JP2006516537A - 血管新生および抗血管新生療法のための標的 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年11月7日に出願された米国特許仮出願第60/425,018号の利益を請求するものであり、この出願はその全体が本明細書に参照として組み入れられる。
本開示は、血管新生に影響を及ぼすペプチドおよび薬学的組成物などの組成物の使用に関する。特定の方法は血管新生を促進するために有用であるが、他のものは特に血管新生を阻害するために有用である。
血管新生は、既存の血管から血液血管系ネットワークを発達させるプロセスであるが、これは固形腫瘍の成長に必須であり、通常の創傷治癒および成長プロセスの構成要素である。これは、アテローム発生、関節炎、乾癬、角膜の新血管形成、および糖尿病性網膜症を含む、多くの疾患および状態の病態生理にも関与している。
本開示は、プレプロアドレノメジュリンの翻訳後プロセッシングにより生じる20個のアミノ酸分子であるプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)が、その低血圧性および血管拡張性の作用に加え、強力な血管新生因子として機能するという発見を利用している。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)のような他の公知の血管新生因子と比較して、PAMPはモルベースで100万倍強力であると推定される。
I.略号
aFGF:酸性線維芽細胞増殖因子
bFGF:塩基性線維芽細胞増殖因子
CABG:冠動脈バイパス移植手術
GLP-1:グルカゴン様ペプチド-1
IL-8:インターロイキン-8
KLH:キーホールリンペットヘモシアニン
MMP2:メタロプロテイナーゼ2
MMP9:メタロプロテイナーゼ9
PAMP:プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PTCA:経皮経管冠動脈形成術
PVD:末梢血管疾患
VEGF:血管内皮細胞増殖因子
特に指定しない限り、技術用語は通常使用されるように使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Benjamin Lewin、「Genes V」Oxford University Press、1994(ISBN 0-19-854287-9);Kendrew et al.(eds.)、「The Encyclopedia of Molecular Biology」、Blackwell Science Ltd.、1994(ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (ed.), 「Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference」、VCH Publishers, Inc.、1995(ISBN 1-56081-569-8)に認めることができる。
第一の態様は、組織における血管新生を誘導する方法である。この方法は、配列番号:4で示されたペプチド、または配列番号:4と少なくとも90%の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片の有効量を組織へ導入し、これにより組織における血管新生を誘導する段階を含む。この方法の一部の例において、変種または断片は、配列番号:4と少なくとも95%の配列同一性を有するのに対し、他の例においては、ペプチドは配列番号:4に示されたペプチドである。この方法の一部の例において、組織は、移植片、心臓組織、血管、創傷、または冠動脈である。具体例において、移植片は皮膚または臓器移植片である。
プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)は、プレプロアドレノメジュリンの翻訳後プロセッシングから生じる20アミノ酸のペプチド分子である(例えば、Ishimitsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 203,631-639,1994参照)。PAMPは、脳、下垂体、および副腎を含む多種多様な哺乳類の組織において検出されている。
最適には、PAMPに対する抗体は、そのペプチドを特異的に検出するか、またはPAMPの血管新生活性を阻害するであろう。PAMPを特異的に検出する抗体は、PAMPペプチドを認識して結合し、生物学的試料中の他の蛋白質またはペプチドは実質的には認識または結合しないであろう。抗体がその標的蛋白質を特異的に検出することの決定は、多くの標準イムノアッセイ法のいずれかにより行われる。例えば、ウェスタンブロット法(Sambrook et al., In Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989)。
PAMPペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilsteinの古典的方法(Nature, 256:495,1975)またはその派生法に従って、マウスのハイブリドーマから調製することができる。簡単に述べると、選択された蛋白質の数μgを数週間の間マウスに反復接種する。その後このマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾臓細胞を、ポリエチレングリコールによりマウス骨髄細胞と融合し、過剰な非融合細胞を、アミノプテリンを含有する選択培地(HAT培地)上でこのシステムを増殖させることにより破壊する。うまく融合された細胞を希釈し、希釈物のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに配置し、培養物の増殖を継続する。抗体産生クローンを、Engvallにより最初に説明されたような(Enzymol., 70:419,1980)ELISAおよびその派生法などのイムノアッセイ手法により、ウェル内の上清液中の抗体の検出により同定する。選択された陽性クローンを増殖し、それらのモノクローナル抗体産物を収集して使用することができる。モノクローナル抗体産生に関する詳細な手法は、HarlowおよびLane(Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988)に説明されている。
単一蛋白質の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清は、未修飾でも、免疫原性を増強するように修飾されていてもよい発現蛋白質で適当な動物を免疫処置することにより調製することができる。効果的なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の両方に関連した多くの因子により影響を受ける。例えば、小分子は他のものよりも免疫原性が少ない傾向があり、担体およびアジュバントの使用を必要かもしれない。また、宿主動物の接種部位および投与量に対する応答は変動し、抗原の量が不十分であるか過剰であるかのいずれかにより低力価の抗血清を生じる。複数の皮内部位への抗原の少量投与(ngレベル)が最も信頼できるようである。ウサギに有効な免疫処置プロトコールは、Vaitukaitisら(J. Clin. Endocrinol. Metab., 33:988-991,1971)に見ることができる。
PAMPペプチドに対して抗体を作製する第三のアプローチは、PAMPのアミノ酸配列を基にして市販のペプチド合成装置上で合成された合成ペプチドの使用である。
単なる例として、PAMPペプチドに対するポリクローナル抗体を、化学的に合成されたペプチドをウサギに注射することによって周知の技術により作成することができる。
PAMPペプチドを発現するDNAベクターをマウスなどの実験動物へ皮下注射することにより、PAMPペプチドに対する抗体を作製してもよい。組換えベクターの動物への送達は、Tangら(Nature, 356:152-154,1992)に説明されたように携帯型Biolisticシステム(Sanford et al., Particulate Sci. Technol, 5:27-37,1987)を用いて行うことができる。この目的に適した発現ベクターとしては、ヒトβ-アクチンプロモーターまたはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターのいずれかの転写制御下でPAMPペプチドをコードする配列を発現するものを挙げることができる。
A.配列変種
本明細書に開示されるペプチドの血管新生または抗血管新生特性は、正確なアミノ酸配列にあるわけではなく、DNA配列によりコードされたアミノ酸配列に固有の三次元構造による。正確なアミノ酸配列を再現することは必要ではなく、三次元構造を再現することにより、これらペプチドの任意の結合特性、例えばPAMPの結合特性を再現することが可能である。これは、三次元構造をコードしているが、例えば遺伝暗号の縮重のために異なる核酸配列をデザインすることにより実現することができる。同様にDNA配列も変動しうるが、機能的血管新生または抗血管新生ペプチドを生じうる。
本開示は、本開示のPAMPおよびPAMPインヒビターペプチドの作用を模倣する生物学的活性分子を含む。本開示のペプチドは、本明細書に説明される天然のペプチドの合成態様に加え、PAMP受容体に特異的に結合するこれらのペプチドのアナログ(非ペプチド有機分子)、誘導体(開示ペプチド配列から出発して得られた化学的に機能化された蛋白質分子)、および変種(ホモログ)を含む。本開示の各ペプチドはアミノ酸配列により構成され、天然およびそうではないL-および/またはD-アミノ酸のいずれかでありうる。
