KR101438996B1

KR101438996B1 - 혈관형성 촉진 활성을 갖는 돌연변이형 합토글로빈의 용도

Info

Publication number: KR101438996B1
Application number: KR1020130004209A
Authority: KR
Inventors: 김인숙; 오미경
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2014-09-05
Also published as: WO2014112702A1; US9260497B2; US20160017013A1; KR20140092021A

Abstract

본 발명은 혈관형성 촉진 활성을 갖는 돌연변이형 합토글로빈의 용도에 관한 것으로서, 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유한 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 돌연변이형 합토글로빈은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 143번째 아미노산이 Arg 이외의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 돌연변이형 합토글로빈으로서 야생형 합토글로빈에 비해 혈관 형성 촉진 활성이 우수하고, 모세관 유사 관 형성 능력이 우수하며, 세포의 이동성을 촉진시켜 혈관 미형성으로 인해 유발되는 질환의 치료를 위한 치료제로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

혈관형성 촉진 활성을 갖는 돌연변이형 합토글로빈의 용도{Use of Mutated Haptoglobin having angiogenesis promoting activity}

본 발명은 혈관형성 촉진 활성을 갖는 돌연변이형 합토글로빈의 용도에 관한 것으로서, 돌연변이형 합토글로빈 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 벡터 또는 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

국소빈혈성 조직손상의 경우 조직이 회복되려면 손상된 위치에서 새로운 혈관이 형성되어야 한다. 출생 이후에 새로운 혈관은 신생혈관형성(angiogenesis), 동맥신생(arteriogenesis) 및 맥관형성(vasculogenesis) 과정에 의해 생성된다. 신생혈관형성 과정은 이미 존재하는 성숙한 혈관내피세포(endothelial cell)들로부터 자라나는 혈관내피세포의 증식 및 이동과 관련이 있으며, 동맥신생은 이미 존재하는 소동맥 연결(arteriolar connection)을 측부혈관(collateral vessels)으로 리모델링하는 과정이다(Carmeliet, P. (2000) Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat . Med. 6, 389.395). 반면에, 맥관형성은 내피 전구세포(endothelial progenitor cells (EPCs))가 성숙한 혈관 내피세포로 분화되는 과정을 통해 진행된다(Asahara, T. and Kawamoto, A. (2004) Endothelial progenitor cells for postnatal vasculogenesis. Am . J. Physiol . Cell Physiol . 287, 572.579.). 골수로부터 나와서 순환하는 EPCs는 혈관 손상 부위로 이동하고, 새롭게 형성되는 혈관으로의 직접적인 삽입 또는 다양한 신생혈관형성 및 영양 인자들의 분비를 통해 새로운 혈관 형성에 관여한다(Jujo, K., Ii, M. and Losordo, D.W. (2008) Endothelial progenitor cells in neovascularization of infarcted myocardium. J. Mol . Cell . Cardiol. 45, 530.544., Urbich, C., Aicher, A., Heeschen, C., Dernbach, E., Hofmann, W.K., Zeiher, A.M. and Dimmeler, S. (2005) Soluble factors released by endothelial progenitor cells promote migration of endothelial cells and cardiac resident progenitor cells. J. Mol . Cell . Cardiol . 39, 733.742.).

따라서 EPCs는 재혈관신생(revascularization)을 통한 치료목적에 잠재적인 표적으로 주목받고 있다(Jujo, K., Ii, M. and Losordo, D.W. (2008) Endothelial progenitor cells in neovascularization of infarcted myocardium. J. Mol . Cell. Cardiol. 45, 530.544.).

또한, 최근의 연구들은 세포의 기능을 증가시키기 위한 생체 외(ex vivo) 유전자-변형 EPCs에 초점을 맞추고 있으며, 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor (VEGF)) 및 저산소증 유도인자-1a(hypoxia-inducible factor-1a)가 EPCs의 신생혈관형성 능력(pro-angiogenic capacity)을 증가시키는 활성이 있어 이를 사용하여 왔다(Iwaguro, H., Yamaguchi, J., Kalka, C., Murasawa, S., Masuda, H., Hayashi, S., Silver, M., Li, T., Isner, J.M. and Asahara, T. (2002) Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation 105, 732.738., Jiang, M., Wang, B., Wang, C., He, B., Fan, H., Guo, T.B., Shao, Q., Gao, L. and Liu, Y. (2008) Angiogenesis by transplantation of HIF-1a modified EPCs into ischemic limbs. J. Cell. Biochem . 103, 321.334.).

