JPH09124506A - 組織因子凝固系インヒビター含有動脈硬化治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰＩ）を
有効成分として含有する動脈硬化治療剤。 【効果】 本発明のＴＦＰＩ含有動脈硬化治療剤によ
り、血管平滑筋細胞の増殖及び／または遊走により惹起
される動脈硬化を効果的に治療することができる。さら
に、本発明のＴＦＰＩ含有製剤は、経皮経管的血管形成
術や他の血管拡張術後の再発性狭窄症を防止するための
極めて有効な治療剤である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、平滑筋細胞の増殖並び
に遊走を効果的に抑制しうる、組織因子凝固系インヒビ
ター（Tissue Factor Pathway Inhibitor；ＴＦＰＩ）
を有効成分として含有する動脈硬化治療剤に関するもの
である。特に、経皮経管的血管形成術や他の血管拡張術
（アテローム切除術等）後の再発性狭窄症を防止するＴ
ＦＰＩ含有製剤に関するものである。

【０００２】

【発明の背景及び従来技術】動脈硬化は動脈壁の肥厚、
改築、硬化、機能低下を示す局在性の動脈病変の総称で
あるが、病理学的には、細小動脈硬化、中膜石灰化、粥
状動脈硬化の３つに大別される。その中で、粥状動脈硬
化が虚血性心疾患や脳卒中、脳梗塞の原因となることか
ら、臨床的上最も重要な問題となっている。この粥状動
脈硬化は大動脈、冠状動脈などの大、中型弾性型および
筋性動脈に好発し、最終的に臓器、組織障害を引き起こ
し、その結果心筋梗塞、脳梗塞などを誘発する。この病
変による基本的変化は、血管内膜を病変部とした血管
平滑筋細胞やマクロファージの増殖、細胞間基質の増
加、細胞内、細胞外へのリン脂質、コレステロールエ
ステルを主とする脂質の沈着である。一般に、高脂血
症、高血圧、加齢、喫煙等が動脈硬化の主要な危険因子
と考えられている。

【０００３】動脈硬化の治療に関しては、危険因子の治
療薬として抗高脂血症剤、抗圧剤がその進展抑制のため
に用いられており、また、その発症原因を抑える治療薬
として抗酸化剤、抗血小板剤、血管拡張剤、抗凝固剤等
が用いられているが、現在までのところ、それらの治療
効果は臨床的に十分なものではない。

【０００４】さらに、動脈硬化によって引き起こされる
狭心症や心筋梗塞等の虚血性心疾患の初期的な血管拡張
の治療法として、経皮経管的血管形成術や粥腫切除術
（アテレクトミー）、レーザー切除術法が臨床的に試み
られている。特に、経皮経管的冠動脈形成術（Percutan
eous Transluminal Coronary Angioplasty, ＰＴＣＡ）
は血流確保を目的として広く用いられている。ＰＴＣＡ
は冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）よりも簡便であり、繰
り返して行うことが容易で、高齢者でも術後の合併症が
少ないことなどから狭心症に対する根治的治療法として
急速に普及し、昨今では狭心症の治療法の１つとして定
着している［Landau, C., N. Engl. J.Med.,330,p981(1
994)］。

【０００５】しかし、これらのＰＴＣＡやアテレクトミ
ー等の血管拡張術の方法には手技の改善、器具の改良、
新たな手法の開発が行われてきたにも拘わらず、依然と
して重要な問題が未解決のまま残されている。その問題
とは、術後３〜５カ月で25〜49％の患者に見られる再発
性狭窄症の問題である。この再発性狭窄症はＰＴＣＡや
ＣＡＢＧ等の再治療を必要とすることから、患者生活へ
の負担、保険財政の圧迫を考慮すると非常に深刻な問題
である。

【０００６】再発性狭窄症の発症機序については検討段
階ではあるが、近年の研究から多くの事実が解明されつ
つある。現在までに、再発性狭窄症の主な要因として、
elastic recoil、血栓形成、平滑筋細胞の増殖に
よる内膜肥厚、血管remodelingが考えられているが、
本質的には血管壁傷害に対する平滑筋細胞を中心とした
過剰修復反応と考えられている。つまり、再発性狭窄症
はバルーンにより物理的に破壊された血管壁構造を修復
する血管平滑筋細胞の治癒反応に歯止めがかからず、い
わゆる過形成の状態であると推定されている。