本開示は、PAMPおよびPAMPインヒビターの融合蛋白質を含む。融合蛋白質は、天然には一緒に結合しては認められない2種のアミノ酸配列を含む蛋白質である。PAMP融合蛋白質は具体的には少なくとも(1)配列番号:4に示されたアミノ酸配列、または配列番号:4と90%または95%の配列同一性を共有する配列と(2)配列番号:4に示されたアミノ酸配列、または配列番号:4と90%または95%の配列同一性を共有する配列の末端または内部のいずれかに配置されたペプチド部分とを含む。このようなPAMP融合蛋白質は加えて、このようなペプチド部分間にリンカーなどの他の蛋白質エレメントを含むことができる。
以下の説明は、例えばPAMP、PAMPの誘導体およびアナログ、ならびにその血管新生活性のインヒビターもしくはインヒビターと推定されるものの存在下でのPAMPの血管新生活性を測定するのに有用であるであろう血管新生アッセイの例を提供する。当業者は、他の血管新生アッセイも使用することができることを認めるであろう。
これは、通常は無血管の角膜の新血管形成を促進する定義された物質の作用を辿るための「最も基準になる」方法である。血管新生または抗血管新生活について試験される物質は、およそ1〜2μl容量の不活性ハイドロンペレット中に徐放形態で固定される。このペレットは、麻酔をかけたC57BLマウス(またはウサギ)の角膜上皮の、微小切開により形成されたポケット中に移植される。5〜7日間にわたって、血管新生因子は、隣接する血管を有する角膜縁の血管の内方成長を刺激する。写真記録はスリットランプ写真により作成される。これらの血管の外観、密度、および広がりが評価され、スコア化される。場合によっては、進行の時間経過を、麻酔をかけた動物において辿り、その後屠殺する。血管は、長さ、密度、およびそれらが出現する縁の放射状表面(時計の文字盤の時刻として表される)について評価される。
規定量の被験試薬を含浸した不活性バイオポリマースポンジが、皮下組織中に作成されたポケットに経皮切開により皮下移植される。その後5〜15日間の範囲の所定の期間経過後にスポンジは取り除かれ、新規血管形成が多くの生化学的および組織形態測定学的パラメータにより定量化される。スポンジの一部は、VEカドヘリン、FLK-1受容体などの内皮細胞に制限された遺伝子産物のウェスタンブロットにより抽出および分析されうる。同じ試料の凍結切片の一部は、同様の抗原について免疫組織化学により評価され、発現レベルはスポンジを侵襲した新規血管内に含まれる内皮細胞蛋白質を反映していることが確認される。マウス角膜ポケットアッセイと共に、腹腔内または静脈内経路による推定血管新生インヒビターの全身投与は、様々な微小血管床における血管新生刺激に対するこれらのインヒビターの局所作用の評価および比較を可能にする。
CAMアッセイは、鶏胚絨毛尿膜(CAM)中で血管新生および抗血管新生の定量を可能にする。簡単に述べると、鶏卵は、インキュベーションの2または3日目に窓が開けられ、この窓は、テープ、ワックス、ガラススライド、またはパラフィルムで封をされる。インキュベーション8日目に、この窓が開けられ、小さいスポンジまたはゼラチン片が、成長しているCAMの上に置かれる。
シリコーンチューブ(外径0.15mm、New Age Industries, Southampton, PA)は、長さ1cmに切断され、各チューブの片端は液体シリコンで封止され、24時間乾燥され、その後オートクレーブにかけられる。被験物質の希釈液が、滅菌した冷エッペンドルフチューブ内のマトリゲル中に調製される。チューブはHamiltonシリンジで満たされる。ヌードマウスに麻酔をかけ、ポケットが各動物の背側皮膚内に形成される。その後チューブが、開放端を先にして移植され、その後創傷が閉じられる。
本明細書に説明される血管新生および抗血管新生ペプチドならびにPAMPインヒビターは、治療または予防される疾患の位置および種類に応じて様々な方法で製剤化されうる。このように、患部または患部近傍での局所使用のため、および全身使用のため(物質は心臓血管系により広範に散在される方法で投与される)の両方のための薬学的組成物が提供される。本開示はその範囲内に、ヒトまたは獣医学的医薬に使用するために製剤化された少なくとも1種の血管新生ペプチド(例えば、PAMP)もしくは抗血管新生ペプチド、またはPAMPインヒビターを含む薬学的組成物を含む。血管新生および抗血管新生ペプチドならびにPAMPインヒビターは典型的にはヒト対象を治療するために使用されるが、これらは、他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの他の脊椎動物における同様のまたは同一の疾患を治療するために使用することもできる。
A. PAMPによる疾患または状態の治療法
冠動脈疾患、脳虚血、創傷、または末梢血管疾患を有するまたは発症のリスクのある対象における領域内の血管新生を促進する方法が、本明細書に開示される。本方法は、治療領域へ治療有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)を導入し、これによって対象における血管新生を促進する段階を含む。一部の態様において、PAMPは、例えば虚血性組織へVEGFを送達するために使用されるプロトコールを使用して、そのペプチドをコードしている裸のDNAとして投与される(例えば、Isner, et al., J. Vasc. Surg., 28:964-975,1998;Losardo et al., Circulation, 98:2800-2804,1998参照)。
