KR101595641B1 - Cd31-itim 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관생성 촉진용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본원은 CD31-ITIM 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 혈관생성 촉진용 약학조성물을 개시한다. 본원에 따른 약학 조성물은 혈관생성을 촉진하여, 허혈로 인한 증상 또는 다양한 질환 예를 들면 허혈로 인한 조직 손상, 뇌경색, 뇌졸중, 재관류손상, 심근경색, 울혈성심장기능상실, 말초혈관폐색증, 심장비후, 저심장수축증, 저심장이완증, 부적응성심장비대, 수축기 심부전, 이완기 심부전, 고혈압성 심부전, 동맥 및 승포판 질환, 폐동맥판 질환심혈관, 또는 허혈성 장염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CD31-ITIM 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관생성 촉진용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition comprising CD31-ITIM polypeptide or nucleic acids encoding the same for promoting blood vessel formation}
본원은 단백질을 이용한 혈관생성 조절을 통한 이와 관련된 질환 치료제 개발에 관한 것이다.
허혈이란 국소 빈혈이 심하여 해당 부위에 육안으로 혈액이 있음을 거의 인정할 수 없는 상태로 대표적인 예로 허혈성 심혈관질환을 들 수 있다. 허혈성 심혈관 질환의 치료법으로는 세포치료법 및 약물학적 방법 등을 들 수 있다.
세포치료 방법은 주로 조직 재생이 가능한 성체 줄기세포 또는 전구세포를 이용한 것으로 예를 들면 골수유래 줄기세포를 이용한 혈관 및 근육을 재생하려는 시도가 있다. 하지만 성체줄기세포를 구성하는 세포 및 조직 재생에 적합한 줄기세포의 선별을 위한 방법에 대한 불충분한 이해로 인해 실제 사용에 어려움이 있다. 예를 들면 분획화되지 않은 전체 골수유래 줄기세포를 사용하는 경우, 심근내 석회화가 유발될 수 있다.
약물학적 방법으로는 포스포디에스터라제 III의 선택적 저해작용에 의해 혈소판내 cAMP를 증가시켜, 혈소판 응집 억제작용을 나타내는 실로스타졸(Cilostazol)을 들 수 있으며, 상기 약물은 이외에도 혈관확장작용, 혈관 평활근 세포 증식억제작용, 중성지방 저하작용 등이 있다. 그 외 신경세포 세포사 예방 효과등도 밝혀지고 있으며, 이와 같은 작용으로 실제 허혈성 질환의 임상 치료제로 사용되고 있다.
동맥경화증은 심근경색, 뇌졸중, 혈관성 사망 등과 같은 허혈성 혈관질환으로 발전하는 병적상태로서 심한 경우 사망에까지 이를 수 있기 때문에 그 치료가 매우 중요하다. 클로피도그렐 (Clopidogrel)은 티에노피리딘계 항혈소판 응집억제 약물로, 혈소판의 ADP 수용체를 막아 피브리노겐과의 결합을 차단함으로써 혈소판의 점착과 응집을 감소시켜 동맥경화증의 치료에 사용된다.
미국공개특허 제2010/0119490호는 CD31 발현세포를 치료제로 사용하는 것에 관한 것으로, CD31 발현 세포의 분리 및 이를 조직 재생 용도로 사용하는 방법에 대하여 개시한다.
대한민국 공개특허 제2007-0054140호는 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는 허혈성괴사질환 치료용 세포치료제에 관한 것으로 폐쇄성 동맥질환에 의한 허혈성 괴사질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
종래의 세포치료제 또는 저분자화합물 이외에 이용한 약물 이외의 다양한 치료제 개발에 대한 필요성이 있다.
본원은 혈관생성이 필요한 질환 치료제를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 혈관생성 촉진용의 하나 이상의 CD31-ITIM 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서 CD31-ITIM 폴리펩타이드는 복수개 특히 1 ~ 4개 포함될 수 있고, 또한 폴리펩타이드는 특정 잔기에서 인산화될 수 있다. 본원의 펩타이드가 효과가 있는 혈관생성은 혈관형성 및/또는 혈관신생을 포함한다.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포 발현용 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 E.coli와 같은 박테리아, 효모, 또는 포유류 유래 세포를 제공한다.