【０００７】そして、現在までにこの予防には発生のそ
れぞれの過程に対して有効と考えられる薬剤がいろいろ
と試みられてきた。血栓形成を抑制する観点からヘパリ
ン、ワーファリン、抗血小板剤が用いられ、平滑筋細胞
の増殖を抑制する観点から増殖抑制剤、さらに脂質低下
の観点から脂質低下剤も用いられてきた。さらに、最近
では薬剤や遺伝子を再発性狭窄部位の平滑筋細胞に特異
的に直接導入することによって、再発性狭窄症を治療し
ようとする試みがなされたが、十分な効果をあげること
はできなかった［Gimple, L.W. et al., Circulatio
n, 86, p1536(1992)，Leclerc, G. et al., J. Clin.
Invest., 90, p936(1992)］。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、経皮
経管的血管形成術や他の血管拡張術、例えばアテレクト
ミー後の再発性狭窄症を防止するために、様々な治療法
が試みられているが、ほとんどの薬剤が動物実験や少数
の患者例で有効性が示されても、実際の多様な臨床症例
では統計学的有意性が示されず、未だ有効な薬剤は見い
だされていない。そこで、本発明の課題は、動脈硬化
症、特に経皮経管的血管形成術や他の血管拡張術後の再
発性狭窄症を効果的に防止しうる薬剤を提供することで
ある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】このような状況におい
て、本発明者らは鋭意研究した結果、ＴＦＰＩが血管平
滑筋細胞の増殖や遊走等を効果的に抑制することを見い
だし、この発見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ＴＦＰＩを有効成分として含有す
る動脈硬化治療剤を提供するものである。また、本発明
は、経皮経管的血管形成術や他の血管拡張術の術中、術
後のいずれかに有効量のＴＦＰＩを投与することによ
り、術後の再発性狭窄症を効果的に防止するものであ
る。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】本発明者らは、経皮経管的血管形成術や他
の血管拡張術後の再発性狭窄症を顕著に防止する薬剤を
見いだすために、バルーン傷害により作製した血管内膜
肥厚モデル動物と培養平滑筋細胞を用いて、再発性狭窄
症を促進させる重要な因子とその阻害因子の検索を行っ
た。その結果、バルーン傷害により作製されたモデル動
物の血管内膜肥厚部位中の平滑筋細胞に組織因子（Tiss
ue Factor：ＴＦ）の異常発現を見いだした。ＴＦは活
性型第VII因子（VIIa）と複合体を形成して第Ｘ因子及
び第IX因子を活性化させる血液凝固の実質的開始因子と
して知られており［Davie,E.V. et al., Biochem., 30,
p10363(1991)］、さまざまな病態の凝固亢進状態との
関与も示唆されているものである。さらに本発明者ら
は、このＴＦが血管中膜内の平滑筋細胞に直接作用し
て、平滑筋細胞を血管内膜に遊走させることにより内膜
肥厚をも促進させることを初めて見いだした。よって、
血管内膜肥厚部位に存在するＴＦが、経皮経管的血管形
成術や他の血管拡張術後に血管中膜の平滑筋細胞に作用
して血管内膜へ遊走させることで、再発性狭窄症の発症
へ深く関与することが明らかとなった。

【００１１】上記の知見に基づき、ＴＦの遊走活性に対
する阻害因子の検索を行った結果、培養平滑筋細胞での
検討により、ＴＦＰＩがＴＦの平滑筋細胞遊走活性を阻
害することを見いだした。さらにＴＦＰＩには、平滑筋
細胞の細胞増殖やＤＮＡ合成量の分析から、平滑筋細胞
の増殖を抑制する全く新規な作用があることも見いだし
た。よって、ＴＦＰＩが単にＴＦ活性を抑制して血栓形
成を阻害するだけでなく、直接平滑筋細胞の重要な生物
学的反応（遊走、増殖）を阻害する多面的な効果を有す
ることから、ＴＦＰＩは経皮経管的血管形成術や他の血
管拡張術後の再発性狭窄症を予防する極めて有効な新規
薬剤になりうることが明らかとなった。

