JPH03501262A - インターフェロン及び／又はインターロイキン‐６を用いたｃ１インヒビター濃度増加法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターフェロン及び／又はインターロイキン−６を用いたＣ１インヒビター濃 度増加法 （関連分野） 本発明はＣ１インヒビター欠乏症の症状を示すか、もしくはその危険性を有する 患者の血管内Ｃ１インヒビクー濃度を増加する目的のヒトインターフェロン及び ／又はインターロイキン−６の使用に関する。

（背景） Ｃ１インヒビクー（ＣＩＩＮＨ）は補体、接触、凝固及びフィブリン分解システ ムを含む血景中のいくつかのたん白質分解システムの調節に関するセリンプロテ アーゼインヒビターである。デービス（Ｄａｖｉｓ）等、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｔｍ１ｌｕｎｏ１．　６　：　５９５　６２８（１９８８）。ＣＩＩＮＨは各シ ステムの特異的セリンプロテアーゼ成分との共有結合的複合体を形成することに よりこれらのシステムを調節することが知られている。

活性が直接Ｃ１インヒビターで調節されるいくつかの特異的セリンプロテアーゼ が同定されている。たとえば、ＣＩＩＮＨは補体システム成分Ｃ１の活性フラグ メントであるＣ１ｒ及びＣ１ｓの唯−知られているインヒビターである。

さらにＣＩＩＮＨは因子Ｘｌ１ａ及びＸｌ１ｆ（ヘージマン因子）を含む凝固因 子Ｘ■の活性型及びカリクレイン両方の主要インヒビターであることから接触シ ステムの最も重要なインヒビターであることが示されている。ブラウト（Ｐｒｏ ｕｄ）等、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、６　：　４９　８３　（１９８８）。

ＣＩＩＮＨの欠乏は重くかつ潜在的な命にかかわる病気を引き起こすことが知ら れている。ＣＩＩＮＨ欠乏症のうち最も明らかにされている例はＣＩＩＮＨを生 産する能力を遺伝的に欠いていることによる遺伝性血管神経症としても知られて いる遺伝性血管浮腫（ＨＡ　Ｅ）の患者に見られる。ＨＡＥの症状を示す患者は 最初は手足、顔、喉頭及び胃腸など皮膚又は粘膜の再発性、急性、局所性、限局 性浮腫を示す。デービス（Ｄａｖｉｓ）等、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｔｓ＋＋ｎｕｎｏ１．、　ＪＬ：５９５　６２８　（１９８８）。

後天性ＣＩＩＮＨ欠乏症と命名される別のタイプのＣＩＩＮＨ欠乏症は通常量の ＣＩＩＮＨを合成するが代謝が早く十分な濃度のインヒビターを維持できないヒ トにみられる。後天性ＣＩ　ＩＮＨ欠乏症の患者はＨＡＥの症状を示す。ＣＩＩ Ｎ）１及び補体システム成分Ｃ４及びＣ２の両方の濃度が減少する典型的症状を ＨＡＥ及び後天性ＣＩＩＮＨ欠乏症両方が示す一方、補体システム成分Ｃ１ｑの 濃度は後天性のもののみ減少する。

現在、後天性ＣＩＩＮＨ欠乏症を起こす３種のメカニズムが提唱されている。第 １に、通常に使用可能なＣＩＩＮＨ量が過剰量の補体及び／又は接触システム活 性化により消費される場合にＣ１１ＮＨ欠乏症が獲得される。補体及び接触シス テム各々の活性成分のいくつかはＣＩＩＮＨと結合し、これを不活性化し得る。

さらに活性接触システム成分はＣＩＩＮＨを切断し、不活性フラグメントにし得 る。ズロー（Ｚｕｒａｗ）等、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、。

１工：５６７−５７５　（１９８６）。

第２に、ＣＩＩＮＨ欠乏症は抗−ＣＩＩＮＨ自己免疫反応の結果として獲得され る。この場合、ＣＩＩＮＨは合成されるが抗＝ＣＩＩＮＨ自己抗体がこのインヒ ビターに結合し、それによりセリンプロテアーゼ活性の１Ｍ節能を妨害する。第 ３にＣＩＩＮＨが循環系から迅速に排泄される補体含有自己免疫複合体に結合さ れる結果ＣＩＩＮＨ欠乏症が獲得される。

先に述べたことから、ＣＩＩＮＨの血管白濃度の増加法はＣＩＩＮＨ欠乏症によ り引き起こされる病気の治療に有効であることが分る。血管内ＣＩＩＮＨｒＪｆ ｆ度の増加法は急性補体及び／又は接触システム活性化によるＣＩＩＮＨ消費に 対する予防に特に有効である。

現在、ＣＩＩＮＨの血中濃度を調節する特異的生理的メカニズムは知られていな い。血液障害に対する急性反応におけるＣｌ１ＮＨ合成の主要部位は肝臓である と提唱されている。デービス（Ｄａｖｉｓ）等、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、、　ＪＬ：　５９５　６２８（１９８８）、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ）等、５ｃｉｅｎｃｅ　工１１；５５３−５５４　（１９７１）。さらにインビ トロ研究の結果は培養した肝細胞がインターフェロン−ガンマに応答してＣＩＩ ＮＨを合成することを示している。ズロー（Ｚｕｒａｗ）等、Ｃｏｍｐｌｅｍｅ ｎｔ。

Ｌ：２４４．Ａ３１９　（１９８７）。一方、局所的非障害性炎症に応答して生 ずるＣＩＩＮＨ源は単球／マクロファージ系列の細胞であるようである。たとえ ばいくつかのインビトロ研究は培養した単球がインターフェロン−ガンマ処理に より刺激されＣｌ１ＮＨを合成することを示した。ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏ ｎ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、ｆ土、、ｉ；８０９−８１５　（１９８７）ｉ ロソツ（ＬｏＬｚ）等、Ｊ、　Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．、　ｌｉｉ；３３８２　３３ ８７　（１９８７）　；ロフツ（Ｌｏｔｚ）等、Ｊ、　ＡＩｌｅｒｇ、　Ｃｌ１ ｎ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、＋　７９　；　ｌ　９４＋Ａ２８０　（１９８７）；及 びラピン（Ｌａｐｐｉｎ）等、Ｃｏ＋ｎｐｌｅ＋ｐｅｎＬ１−：１８４．Ａ１６ ０　（１９８７）参照、さらに１つのインビトロ研究の結果は培養した肝細胞が インターフェロン−ガンマに応答してＣＩＩＮＨを合成することを示している。

ズロー（Ｚｕｒａｗ）等、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ、土：２４４．Ａ３１９　（１ ９８７）。

しかし、この分野でよく知られているように、インターフエロンーガンマで得ら れたインビトロ研究の結果はインビボで同様の結果を生むことを示していない。

たとえば培養単球をインターフェロン−ガンマで処理すると単球表面上でのＨＬ Ａ−Ｄ’Ｒ抗原の発現レベルを増加させる。一方、患者にインターフェロン−ガ ンマを投与すると患者の単球によるＨＬＡ−ＤＲ抗原の発現レベルは減少した。

ファイヤスタイン（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ）等、Ａｒｔｈｒｉｔ、　Ｒｈｅｕｍ、 。

３０．５１１５．Ｅ１３　（１９８７）。

今日までインビボにおけるＣＩＩＮＨレベルに対するインターフェロン−ガンマ の効果に関する研究はない。現在理解されているインターフェロン−ガンマが特 定の免疫細胞の活性化及び増殖を調節するイムノモジュレータ−と考えられてい る事実からみて驚くべきことではない。

（本発明の概要） 現在インターフェロン−ガンマ及び／又はインターロイキン−６（ＩＬ−６）の 投与はＣ１インヒビターの血管白濃度を増加することが知られている。

それゆえ、本発明はＣ１インヒビター濃度増加量のインターフェロン及び／又は ＩＬ−６を患者に投与することを含む、血液障害の緩和治療に関する。

別の態様において本発明は患者の血液を補綴装置に循環させる治療法に関し、こ の方法は患者の血液をこの装置の補綴表面に接触させることと実質的に同時に、 患者に０１インヒビタ一濃度増加量のインターフェロン及び／又はＩＬ−６を投 与することを含む。

