WO2007013603A1 - リンパ管新生促進剤 - Google Patents

リンパ管新生促進剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2007013603A1
WO2007013603A1 PCT/JP2006/315010 JP2006315010W WO2007013603A1 WO 2007013603 A1 WO2007013603 A1 WO 2007013603A1 JP 2006315010 W JP2006315010 W JP 2006315010W WO 2007013603 A1 WO2007013603 A1 WO 2007013603A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
seq
hgf
nucleic acid
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/315010
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ryuichi Morishita
Yasufumi Kaneda
Hironori Nakagami
Yukihiro Saito
Original Assignee
Anges Mg, Inc.
Osaka University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anges Mg, Inc., Osaka University filed Critical Anges Mg, Inc.
Priority to EP06781920.1A priority Critical patent/EP1911459B1/en
Priority to JP2007526918A priority patent/JP4111993B2/ja
Priority to ES06781920.1T priority patent/ES2561155T3/es
Priority to US11/996,898 priority patent/US20110160132A1/en
Publication of WO2007013603A1 publication Critical patent/WO2007013603A1/ja
Priority to US15/088,443 priority patent/US20160271219A1/en
Priority to US16/239,381 priority patent/US20190321444A1/en
Priority to US17/240,373 priority patent/US20220088141A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0016—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the nucleic acid is delivered as a 'naked' nucleic acid, i.e. not combined with an entity such as a cationic lipid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/4753—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to a novel lymphangiogenesis-promoting agent containing HGF or a nucleic acid encoding it as an active ingredient and a method for promoting Z or lymphangiogenesis.
  • the present invention also relates to a prophylactic or therapeutic agent for lymphedema, or a method for preventing or treating lymphedema. Further, the present invention relates to a screening method for a compound having lymphangiogenesis-promoting activity or a compound having a preventive or therapeutic effect on lymphedema.
  • Lymphedema is a condition in which tissue fluid abnormally accumulates due to lymphatic obstruction, causing swelling, chronic inflammation and / or fibrosis.
  • Primary and secondary lymphedema are known.
  • Primary lymphedema is known as Milroy's disease, Meige's disease, distal hypoplasia, proximal obstructive lymphadenopathy, giant lymphangiopathy, etc. In particular, it often appears as a sequela of surgical treatment for cancer, especially after surgery such as breast cancer, eclampsia cancer, prostate cancer, force-positive sarcoma, or radiation therapy. .
  • lymphedema of the upper limb is expected to develop at a rate of several percent or more after breast cancer surgery.
  • Lower limb lymphedema is often found after surgery for uterine cancer.
  • trauma such as infection, burns, and inflammation can also cause secondary lymphedema.
  • Lymphedema significantly reduces motor function and lowers the patient's quality of life in order to increase the possibility of infection in the affected area.
  • symptomatic therapies such as massage, exercise therapy and supporters are common as powerful treatments for lymphedema, and there are currently no drastic treatments or drugs.
  • drugs There are few known drugs, and the only compound known as guaifenesin has been reported to be effective in the treatment of lymphedema, but its therapeutic effect has not yet been clarified (patent text) Offer 1).
  • VEGF-C a member of the VEGF family, has been reported as a peptidic factor that promotes lymphangiogenesis (Patent Documents 2 and 3, Non-Patent Documents 1 and 2). However, other VEGF family members do not act to promote lymphangiogenesis. VEGF-C is the only known lymphangiogenesis-promoting factor.
  • VEGF which is a member of the VEGF family, like VEGF-C (VEGF-A, or
  • VEGF vascular permeability
  • VEGF vascular permeability increasing action
  • VEGF-C is a ligand for VEGF receptor 3 (VEGFR-3), and it has been found that VEGFR-3 alone is sufficient for lymphangiogenesis, but VEGF-C is Also binds to VE GFR-2.
  • VEGFR-2 deficient mice die earlier than VEGF-A deficient mice, and VEGF-C and other VEGF members are supposed to supplement and obtain the effects of VEGF (Scavelli, C. J. Anat. (2004) 433-449).
  • VEGF exerts its action through binding to VEGFR-1 and VEG FR-2. Therefore, it is believed that the activity of VEGFR-2 induces increased vascular permeability (Issbrucker, K. et al., FASEB J. express articl e See 10.1096 / lj.02-0329ije. Published online December 18, 2002).
  • HGF is a hepatocyte growth factor, and has various physiological functions in addition to promoting the growth of hepatocytes, and angiogenic action is one of them (see Non-Patent Document 3, etc.). .
  • Application of HGF to the treatment of ischemic diseases has been promoted by utilizing the angiogenic action of HGF (Patent Document 4, Patent Document 5, Non-Patent Document 4).
  • Patent Document 1 WO03 / 000242
  • Patent Document 2 US Patent Publication No. 6,818220
  • Patent Document 3 US Patent Publication No. 6,689352
  • Patent Document 4 WO97 / 07824
  • Patent Document 5 WO01 / 32220
  • Non-Patent Literature l Szuba, A, et al., FASEB J. express article 10.1096 / fj.02-0401fje.Published online October 18, 2002
  • Non-Patent Document 2 Young—sup, Yoo et al., J. Clin. Invest. 111: 717-725 (2003)
  • Non-Patent Document 3 Nakamura Y. et al., J Hypertens. 1996 Sep; 14 (9): 1067-72
  • Non-Patent Document 4 Taniyama Y., et al., Gene Therapy (2001) 8, 181-189
  • An object of the present invention is to provide a novel use of HGF and its gene. More specifically, an object of the present invention is to provide a new therapeutic agent and a therapeutic method for lymphedema, which have been effective without existing effective therapeutic agents and methods.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems.
  • the present inventors tried to search for a factor that can reduce or eliminate lymphedema, and found that HGF significantly reduces lymphedema. It was also found that HGF has a lymphangiogenic effect that induces the proliferation of lymphatic endothelial cells.
  • VEGF gene therapy has a high risk of inducing edema. Therefore, the present inventors have difficulty applying VEGF to the treatment of lymphedema. I thought it was difficult.
  • VEGF-C also has the potential to increase cell permeability by binding to VEGF receptors other than VEGF-C. Therefore, the inventors considered that the application of VEGF-C to the treatment of lymphedema was also at high risk.
  • HGF is known as an angiogenic factor, but VEGF, also known as an angiogenic factor, has no lymphangiogenic activity (see, eg, Dev. Biol. 1997, 188: 96-109) In addition, considering that it is thought that it does not have the effect of reducing lymphedema as described above, HGF has the effect of reducing lymphangiogenesis and lymphedema! / The new findings of the present inventors were a surprising fact.
  • HGF receptor c-met is expressed in lymphatic endothelial cells, which supports the lymphangiogenic action of HGF, which is the strength of the mechanism of action. It was clarified that phosphorylation of MA PK and Akt, intracellular signaling proteins known to induce acid trough, is also induced in lymphatic endothelial cells.
  • HGF and its gene are effective as a therapeutic or preventive agent for lymphedema and a pro-angiogenic agent for lymphangiogenesis. That is, the present invention provides the following [1] to [44].
  • a lymphangiogenesis-promoting agent comprising HGF or a protein or compound functionally equivalent to HGF as an active ingredient.
  • lymphangiogenesis promoting agent which is a protein according to any one of the following (a) to (d):
  • a protein encoded by a nucleic acid that is hybridized under stringent conditions with a nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and comprising the amino acid set forth in SEQ ID NO: 2 A protein that is functionally equivalent to a protein containing a sequence.
  • a lymphangiogenesis promoting agent comprising, as an active ingredient, nucleic acid encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF.
  • lymphangiogenesis promoting agent according to any one of [1] to [6], which is used as a drug for prevention or treatment of lymphedema.
  • a method for promoting lymphangiogenesis comprising a step of administering HGF or a protein or compound functionally equivalent to HGF to a subject.
  • HGF or a protein force functionally equivalent to HGF
  • a method for promoting lymphangiogenesis comprising the step of administering to a subject a nucleic acid encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF.
  • nucleic acid is a naked nucleic acid.
  • a method for inducing activation of HGF receptor and promoting lymphangiogenesis by the activation comprises the step of administering HGF or a protein or compound functionally equivalent to HGF to a subject.
  • the protein according to [15] which is a protein according to any one of the following (a) to (d): (a) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
  • a method for preventing or treating lymphedema which comprises the step of administering to a subject a nucleic acid encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF.
  • [18] A nucleic acid capable of encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF
  • the method according to [17] which is a nucleic acid encoding the protein according to any one of (a) to (d) below:
  • nucleic acid is a naked nucleic acid.
  • HGF HGF
  • a protein or compound functionally equivalent to HGF in the manufacture of a lymphangiogenesis-promoting agent or a drug used for the prevention or treatment of lymphedema.
  • the protein according to [21] which is a protein described in any one of the following (a) to (d):
  • nucleic acid encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF in the manufacture of a lymphangiogenesis-promoting agent or a drug used for the prevention or treatment of lymphedema.
  • a nucleic acid capable of encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF The use according to [23], which is a nucleic acid encoding the protein according to any one of (a) to (d) below;
  • nucleic acid according to [23] or [24], wherein the nucleic acid is inserted into an expression vector for mammals.
  • nucleic acid Use of the nucleic acid according to any one of [23] to [25], wherein the nucleic acid is a naked nucleic acid
  • a screening method for a compound having a lymphangiogenesis-promoting activity or a compound having a preventive or therapeutic effect on lymphaedema comprising the following steps (a) to (c):
  • test compound (a) contacting the test compound with HGF receptor or a protein functionally equivalent to HGF receptor,
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is obtained by substituting, deleting, inserting, and Z or adding one or more amino acids to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4.
  • a screening method for a compound having a lymphangiogenesis-promoting activity or a compound having a preventive or therapeutic effect on lymphaedema comprising the following steps (a) to (c):
  • test compound (a) contacting the test compound with a cell expressing a HGF receptor or a protein functionally equivalent to the HGF receptor,
  • test compound was contacted to increase the proliferation ability of the cells compared to the case.
  • a process of selecting test compounds that have increased migration or phosphorylated signal molecules is provided.
  • HGF receptor or a protein functionally equivalent to the HGF receptor is selected from the following (i) to (iv): (i) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is obtained by substituting, deleting, inserting, and Z or adding one or more amino acids to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4.
  • a nucleic acid capable of encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF The vector according to [31], which is a nucleic acid encoding the protein according to any one of (a) to (d) below;
  • a nucleic acid capable of encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF The drug according to [36], which is a nucleic acid encoding the protein according to any one of (a) to (d) below;
  • a method for preventing or treating lymphedema comprising:
  • a nucleic acid capable of encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF The method according to [39], which is a nucleic acid encoding the protein according to any one of (a) to (d) below:
  • [42] Use of a mammalian expression vector into which a nucleic acid encoding a protein functionally equivalent to HGF or HGF is inserted in the manufacture of a drug for the prevention or treatment of lymphedema, the vector being a naked Use of a vector characterized by being administered by intramuscular injection in or around an affected area of a subject in a stable state.
  • a nucleic acid capable of encoding HGF or a protein functionally equivalent to HGF The use according to [42], which is a nucleic acid encoding the protein according to any one of (a) to (d) below;
  • FIG. 1 is a photograph showing fluorescent immunostaining of lymphatic endothelial cells.
  • the upper panel is stained with anti-c-met antibody
  • the middle panel is nuclear staining with DAPI
  • the lower panel is a superposition of these. From these, it was confirmed that c-met was expressed in all cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of examining the proliferative ability of human recombinant HGF using MTS Atsey. The The vertical axis is the measured value. HGF has been shown to promote lymphatic endothelial cell proliferation in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of examination of migration ability by human recombinant HGF by migration ability sey (migration assey). The vertical axis is the number of cells. HGF has been shown to promote lymphatic endothelial cell migration.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of examination of the proliferation ability by introduction of a naked cDNA plasmid by MTS Atsey.
  • the vertical axis is the measured value. It has been shown that introduction of the HGF gene is effective in promoting the proliferation of lymphatic endothelial cells.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of examination of the growth ability by introduction of a naked cDNA plasmid by c-fos promoter assembly.
  • the vertical axis represents the measured value of luciferase activity.
  • the ability to introduce the HGF gene has been shown to be effective in promoting the proliferation of S lymphatic endothelial cells.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of examination of the growth ability by introduction of a naked cDNA plasmid by c-fos promoter assembly.
  • the vertical axis represents the measured value of luciferase activity. It is shown that the HGF cDNA expression vector significantly increases the c-fos promoter activity, whereas the VEGF cDNA expression vector does not increase the c-fos promoter activity! /.
  • This graph shows the effects of HGF on the proliferation and migration of human lymphatic endothelial cells. A is the result of examining cell proliferation by MTS assembly, and B is the result of examining migration ability by migrating assembly.
  • Recombinant human HGF is added to human lymphatic endothelial cell cultures at concentrations of 0, 2, 10, and 50 ng / ml to perform each assay.
  • the vertical axis of A is the absorbance at 490 nm.
  • the vertical axis of B is the number of cells. It has been shown that proliferation and migration are promoted by HGF supplemented silkworms. * p ⁇ 0.001 (for human recombinant HGF 0 ng / ml), ⁇ p ⁇ 0.001 (for human recombinant HGF 2 ng / ml).
  • FIG. 8 This is a graph showing the effect of improving lymphatic edema by HG F cDNA expression plasmid in a lymphatic edema model rat having lymphatic edema at the base of the tail.
  • the horizontal axis shows the number of days after operation (Day), and the vertical axis shows the thickness (mm) of the base of the tail.
  • a GFP expression plasmid was injected into the Venus group
  • an HGF expression plasmid was injected into the HGF group
  • a VEG F expression plasmid was injected into the VEGF group at 200 g / 0.1 ml
  • physiological saline was injected into the saline group.
  • 0.1 ml of water was injected. Naked HGF cDNA administration helps reduce tail thickness and increases It has been shown that mumps tube edema is improved.
  • FIG. 9 is a graph in which the area under the curve of the graph shown in FIG. 8 is calculated. It is shown that the tail thickness was significantly reduced only in the group of rats introduced with the HGF gene. The vertical axis represents the area ratio (%) relative to the control. * * * p 0.000K VEGF gene transfer group, Venus group, physiological saline group, and surgery only group).
  • FIG. 10 is a photograph and graph showing the results of examining lymphangiogenesis at the surgical site after introduction of HGF gene or VEGF gene in lymphangioedema model rats.
  • A is a microscopic image obtained by immunostaining a tissue section in the vicinity of the site where the gene was injected in each rat using antibodies against PECAM-1, LYVE-1, Prox1 and c-Met.
  • the upper row shows HGF transgenic rats, the middle row shows VEGF transgenic rats, and the lower row shows controls of rats injected with physiological saline.
  • B is a graph showing the number of immunity-positive tubes for each antibody after the immunostaining.
  • HGF HGF gene-introduced rat
  • VEGF VEGF gene-introduced rat
  • control rat injected with physiological saline.
  • the vertical axis is the number of positive tubes.
  • Endothelial cell markers The number of PECAM-1-positive tubes increased in both HGF and VEG F-transduced rats compared to controls, but there was no significant difference, whereas lymphatic endothelial cell markers (LYVE-1 and Proxl ) The number of positive tubes has been shown to increase significantly only in the HGF gene transfer rat. It can also be seen that in HGF transgenic rats, c-Met-positive tubes are significantly increased compared to VEGF transgenic rats, and tend to increase compared to control mice.
  • FIG. 11 is a photograph showing the MAPK and Akt phosphates after stimulation with HGF in thymus duct-derived lymphatic endothelial cells.
  • FIG. 11A shows the results of Western blotting using a phosphorylated MAPK-specific antibody
  • FIG. 11B shows the results of phosphorylated AKt-specific antibody (each upper panel).
  • the bottom panel is a Western blot with antibodies specific for MAPK or Akt, whether phosphorylated or non-phosphorylated, as an internal control to show that the amount of MAPK and Akt in the sample is approximately equivalent. Is the result of
  • the present invention relates to an agent for promoting lymphangiogenesis, comprising HGF or a protein or compound functionally equivalent thereto (hereinafter sometimes referred to as “H GFj”) as an active ingredient.
  • HGFj a protein or compound functionally equivalent thereto
  • the present invention is based on the fact that the present inventors have found that HGF activates the proliferation and migration of lymphatic endothelial cells and promotes lymphangiogenesis.
  • the present invention is that HGF activates proliferation and migration and promotes lymphangiogenesis for isolated lymphatic endothelial cells that are isolated from embryonic or neonatal anatomy. Is based. Since lymphatic endothelial cells differentiate from embryonic vein early in embryogenesis, lymphatic endothelial cell marker protein is also expressed in venous endothelial cells in early embryogenesis, and lymphatic endothelial cells are further transformed into venous endothelial cells. It is also known to share (Wigle JT and Oliver G. Cell, 1999, 98: 769-778).
  • embryonic or neonatal cells are likely to be in a stage of embryonic or neonatal lymphatics that express lymphatic endothelial cell markers but are not likely to be in the final stage of differentiation.
  • the skin cells are unlikely to accurately reflect the lymphatic endothelial cells of the adult animal.
  • the effect of HGF on lymphatic endothelial cells in adult animals has been confirmed, so that patients suffering from lymphatic edema after cancer tissue and / or lymphadenectomy for cancer treatment (many HGF and the HGF gene have been shown to be effective as therapeutic agents for adults) and other patients with lymphedema.
  • HGF in the present invention includes a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • Another embodiment of HGF in the present invention includes a protein encoded by an “H GF gene”.