【００１２】ＴＦＰＩは分子量42,000の糖蛋白質で、活
性型第Ｘ因子を介してＴＦ−活性型第VII因子に結合し
てその凝固活性を抑制すると考えられているクニッツ型
プロテアーゼインヒビターである［Broze,G.J., Proc.N
atl.Acad.Sci., 84, p1886(1987)］。蛋白構造的には主
にクニッツ１、クニッツ２、クニッツ３の３つの領域か
ら構成されており、クニッツ１が活性型第VII因子との
結合部位、クニッツ２が活性型第Ｘ因子との結合部位で
あることが明らかとなっている［Girard, T.J.et al.,
Nature, 338, p518(1989)］。

【００１３】本発明において使用されるＴＦＰＩはヒ
ト、その他の哺乳動物の血液から得られるＴＦＰＩ及び
遺伝子組換え技術によって製造されるヒト、その他の哺
乳動物由来のＴＦＰＩを含むものをいう。なお、本発明
の目的とする再発性狭窄症の予防剤としての効果を得ら
れる限り、血液由来及び遺伝子組換え技術によって製造
されるＴＦＰＩと生理学的に同等の活性を有するＴＦＰ
Ｉの全アミノ酸配列の一部が欠損、置換、挿入、追加等
の誘導体も本発明に含まれる。本発明におけるＴＦＰＩ
の製造方法は特に限定されないが、ヒト血液より分離さ
れるもの、あるいは遺伝子組換え技術によって製造され
るものが含まれる。特に、血液由来のＴＦＰＩについて
は血液中の含量が非常に少なく（約100ng/ml)、殆どの
ＴＦＰＩがリポ蛋白質と結合していることから、比活性
の高い遊離型のＴＦＰＩを大量に製造することは非常に
困難である。よって、遺伝子組換え技術によって組換え
型ＴＦＰＩ（rＴＦＰＩ）を調製することが好ましいと
考えられる。

【００１４】そのrＴＦＰＩの製法としては、特願平5-1
88746号（亀井ら）や円城寺の報告［Biochem.,34,p5725
(1995)］に記載された以下の方法がある。例えば、ヒト
ＴＦＰＩのｃＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞の培養上清か
ら、抗ＴＦＰＩ抗体（好ましくはモノクローナル抗体）
を結合させたゲルによるアフィニティークロマトグラフ
ィーを行った後、ヘパリンゲル（Pharmacia-LKB）によ
るアフィニティークロマトグラフィーで精製する方法で
ある。

【００１５】また、血液から調製する方法としては、
Novotnyらの方法［J.Biol.Chem., 264, p18832(1989)］
らの報告に従って、Phenyl-Sepharose（Pharmacia-LK
B）、Q-Sepharose（Pharmacia-LKB）と活性型第Ｘ因子
によるアフィニティークロマトグラフィーを併用して調
製する方法、抗ＴＦＰＩ抗体ゲルによるアフィニティ
ークロマトグラフィーとヘパリンゲルによるアフィニテ
ィークロマトグラフィーを併用する方法がある。

【００１６】上述の方法でＴＦＰＩの活性を最大限に維
持するためには、本発明のＴＦＰＩが新鮮であるか、凍
結保存しておく方が好ましい。あるいは、有効成分とし
てのＴＦＰＩを公知の適当な賦形剤（人血清アルブミ
ン、マンニトール等）と組み合わせて、好適な安定化剤
と共に凍結乾燥して保存することが望ましい。

【００１７】本発明のＴＦＰＩ製剤の投与形態は、Ｔ
ＦＰＩ溶液をドラッグデリバリーカテーテル等を介し
て、血管患部へ直接投与する方法、ＴＦＰＩ溶液をス
テントやバルーン等の表面へ塗布して血管患部へ投与す
る方法、ボーラスもしくは連続的に静脈及び動脈内へ
投与する方法がある。ＴＦＰＩが肝臓に取り込まれて代
謝されやすい性質［Kamikubo.Y. et al., Thromb.Haemo
stasis., 73, p1261(1995)］と患部での濃度を高めてＴ
ＦＰＩの効果を増強させることを考えると、経皮経管的
血管形成術や他の血管拡張術施行時に前記もしくは
の方法により、少量の、しかし抑制有効量を血管患部へ
局所投与する方が好ましい。また、投与したＴＦＰＩの
有効性を考慮するならば、ＴＦＰＩをコードする遺伝子
を直接患部の平滑筋細胞に導入する遺伝子治療で、ＴＦ
ＰＩを過剰発現させる方法も再発性狭窄症の予防法とし
て有効である。具体的な投与量、投与回数および投与時
は患者の病態に依存して変化するが、局所投与を行う場
合、概ね血管形成術施行中および施行直後に、血中濃度
が１μg/mlから50μg/mlの濃度範囲になるように投与す
ることが好ましい。以下、本発明の理解を深めるために
実施例にそって説明するが、本発明はこれらの実施例に
必ずしも限定されるものではない。