また本発明は外科的に誘導された血液障害に対する緩和治療に関し、この治療に は患者への侵害的外科操作を行うのと実質的に同時に患者に０１インヒビタ一濃 度増加量のインターフェロンを投与することを含む。

さらに本発明はＣ１インヒビター欠乏症のＲ法的症状を示す患者の血管内Ｃ１イ ンヒビター濃度を増加する方法に関し、本方法には１色者に治療有効量のインタ ーフェロン及び／又はＩＬ−６を投与することが含まれる。

（図の簡単な説明） 第１図はＣＩＩＮＨ分泌に関するガンマインターフェロン刺激のインビトロ投与 量依存効果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を実施例３Ａで述べるように培 養培地１　ｍｅ当り１　（ＩＦＮＩ）から１００国際単位（ＩＵ）のインターフ ェロンガンマを添加することにより刺激した。コントロール培養にはインターフ ェロン−ガンマを入れないものを使用した。指示しである日に培養上清サンプル を取り出し、分泌されたＣＩＩＮＨレベルをＥＬＩＳＡ検定法で測定して培地１ ミリリットル当りのＣＩＩＮＨナノグラム量（ｎｇ／ＩＲ１）で表わした。

第２図はインターフェロン−ガンマ刺激後の２種の肝細胞系列のＣＩＩＮＨ分泌 量の増加を示す棒グラフである。ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂ細胞系列両方とも実 施例３Ａで述べているようにミリリットル当り１００１　Ｕ　Ｎ　Ｕ／ｍｅ＞の インターフェロン−ガンマを用いて培養した。平行してＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３ Ｂ細胞をインターフェロン−ガンマの代りにインターロイキン−６（ＩＬ−６） 存在下で培養した。コントロール培養には刺激なしのものを使用した。１日目及 び３日目に培養上清サンプルを取り出し、各培養上滑中に分泌されたＣＩＩＮＨ レベルをＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法で測定して培地１−当りのＣＩＴＮＨｎｇ量（ｎ ｇ／ｍＥ）で表わした。

第３図はＣＩＩＮＨ分泌に関するインターロイキン−６（ＩＬ−６）刺激のイン ビトロ投与量依存効果を示すグラフである。指示されているように培養培地１− 当り０　（コントロール）から１００国際単位のＩＬ−６、又は実施例３Ｂに述 べているようにｍｌ当り１００国際単位のインターフェロン−ガンマを添加して ＨｅｐＧ３細胞を刺激した。指示されている日に培養上滑サンプルを取り出し、 分泌されたＣＩＩＮＨレベルをＥＬＴＳＡ検定法で測定してｎｇ／ｍｌで表わし た。

第４図はインビトロにおけるＣＩＩＮＨ分泌に関するインターフェロン−ガンマ とＩＬ−６の組合せがもつ添加効果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を−当 りの国際単位（ＩＵ／ｄ）で示されている濃度のインターフェロン−ガンマとと もに培養した。平行したＨｅｐＧ２細胞の培養物にはインターフェロン−ガンマ に加えて１００国際単位（ＩＵ／ｄ）のＩＬ−６を添加した。両培養上清サンプ ルを６日後に取り出し分泌されたＣＩＩＮＨレベルをＥＬＩＳＡ検定法で測定し −当りのＣＣ１１ＮＨｎ量（ｎｇ／１ｎ１）で表わした。

第５図は実施例３Ｂで述べるようにインターフェロン−ガンマ刺激後インビトロ でＣＩＩＮＨが合成されることを示すオートラジオグラフである。ＨｅｐＧ２細 胞を１００　ｒ　Ｕ／ｉ＋ｊのインターフェロン−ガンマ存在下又は非存在下（ コントロール）で培養し、また同時に２４時間にわたり３５３−メチオニンで標 識した。その後この培養上清を収穫しモノクローナル抗−ＣＩＩＮ）（を結合し たセファロース４Ｂビーズと免疫反応させた。免疫反応させたビーズ上に存在す るたん白質を７．５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動しオートラジオグラフ ィーで可視化した。標識したＣｌ１ＮＨたん白質は分子量約１１０キロダルトン （Ｋ）のバンドとして泳動する。

（本発明の詳細な説明） 本発明はインターフェロン及びＩＬ−６の両方又はいずれかの投与が患者血中の ０１インヒビター量を増加するという発見に基づくインターフェロン及びＩＬ− ６の新しい用途に関する。

したがって本発明はＣ１インヒビタ一壇度増加量のインターフェロン、好ましく はインターフェロン−ガンマ又はＩＬ−６、もしくはその両方を患者に投与する ことを含む患者中の血液障害を緩和又は防止する方法に関する。

ここで用いられている“血液障害（ｂｌｏｏｄ　ｔｒａｕ＋ｎａ）　”という語 句は患者血液の補体システム及び／又は接触システムを臨床的に有意な程度、す なわち急性又は慢性炎症、肺浮腫、低血圧などの二次症状を示す程度に活性化さ れる生理状態を示す。

患者血液における臨床的に有意な補体システム活性化の存在を測定する方法は当 分野でよく知られている。＝ｉ的にこれらの方法は活性化した補体システム成分 の量を検定する。たとえば血液中の非活性化補体成分Ｃ４に対する活性補体フラ グメン）Ｃ４Ｄの比が１．２を越える場合は血液障害の存在、すなわち臨床的に 有意な補体システム活性化を示す。ニシェ（Ｎｉｔｓｃｈｅ）等、Ａｎ、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、、７５：６７９　６８４　（１９８１）参照。（本明細書 に述べられている文献は参照として引用している）。

さらに補体システム活性化は活性補体成分Ｃ１ｓ、Ｃ３ａ、又はＣ５ａの血管白 濃度の増加を検出することによって測定することができる。１つの方法では、Ｃ １ｓの血管内レベルはロックシン（Ｌｏｃｋｓｈｉｎ）等（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ 　Ｒｈｅｕｏ＋、、　２９　；　１４６７−１４７２（１９８６））により報告 されているように血液サンプル中に存在するＣ１ｓ：ＣＩＩＮＨ複合体量を検出 することにより測定される。Ｃ１ｓ：ＣＩＩＮＨ複合体の血管内レベルが血液ミ リリットル当り１２ナノモルを越えるとき補体システム活性化は臨床的に有意で あると考えられる。

補体活性化の２つの産物Ｃ３ａ及びＣ５ａは病理生理学的に特に重要である。Ｃ ３ａ及びＣ５ａは好中球、卓球及び好塩基球を活性化し、酸素ラジカル、アラキ ドン酸代謝物及びヒスタミンを生成する。卓球においてＣ３ａ及びＣ５ａはイン ターロイキン１及び６　（ＩＬ−１及びＩＬ−６）の合成を刺激し、発熱及び急 性肝臓応答を起こす。それゆえＣ３ａ及びＣ５ａは血液障害の結果起こる臨床的 症状の重要な仲介物である。Ｃ３ａ及びＣ５ａの血管内レベルはハグリ　（Ｈｕ ｇｌｉ）等（イムノアッセイ：１９８０年代の臨床実験技術、ナカムラ（Ｎａｋ ａｍｕｒａ）等縄、アランＲ，リス（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）ニューヨーク、 ４４３−４６０　（１９８０）、“Ｃ３ａ及びＣ５ａ測定技術と意義”）により 報告されているラジオイムノアッセイにより測定される。ハグリ　（Ｈｕｇｌｉ ）の操作に基づく検定キットはアップジョンダイアグノスティクス（Ｕｐｊｏｈ ｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｅｓ）　（カラマズ、旧）から市販されている。チェノウ ェス（Ｃｈｅｎｏｗｅｔｈ）等（Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、）、主ｌ土 ；４９７−５０３（１９８１））により議論されているようにハグリ　（）ｌｕ ｇｌｉ）の操作法（上述）により検定したときＣ３ａ及びＣ５ａの血管内レベル が−当りそれぞれ２００ｎｇ又は３０ｎｇを越える場合、補体システム活性化は 臨床的に有意であると考えられる。