  • An example of such a gene is a nucleic acid containing the coding region of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the "protein functionally equivalent to HGF” refers to a protein isolated from a human having a biological activity equivalent to that of the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or Non-human animal forces also include isolated proteins. That is, as a more specific embodiment of the protein functionally equivalent to HGF in the present invention, one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, inserted, and Z Or a protein having an added amino acid sequence ability, or a protein encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and described in SEQ ID NO: 2. A protein containing an amino acid sequence and Mention may be made of functionally equivalent proteins.
  • the HGF in the present invention may be HGF derived from human or HGF derived from other animals, but human HGF is most preferable.
  • the amino acid sequence of HGF derived from other animals and the nucleic acid sequence encoding it can be obtained from various databases by those skilled in the art.
  • protein or compound functionally equivalent to HGF includes intracellular signal transduction by binding to c-met, which is an HGF receptor, and activating c-met intramolecular kinase. It may also include proteins that induce, and compounds.
  • c-met which is an HGF receptor
  • an antibody that acts agonistically on c-met including an agonist of HGF, for example, disclosed in Prat, M., et al. (J. Cell Sci. Ill 237-247 (1998)), and Also included are HGF variants that bind to the HGF receptor disclosed in W098 / 51798.
  • the biological activity equivalent to that of the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is that tyrosine (Y 1349 and Y 1356 ) in the intracellular domain of c-met and / or below Phosphorylation of signal molecules located in the stream (eg, Graziani, A. et al., J. Biol. Chem. 266, 22087-22090, (1991), Graziani, A. et al., J. Biol. Chem. 268, 9165- 9168, (1993), Naka garni, H.
  • the “protein or compound functionally equivalent to HGF” in the present invention includes all proteins and compounds having such an activity. Whether these compounds have a biological activity equivalent to HGF can be determined by methods known to those skilled in the art. For example, Graziani, A. et al., J. Biol. Chem. 266 , 22087-22090, (1991), Graziani, A. et al., J. Biol. Chem. 268, 9165-9168, (1993), Nakagami, H. et al., Hypertensi on, 2001, 37 [part2]: 581-586 Please refer to.
  • an increase in intracellular cyclic AMP concentration promotes the production of HGF by the cell, resulting in an enhancement of the biological activity of HGF (Morishita R., et.al. Diabetologia 1997 40 (9): 1053-61)
  • compounds and proteins that cause an increase in intracellular cyclic AMP levels such as cilostazol, a type 3 phosphodiesterase inhibitor, are also functionally associated with HGF of the present invention.
  • Equivalent protein or compound ".
  • angiotensin II Nakano N., et.al. Hypertension. 1998 32 (3): 444-51
  • Antagost antagonist of angiotensin II receptor suppresses the production of HGF. Etc. can be included as well.
  • the stringent nobbreviation and isolation conditions for isolating a nucleic acid hybridizing under stringent conditions with the nucleic acid comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 are 6M. Examples include urea, 0.4% SDS, 0.5 x SSC, 37 ° C conditions, or equivalent stringency hybridization conditions. Isolation of nucleic acids with higher homology can be expected by using conditions with higher stringency, such as 6 M urea, 0.4% SDS, 0.1 X SSC, and 42 ° C.
  • the sequence of the isolated nucleic acid can be determined by a known method described later.
  • the homology of the isolated nucleic acid is at least 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more (e.g., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) over the entire base sequence. And the like).
  • a gene amplification method using a primer synthesized based on the sequence information of the nucleic acid encoding HGF (SEQ ID NO: 1), for example, polymerase chain A protein encoded by a nucleic acid that comprises a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid that is hybridized under stringent conditions using a reaction (PCR) method, and is described in SEQ ID NO: 2. It is also possible to isolate a nucleic acid encoding a protein that is functionally equivalent to a protein containing an amino acid sequence.
  • the protein of the present invention also includes a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of HGF (SEQ ID NO: 2) and functionally equivalent to the protein. .
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T), amino acids having lunar aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atoms
  • Amino acids with side chains C, M
  • amino acids with carboxylic acid and amide side chains D, N, E, Q
  • amino acids with base side chains R, K, ⁇
  • aromatic Mention may be made of amino acids (H, F, Y, W) having aromatic-containing side chains (the parentheses indicate single letter amino acids).
  • Amino acid substitutions within each of these groups are referred to as conservative substitutions. It is already known that a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by another amino acid residue of one amino acid sequence maintains its biological activity. (Mark, DF et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 5662-6; Zoller, MJ and Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 6487-500; Wang, A. et al., Science (1984) 224: 1431-3; Dalbadie— McFarla nd, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409-13).
  • Such variants are at least 70%, more preferably at least 75%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90% of the amino acid sequence of the HGF of the present invention, Most preferably, it has at least 95% amino acid sequence identity.
  • sequence identity is determined by aligning the sequences as necessary so that the sequence identity is maximized, introducing gaps as appropriate, and then using the same residues as those in the amino acid sequence of the original HGF. Defined as a percentage.
  • Amino acid sequence identity can be determined by the methods described above.
  • the identity of the base sequence and amino acid sequence can be determined by the algorithm BLA ST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 5873-7) by Karlin and Altschul. Based on this algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-10).
  • BLASTN based on BLAST
  • the amino acid sequence is analyzed by BLASTX based on BLAST
  • the HGF of the present invention can be isolated from nature using various biological samples such as cells or tissues expressing HGF as a raw material based on its physical properties. Alternatively, it may be chemically synthesized based on known sequence information.
  • a host cell is transformed with a vector containing a gene encoding HGF by gene recombination technology, and the transformed cell producing gene recombinant HGF is cultured, so that the cell or its supernatant can be cultured. It can also be obtained.
  • Various vectors using viruses, cosmids, plasmids, nocteriophages and the like can be used as appropriate vectors for producing HGF by genetic engineering methods (Molecular cloning 2nd ed. old Spring Harbor Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987)) 0
  • the vector contains appropriate regulatory sequences so that HGF is expressed when introduced into the desired host cell.
  • the reading frame is inserted so as not to deviate from the control array.
  • the nucleic acid that encodes HGF is not particularly limited as long as it can be expressed in the selected vector and host. You can.
  • control sequence includes at least a promoter, a ribosome binding site and a terminator when a prokaryotic cell is selected as a host cell, and is a promoter and a terminator when eukaryotic cells are used. If necessary, it may contain enhancers, splicing signals, transcription factors, transactivators, poly A signals and / or polyadenylation signals, etc.
  • the vector for expressing HGF may optionally contain a selectable marker to facilitate the selection of transformed host cells.
  • HGF expressed in cells is incorporated into the vector by adding a signal peptide to HGF in order to transfer it into the lumen of the endoplasmic reticulum or extracellular space, or into periplasm if the host is a Gram-negative bacterium. But it ’s okay.
  • a signal peptide may be unique to HGF or derived from a heterologous protein as long as it is recognized correctly in the selected host cell. If necessary, a linker, a start codon, a stop codon, and the like may be added.
  • Insertion of a gene into a vector can be achieved by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Molecular Cloning 2 ⁇ ed., Old bpnng Harbor Press (1989) 3 ⁇ 4ection 5. ri ⁇ — 5.6 3; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) 11.4-11.11).
  • a vector can be designed by selecting a base sequence that provides high expression efficiency (Grantham et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9 : r43-74) 0
  • HGF When HGF is produced by introduction into an appropriate host, a combination of the above-described expression vector and an appropriate host can be used.
  • eukaryotic cells When eukaryotic cells are used as hosts, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used.
  • a method suitable for the selected host and vector may be employed.
  • calcium treatment and electroporation The method by the method etc. is known.
  • the agrobacterium method can be used, and for mammalian cells, the calcium phosphate precipitation method can be used.
  • the present invention is not particularly limited to these methods, but known nuclear microinjection, cell fusion, electric pulse perforation, protoplast fusion, lipophectamine method (GIBCO BRL), DEAE-dextran method, FuGENE6 reagent (Boehringer- Various methods including the method using Mannheim) can be adopted.
  • Host cells can be cultured according to known methods suitable for the selected cells. For example, when animal cells are used as a host, a medium such as DMEM, MEM, RPMI_1640, 199 or IMD M is used, and urine fetal serum (FCS) is added as necessary, so that the pH is about 6 to 8, 30 to Cultivation can be performed at 40 ° C for about 15 to 200 hours.
  • a medium such as DMEM, MEM, RPMI_1640, 199 or IMD M is used, and urine fetal serum (FCS) is added as necessary, so that the pH is about 6 to 8, 30 to Cultivation can be performed at 40 ° C for about 15 to 200 hours.
  • FCS urine fetal serum
  • HGF can be uniformly purified according to a general protein purification method.
  • HGF can be separated and purified by selecting and combining chromatography force ram, filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing (Strategies for Protein Purification and harcterization: A Laboratoy ourse Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibod ies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laborat ory (1988)) Power
  • Power Power The present invention is not limited to these.
  • the HGF in the present invention includes a protein or polypeptide in which an amino acid residue is added to HGF in the present invention.
  • a protein or polypeptide with an amino acid residue added to an HGF protein includes a fusion protein.
  • DNA encoding HGF and a nucleic acid encoding another protein or polypeptide can be ligated so that the reading frame matches.
  • the protein or polypeptide to be fused to HGF is not particularly limited, and a nucleic acid encoding an appropriate protein or polypeptide can be linked according to the purpose.
  • the present invention also relates to new uses of the following proteins (1) to (4), nucleic acids, or compounds.
  • a nucleic acid that encodes HGF or a protein functionally equivalent to it as a naked nucleic acid (4) A nucleic acid that encodes HGF or a protein functionally equivalent to it as a naked nucleic acid.
  • the present invention provides:
  • a method for preventing or treating lymphedema comprising a step of administering the protein, nucleic acid, or compound of (1) to (4) above to a subject,
  • HGF is preferably human HGF.
  • the lymphangiogenesis-promoting agent of the present invention contains HGF obtained as described above as an active ingredient. “Containing HGF as an active ingredient” means that HGF is contained as at least one of the active ingredients, and does not limit the content.
  • the lymphangiogenesis promoting agent of the present invention may contain an active ingredient that promotes the neovascularization of other lymphatic vessels in combination with HGF.
  • the HGF of the present invention can be formulated according to a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing company, Easton, USA).
  • a pharmaceutically acceptable carrier and / or additive may be included.
  • surfactants PEG, Tween, etc.
  • excipients antioxidants (ascorbic acid, etc.)
  • coloring agents flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents (phosphoric acid, citrate, other organics) Acid), chelating agents (EDTA, etc.), suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, flavoring agents, and the like.
  • the lymphangiogenesis-promoting agent of the present invention is not limited to these and may contain other commonly used carriers as appropriate.
  • light anhydrous key Acid Lactose, Crystalline cellulose, Mannitol, Starch, Carmellose calcium, Carmellose sodium, Hydroxypropyl cellulose, Hydroxypropyl methylcellulose, Polybulacetal jetylaminoacetate, Polybulol pyrrolidone, Gelatin, Medium chain fatty acid tridalylide
  • Examples include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethyl cellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • HGF low molecular weight polypeptides
  • proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin
  • amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine.
  • HGF is dissolved in an isotonic solution containing, for example, physiological saline, glucose or other adjuvants.
  • Adjuvants include, for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable solubilizers such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene dallicol, PEG, etc.) and nonionic surfactants (polysorbate 80, HCO-50) etc.
  • HGF may be enclosed in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]), or colloid drug delivery systems (ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, Nanoparticle, nanocapsenore, etc.) (see Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed. (1980), etc.).
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to HGF (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12: 98-105; U.S. Pat. No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 5,8481, Sidman et al., Biopolymers (1983) 22: 547-56; EP 133,988).
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]
  • the lymphangiogenesis-promoting agent of the present invention can be administered to all mammals including humans, rats and Inu.
  • the route of administration can be either oral or parenteral.
  • Power is preferably parenteral.
  • it is administered to patients by injection and transdermal administration.
  • an injection form it can be administered locally, for example, by intravenous injection, intramuscular injection or subcutaneous injection, etc., but local injection, particularly intramuscular, at or around the site where lymphangiogenesis is to be promoted. Injection is preferred.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • effective doses in promoting lymphangiogenesis or preventing or treating lymphedema include, for example, 0.0001 mg to 10 mg of active ingredient per kg body weight It is possible to select by range.
  • the active ingredient per patient can be selected in the range of 0.001 to 100 mg / body, and the dosage per dose is, for example, an amount of about 0.01 to 5 mg / body of HGF protein. Is preferably included.
  • the lymphangiogenesis promoting agent of the present invention is not limited to these doses.
  • the present invention also relates to a lymphangiogenesis-promoting agent containing, as an active ingredient, a nucleic acid encoding HGF or a functionally equivalent protein thereof (hereinafter sometimes referred to as "HGF gene").
  • HGF gene a nucleic acid encoding HGF or a functionally equivalent protein thereof.
  • the HGF in this case is also preferably human HGF.
  • the nucleic acid encoding HGF in the present invention includes genomic DNA, chemically synthesized DNA and the like in addition to cDNA.
  • the nucleic acid encoding HGF may have an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code as long as it encodes HGF.
  • the nucleic acid encoding HGF includes, in addition to the DNAs listed above, derivatives thereof, or nucleic acids that have been artificially modified.
  • the artificially modified nucleic acid is not limited to these, but for example, DNA, cDNA, genomic DNA, chemically synthesized DNA, or derivatives thereof with a modified sugar chain structure. Is included.
  • Genomic DNA and cDNA can be prepared by those skilled in the art using conventional means.
  • genomic DNA for example, cell-derived genomic DNA derived from humans is extracted, and a genomic library (plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as a vector) is created and expanded.
  • a genomic library plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as a vector
  • Preparation by colony, hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on a nucleic acid encoding HGF (for example, the nucleic acid described in SEQ ID NO: 1) Is possible. It is also possible to prepare a primer specific for DNA encoding HGF and perform PCR using this primer.
  • cDNA is synthesized from, for example, human-derived cell force-extracted mRNA and inserted into a vector such as ⁇ ZAP to create a cDNA library.
  • a vector such as ⁇ ZAP
  • colonino and ibridization It can be prepared by performing hybridization or plaque hybridization, or by performing PCR.
  • the nucleic acid encoding HGF or a functionally equivalent protein contained as an active ingredient is encapsulated in a virus-derived envelope or ribosome. Or it may be a naked nucleic acid.
  • naked nucleic acid refers to nucleic acid molecules that are present in an aqueous solution without being covered naked, as nucleic acid molecules are not present in inclusions such as virus envelopes or ribosomes. ! / Nucleic acid.
  • the nucleic acid encoding HGF or a functionally equivalent protein thereof is incorporated into a nucleic acid vector.
  • Any nucleic acid vector can be used as long as the nucleic acid encoding the HGF of the present invention introduced into the vector is expressed in mammals.
  • vectors include, for example, plasmids, retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, vaccinia virus vectors, lentivirus vectors, herpes virus vectors, alphavirus vectors, EB virus vectors, Examples include, but are not limited to, papillomavirus vectors, viral vectors such as foamy virus vectors, and non-winoles vectors (Niitsu Y. et al., Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1998)).
  • the vector used in the present invention can be used as a vector for gene therapy.
  • a person skilled in the art can appropriately design and use a desired vector.
  • the vector used in the present invention can be used in order to more efficiently express HGF such as a transcription initiation region and a transcription termination region that function in the expression host in addition to any polynucleotide to be introduced. Including the polynucleotide sequence.
  • a preferred form of the nucleic acid encoding HGF used in the present invention is, for example, pVAX 1 HGF / MGB 1 shown in SEQ ID NO: 5 or pcDNA3.1 (-) HGF shown in SEQ ID NO: 6. And a plasmid vector in which a nucleic acid encoding HGF is inserted.
  • the nucleic acid encoding the HGF of the present invention or a protein functionally equivalent to HGF is incorporated into a vector such as a force-photonic ribosome, a ligand DNA complex, or a gene gun. May be.
  • a vector such as a force-photonic ribosome, a ligand DNA complex, or a gene gun.
  • a vector such as a force-photonic ribosome, a ligand DNA complex, or a gene gun.
  • a vector such as a force-photonic ribosome, a ligand DNA complex, or a gene gun.
  • HVJ-E vector Kaneda, Y. et al., 2002, Mol. Ther. 6, 219-226
  • Sendai Winores Envelope Alternatively, it may be a naked nucleic acid.