한편, 합토글로빈(haptoglobin: Hp)은 혈액순환 내의 급성기(acute-phase) 당단백질이며, 잘 알려져 있는 Hp의 생물학적 기능은 헤모글로빈(haemoglobin)의 포획이다. Hp는 Hp-헤모글로빈 복합체의 형성을 통해 혈관외 헤모글로빈-자극성 산화적 조직손상을 막는 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Lim, Y.K., Jenner, A., Ali, A.B., Wang, Y., Hsu, S.I., Chong, S.M., Baumman, H., Halliwell, B. and Lim, S.K. (2000) Haptoglobin reduces renal oxidative DNA and tissue damage during phenylhydrazine-induced hemolysis. Kidney Int . 58, 1033.1044., Buehler, P.W., Abraham, B., Vallelian, F., Linnemayr, C., Pereira, C.P., Cipollo, J.F., Jia, Y., Mikolajczyk, M., Boretti, F.S., Schoedon, G., Alayash, A.I. and Schaer, D.J. (2009) Haptoglobin preserves the CD163 hemoglobin scavenger pathway by shielding hemoglobin from peroxidative modification. Blood 113, 2578.2586).

또한, Hp는 동맥에서 발현될 수 있으며(Smeets, M.B., Pasterkamp, G., Lim, S.K., Velema, E., van Middelaar, B. and de Kleijn, D.P.V. (2002) Nitric oxide synthesis is involved in arterial haptoglobin expression after sustained flow changes. FEBS Lett. 529, 221.224.), 동맥 재구성(arterial restructuring)과 관련된 세포 이동 인자로서 작용하는 것으로 알려진 바 있다(de Kleijn, D.P.V., Smeets, M.B., Kemmeren, P.P.C.W., Lim, S.K., van Middelaar, B.J., Velema, E., Schoneveld, A., Pasterkamp, G. and Borst, C. (2002) Acutephase protein haptoglobin is a cell migration factor involved in arterial restructuring. FASEB J. 16, 1123.1125., Lohr, N.L., Warltier, D.C., Chilian, W.M. and Weihrauch, D. (2005) Haptoglobin expression and activity during coronary collateralization. Am . J. Physiol . Heart Circ . Physiol . 288, H1389.H1395).

그러나 지금까지 돌연변이형 합토글로빈을 이용하여 신생혈관 형성을 유도하는 연구에 대해서는 보고된 바가 없다.

1. J Clin Invest, 91:977-985, 1993

이에 본 발명자들은 돌연변이형 합토글로빈이 야생형 합토글로빈에 비하여 더 나은 혈관신생 작용을 촉진하는 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 143번째 아미노산이 Arg 이외의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 143번째 아미노산이 Arg 이외의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 돌연변이형 합토글로빈은 서열번호 1의 143번째 아미노산 부위 특이적 절단이 저해되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 돌연변이형 합토글로빈은 서열번호 1의 143번째 아미노산인 Arg이 Gln으로 치환된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 돌연변이형 합토글로빈은 서열번호 1의 143번째 아미노산인 Arg이 Leu으로 치환된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 혈관형성 부전-관련 질환으로 당뇨병성 궤양, 괴저, 허혈성 질환, 폐색성 혈관 질환, 심혈관 질환 및 국소빈혈로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 돌연변이형 합토글로빈 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 벡터 또는 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물은 혈관내피 전구세포가 성숙한 혈관 내피 세포로 분화될 수 있도록 혈관 형성을 촉진하는 활성이 우수하고, 모세관 유사 관 형성 능력이 우수하며, 세포의 이동성을 촉진시켜 혈관 미형성으로 인해 유발되는 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 야생형 합토글로빈 2-2 단백질의 아미노산 서열을 보여주는 모식도이다.
도 2는 143번 아미노산이 Arg에서 Gln으로 치환된 돌연변이형 합토글로빈 2-2 단백질의 아미노산 서열을 보여주는 모식도이다.
도 3은 143번 아미노산이 Arg에서 Leu으로 치환된 돌연변이형 합토글로빈 2-2 단백질의 아미노산 서열을 보여주는 모식도이다.
도 4는 야생형 합토글로빈(Hp2-2)과 돌연변이형 합토글로빈(변이형 Hp)의 절단 여부를 보여주는 웨스턴 블라팅 결과이다.
도 5는 야생형 합토글로빈 또는 돌연변이형 합토글로빈을 처리한 HUVECs 세포에서 VEGF 및 VEGFR2의 RNA양 변화를 관찰한 RT-PCR 결과이다.
도 6은 야생형 합토글로빈 또는 돌연변이형 합토글로빈을 처리한 HUVECs 세포에서 모세혈관-유사 관(capillary-like tube) 형성을 관찰한 결과이다.
도 7은 야생형 합토글로빈 또는 돌연변이형 합토글로빈을 처리한 HUVECs 세포에서 세포의 이동거리를 측정한 결과이다.