“接触システム活性化１は凝固因子ＸＩ、ＸＩＩ及びプレカリクレインなどの接 触システムの成分が活性化される過程を意味する。

接触システム活性化は炎症反応を仲介し、かつ血液流や血圧をコントロールする ブラディキニンなどの強力な血管活性ペプチドを産生させる。接触システムの３ 個の重要な活性成分、カリクレイン、凝固因子Ｘｌａ及びＸＩ［ｌａは、それら の非活性前駆体、各々プレーカリクレイン、凝固因子Ｘ！及びＸ■がたとえば内 皮基底膜表面又は合成補綴表面上にみられるようなアニオン性マクロ分子表面な ど接触システム活性化表面に接触したとき生成する。たとえばブラウト（Ｐｒｏ ｕｄ）等、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、１ｍｍｕｎｏ１．＋　６　：　４９−８３　（１ ９８８）；およびコシン（Ｋｏｚｉｎ）等、炎症二基本原理と臨床的相関、ガリ ン（Ｇａｌｌｉｎ）等編、レーベンプレス版、１０１−１２０　（１９８８）の “血柴の接触活性化システム”参照。

患者血液中の活性接触システム成分の存在、すなわち接触システム活性化を測定 する方法はよく知られている。たとえばＣ１インヒビター−カリクレイン複合体 はレウィン（Ｌｅｗｉｎ）　等（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、）２５８：６４１５　６４２１　（１９８３））により報告されてい るように酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により検出し得る。ＣＩＩＮＨ −カリクレイン複合体が約５ナノモル濃度（ｎＭ）を越える場合、接触システム 活性化は臨床的に有意と考えられる。

同様に患者血液中の０１インヒビター−因子Ｘ１ｌａ複合体はカブラン（Ｋａｐ ｌａｎ）等（Ｂｌｏｏｄ、６０：６３６　６４１　（１９８５））により報告さ れているようにＥＬＩＳＡにより検出し得る。血管内のＣＩＩＮＨ−因子ＸＩＩ ａ複合体レベルが５ｎＭよりも大きいとき接触活性化は臨床的に有意と考えられ る。別に患者血液中に低分子量切断産物を生じる高分子量キニノゲン（ＨＭＷＫ ）の切断はベレティｓ−（Ｂｅｒｒｅｔｔｉｎｉ）等（Ｂｌｏｏｄ、　６８　： 　４５５−４６２（１９８６））により報告されているイムノブロッティング操 作によりモニターし得る。ＨＭＷＫの切断は活性接触システム成分カリクレイン の作用により起こることから切断産物の存在は接触システム活性化を示す。さら に患者血液中で、Ｃ１インヒビターを修正するプロセシングは接触システム活性 化を示す。患者血液中の９４０００ダルトンの修正型Ｃ１インヒビターたん白質 はズロ−（Ｚｕｒａｉｉ）等、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、）　７８　 ：　５６　ｊ−５７５（１９８６））により報告されているイムノプロンティン グ法により検出し得る。

別に、接触システム活性化はスコフト（Ｓｃｏｔｔ）等（Ｂ　］　ｏｏｄ　、　 ｉｉ：４２−５０　（１９８４））により報告されているアミド分解検定法を用 い活性因子ＸＩ（たとえばＸ１ａ）の凝固活性を測定することにより測定し得る 。この検定法において１国際車位（ＩＵ）の因子Ｘｌａは−当り、分当り合成基 質ＰｙｒＧ］ｕ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　−ｐ−ニトロアナリド（Ｓ−２３６６） 　０．４９マイクロモルを加水分解するのに十分な量である。血管内因子Ｘｌａ レベルがｍＥ当り１．５１０を越える場合接触システム活性化は臨床的に有意で あると考えられる。

さらに接触システム活性化は臨床的な患者の症状により示され得る。たとえば接 触システム成分の活性化はアレルギー反応、関節炎、分散型皿管内凝固及びショ ックのような臨床状態と関係する。これらの症状の説明はサイト−（Ｓａｉｔｏ ）　Ｓｅｍ１ｎ、　Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈｅｍｏｓ　ｔａ　ｔ　ｉ　Ｓ　＋土１１６−４９　（１９８７）を参照せよ。

本明細書で使用される“インターフェロン′はヒトに由来する場合又はインター フェロンたん白質を発現するための組換えＤＮＡシステムにより調製される場合 も特に示さないかぎりアルファ、ベータ、及びガンマ型のヒトインターフェロン を意味する。たとえば組換えヒトインターフェロン−ガンマの調製法及び該調製 組成物の特異的活性の測定法は当分野でよく知られている。たとえばグレー（Ｇ ｒａｙ）等、Ｎａｔｕｒｅ、、Ｌｉｉ：　５０３　５０８　（１９８２）及びロ ング（Ｌｏｔｚ）等、Ｊ、　Ｉａｖｕｎｏｌ、、１」」−３６３６３６４２（１ ９８６）参照０組換え的に生成したインターフェロン−ガンマはジェネテク（Ｇ ｅｎｅｔｅｃｈ）　（サンフランシスコ、ＣＡ）及びアムゲン（Ａｍｇｅｎ）（ サウザンドオークス、ＣＡ）のような販売会社より市販されている。

さらに、ヒトインターフェロン−アルファ及び−ベータの調製法及び該調製組成 物の特異的活性の測定法もよく知られている。

たとえばズーン（Ｚｏｏｎ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、、　ＵＳＡ。

（１９８０）；アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、。

よびグレー（Ｇｒａｙ）等、上述参照。

組換えヒトインターフェロン−アルファ及び−ベータの調製法もよく知られてい る。ヒトインターフェロン−アルファ及び−ベータの組換え生産の実験的方法に ついては各々ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）７２２　（１９８１）参照。

組換え的に生産したヒトインターフェロン−アルファはシェリング社（Ｓｃｈｅ ｒｉｎｇ　Ｃａｒｐ、）　（７ジソン、ＮＴ）、アムゲン（Ａｍｇｅｎ）。

０７シユラボラトリーズ（Ｒｏｃｈｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　（ナラト レー。

ＮＴ）及びベーリンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）（インディアナポリス、ＩＮ）などの販売会社から市販されている。組換え 的に生産したヒトインターフェロン−ベータもセタス（Ｃｅｔｕｓ）　（エミリ ービル、ＣＡ）などの販売会社から市販されている。

“Ｃ１インヒビター濃度増加量”及び“治療的有効量”とは、患者の血管内Ｃ１ インヒビター濃度を好ましくは少なくとも約１０パーセント、更に好ましくは少 なくとも約５０パーセント、最も好ましくは少なくとも約１００パーセント測定 可能なように増加するのに十分なインターフェロン又はＩＬ−６の量を意味する 。インターフェロン及び／又はＩＬ−６は一般的に溶液又はサスペンション状の 医薬組成物として投与される。しかし、よく知られているように単独又は混合し たインターフェロン及びＩＬ−６は錠剤、丸薬、カプセル、エアロゾル、放出持 続成型又は粉末など治療投与用にも成型し得る。

活性成分としてインターフェロン及び／又はＩＬ−６を含む治療組成物の調製法 もよく知られている。一般にこれら組成物は注射可能なように液体溶液又はサス ペンションとして調製されるが、注射前に溶液又はサスペンションなどの液体に するのに適した固体も調製し得る。この調製物はエマルジツンとすることもでき る。

インターフェロン及び／又はＩＬ−６はしばしば医学的に許容可能でかつ活性成 分（インターフェロン及び／又はＩＬ−６）と適合し得る無機及び／又は有機的 賦形剤と混合される。適当な賦形剤にはたとえば水、食塩水、デキストロース、 グリセリンなど及びこれらの混合物がある。さらに望ましい場合はこの組成物は 活性成分の効果をあげる湿潤剤またはエマルジョン化剤、ｐＨ１ｉ衝剤など少量 の医薬的に許容可能な補助物質を含み得る。

本明細書で用いている“医薬的に許容可能”という語句は、ヒトに投与した時、 胃腸不良、めまいなどアレルギー又は同様の不都合な反応を起こさない分子及び 組成物に使用する。

従来インターフェロン及び／又はＩＬ−６はたとえば単位投与量の皮下注射によ り投与される。単位投与という語句は各単位が必要とされる賦形剤とともに目的 とする治療効果を産むと計算された所定量のインターフェロン及び／又はＩＬ− ６を含む一回の投与に通する物理的に分離した単位である。