  • the HGF gene may be used alone or, if necessary, other genes and / or other drugs may be used in combination.
  • the HGF gene and, if necessary, the gene used in combination with it are incorporated into an appropriate vector that guarantees the expression of the gene in vivo, and are administered to the affected area of the patient.
  • lymphangiogenesis-promoting agent containing a nucleic acid encoding HGF or a functionally equivalent protein as an active ingredient
  • those skilled in the art can easily select an appropriate administration route and dosage as appropriate.
  • lymphangiogenesis! / it is preferable to administer by injection at the site and / or the periphery, and it is particularly preferable to inject muscle into the muscle at the site and / or the periphery.
  • the nucleic acid power administered also promoted lymphangiogenesis with HGF or protein functionally equivalent to it! /, As long as it can be expressed at and around the site.
  • the effective dose in promoting lymphangiogenesis or preventing or treating lymphedema is, for example, from 0.001 mg to It is possible to select in the range of 10mg.
  • the nucleic acid can be selected in the range of 0.001 to 50 mg / body per patient, and the dose per dose is about 0.5 to 50 mg / body of the nucleic acid. It is preferably included. However, it is not limited to these doses.
  • lymphangiogenesis-promoting agent containing a nucleic acid encoding HGF or a protein functionally equivalent thereto as an active ingredient is, for example, a physiological buffer when administered to humans.
  • a plasmid containing human HGF cDNA dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier for example, pVAXIHGF / MGBl shown in SEQ ID NO: 5 or pcDNA3.1 (-) HGF shown in SEQ ID NO: 6
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, pVAXIHGF / MGBl shown in SEQ ID NO: 5 or pcDNA3.1 (-) HGF shown in SEQ ID NO: 6
  • a dose of -20 mg preferably 1-10 mg, more preferably 2-10 mg (e.g. 3-6 mg or 2-4 mg) in the site of the human patient and / or in the surrounding muscle Inject intramuscularly.
  • 1 to 10 weeks preferably 1 to 8 weeks (for example 2 to 6 weeks or 1 to 4 weeks) with an interval of about 2 or more times, preferably Should be administered at least 3 times.
  • it may be administered, for example, by referring to the method described in Morishita R. et al., Hypertension 2004 44 (2): 203_9, or by appropriately modifying it.
  • the lymphangiogenesis promoting agent of the present invention can be used as a drug for preventing or treating lymphedema.
  • Lymphedema is abnormal retention of tissue fluid due to lymphatic blockage.
  • lymphedema that is targeted for prevention or treatment by the lymphangiogenesis-promoting agent in the present invention is not limited as long as it has such symptoms.
  • the lymphangiogenesis-promoting agent of the present invention is useful for the prevention or treatment of diseases having such symptoms.
  • the lymphangiogenesis-promoting agent of the present invention is administered to a subject (for example, a patient who also removed a lymph node at the time of surgical removal of a malignant tumor) with a high possibility of causing lymphedema In this way, lymphedema can be prevented.
  • the present invention also relates to lymphedema comprising the step of administering to a subject a nucleic acid encoding HGF or a protein or compound functionally equivalent to HGF, or HGF or a protein functionally equivalent thereto. It relates to a method for preventing or treating.
  • the HGF is preferably human HGF.
  • the site of administration can be any site where it is desired to promote lymphangiogenesis. It is also possible to treat lymphedema by applying a powerful method, for example, to a patient with lymphedema. More specifically, as described above, lymphangiogenesis can be promoted by administering a lymphangiogenesis promoting agent.
  • a person skilled in the art can administer human HGF or a human HGF gene to an affected area of a patient having lymphedema, considering the purpose as appropriate. Administration to the affected area of a patient can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • the proteins, nucleic acids, or compounds of the above (1) to (4) may be administered alone or in combination with a gene encoding another lymphangiogenic factor, or It may be administered as a composition in combination with a pharmaceutically acceptable carrier and / or additive.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and / or additive Specific embodiments of genes, pharmaceutically acceptable carriers and / or additives encoding other angiogenic factors used in combination when administered in the form of a composition are as described above.
  • the affected area to which the protein, nucleic acid, or compound of (1) to (4) above is administered is particularly limited as long as it is a site where symptoms of lymphedema appear or are expected to appear. For example, upper limb lymphedema often seen after breast cancer surgery, upper arm, and lower limb lymphedema often seen after uterine cancer surgery to the thigh. Can be administered locally.
  • the dosage is as described above, it varies depending on the disease, the patient's weight, age, sex, symptom, administration purpose, transgene form, etc., but can be appropriately determined by those skilled in the art. is there.
  • the administration target of the protein, nucleic acid, or compound-containing composition of the present invention includes humans and any mammals such as monkeys, dogs and cats.
  • one embodiment of the method for promoting lymphangiogenesis according to the present invention includes a method for inducing activation of HGF receptor and promoting lymphangiogenesis by the activation.
  • the HGF receptor is a membrane protein named c-met, and a tyrosine kinase exists in its intracellular domain.
  • HGF binds to the HGF binding site in the extracellular domain of c-met
  • the intracellular tyrosine kinase is activated, and tyrosine residues (Y 1349 and Y 1356 ) in the c-met molecule are phosphorylated. Hesitate.
  • tyrosine residues Y 1349 and Y 1356
  • the activity of the HGF receptor refers to the activity of c-met's intramolecular tyrosine kinase.
  • lymphangiogenesis is promoted by activating c-met expressed in lymphatic endothelial cells.
  • the activity of c-met is induced by the action of HGF or a functionally equivalent protein or compound on c-met on lymphatic endothelial cells. Therefore, the use of the above-mentioned lymphangiogenesis-promoting agent can also be included in this embodiment.
  • the present invention relates to a method for screening a compound having lymphangiogenesis-promoting activity or a compound having preventive or therapeutic effect on lymphedema.
  • the first aspect of the screening method of the present invention is a method for screening a compound having lymphangiogenesis promoting activity, which comprises the following steps ( a ) to (c).
  • test compound (a) contacting the test compound with an HGF receptor or a protein functionally equivalent thereto,
  • a test compound is contacted with an HGF receptor or a protein functionally equivalent thereto.
  • HGF receptor or the protein functionally equivalent thereto in the screening method of the present invention include c-me and proteins functionally equivalent thereto. Specifically, the following (i) to (i) to (c) (iv) is included.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is obtained by substituting, deleting, inserting, and Z or adding one or more amino acids to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4.
  • test compound in the method of the present invention is not particularly limited.
  • natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, single compounds such as proteins and peptides, and compound libraries Gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermentation microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts, eukaryotic single cell extracts or animal cell extracts, etc.
  • the above test compound can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
  • “contact” is performed as follows. For example, test in cell culture medium expressing HGF receptor or functionally equivalent protein, or cell extract expressing HGF receptor or functionally equivalent protein.
  • test compound is a protein
  • a vector containing DNA encoding the protein is introduced into a cell in which an HGF receptor or a protein functionally equivalent to it is expressed, or the vector is used. It can also be carried out by adding it to a cell extract expressing an HGF receptor or a functionally equivalent protein. Further, for example, a two-hybrid method using yeast or animal cells can be used.
  • the binding of the test compound to the HGF receptor or a protein functionally equivalent thereto is then detected.
  • the means for detecting or measuring the binding between proteins can be performed, for example, by using a label attached to the protein.
  • the types of signs are
  • Enzyme 2 hybrid method and BIAC BIAC
  • test compound that binds to the HGF receptor is selected.
  • the selected test compound includes a compound having a lymphangiogenesis-promoting activity or a compound having a preventive or therapeutic effect on lymphedema.
  • the compound has a lymphangiogenesis-promoting activity, or has the effect of preventing or treating lymphedema, including the following steps (a) to (c): Methods for screening compounds are provided.
  • test compound was contacted to increase the proliferation ability of the cells compared to the case.
  • the HGF receptor or a protein functionally equivalent thereto A test compound is brought into contact with a cell expressing quality.
  • a cell expressing an HGF receptor or a functionally equivalent protein thereof refers to an isolated cell expressing a HGF receptor or a functionally equivalent protein thereof, a recombinant HGF receptor. Forces including transformed cells in which the body is expressed are not limited to these. For example, thoracic duct-derived lymphatic endothelial cells.
  • the HGF receptor or protein functionally equivalent thereto used in the present method includes the above-mentioned HGF receptor or protein functionally equivalent thereto.
  • the proliferative ability, migration, or c- such as MAPK, Akt, c_met, Ras or the like of cells expressing the HGF receptor or a functionally equivalent protein is then obtained. Measures phosphorylation of signal molecules that have the potential to be phosphorylated by signal transduction.
  • the degree of increase in proliferation ability, the degree of increase in migration ability, and the presence or absence of phosphorylation of MAPK or Akt can be easily measured by those skilled in the art, for example, by the method described in the following Examples. It is.
  • the proliferation ability of cells expressing the HGF receptor or a functionally equivalent protein is increased as compared with the case where the test compound is not contacted.
  • Increased migration, or phosphorylated signal molecules that are known to be phosphorylated by signaling from c-met such as MAPK, Akt, c-met, Ras Select a thing.
  • the compound thus selected can be an active ingredient of the agent for promoting lymphangiogenesis or the agent for preventing or treating lymphedema of the present invention.
  • Intrathoracic duct-derived lymphatic endothelial primary cultured cells were prepared by known methods (Microdrulation (1999) 6, 75-78) 0
  • Adult adult dogs (6 to 12 kg, both males and females) under anesthesia
  • the thoracic duct was isolated 10-15 cm and placed in a cooled (4 ° C) Nontas buffer (HBSS).
  • HBSS Nontas buffer
  • Connective tissue and adipocytes were removed.
  • the branch of the thoracic duct was tied with sterilized silk thread, and the lymphatic vessel was washed with cold HBSS.
  • lymphatic endothelial cells were subcloned to produce lymphatic endothelial cell clones.
  • the cells can be passaged. At least 10 passages were possible.
  • lymphatic endothelial cells immunostaining with a plurality of types of lymphatic endothelial cell-specific antibodies (anti-VEGFR-3 antibody and anti-Proxl antibody) was confirmed.
  • anti-VEGFR-3 antibody and anti-Proxl antibody the expression of c-met, an HGF receptor, was also confirmed by immunostaining, a novel finding found by the present inventors (FIG. 1).
  • the human recombinant HGF is added to the thoracic duct-derived lymphatic endothelial cells obtained in (1) above (at least 70% confluent in 96-well plate) at concentrations of 0, 2, 10, and 50 ng / ml, respectively. After 3 days, MTS assembly was performed using CellTiter 96 One Solutin Reagent (Promega). Independently conducted 9 uels. The results are shown in Table 1 and Fig. 2.
  • the measured values increased significantly even in the presence of HGF 2 ng / ml, indicating that HGF strongly promotes the proliferation of lymphatic endothelial cells.
  • HGF promotes lymphangiogenesis by promoting the proliferation and migration of lymphatic endothelial cells.
  • a human HGF cDNA expression plasmid pVAXIHGF / MGBl (SEQ ID NO: 5) was encapsulated in an HVJ-E vector according to a previously reported method (Kaneda, Y. et al., 2002, Mol. Ther. 6, 219-226).
  • BHK cells were cultured in a 100 mm dish until confluent, and 50 HAU of the plasmid-encapsulated vector was added to the medium of BHK cells and introduced into the cells. After culturing for 24 hours, the cells were transferred to an insert cell for 24 well plates and cultured until almost confluent.
  • a 24-well plate was prepared by culturing the above-mentioned (1) Inu thoracic duct-derived lymphatic endothelial cells to a confluency of 70% or more, and the human HGF cDNA expression plasmid pVAX 1 HGF / MGB 1 introduced An insertion cell containing BHK cells was inserted.
  • the measured value of MTS assay was significantly increased compared to the negative control, indicating that it is effective in promoting the proliferation of HGF gene-introduced endothelial cells. It was done.
  • human VEG F cDNA was used instead of human HGF cDNA, and the same experiment as in (4) above was performed to compare the effects of human HGF cDNA and VEGF cDNA on c-fos promoter activity. Atsei conducted 4 uels independently. The results are shown in Table 5 and FIG.
  • HGF promotes lymphangiogenesis
  • the introduction of HGF gene can promote lymphangiogenesis, which includes a naked HGF cDNA expression plasmid,
  • introduction of nucleic acid encoding HGF is effective
  • lymphatic endothelial cells isolated from adult dogs were used, and it was shown that HGF has the above-mentioned action on lymphatic endothelial cells of the adult animal.
  • This demonstrates the usefulness of HGF as a treatment for lymphedema.
  • human lymphatic endothelial cells should be confirmed for the idea that human lymphatic endothelial cells can also obtain the results of lymphatic endothelial cells isolated from the above-mentioned adult dog (AngioBio Co. ( Del Mar, CA)) was used to examine the enhancement of proliferation and migration ability by HGF.
  • FIG. 7A shows the result of MTS assembly and FIG. 7B shows the result of migration activity.
  • Cell proliferation and migration ability increased with the addition of human recombinant HGF, and at a concentration of lOng / ml or higher, it significantly increased compared to cells without HGF.
  • human lymphatic endothelial cells also promoted lymphangiogenesis by HGF as well as the lymphatic endothelial cells of adult dogs of (1) to (5) above. It was.
  • HGF promotes lymphangiogenesis in mammals other than Inu (including humans) It was suggested to have an effect.
  • Lymphedema model rats were prepared according to the description of Slavin SA et al. (Anals of Surgery 1999, 229, 421-427).
  • a physiological buffer solution containing 0.5% Patent Blue dye was injected at a few centimeters from the base of the tail, and the operation was performed.
  • the tail was dissected, and blue pigment was observed in the lymphatic tube (data not shown).
  • the tail root was clearly thick, and the usefulness of this rat as a lymphedema model was confirmed.
  • naked human HGF cDNA expression plasmid pVAXIHGF / MGBl 200 ⁇ g (/ 100 ⁇ 1), naked VEGF cDNA expression plasmid 200 ⁇ g (/ 100 ⁇ 1), and naked GFP expression plasmid (Venus plasmid) ) 200 ⁇ g (/ 100 ⁇ 1) was administered by intramuscular injection at 1, 7, and 14 days after surgery.
  • the surgery-only group only surgery is performed and no injection is performed. The group without surgery did not have surgery.
  • physiological saline group physiological saline 100 1 was injected intramuscularly on days 1, 7 and 14 after the operation. The tail thickness was measured every 7 days until 35 days after surgery. Five animals were tested in each group, and the average value was obtained and shown in FIG.
  • tissue samples were also collected for the surgical site force of the above rat tail, and the amount of human HGF mRNA was measured by real-time RT-PCR. However, it was confirmed that expression of human HGF was observed until 17 days after surgery only in the group into which the human HGF gene was introduced (data not shown).
  • FIG. 10A A typical stained image is shown in FIG. 10 (FIG. 10A).
  • FIG. 10B the expression level of each marker was positive for immunostaining in a microscopic field randomly extracted using a known method (Yoon YS, et al., J. Clin. Invest. 2003; 111: 717-725). The number of tubes was calculated ( Figure 10B).
  • Recombinant human HGF is added to a concentration of lOOng / ml, and after 0-15 minutes, the medium is removed and the cells are lysed with buffer (50 mM Tris-Cl, 2.5 mM EGTA, ImM EDTA, ⁇ NaF, 1 % Deoxycorticosterone, 1% Triton X100, InM PMSF, 2 mM sodium vanadate, pH 7.5), sonicated to disrupt genomic molecules, and sample containing 20 g protein To 10% SDS-PAGE.
  • buffer 50 mM Tris-Cl, 2.5 mM EGTA, ImM EDTA, ⁇ NaF, 1 % Deoxycorticosterone, 1% Triton X100, InM PMSF, 2 mM sodium vanadate, pH 7.5
  • FIG. 11A is a Western blot result of MAPK. It was found that phosphorylation of both p44 and p42 MAPKs was enhanced within 5 minutes of HGF stimulation!
  • Figure 11B shows the Akt results. Again, within 5 minutes of HGF stimulation, Akt phosphate was increased. Each lower panel detects p44 and p42 MAPK or Akt for internal control.
  • HGF HGF MEK inhibitors U0126 (50 ⁇ ) and PD9805 (30 ⁇ ), ⁇ 3 kinase inhibitor Ly294002 (50 ⁇ ) and It was also found to be reduced by wortmannin ( ⁇ ) (data not shown). This also suggests that the lymphangiogenic action of HGF is due to HGF inducing the same signal cascade as that of vascular endothelial cells via c-met.
  • a novel lymphangiogenesis promoter is provided.
  • the lymphangiogenesis promoting agent provided by the present invention contains human HGF as its active ingredient.
  • VEGF-C is known as a peptidic factor that promotes lymphangiogenesis.
  • other VEGFs belonging to the VEGF family have no action to promote lymphangiogenesis, and only VEGF-C has been known to have a lymphangiogenesis promoting action.
  • HGF which has been found to promote lymphangiogenesis in the present invention, is known as an angiogenic factor, like VEGF. Since VEGF has no lymphangiogenesis-promoting action, it has been considered by those skilled in the art that it has no HGF3 ⁇ 4 or lymphangiogenesis-promoting action. Therefore, the present inventors' finding that HGF has a lymphangiogenic effect can be said to be a surprising fact.
  • VEGF-C has the potential to cause edema by cross-linking with VEGFR2 HGF has no such concern. This is also a great feature of the lymphangiogenesis promoting agent of the present invention.
  • the lymphangiogenesis-promoting agent is effective as a drug for preventing or treating lymphedema.
  • HGF promotes lymphangiogenesis by activating proliferation and migration of lymphatic endothelial cells isolated from adult animals that are not in the embryonic or neonatal period.
  • Many patients suffering from cancer tissue and / or lymphedema after lymphadenectomy for the treatment of cancer are adults.
  • the agent of the present invention is particularly useful as a therapeutic agent for cancer tissue and / or adults suffering from lymphedema after lymph node excision surgery for the treatment of cancer.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　本発明者らは、HGFがリンパ管内皮細胞の増殖および遊走を活性化し、リンパ管新生を促進させることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものであり、本発明は、HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物を活性成分として含有するリンパ管新生促進剤を提供する。本発明はまた、上記知見に基づいて、HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質をリンパ浮腫を有する患者の患部に局所投与する工程を含む、リンパ管新生を促進する方法を提供する。