有効量のPAMPペプチドまたはペプチドをコードしているDNAは、単回投与量、または複数回投与量で、例えば治療期間中に毎時、毎日、または毎週投与することができる。
本明細書において、腫瘍、網膜症、乾癬、子宮内膜症、もしくは関節炎を有するまたは発症のリスクがある対象の領域において血管新生を阻害する方法が開示される。本方法は、治療有効量のPAMPインヒビターをこの領域に導入し、これにより対象における血管新生を阻害する段階を含む。一部の態様において、PAMPインヒビターは、VEGFを虚血性組織に送達するために使用されるプロトコールを用い、このペプチドインヒビターをコードしている裸のDNAとして投与される(例えば、Isner, et al., J. Vasc. Surg, 28:964-975,1998;Losardo et al., Circulation, 98:2800-2804,1998参照)。
本開示は、下記の非限定的な実施例により例証される。
実施例1:血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、アドレノメジュリン(AM)、およびプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)の血管新生能の比較
本実施例は、公知の血管新生因子と比較してPAMPの血管新生能を測定するための、定方向インビボ血管新生アッセイ(DIVAA;Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 94:1226-1237,2002参照)の使用説明を提供する。
インプラントは下記のように調製した:シリコーンチューブ(外径0.15mm、New Age Industries, Southampton, PA)を長さ1cmに切断した。各チューブの片端を液体シリコンで封止し、24時間乾燥してフューム(fume)を発散させた。チューブをオートクレーブにかけた。
ヌードマウスにケタミンおよびキシラジン(比1:4)を、マウス1匹につき50μlを皮内的に用い、麻酔をかけた。はさみで各動物の背側皮膚にポケットを形成した。チューブを開放端を先にして移植した。その後創傷を手術用クリップで封鎖した。マウスは、意識が回復するまで暖かさを保った。その後マウスを9〜11日間飼育した。
マウスを加熱用ランプの下に置き、それらの尾静脈を拡張させた。尾静脈に、FITC-デキストラン(Sigma)25mg/mlを100μl/マウスとなるよう注射した。約20分後、色素が分布した。その後マウスをCO2で安楽死させ、皮膚ポケットを除去し、PBSで湿らせた布の中に保存した。
表2、図1、および図2に示したように、PAMPは、VEGFまたはAMのいずれよりも有意により強力な血管新生因子であった。
本実施例は、PAMPは非常に強力な血管新生因子であり、VEGFおよびAMなどの他の古典的プロ血管新生因子よりも6桁低い濃度で、動物モデルにおいて新血管形成を誘導することができることを明らかにしている。この実施例はまた、ヒト微小血管内皮細胞はPAMPの受容体を有し、マトリゲルアッセイにおいて、それらの遊走および索(cord)形成を増加することにより、これに反応することも明らかにしている。加えて本実施例は、PAMP刺激が内皮細胞における古典的血管新生因子の発現を誘導すること、およびカルボキシ末端ペプチド断片PAMP(12-20)が、PAMPで誘導された血管新生のインヒビターとして作用し、腫瘍進行の異種移植片モデルにおいて腫瘍増殖を遅延することができることも示している。
化学物質
合成ヒトAM、PAMP、およびPAMP(12-20)は、Bachemから購入した。組換えヒトVEGFおよびbFGFは、R&D Systemsから入手した。
鶏胚大動脈弓アッセイは、エクスビボ血管新生アッセイであり、既に説明されているように行った(Isaacs, et al., J. Biol. Chem., 16;277(33):29936-44,2002;Auerbach et al., Clin. Chem., 49,32-40,2003)。簡単に述べると、長さ約0.8mmの大動脈リングを13日齢の鶏胚(Truslow Farms)の五つの大動脈弓から調製し、外膜層の軟結合組織をピンセットで慎重に取り除いた。各大動脈リングを、48ウェルプレートのウェルの中央に配置し、マトリゲル(BD Biosciences)10μlで覆った。マトリゲルが固化した後、適切な濃度の被験物質を含み増殖因子を含まないヒト内皮SFM基本増殖培地(Invitrogene)300μlを、各ウェルに添加した。これらのプレートを、湿潤インキュベーター中に37℃、5%CO2で24〜36時間維持した。各大動脈リングから出芽する微小血管を倒立顕微鏡で写真撮影し、新たに形成された毛細血管で覆われた領域を画像解析により見積もった。