インターフェロンはその治療効果量が投与形状に適合した方法で投与される。本 発明に関する投与方法には注射、注入、移植などが含まれる。投与量はインター フェロン及び／又はＩＬ−６を使用し得る患者の能力及び望まれるＣ１インヒビ ターの血中ン；度の上昇度に依存する。投与に必要とされるインターフェロン及 び／又はＩＬ−６の精密な量は、各個人に応した医師の判断に依存する。しかし 、適当なインターフェロン投与量範囲は１日、体表面平方メートル（Ｍ２）当り ｌＸｌｏｂ国際単位（ＩＵ）から１０ＸＩＯ’　ＩＵ、好ましくはｌＸ１０’ｌ Ｕから４Ｘ１０’ＩＵ／Ｍ”　（体表面積）７日のオーダーであるが投与経路に も依存する。適当なｒＬ−６投与量範囲はｌＸｌ０’〜ｌＸｌ０’ＩＵ／Ｍ”　 （体表面積）７日、好ましくは約１’Ｘ　１０’から６×１０５、そしてより好 ましくは約３Ｘ１０’　ＩＵ／Ｍｔ　（体表面積）のオーダーである。

この分野でよく知られているようにインターフェロンに関して用いられる“国際 単位′　（当分野では“国際参照単位′としても知られている）とは、国際標１ ！検定法においてウィルス感染による細胞変性効果を阻害し得るインターフェロ ンの能力の尺度である。ここで述べられている所定のインターフェロン調製物に 存在する国際単位量はロック（Ｌｏｔｚ）等（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、ｉｉ ｉ：　３０３６−３６４２　（１９８６））により報告されているような方法を 用い、アレルギー及び感染症の国立研究所（Ｎ　Ｉ　Ａ　Ｉ　Ｄ）　（リサーチ ・リソース・ブランチ、ベセスダ、ＭＤ、２０２０５）から入手し得る同型のイ ンターフェロンの国Ｐｉ［ｉｍサンプル中に存在する活性を、該調製物中の活性 を比較することにより測定する。

一般に実質的に純粋なインターフェロン−ガンマ調製物はインターフェロンたん 白質ミリグラム（ｍｇ）当り約２０Ｘ１０’ｌＵの活性を示す。それゆえインタ ーフェロン−ガンマの治療有効単位投与量は１日、体表面積Ｍ２当り約５マイク ログラム（μｇ）から約０．５■、好ましくは約５０μｇから約２００Ａ１ｇの 範囲にある。

一般的に実質的に純粋なインターフェロン−アルファ又はインターフェロン−ベ ータ調製物は各々インターフェロンたん白質■当り約２Ｘ１０ｓ　ＩＵの活性を 示す。それゆえ両型のインターフェロンの治療有効単位投与量は１日、体表面積 Ｍ２当り約０．５μｇから約５０μｇ、好ましくは約５μｇから約２０μｇの範 囲にある。

また、インターフェロンの治療有効量は血漿濃度としても表現し得る。たとえば 本発明の好ましい態様においてインターフェロンは血管内血漿濃度がミリリット ル当り約０．５１０から約５００ＩＵ、好ましくは−当り約１０１Ｕから約５０ ＩＬＪの範囲となるように投与される。

インターロイキン−６又はＩＬ−６はヒトから単離される場合も、ＩＬ−６たん 白質を発現するための組換えＤＮＡシステムを用いて調製される場合もヒインタ ーロイキン−６を意味する。ＩＬ−６の単離法及び調製した組成物の比活性の測 定法もよく知られている。たとえばムラグチ（Ｍｕｒａｇｕｃｈ　ｉ）等、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１又ユニ４１２−４１６　＜１９８１）参照。本報告ではＩＬ−６はＴ−細胞置 換因子即ちＴＲＦとして取扱っている。ＩＬ−６単離物もゲンザイム（Ｇｅｎｚ ｙｍｅ）　（ボストン、ＭＡ）及びアムゲン（Ａｍｇｅｎ）　（サウザンドオー クス、ｃＡ）などの販売会社から市販されている。

本発明で用いられているＩＬ−６量の尺度は国際単位（ＩＬＪ）で表わされてい る。ＩＬ−６１１ＬＩはムラグチ（Ｍｕｒａｇｕｃｈ　ｉ）等（上述）により報 告されているように９６穴マイクロプレートのウェル中２００マイクロリツトル の培養培地で５×１０３個のヒトリンパ腫細胞系列ＣＥＳＳを４日間培養した後 に測定した時、ＩｇＧ分泌がＣＥＳＳにより５０％増加される量である。ＣＥＳ Ｓ細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ。

ロックビル、ＭＤ）から入手でき、受理番号はＴｌＢ１９０である。

血漿中のＣＩインヒビター濃度の測定法はよく知られており、好ましい方法は実 施例３に記述されている。典型的方法には、ロック（Ｌｏｔｚ）等（Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、、上且旦：３３８２−３３８７（１９８７））により報告されてい る酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びニッシェ（Ｎｉｔｓｃｈｅ）等（ Ａｍ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｓ、）。

工５；６７９−６８４　（１９８１）により報告されているロケット免疫電気泳 動（ＲＩ　Ｅ）検定法が含まれる。血漿中の０１インヒビタ一濃度を測定する上 記方法での使用に適した抗−０１インヒビタ一抗体調製物は、実施例２で述べら れている精製Ｃ１インヒビターたん白質を用いる標準的免疫学的技術で調製する こともでき、また市販品から入手することもできる。

別の態様において、本発明は血液を補綴装置に循環したときに起こるような患者 血液を接触システム活性化表面に接触させる治療法に関する。この方法にはＣ１ インヒビター血管内（血中）ａ度増加量のインターフェロン、好ましくはインタ ーフェロン−ガンマ、より好ましくはインターフェロン−アルファ及び／又はイ ンターフェロン−ベータと組合せてインターフェロン−ガンマを投与することが 含まれる。インターフェロンの投与は、たとえば患者血液の補綴装置の補綴表面 への接触のような、患者血液の接触システム活性化表面への接触と実質的に同時 に行なわれる。

“補綴装置”とは、患者血管系のある点から別の点への血液の輸送を可能にする ために血管系に挿入される生物的又は合成的血管補綴物を意味する。“補綴表面 ”又は“ルミナル表面”とは輸送される血液と接触する補綴装置の一部のことで ある。

患者の循環系に機能的に挿入されたとき患者血液に接する表面を有する補綴装置 はよく知られている。“生物的及び合成的血管補綴物″Ｊ、スタンレー（Ｓｔａ ｎｌｅｙ）！、グラン及びストラドン（Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　５ｔｒａｔｔｏｎ ）社、Ｎ、Ｙ、（１９８２）。

典型的補綴装置には動脈補綴物、高脈ステント、人工心臓、人工心臓弁、動脈− 静脈転轍器、生体外治療装置などが含まれる。

動脈−静脈転彎器は一般的に生体外補綴装置を通して直接又は最初に動脈血液を 静脈に輸送するのに使用する通常高分子物質で作られる非内皮処理チューブであ る０代表的生体外補ｒ１装置には血液透析装置、心臓肺バイパス装置などが含ま れる。好ましい態様において、インターフェロン投与は患者循環血液を接触活性 化表面に接触する前に行なわれ、一方好ましくはインターフェロン−ガンマ投与 前のＣＩゼインビター血中濃度に比べその濃度が少な（とも約１０パーセント、 好ましくは少なくとも約５０パーセント、より好ましくは少なくとも約１００パ ーセント増加する。しかし、本発明は治療効果量のインターフェロンの投与及び 患者循環血液の接触活性化表面への接触を実質的に同時に行なう方法、及び接触 を投与前に行なう方法にも関する。

“実質的に同時”ということは患者血液を最初に接触活性化表面に接触させる前 ２４０時間、好ましくは１２０時間から接触後７２時間の間にインターフェロン 及び／又はＩＬ−６の投与を行うことを意味する。しかし、好ましい態様におけ るインターフェロン投与は患者血液の接触システム活性化表面への接触又は侵害 性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）外科手術を行う前４から４８時間、好ましくは８から２ ４時間の期間に行なわれる。他の好ましい態様においては、患者血液を接触シス テム活性化表面への接触又は侵害性外科手段を行う前７２．４８及び２４時間と いうように約２４時間間隔でインターフェロン及び／又はＩＬ−６の投与を何回 か行なわれる。

