, 해마 CA1 신경세포의 탈락이 대조군에 비해 유의적으로 억제되는 것이 분명해졌다. 한편, 해마 신경세포수와 스텝다운형(Step-dowm type) 수동회피 학습시험에서의 반응 지체 시간의 개선은, 매우 연관되어 있다는 보고(Araki, H. et al.: Physiol. Behav. 38: 89-94,1986; Sano, A. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 2 04: 994-1000, 1994; Wen, T.-C. et al.: Neuroscience, 65: 513-521; Wen, T.-C. et al.: Neurosci. Lett. 191: 55-58)가 있다. 따라서, 허혈부하의 전후에 MK 또는 PTN을 뇌실내로 주입하는 것에 의해 반응 지체 시간의 개선을 기대할 수 있다.

뇌허혈 및 그것에 수반되는 재관류에 기인하는 신경세포 상해에 대하여, 가장 취약성을 보이는 것이 해마 CA1 신경세포인 점을 고려하면, 허혈 전 또는 허혈 후에 MK 또는 PTN을 주입한 군에서 해마 CA1 신경세포의 탈락이 대조군에 비하여 유의적으로 억제되는 것, 그리고, 스텝다운형 수동회피 학습시험에서의 반응 지체 시간을 유의적으로 개선하는 것이 기대된다는 것으로부터, MK 또는 PTN이, 뇌허혈 및 그것에 수반되는 혈액 재관류에 기인하는 신경세포 상해에 대해, 그 예방이나 치료에 유용하고, 또한 약물의 최종 목적인 정신증상의 개선도 기대할 수 있다.

또한, 허혈에 의한 스트레스 뿐만 아니라 외상 등에 의한 스트레스로 인해, 신경세포가 손상을 받은 경우도, MK는 초기에 그 손상에 반응하여 그 손상을 받은 부분의 주변에 발현되는 것이, 실시예 3에 의해 분명해졌다.

따라서, MK 또는 PTN은 여러 가지 뇌신경 질환의 근본적인 병인(病因)인 허혈, 외상, 노화 또는 원인불명의 병인에 의한 전반적인, 또는 특정한 영역의 신경 세포의 기능저하, 변성, 세포사에 대하여 직접적으로 그것을 예방하거나, 재생을 촉진시키는 것에 의해 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, MK와는 작용 기작이 상이한 신경영양인자, 예를 들면 bFGF와 병용하는 것에 의해 허혈 또는 스트레스에 기인한 신경세포사에 대하여, 상승적 또는 부가적인 보호효과를 기대할 수 있다. 구체적인 질환으로서는 뇌경색, 일과성 뇌허혈, 거미막하출혈 후유증의 뇌혈관 연축에 의한 뇌장해(encephalopathy due to the cerebrovascular spasm such as sequela of subarachnoid hemorrhage), 치매증, 심장정지 후 소생시의 뇌장해 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명자들은 쥐의 좌전하행 관상동맥(left descending coronary artery)을 결찰하는 것에 의해 실험적 심근경색 모델을 제작하여, 심근세포에서의 MK의 발현을 면역조직화학적 염색으로 조사하였다(Obama, H., et al.: Anticancer Reseach, 18: 145-152, 1998). 그 결과, 정상 심장의 경우, 대부분의 심근세포에서는 MK의 발현이 인정되지 않았지만, 심실에 인접한 몇 군데의 심근세포에서 MK의 발현이 인정되었다(도 4 및 5). 한편, 심근경색 모델 심장의 경우, 우심실벽(RV), 중격 및 좌심실에 인접한 좌심실벽(LV)의 심장 내막 영역에서, MK의 강한 발현이 인정되었다(도 6). 세포사 영역에 상당하는 좌심실벽의 그 밖의 부분은 염색되지 않았다. MK 염색의 특이성은 항MK 항체에 의한 흡수조작을 행하면, MK가 염색되지 않는 것으로부터 확인된다(도 7). 즉, 본 발명자들에 의해 심근경색에 있어서, 저명한 MK의 발현이 면역조직화학에 의해 분명해졌다. 놀랍게도 MK의 염색활성의 저명한 증강은, 좌심실의 경색부에 인접하는 영역만이 아니라 RV 전체 및 중격의 대부분에서 인정된다(도 6).

염색영역과 비염색영역은 명확한 선으로 구분되어 있고, 그것은 관상동맥 영역간의 경계에 상당한다. 흥미롭게도 심근경색 모델에서의 MK의 발현 패턴은 동 모델에 있어서의 bFGF의 발현 패턴과는 다르다(도면에는 나타내지 않음).

경색모델에서의 MK의 발현을 더욱 더 상세하게 조사해보면, RV(도 8) 및 중격(도 9) 각각에 MK 염색의 출현이 인정된다(화살표 및 화살표 머리). 중격을 더욱 확대해보면, 모세관 또는 모세관의 내피세포에 인접한 심근세포의 변연영역이 강하게 염색되어 있는 것이 인정된다(도 10). 또한, 심근세포의 내부도 강하게 염색된다(별표). 염색영역이 비염색영역으로부터 명확하게 분리되어 있는 것이, 중격과 LV 사이의 경계에 의해 명백하다(도 10). 상기한 것처럼, MK 염색활성은 심장내막 근세포를 제외하고는, LV에서 불균일한 염색이 조금 인정될 뿐이다(도 12).

경색 모델 쥐와 정상 쥐의 RV 및 중격에서의 mRNA의 발현을 노던 블로팅 분석으로 비교하면, 전자(경색 모델 쥐)에 있어서 mRNA의 증가가 인정된다. 1.0kb MK mRNA 외에, MK cDNA와 반응하는 1.8kb의 밴드가 인정되지만, 이 밴드는 MK mRNA의 이소포름(isoform)일지도 모른다. 이 결과는, 경색 직후의 심장에서의 MK 면역반응 활성의 증가는 전사활성 또는 mRNA의 안정적 증가에 기인하는 것을 나타내고 있다.