본원에 따른 펩타이드에 의한 혈관생성 촉진은 허혈성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료와 관련된 것으로, 상기 허혈성 질환 또는 증상은 예를 들면 허혈로 인한 조직 손상, 뇌경색, 뇌졸중, 재관류손상, 심근경색, 울혈성심장기능상실, 말초혈관폐색증, 심장비후, 저심장수축증, 저심장이완증, 부적응성심장비대, 수축기 심부전, 이완기 심부전, 고혈압성 심부전, 동맥 및 승포판 질환, 폐동맥판 질환심혈관, 또는 허혈성 장염을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 CD31-ITIM 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 혈관생성 촉진용 조성물을 제공하며, 한 구현예에서는 허혈성 증상 또는 질환 치료용으로 사용된다. 다양한 유래의 CD31-ITIM이 사용될 수 있으며, 예를 들면 상기 CD31-ITIM 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 포유류, 특히 인간 유래이다. 상기 허혈성 질환 또는 증상은 근육, 뇌, 신장, 대장 또는 심장에서 발생한 것으로 상기 허혈성 증상 또는 질환은 예를 들면 허혈로 인한 조직 손상, 뇌경색, 뇌졸중, 재관류손상, 심근경색, 울혈성심장기능상실, 말초혈관폐색증, 심장비후, 저심장수축증, 저심장이완증, 부적응성심장비대, 수축기 심부전, 이완기 심부전, 고혈압성 심부전, 동맥 및 승포판 질환, 폐동맥판 질환심혈관, 또는 허혈성 장염을 들 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원의 CD31-ITIM 또는 이를 코딩하는 유전자 또는 이를 포함하는 약학조성물은 혈관 형성을 유도하여, 혈관생성의 촉진이 필요한 다양한 질환 예를 들면 근육, 뇌, 심장, 신장, 또는 대장에서 발생한 허혈성 질환, 예를 들면 허혈로 인한 조직 손상, 뇌경색, 뇌졸중, 재관류손상, 심근경색, 울혈성심장기능상실, 말초혈관폐색증, 심장비후, 저심장수축증, 저심장이완증, 부적응성심장비대, 수축기 심부전, 이완기 심부전, 고혈압성 심부전, 동맥 및 승포판 질환, 폐동맥판 질환심혈관, 또는 허혈성 장심혈관 재생 또는 회복에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 HUVEC (GFP-HUVEC)을 이용하여 rhCD31 (ITIM) 이 혈관생성에 미치는 영향을 형광현미경을 사용하여 분석한 결과이다.
도 2는 rhCD31 (ITIM)이 Scratch wound healing assay (in vitro)을 이용하여 HUVEC의 이동 (Migration)을 분석한 결과로, 도 2a는 rhCD31을 처리 후 6시간에 촬영한 사진이며, 도 2b는 rhCD31을 처리 후 6시간에 wound size을 정량한 결과이다.
도 3은 혈관 형성에 중요하다고 알려진 분자들의 유전자 발현을 정량 역전사중합효소증폭반응(qRT-PCR)으로 분석한 결과이다.
본원은 내피 세포 표지인자로 알려진 CD31 또는 PECAM-1의 ITIM이 혈관생성능이 있다는 발견에 기초한 것이다.
CD31 또는 PECAM-1 (Platelte Endothelial Cell Adhesion Molecule-1)은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 130 kDa의 타입 I 막관통 당단백질로 내피세포의 세포-세포 경계 (junction)과 단핵구, 과립구, 자연킬러세포, 나이브 T세포 및 혈소판과 같은 조혈세포의 표면에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 아미노말단은 면역글로불린 유사영역으로 세포-세포 상호작용에 필요한 동종친화성 결합에 관여하며, 세포내에 존재하는 ITIM (immunoreceptor tyrosine inhibitory motif)는 타이로신 포스파타제와 같은 신호전달 분자를 모으는 스캐폴드 기능을 하여 상기 단백질의 억제 기능을 매개한다. 일반적으로는 조직절편에서 내피세포 마커로서 사용되었으나, 이의 혈관 형성 촉진 기능은 알려진 바 없다.