治療効果量のインターフェロン、好ましくはインターフェロン−ガンマの投与も 、Ｃ１インヒビター欠乏症による患者の臨床的症状の効果的治療法である。患者 （ヒト）の０１インヒビター欠乏症を診断する方法もよく知られている。カルタ ー（Ｋａ　Ｉｔｅｒ）等Ｊ、　Ｉｎｆｅｅｔ、　Ｄｉｓ、、１５１　：１０１９ −１０２７　（１９８５）参照。

これらの方法にはここで述べられているＥＬＩ　ＳＡ及びＲＩＥ法による血漿Ｃ １インヒビター濃度の直接測定が含まれる。

別に間接的方法でもＣ１インヒビター欠乏症の存在を診断し得る。たとえば後天 的Ｃ１インヒビター欠乏症の患者の血液は補体成分ＣＩＱ、Ｃ１，Ｃ４，及びＣ ２のレベルが低いか又は検出できない。デービス（Ｄａｖｉｓ）等、Ａｎｎ、　 Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、６　：５９５−６２８（１９８８）。それゆえ血 中のこれらの補体成分レベルを測定する検定法はＣ１インヒビターの欠乏を示す 能力を有する。

さらにＣ１インヒビター欠乏症は患者の臨床的症状によっても示される。たとえ ば血管浮腫患者は遺伝的Ｃ１インヒビター欠乏により起こることが知られている 特徴的症状を示す。これり症状についてはゲル７７ンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）等、 　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５８　：３２１−３２８　（１９７９）；およびフランク （Ｆｒａｎｋ）等、　Ａｎｎ。

Ｉｎｔ、Ｍｅｄ、、８４：５８０−５９３　（１９７６）参照。

Ｃ１インヒビター濃度増加量のインターフェロンの投与も侵害性外科手術に関し 治療的に有効である。ここで使用されている″侵害性外科手術”には実質的に同 時に行なわれる付随的医療行為を伴なわない。たとえば皮下注射針などによる患 者の皮膚の単なる破壊は含まれない。

代表的付随医療行為とは真皮を通過し患者の血液や他の体液及び組織に異物、装 置、補綴物、カテーテルなどを接触させる侵害性外科操作である。これらの外科 操作には血液透析、心臓肺バイパス、血管形成などのカテーテル化、動脈バルー ンアシスタンス及び器官移植が含まれるがこれらに限られるものではない。

１つの態様において、関連する侵害性外科操作は診断目的のラジオグラフィック コントラストメディア（ＲＣＭ）のカテーテル化などによる侵害である。ＲＣＭ 侵害は補体システム活性〔アロヤベ（Ａｒｒｏｙａｖｅ）等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、、１１７：１８６６−１８６９（１９７６）；ファリード（Ｆａｒｅｅ ｄ）等、Ｓｅ＋ｎ、　Ｔｈｒｏｒｒｌｂ、　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ。

Ａ２１８（１９８８））を引き起こす。したがって本態様はＲＣＭ侵害を行うこ とに付随してのＣ１インヒビター濃度増加量のインターフェロンの投与に関する 。

さらに本発明はヒト患者に投与して希釈の有無条件下ＣＩＩＮＨ濃度の好ましく は少なくとも１０％増加させ得る好ましくは無菌的で、かつ好ましくは医薬的に 許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。このような組成物には医薬的に許 容可能な賦形剤中インターフェロン−アルファ及び／又はインターフェロン−ベ ータを混合したインターフェロン−ガンマが含まれ、この中ではインターフェロ ンが唯一の生物学的活性成分である。各インターフェロンは少なくとも約１００ ００１　Ｕ　／　ｄ、望ましくは少なくとも約１０００００　Ｔ　Ｕ／−の濃度 で存在することが好ましい。

本発明の別の医薬組成物にはインターフェロンと共にＩＬ−６を含み、この中で はインターフェロン及びＩＬ−６だけが生物学的活性成分であり、双方とも少な くとも治療効果を示す濃度で存在する。好ましい態様において含まれる＋Ｌ−６ 及び各インターフェロンは少なくとも約１００００１　Ｕ／ｄ、好ましくは少な くとも１００．０００　１Ｕ／−の？農度で存在する。

（実施例） 以下の実施例は本発明を説明するものであってこれを制限するものではない。

１、０１インヒビターたん白質の単離 クエン酸化した血Ｗ１４００ｄにカッコ内に示した最終濃度となるように以下の ものを混合した；アプロチニン（３３３１Ｕ／ｄ）、ベンズアミジン（０，１■ ／ｍ＞　、１．１０−フェナントロリン（０，０１ｍＭ）及びフェニルメチルス ルホニルフルオライド（１ｍＭ）。

その後この血漿混合物からサルベセン（Ｓａｌｖｅｓｅｎ）等（Ｊ、　Ｂｉｏｌ 。

Ｃｈｅｗ、２６０：２４３２−２４３６　（１９８５）、本公開に参考として引 用されている）の方法に従かいＣＩＩＮＨたん白質を単離し、ドデシル硫酸ナト リウム存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分 析で分子量約１１０．０００ダルトンの実質的に純粋なバンドとして泳動する約 ５ｎ＋ｇの精製ＣＩＩＮＨたん白質を得た。

２、抗−ＣＩＩＮＨ抗体の調製 当分野でよく知られている技術により実施例１に示されているように調製した精 製ＣＩＩＮＨたん白質を用いてヤギを免疫した。

生成したヤギ抗血清を収穫して抗−ヒトＣＩ　ＩＮＨ抗血清を得た。

硫酸アンモニウムによる沈澱により該抗血清から免疫グロブリンを単離した。４ ０％硫酸アンモニウム沈澱を調製し、沈澱化したＩｇＧ抗体を回収して抗−Ｃ１ １ＮＨ１ｇＧ抗体を得た。

実施例１で述べたように調製した精製ＣＩＩＮＨたん白質を製造業者が推薦する 量及び方法を用いＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ（ファルマシアファインケミカル ズ社、アブサラ、スウェーデン）に結合させた。抗−Ｃ１１ＮＨＩｇＧ抗体をセ ファロース結合インヒビターと混合し抗体−インヒビター複合体を形成するのに 十分な時間維持した。抗体−インヒビター複合体中に存在する抗＝ＣＩＩＮＨ抗 体をひきつづく結合複合体含有セファロース結合物の処理により回収し、アフィ ニティー精製抗−ＣＩＩＮＨ抗体を作った。

３、　インビトロでの肝細胞によるＣ１インヒビターの分泌Ａ、インターフェロ ン処理肝臓がん細胞系列により産生されるＣ１インヒビターの検出 アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＨＢ８０６５゜ＨＢ８０６４及びＣ ＲＬ８０２４．ＡＴＣＣ，ロックビル、ＭＤ）から得られるヒト肝臓がん細胞系 列）（ｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ及びアレキサンダーＰＬＣを各々１０％ウシ胎児血 清、Ｌ−グルタミン及び抗生物質を含むＲＰＭ１１６４０培地中で培養した。こ れらの細胞系列の培養物が集密化したとき、培養培地を除去し、０．０１〜ｌ０ ＩＵ／ｄのインターフェロン−ガンマを含む新鮮な培地を各培養物に添加した。

第１図に示した各時点に各々の培養物から培地サンプル（培養物上清）を収穫し 、マイナス２０℃で凍結した。収穫した培地サンプル中の０１インヒビター量を 以下に述べる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。

実施例２に述べてるように調製したリン酸緩衝液−当り２．５マイクログラム（ μｇ）の濃度のアフイニテイ精製ヤギ抗−ヒトＣ１１ＮＨ抗体を含むコーティン グ溶液約１００マイクロリツトルくμｇ）を平底９６六マイクロプレート　（イ ムロン２；ダイナチクラボラトリーズ社、シャンティリー、ＶＡ）のウェルに添 加した。このプレートを６時間４℃に維持し抗体をウェルの壁に吸着させた。そ れからこのコーティング溶液を逆さにして振ることにより除去した。