血管新生の分析および定量は、既に説明されているDIVAA(Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst, 21;94(16):1226-37,2002;Guedez et al., Am. J. Pathol., 162,1431-1439,2003)を用いて行った。簡単に述べると、長さ10mmの片端だけが開いている手術用シリコーンチューブ(アンギオリアクター)に、20μlのマトリゲル単独、またはAM、bFGF、VEGF、PAMP、および/もしくはPAMP(12-20)との混合物を指定された濃度で充填した。ヒト肺癌細胞株(下記参照)も、マトリゲル単独またはPAMP(12-20)と一緒に、1個のアンギオリアクターにつき10,000細胞で予め混合した。マトリゲルが固化した後、アンギオリアクターを、麻酔をかけた無胸腺ヌードマウスの背側脇に移植した(NCIコロニー)。11日後、マウスに25mg/ml FITC-デキストラン(100μl/マウス、Sigma)を静脈内注射し、20分後、アンギオリアクターを取り出した。これらのインプラントの写真を、血管新生反応の目視検査のために撮影した。アンギオリアクター内の新血管形成の量は、インプラント中に捕獲された蛍光の量として決定し、HP分光光度計(Perkin Elmer)により測定した。
ヒト皮膚微小血管内皮細胞をCell Applications, Inc.から入手し、96ウェルプレート中、1.0x105個細胞/ウェルで培養した。細胞に蛍光色素FLIPR(Molecular Devices)を室温で60分間負荷し、その後分析のためにFlexStation II(Molecular Devices)へ移した。被験化合物は、別のプレートにおいて5x濃度で調製し、FlexStation IIのロボットアームにより適当なウェルに添加した。蛍光を、各ウェルにおいて5秒毎に測定し、記録した。1mM ATP(Sigma)を、カルシウムアゴニストとして使用した(Lau et al., Life Sci., 73,2019-2028,2003)。
同じ微小血管内皮細胞を、96ウェルプレートにおいて、異なる濃度の被験ペプチドを含有する無血清培地中に、密度2.0x105個細胞/ウェルで播種した。3日間培養した後、1個のウェルあたりの生存細胞の数を、既報のMTTアッセイ(Iwai et al., Lung Cancer, 23,209-222,1999)により概算した。結果は、未処理の対照を上回る増殖率(%)として表した。
細胞運動性は、既報(Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002)のように測定した。被験ペプチドを、様々な濃度でChemoTxチャンバー(NeuroProbe Inc.)の底に配置した。間の膜を、10μg/mlフィブロネクチンでコートし、上側チャンバーに5.0x105個ヒト内皮細胞を添加した。37℃で4時間インキュベーションした後、膜を固定し、染色した(Protocol Hema3, Biochemical Sciences Inc.)。多孔質の膜に捕獲された細胞を、25x顕微鏡対物レンズにより写真撮影し、1写真視野あたりの細胞数をカウントした。
ヒト内皮細胞を、2.0x105個細胞/ウェルで被験ペプチドの存在または非存在下、24ウェルプレートの底を覆うマトリゲルの固形層の上に説明されたように播種した(Nam et al., Phytother. Res., 17,107-111)。一晩インキュベーションした後、管状構造を写真撮影し(1ウェルにつき3枚の写真)、1写真視野あたりの節(knot)の数を、格子の複雑さ(lattice complexity)の尺度としてカウントした。
ヒト内皮細胞を、T-75フラスコ中、密度2.5x106個細胞/ウェルで培養した。細胞がプレートの底に付着した後、これらを無血清培地中10nM PAMPで24時間処理した。この曝露の終了時に、細胞をPBSで1回洗浄し、プレートから剥ぎ取り、それらの総RNAをQiagenのRNeasy Mini Kitを用い抽出し、SuperScript First-Strand Synthesisシステム(Invitrogen)を用い逆転写した。遺伝子発現の定量は、既報(Martinez et al., J. Endocrinol., 176,95-102,2003)のようにリアルタイムPCRで行った。PCR反応は、Sybr Green PCRマスターミックス(Applied Biosystems)を用い、Opticonサイクラー(MJ Research)上で進行した。サーモサイクリングは、cDNA(1:10希釈)2μlおよびプライマー(下記参照)400nMを含有する最終容量25μlにおいて行った。全ての標的は、ハウスキーピング遺伝子と同じ試行で、下記のサイクル方式を用いて3つ組で増幅した:最初に試料を95℃で2分間変性させた後、95℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で30秒間を46サイクル行った。