쥐의 좌전관동맥(LAD)의 결찰에 의해서 생기는 심근경색에서는, MK 발현이 현저하게 증강되어 있는 것이 명백하다. 이 증강은 MK mRNA의 증가에 기인하고, 또한 6시간 이내의 초기에 발생한다. 경색심장에서는 MK가 넓은 범위에서 발현되고 있음에도 불구하고, 운명적으로 세포사 되는 영역에서는 MK의 발현이 인정되지 않는 것은 MK가 손상된 심장조직의 회복에 관여하고 있는 것을 시사하고 있다.

상기한 것처럼 뇌경색 직후, 괴사 주변의 부종영역에 MK가 발현하고 있는 것과 함께 생각하면, MK의 발현은 여러 가지 병적 상태에서의 회복 또는 치유의 과정에 관여하고 있을 가능성을 나타내는 것이다. 사실, MK를 미리 투여해 두면, 연속광조사에 노출됨으로써 발생되는 망막변성을 방지하는 것이 밝혀졌다(Unoki, K., et al.: Invest. Opthalmol. Vis Sci., 35: 4063-4068, 1994).

bFGF는 심근경색에 관련되어 발현하고, 심장보호작용(cardioprotective)이 있다는 것이 알려져 있다(Speir, E., et al.: Circ Res., 71: 215-259, 1992). 그러나, 본 발명자들은, 본 발명자들의 실험조건하에서는 MK가 bFGF보다도 더욱 더 많이 발현되는 것을 명확히 나타내 보일 수 있었다. MK와 bFGF는, 대동맥의 내피세 포에서, 플라스미노겐 활성제 활성을 공동으로 증강시키고(Kojima, S., et al.: J. Biol.Chem.,270:9590-9596,1995), 또한 치아 간엽세포(tooth mesenchymal cell)의 증식을 증강시키는 데다가(Mitssiadis TA., et al.: J. Cell Biol., 129: 267-281, 1995), MK와 bFGF는 손상을 받은 심장조직의 회복에도 공동으로 작용할 가능성이 있다고 생각된다.

또한, 본 발명자들은 정상인 심장에서도 MK가 심근세포에서 약하게, 그리고 심장내막에서 강하게 발현하고 있는 것을 발견하였다. 이 국소적인 MK의 발현은, bFGF의 발현과 유사하지만(Speir, E.,et al.:Circ Res.,71: 215-259, 1992), 경색 후의 발현의 증가 패턴은 서로 다르다. 정상인 심근세포에 있어서, bFGF는 DNA 합성을 자극하여, 생존을 촉진시키고, 노화를 늦추며, 이동을 조절하여 세포외 기질의 생산에 관여하고 있다고 생각된다(Speir, E., et al.: Circ Res., 7 1: 215-259, 1992). MK도 심장에 있어서 동일한 역활을 하고 있는 것인지도 모른다. 심근경색 후의 MK 발현의 증강은, 경색영역에 인접한 영역 뿐 아니라 심장으로부터 먼 부위에서도 관찰된다. 이 MK 발현의 증강은 심실 뿐만 아니라 심방벽에서도 관찰된다.

이러한 것으로부터, MK가 심장의 형성과 회복 양쪽에 중요한 작용을 하고 있는 것은 분명하고, MK 발현 또는 그 시그널 전달 시스템의 이상성은, 심장질환도 포함하여 여러 가지 질환에 관여하고 있을 가능성이 있다. 따라서, 관상동맥의 폐색, 또는 급격한 혈류의 감소에 의해 심근의 괴사를 초래하는 심근경색 등의 허혈성 심질환의 예방 ·치료약으로도, MK는 유용하다고 생각된다. 더욱이 허혈이나 스 트레스에 의한 세포장해에 기인하는 그 밖의 질환군, 예를 들면 소화관 영역에서의 혈행장해에 기인하는 허혈성 대장염 또는 장간막 동맥폐색증 등의 질환의 예방 ·치료약으로도, MK 또는 PTN은 유용하다고 생각된다.

본 발명의 허혈에 의한 세포장해를 기반으로 하는 질환의 치료·예방에 사용되는 MK 또는 PTN은 인간 재조합 MK 또는 PTN, 더 나아가서는 그러한 생물활성을 갖는 부분 펩티드가 바람직하다. 천연 MK의 경우, 글리코실화 되어 있지 않으나, 이러한 글리코실화 되지 않은 MK는 본 발명에 오히려 바람직하다고 생각된다. MK의 경우, 121 아미노산 잔기로 되는 인간 MK(Muramatsu, T.:Develop. Growth&Differ. 36:1-8,1994)가 대응되지만, 해당 아미노산 서열을 갖는 MK에 한정되지 않는다.

마우스 MK의 경우, 139개의 아미노산으로 된 전구체로부터 시그널 펩티드가 분리되어 성숙형 MK(아미노산 118개 분자량 13kDa)가 생긴다. 118개 중 30개를 염기성 아미노산, 10개를 시스테인이 차지한다. 이 시스테인이 만드는 5개의 S-S결합에 의해서 N말단과 C말단의 2개의 도메인이 형성된다. 이 2개의 도메인은, 서로 생화학적 특성과 생물학적 특성을 달리하고 있어, 생체 내에서의 기능발현에 있어서도 역할을 분담하고 있을 가능성이 있다. 헤파린 결합능은, N말단보다 C말단 쪽이 강하다(Muramatsu, H., et al.:Biochem. Biophys. Res. Comun., 203: 1131, 1994). 또한, 신경돌기 신장능, 선용계 항진능도 C말단이 그 대부분을 담당하고 있다(Muramatsu, H., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 203: 1131, 1994; Kojima, S., et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 206: 468, 199 5). 따라서, 이러한 MK 본래의 생물활성을 갖는 부분 폴리펩티드도 본 발명의 실시에 포함된다.

