KR20210091323A - 면역조절 단백질 발현용 다유전자 구조체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

면역조절 단백질 발현용 다유전자 구조체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

각 단백질 또는 이의 성분이 적절한 프로모터 및/또는 번역 변형자를 사용하여 발현될 수 있는 IL-12 p35 및 IL-12 p40 단백질을 암호화하는 발현 벡터 구조체가 제공된다. 상기 발현 벡터에 대한 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

면역조절 단백질 발현용 다유전자 구조체 및 이의 사용 방법
관련 출원의 교차 참조
본원은 2018년 12월 11일에 출원된 미국 임시 출원 제62/778,027호의 우선권을 주장하며, 이 출원은 원용에 의해 본원에 포함된다.
EFS 웹을 통해 텍스트 파일로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본원과 함께 전자적으로 제출된 서열 목록 또한 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다(파일명: 541462_SequenceListing_ST25.txt; 작성일: 2019년 12월 10일; 파일 크기: 57 KB).
기술분야
치료적으로 활성인 다량체 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 3개의 유전자의 종양내 전달을 위한 재조합 발현 벡터가 기술된다. 번역 조절 요소에 의해 분리된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 제공된다. 전달 방법이 또한 제공된다.
대장균 플라스미드는 오랫동안, 연구자들과 산업계가 사용하는 재조합 DNA 분자의 중요한 공급원이었다. 오늘날, 차세대 생명 공학 제품(예를 들어 유전자 의약품 및 DNA 백신)이 임상 시험을 거쳐 결국 제약 시장에 진출함에 따라, 플라스미드 DNA는 점점 더 중요해지고 있다. 발현 플라스미드 DNA는 치료가 필요한 환자의 부위, 예를 들어 종양에 치료 단백질을 전달하기 위한 비히클로 응용될 수 있다.
이러한 "종양내 전달"은 종종, 종양 미세환경으로의 면역조절제의 전달을 포함한다. 면역요법은 최근, 종양 치료를 위한 수술, 화학요법, 및 방사선요법에 이은 네 번째 방법으로서 주목받고 있다. 면역요법은 인간 고유의 면역력을 활용하기 때문에, 면역요법에서의 환자의 신체적 부담이 다른 요법에서보다 적은 것으로 언급된다. 면역요법으로 알려진 치료 접근법은 하기를 포함한다: 예를 들어 외인성으로 유도된 세포독성 T-림프구(CTL) 또는 말초 혈액 림프구로부터 다양한 방법을 사용한 확장 배양에 의해 수득된, 림포카인 활성 세포, 자연 살해 T-세포 또는 γδT 세포와 같은 세포가 전달되는 세포 전달 요법; 항원-특이적 CTL의 생체내 유도가 예상되는 수지상 세포 전달 요법 또는 펩타이드 백신 요법; Th1 세포 요법; 및 다양한 효과를 갖는 것으로 예측되는 유전자를 전술된 세포에 생체외에서 도입하여 이들을 생체내로 전달하는 면역 유전자 요법. 이들 면역요법에서, CD4-양성 T 세포와 CD8-양성 T 세포가 중요한 역할을 하는 것으로 전통적으로 알려져 왔다.
생체내 전기천공은 플라스미드 DNA를 여러 상이한 조직으로 효율적으로 전달하기 위해 성공적으로 사용되어 온 유전자 전달 기술이다. 연구들은, 플라스미드 DNA를 B16 흑색종 및 다른 종양 조직으로 전달하기 위한 생체내 전기천공을 보고하였다. 플라스미드에 의해 암호화된 유전자 또는 cDNA의 전신 및 국소 발현은 생체내 전기천공의 투여로 획득될 수 있다. 생체내 전기천공의 사용은 종양 조직에서의 플라스미드 DNA 흡수를 향상시켜 종양 내에서의 발현을 일으키고, 플라스미드를 근육 조직에 전달하여 전신 사이토카인 발현을 일으킨다.
생체내에서 세포를 플라스미드 DNA로 형질감염시키기 위해 전기천공이 사용될 수 있다는 것이 입증되었다. 최근 연구들은 전기천공이 항종양제로서의 플라스미드 DNA의 전달을 향상시킬 수 있음을 입증하였다. 설치류 모델에서 간세포 암종, 선암, 유방 종양, 편평세포 암종 및 B16.F10 흑색종의 치료를 위해 전기천공이 투여되었다. 재조합 단백질로서 또는 유전자 요법에 의한 사이토카인을 비롯한 면역조절 분자의 전달을 위한 잠재적 면역요법 프로토콜을 시험하기 위해, B16.F10 뮤린 흑색종 모델이 광범위하게 사용되었다.
암 치료를 위한 생체내 전기천공을 이용하는 면역조절 단백질을 암호화하는 플라스미드의 전달을 위해, 당업계에 공지된 다양한 프로토콜이 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 프로토콜은, 저전압 및 장파 전류를 사용하여, 종양내 및 근육내 둘 모두의, 생체내 전기천공-매개된 사이토카인 기반 유전자 요법을 기술한다.
암 면역 주기의 다양한 단계를 포함하는 병용 면역요법은, 종양 세포가 면역계에 의한 제거를 피하는 복수의 기전을 표적화함으로써, 면역 회피를 방지하는 능력을 향상시킬 수 있으며, 더 폭넓은 환자 집단에서 향상된 효능을 제공할 수 있는 상승작용 효과를 제공할 수 있다. 종종, 이러한 병용 치료 면역조절 단백질은 하나 이상의 동종이량체 또는 이종이량체 사슬을 포함하는 복합 분자, 예를 들어 IL-12, 유전적 보조제(genetic adjuvant) 및 종양 또는 바이러스 항원을 암호화하는 융합 단백질이다. 치료제로서 복수의 단백질을 투여하는 것은 복잡하고 비용이 많이 든다. 발현 플라스미드를 사용한 복수의 암호화된 단백질의 종양내 전달의 사용이 더 간단하고 비용 효율이 더 높다. 또한, 적절한 번역 요소 및 최적화된 전기천공 매개변수의 사용은, 이종이량체 면역자극 사이토카인을 비롯한 복수의 단백질의 발현을 개선하고 플라스미드 치료제의 치료적 투여 빈도를 감소시킬 수 있다. 그러나, 현재의 발현 플라스미드 구조체는 각 면역조절 단백질의 적절한 생산에 대한 필요성을 해결하지 못한다. 적절하게 배치된 프로모터 및 번역 변형자(translation modifier)와 함께 이종이량체 사이토카인 IL-12 단독 및 종양 항원에 융합된 FLT3 리간드를 암호화하는 발현 벡터를 제공함으로써, 이러한 필요성을 해결하는 화합물 및 상기 화합물을 사용하는 방법이 기술된다.
P-A-T-A'(여기서 P는 프로모터이고; A는 인간 인터류킨-12(IL-12) p35를 암호화하고; T는 P2A 번역 변형 요소를 암호화하고; A'는 인간 IL-12 p40을 암호화함)로 표시되는 화학식을 포함하는 발현 벡터가 기술된다. A, T 및 A'는 단일 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 서열 번호 8, 서열 번호 13, 또는 서열 번호 14의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 암호화한다. 종양 세포와 같은 세포로 전달되는 경우, 기술된 발현 벡터는 단일 폴리시스트론 메시지(polycistronic message)로부터 인간 IL-12 p35(hIL-12 p35) 및 인간 IL-12 p40(hIL-12 p40)을 발현한다. hIL-12 p35 및 hIL-12 p40 단백질은 세포로부터 분비되어 활성 IL-12 p70 헤테로듀플렉스를 형성한다.
또한, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 기술되며, 이는 적어도 하나의 종양내 전기천공 펄스를 사용하여, 기술된 발현 벡터 중 하나 이상을 종양으로 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 종양내 전기천공 펄스는 약 200 V/cm 내지 1500 V/cm의 전계 강도를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 상기 종양은 흑색종, 삼중 음성 유방암, 메르켈 세포 암종, 피부 T-세포 림프종(CTCL) 및 두경부 편평세포 암종(HNSCC) 일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 전기천공 펄스는 전기화학적 임피던스 분광법이 가능한 발생기에 의해 전달된다.
또한, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 기술되며, 이는 인터류킨-12(IL-12)를 암호화하는 기술된 발현 벡터 중 임의의 것을 전달하는 적어도 하나의 저전압 종양내 전기천공(intratumoral electroporation; IT-EP) 치료를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 IT-EP는 200 V/Cm 내지 500 V/cm의 전계 강도 및 약 100 μs(마이크로초) 내지 약 50 ms(밀리초)의 펄스 길이에서이다. 일부 구현예에서, 상기 치료는 적어도 400 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이에서의 적어도 하나의 IT-EP 치료를 포함한다. 또한 고려되는 것은, P2A를 함유하는 IL-12 암호화된 플라스미드의 저전압 IT-EP 치료가 IRES 모티프를 함유하는 IL-12 암호화된 플라스미드와 비교하여 하기 중 적어도 하나를 포함하는 경우이다: a) 적어도 3.6배 더 높은, IL-12의 종양내 발현; b) 치료된 종양 병변에서의 더 낮은 평균 종양 부피; c) 치료되지 않은 대측성 종양 병변에서의 더 낮은 평균 종양 부피; d) 종양으로의 림프구의 더 높은 유입; e) 종양-특이적 순환 CD8+ T 세포의 증가; f) 종양에서의 림프구 및 단핵구 세포 표면 마커 발현의 증가; 및 g) 표 23 및 24의 유전자 중 하나 이상 또는 모두와 같은 INF-g 관련 유전자의 mRNA 수준의 증가.
도 1은 인간 IL-12 및 FLT3L-NYESO1 융합 단백질의 발현을 위한 pOMI-PIIM(온코섹 메디컬 인코퍼레이티드 - 폴리시스트론 IL-12 면역 조절제(OncoSec Medical Incorporated - Polycistronic IL-12 Immune Modulator))이라는 벡터의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 2는 HEK Blue 리포터 세포를 사용하여 측정된 pOMI-PIIM으로부터 발현된 분비된 IL-12 p70 이종이량체를 함유하는, 조직 배양 세포 조절 배지의 활성을 도시한다. 대조군(중화 항-IL12 항체 추가, 형질감염되지 않은 세포로부터의 조절 배지)은 점선으로 표시하였다.
도 3은 마우스에서의 원발성(치료된) 및 대측성(치료되지 않은) B16-F10 종양 둘 모두의 성장을 조절하는 pOMI-PIIM의 종양내 전기천공의 능력을 도시한다(흑색 선). 비교를 위해 pUMVC3(빈 벡터 대조군)의 종양내 전기천공을 도시하였다(점선).
도 4는 pOMI-PIIM으로부터 생산된 Flt3L 융합 단백질이 시험관내에서 인간 수지상 세포를 성숙시키는 능력을 도시한다. 빈 벡터(EV) 및 비활성 돌연변이체 Flt3L(H8R) 대조군과 비교하여, Flt3L-NY-ESO-1은 1차 인간 미성숙 수지상 세포 상에서의 a. CD80 및 b. CD86의 발현을 유의하게 증가시켰다: *=p <0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001.
도 5는 미치료, NY-ESO-1(157-165) 치료, EV 단독 치료, Flt3L-NY-ESO-1 치료, 또는 Flt3L-NY-ESO-1(H8R) 치료 후의, a. TNF-α 양성 세포 % 또는 b. IFN-γ-양성 세포 %를 도시한다: *=p <0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001.