따라서 한 양태에서 본원은 하나 이상의 CD31-ITIM 폴리펩타이드를 포함하는 혈관 형성 촉진용 폴리펩타이드에 관한 것이다.
상술한 바와 같이 본원의 CD31-ITIM은 CD31의 세포내 존재하는 카르복시 말단을 이루는 모티브로, 예를 들면 인간유래 CD31은 GenBank No. NP_000433로 개시되어 있으며, ITIM은 아미노산 잔기 621-738에 해당한다. 본원의 목적을 위해서는 한 개 이상의 ITIM이 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 1 ~ 4개가 포함되며, 특히 두 개가 포함된다. 각 ITIM 모티브는 공지된 펩타이드 또는 비펩타이드성 연결체를 이용하여 연결될 수 있다. 두 개 이상의 ITIM 모티브는 두 개 또는 그 이상으로 연결 될 수 있다.
나아가 본원의 ITIM 모티브는 하나 이상의 타이로신 잔기에서 인산화될 수 있다. 예를 들면 상기 NP_000433로 개시된 서열을 기준으로 690 및/또는 713 위치가 인산화 될 수 있다. 인산화가 되면 SHP-2와 Gab1이 리쿠르트되어, 이로 인해 Erk가 활성화되고 하위 신호가 증폭된다 (Ref: Peter J. Newman and Debra K. Newman, ATVB, 2003 Jun 1;23(6):953-64).
상술한 서열은 예시적인 것으로, CD31-ITIM 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자는 본 발명에 따른 효과를 나타내는 한 인간을 포함한 다양한 포유류 유래의 것 및 이와 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본원의 범위에 포함된다. 본원에 사용될 수 있는 CD31 아미노산 서열은 예를 들면 인간 유래의 경우 GenBank 번호 NP_000433, 핵산 서열은 NC_000017 을 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, 이와 기능적으로 동등한 변이체도 포함한다. ITIM은 상기 CD31의 카르복시 말단에 존재하는 (아미노산 잔기 621-738) CD31의 세포내 영역이다. 본원에서 CD31 또는 ITIM 폴리펩타이드는 GenBank 번호 NP_000433에 개시된 ITIM 아미노산 서열과 적어도 85%의 상동성을 가진다.
본원의 CD31-ITIM은 ITIM 분자를 하나 또는 두 개 이상을 포함할 수 있으며, 일 구현예에서는 하나, 다른 구현예에서는 두 개, 또다른 구현예에서는 세 개를 포함한다.
용어 "기능적으로 동등한 변이체"란 특정 종 유래의 야생형 단백질 또는 이의 유전자 서열과 비교하여 변이가 있지만 혈관 형성 촉진 기능을 갖는 것을 말한다. 따라서, 예를 들면, 본원의 CD31-ITIM 또는 이를 코딩하는 유전자는 사람 유래의 GenBack NO. NP_000433로 표시되는 서열과 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다. 예를 들면 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함한다.
이와 같이, 야생형 CD31-ITIM 단백질을 암호화하는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자도 동등한 기능을 가지는 단백질을 암호화하는 한, 본 발명의 유전자에 포함된다. 나아가, 예를 들어, 염기서열 변이가 단백질 중의 아미노산의 변이를 수반하지 않는 경우(축중변이)가 존재하며, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 유전자에 포함된다.
상기 본원에 사용되는 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 과발현 시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 pET28b(Novagen)과 같은 벡터에 해당 유전자를 클로닝하여 세포주에 전달이입한 후, 발현된 단백질을 당업계에 공지된 분리방법에 의해 정제하여 사용할 수 있다. 정제 방법은 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기 위해 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그라피 예를 들면 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼에 적용한다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용하여 만들 수 있다.
본원의 펩타이드는 치료용 펩타이드로 사용될 수 있으며, 치료용 펩타이드는 개체의 기능에 긍정적 영향을 미치는 단백질 또는 그 유사체로, 질환, 증상, 질병의 발생 또는 진행을 감소, 억제, 경감, 완화 또는 안정화 시킬 수 있다. 일 구현예에서, 본원의 폴리펩타이드는 혈관생성의 촉진에 효과가 있는 것으로 혈류의 감소로 인해 발생하는 다양한 허혈성 질환의 치료에 사용될 수 있다.