본 발명의 약제의 활성을 높이거나, 안전성을 향상시킬 목적으로, 인간 MK의 아미노산 서열에서 특정한 아미노산의 결실, 또는 다른 아미노산의 삽입, 또는 배열 중인 아미노산의 치환 등을 행하는 것은, 재조합 DNA 기술에 의해 용이하게 행할 수 있다. 예를 들면, 특정한 부위의 아미노산 잔기를 화학적으로 동등한 아미노산으로 치환하는 것이 가능하다. 예를 들면, 소수성 아미노산(Ala 등)을 다른 소수성 아미노산(Gly 등)으로 치환하는 것이 가능하지만, 또는 보다 소수성 아미노산 (Val, Leu 또는 Ile 등)으로 치환하는 것도 가능하다. 마찬가지로, 하나의 음성으로 대전(帶電)된 아미노산잔기를 다른 아미노산과 치환하는 것(Asp를 Glu에서 치환하는 등), 또는 하나의 양성으로 대전된 아미노산 잔기를 다른 아미노산과 치환(Lys를 Arg으로 치환하는 등)하는 것이 가능하다. 또한, MK의 C말단측의 절반, 예를 들면 60번 위치-121번 위치(C-half 60-121), 또는 C말단측으로부터 62번 위치-104번 위치(C-Half 62-104)(Muramatsu, H.: et al. :Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 1131-1139, 1994)는, MK의 신경돌기 신장능을 담당하고, 헤파린 결합부위도 이 부분에 존재하기 때문에 본 발명의 약제에 사용할 수 있을 거라고 예상된다. 또한, MK의 생물활성에 바람직하지 않은 영향이 인정되지 않는 경우, 소수성 아미노산의 대전된 아미노산으로의 변화는 바람직하다고 생각된다. 당업자라면, 바람직한 MK의 생물활성을 갖도록, 이들의 변형을 행할 수 있다. 또한 일반적으로, 단백질성 의약품은 단백질 분해효소의 공격이나 불필요한 수용체의 관여에 의해, 그 약효를 발휘할 수 없는 경우가 많아, MK나 PTN의 경우도 그 예외가 아닐 가능성이 있다. 따라서, MK나 PTN에 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 또는 덱스 트란 등을 결합시켜, 체내에서의 안정성을 향상시키는 것이 고려된다. 예를 들면 IL-6의 혈중 체류성의 향상을 목적으로서, PEG 혼성화 IL-6이 제작되어 성공하고 있다. 본 발명에는 이러한 화학변형된 MK나 PTN도 포함된다.

본 명세서에 기재된「미드카인」또는「MK」란, 본래의 생물활성을 갖는 한, 모든 이러한 변형 및 변화된 MK를 포함하고, 본 발명의「MK 패밀리」란, 본래의 생물활성을 갖는 한 모든 이러한 변형 및 변화된「MK 패밀리」에 속하는 단백질 (MK, PTN)을 포함한다.

본 발명의 MK 패밀리에 속하는 단백질을 유효성분으로서 의약조성물을 제조하여 뇌경색, 심근경색, 허혈성 대장염 또는 상부 장간막 동맥폐색증 등의 예방 또는 치료제로서 사용하는 경우, MK 그 자체를 직접 투여할 수도 있지만 유효성분으로서 MK를 함유하고 있으면, 공지의 제제학적 제조법에 의해, 제제화하여 투여할 수도 있다. 예를 들면, 약제로서 일반적으로 사용되는 적당한 담체 또는 매체, 예를 들면 멸균수나 생리식염수, 식물유(예, 참기름, 올리브유 등), 착색제, 유화제(예, 콜레스테롤), 현탁제(예, 아라비아 고무), 계면활성제(예, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유계 계면활성제), 용해보조제(예, 인산나트륨), 안정제(예, 당, 당알코올, 알부민) 또는 보존제(파라벤) 등과 적절하게 조합시켜, 생체에 효과적으로 투여하는 데 알맞은 주사제, 경비흡수제, 경피흡수제, 경구제 등의 의약용 제제, 바람직하게는 주사제로 조제할 수 있다. 예를 들면, 주사제의 제제로서는 동결건조품이나 주사용 액제, 삼투압 펌프에 밀봉된 형태 등으로 제공할 수 있다. 본 발명의 제제는 뇌의 실질이나 심근세포에 직접 작용하여 효과를 발휘하는 MK 또는 PTN을 함유하기 때문에, 지금까지 사용되어 온 뇌대사 자극제나 뇌순환 증진제 등의 대증요법제과 달리, 여러 가지 뇌신경질환의 근본적인 병인인 허혈, 외상, 노화 또는 원인불명의 병인에 의한 전반적인, 또는 특정한 영역의 신경세포의 기능저하, 변성, 괴사에 대해, 직접적으로 그것을 예방하거나 재생을 촉진시키는 것에 의해, 질환의 치료에 사용할 수 있다.

또한, MK 또는 PTN 유전자의 프로모터 영역을 사용하여, 허혈성 질환부위에서의 MK 또는 PTN 단백질의 발현, 증강을 꾀하는, 소위 유전자 치료의 가능성이 생각된다.