도 6. HEK293 세포에서의 pOMIP2A 및 pOMI-PI 벡터로부터의 hIL-12 p70의 발현을 도시하는 그래프. pOMIP2A는, 제한 효소 부위를 결실시키는 IL-12 p35 암호화 서열에서의 5개의 침묵 돌연변이를 함유하고, 클로닝을 용이하게 하기 위한 NotI 및 BamHI 제한 부위를 부가한다. pOMI-PI는 내인성 IL-12 p35 및 IL-12 p40 암호화 서열을 함유하며, NotI 및 BamHI 제한 부위를 부가하지 않고 제조되었다.
첨부된 청구범위를 포함한 본원에서, 단수의 표현은, 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 상응하는 복수의 언급 대상을 포함한다.
본원에 인용된 모든 참조문헌은, 각각의 개별 간행물, 특허 출원 또는 특허가 원용에 의해 구체적으로 및 개별적으로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로, 원용에 의해 본원에 포함된다.
I. 정의.
분자의 "활성"은 리간드 또는 수용체에 대한 분자의 결합, 촉매 활성, 유전자 발현을 자극하는 능력, 항원 활성, 다른 분자의 활성의 조절 등을 기재하거나 지칭할 수 있다. 분자의 "활성"은 또한 세포-대-세포 상호작용, 예를 들어, 접착, 또는 세포의 구조, 예를 들어, 세포막 또는 세포 골격을 유지하는 데 있어서의 활성을 지칭할 수 있다. "활성"은 또한 특정 활성, 예를 들어 [촉매 활성]/[단백질 mg] 또는 [면역 활성]/[단백질 mg] 등을 의미할 수 있다.
본원에서, "번역 조절 요소"또는 "번역 변형자"는, 미완성 폴리펩타이드 사슬의 피코르나바이러스 유래 서열이 다음 아미노산과의 공유 아미드 결합을 방지하는 리보솜 스키핑 조절자(ribosomal skipping modulator) 또는 특정 번역 개시자를 의미한다. 이 서열의 혼입은 동일 몰 수준의 번역된 폴리펩타이드와의 이종이량체 단백질의 각 사슬의 공동발현을 유발한다. 일부 구현예에서, 상기 번역 변형자는 2A 패밀리의 리보솜 스키핑 조절자이다. 변형된 2A 번역은 P2A, T2A, E2A 및 F2A일 수 있지만 이에 제한되지는 않으며, 이들 모두는 PG/P 절단 부위를 공유한다(표 5 참조). 일부 구현예에서, 상기 번역 변형자는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)이다.
본 발명에 따르면, 당업계의 기술 내의, 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (본원에서 "Sambrook, et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994) 참조.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어인 "핵산", "뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체 또는 변형된 버전을 비롯한 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 이들은, 단일 가닥, 이중 가닥 및 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기 또는 기타 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비천연, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
"폴리뉴클레오타이드 서열", "핵산 서열" 또는 "뉴클레오타이드 서열"은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 일련의 뉴클레오타이드이며, 2개 이상의 뉴클레오타이드의 임의의 사슬을 의미한다.
핵산은 "5' 말단" 및 "3' 말단"을 갖는 것으로 언급되는데, 이는, 하나의 모노뉴클레오타이드 오탄당 고리의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 결합을 통해 일 방향으로 이의 이웃의 3' 산소에 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오타이드를 생성하도록 모노뉴클레오타이드가 반응되기 때문이다. 올리고뉴클레오타이드의 말단은, 이의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오타이드 오탄당 고리의 3' 산소에 연결되지 않은 경우 "5' 말단"으로 지칭된다. 올리고뉴클레오타이드의 말단은, 이의 3' 산소가 다른 모노뉴클레오타이드 오탄당 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않은 경우 "3' 말단"으로 지칭된다. 핵산 서열은, 더 큰 올리고뉴클레오타이드에 내재하더라도, 또한 5' 및 3' 말단을 갖는 것으로 언급될 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 불연속 요소는 "상류" 또는 "하류"의 5' 또는 3' 요소로 지칭된다.
"암호화 서열" 또는 RNA 또는 펩타이드(들)(예를 들어 면역글로불린 사슬 또는 IL-12 단백질)와 같은 발현 산물을 "암호화하는" 서열은, 발현되는 경우 그 산물 또는 산물들의 생산을 유발하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본원에서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는, 일반적으로 약 300개 이하의 뉴클레오타이드(예를 들어 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 150, 175, 200, 250 또는 300개)의 핵산을 지칭하며, 이는 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 또는 유전자, mRNA, cDNA 또는 다른 관심 핵산을 암호화하는 mRNA 분자에 혼성화될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 단일 가닥이지만, 이중 가닥일 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 바이오틴과 같은 표지가 공유 접합된 32P-뉴클레오타이드, 3H-뉴클레오타이드, 14C-뉴클레오타이드, 35S-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 혼입에 의해 표지될 수 있다. 일부 구현예에서, 표지된 올리고뉴클레오타이드는 핵산의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드(이들 중 하나 또는 둘 모두가 표지될 수 있음)는, 유전자의 전장 또는 단편을 클로닝하거나 핵산의 존재를 검출하기 위해, PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 핵산 합성기에서, 합성적으로 제조된다.
"작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 두 성분 모두가 정상적으로 기능하고 상기 성분들 중 적어도 하나가 다른 성분들 중 적어도 하나에 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하는 2개 이상의 성분(예를 들어, 프로모터 및 다른 서열 요소)의 병치를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 암호화 서열의 전사 수준을 조절하는 경우, 상기 프로모터는 암호화 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 작동 가능한 연결은 서로 인접하거나 트랜스로 작용하는 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 조절 서열은 암호화 서열의 전사를 조절하기 위해 멀리서 작용할 수 있음).
용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 박테리아 전달 벡터, 바이러스 벡터 전달 벡터, 펩타이드 면역요법 전달 벡터, DNA 면역요법 전달 벡터, 에피솜 플라스미드, 통합형 플라스미드 또는 파지 벡터를 비롯한 임의의 공지된 전달 벡터를 포함한다. 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 폴리펩타이드를 전달하고, 선택적으로 발현할 수 있는, 구조체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 원형 pOMIP2A, pOMI-PIIM, 또는 pOMI-PI 플라스미드이다.
"단백질 서열", "펩타이드 서열" 또는 "폴리펩타이드 서열" 또는 "아미노산 서열"은 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드에서의 일련의 2개 이상의 아미노산을 지칭한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어인 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 암호화된 및 비-암호화된 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산을 비롯한 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다. 상기 용어들은 변형된 펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드와 같은 변형된 중합체를 포함한다.
단백질은 "N-말단"과 "C-말단"을 갖는 것으로 언급된다. 용어 "N-말단" 은 유리 아민기(-NH2)를 갖는 아미노산에 의해 종결된 단백질 또는 폴리펩타이드의 시작부에 관한 것이다. 용어 "C-말단"은, 유리 카르복실기(-COOH)에 의해 종결된 아미노산 사슬(단백질 또는 폴리펩타이드)의 말단에 관한 것이다.
용어 "융합 단백질"은 펩타이드 결합 또는 다른 화학 결합에 의해 함께 연결된 2개 이상의 펩타이드를 포함하는 단백질을 지칭한다. 상기 펩타이드들은 펩타이드 또는 다른 화학 결합에 의해 직접 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 키메라 분자는 단일-사슬 융합 단백질로서 재조합적으로 발현될 수 있다. 대안적으로, 상기 펩타이드들은 하나 이상의 아미노산 또는 상기 2개 이상의 펩타이드 사이의 다른 적합한 링커와 같은 "링커"에 의해 함께 연결될 수 있다.
용어 "단리된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "단리된 폴리펩타이드"는 각각, 세포에서 또는 재조합 DNA 발현 시스템 또는 임의의 다른 오염 물질에서 일반적으로 발견되는 다른 성분으로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, RNA 또는 DNA 분자, 또는 혼합된 중합체) 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 이들 성분은 세포막, 세포벽, 리보솜, 중합효소, 혈청 성분 및 외래 게놈 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
단리된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, pOMI-PIIM 또는 pOMI-PI) 또는 폴리펩타이드는 바람직하게는, 분자의 본질적으로 균질한 조성물이지만 일부 이질 성분을 함유할 수 있다.
용어 "숙주 세포"는, 상기 세포에 의한 물질의 생산, 예를 들어, 상기 세포에 의한 유전자, 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 원형 플라스미드(예를 들어, pOMI-PIIM 또는 pOMI-PI) 또는 RNA 또는 단백질의 발현 또는 복제를 위해, 임의의 방식으로 선택, 변형, 형질감염, 형질전환, 성장 또는 사용 또는 조작되는 임의의 유기체의 임의의 세포를 포함한다. 예를 들어, 숙주 세포는 포유류 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균), 또는 기술된 발현 벡터를 유지하고 발현 벡터에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 촉진할 수 있는 임의의 단리된 세포일 수 있다.
pOMI-PIIM 또는 pOMI-PI와 같은 벡터는, 당업계에 공지된 많은 기술 중 임의의 것, 예를 들어 덱스트란-매개된 형질감염, 폴리브렌-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 칼슘 포스페이트 공침, 리포펙션, 핵으로의 벡터의 직접적인 미세주입, 또는 특정 숙주 세포 유형에 적합한 임의의 다른 수단에 따라 숙주로 도입될 수 있다.
"카세트(cassette)" 또는 "발현 카세트"는 벡터로 도입될 수 있는 발현 산물(예를 들어, 펩타이드 또는 RNA)을 암호화하는 DNA의 분절 또는 DNA 암호화 서열을 지칭한다. 상기 발현 카세트는 DNA 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 polyA 신호 및/또는 종결자 및/또는 프로모터를 포함할 수 있다.
일반적으로, "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 (예를 들어, 직접적으로 또는 다른 프로모터-결합된 단백질 또는 물질을 통해) 세포에서 RNA 중합효소에 결합하고 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은, 일반적으로, 3' 말단에서 전사 개시 부위에 의해 결합되고, 임의 수준으로 전사를 개시하는 데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류(5' 방향)로 연장된다. 프로모터는, 인핸서를 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 전사 개시 속도에 영향을 미치는 하나 이상의 추가적인 영역 또는 요소를 포함할 수 있다. 프로모터 서열 내에서, 전사 개시 부위뿐만 아니라 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 수 있다. 프로모터는 인핸서 및 억제자 서열을 비롯한 다른 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연관되거나 작동 가능하게 연결되거나 또는 발현될 핵산과 작동 가능하게 연관될 수 있다. 발현 조절 서열은, 프로모터로부터의 발현을 조절하는 경우, 상기 프로모터와 작동 가능하게 연관되거나 작동 가능하게 연결된다.
프로모터는 구성적으로 활성인 프로모터, 조건적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 세포 유형 특이적 프로모터일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 프로모터의 예는 예를 들어 WO 2013/176772에서 발견될 수 있다. 상기 프로모터는 CMV 프로모터, Igκ 프로모터, mPGK 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, α-액틴 프로모터, SRα 프로모터, 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복부(long terminal repeat; LTR) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter; Ad MLP), 라우스 육종 바이러스(rous sarcoma virus; RSV) 프로모터 및 EF1α 프로모터일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 CMV 프로모터는 CMV 즉시 초기 프로모터, 인간 CMV 프로모터, 마우스 CNV 프로모터 및 유인원 CMV 프로모터일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, pOMI-PIIM 또는 pOMI-PI에서의 유전자 발현에 사용되는 프로모터는 인간 CMV 즉시 초기 프로모터이다(Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985); Foecking et al., Gene 45:101-105 (1986)). 상기 hCMV 프로모터는 다양한 포유류 세포 유형에서 높은 수준의 발현을 제공한다.