NIHコロニー(Frederick(MD))から入手した20匹の雌性無胸腺ヌードマウスに、1.0x107個A549細胞/マウスを皮下注射した。2週間後、マウスは全て、皮膚の下に触知可能な腫瘍を発生させ、この時点でマウスを2群に分けた。週3回、個々の腫瘍を各々測定し(長さ、高さ、厚さ)、各マウスに、その群に応じた腫瘍内注射を施した。第1群(対照)には、PBS 100μlを与えた。第2群は、1μM PAMP(12-20)のPBS溶液を100μl与えた。腫瘍組織量を保持しきれなくなった時点で、マウスを屠殺した。
適当な場合、データは、両側スチューデントt検定により比較した。0.05未満のP値は、統計学的に有意であるとみなした。
血管新生を試験するには多くの方法があり(Auerbach et al., Clin. Chem., 49,32-40,2003)、本実験は、PAMPの血管新生特性の予備的評価のために、鶏胚大動脈弓アッセイを使用する。AMおよびVEGFのような通常の血管新生分子は、100nMおよびそれよりも高い濃度で、未処理の対照を上回る出芽血管の統計学的に有意な増加を誘導することができた。比較すると、PAMPは、1nMと低い濃度で多くの血管の成長を誘導することができるのに対して、AMおよびVEGFはこの濃度では、対照を上回る有意な増殖を促進することができない(図3A)。この最初の知見は、PAMPは、それまで説明された分子よりもはるかに強力なプロ血管新生因子であることを示している。
AM受容体は分子レベルで良く特徴付けられているが(McLatchie et al., Nature, 393,333-339,1998)、PAMP受容体の構造は未だ入手不可能である。しかしながら、副腎髄質細胞のPAMPへの曝露は、カルバコールが誘導したカルシウム流入の減少をもたらす(Katoh et al., J. Neurochem., 64,459-461,1995)。内皮細胞において類似条件を作出するために、細胞を、周知のこれらの細胞におけるカルシウム流入の一過性アゴニストである1mM ATPで刺激し(Lau et al., Life Sci., 73,2019-2028,2003)、典型的反応を得た(図5、□)。この反応は、培地中の10nM PAMPの存在により大きく低下された(図5、◇)。ペプチド断片PAMP(12-20)は、血圧調節において全長PAMPとは逆の作用を有することが示され(Fry et al., Life Sci., 60,PL161-167,1997)、このことは、そのPAMPアンタゴニストとしての利用可能性を示唆している。阻害特異性を明らかにするために、過剰なPAMPペプチド断片を添加し、初期反応を回復した(図5、○)。まとめると、これらのデータは、内皮細胞の膜に機能性PAMP受容体が存在し、その結果このペプチドは前述のような血管新生反応を直接活性化しうることを示している。
血管新生が起こるためには、内皮細胞が増殖して新たな位置へ遊走し、それら自身が最終的には中空の管に発達する固形索へ組織化しなければならない。これらのプロセスは全てプロ血管新生物質により促進され、全てのプロ血管新生分子は、これらの生理学的作用の少なくともひとつを誘起しなければならない。これらの現象のいずれがPAMPにより誘導されるかを調べるために、ヒト微小血管内皮細胞を、漸増濃度のPAMP、AM、およびVEGFに曝露し、それらの増殖(図6A)、遊走(図6B)、および索形成(図6C)に対する作用を比較した。
PAMPは血管新生の強力なプロモーターであることをデータが示しているので、PAMPの阻害は血管新生を低下させることができると考えられ、腫瘍増殖の管理に有益である可能性がある。ペプチド断片PAMP(12-20)は、内皮細胞においてPAMP受容体アンタゴニストとして作用することから、このペプチドの血管新生の阻害能をインビボにおいて試験した。まず、合成全長PAMPの濃度1nMと漸増用量のPAMP(12-20)との間の競合を、DIVAAアッセイを用いて調べた。PAMPにより誘起された血管新生反応の用量依存型阻害が観察された(図7A)。100倍過剰量のペプチド断片(100nM)は、対照から得られる基本レベルにまで血管新生を阻害した(図7Aの第一のバー)。このペプチド断片はそれ自身は、基本的血管新生を修飾しなかった(図7Aの最後のバー)。
従って、AM遺伝子関連ペプチドPAMPは、AMおよびVEGFのようなこれまでに認められている血管新生分子よりも6桁低い濃度で活性がある強力な血管新生因子である。加えて、PAMPの受容体はヒト内皮細胞に存在し、これらの細胞は、他の血管新生因子の発現が高められる(boost)のと同時に、それらの遊走および索形成能を増大することにより、PAMPの存在と反応する。加えてペプチド断片PAMP(12-20)は、新血管形成が合成PAMPによりまたは腫瘍細胞により誘導されたかどうかにはかかわらず、血管新生アンタゴニストとして作用し、異種移植片モデルにおける結果により示されたように、腫瘍管理の新規治療法を提供する。