본 발명의 의약조성물은, 예를 들면 MK 또는 PTN 단백질로서 1일 약 0.001~100㎍/kg을, 1회~6회로 나눠 동맥내 주사, 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하주사, 뇌실내 주사, 척수내 주사 등의 방법에 의해서 투여할 수 있다. 또한, 뇌실내나 척수내로 카테테르를 설치하여, 이곳으로부터 직접 약물을 투여할 수도 있다. 또는, 삼투압 펌프 등에 밀봉하여 생체에 유치하는 것에 의해 연속적으로 투여할 수도 있다.

또한, 경동맥으로 만니톨이나 요소 등의 고장액을 주입하면 일과성으로 뇌혈액관문의 투과성이 상승하는 것(Proc.Natl.Acad. Sci. USA 76:481-485, 1979), 또한 알킬글리세롤 등의 물질에, 다른 약물의 뇌이행성을 촉진하는 작용이 있는 것 등이 보고되어 있어, 이러한 수법을 사용하여 투여할 수도 있다. 또한, 양이온화한 양이온 알부민은, 일정 기전으로 뇌 안으로 들어갈 가능성이 시사되고 있어(J. Cl in. Invest.70:289-295,1982), 이러한 수법을 사용하여 MK 또는 PTN 단백질을 화학 변형한 후 투여할 수도 있다.

도 1은, 드라이아이스 처치 2일 후의 뇌세포의 현미경 사진(×10)이다. A는 드라이아이스에 의해서 생긴 경색부와 그 주변의 세포를 헤마톡시린-에오신 염색 (H·E 염색)한 것이다. B는 손상의 정도가 강한 경색부를 나타낸 H·E 염색의 상이다. C는 B와 유사한 부분을 항MK 항체로 염색한 상이다.

도 2는, 드라이아이스 처치 2일 후의 뇌세포의 현미경 사진이다. D는 경색부주위의 항MK 항체 양성세포를 확대(×50)하여 본 것이다. E는 D와 같은 부분을 TUNEL법('Takara In situ Apoptosis Detection Kit'를 사용)으로 세포자멸사 염색된 사진이다. 핵의 단편화가 일어나 TUNEL 반응 양성의 세포자멸사를 일으킨 세포를 확인할 수 있다.

도 3은, 두부 외상 모델 쥐의 뇌세포 사진이다. A, C 및 E는 H·E 염색의 상이다. B, D 및 F는 A, C 및 E에 대응되는, 항MK 항체에 의해서 염색된 상이다. 현미경 배율은 A 및 B는 25배, C, D, E 및 F는 100배이다.

도 4는, 정상 심장에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경사진이다.

도 5는, 정상 심장에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경사진이다.

도 6은, 좌전방 하행 관상동맥 폐색 후의 쥐심장에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경 사진이다.

도 7은, 중화 항MK 항체로 처리한, 좌전방 하행 관상동맥 폐색 후의 쥐심장에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경 사진에 대한 대조군의 현미경 사진이다.

도 8은, 심근경색 형성 6시간 후의 쥐심장의 우심실벽에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경 사진이다.

도 9는, 심근경색 형성 6시간 후의 쥐심장의 중격에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경 사진이다.

도 10은, 심근경색 형성 6시간 후의 쥐심장의 중격과 경색부위를 갖는 심실벽, 좌심실벽사이의 경계영역에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경 사진이다.

도 11은, 심근경색 형성 6시간 후의 쥐심장의 중격에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경 사진이다.

도 12는, 심근경색 형성 6시간 후의 쥐심장 좌심실벽에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경 사진이다.

도 13은, 심근경색 형성 6시간 후의 쥐심장 좌심실 내의 심장내막에서의 MK의 분포를 나타내는 현미경 사진이다.

도 14는, 심근경색 환자의 혈청 중 MK량을 시간의 경과에 따라 측정한 결과를 정리한 그래프이다.

도 15는, 뇌경색 환자의 혈청 중 MK량을 측정한 결과를 그래프로 정리한 것이다.

실시예 1 : 일과성 전뇌 허혈 모델에서의 허혈뇌 보호물질의 평가

1.1 허혈 처치 전의 허혈뇌 보호물질 투여

1.1.1 MK의 허혈뇌 보호효과

재조합 인간 MK는 특개평 9-95454호 공보의 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 제작한 것을 본 실시예, 실시예 1.1.2 및 실시예 1.2에서 사용하였다. 1군 6∼16마리의 수컷 몽고쥐(생후 6∼8주, 체중 60∼80g)를 플루오탄 전용 마취약 송부장치 「HONEY MAT IC M-3」(기무라 의과기계(주))에 넣고, 흡입마취제 「플루오탄」(일본 약전 할로탄)을 용기내에 적절히 채워 마취를 실시하였다. 몽고쥐는 주입기 고정장치부착 수술대(NARISHIGE SCIENTIFIC INSTRUMENT LAB.; TYPE SR-5N, No.97024)에 고정하였다. 두부를 정가운데 절개한 후, 브레그마(bregma)의 위치에서 2mm 좌안구측으로 벗어난 곳에, 치과용 드릴을 사용하여 주사기가 들어갈 만한 적당한 구멍을 뚫었다. 이 구멍으로 MK 0.5mg/mL, 1mg/mL 또는 2mg/mL용액(생리식염수 용액)을, 미량 주사기(HAMILTON MICROLITER # 701)를 사용하여 1μL씩(0.5㎍, 1.0㎍, 2.0㎍)뇌실내로 주입하였다. 대조군으로서, 생리식염수(일본 약전 생리식염수: 오쯔카 생리 식염수 주사제, 오쯔카제약 주식회사)만을 주입한 군 및 겉보기 수술군(Sham operation group; Sham-op군)을 준비하였다. 뇌실내로 주입 후 4분간 방치하고, 그 후 수술부를 봉합하였다. 계속해서 흉부를 정가운데로 절개하여 좌우의 총경동맥을 노출시키고,「No.23 동맥 크레머 스트레이트」(No.23 artery Kremmer Straight)로 양측의 총경동맥을 결찰하여 혈류를 5분간 차단한 후, 혈류를 재개하였다. 허혈 부하중에는 뇌의 온도, 체온을 일정(37 ±0.2℃)하게 유지했다. 개체식별을 실시하여 마취가 풀린 후, 사육우리로 되돌려 보내 자유급수, 자유급식 하에서 사육을 계속하고, 96시간 후에 0.2%의 비율로 헤파린(노보 ·헤파린 주사제 100; 일본 호에체트 ·마리온 ·루셀 주식회사; Japan Hoechat Marion Russell, LTD.)을 포함하는 생리식염수와 4% 파라포름알데히드 용액으로 관류고정하였다. 단두된 두부로부터 뇌를 꺼냈다. 뇌는 4% 파라포름알데히드 고정액 중에 1일 방치한 후, 배측(背側) 해마를 포함하는 조직편을 탈수 ·침투 후, 파라핀으로 포매(embed)하였다.

