KR20230167535A - 피브릴린 재조합 단백질을 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물 - Google Patents
피브릴린 재조합 단백질을 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피브릴린-1(FLN1) 및 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)를 포함하는 재조합 단백질 rcFE을 이용한 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물에 대한 것으로서, 재조합 단백질이 줄기세포의 접착, 증식 및 줄기세포의 평활근세포로의 분화 활성을 촉진시키는 효과를 확인하였다. 이를 이용한 약학적 조성물을 통해 평활근세포 관련 질환인 빈뇨, 심혈관 질환, 허혈성 질환 및 창상 등의 예방 및 치료에 활용하거나 조직재생에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 피브릴린 재조합 단백질을 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
평활근세포들은 심장을 제외한 대부분의 내장의 근육벽을 구성하며, 호르몬과 자율신경계의 조절을 받아 수축하고 이완하면서 이들 기관이 각각의 기능을 원활하게 수행할 수 있도록 하는 역할을 한다. 혈관에서 평활근세포는 혈관 중간층(medial layer)의 내벽을 형성하며, 성숙하고 안정된 혈관계가 발생하는데 매우 중요하다. 혈관을 구조적으로 지지하고, 혈류와 혈압을 조절하며, 혈관의 내구성과 탄성력에 필수적인 세포외 기질을 합성하고 분비한다. 또한 평활근세포들은 혈관이 손상되면 이를 회복하기 위하여 수축성은 감소하고 세포분열과 이동성이 증가한 재생 상태로의 적응적인 변화를 보이기도 한다. 따라서 평활근세포가 유전자 손상, 감염, 다른 질환 등의 선천적 또는 후천적인 이유로 기능이 손상되면 정상적인 생리 기능을 유지할 수 없게 된다.
따라서 평활근세포 퇴행성 질환의 치료를 위하여 평활근세포로의 분화를 효과적으로 촉진할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
1. 대한민국 공개문헌 JBMR Volume31, Issue1 January 2016 Pages 86-97(2015.07.18.).
본 발명의 목적은 피브릴린-1(FLN1) 및 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)를 포함하는 재조합 단백질을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 (2) 상기 (1)단계에서 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 상기 재조합 단백질 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 개체로부터 분리된 줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 포함하는 평활근세포 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물에 줄기세포를 추가로 포함하는 조직재생용 약학적 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피브릴린-1(FLN1) 및 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)를 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 (2) 상기 (1)단계에서 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 상기 재조합 단백질 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 개체로부터 분리된 줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 평활근세포 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물에 줄기세포를 추가로 포함하는 조직재생용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 피브릴린-1(FLN1) 및 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)를 포함하는 재조합 단백질을 이용한 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물에 대한 것으로서, 재조합 단백질을 이용하여 줄기세포의 접착, 증식 및 평활근세포로의 분화 활성을 촉진시키는데 효과적이다. 이를 통해 평활근세포 관련 질환의 예방 및 치료에 활용하거나 조직재생에 활용될 수 있다.
도 1은 피브릴린-1(이하 FLN1라 함) 및 엘라스틴 유사 폴리펩티드(이하 ELP라 함)를 포함하는 재조합 단백질(이하 rcFE라 함)의 구성과 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 결과이다.
도 2는 인간 하비갑배 유래 중간엽 줄기 세포(이하 hTMCS라 함)의 접합 활성에 대한 rcFE의 영향을 확인한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 3은 hTMCS의 증식 활성에 대한 rcFE의 영향을 확인한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 4는 hTMCS의 평활근세포로의 분화 활성에 대한 rcFE의 영향을 확인한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 2는 인간 하비갑배 유래 중간엽 줄기 세포(이하 hTMCS라 함)의 접합 활성에 대한 rcFE의 영향을 확인한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 3은 hTMCS의 증식 활성에 대한 rcFE의 영향을 확인한 실험결과를 나타낸 것이다.
도 4는 hTMCS의 평활근세포로의 분화 활성에 대한 rcFE의 영향을 확인한 실험결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 피브릴린-1(FLN1) 및 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)를 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
상기 피브릴린-1은 재조합 단편인 PF14일 수 있다.