암호화 서열은, 상기 서열이 상기 서열의 발현을 지시하거나 조절하는 경우, 세포에서 전사 및 번역 조절 서열의 "조절 하에 있거나", "기능적으로 연관되거나", "작동 가능하게 연결되거나" 또는 "작동 가능하게 연관"된다. 예를 들어, 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 RNA, 바람직하게는 mRNA로의 암호화 서열의 RNA 중합효소 매개된 전사를 지시하고, RNA는 이후 (이것이 인트론을 함유하는 경우) 스플라이싱되고, 선택적으로, 암호화 서열에 의해 암호화된 단백질로 번역될 수 있다. 유전자에 작동 가능하게 연결된 종결자/polyA 신호는 RNA로의 유전자의 전사를 종결시키고, RNA로의 polyA 신호의 부가를 지시한다.
용어 "발현하다" 및 "발현"은 유전자, RNA 또는 DNA 서열의 정보가 분명히 나타나도록 허용하거나 야기하는 것을 의미하며, 예를 들어, 상응하는 유전자의 전사 및 번역에 관여된 세포 기능을 활성화함으로써 단백질을 생성하는 것을 의미한다. "발현하다" 및 "발현"은 RNA로의 DNA의 전사 및 단백질로의 RNA의 번역을 포함한다. DNA 서열은 "발현 산물", 예를 들어 RNA(예를 들어, mRNA) 또는 단백질을 형성하도록 세포에서 또는 세포에 의해 발현된다. 발현 산물 자체 또한 세포에 의해 "발현된다"고 언급될 수 있다.
용어 "형질전환"은 핵산을 세포로 도입하는 것을 의미한다. 도입된 유전자 또는 서열은 "클론"으로 지칭될 수 있다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받아들이는 숙주 세포는 "형질전환"되었으며, "형질전환체" 또는 "클론"이다. 숙주 세포에 도입된 DNA 또는 RNA는 숙주 세포와 동일한 속 또는 종의 세포, 또는 상이한 속 또는 종의 세포를 비롯한 임의의 출처로부터 유래할 수 있다. 당업계에 널리 공지된 형질전환 방법의 예는 리포좀 전달, 전기천공, CaPO4 형질전환, DEAE-덱스트란 형질전환, 미세주입 및 바이러스 감염을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터가 본원에 개시된다. 용어 "벡터"는, 숙주를 형질전환시키고, 선택적으로, 도입된 서열의 발현 및/또는 복제를 촉진하기 위해, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포로 도입시킬 수 있는 비히클(예를 들어, 플라스미드)을 지칭할 수 있다.
기술된 폴리뉴클레오타이드는 특정 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 용어 "발현 시스템"은, 적합한 조건 하에서, 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입되는 단백질 또는 핵산을 발현할 수 있는 숙주 세포 및 양립할 수 있는 벡터를 의미한다. 일반적인 발현 시스템은 대장균 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 배큘로바이러스 벡터, 및 포유류 숙주 세포 및 벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, BAC, YAC 및 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스 및 아데노바이러스 관련 바이러스(AAV)를 포함한다.
용어 "면역자극 사이토카인" 또는 "면역자극 사이토카인들"은 면역 반응을 자극하는 능력을 갖는 면역에 관여하는 세포에 의해 자연적으로 분비되는 단백질을 지칭한다.
용어 "항원"은, 대상체 또는 유기체와 접촉하는 경우(예를 들어, 대상체 또는 유기체에 존재하거나 이에 의해 검출되는 경우), 상기 대상체 또는 유기체로부터 검출 가능한 면역 반응을 일으키는 물질을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. "항원 펩타이드"는, 대상체 또는 유기체에 존재하거나 이에 의해 검출되는 경우, 상기 대상체 또는 유기체에서 면역 반응의 증가를 유도하는 펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 이러한 "항원 펩타이드"는 숙주 세포 표면 상의 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자 상에 탑재 및 제시되며, 숙주의 면역 세포에 의해 인식 및 검출될 수 있어서, 해당 단백질에 대한 면역 반응의 증가를 초래하는 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 면역 반응은 동일한 단백질을 발현하는 질병 세포(예를 들어, 종양 또는 암 세포)와 같은 숙주 내의 다른 세포로 확장될 수도 있다.
본원에서, "공유 종양 항원을 함유하는 유전적 보조제"라는 문구는 표 1에 기술된 바와 같이 세포 표면 수용체에 결합하는 분자에 Ag를 유전적으로 융합함으로써 DNA에 의해 암호화된 Ag를 표적화하는 것을 지칭한다. 유전적 보조제의 추가 표적화 성분을 표 2에 제시하였다. 여기에 기술된 유전적 보조제는 특정 항원과 조합하여 사용되는 경우 항원-특이적 면역 반응을 가속화, 연장, 향상 또는 변형하는 역할을 할 수 있다.
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여, "서열 동일성" 또는 "동일성"은 지정된 비교 범위(comparison window)에 걸쳐 최대 일치를 위해 정렬되는 경우 동일한 상기 2개의 서열의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되어서 분자의 기능적 성질을 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환에 의해 차이가 있는 것으로 인정되고 있다. 서열이 보존적 치환에 있어 상이한 경우, 서열 동일성 백분율은 치환의 보존적 성질에 대해 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 차이가 있는 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 언급된다. 이러한 조정을 하기 위한 수단은 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이것은 보존적 치환을 완전 미스매치(mismatch)가 아닌 부분 미스매치로서 스코어링(scoring)하여, 서열 동일성 백분율을 증가시키는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에는 1의 점수가 주어지고 비보존적 치환에는 0의 점수가 주어지고, 보존적 치환에는 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존적 치환의 스코어링은, 예를 들어, 프로그램 PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California)에서 구현되는 바와 같이 계산된다.
"서열 동일성의 백분율"은 비교 범위에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열(완벽하게 매칭된 잔기의 최대 수)을 비교함으로써 측정된 값을 지칭하고, 여기서 비교 범위에서의 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 상기 2개의 서열의 최적의 정렬에 대한 기준 서열(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기들이 양 서열에 존재하는 위치의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 범위 내의 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 달리 명시되지 않는 한(예를 들어, 더 짧은 서열은 연결된 이종 서열을 포함함), 비교 범위는 비교되는 두 서열 중 더 짧은 서열의 전체 길이이다.
달리 언급되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 하기의 매개변수를 사용하여 GAP 버전 10을 사용하여 수득된 값을 지칭한다: 50의 GAP 중량 및 3의 길이 중량(Length Weight), 및 nwsgapdna.cmp 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 사용한 뉴클레오타이드 서열에 대한 동일성 % 및 유사성 %; 8의 GAP 중량 및 2의 길이 중량, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 사용한 아미노산 서열에 대한 동일성 % 및 유사성 %; 또는 이와 동등한 임의의 프로그램. "동등한 프로그램"은, 대상이 되는 임의의 2개의 서열에 대하여, GAP 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬과 비교할 때 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 매치 및 동일한 서열 동일성 백분율을 갖는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산을 유사한 크기, 전하, 또는 극성의 상이한 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 치환의 예는 이소류신, 발린, 또는 류신과 같은 비극성(소수성) 잔기로 다른 비극성 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 마찬가지로, 보존적 치환의 예는, 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 또는 글리신과 세린 사이의 치환과 같이 하나의 극성(친수성) 잔기로 다른 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 추가적으로, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기로 다른 잔기를 치환하는 것, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 산성 잔기로 다른 산성 잔기를 치환하는 것이 보존적 치환의 추가적인 예이다. 비보존적 치환의 예는, 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신과 같은 극성(친수성) 잔기를 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌과 같은 비극성(소수성) 아미노산 잔기로 치환하는 것 및/또는 비극성 잔기를 극성 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 전형적인 아미노산 분류를 하기에 요약하였다.
Figure pct00001
"상동(homologous)" 서열(예를 들어, 핵산 서열)은, 공지된 기준 서열과 동일하거나 실질적으로 유사하여, 상기 공지된 기준 서열과 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 지칭한다.
용어 "시험관내"는 인공 환경, 및 인공 환경(예를 들어, 시험관) 내에서 발생하는 공정 또는 반응을 지칭한다.
용어 "생체내"는 천연 환경(예를 들어, 세포 또는 유기체 또는 신체), 및 천연 환경 내에서 발생하는 공정 또는 반응을 지칭한다.
하나 이상의 언급된 요소를 "포함하는(comprising, including)" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함"하는 조성물은 상기 단백질을 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 함유할 수 있다.
값의 범위의 지정은 그 범위 내의 또는 그 범위를 한정하는 모든 정수, 및 그 범위 내의 정수에 의해 정의되는 모든 하위 범위를 포함한다.
문맥으로부터 달리 분명하지 않는 한, 용어 "약"은 언급된 값의 측정의 표준 오차 범위(예를 들어, SEM) 이내의 값 또는 명시된 값으로부터의 편차 ±0.5%, ±1%, ±5%, 또는 ±10% 이내의 값을 포함한다.
단수의 표현은, 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "항원" 또는 "적어도 하나의 항원"은 이들의 혼합물을 비롯한 복수의 항원을 포함할 수 있다.
II. 일반.
종양 미세환경에서 생체내 세포, 특히 종양 세포 또는 다른 세포, 예를 들어 면역 세포의 형질감염 후 복수의 단백질의 발현을 허용하는 발현 벡터가 기술된다.
효능 및 안전성을 향상시키도록 설계된 본원에 기술된 변형 중 일부 또는 전부를 함유하는 벡터가 제공된다. 상기 벡터의 최적화는 적절한 펩타이드를 암호화하는 서열의 혼입과 유전자 발현을 향상시키기 위한 부위의 조정을 포함한다. 펩타이드는, 예를 들어 글리코실화 및 인산화에서와 같은 번역 후 변형 여부 및 크기에 관계없이, 임의의 번역 산물로 이해된다.
발현될 유전자 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 번역 조절 요소, 예를 들어 P2A를 포함하는 발현 벡터가 기술된다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 전사 및 번역될 적어도 2개의 핵산 서열 또는 발현 카세트를 포함하고, 상기 번역 조절 요소는 번역될 서열 중 적어도 하나에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 전사 및 번역될 적어도 3개의 핵산 서열 또는 발현 카세트를 포함하고, 번역 조절 요소는 번역될 서열 중 적어도 2개에 작동적으로 연결된다. 벡터는 공지되어 있거나 당업자에 의해 구축될 수 있으며, 하기 본원의 실시예에 제시된 바와 같은 본원에 기술된 서열에 추가하여, 서열의 목적하는 전사를 달성하는 데 필요한 모든 발현 요소를 함유한다. 상기 벡터는 이의 용도에 따라 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서 사용하기 위한 요소를 함유한다. 당업자는 어떤 숙주 시스템이 특정 벡터와 양립할 수 있는지를 이해할 것이다.