機能をブロックする(機能を中和する)精製ポリクローナル抗体は、下記の方法で産生される。PAMPペプチドまたはPAMPペプチドの一部1mg、およびキーホールリムペットヘモシアニン(KLH)1mgを、1mlのPBS中で混合する。25%グルタルアルデヒド(Sigma)10μlをこの混合物に添加すると、フロキュラー(flocular)となる。その後、この混合物を完全フロイントアジュバント1mlに添加し、乳化する。
下記実施例は、PAMPの小分子インヒビターを同定するために使用することができる方法を説明している。
配列番号:1は、プレプロアドレノメジュリンをコードしているヌクレオチド配列である。
配列番号:2は、プレプロアドレノメジュリンの蛋白質配列である。
配列番号:3は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)をコードしているヌクレオチド配列である。
配列番号:4は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)の蛋白質配列である。
配列番号:5は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)をコードしているヌクレオチド配列である。
配列番号:6は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)の蛋白質配列である。
配列番号:7は、AMフォワードプライマーである。
配列番号:8は、AMリバースプライマーである。
配列番号:9は、VEGFフォワードプライマーである。
配列番号:10は、VEGFリバースプライマーである。
配列番号:11は、bFGFフォワードプライマーである。
配列番号:12は、bFGFリバースプライマーである。
配列番号:13は、PGDF Aフォワードプライマーである。
配列番号:14は、PGDF Aリバースプライマーである。
配列番号:15は、PDGF Bフォワードプライマーである。
配列番号:16は、PDGF Bリバースプライマーである。
配列番号:17は、PDGF Cフォワードプライマーである。
配列番号:18は、PDGF Cリバースプライマーである。
配列番号:19は、18S RNAフォワードプライマーである。
配列番号:20は、18S RNAリバースプライマーである。
Claims (46)
- 組織において血管新生を誘導する方法であって、配列番号:4に示されたペプチド、または配列番号:4と少なくとも90%の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片の有効量を組織へ導入し、これにより組織における血管新生を誘導する段階を含む方法。
- 変種または断片が、配列番号:4と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1記載の方法。
- ペプチドが配列番号:4に示されたペプチドである、請求項1記載の方法。
- 組織が、移植片、心臓組織、血管、創傷、または冠動脈を含む、請求項1記載の方法。
- 移植片が、皮膚または臓器の移植片を含む、請求項4記載の方法。
- 導入が局所投与を含む、請求項1記載の方法。
- 局所投与が、外用投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、心膜内投与、眼球内投与、点眼投与、または吸入による投与を含む、請求項6記載の方法。
- 導入が全身投与を含む、請求項1記載の方法。
- 血管新生の誘導が新血管形成の誘導を含む、請求項1記載の方法。
- 血管新生が望ましい対象の標的領域において血管新生を促進する方法であって、配列番号:4に示されたペプチド、または配列番号:4と少なくとも90%の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片の治療有効量を標的領域へ導入し、これにより対象の標的領域における血管新生を促進する段階を含む方法。
- 変種または断片が、配列番号:4と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項10記載の方法。
- ペプチドが配列番号:4である、請求項10記載の方法。
- 組織が、移植片、心臓組織、血管、創傷、または冠動脈を含む、請求項10記載の方法。
- 移植片が、皮膚または臓器の移植片を含む、請求項13記載の方法。
- 導入が局所投与を含む、請求項10記載の方法。
- 局所投与が、外用投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、心膜内投与、眼球内投与、点眼投与、または吸入による投与を含む、請求項15記載の方法。
- 導入が全身投与を含む、請求項10記載の方法。
- 血管新生の誘導が新血管形成の誘導を含む、請求項10記載の方法。
- 対象が、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳虚血、または創傷を有するか、または発症のリスクがある、請求項10記載の方法。