상기 피브릴린-1은 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 엘라스틴 유사 폴리펩티드는 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 재조합 단백질은 서열목록 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 재조합 단백질은 줄기세포의 접착, 증식 및 평활근세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 상기 줄기세포는 지방줄기세포, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 및 유도만능줄기세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 단백질은 칼포닌, α-액틴 및 MYH11의 mRNA 발현을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능한게 연결된 코팅 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다.
그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 개체로부터 분리된 줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진 방법을 제공한다.
상기 줄기세포는 지방줄기세포, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 및 유도만능줄기세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 포함하는 평활근세포 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 평활근세포 관련 질환은 빈뇨, 심혈관 질환, 허혈성 질환 및 창상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 심혈관 질환 및 허혈성 질환이란, 동맥경화증, 안정형 및 불안정형 협심증, 말초 심혈관 질환, 고혈압, 심부전증, 말초 순환장애, 심근경색증, 뇌졸중, 일과성 및 허혈성 발작, 지주막하 출혈 등을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물에 줄기세포를 추가로 포함하는 조직재생용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “조직재생”이 되는 조직은 특별히 한정되지 않고 전신의 여러 조직을 포함한다. 관련된 조직으로는 한정되지 않고, 예를 들면, 간, 췌장, 신장, 대장, 폐, 비장, 심장, 골수, 성대, 피부, 복막, 눈, 혈관 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물에 의한 조직재생은 줄기세포의 분화 및/또는 증식을 수반하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에 의한 조직재생은 조직 실질 세포의 증식을 수반하는 것일 수 있다. 줄기세포의 분화 예를 들어, 분화 세포에 특이적인 세포 마커의 검출, 분화 세포가 나타내는 기능의 검출 등에 의해 평가될 수 있다. 세포의 증식은 다양한 알려진 방법, 예를 들어, 시간에 따른 살아있는 세포 수의 계산, 조직의 크기, 부피 또는 무게 측정, DNA 합성량의 측정, WST-1법, BrdU(브로모 디옥시 우리딘(bromo deoxyuridine)법, 3 H 티미딘(thymidine) 포착법 등으로 평가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 조직재생이 억제된 상태를 갖는 개체에 대해서 이용할 수 있다. 조직재생이 억제된 상태로는 한정되지 않고, 예를 들면, 염증, 괴사, 섬유화, 장기 부전, 혈소판 감소, 유전자 이상, 노르아드레날린(noradrenaline)의 감소 등을 포함한다.
본 발명의 조성물에서 유효성분의 배합량은 조성물이 투여된 경우 조직재생을 촉진하는 양인 것이 바람직하다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 소요된 양은 공지되어 있거나 배양 세포 등을 이용한 실험관 내(in vitro) 시험과 마우스, 랫드, 개, 돼지 등의 동물 모델에서 시험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 시험 법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 조직재생의 촉진은 조직의 기능, 무게, 크기 등의 회복을 생화학 검사, X-ray, 초음파, MRI, CT, 내시경 등을 이용한 화상 진단 등으로 평가할 수 있다. 유효성분의 배합량은 조성물의 투여 형태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 1회 투여로 여러 단위의 조성물을 사용하는 경우, 조성물 1 단위에 배합 유효 성분의 양은 1회 투여에 필요한 유효성분의 양을 복수 분의 1로 할 수 있다. 소요 배합량의 조정은 당업자가 적절히 할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험 예 1> 재조합 단백질의 발현 및 정제
엑손 33-40(잔기 1368-1688)을 포함하는 인간 FBN1 단편 PF14 당단백질 서열(N1369, N1484, N1581, N1669의 글리코실화 부위)을 합성(Genotech, Daejeon, Korea)하고, ELP의 특성을 기반으로 하였다. 게스트 잔기 위치에 Val, Leu 및 Gly를 17:4:9의 비율로 삽입하여 ELP 코딩 서열을 설계하였다. 따라서 먼저 ELP를 pBAD-His 벡터에 삽입한 다음 FBN1PF14를 삽입하여 rcFE를 복제하였다. 이후, 제한효소 BamHI 및 EcoRI를 이용하여 생성된 플라스미드로 대장균 TOP10 세포를 형질전환시켰다.
rcFE를 발현하기 위해 대장균 TOP 10 세포를 암피실린을 함유하는 레녹스 브로스(Lennox Broth, LB) 배지에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 배양액의 OD600이 0.6에 도달하면 L-아라비노스(L-arabinose) 0.1%(w/v)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 6시간 후, 박테리아를 6000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 그 후 펠렛을 용해하고 초음파 처리하였다.