이 파라핀 블록으로부터, 해마의 제일 앞부분에서 0.5∼1.0mm 또는 시상봉합의 후방 1.4∼1.9mm에 상당하는 두께 5㎛의 절편을 제작하여 헤마톡시린-에오신으로 염색(H·E 염색)하였다. 이 조직 표본에 대해서, 커브미터 편면형을 사용하여 해마 CA1의 길이를 5회 측정하여, 그 평균치를 산출하였다. 좌측 해마 추체세포(신경세포)의 해마영역의 세포수를 200배의 배율하에서 세어, 상기 평균치로 나누고 해마 CA1 1mm당 생존 신경세포수를 산출하였다. 그 결과를 표1에 나타내었다.

	투여량 (㎍)	동물수	CA1 신경세포수 (세포수/mm) ±S.E
sham-op군 생리식염수 투여군 MK 투여군 MK 투여군 MK 투여군	- - 0.5 1.0 2.0	4 6 4 5 4	237.5 ±34.59* 9.6 ±10.31 232.4 ±17.75* 221.6 ±11.04* 236.2 ±40.02*

* p < 0.05(듀넷(Dunnett) 형의 다중비교)

표 1로부터 명백한 것처럼, MK는 단일 투여 0.5㎍ 이상의 투여량으로, 해마 CA1 영역의 지발성 신경세포사를 현저히 방지하고 있다.

1.1.2 MK와 다른 허혈뇌 보호인자와의 허혈뇌 보호효과 비교

각 허혈뇌 보호인자 2μL씩을 뇌실내로 투여했다. 더욱이, 양측 총경동맥의 결찰에는 스기타 뇌동맥류 클립(standard type; MIZUHO)을 사용하여, 한 쪽에 2곳씩 결찰하였다. 뇌의 관류고정은 일주일 후에 행하였다. 이 세가지 점을 제외하고는, 1.1.1의 실시예와 동일한 방법으로 행하였다. 재조합 인간 플레이오트로핀 (pleiotrop hin:PTN) 및 재조합 인간 염기성 섬유모세포 성장인자(bFGF)는, R&D 시스템(Funakoshi)으로부터 구입하였다. 각각의 투여량은, PTN 2㎍, 1㎍, 0.5㎍, bFGF 2㎍, 1㎍이었다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

	투여량(㎍)	동물수	CA1 신경세포수 (세포수/㎜ ±S.E)
sham-op군 생리식염수 투여군 MK 투여군	- - 0.063 0.125 0.25 0.5 1.0 2.0	4 16 6 10 15 6 8 10	237.5 ±34.59 15.7 ±24.43 12.6 ±6.41 83.4 ±111.9 28.3 ±57.70 199.5 ±99.03* 208.5 ±80.18*** 219.4 ±73.87***
PTN 투여군	0.5 1.0 2.0	2 2 2	26.1 ±4.03 43.8 ±0.78 179.4 ±33.02*
bFGF 투여군	1.0 2.0	3 7	28.8 ±28.89 98.3 ±74.66*

* p < 0.05, *** p < 0.001 (듀넷(Dunnett) 형의 다중비교)

본 실시예에서도, MK가 통계적으로 유의성있게 허혈뇌 보호효과를 발휘하는 양은 상기 1.1.1의 실시예와 거의 일치하여, 0.5㎍ 이상으로 추정된다. 0.125㎍으로도 생리식염수 투여군보다 많은 신경세포의 생존이 인정되지만, 통계적으로는 유의적이지 않다. PTN의 경우, 유의적으로 허혈뇌 보호효과를 발휘하는 양은 거의 2㎍으로, MK와 비교하여 약 4배량을 필요로 한다. 또한, 허혈뇌 보호효과가 있다고 하는 bFGF(Nakata, N. et al.: Brain Res.,605: 354-356, 1993)의 경우, 유의적으로 허혈뇌 보호효과를 발휘하는 양은 2㎍이지만, 그 생존 신경세포수는 동량의 MK를 투여한 경우의 거의 반 이하이다. 이상으로부터, 허혈에 기인하는 뇌신경세포사를 억제하는 인자로서, MK는 기존의 프로사포신, 모양체 신경영양인자(CNTF), 또는 IL-6 등의 허혈뇌 보호인자에 의한 몽고쥐 일과성 전뇌 허혈 모델의 허혈뇌 보호효과와 비교하여, 손색이 없는 것이 밝혀졌다.