【００１８】

【実施例】

《参考例１．ＴＦの調製》本実施例で使用する全長型の
ＴＦ（全長型ＴＦ）及びリン脂質結合型ＴＦ（再リン脂
質化ＴＦ）はAmerican diagnostica社より購入した。全
長型ＴＦの細胞外領域に相当するペプチド（細胞外Ｔ
Ｆ）は水口ら（特開平5-219957号）の方法に従って、大
腸菌を用いて作製した。

【００１９】《参考例２．ＴＦＰＩの調製》本実施例で
使用するＴＦＰＩは亀井ら（特願平5-188746号）や円城
寺の報告［Biochem.,34,p5725(1995)］に記載した方法
に従い、ヒトＴＦＰＩのｃＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞
の培養上清から、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体（HTFP
I-K9(微工研菌寄14467号)）を結合させたゲルとヘパリ
ンゲル（Pharmacia-LKB）によるアフィニティークロマ
トグラフィーを行って精製した。なお、この方法で得ら
れたＴＦＰＩはアミノ酸配列分析やSDS-PAGE等の分析よ
り、分解を受けていない比活性の高い全長型のＴＦＰＩ
であった。

【００２０】《実施例１．内膜肥厚血管中のＴＦ発現の
分布検討》ウサギで作製した内膜肥厚モデルを用いて狭
窄部位中のＴＦ発現状況を調べた。内膜肥厚モデル動物
は、ウサギの胸部大動脈の内皮細胞を1300mmHgの圧力で
拡張したバルーンにより剥離して作製した。そして、病
理切片として傷害後４週間目に解剖して内膜肥厚患部を
採取した。内膜肥厚部位のＴＦ発現は抗ＴＦポリクロー
ナル抗体を用いた免疫組織染色法により解析した。

【００２１】(1) 抗ＴＦポリクローナル抗体の調製 ＴＦに対するポリクローナル抗体を調製するために、常
法に従いフロイントの完全アジュバンド（Difco社）と
混合した細胞外ＴＦを２〜３週間の間隔でモルモットに
皮下投与して、抗血清を調製した。抗ＴＦ免疫グロブリ
ンは抗血清からプロテインＡゲル（Pharmacia-LKB）に
より精製した。さらに、免疫グロブリン画分から特異抗
体を調製するために、細胞外ＴＦを結合させたゲルによ
るアフィニティークロマトグラフィーを行った。

【００２２】(2) 免疫染色法によるＴＦ発現の分析 採取した胸部大動脈をパラホルムアルデヒドとグルタル
アルデヒドの混合液で固定した後、パラフィン包埋後切
片化して病理標本を調製した。血管標本中のＴＦは抗Ｔ
Ｆ抗体を反応させた後、パーオキシダーゼ法により検出
した。その結果、血管内膜肥厚部の平滑筋細胞にＴＦの
顕著な発現が確認された。なお、血管中膜の平滑筋細胞
での発現は殆ど見られなかった。

【００２３】(3) 内膜肥厚部の再傷害 上記のモデル動物の内膜肥厚部を再度同様なバルーン傷
害を起こすと、明らかなフィブリン血栓が確認された。

【００２４】《実施例２：ＴＦによる平滑筋細胞遊走促
進作用》 (1) 平滑筋細胞の培養法 遊走の実験に用いる平滑筋細胞はウサギ胸部大動脈中膜
より外植片法（explant法）により採取し、10％牛胎児
血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（日水製薬）で
継代培養し、４〜７継代目で実験に供した。

【００２５】(2) 遊走活性の評価法 遊走活性は、ボイデンチャンバーの上層部に播種した平
滑筋細胞（細胞数：10万）を下層部の各遊走因子と２％
ウシ血清アルブミンを含む無血清培地と６時間反応させ
た後、下層部のチャンバー方向に移動した細胞数を顕微
鏡下に計測する事で評価した。