본 발명은 돌연변이형 합토글로빈(haptoglobin) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드를 제공함에 그 특징이 있다.

혈관신생(angiogenesis)은 성장인자, 사이토카인 및 기타 생리학적 분자뿐만 아니라 저산소증 및 낮은 pH와 같은 다양한 혈관신생 인자(angiogenic factor)에 반응하여 새로운 혈관이 생기도록 고도로 조절되는 과정을 말한다(Folkman and Shing, J. Biol. Chem., 267, 10931, 1992). 새로운 혈관이 발달하기 위한 혈관신생 메카니즘은 세포외 기질(ECM)의 분해 및 재구성, 이동, 증식, 분화 및 튜브(관) 형성을 조절하는 다양한 분자의 협동을 필요로 하며, 혈관신생 개시 이후에, VEGF, bFGF, PDGF 등을 비롯한 혈관신생 촉진 인자는 세포 표면 수용체의 자극을 통하여 내피세포를 활성화시키고, 활성화된 세포는 세포 증식과정, 세포 접착 분자의 발현 증가, 단백질 분해성 효소의 분비 증가, 세포 이동 및 침입의 증가를 일으킨다. 또한, 세포 부착을 위한 인테그린, 셀렉틴 및 면역글로불린 유전자 슈퍼 패밀리의 구성원뿐만 아니라 ECM을 분해하기 위한 매트릭스 메탈로프로테아제 및 세린 프로테아제와 같은 단백질 분해용 효소를 비롯한 다수의 분자가 세포의 증식 및 침입을 증진시키고(Brooks, Eur. J. Cancer, 32A, 2423, 1996), 나아가 ECM 성분 및 용해성 인자와 상호작용하는 세포 표면의 수용체로부터 유래한 신호 전달 메카니즘에 의해 관내강(Lumen) 형성 및 성숙 혈관으로의 분화가 유도됨으로써 혈관신생이 형성된다.

한편, 최근에는 혈관신생을 유도 또는 억제하는 인자를 이용하여 암, 류마티스 관절염, 건선, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 뇌혈관성 질환 등 혈관신생에 의존하는 질병을 치료하고자 하는 시도가 활발히 이루어지고 있다 (Folkman J., J. Nat. Med., 1:27, 1995; Jackson J.R., et al., FASEB J., 11:457, 1997; Risau W., Nature, 386:671, 1997; Bussolino, F., et al., Trends Biochem. Sci., 22:251, 1997; Hanahan D., et al., Cell, 86:353, 1996).

정상 성인의 경우, 혈관을 이루고 있는 내피세포의 교체 시간은 일반적으로 47일~20,000일로 다양하며, 매우 엄격한 조절을 받고 있다. 일반적으로 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1), 혈소판 인자-4(platelet factor-4), 엔지오스타틴(angiostatin) 등의 혈관신생 억제인자와, 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor), 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor) 등과 같은 혈관신생 촉진인자가 평상시에는 양적 평형 상태를 유지하여 혈관신생이 일어나지 않지만, 상처나 암이 발생한 경우, 상처 발병 조직의 재생 및 암의 성장을 위하여 혈관신생 억제인자와 촉진인자의 양적 평형상태가 깨어지고 새로운 혈관이 형성되는데, 이때 혈관신생 촉진인자의 과다 발현이 관여하게 된다.

따라서 과다한 혈관 형성은 질병 악화의 주원인이 되기도 하지만, 혈관의 미형성 또한 심각한 질병의 원인이 되고 있다. 혈관신생은 상처 치유나 조직 재생에 필수적인 현상이라 할 수 있는데, 예를 들어 혈관 형성이 미발달된 태반은 유산의 중요한 원인이 되며, 혈관의 미형성으로 인한 괴사, 궤양 및 허혈의 경우 조직이나 기관의 기능 이상을 유발하거나, 사망의 원인이 될 수 있다. 또한, 동맥경화증, 심근경색 및 협심증과 같은 질병도 원활하지 못한 혈액 공급이 원인이 되고 있다.