1.2 허혈처치 혈액 재관류 일정기간 후의 허혈뇌 보호물질 투여

허혈처치 혈액 재관류 48시간 후에, MK를 투여하는 것 이외에는, 1.1.2의 실시예와 완전히 동일한 방법으로 실시하였다. MK를 2㎍ 투여한 경우, 48시간 후의 생존 해마 CA1 신경세포는 해마 1mm당 160개였다. 이것은, 1.1.2의 실시예에서의 MK 0.5㎍을 투여한 경우의 생존수와 거의 동등했다. 즉, 일과성 뇌허혈 후 혈액이 재관류하고 일정시간 이내에, MK를 투여하더라도, 허혈뇌 보호작용 효과를 기대할 수 있다는 것이 이 실험으로 밝혀졌다.

이상으로부터, MK 패밀리 단백질은 기존의 단백질성 허혈뇌 보호인자와는 다른 작용 메카니즘으로 효과를 발휘할 가능성을 기대할 수 있다. 최근, 외상 ·허혈 등 신경손상에 있어서 여러 가지 신경영양인자의 발현 ·증가가 보고되고 있다. 이 들 신경영양인자는, 신경손상 후의 회복 메카니즘에 관계하여, 직접적으로 또는 신경교세포 등을 통해 간접적으로 신경 세포에 작용하여, 그 생존 ·회복에 중요한 역활을 하고 있다고 생각된다. 이러한 것으로부터, MK와 다른 신경영양인자를 조합시켜 사용함으로써, 상승적 효과 또는 부가적 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

실시예 2 : 드라이아이스 뇌손상(Cold Injury) 모델에서의 MK의 발현

수컷 Sprague-Dawley 쥐(SD쥐)(체중:160g) 10마리를 사용하였다. 4% 수화 클로랄(10mL/kg)을 쥐의 복강에 주사하여 마취했다. 가위로 두피를 절개하고 두개골 상부로부터, 7mm ×10mm(두께는 2mm 정도)로 자른 드라이아이스를 10초간 압박하였다. 그 후, 두피를 봉합하고 재차 자유급수, 자유급식 사육을 계속하였다. 드라이아이스 처치 후 1, 2, 4, 7 및 14일 째에, 각 2마리의 쥐에 대하여, 4% 수화 클로랄을 복강투여(10mL/kg)하여 마취한 후, 0.2% 헤파린(노보 ·헤파린 주사제 100; 일본 호에체트 ·마리온·루셀 주식회사)을 포함하는 생리식염수(일본 약전 생리식염수: 오쯔카 생리식염수 주사제, 오쯔카제약 주식회사)와 4% 파라포름알데히드 고정액으로 관류고정했다. 충분히 고정한 시점에서 단두하고, 가위를 사용하여 뇌를 꺼내어 4% 파라포름알데히드 고정액에 넣었다. 24시간 고정하여, 뇌가 충분히 굳은 상태에서, 양날 면도칼(FEATHER)을 사용하여, 뇌를 전방으로부터 4분할하였다. 이 중, 경색부를 관찰할 수 있는 조직편을 탈수·침투 후, 전자동 포매기로 파라핀 포매하였다. 이 파라핀 블록으로부터, 5㎛ 두께의 절편을 제작하였다. 이들 파라핀 절편에 대해서, 1) 헤마톡시린-에오신 염색(H·E 염색), 2) 항MK 항체(토끼 항마우 스 MK 다중 클론 항체)염색, 3) 세포자멸사 검출을 행하였다.

도 1에 드라이아이스 처치 2일 후의 뇌세포의 H·E 염색 및 항MK 항체에 의한 염색의 현미경 사진을 나타내었다(×10). A는 드라이아이스에 의해서 생긴 경색소와 그 주변의 세포를, B는 손상이 강한 경색소를, C는 B와 유사한 부분의 항MK 항체 염색을 각각 나타낸다. 도 1의 C(항MK 항체에 의한 염색)로부터, 경색부위의 주변에 MK의 강한 발현이 관찰된다.

또한, 도 2에 드라이아이스 처치 2일 후의 뇌세포의 항MK 항체에 의한 염색 및 세포자멸사 염색의 현미경 사진을 나타내었다. D는 경색부 주위의 항MK 항체 양성세포를 확대한(×50) 도면이다. E는 D와 동일한 경색부 주위의 세포가 세포자멸사를 일으키고 있는지 여부를 TUNEL법('TaKaRa In situ Apoptosis Detection Kit'을 사용)에 의해 검출한 현미경 사진을 나타낸다. 핵의 단편화가 일어나 TUNEL 반응 양성세포를 확인할 수 있다. 도 2에 나타낸 것처럼, 경색소의 H·E 염색의 염색성이 희미할수록, 세포는 강한 손상을 받고 있다.

실시예 3 : 쥐 뇌손상 모델에서의 MK의 발현

실시예 2에서는 허혈에 의한 뇌경색 모델에서의 MK의 발현을 조사했으나, 본 실시예에서는 기계적인 스트레스에 의한 경색 모델을 제작하여 MK의 발현을 조사하였다. 수컷 SD쥐(체중:320g) 10마리를 사용하였다. 쥐의 복강에 4% 수화 클로랄(10mL/kg)을 주사하여 마취하였다. 대뇌피질을 박리하여 뇌손상 모델을 제작했다. 가위로 두피를 절개하고 관상봉합에 따라 좌안(左眼)쪽으로 3mm, 또한 시상봉합에 따라 후두부측으로 3mm의 위치에서 지름 4mm, 깊이 3mm가 되도록 대뇌피질 을 박리했다. 박리에는 디스포펀치(일회용 피부 트레판)(Dispopunch; Stiefel Laboratries)를 사용하였다. 박리가 완전히 실행된 것을 확인한 후, 두부를 봉합하고 재차 자유급수, 자유급식으로 사육을 계속하였다. 뇌손상 모델 제작 후 1, 2, 4, 7, 14일 째의 각각의 날에, 각 2마리의 쥐로부터, 실시예 2와 동일하게 5㎛ 두께의 절편을 제작하였다. 이들 파라핀 절편에 대해서, H·E 염색 및 항마우스 MK 항체로 염색을 하였다. 뇌손상 모델 제작 후 1일 째의 결과를 도 3에 나타내었다. A, C 및 E는 H·E 염색을, B, D 및 F는 항MK 항체 염색을 나타낸다. 기계적인 손상에 대하여 MK는 대단히 매우 빠르게 반응하는 것이 확인되었다. A, C 및 E의 H·E 염색상으로부터 기계적인 손상에 대하여 뇌세포가 큰 손상을 받고 있는 것이 관찰된다. 이 뇌세포의 손상과 일치하여, B, D 및 F의 항MK 항체 염색상으로부터, 주로 출혈이 확인되는 주위와 뇌세포의 손상이 강한 부분에, 항체 염색 양성세포가 많이 관찰된다. 이들의 결과는, 허혈에 의한 스트레스 뿐만 아니라, 기계적인 스트레스에 의해 신경세포가 손상을 입는 경우에도, MK는 그 손상에 초기에 반응하여 그 손상을 받은 부분의 주위에 발현하기 시작하는 것이 밝혀졌다.