【００２６】(3) 平滑筋細胞の遊走へのＴＦの影響 平滑筋細胞の遊走へのＴＦの影響を調べるために、再
リン脂質化ＴＦ、全長型ＴＦ、細胞外ＴＦの３種の
ＴＦを用いて行った。なお、陽性対照として、遊走活性
のあることが知られている血小板由来増殖因子（PDGF-B
B）と塩基性線維芽細胞増殖因子（basic FGF）を用い
た。その結果、図１に示したように、３種のＴＦを10ng
/mlの濃度で培地に添加した結果、どのＴＦもPDGF-BBや
basic FGFと同等以上の遊走促進活性をもつことが明ら
かとなった。また、この作用はコントロール群に対する
統計学的解析（スチューデントｔ検定）結果から、危険
率が１％以下、もしくは0.5%以下で有意であることが確
認された。さらに、このＴＦによる遊走促進作用が方向
性を持たずに無秩序に動き回る運動（化学運動性）、も
しくは走化性因子の影響を受けて方向性をもって移動す
る運動（走化性）のどちらを促進させているかを調べる
目的で、チェッカーボード分析を行った。その結果、こ
のＴＦの作用は平滑筋細胞の走化性を促進させる作用で
あることが明らかとなった。以上の結果から、血管内膜
肥厚部位に存在するＴＦが経皮経管的血管形成術や他の
血管拡張術後にフィブリン血栓を形成させるだけでな
く、血管中膜の平滑筋細胞に直接作用して血管内膜へ遊
走させることで、再発性狭窄症の発症へ深く関与すると
考えられた。

【００２７】《実施例３．ＴＦの平滑筋細胞遊走促進作
用に対するＴＦＰＩの抑制作用》 (1) 平滑筋細胞の培養法と遊走活性の評価法 ウサギ胸部大動脈中膜よりexplant法で調製した平滑筋
細胞の培養及び遊走活性の評価は実施例２と同様な方法
で行った。

【００２８】(2) ＴＦの遊走活性へのＴＦＰＩの影響 ＴＦの遊走活性へのＴＦＰＩの影響を調べるために、ボ
イデンチャンバーの上層部に播種した平滑筋細胞を下層
部の全長型ＴＦ（10ng/ml）とＴＦＰＩを含む無血清培
地と６時間反応させた後、下層部のチャンバー方向に移
動した細胞数を顕微鏡下に計測した。その結果、図２に
示したように、ＴＦＰＩは全長型ＴＦの遊走促進活性を
濃度依存的に抑制することが明らかとなった。この作用
はＴＦ添加群に対する統計学的解析（スチューデントｔ
検定）結果から、危険率が５％以下で有意であることが
確認された。

【００２９】以上の結果から、細胞外に遊離したＴＦは
新たな機能として平滑筋細胞に対する強力な遊走活性を
もち、さらにその作用はＴＦＰＩにより抑制されること
が明らかとなった。この現象は、生理的にも非常に重要
な反応であると考えられる。なぜならば、血管内膜肥厚
形成の初期に血管内膜中の平滑筋細胞やマクロファージ
に由来するＴＦの一部が細胞外に遊離してくると、血管
中膜から内膜への新たな平滑筋細胞の遊走を誘発し、内
膜肥厚形成をさらに助長することが十分考えられるから
である。よって、このＴＦの遊走活性を抑制するＴＦＰ
Ｉの作用は非常に重要である。

【００３０】《実施例４：ＴＦＰＩによる平滑筋細胞の
増殖性抑制作用》ＴＦＰＩのヒト平滑筋細胞の増殖性へ
の影響は、以下の２方法により検討した。 (1) 平滑筋細胞の培養法 平滑筋細胞はクラボウ社から購入したヒト大動脈由来血
管平滑筋細胞を用いた。平滑筋細胞の継代培養はクラボ
ウ社のプロトコールに従い、基礎培地（S-BM）にbasic
FGF、上皮増殖因子（ＥＧＦ）さらには牛胎児血清（５
％）とデキサメタゾンを添加した増殖用培地（S-GM）で
行った。なお、以下の実験には５もしくは６の継代数の
平滑筋細胞を用いた。