그러므로 혈관의 미형성으로 인한 저산소 상태 또는 저영양 상태의 유발로 인한 조직 손상을 감소시키고, 원활한 조직 재생을 위해서는 새로운 혈관 형성을 유도하거나 촉진시키는 역할이 매우 중요하다.

특히, 혈관신생은 상처받은 피부 조직이 재생되기 위한 필수적인 상처 회복 과정에 반드시 수반되어야 한다. 상처의 초기 단계에는 세포의 괴사와 혈관의 파괴로 인한 염증 반응이 일어나게 되고, 이 염증 반응 이후에 혈액 성분의 탈혈관 현상, 혈소판의 활성화 및 혈액 응고와 함께, 칼리크레인, 트롬빈 및 플라스민 등과 같은 생물학적 매개 물질이 형성되는 일련의 과정을 거치게 된다.

또한, 혈관신생을 이용한 생체 질환의 치료를 혈관신생 치료라고 불리기도 하는데, 이미 혈관내피 성장인자와 같은 혈관신생 촉진인자는 중증의 국소 빈혈을 위한 치료제로 사용되고 있다. 또한 섬유아세포 성장인자, 표피 성장인자(epidermal growth factor) 및 혈소판 유도 내피 성장인자(platelet-derived endothelial growth factor) 등의 혈관신생 촉진인자들도 임상 치료를 위하여 연구되고 있다.

본 발명에서는 상기와 같이 혈관의 미형성으로 인해 발생하는 질환을 치료하기 위해 돌연변이형 합토글로빈이 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 합토글로빈의 143번 아미노산이 돌연변이 되어 부위 특이적 절단능이 상실되면 혈관형성 촉진작용이 매우 우수함을 최초로 규명하였다.

사람은 합토글로빈(Hp)에 대해 대립유전자 다형성(allelic polymorphism)을 보인다. 2개의 주요한 대립유전자인 Hp ¹ 및 Hp ² 에 따라, Hp는 Hp 1-1(Hp ¹ /Hp ¹ ), Hp 2-1 (Hp ¹ /Hp ² ) 및 Hp 2-2(Hp ² /Hp ² )의 3개의 주요한 형질들로 발현된다(Maeda, N., Yang, F., Barnett, D.R., Bowman, B.H. and Smithies, O. (1984) Duplication within the haptoglobin Hp2 gene. Nature 309, 131.135.). Hp 2-2 는 Hp 1-1에 비해 더 큰 신생혈관형성 활성을 가지고 있으며(Cid, et al. (1993) Identification of haptoglobin as an angiogenic factor in sera from patients with systemic vasculitis. J. Clin . Invest . 91, 977.985.), 따라서 본 발명에서는 Hp 2-2 가 혈관형성에 미치는 영향을 조사하였다.

합토글로빈은 Hp2 유전자가 세포내에서 발현되어 a사슬과 β사슬이 연결되어 있는 하나의 폴리펩티드(preprohaptoglobin)로 합성된 후, N 말단의 18개 아미노산으로 이루어진 신호 서열이 제거되고 388개 아미노산의 폴리펩티드(prohaptoglobin)가 되고, 그 후 다시 143번 Arg 위치에서 부위 특이적 절단이 일어나면서 143번 Arg이 제거되고 142개의 아미노산으로 이루어진 a사슬과 245개의 아미노산으로 이루어진β사슬로 나누어진다. 이 후, 이들 a사슬과 β사슬이 이황화 결합되어 중합체를 이루어 세포외로 분비된다.

한편, 전신성 혈관염 환자의 혈청에서 혈관신생에 관여하는 물질을 분리하여 확인한 결과 합토글로빈이 정상인에 비하여 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 분리된 합토글로빈 2-2(Hp 2-2)를 사용하여 마트리겔(Matrigel) 상에서 실험관 내 관 형성(in vitro tube formation)을 확인한 결과 20ug/ml 이상의 농도에서 효과가 있음이 확인되었다.

본 발명자들은 합토글로빈을 이용한 혈관신생 실험 중 합토글로빈의 성숙된 형태인 합토글로빈 2-2(Hp 2-2)에 비하여 미성숙 형태인 프리프로합토글로빈(preprohaptoglobin)에 의하여 더 높은 혈관생성 효과가 발휘된다는 것을 확인하고 이에 대한 실험을 시작하였다.