재조합 유전자 발현은 적절한 유전자의 전사와 메시지의 효율적인 번역에 따라 결정된다. 이들 과정 중 하나를 올바르게 수행하지 못하면 특정 유전자가 발현되지 않거나 상기 유전자의 발현이 감소할 수 있다. 이는, 단일 플라스미드로부터 하나 초과의 유전자가 발현되는 것이 바람직한 경우 더욱 복잡하다. 전통적으로, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)가 발현될 유전자들 사이에 사용되었다. IRES는 크기로 인해 한계가 있으며 두 번째 유전자의 번역 효율이 첫 번째 유전자보다 훨씬 낮다. 최근 연구들은 피코르나바이러스 다단백질 2A("P2A") 펩타이드의 사용이 P2A 펩타이드를 플랭킹하는 복수의 단백질을 일대일 화학양론으로 발현시킨다는 것을 발견하였다(예를 들어 Kim et al (2011) PloS One 6:318556 참조). 재조합 DNA는 종종, 제한 효소 부위를 부가하거나 결실시키는 것과 같이, 제한 효소를 사용하여 클로닝을 용이하게 하도록 서열을 변경함으로써 제조된다. 이러한 변경된 서열은 핵산 서열 및 암호화된 단백질 서열을 변경할 수 있거나, 또는 이들은 암호화 단백질 서열을 변경하지 않으면서 뉴클레오타이드 서열을 변경할 수 있다. 전사체를 따라 희귀 또는 비정형 코돈이 존재하는 것은 비효율적인 번역을 일으키고 이종 단백질 생산 수준을 감소시킬 수 있다. 또한, 희귀 또는 비정형 코돈의 존재는 번역 정확도에도 영향을 미칠 수 있다. 특히 인간에서 사용하기 위한, 치료 약물로서 재조합 DNA가 사용되는 경우, 가능한 한 많은 천연 암호화 서열을 유지하는 것이 바람직하다. 본원에 기술된 발현 벡터는 제한 효소 클로닝 이외의 방법을 사용하여 제조되며, IL-12 p35 및 IL-12 p40에 대한 내인성 암호화 서열을 보유하며, 단일 폴리시스트론 계약으로부터의 2개의 단백질의 발현에 불필요한 임의의 추가 암호화 서열을 최소화한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 이종이량체 단백질, 예를 들어 IL-12(GenBank 참조 번호 NP_000873.2, NP_002178.2) 및 유전적 보조제, 예를 들어, 공유 종양 항원을 함유하는 FLT3 리간드 세포외 도메인(FLT3L, GenBank # XM_017026533.1), 예를 들어 FLT3L-NYESO1 융합 단백질을 포함하는 다양한 면역조절제의 발현을 위한 발현 벡터가 기술된다. 일부 구현예에서, 상기 발현 벡터는 생체내 전기천공을 통해 종양에 전달된다(종양내 전달).
Figure pct00002
Figure pct00003
추가적인 유전적 보조제가 또한 고려된다(표 2).
Figure pct00004
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 아미노산 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 아미노산 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 9의 아미노산 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 11의 아미노산 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 11의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99%의 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열은, 프로모터, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열은, 프로모터, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 7의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열은, 프로모터, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열은, 프로모터, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열은 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 실질적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 기술한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열과 70% 초과, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 실질적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 발명자들은 서열 번호 13의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 발현 벡터를 기술한다.
III. 장치 및 용도
일부 구현예에서, 기술된 발현 벡터는 종양내 유전자 전기 전달(gene electrotransfer)에 의해 전달된다. 기술된 발현 벡터는 충분한 농도의 여러 재조합적으로 발현된 면역조절 분자, 예를 들어 다량체 사이토카인 또는 다량체 사이토카인의 조합, 천연 또는 조작된 형태의 공동자극 분자, 공유 종양 항원을 함유하는 유전적 보조제 등을 생성하는 데 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터를 조직, 예를 들어 종양으로 전달하기 위해, 전기천공 장치가 사용될 수 있다.
본 구현예의 장치 및 방법은, 전기 치료를 연속적으로 및/또는 펄스로 몇 분의 1초 내지 수일, 수주 및/또는 수개월 범위의 기간 동안 종양에 전달함으로써, 암성 종양을 치료하기 위해 작동한다. 일부 구현예에서, 전기 치료는 직류 전기 치료이다.
본원에서, 용어 "전기천공"(즉, 세포막을 투과성으로 만드는 것)은 세포막의 구멍을 열기에 (예를 들어 의약품, 용액, 유전자 및 기타 제제와 같은 분자가 생존 세포로 확산되도록 하기에) 충분한 임의의 기간에 환자에게 전달되는 임의의 양의 쿨롱, 전압 및/또는 전류에 의해 유발될 수 있다.
조직에 전기 치료를 제공하면 일련의 생물학적 및 전기화학적 반응이 일어납니다. 충분히 높은 전압에서, 세포 구조와 세포 대사는 전기 치료의 적용에 의해 심각하게 방해받는다. 암 세포와 비암성 세포 모두 특정 수준의 전기 치료에서 파괴되지만, 종양 세포는 비암성 세포보다 미세환경의 변화에 더 민감한다. 대량 요소와 미량 요소의 분포가 전기 치료의 결과로 변경된다. 전기천공 근처에서의 세포의 파괴는 비가역적 전기천공으로 알려져 있다.
가역적 전기천공의 사용도 또한 고려된다. 가역적 전기천공은 전극에 인가된 전기가 표적 조직의 전계 임계값 미만일 때 발생한다. 인가된 전기가 세포의 임계값 미만이기 때문에, 세포는 인지질 이중층을 복구하고 이의 정상적인 세포 기능을 계속할 수 있다. 가역적 전기천공은 전형적으로, 약물이나 유전자 (또는 세포막에 보통 투과성이 아닌 다른 분자)가 세포로 도달되게 하는 것을 수반하는 치료에 의해 수행된다. (Garcia, et al. (2010) "Non-thermal irreversible electroporation for deep intracranial disorders". 2010 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology: 2743―6.)
단일 전극 구성에서, 전압은 암성 조직의 파괴를 시작하기 위해 리드 전극과 발생기 하우징 사이에 몇 분의 1초 내지 수시간 동안 인가될 수 있다. 특정 전압의 인가는 일련의 펄스일 수 있고, 각 펄스는 몇 분의 1초 내지 수분 동안 지속된다. 일부 구현예에서, 펄스 기간 또는 폭은 약 10 μs 내지 약 100 ms이다. 낮은 전압은 또한 몇 분의 1초 내지 수분의 기간 동안 인가될 수 있고, 이는 종양 부위로 백혈구를 끌어당길 수 있다. 이러한 방식으로, 세포 매개된 면역계는 죽은 종양 세포를 제거할 수 있고, 종양 세포에 대한 항체를 발달시킬 수 있다. 더욱이, 자극된 면역계는 경계(borderline) 종양 세포 및 전이를 공격할 수 있다.
숙주 종에 따라, 임의의 면역 반응을 증가시키기 위해, 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)(완전 및 불완전), 광물염, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트, 다양한 사이토카인, 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가 음이온, 펩타이드, 오일 에멀션, 및 잠재적으로 유용한 인간 보조제, 예를 들어 BCG(바실 칼멧-궤린(bacille Calmette-Guerin)) 및 코리네박테륨 파르붐(Corynebacterium parvum)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 보조제가 사용될 수 있다. 대안적으로, 면역 반응은 분자, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 오브알부민, 콜레라 독소 또는 이의 단편과의 조합 및 또는 커플링에 의해 증대될 수 있다.
Draghia-Akli 등의 미국 특허 제7,245,963호는 모듈식 전극 시스템 및 신체 또는 식물에서의 선택된 조직의 세포로의 생체분자의 도입을 용이하게 하기 위한 이의 용도를 기술한다. 상기 모듈식 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그램 가능한 정전류 펄스 제어기로부터 상기 복수의 바늘 전극으로 전도성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원 장치를 포함한다. 조작자는 지지체 구조에 탑재된 복수의 바늘 전극을 잡고, 신체 또는 식물의 선택된 조직으로 이들을 확고히 삽입할 수 있다. 이후, 생체분자는 선택된 조직으로 상기 피하 바늘을 통해 전달된다. 상기 프로그램 가능한 정전류 펄스 제어기가 활성화되고, 정전류 전기 펄스가 상기 복수의 바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 상기 복수의 전극 사이의 세포로의 생체분자의 도입을 용이하게 한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용은 원용에 의해 본원에 포함된다.
미국 특허 공보 제2005/0052630호는 신체 또는 식물에서의 선택된 조직의 세포로의 생체분자의 도입을 효과적으로 용이하게 하는 데 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기술한다. 상기 전기천공 장치는 조작이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 구체화되는 전기-역학적 장치(electro-kinetic device; "EKD 장치")를 포함한다. 상기 EKD 장치는 펄스 매개변수의 입력 및 사용자 제어에 기초하여 어레이에서의 전극 사이의 일련의 프로그램 가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 상기 전기천공 장치는 또한, 바늘 전극의 어레이를 갖는 대체 가능한 전극 디스크, 주사 바늘을 위한 중앙 주사 통로 및 제거 가능한 가이드 디스크를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 공보 제2005/0052630호(원용에 의해 본원에 포함됨) 참조).
미국 특허 제7,245,963호 및 미국 특허 공보 제2005/0052630호에 기술된 전극 어레이 및 방법은 조직, 예를 들어 근육뿐만 아니라, 다른 조직 또는 장기로의 깊은 침투에 적합하다. 상기 전극 어레이의 구성으로 인해, (선택된 생체분자를 전달하기 위한) 주사 바늘은 또한 표적 장기로 완전히 삽입되고, 상기 주사는 상기 전극에 의해 미리 그려진 영역에서 해당 표적에 수직으로 투여된다.
전기화학적 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy; "EIS")을 도입한 전기천공 장치가 또한 포함된다. 이러한 장치는 생체내, 특히 종양내, 전기천공 효율에 대한 실시간 정보를 제공하여, 조건의 최적화를 허용한다. EIS를 도입한 전기천공 장치의 예는 예를 들어 WO2016161201(원용에 의해 본원에 포함됨)에서 발견될 수 있다.
다른 대안적인 전기천공 기술이 또한 고려된다. 생체내 플라스미드 전달은 또한 저온 플라즈마를 이용하여 수행될 수 있다. 플라즈마는 4개의 기본적인, 물질의 상태 중 하나이고, 다른 것은 고체, 액체 및 기체이다. 플라즈마는 결합되지 않은 양의 입자 및 음의 입자의 전기적으로 중성인 매체이다(즉, 플라즈마의 전체 전하는 거의 0임). 플라즈마는 기체를 가열함으로써 또는 레이저 또는 마이크로파 발생기에 의해 인가된 강한 전자기장으로 이것을 처리함으로써 생성될 수 있다. 이것은 전자의 수를 감소시키거나 증가시켜서, 이온이라 불리는 양으로 또는 음으로 하전된 입자를 생성하고(Luo, et al. (1998) Phys. Plasma 5:2868-2870), 존재하는 경우 분자 결합의 해리가 동반된다.