실시예 4 : 심근경색 모델에서의 MK의 발현

4.1 심근경색 모델의 제작

Fine,G. 등의 방법(Fine,G., Morales, A. and Scerpella, J.R:Arch. Path. 82 :4-8,1966)에 준하여, 위스터 쥐(생후 7주의 수컷)의 좌전방 하행 관상동맥(LAD)을 결찰하여, 좌심실벽에 실험적 쥐 심근경색을 형성시켰다. 결찰 6시간 후 쥐를 죽이자마자, 해석을 위해 심장을 꺼내었다. 심근세포의 생존을 확인(Fishbein, M.C. et al.:Am. Heart, J.101:593-600,1981)하기 위해서, 트리페닐 테트라졸리움 클로라이드(TTC)염색하여 심근경색의 영역과 크기를 측정했다.

4.2 MK, 항MK 항체 및 항bFGF 항체

MK 및 어피니티 정제 토끼 항마우스 MK 항체는, Take, M. 등의 방법 (Take, M. et al.:J.Biochem.116:1063-1068,1994)에 준하여 조제하였다. 어피니티 정제 항MK 항체의 특이성은 무라마쯔 등의 문헌의 항체(Muramatsu, H. et al.:Dev. Biol. 159: 392-402,1993)와 거의 같았다. 이 항체는, 웨스턴 블로팅 해석에서 MK와 반응했지만, PTN과는 반응하지 않았다. 마우스 항인간 bFGF 단일 클론 항체로서는, MAb52(와코우 순약제)를 사용하였다. 이 항체는 쥐의 bFGF를 인식한다(Takami, K. et al.:Ex p. Brain. Res.90:1-10,1992).

4.3 면역조직화학적 분석

쥐 심장의 심실영역의 수평 단면 절편을 꺼내어, 중성 완충액 포르말린 고정액 중에서 실온으로 고정한 후, 파라핀 포매하였다. 이어서, 5㎛ 두께의 절편을 조제하였다. 탈 파라핀 후, 0.3% 과산화수소수 함유 100% 메탄올 속에서 30분간 내인성 과산화효소를 블로킹하였다. 1% 소 혈청 알부민을 첨가하여 30분간 반응시켰다. MK를 검출하기 위해서, 이들 절편을 4℃에서 하룻밤 어피니티 정제 토끼 항MK 다중 클론 항체(8㎛/mL)와 배양하였다. 비오틴화 염소 항토끼 IgG 항체(Vector Laboratories Corp ., California)와 30분 배양한 후, 비오틴화 알카리성 포스파타아제-스트렙타비딘 복합체(biotinized alkaline phosphatase-Streptavidin complex; Dako, Giostrup, Denmark)와 30분간 배양시켰다. 또한, bFGF의 검출을 위 해, 절편을 4℃에서 하룻밤, 마우스 항bFGF 단일 클론 항체(5㎍/mL)와 반응시켰다. 다음에, 비오틴화 토끼 항마우스 항체(Vector Laboratories Corp ., California)와 30분간 배양한 후, 비오틴화 알카리성 포스파타아제-스트렙타비딘 복합체 (Dako, Giostrup, Denmark)와 30분간 배양시켰다. 면역반응은 Fast Red TR/Naphthol (Sigma, St. Louis, MO)에 의해 가시화하였다. 대비염색(counterstaining)은 헤마톡시린으로 행하였다. MK의 면역염색의 특이성을 결정하기 위해서, 항MK 항체를 재조합 MK로 흡수조작한 후, 헤파린 세파로스(heparin-Sepharose) 친화성 크로마토그래피하였다(Yasuhara, O. etal.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 192: 246-251, 1993).

그 결과를 도 4∼도 13에 나타내었다.