Description

明 細 書
リンパ管新生促進剤
技術分野
[0001] 本発明は、 HGFまたはそれをコードする核酸を有効成分として含有する新規なリン パ管新生促進剤および Zまたはリンパ管新生を促進する方法に関する。また本発明 は、リンパ浮腫の予防剤または治療剤、もしくは予防または治療の方法に関する。さ らにまた、リンパ管新生促進活性を有する化合物またはリンパ浮腫の予防もしくは治 療効果を有する化合物のスクリーニング方法にも関する。
背景技術
[0002] リンパ浮腫とは、リンパ管の閉塞により、組織液が異常に滞留し、むくみ、慢性炎症 および/または線維化をきたした状態を!ヽぅ。原発性および続発性のリンパ浮腫が知 られている。原発性のリンパ浮腫としては、ミルロイ病、メージュ病、遠位性低形成、 近位性閉塞性リンパ節病、巨大リンパ管症などが知られている力 続発性の場合は、 他の疾患に起因して発症し、特に、癌の外科的治療の後遺症として現れる場合が多 く、中でも、乳がん、子宫ガン、前立腺ガン、力ポジ肉腫などの外科手術、または放射 線治療後に発症する場合が多い。特に、乳がんの手術後に、上肢のリンパ浮腫が認 められる場合が多ぐ上肢リンパ浮腫患者の 80%以上が乳がんの術後に発症してい ると言われている。また、乳がんの術後では数パーセント以上の割合で上肢リンパ浮 腫が発症すると考えられる。また、下肢リンパ浮腫は、子宮がんの手術後に認められ る場合が多い。そのほか、感染、火傷などの外傷、炎症なども続発性リンパ浮腫の原 因となる。
[0003] リンパ浮腫は、運動機能に著 、不具合を生じさせ、また、患部の感染の可能性を 高めるため、患者の QOLを低下させる。にもかかわらず、力かるリンパ浮腫の治療法 としては、マッサージ、運動療法およびサポーターの装着等の対症療法が一般的で あり、現在のところ抜本的な治療法および治療薬がない。治療薬はほとんど知られて おらず、唯一、グァイフェネシン (guaifenesin)と呼ばれる化合物がリンパ浮腫の治療に 有効であるという報告はあるが、その治療効果は未だ明らかにされていない (特許文 献 1)。
[0004] リンパ管新生を促進するペプチド性の因子としては、 VEGFファミリーのメンバーで ある、 VEGF-Cが報告されている（特許文献 2、 3、非特許文献 1、 2)。しかし、他の VE GFファミリーメンバーにはリンパ管新生を促進する作用はなぐ VEGF-Cが現在唯一 知られているリンパ管新生促進因子である。
[0005] 一方、 VEGF-Cと同じく VEGFファミリーのメンバーである VEGF (VEGF- A、または
165
単に VEGFとも呼ばれる。本明細書中、以下 VEGFと記す)もまた血管新生因子として 広く知られて 、るが、血管透過性を増大させる因子としても以前より知られて 、た (Se nger, D.他、 Science, 1983, 219, 983-6など参照のこと）。事実、 VEGFを組織内で過 剰発現させた場合、その血管透過性増大作用により浮腫を誘発しうることが報告され ている（Isner, JM.,他、 Circ. Res.2001 89:389-400など参照のこと）。事実、下肢虚血 性疾患のヒト患者の下肢虚血部位に、その治療を目的として動脈内投与または筋肉 内投与により VEGF遺伝子を導入すると、 30%以上の頻度で浮腫が認められたことが 報告されている（Baumgartner, I.他、 Ann. Intern. Med. 2000; 132:880-884)。そのほ 力にも、 9人の患者の下肢虚血部位にネイキッドな VEGFをコードするプラスミドを筋 肉内注射により投与した場合、 6人の患者に下肢の浮腫が認められたという報告 (Ba umgartner, I.他、 Circulation, 1998; 97: 1114-1123)、閉塞性血栓血管炎（TAO)に より下肢虚血を有する患者 6人の 7肢の虚血部位にネイキッドな VEGFをコードするプ ラスミドを筋肉内注射により投与した場合、 3肢に浮腫が認められたという報告 (Isner, JM.,他、 J. Vase. Surg. 1998, 28: 964-975)をはじめ、 VEGFの遺伝子治療は浮腫を 誘発するリスクが高 、ことが多数報告されて 、る。
[0006] さらに、 VEGF- Cは、 VEGF受容体 3 (VEGFR- 3)のリガンドとされ、リンパ管新生に は VEGFR-3のみのシグナルでは十分であることがわかっているが、 VEGF-Cは、 VE GFR- 2にも結合する。 VEGFR- 2欠損マウスは、 VEGF- A欠損マウスに比して早い段 階で死ぬことから、 VEGF-Cおよび他の VEGFメンバーが VEGFの作用を補 、得るとさ れている（Scavelli, C.他、 J. Anat. (2004) 433-449)。 VEGFは、 VEGFR- 1および VEG FR-2との結合を介してその作用を発揮する。従って、 VEGFR-2の活性ィ匕が血管透 過性の増大を誘導すると考えられている（Issbrucker, K.他、 FASEB J. express articl e 10.1096/lj.02-0329ije. Published online December 18, 2002など参照のこと）。
[0007] HGFは、肝細胞増殖因子である力 肝細胞の増殖促進のほかに種々の生理作用 を有しており、血管新生作用もその一つである（非特許文献 3など参照のこと)。 HGF の血管新生作用を利用して、 HGFの虚血性疾患の治療への応用が進められている（ 特許文献 4、特許文献 5、非特許文献 4)。
特許文献 1： WO03/000242
特許文献 2：米国特許公報第 6,818220号
特許文献 3：米国特許公報第 6,689352号
特許文献 4： WO97/07824
特許文献 5 :WO01/32220
非特許文献 l : Szuba, A他、 FASEB J. express article 10.1096/fj.02- 0401fje. Publish ed online October 18, 2002
非特許文献 2 : Young— sup, Yoo他、 J. Clin. Invest. 111:717-725 (2003)
非特許文献 3 : Nakamura Y.他、 J Hypertens. 1996 Sep; 14(9): 1067-72
非特許文献 4 : Taniyama Y.，他、 Gene Therapy (2001) 8, 181-189
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は上述した背景に鑑みてなされた。本発明の課題は、 HGFおよびその遺伝 子の新規用途を提供することである。より具体的には、本発明の課題は、これまで有 効な治療薬や治療方法が存在しな力つたリンパ浮腫の新しい治療薬および治療方 法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは上記課題を解決すベぐ鋭意研究を行った。本発明者らは、リンパ浮 腫を軽減または解消しうる因子の探索を試みたところ、 HGFがリンパ浮腫を著しく軽 減させることを見出すに至った。そして HGFがリンパ管内皮細胞の増殖を誘導するリ ンパ管新生作用を有していることを見出した。
[0010] 上述したように、 VEGFの遺伝子治療は浮腫を誘発するリスクが高 、ことが多数報 告されている。従って本発明者らは、 VEGFをリンパ浮腫の治療に適用することは困 難と考えた。また VEGF-Cについても、 VEGF-C力VEGF-3以外の VEGF受容体と結 合することにより、細胞透過性を増大させる可能性が示唆される。従って本発明者ら は、 VEGF-Cのリンパ浮腫の治療への応用もまた、リスクが高いと考えた。
HGFは血管新生因子として知られて 、たが、同様に血管新生因子として知られて いる VEGFがリンパ管新生作用を有さないこと（例えば、 Dev. Biol. 1997, 188:96-109 など参照のこと）、また上述したようにリンパ浮腫を軽減させる効果を有さないと考えら れることを考慮すると、 HGFがリンパ管新生作用及びリンパ浮腫を軽減させる効果を 有して 、ると!/、う本発明者らの新規知見は、驚くべき事実であった。
[0011] さらに本発明者らは、 HGFのリンパ管新生作用を作用機序の面力 裏付けるベぐ リンパ管内皮細胞において HGF受容体 c-metが発現していること、ならびに HGFによ りリン酸ィ匕が誘導されることが知られている細胞内シグナル伝達タンパク質である MA PKおよび Aktのリン酸化が、リンパ管内皮細胞においても誘導されることを明らかにし た。
[0012] これらの知見から、 HGFおよびその遺伝子は、リンパ浮腫の治療または予防薬なら びにリンパ管新生促進剤として有効であることが分力つた。すなわち、本発明は、以 下の〔1〕〜〔44〕を提供するものである。
〔1〕HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物を活性成分として含 有する、リンパ管新生促進剤。
〔2〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質力 以下 (a)〜（d)の 、ずれかに記 載のタンパク質である、〔1〕に記載のリンパ管新生促進剤；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔3〕HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を活性成分として 含有する、リンパ管新生促進剤。
〔4〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（d )のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、〔3〕に記載のリンパ管新 生促進剤；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔5〕核酸が哺乳動物用発現ベクターに挿入されている、〔3〕または〔4〕に記載のリン パ管新生促進剤。
〔6〕核酸がネイキッドな核酸である、〔3〕〜〔5〕の 、ずれかに記載のリンパ管新生促 進剤。
〔7〕リンパ浮腫の予防または治療用の薬剤として用いられることを特徴とする、〔1〕〜 〔6〕の 、ずれかに記載のリンパ管新生促進剤。
〔8〕HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物を被験体に投与す る工程を含む、リンパ管新生を促進する方法。
〔9〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質力 以下 (a)〜（d)の 、ずれかに記 載のタンパク質である、〔8〕に記載のリンパ管新生を促進する方法；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、 (c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔10〕HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を被験体に投与 する工程を含む、リンパ管新生を促進する方法。
〔11〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（ d)のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、〔10〕に記載のリンパ管 新生を促進する方法；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔 12〕核酸が哺乳動物用発現ベクターに挿入されて!、る、〔 10〕または〔 11〕に記載の 方法。
〔13〕核酸がネイキッドな核酸である、〔10〕〜〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔14〕 HGF受容体の活性化を誘導し、該活性化によりリンパ管新生を促進する方法。 〔15〕HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物を被験体に投与す る工程を含む、リンパ浮腫を予防または治療する方法。
〔16〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質力 以下 (a)〜（d)の 、ずれかに 記載のタンパク質である、〔15〕に記載の方法； (a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔17〕HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を被験体に投与 する工程を含む、リンパ浮腫を予防または治療する方法。
〔18〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（ d)のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、〔17〕に記載の方法；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔19〕核酸が哺乳動物用発現ベクターに挿入されて!、る、〔 17〕または〔 18〕に記載の 方法。
〔20〕核酸がネイキッドな核酸である、〔17〕〜〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔21〕リンパ管新生促進剤またはリンパ浮腫の予防もしくは治療のために用いる薬剤 の製造における、 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物の使 用。 [22] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質力 以下 (a)〜（d)の 、ずれかに 記載のタンパク質である、〔21〕に記載の使用；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔23〕リンパ管新生促進剤またはリンパ浮腫の予防もしくは治療のために用いる薬剤 の製造における、 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸の 使用。
〔24〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（ d)のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、〔23〕に記載の使用；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔25〕核酸が哺乳動物用発現ベクターに挿入されている、〔23〕または〔24〕に記載の 核酸の使用。
〔26〕核酸がネイキッドな核酸である、〔23〕〜〔25〕の 、ずれかに記載の核酸の使用 [27]以下 (a)〜 (c)の工程を含む、リンパ管新生促進活性を有する化合物またはリ ンパ浮腫の予防もしくは治療効果を有する化合物のスクリーニング方法；
(a) HGF受容体または HGF受容体と機能的に同等なタンパク質に被検化合物を接 触させる工程、
(b)該タンパク質と被検化合物の結合を検出する工程、
(c)該タンパク質と結合する被検化合物を選択する工程。
〔28〕 HGF受容体または HGF受容体と機能的に同等なタンパク質が、以下 (i)〜 (iv) から選択される、〔27〕に記載の方法；
(i)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(ii)配列番号： 3に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(iii)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列にお!/、て 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号: 4に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(iv)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジ ントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号: 4に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔29〕以下 (a)〜 (c)の工程を含む、リンパ管新生促進活性を有する化合物またはリ ンパ浮腫の予防もしくは治療効果を有する化合物のスクリーニング方法；
(a) HGF受容体または HGF受容体と機能的に同等なタンパク質を発現している細胞 に被検化合物を接触させる工程、
(b)該細胞の増殖能、遊走性、またはシグナル分子のリン酸ィ匕を測定する工程、
(c)被検化合物を接触させて 、な 、場合と比較して、該細胞の増殖能を増カロさせた
、遊走性を増加させた、またはシグナル分子をリン酸化させた披検化合物を選択する 工程。
〔30〕 HGF受容体または HGF受容体と機能的に同等なタンパク質が、以下 (i)〜 (iv) から選択される、〔29〕に記載の方法； (i)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(ii)配列番号： 3に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(iii)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列にお!/、て 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号: 4に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(iv)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジ ントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号: 4に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔31〕HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸が挿入された哺 乳動物用発現ベクターであって、リンパ浮腫の予防または治療用のベクター。
〔32〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（ d)のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、〔31〕に記載のベクター；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔33〕配列番号： 5または 6に記載の塩基配列力もなるベクターである、〔31〕または〔3 2〕に記載のベクター。
〔34〕ネイキッドな状態で投与されることを特徴とする、〔31〕〜〔33〕のいずれかに記 載のベクター。
〔35〕被験体の患部またはその周辺に筋肉内注射により投与されることを特徴とする 、〔31〕〜〔34〕のいずれかに記載のベクター。 〔36〕HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸が挿入された哺 乳動物用発現ベクターを活性成分として含有する、リンパ浮腫の予防または治療用 の薬剤であって、該ベクターがネイキッドな状態で、被験体の患部またはその周辺に 筋肉内注射により投与されることを特徴とする薬剤。
〔37〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（ d)のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、〔36〕に記載の薬剤；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔38〕ベクターが、配列番号： 5または 6に記載の塩基配列力もなるベクターである、〔 36〕または〔37〕に記載の薬剤。
〔39〕HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸が挿入された哺 乳動物用発現ベクターを、ネイキッドな状態で、被験体の患部またはその周辺に筋 肉内注射により投与する工程を含む、リンパ浮腫を予防または治療する方法。
〔40〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（ d)のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、〔39〕に記載の方法；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、 (d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔41〕ベクターが、配列番号： 5または 6に記載の塩基配列力もなるベクターである、〔 39〕または〔40〕に記載の方法。
〔42〕リンパ浮腫の予防または治療用の薬剤の製造における、 HGFまたは HGFと機 能的に同等なタンパク質をコードする核酸が挿入された哺乳動物用発現ベクターの 使用であって、該ベクターがネイキッドな状態で、被験体の患部またはその周辺に筋 肉内注射により投与されることを特徴とするベクターの使用。
〔43〕 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（ d)のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、〔42〕に記載の使用；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
〔44〕ベクターが、配列番号： 5または 6に記載の塩基配列力もなるベクターである、〔 42〕または〔43〕に記載の使用。
図面の簡単な説明
[図 1]リンパ管内皮細胞の蛍光免疫染色を示す写真である。上段のパネルは、抗 c-m et抗体による染色、中段のパネルは、 DAPIによる核染色、下段のパネルは、これらを 重ね合わせたものである。これらから、全ての細胞に c-metが発現していることが確認 された。
[図 2]MTSアツセィによるヒト組み換え HGFによる増殖能の検討結果を示すグラフであ る。縦軸は測定値である。 HGFが濃度依存的にリンパ管内皮細胞の増殖を促進する ことが示されている。
[図 3]遊走能アツセィ (migration assey)によるヒト組み換え HGFによる遊走能の検討 結果を示すグラフである。縦軸は細胞数である。 HGFがリンパ管内皮細胞の遊走を 促進することが示されて ヽる。
[図 4]MTSアツセィによる、ネイキッドな cDNAプラスミドの導入による増殖能の検討結 果を示すグラフである。縦軸は測定値である。 HGF遺伝子の導入がリンパ管内皮細 胞の増殖促進に有効であることが示されている。
[図 5]c- fosプロモータアツセィによる、ネイキッドな cDNAプラスミドの導入による増殖 能の検討結果を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ活性の測定値である。 HG F遺伝子の導入力 Sリンパ管内皮細胞の増殖促進に有効であることが示されている。
[図 6]c- fosプロモータアツセィによる、ネイキッドな cDNAプラスミドの導入による増殖 能の検討結果を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ活性の測定値である。 HG Fの cDNA発現ベクターは c-fosプロモータ活性を有意に増大させるのに対し、 VEGF の cDNA発現ベクターは c-fosプロモータ活性を増大させな!/、ことが示されて!/、る。 圆 7]HGFによるヒトリンパ管内皮細胞の増殖および遊走性への影響を調べたグラフ である。 Aは MTSアツセィにより細胞増殖を調べた結果であり、 Bは遊走性アツセィに より遊走能を調べた結果である。ヒト組換 HGFを 0、 2、 10、 50ng/mlの濃度になるように ヒトリンパ管内皮細胞培養液に添加して、それぞれのアツセィを行っている。 Aの縦軸 は 490nmの吸光度である。 Bの縦軸は細胞数である。 HGF添カ卩により増殖および遊走 性が促進されていることが示されている。 *p〈0.001(ヒト組換 HGF 0 ng/mlに対して)、卞 p〈0.001(ヒト組換 HGF 2 ng/mlに対して)。
圆 8]尾の付け根部位にリンパ管浮腫を有するリンパ管浮腫モデルラットにおける HG F cDNA発現プラスミドによるリンパ管浮腫改善効果を示すグラフである。横軸は術後 日数（Day)を、縦軸は尾の付け根部分の太さ（mm)を示す。コントロールとしての Ven us群には GFP発現プラスミドを、 HGF群には HGF発現プラスミドを、 VEGF群には VEG F発現プラスミドを、それぞれ 200 g/0. lml注射し、生理食塩水群には生理食塩水を 0.1ml注射した。ネイキッドな HGF cDNAの投与により、尾の太さの減少が促進され、リ ンパ管浮腫が改善されることが示されて 、る。