저온 플라즈마(즉, 비열 플라즈마)는 적합한 전극으로의 펄스화된 높은 전압 신호의 전달에 의해 생성된다. 저온 플라즈마 장치는 가스 제트 장치 또는 유전체 장벽 방전(dielectric barrier discharge; DBD) 장치의 형태를 취할 수 있다. 저온 플라즈마는 상대적으로 낮은 기체 온도에서 플라즈마를 제공하기 때문에 많은 열의와 관심을 끌었다. 이러한 온도에서의 플라즈마의 제공은 상처 치유, 항균 공정, 다양한 다른 의학 요법 및 살균을 비롯한 다양한 응용 분야에서 흥미롭다. 이전에 기술된 바대로, 저온 플라즈마(즉, 비열 플라즈마)는 적합한 전극으로의 펄스화된 높은 전압 신호의 전달에 의해 생성된다. 저온 플라즈마 장치는 가스 제트 장치, 유전체 장벽 방전(DBD) 장치 또는 다중 주파수 고조파-풍부 전원 장치(multi-frequency harmonic-rich power supply)의 형태를 취할 수 있다.
유전체 장벽 방전 장치는 상이한 공정에 의존하여 저온 플라즈마를 생성한다. 유전체 장벽 방전(DBD) 장치는 유전층에 의해 피복된 적어도 하나의 전도성 전극을 함유한다. 전기 귀선 경로는 저온 플라즈마 처리를 거치는 표적 기질에 의해 제공될 수 있는 접지에 의해, 또는 전극용 내장 접지(in-built ground)를 제공함으로써 형성된다. 유전체 장벽 방전 장치를 위한 에너지는 고전압 전원 장치, 예를 들어 전술된 것에 의해 제공될 수 있다. 더 일반적으로, 에너지는 플라즈마 방전을 형성하도록 펄스화된 DC 전기 전압의 형태로 유전체 장벽 방전 장치로 유입된다. 유전층으로 의해, 방전은 전도성 전극으로부터 분리되고, 전극 에칭 및 기체 가열이 감소한다. 펄스화된 DC 전기 전압은 다양한 조작 체계를 달성하도록 진폭 및 주파수가 변할 수 있다. 저온 플라즈마 생성의 이러한 원칙을 도입한 임의의 장치(예를 들어, DBD 전극 장치)는 기술된 다양한 구현예들의 범위 내에 속한다.
저온 플라즈마는 외래 핵산으로 세포를 형질감염시키기 위해 사용되었다. 특히, 종양 세포의 형질감염(예를 들어, Connolly, et al. (2012) Human Vaccines & Immunotherapeutics 8:1729―1733; 및 Connolly et al (2015) Bioelectrochemistry 103: 15―21 참조).
상기 장치는 암 또는 다른 비암성(양성) 성장으로 고통받는 환자에서 사용하기 위해 고려된다. 이들 성장은, 병변, 용종, 신생물(예를 들어, 유두상 요로상피 신생물), 유두종, 악성 종양, 종양(예를 들어, 담관 종양, 간문부 종양, 비침습성 유두상 요로상피 종양, 생식 세포 종양, 유잉 종양, 아스킨 종양, 원시 신경외배엽 종양, 레이디히 세포 종양, 윌름스 종양, 세르톨리 세포 종양), 육종, 암종(예를 들어, 편평세포 암종, 총배설강 암종, 선암, 선편평 암종, 쓸개관암종, 간세포 암종, 침윤성 유두상 요로상피 암종, 편평 요로상피 암종), 덩어리, 또는 암성 또는 비암성 성장의 임의의 다른 유형 중 임의의 것으 나타날 수 있다. 본 구현예의 장치 및 방법에 의해 치료되는 종양은 비침습성, 침습성, 표재성, 유두상, 편평, 전이성, 국소화된, 단일중심성, 다중심성, 저등급 및 고등급 종양 중 임의의 것일 수 있다.
상기 장치는 다수의 유형의 악성 종양(즉, 암) 및 양성 종양에서 사용하도록 고려된다. 예를 들어, 본원에 기술된 장치 및 방법은, 부신 피질암, 항문암, 담도암(예를 들어, 간문부 암, 원위 담도암, 간내 담도암), 방광암, 양성 및 암성 골암(예를 들어, 골종, 유골 골종, 뼈모세포종, 뼈연골종, 혈관종, 연골점액유사 섬유종, 골육종, 연골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 골거대세포종, 척삭종, 림프종, 다발성 골수종), 뇌암 및 중추 신경계암(예를 들어, 수막종, 성상 세포종, 희돌기교종, 뇌실막세포종, 신경교종, 수모세포종, 신경절교종, 신경초종, 배아세포종, 두개인두종), 유방암(예를 들어, 유관 상피내 암종, 침윤성 유관 암종, 침윤성 소엽성 암종, 소엽성 상피내 암종, 여성형 유방, 삼중 음성 유방암(TNBC)), 캐슬만병(예를 들어, 거대 림프절 과형성, 혈관여포성 림프선 증식증), 자궁경부암, 결장직장암, 자궁내막암(예를 들어, 자궁내막 선암, 선극세포종, 유두성 장액성 선암, 투명 세포) 식도암, 담낭암(점액성 선암, 소세포 암종), 위장 카르시노이드 종양(예를 들어, 융모 암종, 파괴 융모막샘종), 호지킨병, 비호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종(CTCL), 카포시 육종, 신장암(예를 들어, 신장 세포 암), 간암(예를 들어, 혈관종, 간 선종, 국소 결절성 과증식, 간세포 암종), 폐암(예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암), 중피종, 형질세포종, 두경부의 편평세포 암종(비강암 및 부비동암(예를 들어, 감각신경모세포종, 정중선육아종), 침샘암, 비인두암, 신경모세포종, 후두암 및 하인두암, 구강암 및 구인두암을 포함하지만 이에 제한되지는 않음), 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체암, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종(예를 들어, 배아 횡문근육종, 폐포성 횡문근육종, 다형성 횡문근육종), 피부암, 흑색종 및 비흑색종 피부암 둘 모두(메르켈 세포 암종 포함), 위암, 고환암(예를 들어 정상피종, 비정상피종 생식 세포암), 흉선암, 갑상선암(예를 들어, 여포 암종, 역형성 암종, 저분화 암종, 갑상선 수질 암종, 갑상선 림프종), 질암, 외음부암 및 자궁암(예를 들어, 자궁 평활근육종)에서의 사용에 대해 고려된다.
IV. 종양내 전기천공 매개변수
전형적으로, 생체내 세포 전기천공, 특히 종양내 전기천공(IT-EP)에 필요한 전계는 일반적으로, 시험관내 세포에 필요한 전계와 크기가 유사하다. 일부 구현예에서, 상기 전계의 크기는 대략, 10 V/cm 내지 약 1500 V/cm, 약 200 V/cm 내지 1500 V/cm, 약 200 V/cm 내지 800 V/cm, 약 200 V/cm 내지 500 V/cm 범위이다. 일부 구현예에서, 전계 강도는 약 200 V/cm 내지 약 400 V/cm이다. 일부 구현예에서, 전계 강도는 약 400 V/cm이다.
펄스 길이 또는 주파수는 약 10 μs 내지 약 100 ms, 약 100 μs 내지 약 50 ms, 약 500 μs 내지 10 ms일 수 있다. 일부 구현예에서, 전계 강도는 약 400 V/cm이고 펄스 길이는 약 10 ms이다. 목적하는 수의 펄스가 있을 수 있으며, 전형적으로 초당 1 내지 100 펄스이다. 펄스 세트 사이의 간격은 임의의 목적하는 시간, 예를 들어 1초일 수 있다. 파형, 전계 강도 및 펄스 기간은 또한, 전기천공을 통해 세포에 진입되어야 하는 세포의 유형 및 분자의 유형에 따라 결정될 수 있다.
플라스미드 암호화된 면역자극 사이토카인은 전기천공에 의해 교번 주기(alternating cycle) 또는 각 주기의 적어도 1, 2 또는 3일 동안 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 각 주기의 1, 5 및 8일째에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 사이토카인은 매 홀수 주기의 1, 3 및 8일째에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 플라스미드가 P2A 번역 요소를 함유하는 경우, 상기 플라스미드 암호화된 사이토카인은 1일째에만 단일 치료로서 전달된다.
상기 면역자극 사이토카인을 암호화하는 P2A 함유 플라스미드는 약 1 μg 내지 100 μg, 약 10 μg 내지 약 50 μg, 약 10 μg 내지 약 25 μg으로 투여된다. 일부 구현예에서, 플라스미드의 양은 표적 종양 부피의 계산, 및 이 부피의 ¼의, 상기 P2A 함유 플라스미드의 0.5 mg/ml 용액을 투여함으로써 결정된다.
IV. 병용 요법
본 개시내용은 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 치료적 유효량의, 기술된 발현 벡터 중 하나 이상을 상기 대상체에게 투여하는 단계(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 기술된 발현 벡터는 전기천공과 조합하여 투여된다.
일부 구현예에서, 기술된 요법 중 임의의 것은 하나 이상의 추가(즉, 제2) 치료제 또는 치료와 조합된다. 상기 발현 벡터 및 추가 치료제는 단일 조성물로 투여되거나, 또는 이들은 개별적으로 투여될 수 있다. 추가 치료제의 비제한적인 예는 항암 약물, 항암 생물제제, 항체, 항-PD-1 억제제, 항-CTLA4 길항제 Ab, 종양 백신, 또는 당업계에 공지된 다른 요법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
면역조절 단백질을 암호화하는 DNA의 종양내 전기천공(IT-EP)은 다른 치료제와 함께 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 표 3은 가능한 조합을 제공한다. 상기 병용 요법의 투여는 전기천공 단독 또는 전기천공 및 전신 전달의 조합에 의해 달성될 수 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
기술된 발현 벡터 및/또는 조성물은 암의 치료적 치료를 위한 방법에 사용될 수 있다. 상기 암은 흑색종, 유방암, 삼중 음성 유방암, 메르켈 세포 암종, CTCL 및 두경부 편평세포 암종 또는 전술된 바와 같은 기타 암일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법은 전기천공에 의한 발현 벡터의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 기술된 발현 벡터 중 적어도 하나는 종양에서의 IL12 및 FLT3L-NY-ESO의 발현에 도움이 될, 대상체의 치료를 위한 약학적 조성물(즉, 약제)의 제조에 사용된다. 일부 구현예에서, 기술된 약학적 조성물은 대상체에서 암을 치료하기 위해 사용된다.
본원에서, 약학적 조성물 또는 약제는 약리학적 유효량의, 기술된 발현 벡터 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물 또는 약제는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제(부형제들)는, 안전성에 대해 적절하게 평가되었고 상기 약물 전달 시스템에 의도적으로 포함된, 활성 약학적 성분(Active Pharmaceutical ingredient(API, 치료제, 예를 들어, 발현 벡터)) 이외의 물질이다. 부형제는 의도된 투여량에서 치료적 효과를 발휘하지 않거나, 발휘하도록 의도되지 않는다. 부형제는 a) 제조 동안 약물 전달 시스템의 처리를 돕도록, b) API의 안정성, 생체이용률 또는 환자 용인성을 보호하거나 지지하거나 향상시키도록, c) 생성물 확인을 돕도록, 및/또는 d) 저장 또는 사용 동안 API의 전달의 전체 안전성, 유효성의 임의의 다른 속성을 향상시키도록 작용할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 불활성 물질일 수 있거나 아닐 수 있다.