따라서 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 펩타이드 및/또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관생성의 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본원의 조성물은 혈관생성의 촉진에 효과가 있는 것으로 혈류의 감소로 인해 발생하는 다양한 허혈성 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본원에서 “혈관생성”은 “혈관형성 (vasculogenesis)”및“혈관신생(angiogenesis)”을 모두 포함하는 것이다. 혈관 형성은 초기 배아에서 일차 혈관총의 형성시 발생하는 것과 같이 내피세포 전구체의 성숙한 내피세포로의 제자리 분화 및 신생혈관을 형성하기 위한 이들 세포의 회합을 특징으로 한다. 혈관신생은 이미 존재하고 있는 혈관의 성장 및 분기에 의한 혈관 성장이 원인이다. 다른 측면에서는 이미 존재하는 혈관에서 유래한 것일 수도 있으며, 줄기세포, 혈관모세포 또는 기타 전구세포에서 생성된 것일 수 있다. 혈관생성을 측정하는 방법은 공지된 것으로, 예를 들면 비분지형 혈관 분절의 수 (단위 면적당 분절의 수), 기능성 혈관밀도 (단위 면적당 관류된 혈관의 총 길이), 혈관 직경, 또는 혈관 부피 밀도 (단위면적당 각 분절의 직경과 길이를 근거로 계산한 총 혈관 부피)를 측정하여 결정할 수 있다.
본원에서 “치료”란 질환, 또는 질환으로 인한 증상 또는 상태의 억제, 제거, 경감, 완화, 개선, 및/또는 예방을 포함하는 개념이다.
본원에서 “허혈 증상”이란 출혈, 색전 (embolism) 및 경색 (infarction) 등에 의해 조직으로의 혈류공급이 중단되어 세포손상이 일어난 상태로, 불충분한 혈액 순환으로 인한 산소결핍으로 인한 다양한 증상을 포함한다. 본원에서“허혈성 질환”이란, 허혈로 인하여 발생하는 조직 또는 장기의 손상 또는 이로 인한 질환으로, 근육조직, 뇌, 심장, 신장, 대장과 같은 각종 장기를 포함하는 어떤 장기에서도 발생할 수 있다. 예를 들면 뇌 허혈은 뇌졸중, 재관류손상 등과 같은 질환으로 이어지며, 장의 경우 대장으로의 혈류가 감소할 경우 허혈성 대장염이 발생할 수 있고, 심장 허혈은 심근경색, 울혈성심장기능상실로 이어질 수 있다.
한 구현예에서 허혈성 질환은 허혈성 심질환으로, 허혈로 인한 심혈관 조직 손상을 포함한다. 허혈성 심질환은 관상동맥의 죽상경화 등에 의하여 심근에 대한 혈류가 감소하여 초래되는 심장 질환으로, 임상적으로 예를 들면 심근경색, 협심증, 울혈성심장기능상실, 말초혈관폐색증, 심장비후, 저심장수축증, 저심장이완증, 부적응성심장비대, 수축기 심부전, 이완기 심부전, 고혈압성 심부전, 동맥 및 승포판 질환, 및 폐동맥판 질환 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. CD31-ITIM 을 포함하는 본원 조성물은 심장 조직의 혈관생성을 촉진하거나 또는 심장 기능을 향상시키는데 사용될 수 있다.
다른 구현예에서 허혈성 질환은 허혈성 뇌질환으로 뇌졸중, 재관류 손상 및 하지허혈성질환과 같은 질환을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. CD31-ITIM 을 포함하는 본원 조성물은 뇌 조직 혈관생성을 촉진하거나 또는 뇌 기능을 향상시키는데 사용될 수 있다.
본원에서 “치료적으로 유효한 양”은 환자의 증상, 상태 또는 질환의 경감, 또는 치료에 필요한 양을 의미한다. 본원 조성물에 포함되는 CD31-ITIM의 유효량은 투여경로, 환자의 나이, 체중, 기저질환, 일반적 건강상태 등에 따라 달라질 수 있으며, 최종적으로 진료 의사의 판단에 의해서 결정될 것이다.