各ウェルに約１００μｌのプロンキング溶液（０，０５％トウイーン２０を含む ＰＢＳ中５■／−ウシガンマグロブリン、ｌｌ１１ｇ／−ウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）　、１■／　ｍｌゼラチン）を添加した。このプロ７キング溶液をウェ ル中で１６時間４℃に維持し、過剰のたん白質結合部位をブロックした後逆さに して振ることにより除去した。それからウェルを洗浄溶液（０，０５％トウイー ン２０を含むＰＢＳ）で３回洗い未結合たん白質を除した。

血清バッフ７（１ｗ／−ゼラチン、０．８２％ＮａＣ１，０，１ｗ／ｄチメロサ ル、１■／ｄＢｓＡ及び０．０５％トウィーン２０を含む０．ＯＩＭリン酸バフ ファ〕で９：１に希釈した２００μｌの収穫培地サンプルをブロック化ウェルに 添加し、免疫反応混合物を作った。それからこのウェルを１６時間４℃に維持し 免疫反応を起こさせた。その後逆さにして振ることにより免疫反応させたウェル から収穫培地サンプルを除去し、先に述べたようにウェルを３回洗浄した。

モノクローナル抗−ＣＩＩＮＨ抗体をズロー（Ｚｕｒａｗ）等（Ｊ。

ＡＩｌｅｒｇｙ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏ＋、　ユニ　１５５　（１９８４ ）　）によって報告されている方法で調製した。抗−１ｇバッフ７（０，８２％ ＮａＣｌ！、０．１ｍｇ／−チメソサル、５Ｎ／ｓ＋ｆＢｓＡ、及び０．０５％ トウィーン２０を含む０．ＯＩＭリン酸バフファ〕中２μｇ／ｄの濃度モノクロ ーナル抗−ＣＩＩＮＨ抗体を含む約１００μｌ溶液を免疫反応させた各ウェルに 添加し、このウェルを振とうしながら３時間室温に維持した。逆さにして振るこ とによりモノクローナル抗体溶液を除去し、各ウェルを先に述べたように３回洗 浄した。

抗−１ｇバッファで１　：　４０００に希釈したヤギ抗−マウスＩｇＧホースラ ディツシュパーオキシダーゼ結合体（カルタグラボラトリーズ、Ｓ、Ｆ、ＣＡ） を含む約１００μｌの溶液を各ウェルに添加し、このウェルを振とうしながら２ 時間室温に維持した。その後ウェルを逆さにして振ることにより該ホースラディ ツシュパーオキシダーゼ結合体を除去し、先に述べたように３回洗浄してからさ らにＰＢＳで２回洗浄した。

バフフｙ？容液（９４ｍＭ　ＮａｚＨＰＯａ　＋　５３ｍＭクエン酸、ｐＨ４， ６，０、００５％　ＨｚＯｉ）中１■／−濃度の２．２′−アジノージ−３＝エ チルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（シグマケミカル社。

セントルイス、ＭＯ，）を含む約１００μβ発色基Ｎ’４液を各ウェルに加え、 このウェルを振とうしながら２０〜６０分間室温に維持して発色反応産物を形成 させた。各ウェル中の溶液の光学密度をＭＲ６００マイクロプレートリーダー（ ダイナチク、アレキサンドリア、ＶＡ）を用いて読み取り生成したＣＩＩＮＨ含 有免疫反応産物を測定し、これにより各培養培地サンプル中に存在するＣＩＩＮ ＨＩを知ることができる。

上記ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定の結果を第１図に示す。検出されたＣ１１ＮＨ量は精製 ＣＩＩＮＨたん白質を既知量含むサンプルに対して得られた光学密度値と比較す ることにより計算したｉ当りのナノグラム量（ｎｇ）で示される？震度で表わさ れている。全てのＥＬＩＳＡ測定値は２回の測定の平均値が示されている。０． １１　Ｕ／ｍｌ及ヒｏ、ｏ　］　Ｉ　ｖ／−を含むテストした全てのインターフ ェロン−ガンマ濃度においてＨｅｐＧ２細胞から分泌されるＣＩＩＮＨＩは非刺 激化培養物から自然に分泌される値よりも高かった。この研究の結果はＨｅｐＧ ２細胞培養物へのインターフェロン−ガンマの添加は細胞から分泌されるＣＩＩ ＮＨＩの投与量依存的増加をもたらすことを示している。

インターフェロン−ガンマ刺激化Ｈｅｐ３Ｂ細胞由来の収穫培地サンプルを用い た場合上述のＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定において同様の結果が得られた。第２図に示し たようにインターフェロン−ガンマはＨｅｐ３Ｂ細胞から分泌されるＣＩＩＮＨ Ｉを増加させる。

インターフェロン−ガンマで刺激したアレキサンダーＰＬＣ細胞に由来する収穫 培地サンプルを用いた場合、上述のＥＬ　Ｔ　ＳＡ検定においてＣＩＴＮＨ分泌 の増加が観測された。しかし、１００１　Ｕ／　ｗｅのインターフェロン−ガン マを伴う３日間培養後に分泌されるＣＩＩＮＨレベルは累積濃度１３６ｎｇ／− であったが、これに比してインターフェロン−ガンマ非存在下の培養に由来する 自然に生成されるＣ１１ＮＨレベルは９５ｎｇ／−である。これらの結果はイン ターフェロン−ガンマで刺激したときＨｅｐ３Ｂ細胞及びアレキサンダーＰＬＣ 細胞の両方ともＣＩＩＮＨの分泌を増加させることを示している。

Ｂ、インターフェロン及びＩＬ−６で処理した肝臓がん細胞系列によえ生成され るＣ１インヒビターの検出実施例３Ａで述べているようにインターフェロン−ガ ンマを添加する代りに培養物に１００１０／−の濃度のインターロイキン−６（ ＩＬ−６，大阪大学から入手、大阪９日本）を添加したとき、Ｈｅｐ３Ｂ細胞及 びＨｅｐＧ２細胞の両方においてＣＩＩＮＨ分泌に同様であるが、より低い増加 が見られる。第２図参照。

ＩＬ−６刺激によるＣＩＩＮＨ分泌の投与量応答性も）（ｅｐＧ２培養物にイン ターフェロン−ガンマの代りにＩＩＵ／−から１００ＩＵ／−のＩＬ−６を添加 し、その分泌されたＣＩＩＮＨを実施例３Ａで述べられているＥＬ　Ｉ　ＳＡ検 定法により測定することにより示された。第３図に示されているように、ＩＬ− ６はＨｅｐＧ２細胞により分泌されるＣＩＩＮＨ量を投与量依存的に増加させる 。

ＨｅｐＧ２細胞培養にインターフェロン−ガンマ及びＩＬ−６の両方を同時に添 加することによりＣＩＩＮＨ分泌に付加的効果が現れる。ＨｅｐＧ２細胞を刺激 する実施例３Ａの操作につづいてその細胞培養物を（１＞　ｌｉ当り０から１０ ０ＯＩＵの種々の量のインターフェロン−ガンマ及び（２）　１ｒｎＩ！当り１ ００ＩＵの一定量のＩＬ−６、両方を含む新鮮な培地で刺激した。それから収穫 培地サンプル中の０１インヒビター量を実施例３Ａで述べられているＥＬＩＳＡ 検定法で測定した。第４図に示されているように、この結果はＩＬ−６の添加は 、インターフェロン−ガンマの投与量とは無関係に１ｄ当り約４０ｎｇという比 較的一定に０１インヒビタ一分泌レベルを増加させることを示している。

したがって、好ましい態様において、本発明の方法には、治療効果量のインター フェロンの投与とともに０１インヒビタ一濃度増加量のＩＬ−６の投与が含まれ る。

Ｃ，インターフェロン又は他のサイトカインで処理したヒトの初期肝細胞により 生産されるＣ１インヒビターの検出ヒト初期肝細胞を新鮮な肝臓生検から単離し 、初代培養物を作った。この培養物を種々のサイトカインで刺激し、その培養物 を第１表に示されている時間維持した後培養上清を収穫した。各培養上清中に分 泌されたＣ１インヒビター量を実施例３Ａで述べているＥＬＩＳＡを使用して測 定した。この実験の結果は第１表に示されており、またそれはＣＩＩＮＨは約４ ４時間後インターフェロンーガンマ刺激化初期肝細胞から分泌され、またその後 ＣＩＩＮＨレベルが増加しつづけることを示している。さらにこの結果は初期肝 細胞からのＣＩＩＮＨ分泌はＩＬ−６おより腫瘍壊死因子アルファ　（ＴＮＦ） により刺激を受けることを示している・第　１　表 インビトロにおけるヒトの初期肝細胞によるＣＩＩＮＨ分泌１Ｃ１■ＮＨＸ゛Ｉ ・ 對檄月２　■−肚　■−肚　■−敗　１一旦　土一旦Ｎｏｎｅ　ＯＯ０００ ｒＦＮ　０　０　１．０７　１．５１　３．９８ＩＬ−６００００，４５０，６ ９ ＬＰＳ　Ｏ００００ ＩＬ−１’０　０　０　０　０ ＴＮＦ　Ｏ０００，４２１，２１ １、初期肝細胞によるＣＩＩＮＨ分泌はたん白質濃度（ｎ　ｇ　／　ｍｌ　）で 表わされている。