용해물을 냉장 원심분리기에서 4℃, 5,000rpm, 10분 동안 원심분리하고 상층액을 다시 회전시켰다. 최종 상층액을 새 튜브로 옮기고 상층액의 조 단백질(crude protein)을 제조사의 지침(Qiagen, Hilden, Germany)에 따라 니켈-니트릴로트리아세트산 수지 컬럼을 사용하여 정제하였다.
rcFE의 분자량은 12%(v/v) SDS-PAGE를 사용하여 평가한 후 코마시 블루 염색을 수행하였다. 또한, rcFE 발현을 확인하기 위해 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 모노클로날 항-폴리히스티딘 항체(1:1000 희석, GT359, GeneTex, Irvine, CA, USA)를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 제조사의 지침에 따라, 항체 결합 재조합 rcFE는 화학발광(Amersham)에 의해 검출되었다.
<실험 예 2> 줄기세포 배양
hTMSC는 수술 후 폐기된 하비갑개 조직에서 분리한 줄기세포로 가톨릭대학교 서울성모병원 기관심사위원회(승인번호 KC08TISS0341)의 승인을 받았습니다. hTMSCs는 10%(v/v) 소태아혈청(WELGENE), 10μg/mL 스트렙토마이신 및 100단위/mL 페니실린 G 나트륨을 함유하는 α-MEM(Minimum Essential Medium Eagle alpha modify)(Welgene, 경산, 한국)에서 37℃의 5% CO2 분위기에서 배양되었다. 2-3일 후에 배양 배지를 교체하여 부착되지 않은 죽은 세포를 제거하고, 나머지 세포는 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(트립신 EDTA)을 사용하여 5분동안 트립신 처리 후 합류하여 계대배양되었다. 3 및 4 계대배양한 hTMSC만 세포 접착, 증식 및 분화 실험의 분석에 사용되었다.
<실험 예 3> rcFE의 줄기세포에 대한 접착 영향 분석
접착 활성은 크리스탈 바이올렛 분석을 사용하여 평가되었다. 24-웰 플레이트는 500 μL/웰의 부피를 갖는 rcFE(0-30 μg/mL)로 4℃에서 밤새 코팅되었고, 코팅되지 않은 플레이트는 대조군으로 사용되었다. 이후, 각 웰을 둘베코 인산염 완충 식염수(Dulbecco phosphate-buffered saline, DPBS)(WELGENE)로 세척한 후 2%(w/v)의 소혈청알부민(bovine serum albumin,BSA) 용액으로 4℃에서 2시간 동안 차단하였다. hTMSC를 1 x 105 세포 밀도로 시딩하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 부착된 세포를 DPBS로 2회 세척하고 37℃에서 15분 동안 3.7%(w/v) 포르말린 용액으로 고정하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 2% 에탄올/물(v/v)에서 0.25%(w/v) 바이올렛(Sigma, St Louis, USA)으로 염색하고 DPBS로 가볍게 3회 세척하였다. 그런 다음, 2% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 용액으로 세포를 용해시키고, 용해물을 96-웰 플레이트에 옮겼다. 각 시료의 흡광도는 마이크로플레이트 리더(BioTek, Seoul, Korea)를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.
<실험 예 4> rcFE의 줄기세포 증식에 대한 영향 분석
세포 증식 활성은 제조사의 지침(AMRESCO Inc, Solon, USA)에 따라 MTT 분석을 사용하여 측정되었다. 24-웰 플레이트를 10 μg/mL rcFE로 코팅한 다음, hTMSC를 1 x 104개 세포/웰의 밀도로 시딩하고 37℃에서 8일 동안 인큐베이션하였다. 또한, 코팅되지 않은 플레이트를 대조군으로 사용하고 hTMSC에 시딩하였다. 각 웰은 세 번 세척되었다.