- 標的領域が、血流が制限された血管を含む、請求項10記載の方法。
- 血管新生を誘導するための薬学的組成物における使用のための、配列番号:4のペプチド、または配列番号:4と少なくとも90%の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片。
- ペプチドが配列番号:4である、請求項21記載の使用。
- 冠動脈疾患、末梢血管疾患、または創傷を治療するための、請求項21記載の使用。
- 対象の組織において血管新生を誘導するためのキットであって、容器と、ある量の配列番号:4、または配列番号:4と少なくとも90%の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片とを備えるキット。
- 第二の血管新生物質を含む容器を更に備える、請求項24記載のキット。
- 第二の血管新生物質が、血管内皮細胞増殖因子または塩基性線維芽細胞増殖因子である、請求項25記載のキット。
- ペプチドを対象に投与するための使用説明書を更に備える、請求項25記載のキット。
- 新規血管の形成が望ましくない組織において血管新生を阻害する方法であって、有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)のインヒビターを組織へ導入し、これにより組織における血管新生を阻害する段階を含む方法。
- インヒビターが、抗体、小分子インヒビター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項28記載の方法。
- インヒビターがプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)である、請求項28記載の方法。
- 組織が新生物または網膜を含む、請求項28記載の方法。
- 血管新生の阻害が望ましい対象の標的領域において血管新生を阻害する方法であって、治療有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)インヒビターを標的領域へ導入し、これにより対象の標的領域における血管新生を阻害する段階を含む方法。
- インヒビターが、抗体、小分子インヒビター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項32記載の方法。
- インヒビターがプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)である、請求項33記載の方法。
- 標的領域が、皮膚、腫瘍、網膜、関節、または子宮内膜組織である、請求項32記載の方法。
- 対象が、腫瘍、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を有するか、または発症のリスクがある、請求項32記載の方法。
- 導入が局所投与を含む、請求項32記載の方法。
- 局所投与が、外用投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、心膜内投与、眼球内投与、点眼投与、または吸入による投与を含む、請求項37記載の方法。
- 導入が全身投与を含む、請求項32記載の方法。
- 血管新生を阻害するための薬学的組成物における使用のための、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)。
- 腫瘍、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を治療するための、請求項40記載の使用。
- 容器と、ある量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)とを備える、対象の組織における血管新生を阻害するためのキット。
- 別の抗血管新生物質を含む容器を更に備える、請求項42記載のキット。
- 抗血管新生物質が、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のインヒビターまたは塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)のインヒビターである、請求項43記載のキット。
- 対象へペプチドを投与するための使用説明書を更に備える、請求項42記載のキット。
- プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)のインヒビターをスクリーニングする方法であって、PAMPへの抗PAMP抗体の結合の破壊について小分子ライブラリーをスクリーニングする段階と、PAMPへの抗PAMP抗体の結合を破壊することが同定された分子を、血管新生バイオアッセイにおいて抗血管新生活性についてスクリーニングする段階とを含む方法。
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