[図 9]図 8に示すグラフの曲線下面積を算出したグラフである。 HGF遺伝子を導入し たラットの群でのみ尾の太さが有意に減少していたことを示す。縦軸は、コントロール に対する面積比（％)である。 * * pく 0.000KVEGF遺伝子導入群、 Venus群、生理食 塩水群、および手術のみの群のいずれに対しても)。
[図 10]リンパ管浮腫モデルラットの HGF遺伝子または VEGF遺伝子の導入後の手術 部位でのリンパ管形成を調べた結果を示す写真及びグラフである。 Aは、それぞれの ラットにおける、遺伝子を注射部位の近傍の組織切片を、 PECAM- 1、 LYVE-1、 Prox 1および c-Metに対する抗体を用いて免疫染色した顕微鏡画像である。上段は HGF 遺伝子導入ラット、中段は VEGF遺伝子導入ラット、および下段は生理食塩水を注射 したラットのコントロールである。 Bは、上記免疫染色後、それぞれの抗体に対して免 疫染陽性の管の数を示すグラフである。 HGF:HGF遺伝子導入ラット、 VEGF:VEGF 遺伝子導入ラット、コントロール:生理食塩水を注射したラット。縦軸は陽性の管の数 である。内皮細胞マーカー PECAM-1陽性の管の数は、 HGF遺伝子導入ラット、 VEG F遺伝子導入ラットともコントロールより増加しているが有意差はないのに対し、リンパ 管内皮細胞マーカー（LYVE-1および Proxl)陽性の管の数は、 HGF遺伝子導入ラッ トでのみ有意に増加していることが示されている。また、 HGF遺伝子導入ラットでは、 c -Met陽性の管が VEGF遺伝子導入ラットに対して有意に増加しており、またコント口 ールよりも増加傾向にあることがわかる。
[図 11]ィヌ胸管由来リンパ管内皮細胞の HGF刺激後の MAPKおよび Aktのリン酸ィ匕を 示す写真である。図 11Aはリン酸ィ匕 MAPK特異的抗体によるウェスタンブロットの結果 であり、図 11Bはリン酸化 AKt特異的抗体の結果である（各上のパネル)。下のパネ ルは、サンプル中の MAPKおよび Aktの量がほぼ同等であることを示すためのインタ ーナルコントロールとして、リン酸化/非リン酸化を問わず MAPKまたは Aktに特異的 な抗体によるウェスタンブロットの結果である。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、 HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物（以下、「H GFjと表記される場合あり）を活性成分として含有する、リンパ管新生促進剤に関する 。本発明は上述のとおり、本発明者らによって、 HGFがリンパ管内皮細胞の増殖およ び遊走を活性ィ匕し、リンパ管新生を促進することが見出されたことに基づく。
[0015] さらに、本発明は、胎生期、または新生期ではなぐアダルト動物力 単離されたリ ンパ管内皮細胞に対して、 HGFが増殖および遊走を活性化しリンパ管新生を促進す ることに基づいている。リンパ管内皮細胞は、胚形成初期に胎生静脈から分化するの で、リンパ管内皮細胞マーカータンパク質は胎生初期の静脈内皮細胞にもまた発現 されており、リンパ管内皮細胞は、さらに静脈内皮細胞へ分ィ匕することも知られている (Wigle J Tおよび Oliver G. Cell, 1999, 98: 769-778)。したがって、胎生期または新 生期の細胞は、リンパ管内皮細胞マーカーを発現していても最終的な分ィ匕が完了し ていない段階にある可能性が高ぐ胎生期または新生期のリンパ管内皮細胞は、ァ ダルト動物のリンパ管内皮細胞を正確に反映して 、るとは考え難 、。本発明にお ヽ て、アダルト動物のリンパ管内皮細胞に対する HGFの効果が確認されたことによって 、癌の治療のための癌組織および/またはリンパ節摘出手術後のリンパ浮腫に苦しむ 患者 (多くは成人である）、およびその他のリンパ浮腫の患者にとって、 HGFおよび H GF遺伝子がその治療薬として有効であることが示された。
[0016] 本発明における HGFの 1つの態様としては、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含 むタンパク質が挙げられる。また本発明における HGFの他の 1つの態様としては、「H GF遺伝子」によってコードされるタンパク質を挙げることが出来る。このような遺伝子と しては、例えば、配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸が挙げられ る。
[0017] また本発明における「HGFと機能的に同等なタンパク質」とは、配列番号： 2に記載 のアミノ酸配列を含むタンパク質と同等の生物学的活性を有するヒトから単離された タンパク質、またはヒト以外の動物力も単離されたタンパク質を含む。すなわち、本発 明における HGFと機能的に同等なタンパク質のより具体的な態様としては、配列番号 : 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およ び Zまたは付加したアミノ酸配列力もなるタンパク質、または、配列番号： 1に記載の 塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と 機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。
[0018] 本発明における HGFは、ヒト由来の HGFであっても他の動物由来の HGFであっても よいが、ヒトの HGFが最も好ましい。他の動物由来の HGFのアミノ酸配列およびそれ をコードする核酸配列は、当業者であれば各種データベースから取得することが可 能である。
[0019] さらにまた、「HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物」には、 HGFの受容 体である c-metに結合して c-met分子内キナーゼを活性ィ匕して細胞内シグナル伝達 を誘発するタンパク質、およびィ匕合物をも含みうる。したがって、 HGFのァゴニストをも 含み、例えば、 Prat, M.,他（J. Cell Sci. I l l 237-247 (1998))に開示されている c- met にァゴニスティックに作用する抗体、および W098/51798に開示されて ヽる HGF受容 体に結合する HGF変異体も包含される。
[0020] 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と同等の生物活性としては、 c- metの細胞内ドメイン内のチロシン (Y1349および Y1356)のリン酸ィ匕および/またはその下 流に位置するシグナル分子のリン酸化（例えば、 Graziani, A.他、 J. Biol. Chem. 266 、 22087-22090,(1991), Graziani, A.他、 J. Biol. Chem. 268、 9165-9168,(1993)、 Naka garni, H.他、 Hypertension, 2001, 37 [part2] :581- 586参照のこと）、血管内皮細胞お よび/またはリンパ管内皮細胞の増殖促進および遊走促進などが挙げられるが、これ らに限定されることはなぐ HGFが細胞に対して示すあらゆる生物学的な活性を含む
[0021] 本発明における「HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物」には、このよう な活性を有する全てのタンパク質およびィ匕合物が含まれる。これらの化合物が HGFと 同等の生物学的活性を有するか否かは、当業者に公知の方法によって判定すること が可能であるが、例えば、 Graziani, A.他、 J. Biol. Chem. 266、 22087-22090,(1991)、 Graziani, A.他、 J. Biol. Chem. 268、 9165—9168,(1993)、 Nakagami, H.他、 Hypertensi on, 2001, 37 [part2] :581-586を参照すればよい。本明細書中に実施例として記載す る、リンパ管内皮細胞の増殖能、遊走能および c-fosプロモーターアツセィの方法を 用いて上記判定を行うことができる力 これらに限定はされない。他にも、 c-metを発 現して 、る細胞と HGFを接触させた後、細胞溶解物中の c-metまたは他の HGF-c-m etのシグナル伝達経路の下流にある分子のリン酸ィ匕を検出する方法などが挙げられ る。これらの方法は、当業者には周知である。また、公知の方法に適宜変更および改 良を加えることは、当業者であれば容易に行うことができる。
[0022] さらにまた、例えば、細胞内サイクリック AMP濃度が上昇することによって細胞による HGF産生が促進され、 HGFの生物学的活性の増強力もたらされることから (Morishita R., et.al. Diabetologia. 1997 40 (9): 1053-61)、タイプ 3ホスホジエステラーゼ阻害剤 であるシロスタゾール (cilostazol)などの細胞内サイクリック AMP濃度の上昇をもたらす 化合物およびタンパク質もまた、本発明の「HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは 化合物」に包含されうる。他にも、 HGFの産生を抑制するアンジォテンシン II (Nakano N., et.al. Hypertension. 1998 32(3): 444- 51)のアンタゴ-スト（アンジォテンシン II受 容体の拮抗薬)などもまた、同様に包含されうる。
[0023] 上記、配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジ ントな条件下でハイ ブリダィズする核酸を単離するための、ストリンジェントなノ、イブリダィゼーシヨン条件 としては、 6M尿素、 0.4%SDS、 0.5 x SSC、 37°Cの条件またはこれと同等のストリンジェ ンシ一のハイブリダィゼーシヨン条件を例示できる。よりストリンジエンシーの高 、条件 、例えば、 6M尿素、 0.4%SDS、 0.1 X SSCの条件、 42°Cを用いれば、より相同性の高 い核酸の単離を期待することができる。単離した核酸の配列の決定は、後述の公知 の方法によって行うことが可能である。単離された核酸の相同性は、塩基配列全体で 、少なくとも 50%以上、さらに好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 90%以上 (例えば 、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%以上）の配列の同一性を有する。
[0024] 上記ノ、イブリダィゼーシヨン技術を利用する方法にかえて、 HGFをコードする核酸（ 配列番号： 1)の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば 、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)法を利用して、配列番号： 1に記載の塩基配列を含む 核酸とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする核酸によりコードされるタンパク 質であって、配列番号: 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な タンパク質をコードする核酸を単離することも可能である。
[0025] また、あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく 知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、 当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto- Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasa hara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide- directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271—275、 Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide- directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468—500、 Kramer, W, Drutsa'V, Jansen.HW, Krame r,B, Pflugfelder.M, and Fritz, HJ( 1984) The gapped duplex DNA approach to oligonu cleotide— directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456、 Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide- directed construction of mutations via gapp ed duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350—367、 Kunkel,TA(1985) Rapid and effici ent site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A . 82, 488-492)などを用いて、ヒト HGFのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、 H GFと機能的に同等な変異体を調製することができる。また、タンパク質中のアミノ酸 の変異は自然界においても生じうる。このように、 HGFのアミノ酸配列（配列番号： 2) にお 、て 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該タンパク質と機能 的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。
アミノ酸残基を改変する場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ 酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（ A、 I、し、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水'性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、月旨 肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖 を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R、 K、 Η)、及び、芳 香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる (括弧内はいずれ もアミノ酸の一文字標記を表す)。これらの各グループ内のアミノ酸の置換を保存的 置換と称す。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及 び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al, Proc. Natl.Acad.Sci.USA (1984)81:5662—6 ; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Re s.(1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie— McFarla nd, G. et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982)79:6409-13)。このような変異体は、本 発明の HGFのアミノ酸配列と少なくとも 70%、より好ましくは少なくとも 75%、より好まし くは少なくとも 80%、さらに好ましくは少なくとも 85%、さらにより好ましくは少なくとも 90 %、そして、最も好ましくは少なくとも 95%のアミノ酸配列の同一性を有する。本明細 書において配列の同一性は、配列同一性が最大となるように必要に応じ配列を整列 化し、適宜ギャップ導入した後、元となった HGFのアミノ酸配列の残基と同一の残基 の割合として定義される。アミノ酸配列の同一性は、上述の方法により決定することが できる。
[0027] 塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLA ST (Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7)によって決定することができる。このァ ルゴリズムに基づいて、 BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（ Altschul et al.,J.Mol.Biol.(1990)215:403- 10)。 BLASTに基づいて BLASTNによって 塩基配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば score = 100、 wordlength = 12 とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメータ一は例えば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプ ログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの 解析方法の具体的な手法は公知である（NCBI (National Center for Biotechnology I nformation)の BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)のウェブサイトを参照； ht tp： // www.ncbi . nlm . nih . gov)。
[0028] 本発明の HGFは、種々の生物学的サンプル、例えば HGFを発現する細胞若しくは 組織等を原料として、その物理的性質等に基づいて天然より単離することができる。 また、公知の配列情報に基づき、化学的に合成してもよい。また、遺伝子組換え技術 により HGFをコードする遺伝子を含むベクターにより宿主細胞を形質転換し、遺伝子 組換え HGFを産生する形質転換細胞を培養することにより、該細胞またはその培養 上清中カゝら得ることもできる。
[0029] 遺伝子工学的方法により HGFを製造する際の適当なベクターとして、ウィルス、コス ミド、プラスミド、ノ クテリオファージ等を利用した各種ベクターを利用することができる (Molecular cloning 2nd ed., し old Spring Harbor Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987)) 0所望の宿主細胞内に導入された場 合に HGFが発現されるよう、ベクターには適当な制御配列が含まれ、 HGFをコードす る核酸は、該制御配列に対して読み枠がずれないように挿入される。ここで、 HGFを コードする核酸は、選択されたベクター及び宿主にぉ 、て発現され得るものであれば よぐ好適には、 cDNAを挙げることができる力 場合によっては、 RNA等も利用するこ とができる。また、「制御配列」とは、宿主細胞として原核細胞を選択した場合には、 少なくともプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネータ一が含まれ、真核細胞 の場合には、プロモーター及びターミネータ一であり、さらに必要に応じ、ェンハンサ 一、スプライシングシグナル、転写因子、トランスァクチべ一ター、ポリ Aシグナル及び /またはポリアデ-ルイ匕シグナル等を含んで 、てもよ 、。 HGFを発現するためのベタ ターは、さらに必要に応じ、形質転換された宿主細胞の選択を容易にするため、選 択可能なマーカーを含んでいてもよい。さらに、細胞内で発現された HGFを、小胞体 内腔若しくは細胞外、または、宿主がグラム陰性菌の場合にはペリブラズム内へ移行 させるためにシグナルペプチドを HGFに付加するようにしてベクターに組み込んでも よい。このようなシグナルペプチドは、選択された宿主細胞において正確に認識され ればよぐ HGF固有のものでも、異種タンパク質由来のものであってもよい。また、必 要に応じリンカ一、開始コドン及び終止コドン等を付加してもよい。
[0030] ベクターへの遺伝子の挿入は、制限酵素部位を利用したリガーゼ反応により達成 でさる (Molecular Cloning 2ηα ed., し old bpnng Harbor Press (1989) ¾ection5.り丄— 5.6 3; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987)11.4—11.11)。 また、使用する宿主細胞のコドン使用頻度を考慮して、高い発現効率が得られる塩 基配列を選択し、ベクターを設計することができる（Grantham et al.， Nucleic Acids R es.(1981)9:r43-74) 0
[0031] 適当な宿主に導入して HGFを作製する場合には、上述の発現ベクターと適当な宿 主との組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動 物細胞、植物細胞及び真菌細胞を用いることができる。
[0032] 宿主細胞の形質転換は、選択した宿主及びベクターに適した方法を採用すればよ い。例えば、原核細胞を宿主とする場合には、カルシウム処理及びエレクトポレーショ ン等による方法が知られている。植物細胞についてはァグロバタテリゥム法を、哺乳 動物細胞についてはリン酸カルシウム沈降法を例示できる。本発明は、特にこれらの 方法に限定されるわけではなぐ公知の核マイクロインジェクション、細胞融合、電気 パルス穿孔法、プロトプラスト融合、リポフエクタミン法（GIBCO BRL)、 DEAE-デキスト ラン法、 FuGENE6試薬 (Boehringer- Mannheim)を用いた方法を包含する様々な方法 を採用することができる。
[0033] 宿主細胞の培養は、選択した細胞に適した公知の方法にしたがって行うことができ る。例えば、動物細胞を宿主とする場合、 DMEM、 MEM, RPMI_1640、 199または IMD M等の培地を用い、必要に応じゥシ胎児血清 (FCS)等を添加して、 pH約 6〜8、 30〜 40°Cにおいて 15〜200時間前後の培養を行うことができる。
[0034] HGFは、公知の手法により精製して用いることが好ま 、。 HGFは、一般的なタンパ ク質の精製方法に従って均一に精製することができる。例えば、クロマトグラフィー力 ラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動及 び等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせて HGFを分離'精製することができる（ Strategies for Protein Purification andし harcterization: A Laboratoyし ourse Manual, Daniel R.Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ;Antibod ies ： A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laborat ory(1988))力 本発明は、これらに限定されるものではない。
[0035] また、上述したように、本発明における HGFには、 HGFに対してアミノ酸残基が付カロ されたタンパク質またはポリペプチドも、本発明における HGFに含まれる。 HGF〖こ対し てアミノ酸残基が付加されたタンパク質またはポリペプチドには、融合タンパク質が含 まれる。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製するためには、例えば、 H GFをコードする DNAと、その他のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸をそ の読み枠が合うように連結することができる。 HGFに融合されるタンパク質またはポリ ペプチドは特に限定されず、 目的に応じ適当なタンパク質またはポリペプチドをコー ドする核酸を連結させることがでさる。