【００３１】(2) 細胞数測定による分析 a）細胞数の測定法 平滑筋細胞の増殖は、9600個／well（24 穴培養プレー
ト）の細胞密度で播種した平滑筋細胞を増殖用培地で培
養し、経時的に細胞数を求めることで評価した。細胞数
の計測は付着した細胞をトリプシン／EDTAではがした
後、血球計算板を用いて行った。なお、培地交換は２日
毎に行った。 b）ＴＦＰＩの平滑筋細胞増殖への影響 上記の培地に各濃度のＴＦＰＩを添加して平滑筋細胞を
培養すると、図３に示したように、培養８日目にＴＦＰ
Ｉ濃度に依存して最大で約40％の増殖抑制作用を示し
た。

【００３２】(3) ＤＮＡ合成量での分析 細胞は増殖因子等の刺激によって増殖する際、細胞分裂
の前に活発なＤＮＡ合成を行い、染色体を倍加させる。
よって、このＤＮＡ合成量を測定することで細胞の増殖
性を分析できることが知られている。今回、ＴＦＰＩが
平滑筋細胞の増殖に及ぼす影響を検討するために、増殖
を停止させた平滑筋細胞を各種濃度のＴＦＰＩを含む増
殖因子培地で増殖刺激し、刺激開始後48〜72時間の間に
細胞内に取り込まれた核酸前駆体類縁物質ブロモデオキ
シウリジン（BrdU）の量を測定した。BrdUの定量は、ce
ll proliferation ELISA(ベーリンガーマンハイム）で
行った。なお、細胞内に取り込まれたBrdU量はＤＮＡ合
成量に比例する。その結果、図４に示したように、各濃
度のＴＦＰＩを培地に添加して刺激した結果、細胞内Br
dU量がＴＦＰＩ濃度に依存して明らかな減少傾向を示し
た。よって、ＴＦＰＩは平滑筋細胞のＤＮＡ合成を抑制
することが明らかとなった。以上の結果より、ＴＦＰＩ
は平滑筋細胞に対する増殖抑制作用をもつことが明らか
となった。

【００３３】《実施例５．ＴＦＰＩによるＴＦ凝固活性
の阻害作用とＴＦ発現の抑制作用》平滑筋細胞中のＴＦ
は成長因子の刺激により発現することが知られているの
で、増殖を停止させた平滑筋細胞を増殖因子を含む培地
で刺激した後、実験に供与した。

【００３４】(1) 平滑筋細胞の培養法 平滑筋細胞は実施例４と同様に、クラボウ社から購入し
たヒト大動脈由来血管平滑筋細胞を用いた。平滑筋細胞
の継代培養はbasic FGF、EGF、さらには５％牛胎児血清
を含む増殖用培地（S-GM）で行った。なお、以下の実験
には６継代目の平滑筋細胞を用いた。

【００３５】(2) ＴＦＰＩによる平滑筋細胞由来ＴＦ凝
固活性の阻害 a）TF活性測定用の細胞調製 増殖を停止させた平滑筋細胞は、800個／well（96穴培
養プレート）の細胞密度で播種した平滑筋細胞をS-GM培
地で５日間培養した後、増殖因子を含まない低血清培地
（0.4％牛胎児血清）に交換し、２〜３日間培養する事
で調製した。その後、再度増殖用培地（S-GM）に交換し
６時間培養後、細胞中のＴＦ活性を測定した。 b）ＴＦ凝固活性の測定法 細胞中のＴＦ活性は、細胞に活性型第VII因子（16.7ng/
ml）と第Ｘ因子（0.5Ｕ/ml）を添加し、37℃で30分間反
応させた後、形成される活性型第Ｘ因子量をもとに算出
した。活性型第Ｘ因子量は、合成基質（S-2222, 第一化
学）を用いて定量した。なお、第Ｘ因子はヒト血漿から
抗第Ｘ因子抗体結合ゲルによるアフィニティークロマト
グラフィーを行って精製した。活性型第Ｘ因子はヘビ毒
由来の活性化酵素（RVV-X、シグマ社）により第Ｘ因子
を活性化して調製した。活性型第VII因子もヒト血漿か
ら抗VII抗体結合ゲルにより第VII因子を調製した後、活
性型第Ｘ因子により活性化して調製した。 c）ＴＦ凝固活性の阻害作用 上記のＴＦ活性測定時に、各種濃度のＴＦＰＩを添加し
て反応させ、形成される活性型第Ｘ因子量を指標に阻害
活性を調べた。その結果、図５に示したように、ＴＦＰ
Ｉ濃度に依存したＴＦ活性の阻害作用が確認され、ＴＦ
ＰＩにより平滑筋細胞中のＴＦ活性は完全に阻害される
ことが明らかとなった。