본 발명은 합토글로빈 유전자(Hp2)의 143번 아미노산인 Arg을 Gln이나 Leu으로 치환시켜 성숙된 형태의 합토글로빈 2-2(Hp 2-2)를 생성하지 못하도록 하는 돌연변이형 합토글로빈 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이 경우 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 모두 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 돌연변이형 합토글로빈 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명에서 상기 재조합 벡터는 돌연변이형 합토글로빈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 즉 돌연변이형 합토글로빈 유전자가 벡터내의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 삽입된 발현벡터를 말하며, 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 발현벡터로는 이에 한정되지 않지만, 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 사용할 수 있다. 바람직하게는 레트로 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

본 발명의 일실시예에서는 야생형 합토글로빈의 143번 아미노산이 Arg에서 Gln 또는 Leu으로 치환될 수 있도록 돌연변이형 합토글로빈 유전자를 제작하여 pcDNA3.0 벡터에 삽입한 재조합 발현벡터를 제조하였으며, 이를 형질감염(transfection)하여 세포에 도입하였다.

본 발명에 따른 돌연변이형 합토글로빈이 도입되어 형질전환된 형질전환체는는 형질전환체에서 발현된 돌연변이형 합토글로빈에 의해 혈관의 분화가 촉진되어 혈관신생을 촉진하는 활성을 갖는 특징이 있다.

또한, 본 발명은 야생형 합토글로빈 아미노산 서열 중 143번째 아미노산이 Arg 이외의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드를 제공한다.

상기 폴리펩티드는 야생형 합토글로빈의 143번 아미노산이 돌연변이화 되어 부위 특이적 절단능이 상실된 돌연변이형 합토글로빈 단백질 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있으며, 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 143번 아미노산이 돌연변이화 되어 부위 특이적 절단능이 상실된 합토글로빈 단백질과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)를 포함할 수 있다.

상기 "기능적 동등물"에는 상기 돌연변이형 합토글로빈 아미노산 서열 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로 돌연변이형 합토글로빈 단백질과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.

상기 "기능적 유도체"는 상기 돌연변이형 합토글로빈 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 상기 돌연변이형 합토글로빈 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.

나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이형 합토글로빈 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 돌연변이형 합토글로빈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 혈관형성 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 폴리펩티드 또는 재조합 벡터를 함유하는 혈관형성 촉진용 조성물은 튜브 형성 및 세포의 이동을 촉진시키는 작용을 통해 신생혈관을 형성하는 특징이 있다.

따라서 본 발명에 따른 상기 혈관형성 촉진용 조성물은 혈관형성 부전과 관련된 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 부전-관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 혈관형성 촉진용 조성물에 의해 예방 또는 치료할 수 있는 혈관형성 부전-관련 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 당뇨병성 궤양, 괴저, 허혈성 질환, 폐색성 혈관 질환, 심혈관 질환 및 국소빈혈로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 혈관형성 촉진용 조성물 또는 혈관신생 부전-관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 생리활성 성분으로서 약학적으로 유효한 양의 폴리펩티드 또는 재조합 벡터를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여를 위한 다양한 형태로 제형화 될 수 있다.

비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 투여경로로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 생리활성 성분인 상기 폴리펩티드, 재조합 벡터의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 생리활성 성분의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 생리활성 성분을 혈관신생 부전-관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

돌연변이형 합토글로빈의 제조 및 분리

본 발명자들은 혈관신생 활성이 우수한 합토글로빈의 제조를 위해 야생형 합토글로빈인 서열번호 1의 서열에서 143번째 아미노산 Arg을 Gln 또는 Leu으로 치환된 돌연변이형 합토글로빈을 제조하였는데, 구체적인 제조 과정은 하기에 기술된 바와 같다.

1-1. 야생형 합토글로빈 및 이를 포함한 발현용 벡터 제작

인간 게놈 DNA로부터 합토글로빈 Hp2 cDNA를 하기와 같은 프라이머 세트 및 Taq MasterMix(Qiagen)을 이용하여 제조자의 방식에 따라 증폭시켰다.

Hp2-F: 5'-GCGAATTCGCCACCATGAGTGCCCTGGGAGCTG-3'

Hp2-R: 5'-CCGGTACCGTTCTCAGCTATGGTCTTCTGAAC-3'

증폭 결과 예측된 1218bp의 생성물과 일치하는 단편이 얻어졌으며, 증폭된 Hp2 cDNA를 EcoRI 및 KpnI을 이용하여 flag 유전자를 포함하고 있는 pcDNA 3.0 벡터에 클로닝하였다. 상기와 같은 방법으로 제작된 벡터는 서열결정법을 통하여 정확한 배향과 프레임으로 클로닝 되었음을 최종 확인하였다.