[0036] また本発明は、以下（1)〜(4)のタンパク質、核酸、または化合物の新たな用途に 関する。 (1) HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物、
(2) HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸、
(3)哺乳動物用発現ベクターに挿入された HGFまたはそれと機能的に同等なタンパ ク質をコードする核酸、
(4)ネイキッドな核酸である、 HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質をコードす る核酸。
[0037] 具体的には、本発明は、
•上記（1)〜(4)のタンパク質、核酸、または化合物を活性成分として含有するリンパ 管新生促進剤、
•上記（1)〜(4)のタンパク質、核酸、または化合物を被験体に投与する工程を含む 、リンパ浮腫を予防または治療する方法、
'リンパ管新生促進剤またはリンパ浮腫の予防もしくは治療のために用いる剤の製造 における上記（1)〜 (4)のタンパク質、核酸、または化合物の使用、
に関する。
ここで、 HGFはヒト HGFが好ましい。
[0038] 本発明のリンパ管新生促進剤は、上述のようにして得られる HGFを有効成分として 含有する。 HGFを「有効成分として含有する」とは、 HGFを活性成分の少なくとも 1つ として含むという意味であり、その含有率を制限するものではない。また、本発明のリ ンパ管新生促進剤は、 HGFと合わせて他のリンパ管の新生を促進する有効成分を含 有してちょい。
[0039] 本発明の HGFは、常法に従って製剤化することができる（例えば、 Remington's Pha rmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing company, Easton, U.S.A)。 ら に、必要に応じ、医薬的に許容される担体及び/または添加物を供に含んでもよい。 例えば、界面活性剤 (PEG, Tween等)、賦形剤、酸化防止剤 (ァスコルビン酸等)、着 色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤 (リン酸、クェン酸、他の有機酸等)、キレート 剤 (EDTA等)、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味 剤等を含むことができる。し力しながら、本発明のリンパ管新生促進剤は、これらに制 限されず、その他常用の担体を適宜含んでいてもよい。具体的には、軽質無水ケィ 酸、乳糖、結晶セルロース、マン-トール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメ ロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース 、ポリビュルァセタールジェチルァミノアセテート、ポリビュルピロリドン、ゼラチン、中 鎖脂肪酸トリダリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、白糖、カルボキシメチ ルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低 分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン等のタンパク質 、並びに、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸を含 んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、 HGFを、例えば、生理食塩水、ブ ドウ糖またはその他の補助薬を含む等張液に溶解する。補助薬としては、例えば、 D -ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩化ナトリウムが挙げられ、さらに、適 当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等）、ポリアルコール (プロピレンダリ コール、 PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート 80、 HCO- 50)等と併用して ちょい。
[0040] また、必要に応じ HGFをマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、 ポリ [メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリ 一システム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及び ナノカプセノレ等)とすることもできる（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed. (1980)等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、 HGFに適用し得る（Langer et al, J.Biomed.Mater.Res.(1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982)12: 98- 105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 5 8,481号； Sidman et al., Biopolymers(1983)22:547- 56;EP第 133,988号）。
[0041] 本発明のリンパ管新生促進剤は、ヒト、ラットおよびィヌを含むあらゆる哺乳動物に 投与することができる。その投与経路は、経口または非経口のいずれでも可能である 力 好ましくは非経口投与である。具体的には、注射及び経皮投与により患者に投 与される。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射または皮下注 射等により局所的に投与することができるが、リンパ管新生を促進したい部位または その周辺に局所注入、特に筋肉内注射することが好ましい。また、患者の年齢、症状 により適宜投与方法を選択することができる。 [0042] 活性成分がタンパク質である場合、リンパ管新生の促進またはリンパ浮腫の予防も しくは治療において効果的な投与量としては、例えば、 1回につき体重 lkgあたり活性 成分が 0.0001mg〜10mgの範囲で選ぶことが可能である。または、例えば、ヒト患者に 投与する場合、患者あたり活性成分が 0.001〜100mg/bodyの範囲を選ぶことができ、 1回当たり投与量としては、例えば、 HGFタンパク質が 0.01〜5mg/body程度の量が含 まれることが好ましい。し力しながら、本発明のリンパ管新生促進剤は、これらの投与 量に制限されるものではない。
[0043] 本発明はまた、 HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸 (以 下「HGF遺伝子」と表記される場合あり）を活性成分として含有するリンパ管新生促進 剤に関する。本発明における「HGF」、「HGFと機能的に同等なタンパク質」は、上に 記載した通りである。この場合の HGFもまた、ヒト HGFが好ましい。
[0044] 本発明における HGFをコードする核酸には、 cDNAの他、ゲノム DNA、化学合成 DN Aなどが含まれる。また HGFをコードする核酸は、 HGFをコードするものであれば、遺 伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有していてもよい。さらに HGFをコードする 核酸には、上記に挙げた DNAの他に、それらの誘導体、もしくは人工的な修飾が施 された核酸も含まれる。人工的な修飾が施された核酸としては、これら〖こ限定されるも のではないが、例えば、糖鎖の構造が修飾された DNA、 cDNA、ゲノム DNA、化学合 成 DNA、もしくはそれらの誘導体が含まれる。
[0045] ゲノム DNAおよび cDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが 可能である。ゲノム DNAは、例えば、ヒトに由来する細胞力 ゲノム DNAを抽出し、ゲ ノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、 BAC、 PACなど が利用できる）を作成し、これを展開して、 HGFをコードする核酸 (例えば、配列番号： 1に記載の核酸)を基に調製したプローブを用いてコロニーノ、イブリダィゼーシヨンあ るいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことにより調製することが可能である。ま た、 HGFをコードする DNAに特異的なプライマーを作成し、これを利用した PCRを行う ことによって調製することも可能である。また、 cDNAは、例えば、ヒトに由来する細胞 力 抽出した mRNAを基に cDNAを合成し、これを λ ZAP等のベクターに挿入して cDN Aライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーノ、イブリダィゼーショ ンあるいはプラークハイブリダィゼーシヨンを行うことによって、また、 PCRを行うことに よって、調製することが可能である。
[0046] 本発明のリンパ管新生促進剤において、活性成分として含有される HGFまたはそ れと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸は、ウィルス由来のエンベロープま たはリボソームなどに封入されたものであっても、ネイキッドな核酸であってもよい。こ こで、「ネイキッドな核酸」とは、核酸分子がウィルスエンベロープまたはリボソーム等 の封入物内に存在しているのではなぐ核酸分子が裸のまま被覆されることなく水溶 液中に存在して!/ヽる状態にある核酸をさす。
[0047] HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸は、核酸ベクターに 組み込まれて 、ることが好ま 、。本発明にお！/、て用いられる核酸ベクターとしては、 そのベクターに導入される本発明の HGFをコードする核酸が哺乳動物において発現 されるものである限り、任意のものが用いられうる。このようなベクターの例としては、 例えば、プラスミドをはじめ、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ 関連ウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、レンチウィルスベクター、ヘルぺ スウィルスベクター、アルファウィルスベクター、 EBウィルスベクター、パピローマウイ ルスベクター、フォーミーウィルスベクターなどのウィルスベクター、および非ウイノレス ベクターが挙げられるが（Niitsu Y. et al.， Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1998) )、これらに限定されるものではない。本発明において用いられるベクターは、遺伝子 治療用のベクターとして使用することが可能である。
[0048] 当業者であれば、適宜目的のベクターを設計し、使用することが可能である。本発 明において使用されるベクターは、導入される任意のポリヌクレオチドにカ卩えて、発現 宿主にお 1、て機能する転写開始領域、転写終結領域など HGFの発現をより効率的 に行うためのポリヌクレオチド配列を含んで 、てもよ 、。
[0049] 本発明に用いる HGFをコードする核酸の好ま 、形態としては、例えば、配列番号 ： 5に示す pVAX 1 HGF/MGB 1または配列番号： 6に示す pcDNA3.1 (-)HGFのような、 プラスミドベクター中に HGFをコードする核酸が挿入されたものが挙げられる。
[0050] また本発明の HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸は、力 チォニックリボソーム、リガンド DNA複合体、ジーンガンなどのベクターに組み込まれ ていても良い。例えば、センダイウイノレスエンベロープ由来の HVJ- Eベクター (Kaneda , Y.他、 2002、 Mol. Ther. 6, 219-226)に封入された形であってもよい。あるいはまた、 ネイキッドな核酸であってもよ ヽ。
[0051] 本発明において、 HGF遺伝子は単独で使用してもよぐまた必要に応じ、他の遺伝 子および/または他の薬剤を組み合せて使用してもよい。本発明において、 HGF遺 伝子、及び、必要に応じそれと組み合せ用いられる遺伝子は、遺伝子の in vivoにお ける発現を保証する適当なベクター中に組み込まれ、患者の患部へ投与される。
[0052] HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を活性成分として含 有するリンパ管新生促進剤を投与する場合、当業者であれば適宜、適切な投与経路 および投与量を容易に選択できるが、リンパ管新生を促進した!/、部位および/または 周辺に注射により投与することが好ましぐ特に該部位およびまたは周辺の筋肉に筋 肉注射することが好ましい。他にも、投与した核酸力も HGFまたはそれと機能的に同 等なタンパク質力 リンパ管新生を促進した!/、部位およびその周辺で発現されうるよ うな投与方法であればょ 、。
[0053] 活性成分が上記核酸である場合、リンパ管新生の促進またはリンパ浮腫の予防もし くは治療において効果的な投与量としては、例えば、 1回につき体重 lkgあたり該核 酸が 0.001mg〜10mgの範囲で選ぶことが可能である。または、例えば、ヒト患者に投 与する場合、患者あたり該核酸が 0.001〜50mg/bodyの範囲を選ぶことができ、 1回当 たり投与量は、該核酸が 0.5〜50mg/body程度の量が含まれることが好ましい。しかし ながら、これらの投与量に制限されるものではない。
[0054] HGFまたはそれと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を活性成分として含 有するリンパ管新生促進剤の 1つの好適な実施態様としては、例えば、ヒトに投与す る場合、生理的緩衝液または薬学的に許容されうる担体に溶解したヒト HGF cDNAを 含むプラスミド (例えば、配列番号： 5に示す pVAXIHGF/MGBlまたは配列番号： 6に 示す pcDNA3.1(- )HGF)を 1回あたり、 l〜20mg、好ましくは l〜10mg、より好ましくは 2 〜10mg (例えば 3〜6mgまたは 2〜4mg)の用量にて、ヒト患者のリンパ管新生を促進し たい部位および/またはその周辺の筋肉内に筋肉注射する。 1〜10週間、好ましくは 1 〜8週間（例えば 2〜6週間または 1〜4週間）程度の間隔をあけて、 2回以上、好ましく は 3回以上、投与するとよい。ヒトに投与する場合、例えば、 Morishita R.他、 Hyperte nsion 2004 44(2):203_9に記載の方法を参照して、またはこれに適宜変更を加えた方 法で、投与するとよい。
[0055] 本発明のリンパ管新生促進剤は、リンパ浮腫の予防または治療用の薬剤として用 いることが可能である。リンパ浮腫とは、リンパ管の閉塞により組織液が異常に滞留し
、むくみ、慢性炎症および Zまたは繊維化をきたした状態を言う。本発明におけるリン パ管新生促進剤が予防または治療の対象とするリンパ浮腫は、このような症状を有 するものであれば、名称の如何を問わない。本発明のリンパ管新生促進剤は、このよ うな症状を有する疾患の予防または治療に有用である。
[0056] リンパ浮腫を起こす可能性の高!、被検体 (例えば、悪性腫瘍の摘出手術の際、リン パ節も摘出した患者など）に対して、本発明のリンパ管新生促進剤を投与することで 、リンパ浮腫を予防しうる。
[0057] 本発明はまた、 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物、また は、 HGFもしくはそれと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を被験体に投与 する工程を含む、リンパ浮腫を予防または治療する方法に関する。この場合、 HGFは ヒト HGFであることが好ましい。投与部位は、リンパ管新生を促進したい任意の部位 であってよい。力かる方法を、例えば、リンパ浮腫を有する患者に適用することにより 、リンパ浮腫を治療することも可能である。より具体的には、上述のとおり、リンパ管新 生促進剤を投与することにより、リンパ管新生を促進することができる。
[0058] 当業者であれば、その目的を適宜考慮して、ヒト HGFまたはヒト HGF遺伝子を、リン パ浮腫を有する患者の患部への投与することが可能である。患者の患部への投与方 法は、当業者に公知な方法によって行うことが可能である。
[0059] 本発明においては、上記（1)〜(4)のタンパク質、核酸、または化合物は単独で投 与してもよぐまた他のリンパ管新生因子をコードする遺伝子と併用して、もしくは、医 薬的に許容される担体及び/または添加物と併用し、組成物として投与してもよ ヽ。 組成物の形態として投与する場合に併用される他の血管新生因子をコードする遺伝 子、医薬的に許容される担体及び/または添加物の具体的な態様は、上述の通りで ある。 [0060] 上記（1)〜 (4)のタンパク質、核酸、または化合物が投与される患部としては、リン パ浮腫の症状が現れている部位または現れることが予測される部位であれば特に制 限されるものではないが、例えば、乳ガンの術後などによく見られる上肢リンパ浮腫 に対しては上腕部、子宮ガンの術後などによく見られる下肢リンパ浮腫に対しては大 腿部などへの局所投与が考えられる。
[0061] 投与量は上述したとおりであるが、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目 的、導入遺伝子の形態等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能 である。
本発明のタンパク質、核酸、または化合物含有組成物の投与対象としては、ヒトの 他、サル、ィヌおよびネコなど任意の哺乳動物が含まれる。
[0062] さらにまた、本発明のリンパ管新生を促進する方法の 1態様として、 HGF受容体の 活性化を誘導し、該活性化によりリンパ管新生を促進する方法も含まれる。
HGF受容体は c-metと命名されている膜タンパク質であり、その細胞内ドメイン内に チロシンキナーゼが存在する。 HGFが c-metの細胞外ドメインにある HGF結合部位に 結合すると、前記細胞内チロシンキナーゼが活性ィ匕して、 c-met分子内のチロシン残 基 (Y1349および Y1356)をリン酸ィ匕する。これをトリガーとして、細胞内シグナル伝達経路 が活性ィ匕して HGFがその生物学的機能を発揮することはよく知られている事実であ る（例えば、 Graziani, A.他、 J. Biol. Chem. 266、 22087-22090,(1991)、 Graziani, A.他 、 J. Biol. Chem. 268、 9165— 9168ズ 1993)、 Nakagami, H.他、 Hypertension, 2001, 37 [ part2] :581-586参照のこと）。したがって、本明細書において、 HGF受容体の活性ィ匕 とは、 c-metの分子内チロシンキナーゼを活性ィ匕することを指す。
[0063] 本発明において、リンパ管内皮細胞に発現している c-metを活性ィ匕することによりリ ンパ管新生は促進される。ここで、 c-metの活性ィ匕は、 HGFまたはそれと機能的に同 等なタンパク質もしくは化合物をリンパ管内皮細胞上の c-metに作用させることにより 誘導される。したがって、上述のリンパ管新生促進剤を使用することも、本態様に包 含されうる。
[0064] 本発明は、リンパ管新生促進活性を有する化合物またはリンパ浮腫の予防もしくは 治療効果を有する化合物のスクリーニング方法に関する。 本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、以下の（a)〜（c)の工程を含 むリンパ管新生促進活性を有する化合物のスクリーニング方法である。
(a) HGF受容体またはそれと機能的に同等なタンパク質に被検化合物を接触させる 工程、
(b) HGF受容体またはそれと機能的に同等なタンパク質と被検化合物の結合を検出 する工程、
(c) HGF受容体またはそれと機能的に同等なタンパク質と結合する被検化合物を選 択する工程。
[0065] 第一の態様では、まず、 HGF受容体またはそれと機能的に同等なタンパク質に被 検化合物を接触させる。本発明のスクリーニング方法における HGF受容体またはそ れと機能的に同等なタンパク質としては、 c-meほたはそれと機能的に同等なタンパク 質が挙げられ、具体的には以下の (i)〜 (iv)が含まれる。
(i)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(ii)配列番号： 3に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(iii)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列にお!/、て 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号: 4に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(iv)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジ ントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号: 4に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[0066] 本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなぐ例えば、天然ィ匕 合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化 合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発 酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽 出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被検化合物は必要に応 じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等 を挙げることができる。 [0067] 本発明にお 、て「接触」は、以下のようにして行う。例えば、 HGF受容体またはそれ と機能的に同等なタンパク質が発現している細胞の培養液、または、 HGF受容体ま たはそれと機能的に同等なタンパク質が発現している細胞抽出液に被検化合物を添 加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該 タンパク質をコードする DNAを含むベクターを、 HGF受容体またはそれと機能的に同 等なタンパク質が発現して 、る細胞へ導入する、または該ベクターを HGF受容体また はそれと機能的に同等なタンパク質が発現している細胞抽出液に添加することで行う ことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ハイブリッド法を 利用することも可能である。
[0068] 第一の態様では、次いで、 HGF受容体またはそれと機能的に同等なタンパク質と 被検化合物の結合を検出する。タンパク質間の結合を検出または測定する手段は、 例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は
、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵素 2ハイブリット法や、 BIAC
OREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法におい ては、次いで、上記 HGF受容体と結合した被検化合物を選択する。選択された被検 化合物の中には、リンパ管新生促進活性を有する化合物またはリンパ浮腫の予防も しくは治療効果を有する化合物が含まれる。また、選択された被検化合物を、以下の スクリーニングの被検化合物として用いてもょ 、。
[0069] また、本発明のスクリーニング方法の第二の態様として、以下 (a)〜（c)の工程を含 む、リンパ管新生促進活性を有する化合物またはリンパ浮腫の予防もしくは治療効 果を有する化合物のスクリーニング方法を提供する。