２．１ＦＮは５０１Ｕ／−で添加したインターフェロン−ガンマを示している。

ＩＬ−６は５０１Ｕ／−で添加したインターロイキン−６を示している。ＬＰＳ は１１００ｎ／ｍｌ！で添加したリボ多糖（シグマ）を示している。ＩＬ−１は ２０ｎｇ／−で添加したＣ。

ジナレロ（Ｄｉｎａｒｅｌ　ｌｏ）博士（タフツ大学、ボストン、、ＭＡ）から 入手したインターロイキン−１を示している。ＴＮＦは２０ｎｇ／−で添加した 、Ｈ，シェパード（Ｓｈｅｐａｒｄ）博士（ジエネテク社）から入手した腫瘍壊 死因子アルファを示している。

Ｄ、ＣＩゼインビターの放射能免疫沈降実施例３Ａで述べているように培養した コントロールＨｅｐＧ２細胞及び１００１０／−インターフェロン−ガンマ処理 ＨｅｐＧ２細胞をＰＢＳで３回洗浄し培養培地を除去した。その培養物をさらに ２％ＦＢＳ及び４０μＣｉ／ｍ”Ｓ−メチオニン（ＮＥＣ−００９丁。

ニューイングランドニュークリア社、ボストン、ＭＡ）を含む無メチオニン培養 培地中で２４時間培養した。その後この培地を採取し遠心して標識化培養上清を 得た。

実施例３Ａで述べているように調製したモノクローナル抗−ＣＩ　１ＮＨ抗体サ ンプルを業者の推薦する方法を用いてセファロース４Ｂビーズ（ファルマシア） に結合させた。１ｍ化培養上清１００又は２５０μｌをリン酸緩衝液（ＰＢＳ） 中のセファロース−結合ビーズ５０％（ν／Ｖ）サスペンション４０μｌと混合 し、トミーのＭＴ−３００で緩やかに振とうしながら１時間室温に維持して免疫 反応ビーズを生成させた（ペニンスララボラトリーズ。

ベルモント、ｃＡ）。

この免疫反応後、ビーズをＰＢＳ−）ウィーン（０，０５％トウィーン２０を含 むＰＢＳ）で１０回洗浄して非吸着たん白質を全て除去した。それからこのビー ズをサンプルバッファ　（０，０６２５Ｍトリス、ｐＨ６，８，３％ＳＤＳ、１ ０％グリセリン、およびブロモフェノールブルー）に懸濁し、この懸濁ビーズを 沸騰する湯浴で５分間加熱した。次にこの懸濁ビーズを遠心し、その上清を採取 した。該上滑を７．５％ポリアクリルアミドスラブゲルにかけレムリ（Ｌａｅｍ ｎｌｉ）等の方法（Ｎａｔｕｒｅ、２２ユニ　６８０−’６８５　（１９７０） ）に従って電気泳動して免疫吸着たん白質を分離した。電気泳動後ゲルを乾燥し て過剰の湿気を除きＸ線フィルムを感光させてオートラジオグラフを作った。

このオートラジオグラフを第５図に示す。このオートラジオグラフは分子量約１ １０キロダルトン（Ｋ）のたん白質として泳動するＣＩＩＮＨはＣ１インヒビタ ー増加量のインターフェロン−ガンマで処理したＨｅｐＧ２細胞により分泌され たことを示している。コントロール細胞は７日後になって検出可能となる非常に 低いレベルのＣＩＩＮＨを分泌することが分ったが、インターフェロン−ガンマ 処理細胞は処理かられずか２４時間以内に大量のＣ１１ＮＨを分泌した。このデ ータはインターフェロン−ガンマはインビトロ）ｌｅｐＧ２細胞を刺激し、ＣＩ ＩＮＨを合成させることを示している。

４、急性応答を示す患者中の血清ＣＩＩＮＨレベル３８人の患者からの血清を入 手し、各々を血清たん白質電気泳動プロファール（ＳＰＥＰ）と呼ばれるルーチ ンで標準化された臨床実験操作でスクリーニングした。１９個の５ＰＥＰスクリ ーニング血清は従来の急性応答を示すアルファ、−プロティナーゼインヒビター の増加を示し、残りの１９個の血清は通常のアルファ、−プロティナーゼインヒ ビターレベルを示した。

また同じ３８個の血清をニックｘ　（Ｎｉｔｓｃｈｅ）等（Ａｍｅｒ、　Ｊ、Ｃ ｌ１ｎ。

Ｐａｔｈ、）７６　：　５　（１９８１）　）により報告されているロケット免 疫電気泳動（ＩＥ）操作によりスクリーニングしそれらのＣｌ１ＮＨレベルを測 定した。実施例２で述べたように調製した抗＝ＣＩＩＮＨＩｇＧ抗体をバルビダ ールバッファ（０，０４Ｍ／＜ルビタール、０．０５％アジ化ナトリウム、１０ ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、ｐＨ８，６）で１０＝１に希釈し 、ついでバルビッールバッファ中の１．８％（Ｗ／Ｖ）アガロース溶液で１：１ に混合してニッシェ（Ｎｉ　ｔｓｃｈｅ）等（上述）の方法に従かい抗体含有ア ガロースプレートを作った。患者の血清サンプルをバルビタールバッフ１３：１ に希釈し、その希釈サンプル１０μｌを抗体−アガロースプレートに穴をあけた ウェルに入れてこのサンプルを電気泳動した。

電気泳動したＲＴＥプレート上の生成した沈降アーク（ロケット）を含む領域を モデル上−２０補償ボーラープラニメータを用いた面積測定により測定した（ロ サンジェルスサイエンティフインクインスツルメントカンパニー、ロサンジエル ス、ｃＡ）。

血清サンプル中のＣＩＩＮＨ濃度を実施例１で述べたように調製した既知量の精 製Ｃ１インヒビターを含む一連の希釈溶液を用いて得られたロケット面積と比較 することによりロケット面積測定から測定した。急性応答を示す患者に由来する １９個の血清のＣＩＩＮＨ平均レベル（平均［Ｃ１１ＮＨ）：　３５．１±５． ６■／デシリツトル（ｄｌ））は１９個の正常な血清で測定された平均Ｃ１１Ｎ Ｈレベル（（ＣＩ　ＩＮＨ）：　２６．３±４．１■／ｄりと比較して有意に大 きかった。

これらの結果はＣＩＴＮＨたん白質レベルがアルファ、−ブロティナーゼインヒ ビターレベルと相関することを示している。アルファ、−プロティナーゼインヒ ビターは急性応答の主要成分であることからこの相関関係はＣＩＩＮＨそれ自身 が急性たん白質であることを示している。

５、　インビボにおけるインターフェロン−ガンマによるＣ１インヒビターの増 加 慢性肉芽腫症（ＣＯＤ）患者に２４時間間隔の皮下注射で組換えインターフェロ ン−ガンマ（ジェネテク社）２百万ＩＵを投与した。最初の注射の直前および最 初の注射後第２表に指示した時間に患者から血漿サンプルを採取した。また注射 を受けていないコントロール供与者からも血清サンプルを採取した。

希釈血清サンプルのウェルに未希釈血漿サンプルを添加すること以外実施例４で 述べたロケット免疫電気泳動（ＲＩ　Ｅ）を用いてＣＯＤ患者の１人（患者Ａ） 及びコントロール供与者由来の血清サンプルを分析しＣＩｒＮＨｔＭ度を測定し た。