도 4∼도 7은 좌전방 하행 관상동맥 폐색 후의 쥐 심장에서의, MK 염색성의 증강을 나타내는 현미경 사진이다. 도 4 및 도 5는 정상 쥐의 심장을 면역조직화학적 염색한 것으로, 심실에 인접하고 있는 심근세포가 있는 것에서는, MK가 발현하고 있다. 또한, 심중격의 다른 심근세포에도 약하지만 MK의 면역반응이 인정된다. 그러나, 대부분의 심근세포는 MK를 거의 발현하고 있지 않다. 도 6은, 심근경색 형성 6시간 후의 쥐심장의 현미경 사진으로, 중격(SE), 우심실벽(RV) 및 좌심실벽(LV)의 심장내막(화살표로 표시한 영역)에서는, MK의 강한 염색이 인정된다. 좌심실벽과 중격과의 면역염색의 차이는 대단히 명백하다. 염색영역과 비염색영역은, 이들 영역에 영양을 공급하는 각각의 관동맥의 경계영역에 해당되고 하나의 명백한 경계에 의해서 나누어지고 있다. 또, LV의 세포사 영역의 심근세포는 염 색되어 있지 않다. 또한, 경색부위를 갖는 심장에서 관찰되는 MK의 발현 패턴은 동일한 심장에서의 bFGF의 발현 패턴과 달랐다. 도 7은 중화 항MK 항체에 의한 대조군 염색을 나타낸 현미경 사진으로, 중화 항MK 항체로 처리하면 염색이 일어나지 않는 것으로부터, 이 염색이 MK 특이적인 것임이 확인되었다. 도면에 표시된 막대는 도 4, 6 및 7에서는 1500㎛를 나타내고, 도 5에서는 150㎛를 나타낸다.

도 8∼도 13은 심근경색 형성 6시간 후의 쥐심장에서의 MK 발현에 있어서의 상세함을 나타내는 현미경 사진이다. 우심실벽(도 8), 중격(도 9, 도 11), 중격과 경색부위를 갖는 심실벽, 좌심실벽 사이의 경계영역(도 10), 좌심실벽(도 12) 및 좌심실내의 심장내막(도 13)에 MK의 면역조직화학적 염색이 인정되었다. MK의 면역반응은 심근세포(도 11 및 도 13 중 별표로 표시된 부분)와 내피세포에 인접한 심근세포의 변연영역 또는 내피세포 자신(화살표 및 화살표 머리로 표시된 부분)에서 관찰되었다. 중격을 고배율 사진으로 보면(도 11), 혈관에 인접한 심근세포의 변연부 또는 혈관내피세포에서 MK의 강한 염색이 인정된다. 심근세포의 내측(도 13)도 강하게 또는 중간정도로 염색되어 있다(별표로 표시된 부분). 또, 중격과 LV 사이의 경계에서, 비염색영역과 염색영역은 확실하게 식별된다(도 10). 도면에 표시된 막대는 도 8, 9 및 10에서는 200㎛를 나타내고, 도 11, 12 및 13에서는 50㎛를 나타낸다.

실시예 5 : 경색환자 혈청 중의 MK의 측정

특개평 10-160735호 공보에 기재된 EIA 시스템을 사용하여, 심근경색 및 뇌경색환자의 혈청 중의 MK량을 측정하였다. 각 혈청은, 환자로부터 채혈 후 3000rpm, 15분간(실온)의 원심조작에 의해 얻어진 혈청을 사용했다. 혈청은 -80℃에서 저장했다. 도 14는 심근경색 환자의 혈청을 경시적으로 측정한 경우의 일례이다. 심근경색발병 후, MK는 비교적 초기에 발현하고, 그 혈중 농도는 증가하여, 발병 후 12시간 후 절정에 달하고 있다. 그리고, 24시간 후에는 발병 6시간 후와 동일한 수준까지 저하되고, 31시간 후에는 건강한 보통사람의 평균치인 약 0.16ng/mL까지 저하해 있다. 심근경색 후의 혈중 MK의 양적 변화는 MK에 독특한 것으로 생각되고, 심근경색과 MK의 관련은 경색 주변부위에서의 초기의 MK 발현과의 관련도 포함하여, 심근의 회복 메카니즘에 MK가 관여하고 있음을 시사한다. 도 15는 뇌경색 환자의 혈청 중의 MK량을 측정한 것이다. 뇌경색 환자의 경우도, 환자 A, D, E 및 F와 같이 비교적 경색 발병 후 초기에 채혈되었다고 생각되는 환자에서는, 혈중의 MK농도가 대단히 높은 값을 나타내었다. 이것은, 뇌경색 발병 초기에 그 주변에 다량의 MK가 관찰되는 사실을, 개체수준에서 고찰하는 면에서 볼 때, 흥미있는 데이타라고 생각된다.

본 발명의 미드카인 패밀리 단백질 또는 그 부분 펩티드는, 허혈에 의한 세포장해 또는 그 세포장해를 기반으로 하는 허혈성 질환의 치료 또는 예방에 유효하다. 예를 들면 뇌경색, 일과성 뇌허혈 질환, 두부외상 뿐만 아니라, 거미막하출혈후의 뇌혈관 연축증, 알쯔하이머병, 알쯔하이머형 치매증, 뇌혈관성 치매증 등과 같은 뇌혈관 장해, 파킨슨병, 헌팅톤 무도병, 근위축 퇴행성 질환 등과 같은 다른 뇌혈관 질환의 치료 ·예방제로서도 유효하다. 더욱이, 허혈성 심질환인 심근경색, 노작성 협심증(angina of effort) 또는 허혈성 대장염, 상부 장간막 동맥폐색증 등의 치료·예방제로서 기대할 수 있다.

또한, 허혈부위에서 MK나 PTN의 유전자 프로모터를 활성화하여 MK나 PTN의 단백질을 발현시키는 소위 유전자 치료의 가능성도 기대할 수 있다.

Claims (6)

1. 미드카인 (MK) 패밀리 단백질을 유효성분으로 하는, 허혈성 뇌질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제.
2. 제1항에 있어서, 허혈성 뇌질환이 뇌실질 장해에 기인하는 약제.
3. 제2항에 있어서, 뇌실질 장해가 해마 CA1 추체세포 장해인 약제.
4. 미드카인(MK) 패밀리 단백질을 유효성분으로 하는, 허혈 또는 스트레스성 세포장해에 기인하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제.
5. 제4항에 있어서, 허혈성 질환이 뇌경색인 약제.
6. 제4항에 있어서, 허혈성 질환이 심근경색인 약제.

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