【００３６】(3) ＴＦＰＩによるＴＦ発現の抑制 ＴＦ発現に及ぼすＴＦＰＩの影響は増殖用培地で平滑筋
細胞を６時間刺激した後、TritonX-100で可溶化した細
胞中のＴＦ抗原量を測定する事で評価した。 a）ＴＦ抗原量の測定 ＴＦ抗原量の測定は、ＴＦに対する２種のモノクローナ
ル抗体（HTF-K14（微工研菌寄11945号），HTF-K180（微
工研菌寄11946号)）を用いて、特開平6-148182号公報に
記載の方法に従い高感度のELISA法により行った。 b）ＴＦ発現へのＴＦＰＩの影響 ＴＦ発現へのＴＦＰＩの影響は、各種濃度のＴＦＰＩお
よび活性型第VII因子、活性型第Ｘ因子を添加した増殖
培地で刺激した後の細胞中のＴＦ量を測定する事で検討
した。その結果、図６に示したようにＴＦＰＩは活性型
第VII因子と活性型第Ｘ因子存在下で濃度依存的にＴＦ
発現を抑制し、その程度は最大で約60％であった。以上
の結果から、ＴＦＰＩが平滑筋細胞に由来するＴＦの凝
固活性や発現を抑制することから、凝固反応の結果生じ
る活性型第Ｘ因子、トロンビン、さらにフィブリンの形
成量を制御すると考えられた。さらに、この事は、ＴＦ
ＰＩが平滑筋細胞の遊走および増殖へのこれらの因子の
影響を間接的に抑制することを示唆している。

【００３７】《実施例６：ウサギＰＴＣＡモデルにおけ
るＴＦＰＩの再狭窄抑制効果》ＰＴＣＡ後の再狭窄は、
ウサギを用いた「２回傷害モデル」で評価した。「２回
傷害モデル」とは、正常なウサギの大動脈血管に対しバ
ルーンカテーテルで内膜傷害を与えることにより、ヒト
の粥状動脈硬化巣に似た内膜肥厚をまず形成させ、その
肥厚部位に対して再度バルーンカテーテルによるＰＴＣ
Ａを実施して新たに形成される内膜肥厚による血管の再
狭窄を評価するモデルである。かつて一般的に用いられ
ていた「１回傷害モデル」、すなわち正常な動脈にＰＴ
ＣＡを実施し、それによって起こる内膜肥厚を評価する
モデルに比べ、「２回傷害モデル」は動脈硬化状態の血
管にＰＴＣＡを実施するという点で、実際の臨床状態に
より近いモデルであると言える。以下、方法の詳細を述
べる。

【００３８】実験動物は雄性ニュージーランド白色家兎
（２〜2.3kg）を使用した。まず、大腿動脈よりバクス
ター社製Fogartyバルーンカテーテル（４Ｆ）を下行胸
部大動脈に挿入後、1.75atmの圧力でバルーンを拡張さ
せ、10cmの範囲を２回擦過することにより内膜傷害を行
った。４週間後、バルーン傷害により形成された内膜肥
厚患部に対して、バクスター社製サーモダイリューショ
ンカテーテル（５Ｆ）を挿入し、同圧で２回目のバルー
ン拡張術を実施した。その際、バルーンを拡張し血行を
停止した状態で被検薬剤４mlを患部に注入し、そのまま
30秒間静置して薬剤を血管壁に投与した。被検薬剤とし
て50μg/mlのＴＦＰＩを含む１％アルブミン含有ラクト
リンゲル液を用い、対照としてＴＦＰＩを含まない１％
アルブミン含有ラクトリンゲル液を用いた。２回目のバ
ルーン拡張術後４週目に屠殺し、傷害部の光顕・電顕に
よる観察および肥厚内膜巣の計測を行い、術後の再狭窄
に対する被検薬剤の効果を評価した。