(a) HGF受容体またはそれと機能的に同等なタンパク質を発現している細胞に被検 化合物を接触させる工程、
(b)該細胞の増殖能、遊走性、またはシグナル分子のリン酸ィ匕を測定する工程、
(c)被検化合物を接触させて 、な 、場合と比較して、該細胞の増殖能を増カロさせた
、遊走性を増加させた、またはシグナル分子をリン酸化させた被検化合物を選択する 工程。
[0070] 第二の態様においては、まず、 HGF受容体またはそれと機能的に同等なタンパク 質を発現している細胞に被検化合物を接触させる。ここで「HGF受容体またはそれと 機能的に同等なタンパク質を発現している細胞」としては、 HGF受容体またはそれと 機能的に同等なタンパク質を発現している単離された細胞、組換え HGF受容体が発 現している形質転換細胞等が挙げられる力 これらに限定されるものではない。例え ば、胸管由来リンパ管内皮細胞が挙げられる。また本方法において用いられる HGF 受容体またはそれと機能的に同等なタンパク質としては、上述の HGF受容体または それと機能的に同等なタンパク質が含まれる。
[0071] 第二の態様においては、次いで、 HGF受容体またはそれと機能的に同等なタンパ ク質を発現している細胞の増殖能、遊走性、または MAPK、 Akt、 c_met、 Rasなどの c- met力ものシグナル伝達によりリン酸ィ匕されることが分力つているシグナル分子のリン 酸化を測定する。
[0072] 増殖能の増加の程度、遊走能の増加の程度、 MAPKまたは Aktのリン酸化の有無 は、例えば、下記実施例に記載の方法により、当業者であれば容易に測定すること が可能である。
[0073] 本発明のスクリーニング方法においては、最後に、被検化合物を接触させていない 場合と比較して、 HGF受容体またはそれと機能的に同等なタンパク質を発現している 細胞の増殖能を増加させた、遊走性を増加させた、または MAPK、 Akt、 c-met、 Ras などの c-metからのシグナル伝達によりリン酸化されることが分かっているシグナル分 子をリン酸化させたィ匕合物を選択する。このようにして選択されたィ匕合物は、本発明 のリンパ管新生促進剤またはリンパ浮腫の予防または治療用の薬剤の活性成分とな り得る。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0074] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[0075] [実施例 1]ィヌ胸管由来リンパ管内皮初代培養細胞における HGFの効果
( 1)ィヌ胸管由来リンパ管内皮初代培養細胞の作製 ィヌ胸管由来リンパ管内皮初代培養細胞の作製は、公知の方法で行った (Microdr culation(1999)6、 75-78) 0雑種の成犬（雌雄問わず、 6〜12kg)を麻酔下で、大腿動 脈から放血させた後、胸管を 10〜15cm単離し、冷却 (4°C)したノヽンタス緩衝液 (HBSS )に入れた。結合組織および脂肪細胞を除去した。胸管の分枝部分は滅菌した絹糸 で縛り、リンパ管を冷却 HBSSにて洗った。その後、コラゲナーゼ溶液 (250U/mL HBS S)中に 37°Cにて 10分間インキュベートした。 10%牛胎児血清（FBS)含有 MEM培地で 管を洗浄して細胞を回収した。遠心によりコラゲナーゼを除去した後、 20%FBSおよ び抗生物質を添加した完全 MEM培地に懸濁して、タイプ Iコラーゲンコート 35mmディ ッシュ中で培養した。培養は 37°C5%CO湿潤環境下で行った。コンフルェントにな
2
つた時点でトリプシン/ EDTAで細胞を剥離して回収し、リンパ管内皮細胞をサブクロ 一ユングし、リンパ管内皮細胞のクローンを作製した。この細胞は、継代可能である。 少なくとも 10回以上継代可能であった。
[0076] このようにして得られたリンパ管内皮細胞では、複数種のリンパ管内皮細胞特異的 抗体 (抗 VEGFR-3抗体、抗 Proxl抗体ほ力 による免疫染色が確認された。さらにこ れらの細胞では、 HGF受容体である c-metの発現も免疫染色により確認された。これ は本発明者らによって見出された新規な知見である（図 1)。
[0077] (2)ヒト組み換え HGFによる増殖能の増強
上記（1)で得たィヌ胸管由来リンパ管内皮細胞 (96ゥエルプレート中 70%コンフル ェント以上）にヒト組み換え HGFを、それぞれ、 0、 2、 10、 50ng/mlの濃度となるように 培地中に添力卩し、その 3日後に、 CellTiter 96 One Solutin Reagent(Promega)を用い て MTSアツセィを行った。独立に 9ゥエルずつ実施した。その結果を表 1および図 2に 示す。
[0078] [表 1] HGF Ong/ml HGF 2ng/ml HGF 10ng/ml HGF 50ng/ml
No1 0.22 0.257 0.339 0.285
No2 0.203 0.26 0.291 0.299
No3 0.203 0.279 0.344 0.341
No4 0.183 0.248 0.251 0.25
No5 0.208 0.262 0.3 0.301
No6 0.193 0.247 0.338 0.406
No7 0.26 0.367 0.403 0.477
No8 0.288 0.417 0.499 0.503
No9 0.289 0.387 0.549 0.437 平均 0.227 0.303 0.368 0.367 標準偏差 0.041 0.068 0.099 0.092 標準誤差 0.014 0.023 0.033 0.031
HGF2ng/ml存在下でも、測定値は有意に増大しており、 HGFがリンパ管内皮細胞 の増殖を強力に促進することが示された。
[0079] (3)ヒト組み換え HGFによる遊走能の増強
(0 組み換え HGFによる遊走能の増強
細胞の遊走能は、既報の Boydenチャンバ一を用いる方法に従って実施した (Arteri oscler Thromb Vase Biol. 2002;22:108- 114)。孔径 8 mのポリビュルピロリドン (PVP) 不含ポリカーボネートメンブラン (Neuro Probe Inc., Gaithersburg, MD)を 0.1%ゼラチ ンでコーティングし、生理的リン酸緩衝液 (PBS)で過剰なゼラチンを除去した。 1%FB Sを含有する EBM2培地 28 μ 1を入れた Boydenチャンバ一の下のチャンバ一に、上記 メンブランをのせ、上のチャンバ一に、 106個の（1)で得たィヌ胸管由来リンパ管内皮 細胞を含む 50 μ 1の培地を入れ、ヒト組み換え HGFを、それぞれ、 0、 10、 50ng/mlの濃 度となるように培地中に添カ卩し、 4時間 37°Cにて培養した。培養は 37°C5%CO湿潤
2 環境下で行った。メンブランを取り出し、メンブランの上面にある細胞を剥がし取り、メ ンブランの下面にある細胞を Diff-Quick(Sysmex, Hyogo, Japan)で染色し、細胞の数 をカウントした。各 HGF濃度につき、独立に 3ゥエルずつ実施した。その結果を表 2お よび図 3に示す。
[0080] [表 2] HGF (-) HGF 10ng/ml HGF 50ng/ml
No1 3 224 271
No2 4 238 307
No3 6 222 254
平均 4.33 228.00 277.33
標準偏差 1 .53 8.72 27.06
標準誤差 0.0882 5.033 15.624 上記表 2および図 3より、 HGFlOng/ml存在下でも、測定値は有意に増大しており、 HGFがリンパ管内皮細胞の遊走を促進することが示された。
以上の結果から、 HGFがリンパ管内皮細胞の増殖および遊走を促進して、リンパ管 新生を促進することが示唆された。
[0081] (ii) パラクライン組み換え HGFによる遊走能の増強
ヒト HGF cDNA発現プラスミド pVAXIHGF/MGBl (配列番号： 5)を、既報の方法に 従い HVJ-Eベクターに封入した (Kaneda, Y.他、 2002、 Mol. Ther. 6, 219-226)。
BHK細胞を 100mmディッシュでコンフルェントにまで培養し、 50HAUの該プラスミド 封入ベクターを、 BHK細胞の培地に添加して、細胞に導入した。 24時間培養後、 24 ゥエルプレート用挿入セル (insert)に移し、ほぼコンフルェントになるまで培養した。 一方、上記（1)ィヌ胸管由来リンパ管内皮細胞を 70%以上のコンフルエンシーにな るように培養した 24ゥエルプレートを用意し、そのゥエルに上記ヒト HGFcDNA発現プ ラスミド pVAX 1 HGF/MGB 1導入 BHK細胞の入つた挿入セルを入れた。 48時間培養 後に、上記と同様 MTSアツセィに供した。アツセィは、独立に 6ゥエルずつ実施した。 ヒト HGF cDNA発現プラスミド pVAXIHGF/MGBlの代わりに GFP発現プラスミドを用 いて同様の処理を行ったものを、ネガティブコントロールとした。その結果を表 3およ び図 4に示す。
[0082] [表 3] GFP HGF
No1 0.260 0.497
No2 0.320 0.451
No3 0.338 0.397
No4 0.272 0.414
No5 0.306 0.440
No6 0.307 0.400
平均 0.301 0.433
標準偏差 0.029 0.038
標準誤差 0.012 0.016
HGF cDNA導入細胞との共培養をした場合、ネガティブコントロールに比べて MTS アツセィの測定値は有意に増加しており、 HGF遺伝子の導入カ^ンパ管内皮細胞の 増殖促進に有効であることが示された。
[0083] さらに、 HGFによるリンパ管内皮細胞の増殖促進を確認するために、既報の方法に 従って (Hypertension 2001, 37, 2, 581-586)、 c-fosプロモータ活性の測定を実施した アツセィは、独立に 6ゥエルずつ実施した。上記と同様に GFP発現プラスミドを用い て同様の処理を行ったものを、ネガティブコントロールとした。その結果を表 4および 図 5に示す。
[0084] [表 4]
GFP HGF
N。1 231 101 317234
No2 210645 344423
No3 143101 303133
No4 141224 31 9125
No5 195948 384934
No6 189940 270410
平均 185326.50 323209.83
標準偏差 36327.55 38738.02
標準誤差 14830.66 1 5814.73 この c-fosプロモータ活性は、細胞の増殖能の正の相関を有していることは周知の 事実である。従って、 HGFにより c-fosプロモータ活性が上昇したことからも、 HGF遺伝 子の導入力 Sリンパ管内皮細胞の増殖促進に有効であることが示された。
[0085] (5)オートクライン系でのヒト HGF cDNAと VEGF cDNAとの増殖促進効果の比較
6ゥエルプレートにサブコンフルェントまで培養した上記リンパ管内皮細胞に、リボフ エタトァミンプラス (GIBCO- BRL)を用いてネイキッドのヒト HGF cDNA発現プラスミド pV AX1HGF/MGB1と c- fosプロモータアツセィ用の c- fosルシフェラーゼリポーター遺伝 子プラスミド（P2FTL)を導入した (J. Hypertens. 1998, 16: 993-1000)。 24時間培養後 、無血清培地で 24時間培養し、常法に従ってルシフェラーゼ活性を測定したところ、 c-fosプロモータ活性の上昇が認められた。そこで、ヒト HGF cDNAの代わりにヒト VEG F cDNAを用いて上記（4)と同様の実験を行い、ヒト HGF cDNAと VEGF cDNAとの c- fosプロモータ活性に対する影響を比較した。アツセィは、独立に 4ゥエルずつ実施し た。その結果を表 5および図 6に示す。
[0086] [表 5]
GFP VEGF HGF
No1 281 35 9213 1 20035
No2 1 9431 14273 80231
No3 6789 3728 46335
No4 9085 2936 39688
平均 1 5860.00 7537.50 71 572.25
標準偏差 9859.20 5287.10 36865.23
標準誤差 4929.599 2643.551 18432.61 7
[0087] 上記結果から、 HGFcDNA発現プラスミドの導入により、 HGFのオートクラインにより c -fosプロモータ活性を有意に増大させるのに対し、 VEGFの cDNA発現プラスミドでは c-fosプロモータ活性の増大は認められず、リンパ管内皮細胞の増殖を促進しないこ とが示唆された。
[0088] 以上の初代培養細胞系における実験結果より、 HGFがリンパ管新生を促進すること 、および HGF遺伝子導入によりリンパ管新生の促進が可能であり、かつそれにはネィ キッドの HGF cDNA発現プラスミド、すなわち HGFをコードする核酸の導入が効果的 であることが示唆された。
また上記実施例においては、成犬から単離したリンパ管内皮細胞を用いており、ァ ダルトの動物のリンパ管内皮細胞に対して HGFが上記作用を有するということが示さ れた。このことは、リンパ浮腫の治療薬としての HGFの有用性を示すものである。 さらにまた、この HGFのリンパ管新生促進作用がヒト HGFのィヌリンパ管内皮細胞に 特異的な現象ではないことを確認するため、上記同様、雑種の成犬から単離した初 代培養大動脈内皮細胞および静脈内皮細胞の HGFによる増殖促進作用を調べたと ころ、ヒト HGFがこれら細胞に対して増殖促進作用を有することが示された。また、こ の増殖促進作用は、ヒトのこれらの細胞に対する増殖促進作用とほぼ同等であった（ データ示さず)。したがって、ヒト HGFは、ィヌ血管内皮細胞においてもヒト血管内皮 細胞と同様に作用することが示された。これら知見は、ヒト HGFのリンパ管新生促進 作用がィヌリンパ管内皮細胞に特異的な現象ではないことを示唆する。
[0089] (6)ヒトリンパ管内皮細胞における HGFの作用の確認
発明者らは、ヒトリンパ管内皮細胞でも上記成犬から単離したリンパ管内皮細胞の 結果が得られると考えた力 念のためにそれを確認すベぐヒトリンパ管内皮細胞 (An gioBio Co. (Del Mar, CA) )を用いて HGFによる増殖および遊走能の増強を検討し た。
継代数が 5〜8である細胞を実験に用いた。この細胞においても、リンパ管内皮細 胞のマーカーである、フォンビルブランド因子、 VEGF受容体- 3、 Proxl、および c-Me tが発現されて ヽることを免疫染色で確認した (データ示さず)。 MTSアツセィおよび遊 走性アツセィについては、上記ィヌのリンパ管内皮細胞での実験と同様に行った。
[0090] MTSアツセィの結果を図 7Aおよび遊走性アツセィの結果を図 7Bに示す。ヒト組換え HGFの添カ卩により細胞増殖および遊走能ともに増大しており、 lOng/ml以上の濃度で は、 HGF無添加の細胞に比して有意に増大していた。
このことより、発明者らの予想どおり、上記（1)〜（5)の成犬のリンパ管内皮細胞と 同様、ヒトリンパ管内皮細胞もまた、 HGFによりリンパ管新生が促進されることが確認 できた。
以上より、 HGFは、ィヌ以外の哺乳動物 (ヒトを含む）においてもリンパ管新生促進 作用を有することが示唆された。
[0091] [実施例 2]リンパ浮腫モデルラットにおける HGFの効果
上記の知見に基づいて、 in vivoにおける実証を行うために、リンパ浮腫モデルラット を用いて HGFの効果を確認した。
(1)リンパ浮腫モデルラットの作製
リンパ浮腫モデルラットは、 Slavin SA他（Anals of Surgery 1999, 229, 421- 427)の記 載に従って作製した。力かるモデルラットにおける尾部リンパ管の浮腫を確認するた めに、手術の直前に、尾の付け根から数センチのところに 0.5%の Patent Blue色素を 含む生理的緩衝液を注射し、手術を行った 1日後にその尾部を解剖したところ、リン パ管に青色色素が観察された (データ示さず)。また、対照のラットに比べて、尾の付 け根部分は明らかに太ぐ本ラットのリンパ浮腫モデルとしての有用性が確認できた。
[0092] (2)リンパ浮腫モデルラットにおける HGF cDNA発現プラスミドによるリンパ浮腫改善 効果
上記作製したモデルラットを用いてリンパ浮腫に対するヒト HGF遺伝子導入の効果 を調べた。
術後、ネイキッドのヒト HGF cDNA発現プラスミド pVAXIHGF/MGBl 200 μ g(/100 μ 1)、ネイキッドの VEGFcDNA発現プラスミド 200 μ g(/100 μ 1)、コントロールとしてネィキ ッドの GFP発現プラスミド (Venus plasmid) 200 μ g(/100 μ 1)を、術後 1日、 7日および 14 日で、筋肉内注射により投与した。手術のみの群は、手術のみ行い注射はしていな い。手術無しの群は、手術もしていない。生理食塩水群は、生理食塩水 100 1を術 後 1日、 7日および 14日に筋肉内注射した。それぞれについて術後 35日目まで 7日毎 に、尾の太さを計測した。各群 5匹ずつ試験し、平均値を求め、図 8に示した。
[0093] どの群でも術後一過性に尾の太さは増大した力 HGF cDNAを投与した群のみ、 他の群に比べて、尾の太さの減少が早ぐかつ大き力つた。この差は、 21日目以降で は有意であった。したがって、ネイキッドな HGF cDNAのプラスミドの投与によりリンパ 浮腫の改善が認められた。
[0094] 図 8に示すグラフの曲線下面積を求め、図 9に示した。 VEGF遺伝子の導入ラットは コントロールの Venus群ラットと差がないが、 HGF遺伝子導入ラットでは、有意に尾の 太さが減少していることがわかる。このリンパ浮腫患部である尾の太さの減少は、リン パ浮腫の軽減および治癒を示すものであり、 HGFをコードする核酸 (HGF遺伝子）を 導入することによりリンパ浮腫が軽減および治癒されることが明確に示された。
[0095] なお、術後 4、 10および 17日に、上記ラット尾の手術部位力も組織サンプルを採取 して、ヒト HGFの mRNA量を、常法にした力 ^、リアルタイム RT-PCRにて測定し、ヒト HG F遺伝子を導入した群でのみ、術後 17日までヒト HGFの発現が認められることを確認 している（データ示さず)。
[0096] さらに、 HGF遺伝子導入ラット、 VEGF遺伝子導入ラットおよび生理食塩水を注射し たコントロールのラットについて、術後 35日後における、注射部位での内皮細胞マー カー (PECAM- 1)、リンパ管内皮細胞マーカー（LYVE- 1および Proxl)および c- met の発現を免疫染色にて検出した。典型的な染色画像を図 10に示す（図 10A)。さら に、それぞれのマーカーについて、その発現量を公知の方法 (Yoon YS,他、 J. Clin. Invest. 2003;111:717-725)を用いて無作為に抽出した顕微鏡視野における免疫染 色陽性の管の数を算出した（図 10B)。この結果から、内皮細胞マーカーである PEC AM- 1陽性の管の数は、 HGF遺伝子導入ラットと VEGF遺伝子導入ラットともコントロー ルに対する差異は認められなかった。しかし、リンパ管内皮細胞マーカーである LYV E-1および Proxlのいずれについても、陽性の管の数は、 VEGF遺伝子導入ラットで はコントロールと差異がないのに対して、 HGF遺伝子導入ラットでは有意に増加して いた。さらに、 c-met陽性の管の数もまた、 HGF遺伝子導入ラットでのみコントロール に比して増加する傾向があった。以上より、 VEGF遺伝子ではリンパ管形成は促進さ れず、 HGF遺伝子によりリンパ管の形成が促進されることが確認された。
[0097] 力かるリンパ浮腫モデルラットにおける結果から、 HGFをコードする核酸をリンパ浮 腫の患部近傍に注射して、それを発現させることにより、該注射部位周辺でリンパ管 が新たに形成されることが示された。該モデルラットは、あらゆるリンパ浮腫を反映しう る。したがって、このモデルラットを用いて in vivoで HGF遺伝子投与によるリンパ浮腫 の症状の軽減'治癒が認められたことは、 HGFおよびその遺伝子の、ヒトを含む哺乳 動物のリンパ浮腫の治療薬としての HGFの有用性を示すものである。
[0098] [実施例 3]リンパ管内皮細胞における HGFのシグナル伝達の確認 以上の HGFの作用機序を確認するために、血管内皮細胞において HGFがリン酸 化を誘導することが知られている MAPKおよび Akt力 リンパ管内皮細胞においても H GF刺激によりそのリン酸ィ匕が誘導されることを確認した。 MAPKおよび Aktのリン酸ィ匕 力 HGFによる血管内皮細胞の増殖に必須であることが知られている（Nakagami H., Hypertension. 2001; 37[part 2]581— 586)。
[0099] 上記のィヌ胸管由来リンパ管内皮細胞を、 HGFの添加の 12時間以上前に培地を 0.
5%FCS含有 MEM培地または FCS不含 MEM培地に交換してお!、た。組み換えヒト HG Fを lOOng/mlの濃度になるように添加し、その 0〜15分後に培地を除去して、細胞を 溶解バッファー（50mM Tris- Cl、 2.5mM EGTA、 ImM EDTA、 ΙΟηΜ NaF、 1%デォキ シコルチコステロン、 1%トリトン X100、 InM PMSF、 2mMバナジン酸ナトリウム、 pH7.5) にて溶解させ、超音波処理にてゲノム分子を破砕し、タンパク質 20 gを含むサンプ ルを、常法に従って 10% SDS-PAGEに供した。ニトロセルロース膜に転写後、抗 MA PK/ERK抗体、抗リン酸化 MAPK/ERK特異 (phosphospecific; Tyr705または Ser727) 抗体、抗 Akt抗体および抗リン酸化 Akt特異抗体にて、ウェスタンプロットを行った。用 いた一次抗体は、 Cell Signaling Technologyなどから入手可能であった。 ECLキット (A mersham)を用いて検出した。
[0100] 結果を図 11に示す。図 11Aは、 MAPKのウェスタンブロット結果である。 HGF刺激 5 分以内に p44および p42の両 MAPKのリン酸化が亢進して!/、ることがわかった。図 11B に Aktの結果を示す。やはり、 HGF刺激 5分以内に Aktのリン酸ィ匕が亢進していた。そ れぞれの下のパネルはインターナルコントロールのために p44および p42の MAPKま たは Aktを検出したものである。
[0101] このように、リンパ管内皮細胞においても、 HGF刺激に応答して、 MAPKおよび Akt のリン酸化が亢進することから、リンパ管内皮細胞においても HGFが c-metを介して、 血管内皮細胞と同様のリン酸ィ匕カスケードを誘導することが示された。したがって、 M APKおよび Aktのリン酸ィ匕は、リンパ管内皮細胞の増殖に必須のシグナルであると考 えられる。
[0102] さらにまた、 HGFによるリンパ管内皮細胞の増殖活性力 MEK阻害剤である U0126( 50 μ Μ)および PD9805(30 μ Μ)、 ΡΙ3キナーゼ阻害剤である Ly294002(50 μ Μ)および ウォルトマニン (ΙΟΟηΜ)により低減されることもわ力つた (データ示さず)。このことからも 、 HGFのリンパ管新生作用は、 HGFが c-metを介して血管内皮細胞と同様のシグナ ノレカスケードを誘導することによるものであることが示唆される。
産業上の利用可能性
[0103] 本発明によって、新たなリンパ管新生促進剤が提供された。本発明によって提供さ れたリンパ管新生促進剤は、その活性成分としてヒト HGFを含有する。
[0104] リンパ管の新生を促進するペプチド性の因子として、 VEGF-Cが知られている。しか し、 VEGFファミリーに属する他の VEGFはリンパ管の新生を促進する作用を有さず、 VEGF-Cのみが、リンパ管新生促進作用を有することが知られていた。
[0105] 一方、本発明においてリンパ管新生促進作用を見いだされた HGFは、 VEGFと同様 、血管新生因子として知られている。 VEGFがリンパ管新生促進作用を有さないことか ら、 HGF¾またリンパ管新生促進作用を有さないと、当業者の間で考えられてきた。 従って、 HGFがリンパ管新生作用を有することを見出した本発明者らの知見は、驚く べき事実と言える。
[0106] カロえて、 VEGF-Cは VEGFR2とのクロスリンクにより浮腫を起こす可能性がある力 H GFにはこのような懸念はない。これもまた、本発明のリンパ管新生促進剤の大きな特 徴である。該リンパ管新生促進剤は、リンパ浮腫の予防または治療用の薬剤として有 効である。
[0107] さらに、 HGFは、胎生期または新生期ではなぐアダルト動物から単離されたリンパ 管内皮細胞に対して、その増殖および遊走を活性ィ匕しリンパ管新生を促進する。癌 の治療のための癌組織および/またはリンパ節摘出手術後のリンパ浮腫に苦しむ患 者の多くは成人である。本発明の薬剤は、癌の治療のための癌組織および/またはリ ンパ節摘出手術後のリンパ浮腫に苦しむ成人のための治療薬として、特に有用であ る。