부형제는 흡수 향상제, 항부착제, 소포제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 전달 향상제, 덱스트란, 덱스트로스, 희석제, 붕괴제, 유화제, 증량제, 충전제, 항료, 활택제, 보습제, 윤활제, 오일, 중합체, 보존제, 식염수, 염, 용매, 당, 현탁제, 지속 방출 매트릭스, 감미료, 증점제, 등장제, 비히클, 방수제 및 습윤제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
약학적 조성물은 약학적 조성물에서 흔히 발견되는 다른 추가 성분을 함유할 수 있다. 이러한 추가 성분은 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제(예를 들어 항히스타민제, 디펜히드라민 등)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 기술된 발현 벡터를 발현하거나 포함하는 세포가 "약학적 조성물"로서 사용될 수 있는 것이 구상된다. 본원에서, "약리학적 유효량", "치료적 유효량"또는 간단히 "유효량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하기 위한 발현 벡터의 양을 지칭한다.
일부 구현예에서, 기술된 발현 벡터는, 치료된 종양 병변에서의 평균 종양 부피를 감소시키기 위해, 치료되지 않은 대측성 종양 병변에서의 평균 종양 부피를 감소시키기 위해, 종양으로의 림프구 유입을 유도하기 위해, 종양-특이적 순환 CD8+ T 세포의 증가를 유도하기 위해, 종양에서의 림프구 및 단핵구 세포 표면 마커 발현을 증가시키기 위해, 및/또는 표 23 및 24의 INF-γ 관련 유전자 중 임의의 것의 mRNA 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-12의 종양내 발현은, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, IL-12의 종양내 발현은, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 1×, 적어도 2×, 적어도 3×, 적어도 3.6×, 적어도 4×, 또는 적어도 5×만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 치료된 종양 병변에서의 평균 종양 부피는, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 치료되지 않은 대측성 종양 병변에서의 평균 종양 부피는, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 종양으로의 림프구 유입은, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 종양으로의 림프구 유입은, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 1×, 적어도 2×, 적어도 3×, 적어도 4×, 또는 적어도 5×만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체에서의 종양-특이적 순환 CD8+ T 세포는, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체에서의 종양-특이적 순환 CD8+ T 세포는, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 1×, 적어도 2×, 적어도 3×, 적어도 4×, 또는 적어도 5×만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 종양에서의 림프구 및 단핵구 세포 표면 마커 발현은, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 종양에서의 림프구 및 단핵구 세포 표면 마커 발현은, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 1×, 적어도 2×, 적어도 3×, 적어도 4×, 또는 적어도 5×만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 종양에서의 표 23 및 24의 INF-γ 관련 유전자 중 임의의 것의 mRNA 수준은, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 종양에서의 표 23 및 24의 INF-γ 관련 유전자 중 임의의 것의 mRNA 수준은, 상기 발현 벡터를 투여받기 전의 대상체 또는 상기 발현 벡터를 투여받지 않은 대상체에 비해, 적어도 1×, 적어도 2×, 적어도 3×, 또는 적어도 5×만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 기술된 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터를 함유하는 조성물은 전기천공에 의해 종양 또는 종양 병변으로 전달될 수 있다. 일반적으로, 핵산 분자를 (시험관내로 또는 생체내로) 전달하는 것에 대해 당업계에서 인정된 임의의 적합한 전기천공 방법이, 기술된 발현 벡터와 함께 사용하기에 적합할 수 있다.
본원에 개시된 발현 벡터를 포함하는 기술된 발현 벡터 및 약학적 조성물은 키트, 용기, 팩 또는 디스펜서 내에 포장되거나 포함될 수 있다. 상기 발현 벡터 및 발현 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 사전 충전된 주사기 또는 바이알 내에 포장될 수 있다. 키트는 본원에 개시된 방법을 수행하는 데 사용되는 시약을 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에 개시된 조성물, 도구 또는 기구를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 기술된 발현 벡터 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 기술된 발현 벡터 중 하나 이상 및 전기천공 장치를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 기술된 발현 벡터 중 하나 이상 및 하나 이상의 전극 디스크, 바늘 전극 및 주사 바늘을 포함한다. 모델 키트가 하기에 기술되어 있지만, 다른 유용한 키트의 내용이 본 개시내용에 비추어 명백할 것이다.
상기 또는 아래에 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 기타 간행물, 수탁 번호 등은 각 개별 항목이 구체적으로 및 개별적으로 원용에 의해 그렇게 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 원용에 의해 본원에 포함된다. 상이한 버전들의 서열이 다양한 시점에서 특정 수탁 번호와 연관되는 경우, 본원의 유효 출원일에서의 수탁 번호와 연관된 버전을 의미한다. 유효 출원일은, 해당되는 경우 수탁 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 또는 실제 출원일 중 더 빠른 날짜를 의미한다. 마찬가지로 상이한 버전들의 간행물, 웹사이트 등이 다양한 시점에서 공개된 경우, 달리 지시되지 않는 한, 본원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 본원에 공개된 임의의 특징, 단계, 요소, 구현예, 또는 양태는 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 명확성과 이해의 목적을 위해 예시 및 실시예를 통해 상기 구현예들을 어느 정도 상세하게 기술하였지만, 첨부된 청구범위의 범위 내에서 특정 변경 및 변형이 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
구현예 목록
본원에 개시된 기술 요지는 하기의 구현예를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
1. 발현 벡터로서, 서열 번호 1의 핵산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
2. 발현 벡터로서, 서열 번호 9의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
3. 구현예 2에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
4. 구현예 2 또는 3에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
5. 구현예 4에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
6. 구현예 4 또는 5에 있어서, 상기 핵산이 P2A 번역 변형 요소를 암호화하는 핵산 및 적어도 하나의 항원에 융합된 FLT-3L 펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된, 발현 벡터.
7. 구현예 6에 있어서, 상기 항원이 NYESO-1, NY-ESO-1의 아미노산 80-180, Ny-ESO-1의 아미노산 157-165, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A10, SSX-2, MART-1, 티로시나아제, Gp100, 서바이빈, TERT, hTERT, WT1, PSMA, PRS pan-DR, B7-H6, HPV E7, HPV16 E6/E7, HPV11 E6, HPV6b/11 E7, HCV-NS3, 인플루엔자 HA, 인플루엔자 NA, 폴리오마바이러스 MCPyV LTA, 폴리오마바이러스 VP1, 폴리오마바이러스 LTA, 폴리오마바이러스 STA, OVA, RNEU, 멜란-A, LAGE-1, CEA 펩타이드 CAP-1, 및 HPV 백신 펩타이드 또는 이의 항원성 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 발현 벡터.
8. 구현예 7에 있어서, 상기 항원이 NYESO-1인, 발현 벡터.
9. 구현예 2 내지 구현예 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산이 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 발현 벡터.
10. 구현예 2 내지 구현예 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호 11의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
11. 구현예 10에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
12. 구현예 10 또는 11에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
13. 구현예 12에 있어서, 상기 핵산이 서열 번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
14. 구현예 12 또는 13에 있어서, 상기 핵산이 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 발현 벡터.
15. 구현예 14에 있어서, 상기 발현 벡터가 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
16. 구현예 15에 있어서, 상기 발현 벡터가 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
17. 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 종양내 전기천공 펄스를 사용하여, 구현예 1 내지 구현예 16 중 어느 하나의 발현 벡터를 종양으로 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
18. 구현예 17에 있어서, 상기 종양내 전기천공 펄스는 약 200 V/cm 내지 약 1500 V/cm의 전계 강도를 갖는, 방법.
19. 구현예 17 또는 18에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
20. 구현예 17 내지 구현예 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 종양은 흑색종, 삼중 음성 유방암, 메르켈 세포 암종, 피부 T-세포 림프종(CTCL) 및 두경부 편평세포 암종의 군으로부터 선택되는, 방법.
21. 구현예 17 내지 구현예 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 전기화학적 임피던스 분광법이 가능한 발생기에 의해 전달되는, 방법.
22. 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 하기를 포함하는 발현 벡터를 전달하는 적어도 하나의 저전압 종양내 전기천공(IT-EP) 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양을 치료하는 방법:
a. 서열 번호 1, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열;
b. 서열 번호 1, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열;
c. 서열 번호 9 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
d. 서열 번호 9 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
23. 구현예 22에 있어서, 상기 IT-EP 치료는 약 200 V/Cm 내지 약 500 V/cm의 전계 강도 및 약 100 μs 내지 약 50 ms의 펄스 길이를 포함하는, 방법.
24. 구현예 23에 있어서, 상기 치료는 하나의 IT-EP 치료이고 약 350 내지 450 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이를 포함하는, 방법.
25. 구현예 24에 있어서, 상기 치료는 하나의 IT-EP 치료이고 약 400 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이를 포함하는, 방법.
26. 구현예 17 내지 구현예 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료는 1 내지 10회의 10 ms 전기천공 펄스를 포함하는, 방법.
27. 구현예 26에 있어서, 상기 치료는 5 내지 10회의 10 ms 전기천공 펄스를 포함하는, 방법.
28. 구현예 27에 있어서, 상기 치료는 8회의 10 ms 전기천공 펄스를 포함하는, 방법.
29. 구현예 17 내지 구현예 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료가, IRES 모티프를 함유하는 IL-12 암호화 플라스미드를 사용한 저전압 IT-EP 치료와 비교하여, 하기 중 하나 이상 또는 모두를 유발하는, 방법:
a. 적어도 3.6배 더 높은, IL-12의 종양내 발현;
b. 치료된 종양 병변에서의 더 낮은 평균 종양 부피;
c. 치료되지 않은 대측성 종양 병변에서의 더 낮은 평균 종양 부피;
d. 종양으로의 림프구의 더 높은 유입;
e. 종양-특이적 순환 CD8+ T 세포의 증가;
f. 종양에서의 림프구 및 단핵구 세포 표면 마커 발현의 증가; 및
g. 표 23 및 24의 INF-g 관련 유전자의 mRNA 수준의 증가.
30. 구현예 1 내지 구현예 16 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 것이며, 치료가 적어도 하나의 종양내 전기천공 펄스를 사용하여 상기 발현 벡터를 종양으로 전달하는 단계를 포함하는, 발현 벡터.
31. 구현예 30에 있어서, 상기 종양내 전기천공 펄스가 적어도 하나의 저전압 종양내 전기천공(IT-EP) 치료를 포함하는, 발현 벡터.
32. 구현예 31에 있어서, 상기 IT-EP 치료는 200 V/cm 내지 500 V/cm의 전계 강도 및 약 100 μs 내지 약 50 ms의 펄스 길이를 포함하는, 발현 벡터.
33. 구현예 32에 있어서, 상기 치료는 하나의 IT-EP 치료이고 350 내지 450 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이를 포함하는, 발현 벡터.
34. 구현예 33에 있어서, 상기 치료는 하나의 IT-EP 치료이고 약 400 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이를 포함하는, 발현 벡터.
35. 구현예 30 내지 구현예 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료는 1 내지 10회의 10 ms 전기천공 펄스를 포함하는, 발현 벡터.
36. 구현예 35에 있어서, 상기 치료는 5 내지 10회의 10 ms 전기천공 펄스를 포함하는, 발현 벡터.
37. 구현예 36에 있어서, 상기 치료는 8회의 10 ms 전기천공 펄스를 포함하는, 발현 벡터.