1-2. 돌연변이형 합토글로빈 및 이를 포함한 발현용 벡터 제작

상기 야생형 합토글로빈의 아미노산 서열을 대상으로 서열번호 1의 143번째 아미노산인 Arg가 Gln 또는 Leu로 각각 변이되도록 143번째 Arg를 코딩하는 서열인 CGG를 Gln를 코딩하도록 CAG 또는 Leu를 코딩하도록 CTG로 각각 돌연변이화 시켰다. 이때 돌연변이는 QuickChange site-directed mutagenesis kit(Stratagene)을 사용하여, 제조자의 방식에 따라 돌연변이 시켰고, 최종적으로 돌연변이된 합토글로빈 유전자는 Flag gene 이 함유된 pcDNA3.0 벡터에 클로닝 되었다.

Hp2-R143Q-F: 5'-GCAAACCCAGTGCAGCAGATCCTGGGTGGACAC-3'

Hp2-R143Q-R: 5'-GTGTCCACCCAGGATCTGCTGCACTGGGTTTGC-3'

Hp2-R143L-F: 5'-GCAAACCCAGTGCAGCTGATCCTGGGTGGACAC-3'

Hp2-R143L-R: 5'-GTGTCCACCCAGGATCAGCTGCACTGGGTTTGC-3'

돌연변이형 합토글로빈 유전자가 함유된 벡터는 서열결정법을 통하여 정확한 배향과 프레임으로 클로닝 되었음을 최종 확인하였다.

1-3. 웨스턴 블라팅을 통한 야생형 합토글로빈 및 돌연변이형 합토글로빈 발현 분석

상기 실시예 1-1 및 실시예 1-2에서 제작된 벡터를 cos7 세포주에 형질전환하였다. 즉, cos7 세포주를 6 well plate의 각 well에 1×10⁶으로 분주하고 overnight 배양한 후, lifopectamine^TM(invitrogen, USA)을 이용하여 제조자의 방식에 따라 상기 벡터를 트랜스펙션하였다.

48시간 배양 후, 세포 배양액에 5X 환원용 샘플 버퍼를 넣고 끓인 후 SDS-PAGE로 전기영동하고 PVDF 멤브레인으로 단백질을 이동시켰다. PVDF 멤브레인을 블라킹 용액(5% 스킴 밀크)을 이용하여 상온에서 1시간 동안 블라킹 한 후, rabbit anti-Hp a 항체(1:500) 또는 rabbit anti-Hp β 항체(1:500)와 상온에서 2시간 반응시켰다. 상기 PVDF 멤브레인을 PBS로 10분간 3번 세척한 후, anti-rabbit HRP conjugated (1:4000, Sigma) 이차 항체로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

그 결과, 야생형 합토글로빈(Hp2-2)의 경우 20kDa의 a사슬과 47kDa의 β 사슬이 확인되었으나(도 4A, 4B), 143번 아미노산을 Arg에서 Gln으로 치환한 돌연변이형(변이형 Hp)의 경우 67kDa의 a사슬과 β사슬이 연결된 밴드를 확인할 수 있었다(도 4A, 4B). 한편, 143번 아미노산을 Arg에서 Leu으로 치환한 돌연변이형(변이형 Hp(Leu))에서도 67kDa의 절단되지 않은 밴드가 확인되었다(도 4C).

1-4. 돌연변이형 합토글로빈의 정제

본 발명자들은 돌연변이형 합토글로빈이 혈관형성 촉진에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 돌연변이형 합토글로빈을 정제하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 1-3과 동일한 방식으로 상기 재조합 벡터를 cos 7 세포주로 형질전환시키고, 형질전환된 후 48시간 경과 후 세포 배양액을 원심분리기를 이용하여 농축시킨 후, 필터를 통과시켰다. 트리스 완충 생리식염수(TBS)로 5배 희석하고, Anti-FLAG M2 affinity gel(Sigma)을 이용하여 제작하고 Anti-FLAG 컬럼에 HiLoad Pump P-50(Pharmaciaibotech)를 이용하여 적용하였다. 용출은 FLAG 펩티드(Sigma)를 이용하여 제조자 방식에 따라 진행하였다. 용출액은 SDS-PAGE 후, Anti-flag 단일항원 항체를 이용한 웨스턴 블라팅으로 합토글로빈 발현을 확인할 수 있었고, 용출된 합토글로빈을 ELISA를 이용하여 정량한 후 1㎍/ml 로 나누어 -70℃에 저장하였다.