DPBS와 함께, 500 μL MTT(DPBS에서 5 mg/mL)를 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 150 μL 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 샘플을 96-웰 플레이트에 옮기고 마이크로플레이트 리더(BioTek, Seoul, Korea)를 이용하여 570 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
<실험 예 5> RNA 추출 및 cDNA 합성
hTMSC는 10μg/mL rcFE로 코팅된 세포 배양 접시에서 10일 동안 성장되었다. 이지-스핀 RNA 추출 키트(iNtRON, Seoul, Korea)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. RNA의 순도는 나노드롭 2000 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 평가하고 260nm 및 280nm에서의 흡광도 비율을 결정하였다. 그 후, 2μg의 총 RNA를 0.5μM 무작위 헥사뉴클레오티드 프라이머(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 40단위 RNaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제(Invitrogen), 50단위 SuperScript II 역전사효소(Invitrogen), 5μM DTT 및 500μM dNTP 혼합물(Invitrogen)를 포함하는 20μL 반응 혼합물에서 역전사하였다. 역전사 반응은 50℃에서 1시간 동안 수행한 후, 반응 혼합물을 70℃에서 15분 동안 가열하여 반응을 종결시켰다.
<실험 예 6> rcFE의 줄기세포의 평활근세포로의 분화에 대한 영향 분석
칼포닌, α-액틴 및 MYH11과 같은 유전자의 과발현은 정량적 실시간 PCR로 측정하였다. 모든 실시간 PCR 분석은 ABI 스텝 원 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystem, Foster City, USA)을 사용하여 수행되었다. PCR 반응은 템플릿 cDNA, 증류수, 각 프라이머(0.1μM) 및 2x SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Applied Biosystem, Include AmpliTaq Gold DNA polymerase in buffer, dNTP mix, SYBR Green I dye 및 10mM MgCl2)포함)를 포함하는 15μL 반응 혼합물에서 수행되었다. PCR은 94℃에서 10분 동안 효소 활성화 단계, 94℃에서 15초 동안 변성 단계, 60℃에서 1분 어닐링 단계 및 60℃에서 1분 확장 단계를 40주기 수행하였다. 각 유전자에 대한 Ct(주기 역치) 값은 ABI 기기의 자동화 역치 분석 기능을 사용하여 결정하고 Ct(GAPDH)에 대해 정규화하여 dCt(= Ct(GAPDH) - Ct(특정 유전자))를 얻었다. PCR에 사용된 프라이머의 서열은 표 1과 같다.
| Genes | Forward Primer | Reverse Primer |
| ACTB | 5’-TGGCACCCAGCACAATGAAGAT -3’ | 5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCA -3’ |
| Calponin | 5’-AGAGGGAGCAGGAGGTGACG -3’ | 5’-TAGGTTCGCCTTGGCCCTCT -3’ |
| α-actin | 5’-TGTTCCAGCCATCCTTCATC -3’ | 5’-TAGGGCCGTGATCTCCTTCT -3’ |
| MYH11 | 5’-GCACTGCGACACGCTCAATG -3’ | 5’-AACAGGGAAGGCCTTGACGC -3’ |
<실험 예 7> 통계적 분석
모든 실험은 삼중으로 수행되었다. 실험 결과는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되고, 통계 분석은 t-검정을 사용하여 수행되었다. 결과는 p-값이 0.05(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
<실시 예 1> 대장균에서 rcFE의 엔지니어링 및 추출
rcFE를 구성하기 위해 인간 FBN1PF14를 코딩하는 유전자와 ELP 서열을 pBAD-His 발현 벡터에 클로닝하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 rcFE의 발현을 확인하였다. 그 결과, 도 1에 따르면 rcFE의 분자량은 약 38kDA이었다.