Claims

請求の範囲
[1] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物を活性成分として含有 する、リンパ管新生促進剤。
[2] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質が、以下 (a)〜（d)のいずれかに記載 のタンパク質である、請求項 1に記載の剤；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[3] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を活性成分として含 有する、リンパ管新生促進剤。
[4] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（d)の いずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、請求項 3に記載の剤；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[5] 核酸が哺乳動物用発現ベクターに挿入されている、請求項 3または 4に記載の剤。
[6] 核酸がネイキッドな核酸である、請求項 3〜5のいずれかに記載の剤。
[7] リンパ浮腫の予防または治療用の薬剤として用いられることを特徴とする、請求項 1
〜6の!、ずれかに記載の剤。
[8] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物を被験体に投与するェ 程を含む、リンパ管新生を促進する方法。
[9] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質力 以下 (a)〜（d)のいずれかに記載 のタンパク質である、請求項 8に記載の方法；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[10] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を被験体に投与する 工程を含む、リンパ管新生を促進する方法。
[11] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（d)の いずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、請求項 10に記載の方法；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[12] 核酸が哺乳動物用発現ベクターに挿入されている、請求項 10または 11に記載の方 法。
[13] 核酸がネイキッドな核酸である、請求項 10〜12のいずれかに記載の方法。
[14] HGF受容体の活性化を誘導し、該活性化によりリンパ管新生を促進する方法。
[15] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物を被験体に投与するェ 程を含む、リンパ浮腫を予防または治療する方法。
[16] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質力 以下 (a)〜（d)のいずれかに記載 のタンパク質である、請求項 15に記載の方法；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[17] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸を被験体に投与する 工程を含む、リンパ浮腫を予防または治療する方法。
[18] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（d)の いずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、請求項 17に記載の方法；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、 (d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[19] 核酸が哺乳動物用発現ベクターに挿入されている、請求項 17または 18に記載の方 法。
[20] 核酸がネイキッドな核酸である、請求項 17〜 19のいずれかに記載の方法。
[21] リンパ管新生促進剤またはリンパ浮腫の予防もしくは治療のために用いる薬剤の製 造における、 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質もしくは化合物の使用。
[22] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質力 以下 (a)〜（d)のいずれかに記載 のタンパク質である、請求項 21に記載の使用；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[23] リンパ管新生促進剤またはリンパ浮腫の予防もしくは治療のために用いる薬剤の製 造における、 HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸の使用。
[24] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（d)の いずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、請求項 23に記載の使用；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[25] 核酸が哺乳動物用発現ベクターに挿入されている、請求項 23または 24に記載の核 酸の使用。
[26] 核酸がネイキッドな核酸である、請求項 23〜25のいずれかに記載の核酸の使用。
[27] 以下 (a)〜 (c)の工程を含む、リンパ管新生促進活性を有する化合物またはリンパ浮 腫の予防もしくは治療効果を有する化合物のスクリーニング方法；
(a) HGF受容体または HGF受容体と機能的に同等なタンパク質に被検化合物を接 触させる工程、
(b)該タンパク質と被検化合物の結合を検出する工程、
(c)該タンパク質と結合する被検化合物を選択する工程。
[28] HGF受容体または HGF受容体と機能的に同等なタンパク質が、以下 (i)〜 (iv)から 選択される、請求項 27に記載の方法；
(i)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(ii)配列番号： 3に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(iii)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列にお!/、て 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号: 4に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(iv)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジ ントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号: 4に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[29] 以下 (a)〜 (c)の工程を含む、リンパ管新生促進活性を有する化合物またはリンパ浮 腫の予防もしくは治療効果を有する化合物のスクリーニング方法；
(a) HGF受容体または HGF受容体と機能的に同等なタンパク質を発現している細胞 に被検化合物を接触させる工程、 (b)該細胞の増殖能、遊走性、またはシグナル分子のリン酸ィ匕を測定する工程、
(c)被検化合物を接触させて 、な 、場合と比較して、該細胞の増殖能を増カロさせた
、遊走性を増加させた、またはシグナル分子をリン酸化させた被検化合物を選択する 工程。
[30] HGF受容体または HGF受容体と機能的に同等なタンパク質が、以下 (i)〜 (iv)から 選択される、請求項 29に記載の方法；
(i)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(ii)配列番号： 3に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(iii)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列にお!/、て 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号: 4に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(iv)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジ ントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号: 4に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[31] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸が挿入された哺乳動 物用発現ベクターであって、リンパ浮腫の予防または治療用のベクター。
[32] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（d)の いずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、請求項 31に記載のベクター；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[33] 配列番号： 5または 6に記載の塩基配列からなるベクターである、請求項 31または 32 に記載のベクター。
[34] ネイキッドな状態で投与されることを特徴とする、請求項 31〜33のいずれかに記載 のベクター。
[35] 被験体の患部またはその周辺に筋肉内注射により投与されることを特徴とする、請求 項 31〜34のいずれかに記載のベクター。
[36] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸が挿入された哺乳動 物用発現ベクターを活性成分として含有する、リンパ浮腫の予防または治療用の薬 剤であって、該ベクターがネイキッドな状態で、被験体の患部またはその周辺に筋肉 内注射により投与されることを特徴とする薬剤。
[37] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（d)の いずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、請求項 36に記載の薬剤；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[38] ベクターが、配列番号： 5または 6に記載の塩基配列力もなるベクターである、請求項
36または 37に記載の薬剤。
[39] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸が挿入された哺乳動 物用発現ベクターを、ネイキッドな状態で、被験体の患部またはその周辺に筋肉内 注射により投与する工程を含む、リンパ浮腫を予防または治療する方法。
[40] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（d)の いずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、請求項 39に記載の方法； (a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[41] ベクターが、配列番号： 5または 6に記載の塩基配列力もなるベクターである、請求項
39または 40に記載の方法。
[42] リンパ浮腫の予防または治療用の薬剤の製造における、 HGFまたは HGFと機能的に 同等なタンパク質をコードする核酸が挿入された哺乳動物用発現ベクターの使用で あって、該ベクターがネイキッドな状態で、被験体の患部またはその周辺に筋肉内注 射により投与されることを特徴とするベクターの使用。
[43] HGFまたは HGFと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸力 以下 (a)〜（d)の いずれかに記載のタンパク質をコードする核酸である、請求項 42に記載の使用；
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b)配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む核酸によりコードされるタンパ ク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入、および Zまたは付加したアミノ酸配列力 なり、配列番号： 2に記載のァミノ 酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
(d)配列番号： 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号： 2に記載のアミノ酸 配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
[44] ベクターが、配列番号： 5または 6に記載の塩基配列力もなるベクターである、請求項
42または 43に記載の使用。
PCT/JP2006/315010 2005-07-28 2006-07-28 リンパ管新生促進剤 WO2007013603A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06781920.1A EP1911459B1 (en) 2005-07-28 2006-07-28 Lymphangiogenesis promoter
JP2007526918A JP4111993B2 (ja) 2006-05-29 2006-07-28 リンパ管新生促進剤
ES06781920.1T ES2561155T3 (es) 2005-07-28 2006-07-28 Promotor de la linfangiogénesis
US11/996,898 US20110160132A1 (en) 2005-07-28 2006-07-28 Lymphangiogenesis-promoting agents
US15/088,443 US20160271219A1 (en) 2005-07-28 2016-04-01 Lymphangiogenesis-promoting agents
US16/239,381 US20190321444A1 (en) 2005-07-28 2019-01-03 Lymphangiogenesis-promoting agents
US17/240,373 US20220088141A1 (en) 2005-07-28 2021-04-26 Lymphangiogenesis-promoting agents

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005219410 2005-07-28
JP2005-219410 2005-07-28
JP2006148970 2006-05-29
JP2006-148970 2006-05-29

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/996,898 A-371-Of-International US20110160132A1 (en) 2005-07-28 2006-07-28 Lymphangiogenesis-promoting agents
US15/088,443 Continuation US20160271219A1 (en) 2005-07-28 2016-04-01 Lymphangiogenesis-promoting agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007013603A1 true WO2007013603A1 (ja) 2007-02-01

Family

ID=37683490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/315010 WO2007013603A1 (ja) 2005-07-28 2006-07-28 リンパ管新生促進剤

Country Status (4)

Country Link
US (4) US20110160132A1 (ja)
EP (1) EP1911459B1 (ja)
ES (1) ES2561155T3 (ja)
WO (1) WO2007013603A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008189609A (ja) * 2007-02-06 2008-08-21 Shiseido Co Ltd Ｖｅｇｆｃ産生促進剤
JP2009291191A (ja) * 2008-05-14 2009-12-17 Metheresis Translational Research Sa Ｈｇｆｒの高親和結合部位およびその拮抗剤の同定方法
JP2011084473A (ja) * 2009-10-13 2011-04-28 Nippon Menaade Keshohin Kk Ｓ−ラクトイルグルタチオン及び／又はその塩を含有することを特徴とするむくみ改善剤。

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997007824A1 (fr) 1995-08-29 1997-03-06 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. Medicament comprenant le gene hgf
WO2003000242A2 (en) 2001-06-25 2003-01-03 Sky Biohealth Solutions, Inc. Method for the treatment of lymphedema using guaifenesin
US6689352B2 (en) 2000-05-03 2004-02-10 Ludwig Institute For Cancer Research Method for activating only the vascular endothelial growth factor receptor-3 and uses thereof
US6818220B1 (en) 1994-11-14 2004-11-16 Licentia Ltd. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene mutants thereof, and uses thereof
WO2006105511A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 The General Hospital Corporation Monitoring and modulating hgf/hgfr activity

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6818220B1 (en) 1994-11-14 2004-11-16 Licentia Ltd. Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene mutants thereof, and uses thereof
WO1997007824A1 (fr) 1995-08-29 1997-03-06 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. Medicament comprenant le gene hgf
US6689352B2 (en) 2000-05-03 2004-02-10 Ludwig Institute For Cancer Research Method for activating only the vascular endothelial growth factor receptor-3 and uses thereof
WO2003000242A2 (en) 2001-06-25 2003-01-03 Sky Biohealth Solutions, Inc. Method for the treatment of lymphedema using guaifenesin
WO2006105511A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 The General Hospital Corporation Monitoring and modulating hgf/hgfr activity

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAUMGARTNER, I. ET AL., ANN. INTERN. MED., vol. 132, 2000, pages 880 - 884
BAUMGARTNER, I. ET AL., CIRCULATION, vol. 97, 1998, pages 1114 - 1123
BEERS M.H. ET AL.: "LYMPHEDEMA", THE MERCK MANUAL OF DIAGNOSIS AND THERAPY, SEVENTEENTH EDITION, 1999, pages 1798, XP003004203 *
ISNER, JM. ET AL., CIRC. RES., vol. 89, 2001, pages 389 - 400
ISNER, JM. ET AL., J. VASC. SURG., vol. 28, 1998, pages 964 - 975
ISSBRUCKER, K. ET AL., FASEB J, 18 December 2002 (2002-12-18), pages 10
KAJIYA K ET AL., JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol. 124, no. 4, 2005, pages A1
KAJIYA K. ET AL.: "Hepatocypte growth factor promotes lymphatic vessel formation and function", THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol. 124, no. 4, April 2005 (2005-04-01), pages A1, ABSTR. NR. 003, XP003004202 *
KAJIYA K. ET AL.: "Hepatocyte growth factor promotes lymphatic vessel formation and function", THE EMBO JOURNAL, vol. 24, 17 August 2005 (2005-08-17), pages 2885 - 2895, XP002390312 *
KANEDA, Y ET AL., MOL. THER., vol. 6, 2002, pages 219 - 226
MICROCIRCULATION, vol. 6, 1999, pages 75 - 78
MORISHITA R., HYPERTENSION, vol. 44, no. 2, 2004, pages 203 - 9
SCAVELLI, C. ET AL., J. ANAL, 2004, pages 433 - 449
See also references of EP1911459A4
SENGER, D. ET AL., SCIENCE, vol. 219, 1983, pages 983 - 6
WIGLE J T; OLIVER G, CELL, vol. 98, 1999, pages 769 - 778
YOON YOUNG-SUP ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 111, no. 5, 2003, pages 717 - 725

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008189609A (ja) * 2007-02-06 2008-08-21 Shiseido Co Ltd Ｖｅｇｆｃ産生促進剤
JP2009291191A (ja) * 2008-05-14 2009-12-17 Metheresis Translational Research Sa Ｈｇｆｒの高親和結合部位およびその拮抗剤の同定方法
JP2011084473A (ja) * 2009-10-13 2011-04-28 Nippon Menaade Keshohin Kk Ｓ−ラクトイルグルタチオン及び／又はその塩を含有することを特徴とするむくみ改善剤。

Also Published As

Publication number Publication date
EP1911459A1 (en) 2008-04-16
US20190321444A1 (en) 2019-10-24
US20160271219A1 (en) 2016-09-22
US20110160132A1 (en) 2011-06-30
ES2561155T3 (es) 2016-02-24
US20220088141A1 (en) 2022-03-24
EP1911459A4 (en) 2009-09-30
EP1911459B1 (en) 2015-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11026994B2 (en) Syndecan-2 compositions and methods of use
WO2014081202A1 (ko) Vegfr-2와 dll4를 표적으로 하는 이중표적항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
US20220088141A1 (en) Lymphangiogenesis-promoting agents
EP1968565B1 (en) Compositions and methods for inhibiting angiogenesis
US20090036369A1 (en) Anti-tumor agents comprising r-spondins
JP2015178507A (ja) Ｎｏｔｃｈ３シグナル伝達のデコイインヒビターとしてのヒトｎｏｔｃｈ３に基づく融合タンパク質
KR20010022887A (ko) 내피의 단백질분해 활성 및/또는 맥관형성 활성의 자극, 조절 및/또는 저해
JP2015506961A (ja) Ａｌｋ１アンタゴニストおよび腎細胞癌の治療におけるその使用
WO2012169822A2 (ko) 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물
WO2010149281A1 (en) Use of cd44v6 in the treatment of ophthalmic diseases
Melly et al. Myocardial infarction stabilization by cell‐based expression of controlled vascular endothelial growth factor levels
KR20210091323A (ko) 면역조절 단백질 발현용 다유전자 구조체 및 이의 사용 방법
WO2019027299A2 (ko) 간세포성장인자를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
CA2920730A1 (en) Therapeutic use of vegf-c and ccbe1
JP5036057B2 (ja) リンパ管新生促進剤
Yokoyama et al. Heparan sulfate controls skeletal muscle differentiation and motor functions
KR101438996B1 (ko) 혈관형성 촉진 활성을 갖는 돌연변이형 합토글로빈의 용도
EP4088735A1 (en) Application of cst1 in prevention and/or treatment of liver immune dysregulation diseases
US20060040859A1 (en) Peptides, DNAs, RNAs, and compounds for inhibiting or inducing adrenomedullin activity, and use of the same
US7534436B2 (en) Peptide fragments of the harp factor inhibiting angiogenesis
JP2007519894A (ja) 標的としてのカドヘリンの使用
KR20110102788A (ko) 합토글로빈 유전자가 도입된 혈관내피 전구세포 및 이를 포함하는 혈관형성 촉진용 조성물
WO2022081876A1 (en) Use of reelin for treating cardiac diseases
KR20120004097A (ko) Ｖｅｇｆｒ―３을 포함하는 허혈질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR101521980B1 (ko) 미니서클 벡터를 이용하여 ｔｎｆｒ２가 분비되도록 조절된 줄기세포의 확립

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007526918

Country of ref document: JP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006781920

Country of ref document: EP