<실시예 2>

야생형 및 돌연변이형 합토글로빈 처리에 의한 VEGF와 VEGFR2의 발현양 변화의 관찰 : RT-PCR법

혈관계에 관여하는 신호 전달과정에 있어서, VEGF/VEGFR2 경로는 VECs의 증식, 화학주성 이동 및 생존을 조절하는 주요한 성장인자 신호전달로, 혈관신생 과정에서 VEGF 및 VEGFR2의 발현양이 증가하는 것으로 알려져 있는바, 본 발명자들은 야생형 합토글로빈에 비해 돌연변이형 합토글로빈이 혈관형성에 더 나은 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 VEGF 및 VEGFR2의 발현양을 정량적 RT-PCR을 이용하여 분석해 보고자 하였다.

이를 위하여 본 발명자들은 HUVECs 세포를 24 well plate에 1×10⁵씩 분주하고 overnight 배양하였다. 그 후 야생형 합토글로빈(Hp 2-2, 1㎍/ml) 또는 돌연변이형 합토글로빈(0.1㎍/ml을 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이 후 VEGF 및 VEGFR2의 발현양을 조사하기 위하여 정량적 RT-PCR을 실시하였는데, 이 경우 RT-PCR은 통상의 방법(Lee, M.Y., Kim, S.Y., Choi, J.S., Lee, I.H., Choi, Y.S., Jin, J.Y., Park, S.J., Sung, K.W., Chun, M.H. and Kim, I.S. (2002) Upregulation of haptoglobin in reactive astrocytes after transient forebrain ischemia in rats. J. Cereb. Blood Flow Metab. 22, 1176.1180.)에 따라 수행하였고, RT-PCR은 실시간 PCR 기계(MX-3000P; Stratagene)를 사용하여 정량적 실시간(quantitative real-time) RT-PCR 을 FullVelocity SYBR Green QPCR master mix (Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 수행하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머 조합은 하기와 같다.

VEGF-F: 5'-GCGGAGAAAGCATTTGTTTGT-3'

VEGF-R: 5'-TTGCAGATGTGACAAGCCG-3'

VEGFR2-F: 5'-TGGGAACCGGAACCTCACTATC-3'

VEGFR2-R: 5'-GTCTTTTCCTGGGCACCTTCTATT-3'

GAPDH-F: 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'

GAPDH-R: 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 돌연변이형 합토글로빈(Hp(Gln) 또는 Hp(Leu))를 처리한 경우 0.1㎍/ml을 처리한 경우 VEGF와 VEGFR2의 mRNA가 대조군(PBS 처리)에 비하여 2~3배 증가하는 것으로 확인되었다. 한편, 야생형 합토글로빈(Hp 2-2)를 처리한 세포에서는 0.1㎍/ml을 처리한 경우(실험 결과 미제시)는 물론 1㎍/ml을 처리한 경우에도 대조군에 비하여 VEGF와 VEGFR2의 발현양에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

<실시예 3>

야생형 및 돌연변이형 합토글로빈 처리에 따른 튜브 형성 비교

본 발명자들은 야생형 및 돌연변이형 합토글로빈이 혈관형성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 Matrigel 상에서 야생형 및 돌연변이형 합토글로빈에 의해 시험관 내 튜브 형성(in vitro tube formation)이 나타나는 정도를 관찰해 보고자 하였다.

이를 위하여 우선 차가운 Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA)을 48-웰(well) 플레이트의 웰에 각각 넣고, 37℃에서 30분간 중합하였다. 야생형 합토글로빈(Hp 2-2, 1㎍/ml) 또는 돌연변이형 합토글로빈(Hp(Gln), Hp(Leu) 각각 0.1㎍/ml)으로 처리된 HUVECs 세포(4×10⁴ 세포/웰)를 상기 Matrigel에 깔고, 0.5% FBS가 포함된 EGM-2 배지에서 6 시간 동안 배양하였다. 이후 튜브(tubular) 네트워크의 형성을 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 야생형 합토글로빈(Hp 2-2)을 1㎍/ml의 농도로 처리한 경우 모세관 유사 관(capillary-like tube) 형성에 있어서 대조구(PBS 처리)와 별다른 차이를 나타내지 않는 것으로 확인되었으나, 돌연변이형 합토글로빈(Hp(Gln), Hp(Leu))을 0.1㎍/ml만 처리해도 훨씬 높은 모세관 유사 관(capillary-like tube) 형성을 관찰할 수 있었다(도 6). 따라서, 돌연변이형 합토글로빈이 야생형 합토글로빈에 비하여 튜브의 네트워크 구조 형성에 훨씬 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

야생형 및 돌연변이형 합토글로빈 처리에 따른 세포 이동 비교

본 발명자들은 야생형 및 돌연변이형 합토글로빈이 내피 세포 기능에 영향을 주는지 알아보기 위하여, 야생형 및 돌연변이형 합토글로빈 처리시 세포 이동 분석을 실시하였다.