【００３９】正常血管の内膜は５μm以下であるが、１
回目のバルーン傷害４週後には傷害部の内膜厚は23.1μ
m（４羽の平均）であった。この肥厚状態の内膜に被検
薬剤とともに２回目のバルーン拡張術を実施し、４週目
に傷害部の内膜厚を測定したところ、対照群は39.6±1.
8μm（４羽の平均値±標準偏差）であったのに対し、Ｔ
ＦＰＩ投与群は29.7±2.1μm（４羽の平均値±標準偏
差）であり、ＴＦＰＩ投与群は対照群に比較し、危険率
0.5％以下（スチューデントｔ検定による）で有意に内
膜肥厚を抑制した。２回目のバルーン拡張術後に新たに
形成された肥厚内膜厚を両群で比較した結果を図７に示
す。以上の結果より、ＴＦＰＩはＰＴＣＡ後の再狭窄を
効果的に抑制することが明らかになった。

【００４０】

【発明の効果】本発明のＴＦＰＩ含有製剤は、血管平滑
筋細胞の増殖及び／または遊走により惹起される血管内
膜の肥厚を効果的に抑制することができた。さらに、当
該ＴＦＰＩ製剤は、動物モデル実験の結果、ＰＴＣＡ後
の再狭窄を効果的に防止しうることが明らかとなった。
従って、本発明のＴＦＰＩ製剤は、経皮経管的血管形成
術や他の血管拡張術（アテローム切除術）後の再発性狭
窄症を防止するためには極めて有効な治療剤である。ま
た、本ＴＦＰＩ製剤は、狭心症や心筋梗塞症、脳梗塞症
のような虚血性心疾患及び脳疾患になる可能性のある動
脈硬化巣をもつヒトに対して有効な治療剤となりうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＴＦによる平滑筋細胞遊走促進効果を示す。

【図２】 ＴＦにより促進された平滑筋細胞遊走反応に
対するＴＦＰＩの抑制効果を示す。

【図３】 細胞数測定によるＴＦＰＩの平滑筋細胞増殖
抑制効果を示す。

【図４】 ＤＮＡ合成量測定法によるＴＦＰＩの平滑筋
細胞増殖抑制効果を示す。

【図５】 ＴＦＰＩによる平滑筋細胞由来ＴＦ活性阻害
効果を示す。

【図６】 ＴＦＰＩによるＴＦ発現阻害効果を示す。

【図７】 ＴＦＰＩによるＰＴＣＡ後の血管内膜肥厚
（再狭窄）抑制効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 神窪 勇一 熊本県熊本市八景水谷３丁目６−28 コー ポ渡辺 (72)発明者 嶽本 澄代 熊本県熊本市坪井４−12−22 (72)発明者 羽室 強 熊本県熊本市龍田町上立田385−６ スカ イハイツ (72)発明者 宮本 誠二 熊本県菊池郡西合志町須屋2066−８

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血管平滑筋細胞増殖及び／または遊走に
   より惹起される動脈硬化を治療するための薬剤におい
   て、組織因子凝固系インヒビター（ＴＦＰＩ）を有効成
   分として含有することを特徴とする動脈硬化治療剤。
2. 【請求項２】 当該動脈硬化が、血管拡張術後の再発性
   狭窄症である請求項１に記載の動脈硬化治療剤。
3. 【請求項３】 当該血管拡張術が、経皮経管的血管形成
   術、粥腫切除術、レーザー切除術のいずれかである請求
   項２に記載の動脈硬化治療剤。
4. 【請求項４】 当該血管拡張術が、経皮経管的血管形成
   術である請求項２または３に記載の動脈硬化治療剤。
5. 【請求項５】 当該ＴＦＰＩがドラッグデリバリーカテ
   ーテルを介して血管患部へ投与されることを特徴とする
   請求項１から４のいずれかに記載の動脈硬化治療剤。
6. 【請求項６】 当該ＴＦＰＩがステントやバルーンの表
   面に塗布して血管患部へ投与されることを特徴とする請
   求項１から４のいずれかに記載の動脈硬化治療剤。
7. 【請求項７】 当該ＴＦＰＩが、ボーラスもしくは連続
   的に静脈及び動脈内へ投与されることを特徴とする請求
   項１から４のいずれかに記載の動脈硬化治療剤。
8. 【請求項８】 当該ＴＦＰＩをコードする遺伝子が平滑
   筋細胞内で該遺伝子を発現することができる組換えベク
   ターに含まれたものであることを特徴とする請求項１か
   ら４のいずれかに記載の動脈硬化治療剤。
9. 【請求項９】 当該ＴＦＰＩがヒト血液由来もしくは遺
   伝子組換え技術によって製造されるＴＦＰＩを主成分と
   する請求項１から８のいずれかに記載の動脈硬化治療
   剤。