38. 발현 플라스미드로서, 하기 화학식에 의해 정의된 복수의 발현 카세트를 포함하는, 발현 플라스미드:
P - A - T - A' - T - B
(여기서,
a) P는 인간 CMV 프로모터이고;
b) A 및 A'는 각각 인터류킨-12(IL-12) p35 및 IL-12 p40이고;
c) B는 표 1로부터의 적어도 하나의 항원에 융합된 FLT-3L이고;
d) T는 P2A 번역 변형 요소임).
39. 구현예 38에 있어서, 상기 발현 플라스미드는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 발현 플라스미드.
40. 구현예 39 또는 40에 있어서, 상기 발현 플라스미드는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 발현 플라스미드.
41. 구현예 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 플라스미드는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 플라스미드.
42. 구현예 38 내지 구현예 39 내지 어느 하나에 있어서, 상기 항원이 NYESO-1, NY-ESO-1의 아미노산 80-180, Ny-ESO-1의 아미노산 157-165, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A10, SSX-2, MART-1, 티로시나아제, Gp100, 서바이빈, TERT, hTERT, WT1, PSMA, PRS pan-DR, B7-H6, HPV E7, HPV16 E6/E7, HPV11 E6, HPV6b/11 E7, HCV-NS3, 인플루엔자 HA, 인플루엔자 NA, 폴리오마바이러스 MCPyV LTA, 폴리오마바이러스 VP1, 폴리오마바이러스 LTA, 폴리오마바이러스 STA, OVA, RNEU, 멜란-A, LAGE-1, CEA 펩타이드 CAP-1, 및 HPV 백신 펩타이드 또는 이의 항원성 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 발현 벡터.
43. 구현예 42에 있어서, 상기 항원이 NYESO-1인, 발현 벡터.
44. 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 적어도 하나의 종양내 전기천공 펄스를 사용하여, 구현예 38 내지 구현예 43 중 어느 하나의 발현 벡터를 종양으로 전달하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
45. 구현예 44에 있어서, 상기 종양내 전기천공 펄스는 약 200 V/cm 내지 1500 V/cm의 전계 강도를 갖는, 방법.
46. 구현예 44 또는 45에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
47. 구현예 44 내지 구현예 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 종양은 흑색종, 삼중 음성 유방암, 메르켈 세포 암종, CTCL 및 두경부 편평세포 암종의 군으로부터 선택되는, 방법.
48. 구현예 44 내지 구현예 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 전기화학적 임피던스 분광법이 가능한 발생기에 의해 전달되는, 방법.
49. 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 인터류킨-12(IL-12)를 암호화하는 발현 벡터를 전달하는 적어도 하나의 저전압 종양내 전기천공(IT-EP) 치료를 포함하고, 상기 플라스미드가 P2A 엑손 스키핑 모티프(exon skipping motif)를 함유하는, 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
50. 구현예 49에 있어서, 상기 IT-EP 치료는 200 V/Cm 내지 500 V/cm의 전계 강도 및 약 100 μs 내지 약 50 ms의 펄스 길이를 포함하는, 방법.
51. 구현예 50에 있어서, 상기 치료는 하나의 IT-EP 치료이고 적어도 400 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이를 포함하는, 방법.
52. 구현예 49 내지 구현예 51 중 어느 하나에 있어서, P2A를 함유하는 IL-12 암호화된 플라스미드의 IT-EP 치료가, IRES 모티프를 함유하는 IL-12 암호화된 플라스미드와 비교하여, 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법:
a) 적어도 3.6배 더 높은, IL-12의 종양내 발현;
b) 치료된 종양 병변에서의 더 낮은 평균 종양 부피;
c) 치료되지 않은 대측성 종양 병변에서의 더 낮은 평균 종양 부피;
d) 종양으로의 림프구의 더 높은 유입;
e) 종양-특이적 순환 CD8+ T 세포의 증가;
f) 종양에서의 림프구 및 단핵구 세포 표면 마커 발현의 증가; 및
g) 표 23 및 24의 INF-g 관련 유전자의 mRNA 수준의 증가.
53. 발현 플라스미드로서, CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 IL12 p35-P2A-IL12p40를 위한 암호화 서열을 포함하고, IL12 p35-P2A가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 발현 플라스미드.
54. 구현예 53에 있어서, 상기 플라스미드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 추가로 암호화하는, 발현 플라스미드.
55. 구현예 54에 있어서, 상기 플라스미드는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 추가로 암호화하는, 발현 플라스미드.
56. 구현예 53에 있어서, 상기 플라스미드는 서열 번호 9의 아미노산 서열을 암호화하는, 발현 플라스미드.
57. 구현예 53에 있어서, 상기 플라스미드는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 암호화하는, 발현 플라스미드.
58. 구현예 44에 있어서, 상기 발현 플라스미드를 전달하는 단계는 1차 미성숙 인간 수지상 세포의 성숙을 유발하는, 방법.
59. 발현 벡터로서, 서열 번호 13의 핵산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
60. 구현예 59에 있어서, 상기 발현 벡터가 서열 번호 13의 핵산 서열로 구성된, 발현 벡터.
61. 발현 벡터로서, 서열 번호 9의 아미노산 서열로 구성된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
62. 구현예 61에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
63. 구현예 61에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 70%, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
64. 구현예 61 내지 구현예 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 서열이 프로모터에 작동적으로 연결된, 발현 벡터.
65. 구현예 64에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터, Igκ 프로모터, mPGK 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, α-액틴 프로모터, SRα 프로모터, 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복부(long terminal repeat; LTR) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter; Ad MLP), 라우스 육종 바이러스(rous sarcoma virus; RSV) 프로모터 및 EF1α 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 발현 벡터.
66. 구현예 65에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터인, 발현 벡터.
67. 구현예 66에 있어서, 상기 발현 벡터가 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
68. 약학적 조성물로서, 치료적 유효 투여량의, 구현예 58 내지 구현예 67 중 어느 하나의 발현 벡터를 포함하는, 약학적 조성물.
69. 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 구현예 68의 약학적 조성물을 종양으로 주입하는 단계 및 적어도 하나의 전기천공 펄스를 종양에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
70. 구현예 69에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 약 200 V/cm 내지 약 1500 V/cm의 전계 강도를 갖는, 방법.
71. 구현예 70에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 약 100 μs 내지 약 50 ms의 펄스 길이를 갖는, 방법.
72. 구현예 71에 있어서, 적어도 하나의 전기천공 펄스를 투여하는 단계는 1 내지 10회의 펄스를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
73. 구현예 72에 있어서, 적어도 하나의 전기천공 펄스를 투여하는 단계는 6 내지 8회의 펄스를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
74. 구현예 70에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 200 V/Cm 내지 500 V/cm의 전계 강도 및 100 μs 내지 50 ms의 펄스 길이를 갖는, 방법.
75. 구현예 74에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 약 350 내지 450 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이를 갖는, 방법.
76. 구현예 69에 있어서, 적어도 하나의 전기천공 펄스를 종양에 투여하는 단계가 약 400 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이를 갖는 8회의 전기천공 펄스를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
77. 구현예 69 내지 구현예 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 전기화학적 임피던스 분광법이 가능한 발생기에 의해 전달되는, 방법.
78. 구현예 69 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
79. 구현예 69 내지 구현예 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 종양은 흑색종, 유방암, 삼중 음성 유방암, 메르켈 세포 암종, 피부 T-세포 림프종(CTCL) 및 두경부 편평세포 암종의 군으로부터 선택되는, 방법.
80. 구현예 68에 있어서, 대상체에서 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 약학적 조성물.
81. 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서의, 구현예 68의 약학적 조성물의 용도.
82. 구현예 68에 있어서, 상기 약학적 조성물이, 적어도 하나의 전기천공 펄스의 투여에 의한 종양으로의 주입 및 종양으로의 전달을 위해 제형화된, 약학적 조성물.
서열 식별자
Figure pct00007
이제 하기의 비제한적인 실시예를 사용하여 상기에 제공된 구현예 및 항목을 설명한다.
실시예
I. 일반적인 방법.
분자 생물학의 표준 방법이 기술된다. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook 및 Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif. Standard methods also appear in Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley 및 Sons, Inc. New York, N.Y.(이는 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이 유발(Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝(Vol. 2), 당 접합체 및 단백질 발현(Vol. 3) 및 생물 정보학(Vol. 4)을 기술함).
면역침전, 크로마토그래피, 전기 영동, 원심분리 및 결정화를 비롯한 단백질 정제 방법이 기술된다. Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York. 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질의 생산 및 단백질의 글리코실화가 기술된다. Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391 또한 참조. 다클론 및 단클론 항체의 생산, 정제 및 단편화가 기술된다. Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane (상기와 같음). 리간드/수용체 상호 작용을 특성화하기 위한 표준 기술이 사용 가능하다. 예를 들어, Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York 참조.
형광 활성화 세포 분류 검출 시스템(FACS®)을 포함한 유세포 분석 방법이 사용 가능하다. 예를 들어, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J. Fluorescent reagents suitable for modifying nucleic acids, including nucleic acid primers and probes, polypeptides, and antibodies, for use, e.g., as diagnostic reagents가 사용 가능하다. Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, Mo.
면역계의 조직학의 표준 방법이 기술된다. 예를 들어, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, N.Y.; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, Pa.; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, N.Y. 참조.
예를 들어, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 접힘, 기능 도메인, 글리코실화 부위 및 서열 정렬을 측정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 사용 가능하다. 예를 들어, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, Md.); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, Calif.); DECYPHER® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nev.); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 참조.
II. pOMIP2A로의 인간 IL-12 p35 및 p40 서브유닛의 서브클로닝.
pUMVC3 백본은 Aldevron(Fargo, ND)으로부터 구입하였다. hIL12p40에 프레임 내(in-frame) 연결된 번역 조절 유전 요소 P2A(P2A-hIL12p40)를 암호화하는 1071 bp DNA 단편(유전자 블록)을 IDT(Coralville, IA)로부터 구입하였다. Phusion 중합효소(NEB, Ipswich MA, 카탈로그 번호 M0530S)를 사용하여 p40 유전자 블록을 PCR 증폭시키고, 표준 제한 효소 짝짓기 및 T4 DNA 리가아제(Life Technologies, Grand Island NY, 카탈로그 번호 15224-017)를 사용하여 CMV 프로모터/인핸서의 하류에서 pUMVC3으로 결찰시켰다. 제한 효소 분해를 통해 P2A-hIL12p40/pOMIP2A의 양성 클론을 확인하고, DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
인간 p35는 클로닝을 용이하게 하기 위해 내부 BamH1, BglII 및 Xba1 부위가 제거된 상태로 IDT(Coralville IA)로부터 789 bp 유전자 블록으로 주문되었다. 전술된 바와 같이 p35 유전자 블록을 PCR 증폭시키고, P2A-hIL12p40/pOMIP2A에서 p40 유전자 블록의 하류에 결찰시켰다. 제한 효소 분해를 통해 hIL12p35-P2A-p40/pOMIP2A의 양성 클론을 확인하고, DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
생체내 이미징 및 생체외 유세포 분석을 위한 리포터 유전자를 함유하는 유사한 구조체를 제조하였다. pOMI-Luc2p-P2A-mCherry의 생성을 위해, pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](Promega)로부터 Luc2P를 PCR 증폭시켰고 유전자 블록 단편(IDT)으로부터 mCherry를 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편을 정제하고, 분해시키고, pUMVC3에 결찰시켰다. 제한 효소 분해를 통해 양성 클론을 확인하고, DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
III. FLT3L-항원 융합 단백질 구조체의 생성
FMS-유사 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3L)는 T 세포에 대한 우선적 제시를 위한 항원-제시 세포(APC)로 항원을 유도하는 것으로 입증되었다(Kim et al. Nat Comm. 2014, Kreiter et al., Cancer Res. 2011, 71:6132). 가용성의 분비된 형태의 FLT3L은 다양한 단백질 또는 펩타이드 항원에 융합된다(표 1; Kim et al. Nat Comm. 2014).