患者Ａ及びコントロール供与者の血漿のＲＩＢ分析結果を第２表に示す。

第２表 インビボにおけるＣ１インヒビターに関するインターフェロン−ガンマの効果の ＲＴＦ分析 注射前”　１００　２３７ １８時間　１３７　２５１ ４８時間　１６６　２３１ １２０時間　１９９　ＮＴ’ １、　血漿レベルは注射前の患者Ａに関して検出された量を１００としてその相 対値が示されている。

２、　“注射前”とはサンプルをインターフェロン−ガンマの最初の注射の直前 に得たことを示している。

３、Ｎ、Ｔ、　とはこの条件のサンプルをテストしなかったことを示している。

第２表にみられるように注射後患者への血１ｃ１１ＮＨレベルは連続的に上昇し 、一方コントロール供与者の血漿のＣＩＩＮＨレベルは比較的一定のままであっ た。この結果はインターフェロン−ガンマがインビボで、愚者のＣＩＩＮＨ血管 内濃度を増加させうろことを示している。

またｃ　Ｇ　Ｄ　患者の血漿サンプルをブロック化ウェルに添加する直前に血清 バッファで８．０００：１に希釈すること以外実施例３Ａで述べられているＥＬ 　Ｉ　ＳＡ検定法によりそのＣＩＩＮＨレベルを分析した。ＣＯＤ患者の血漿サ ンプルのＥＬＩＳＡ分析の結果を第３表に示した。

第３表 血管内ＣＩＩＮＨに関するインビボにおけるインターフェロン−ガンマの効果の ＥＬＩＳＡｌｊ？注射前２　９８　１０３　１４０ １４時間　１７７ １　日　１０５　１９３ ３　日　１０６ ４　日　１５０ １、　このデータ血漿中に存在するＣＩＩＮＨを８ｇ　／　ｄ　ｔ１４度で表わ されている。

２、　“注射前２はサンプルをインターフェロン−ガンマの最初の注射の直前に 得たことを示している。

３、　“Ａ”は第２表で述べたものと同じインターフェロン治療処置を受けた同 じ患者を示している。

この結果は皮下注射によるインターフェロン−ガンマ投与後ＣＯＤ患者の血管内 ＣＩＩＮＨが増加することを示している。

４人のリューマチ関節炎患者に皮下注射により週に１度２百万ＩＵＯ組換えイン ターフェロン−ガンマ（アムゲン）を投与した。

最初の注射の直前および患者に応じ注射後的２〜４週開目に血漿サンプルを採取 した。それから血漿サンプルをＣＧＤ患者サンプルについて上述したＲＩＥによ り分析した。

４人のリューマチ関節炎患者由来の血漿サンプルを用いて得られた結果を第４表 に示す。

第４表 リューマチ関節炎患者におけるインビボでのＣＩインヒビターに関するインター フェロン−ガンマのＲＩＥ分析注射前”　１．５４６　１．４３８　１．０５３ 　１．３８１注射後３２．１３４．　１゜７０３　１．７０２　１．６８９１、 数字は指示された時間に患者Ａ−Ｄから得た血漿サンプルに関しプランメーター で測定したＲＩＥロケットの表面積を示している。

２、″注射前”とはサンプルをインターフェロン−ガンマの注射直前に採取した ことを示す。

３、　“注射後”とはサンプルを患者に応じてインターフェロン−ガンマの最初 の注＃！ｉ後２〜４週間目に採取したことを示している。

この結果はインターフェロン−ガンマの注射を受けた全ての患者の血管内Ｃ１イ ンヒビター濃度が増加していることを示している。

これまで述べてきた事項は本発明を説明するものであって、これを制限するもの ではない。本発明の精神および範囲を逸脱することなしに多くの変化および修正 を行ない得る。

ＣＩＩＮＨ（ｎｇ／ｍリ　− １日月　３日月　１日月　３日目 ＦＩＧ、　２ Ｃ１１ＮＨ（ｎｇ／ｍｌ） Ｃ１１ＮＨ（ｎｇ／ｍｌ） コントロール　ＩＦＮγ 日　：１　３　５　７　１　３　５　７ＦＩＧ、５ 国際調査報告 １ｍｍｗＭＩ　Ａ＋ｔ″′１ｔｅａｌｌｅｅ　Ｎｏ、　、、、、、、ｑ、、、、 。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃ１インヒビター濃度増加量のインターフェロン−ガンマを患者に投与する ことを含む血液障害の緩和的治療法。
2. ２．前記インターフェロン−ガンマの量が、患者血中のＣ１インヒビター濃度を 少なくとも１０パーセント増加するのに十分な量である請求項１記載の治療法。
3. ３．前記量のインターフェロン−ガンマが皮下注射で投与され、かつその範囲が 前記患者の体表面積Ｍ２当り１〜４×ｌＯ６ＩＵである請求項１記載の治療法。
4. ４．請求項１記載の方法において、さらにＣ１インヒビター濃度増加量のインタ ーロイキン−６を投与することを含む方法。
5. ５．患者の血液を補綴装置を通して循環させる治療法であって、該装置の補綴表 面に該血液を接触させるのと実質的に同時に該患者にＣ１インヒビター濃度増加 量のインターフェロン−ガンマを投与することを含む方法。
6. ６．前記量のインターフェロン−ガンマが皮下注射で投与され、かつ前記患者の 体表面積Ｍ２当り１〜４×ｌ０６ＩＵの範囲にある請求項４記載の治療法。
7. ７．前記装置の補綴表面に前記血液を接触させる前４時間から４８時間以内に前 記量のインターフェロン−ガンマを投与する請求項４の治療法。
8. ８．前記補綴装置が、以下のもの： （ａ）心臓肺補装置、 （ｂ）血液透析装置、 （ｃ）動脈補綴物、 （ｄ）静脈補綴物、及び （ｅ）動脈−静脈シャント、 からなる群から選ばれる請求項４記載の治療法。
9. ９．請求項５記載の方法において、さらにＣ１インヒビター濃度増加量のインタ ーロイキン−６を投与する方法。
10. １０．外科的に誘導される血液障害の緩和的治療法であって、患者に侵害的外科 操作を行うのと実質的に同時にＣ１インヒビター濃度増加量のインターフェロン −ガンマを投与することを含む治療法。
11. １１．請求項１０記載の方法において、さらにＣ１インヒビター濃度増加量のイ ンターロイキン−６を投与することを含む方法。
12. １２．患者に侵害的外科手段を行う方法であって、該患者の血中Ｃ１インヒビタ ー濃度を少なくとも１０パーセント増加させるのに十分な量のインターフェロン −ガンマを皮下注射投与することを含み、該投与を心臓肺補助装置の補綴表面に 該患者の循環血液が接する４時間から１２０時間前に行う方法。
13. １３．患者に血液透析する方法であって、血液透析装置の補綴表面に患者の循環 血液が接する４時間から１２０時間前に、該患者の血中のＣ１インヒビター濃度 を少なくとも１０パーセント増加するのに十分な量のインターフェロン−ガンマ を投与することを含む方法。
14. １４．Ｃ１インヒビター欠乏症の臨床的症状を示す患者のＣ１インヒビター血管 内濃度を増加する方法であって、該患者に治療効果量のインターフェロン−ガン マを投与することを含む方法。
15. １５．請求項１４記載の方法において、さらにＣ１インヒビター濃度増加量のイ ンターロイキン−６を投与することを含む方法。
16. １６．患者の血液障害の緩和的治療法であって、該患者にＣ１インヒビター濃度 増加量のインターロイキン−６を投与することを含む治療法。
17. １７．患者の血液を補綴装置に循環させる治療法であって、該装置の補綴表面に 該血液を接するのと実質的に同時に該患者にＣ１インヒビター濃度増加量のイン ターロイキン−６を投与することを含む方法。
18. １８．外科的に誘導された血液障害の緩和的治療法であって、患者に侵害的外科 操作を行うのと実質的に同時にＣ１インヒビター増加量のインターロイキン−６ を投与することを含む方法。
19. １９．Ｃ１インヒビター欠乏症の臨床的症状を示す患者の血管内Ｃ１インヒビタ ー濃度を増加させる方法であって、該患者に治療効果量のインターロイキン−６ を投与することを含む方法。