<실시 예 2> hTMSC 접착에 대한 rcFE의 영향 확인
세포 접착에 대한 rcFE의 효과를 조사하기 위해, hTMSC를 rcFE로 코팅된 플레이트에서 무혈청 배지와 함께 배양하였다. 그 결과, 도 2에 따르면 도시된 바와 같이, rcFE는 대조군과 비교하여 용량 의존적 방식으로 hTMSC의 접착력을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(***p<0.001). 특히, 10μg/mL rcFE는 hTMSC의 접착 활성을 크게 개선시켰다. 따라서 후속 실험에서는 10μg/mL rcFE를 사용하였다.
<실시 예 3> hTMSC 증식에 대한 rcFE의 영향 확인
rcFE가 hTMSC의 증식에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 3에 따르면 rcFE 유무에 관계없이 배양 4일 동안의 증식율에는 유의한 차이가 없었다. 그러나 8일 후 rcFE 코팅된 플레이트에서 배양된 세포는 대조군보다 유의하게 더 많이 증식하였다(**p<0.01). 이러한 결과는 rcFE가 장기적으로 hTMSC의 증식을 촉진한다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시 예 4> hTMSC에서 평활근세포 마커의 발현에 대한 rcFE의 영향 확인
hTMSCs의 평활근 세포로의 분화에 대한 rcFE의 영향을 조사하기 위해 실시간 PCR을 통해 평활근 세포 마커 유전자(calponin, α-actin 및 MYH11)의 mRNA 수준을 측정하였다. ACTB의 mRNA 수준을 내부 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 도 4에 따르면 rcFE 처리 및 비처리 플레이트에서 배양된 hTMSC에서 추출된 평활근 세포 마커의 발현 수준을 보여주었다. 대조군과 비교하여 rcFE는 세 가지 마커 모두를 현저하게 상향 조절하였다. 특히, MYH11은 rcFE 처리에 의해 높게 상향조절되었다(***p<0.001). 또한, rcFE는 MYH11만큼은 아니지만 α-액틴과 칼포닌을 상향 조절하였다(**p<0.01). 이러한 결과는 rcFE가 hTMCS의 평활근 세포로의 분화를 유도한다는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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smooth muscle cells containing fibrillin recombinant protein
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<210> 1
<211> 594
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fibrilin-1
<400> 1
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Claims (18)
- 피브릴린-1(FLN1) 및 엘라스틴 유사 폴리펩티드(ELP)를 포함하는 재조합 단백질.
- 청구항 1항에 있어서, 상기 피브릴린-1은 재조합 단편인 PF14인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 청구항 1항에 있어서, 상기 피브릴린-1은 서열목록 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 청구항 1항에 있어서, 상기 엘라스틴 유사 폴리펩티드는 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 청구항 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열목록 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 청구항 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 줄기세포의 접착, 증식 및 평활근세포로의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 청구항 6항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방줄기세포, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 및 유도만능줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 청구항 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 칼포닌, α-액틴 및 MYH11의 mRNA 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
- 청구항 1항 내지 청구항 8항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
- 청구항 9항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 청구항 10항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포.
- (1) 청구항 11항의 재조합 세포를 배양하여 청구항 1항 내지 청구항 8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
(2) 상기 (1)단계에서 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 청구항 1항 내지 청구항 8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질 제조방법. - 청구항 1항 내지 청구항 8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질을 개체로부터 분리된 줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진 방법.
- 청구항 13항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방줄기세포, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 및 유도만능줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진 방법.
- 청구항 1항 내지 청구항 8항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물.
- 청구항 1항 내지 청구항 8항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 포함하는 평활근세포 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 16항에 있어서, 상기 평활근세포 관련 질환은 빈뇨, 심혈관 질환, 허혈성 질환 및 창상으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 청구항 16항의 조성물에 줄기세포를 추가로 포함하는 조직재생용 약학적 조성물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20230167535A true KR20230167535A (ko) | 2023-12-11 |
Family
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Family Applications (1)
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| KR1020220067453A KR20230167535A (ko) | 2022-06-02 | 2022-06-02 | 피브릴린 재조합 단백질을 포함하는 줄기세포의 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물 |
Country Status (1)
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2022
- 2022-06-02 KR KR1020220067453A patent/KR20230167535A/ko unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. 대한민국 공개문헌 JBMR Volume31, Issue1 January 2016 Pages 86-97(2015.07.18.). |
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