본원의 ITIM 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물은 상기 유효성분을 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본원의 ITIM 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물은 임상 투여시에 비경구로 투여, 예를 들면, 정맥주사, 근육주사, 또는 병소에의 직접주입이 가능하며, 레밍턴 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 참조하여 각 질환의 정도, 종류 또는 유효성분에 따라 일반적인 의약품 제제의 형태로 제조될 수 있다.
본원 조성물은 여러 가지 비경구 제형으로 제조되어 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 비경구제형은 예를 들면, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
상기 치료제의 일일 투여량은 약 0.005 내지 10mg/kg 이고, 바람직하게는 0.05 내지 1 mg/kg 이며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
나아가, 본원 조성물은 허혈과 관련된 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명의 범주가 이로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. GFP를 발현하는 HUVEC 제작
세포의 관형성 여부를 관찰하기 위하여 GPF (Green Fluorescence Protein)를 발현하는 Lentiviral vector PLL3.7 system (Addgene plasmid 11795, USA)을 HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, Lonza, USA)에 형질도입(Transduction)하여 사용하였다. 구체적으로 렌티 바이러스 벡터로부터 바이러스를 제조하는 방법은 ViraPower™ Lentiviral Packaging Mix (Invitrogen)을 이용하여 293T 세포에 전달이입을 하였으며, 그로부터 24시간 후에 배양액을 (DMEM, 10% FBS) 교환 후 24시간 뒤에 상등액을 얻은 후 25,000 rpm, 90분, 4℃에서 원심분리하여 바이러스를 얻었다. 이렇게 얻은 바이러스를 HUVEC에 형질도입하여 GFP 발현 HUVEC 을 제조하였다. 형질 도입 방법은 앞서 얻은 렌티바이러스를 약 5X105 pfu/ml 농도로 사용하였다. 배지는 EGM-2MV(Lonza)를 이용하였으며, Polybrene 10ug/ml을 처리하였으며, 37℃, 5% CO2에서 18시간 배양 후 배양액을 교체하였다.
HUVEC은 1.5% 젤라틴(Sigma-Aldrich,USA)을 코팅한 배양접시에서 EGM-2MV배지를 이용하여 배양하였다.
실시예 2. rhCD31 ( ITIM )이 혈관생성에 미치는 영향
혈관생성에 미치는 영향은 GFR Matrigel (BD Bioscience, USA)를 제조사의 방법대로 사용하여 수행하였다. 요약하면 얼음 위에서 35mm 콘포칼 디쉬 (ibidi Inc.)에 Matrigel을 대략 80㎕ 로 코팅한 후, 37℃, 5% CO2에서 30분간 두어 반고형 중합화를 수행하였다. 이어 상기 디쉬에 1% FBS를 포함하는 EBM-2 (Endothelial basal medium-2)에서 배양된 대략 3X104 개의 GFP-HUVEC 세포를 넣었다. 이어 여기에 대조군으로 BSA (Bovine serum albumin) 및 rhCD31 (ITIM) 분자를 각각 200 ng/ml로 처리 한 후 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양하였다. rhCD31(ITIM) 단백질은 PROSPEC회사에서 구입하여 사용 하였다. 이어 형광현미경(Olympus IX2, 40 배율) 을 통해 HUVEC (GFP-HUVEC)의 관형성을 비교하였다.
결과는 도 1에 기재되어 있다. 대조군으로 BSA로 처리된 세포와 비교하여 rhCD31로 처리된 세포에서 관형성이 월등히 증가하였다. 이는 rhCD31 (ITIM) 단백질이 혈관 형성을 촉진시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
이어 Scratch wound healing assay (in vitro)을 이용하여 Migration을 평가하였다. 구체적으로 6웰 플레이트에 HUVEC을 시딩한 후 24시간 후에 스크래치하였다. 이어 5% FBS와 Thymidine (1mM)이 포함된 EBM-2 배지에 각각 rhCD31(100, 200ng/ml)을 처리 하였다. 6시간 후에 Wound size를 정량하여 Migration을 평가하였다. 결과는 도 2에 있다. 도 2a는 rhCD31을 처리 후 6시간에 촬영한 사진이며, 도 2b는 rhCD31을 처리 후 6시간에 wound size을 정량한 결과이다. 이에 나타난 바와 같이, rhCD31을 처리한 조건에서 Migration이 증가한 것으로 나타났다.