이를 위하여 본 발명자들은 Oris^TM cell migration assay kit를 사용하여 제조자 방식에 따라 실험을 진행하였다. 우선 HUVECs 세포를 collagen I이 코팅된 96 well plate에 5×10⁴씩 분주하여 overnight 배양하고, 야생형 합토글로빈(Hp 2-2, 1㎍/ml), 돌연변이형 합토글로빈(Hp(Gln), Hp(Leu), 0.1㎍/ml)을 처리한 후 24시간 동안 배양하여 현미경으로 사진을 찍고 세포의 이동거리를 측정하였다. 이동 거리는 각각 임의의 12곳에서 측정하여 평균±표준편차로 나타내었다.

그 결과, 야생형 합토글로빈(Hp 2-2)에 비해 돌연변이형 합토글로빈(Hp(Gln), Hp(Leu))을 처리한 경우 대조구(PBS 처리)에 비하여 세포 이동 거리가 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 7).

< 실시예 5>

통계처리

실험 및 대조구 조건에서 얻은 값들 사이의 차이를 분석하기 위하여 Student's t-test 및 편차(variance)의 one-way 분석을 사용하였다. P < 0.05 를 유의성 있는 것으로 간주하였다.

상기와 같은 실험 결과를 통해, 돌연변이형 합토글로빈은 혈관 내피세포의 혈관 신생을 촉진시키며, 특히 0.1㎍/ml의 낮은 농도에서도 혈관 신생에 현저한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이는 종래 혈관 신생효과가 있는 것으로 알려진 야생형 합토글로빈의 경우 20㎍/ml 이상의 농도에서 효과를 나타내는 것과 비교할 때 그 효과면에서 훨씬 뛰어난 활성을 나타내는 개선된 물질이라 할 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Use of Mutated Haptoglobin having angiogenesis promoting activity <130> PN1211-523 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 388 <212> PRT <213> Haptoglobin amino acid sequence from Homo Sapiens <400> 1 Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly Cys Pro 1 5 10 15 Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr 20 25 30 Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr 35 40 45 Thr Leu Asn Asn Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys 50 55 60 Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile 65 70 75 80 Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr 85 90 95 Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn Asn Glu 100 105 110 Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu 115 120 125 Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn Pro Val Gln Arg Ile 130 135 140 Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp Gln Ala Lys 145 150 155 160 Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu Ile Asn Glu 165 170 175 Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn His Ser Glu 180 185 190 Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu Thr Leu Tyr Val Gly 195 200 205 Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His Pro Asn Tyr 210 215 220 Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys Val Ser Val 225 230 235 240 Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr Ala Glu 245 250 255 Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala Asn Phe 260 265 270 Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala Asp Gln 275 280 285 Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu Lys Lys 290 295 300 Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu His Thr 305 310 315 320 Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr Gly Asp 325 330 335 Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr Trp Tyr 340 345 350 Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val Ala Glu Tyr 355 360 365 Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln Lys Thr 370 375 380 Ile Ala Glu Asn 385

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열 중 143번째 아미노산이 Arg 이외의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어진 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드.
제1항에 있어서,
상기 돌연변이형 합토글로빈은 서열번호 1의 143번째 아미노산 부위 특이적 절단이 저해되는 것을 특징으로 하는 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드.
제1항에 있어서,
상기 돌연변이형 합토글로빈은 서열번호 1의 143번째 아미노산인 Arg이 Gln으로 치환된 것을 특징으로 하는 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드.
제1항에 있어서,
상기 돌연변이형 합토글로빈은 서열번호 1의 143번째 아미노산인 Arg이 Leu으로 치환된 것을 특징으로 하는 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드.
제1항의 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
삭제
제1항의 돌연변이형 합토글로빈 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 혈관형성 부전-관련 질환으로 당뇨병성 궤양, 괴저, 허혈성 질환, 폐색성 혈관 질환, 심혈관 질환 및 국소빈혈로 이루어진 군 중에서 선택되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 혈관형성 촉진용 조성물.