실시예 3. 혈관생성에 중요한 분자의 발현 양상 분석
혈관생성에 중요한 분자의 발현 양상을 역전사 PCR로 분석하였다.
10% FBS를 포함하는 EBM-2에서 배양된 HUVEC에 매체 대조군(BSA)과 rhCD31(ITIM), rhCD31(extra membrane fragment) 각각을 200ng/ml 처리 한 후 37℃, 5% CO2에서 4시간 배양하였다. 이후 각 실험군의 RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 추출하고 cDNA synthesis kit (Takara)를 제조자의 방법대로 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이어 하기 표 1에 기재된 프라이머를 사용하 혈광생성에 중요하다고 알려진 분자들의 유전자 발현을 PCR로 분석하였다. 결과는 도 3에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, rhCD31 (ITIM) 단백질을 처리해 준 HUVEC에서 VEGF, HGF, Ang2, IL-10의 유전자의 발현이 증가했으며, 뿐만 아니라 Integrin alpha 5, Integrin beta 3, Integrin beta 8 등의 integrin 유전자의 발현도 증가하였다.
유전자명 프라이머 서열 Tm(℃) 산물 길이 ( bp )
IL10 FW
(Foward)		 5' - GCCTAACATGCTTCGAGATC-3' 58 206
RV
(Reverse)		 5' - TGATGTCTGGGTCTTGGTTC-3'
VEGF FW 5' -GCCAGCACATAGGAGAGATGAG-3' 60 161
RV 5' -AACGTACACGCTCCAGGACTTA 3'
HGF FW 5' -CTGGTTCCCCTTCAATAGCA-3' 60 165
RV 5' -CTCCAGGGCTGACATTTGAT-3'
Ang2 FW 5' -AGTCATCCAACACCGAGAAGAT-3' 60 317
RV 5' -CCGAATCCTTTGTGCTAAAATC-3'
Integrin a5 FW 5' - TGCAGTGTGAGGCTGTGTACA-3' 60 88
RV 5' - GTGGCCACCTGACGCTCT-3'
Integrin b3 FW 5' -CCGTGACGAGATTGAGTCA-3' 60 132
RV 5' -AGGATGGACTTTCCACTAGAA-3'
Integrin b8 FW 5' - AATTTGGTAGTGGAAGCCTATC-3' 60 146
RV 5' - GTCACGTTTCTGCATCCTTC-3'
GAPDH FW 5' -GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3' 60 185
RV 5' -GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'
도 1과 도 2의 결과를 종합해 보면, rhCD31 (ITIM)을 처리한 HUVEC에서 혈관 형성 유전자가 증가했을 뿐만 아니라 실제 관형성이 증가하였다. 이는 rhCD31 (ITIM) 단백질에 의해 혈관 형성을 촉진 시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (7)

  1. 하나 이상의 CD31의 ITIM 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 혈관생성 촉진용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 CD31의 ITIM 폴리펩타이드 또는 유전자는 1 ~ 4개 포함된 것인, 혈관생성 촉진용 약학 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 CD31의 ITIM 폴리펩타이드는 인산화된 것인, 혈관생성 촉진용 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 CD31의 ITIM 폴리펩타이드는 포유류 유래인, 혈관생성 촉진용 약학 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관생성은 혈관형성 또는 혈관신생, 또는 혈관형성 및 혈관신생을 포함하는 것인, 혈관생성 촉진용 약학 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관생성 촉진은 허혈성 질환 또는 증상의 예방 또는 치료인 혈관생성 촉진용 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 허혈성 질환 또는 증상은 허혈로 인한 조직 손상, 뇌경색, 뇌졸중, 재관류손상, 심근경색, 울혈성심장기능상실, 말초혈관폐색증, 심장비후, 저심장수축증, 저심장이완증, 부적응성심장비대, 수축기 심부전, 이완기 심부전, 고혈압성 심부전, 동맥 및 승포판 질환, 폐동맥판 질환심혈관, 또는 허혈성 장염인, 혈관생성 촉진용 약학 조성물.
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Cancer Investigation, Vol 30, Pages 364-371 (2012)*

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