FLT3L-NY-ESO-1 융합 단백질 구조체를 생성하기위한 예시 프로토콜이 제공된다. 3개의 유전자 블록을 IDT로부터 구입하였고, 이들은 각각 Igκ 신호 펩타이드 서열, 이어서 FLT3L의 ECD, 짧은 힌지 영역 및 NY-ESO-1 항원의 3개의 상이한 분절을 함유하였다. PCR을 이용하여 플랭킹 제한 부위를 부가하고, 이들 3개의 융합 단백질 구조체를 pUMVC3에 도입하였다. FLT3L은 또한, 마우스에서의 전임상 연구를 위해 오브알부민 유전자로부터의 SIINFEKL 펩타이드 항원을 함유하는 3개의 펩타이드의 연쇄체(concatamer)로 융합되었다. pUMVC3으로부터, 이들 융합 구조체를 pOMIP2A로 도입하였다(하기에 기술됨).
동일한 방법을 사용하여 공유 종양 또는 바이러스 항원을 사용한 대안적인 융합 단백질(표 1)을 구축한다.
확인된 공유 종양 항원 이외에, 환자 특이적 신생항원이 확인될 수 있고, 해당 환자에게 맞춤된 면역원성 펩타이드 항원은 종양내 전기천공을 통한 개별화된 치료를 위해 FLT3L에 융합될 수 있다(예를 들어, Beckhove et al., J. Clin. Invest. 2010, 120:2230 참조).
마우스 상동체 서열을 이용하여 모든 면역조절 단백질의 버전들을 동시에 구축하고, 전임상 연구에 사용한다.
IV. 단일 전사체로부터의 3개의 단백질의 발현을 위한 pOMI-2xP2A의 생성.
IL-12 이종이량체 사이토카인 및 FLT3L-NY-ESO-1에 대한 예시적인 서브클로닝 프로토콜이 제공된다. FLT3L-NYESO-1을 암호화하는 DNA 유전자 블록(IDT)을 상류 P2A 부위 및 플랭킹 제한 부위로 PCR 증폭시키고, hIL-12p40의 하류에 결찰시켰다. Quikchange 돌연변이 유발(Agilent, Santa Clara, USA)을 수행하여 p40의 종결 부위 3'를 결실시켰다. 제한 효소 분해를 통해 양성 클론을 확인하고, DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
동일한 방법을 이용하여, 폴리시스트론 메시지에 이미 존재하는 3개의 유전자의 상류 또는 하류에 제4 유전자를 부가할 수 있다.
V. pOMI-PIIM의 생성
pOMI-PIIM 플라스미드의 개략도를 도 1에 도시하였다. OMI-PIIM은 온코섹 메디컬 인코퍼레이티드 - 폴리시스트론 IL-12 면역 조절제(OncoSec Medical Incorporated - Polycistronic IL-12 Immune Modulator)의 약자이다. 3개의 유전자 모두 동일한 프로모터로부터 발현되며, 개재 엑손 스키핑 모티프는 3개의 단백질 모두가 단일 폴리시스트론 메시지로부터 발현되게 하도록 한다.
Kpn1 제한 효소 분해에 의해 벡터 pUMVC3을 선형화하였다. 3' 부분 P2A 서열 및 선형화된 pUMVC3의 5' 서열과 매칭하는 24 bp 중첩과 함께 임상 hIL12-IRES/pUMVC3 플라스미드 Aldevron(Fargo, ND)으로부터 PCR에 의해 hIL12p35를 증폭시켰다. 선형화된 pUMVC3와의 3' 24 bp 중첩 및 5' P2A 서열과 함께 hIL12-2A/pUMVC3 플라스미드(전술됨)로부터 PCR에 의해 hIL12p40을 증폭시켰다. p35-P2A(부분) 및 P2A-p40 PCR 산물 사이의 서열 중첩은 14 bp였다. 제조업체의 권장 사항(New England Biolabs E2611S/L)에 따라 상기 세 조각의 깁슨 어셈블리(Gibson assembly)를 수행하였으며, 제한 효소 분해에 의해 hIL12-2A-심리스(seamless)/pUMVC3의 양성 클론을 스크리닝하였고, DNA 서열분석으로 검증하였다. pOMI-PIIM 발현 플라스미드는 이전 플라스미드(pOMIP2A, 실시예 II 참조)에 존재하는 IL-12 p35 암호화 서열에 비해, IL-12 p35 암호화 서열에서의 5개의 침묵 코돈 변경을 포함한다. IL-12 p35 암호화 서열의 클로닝을 용이하게 하기 위해 pOMIP2A에서 5개의 침묵 점 돌연변이를 생성하였다. 이들 5개의 점 돌연변이는 내인성 IL-12 p35 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 제한 효소 부위를 결실시켰다. 이들 돌연변이를 갖지 않는 hIL-12 발현 벡터를 생성하기 위해, 깁슨 어셈블리 클로닝 방법을 사용하였다. 깁슨 클로닝 방법을 사용하면, 제한 부위를 결실시킬 필요가 없어서, 내인성 IL-12 p35 암호화 서열을 사용하여 폴리시스트론 hIL-12 발현 벡터를 제조할 수 있었다. 내인성 서열을 사용하면, 클로닝 목적으로 생성된 최적화되지 않은 코돈 대신에 최적화된 내인성 코돈을 사용함으로써, 인간 대상체에서 IL-12 p35 및 하류 IL-12 p40 서열의 발현이 개선될 수 있다. 깁슨 어셈블리는 추가로, PT2 요소를 플랭킹하는 NotI 및 BamHI 제한 효소 부위를 부가하지 않으면서 pOMI-PIIM 발현 플라스미드를 제조하는 것을 가능하게 하였다. NotI 및 BamHI 부위는 P2A 암호화 영역 전후에 각각 GCGGCCGCA(GCGGCCGC 인식 부위) 및 GGATCC 서열을 부가하였다. GCGGCCGCA 서열은 IL-12 p35 및 IL-12 p40 단백질의 C-말단 단부에 Ala-Ala-Ala 트리펩타이드를 부가했고, GGATCC 서열은 pOMIP2A 플라스미드로부터 발현된 Flt3-L 단백질 및 IL-12 p40의 N-말단 신호 서열에 Gly-Ser 디펩타이드를 부가하였다. 이들 서열은 일반적으로 IL12 p35, IL12 p40 또는 Flt3 리간드에 존재하지 않으며, 생체내에서, 발현된 IL-12 p35, IL-12 p40 또는 Flt3-L 단백질의 발현, 접힘, 활성 또는 분비를 변경할 수 있다. 상기 추가 아미노산은 발현된 단백질에 대한 면역 반응을 일으킬 수도 있다. 깁슨 어셈블리 클로닝을 사용하여 침묵 핵산 서열 돌연변이 또는 상기 추가 아미노산(이의 기능은 알려지지 않았으며 이의 존재는 불필요하고 잠재적으로 억제성임)을 함유하지 않는 발현 벡터를 생성하였다. 그 후, 이 구조체를 Not1로 분해하여 hIL12p40 종결 부위의 3'을 선형화하였다. hIL12 내지 hFLT3L-NYESO1을 주형으로 사용하여(전술됨), hIL12p40(종결 부위를 결실시킴)의 말단과의 5' 28 bp 중첩 및 선형화된 pUMVC3와의 3' 28 bp 중첩과 함께 PCR에 의해 P2A-FLT3L-NYESO(80-180aa)를 증폭시켰다. 제조업체의 권장 사항에 따라 깁슨 어셈블리(New England Biolabs E2611S/L)를 수행하였으며, 제한 효소 분해에 의해 hIL12 내지 hFLT3L-NYESO(80-180aa)-심리스/pUMVC3의 양성 클론을 스크리닝하였고 DNA 서열분석으로 검증하였다(pOMI-PIIM, 서열 번호 1).
기능적 연구를 위한 대조군으로서 FLT3 수용체에 결합하지 않는 돌연변이 형태의 FLT3L을 생성하였다(Graddis et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:17626). Quikchange 돌연변이 유발(Agilent, Santa Clara, USA)을 사용하여 Graddis(상기와 같음)에 기술된 점 돌연변이 및 주형으로서의 pOMI-PIIM을 생성하였다.
동시에, 전임상 연구를 위해 마우스 IL-12로 pOMI-PIIM의 버전을 구축하였다.
VIIa. pOMI-PI의 생성.
폴리시스트론 벡터 상에서 hIL-12 p35 및 hIL12-p40을 암호화하는 pOMI-PI는, 제2 PT2 요소 및 hFLT3L-NYESO1 암호화 서열 대신에 IL-12 p40 암호화 서열 바로 뒤에 종결 코돈이 삽입된 것을 제외하고는 pOMI-PIIM과 유사한 방식으로 제조되었다. 따라서 pOMI-PI 발현 벡터는 내인성 hIL-12 p35 암호화 서열, P2A 요소 암호화 서열 및 내인성 hIL-12 p40 암호화 서열을 함유한다. hIL-12 p35, P2A 요소, hIL-12 p40 암호화 서열은 단일 프로모터로부터 전사된다. pOMI-PI는 PTA 요소 전후에 pOMIP2A에 존재하는 GCGGCCGCA 및 GGATCC 서열을 함유하지 않으며, 따라서, 번역된 IL-12 p35 단백질의 C-말단 단부에 Ala-Ala-Ala 트리펩타이드를 부가하거나 번역된 IL-12 p40의 N-말단 신호 서열에 Gly-Ser 디펩타이드를 부가하지 않는다. ELISA 분석은, 시험관내에서 HEK293 세포에서 hIL-12 p70이 pOMI-PI 발현 벡터로부터 효율적으로 발현되었음을 입증하였다(도 6 참조).
VI. ELISA
제조업체의 권장 사항에 따라 TransIT LT-1(Mirus, Madison WI, 카탈로그 번호 MIR 2300)을 사용하여 pUMVC3-IL12(Aldevron, Fargo, ND) 및 pOMI-IL12P2A를 HEK293 세포로 형질감염시켰다. 2일 후, 상청액을 수집하고, 3000 rpm에서 5분 동안 회전시켜 임의의 세포 파편을 제거하였다. 깨끗해진 상청액을 분취하고 -86℃에서 동결시켰다. 상기 복합체들을 특이적으로 검출하는 ELISA(R&D Systems, Minneapolis MN 카탈로그 번호 DY1270)를 사용하여, 조절 배지에서의 hIL-12p70 이종이량체 단백질의 수준을 정량화하였다.
Figure pct00008
pOMI-IL12P2A는 특정 양의 형질감염된 플라스미드에 대한 배양 상청액에서 pUMVC3-IL12가 생성한 것보다 3.6배 더 많은 인간 IL12p70 분비된 단백질을 생성하였다.
제조업체의 권장 사항에 따라 TransIT LT-1(Mirus, Madison WI, 카탈로그 번호 MIR 2300)을 사용하여 pOMI-PIIM의 클론을 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 2일 후, 상청액을 수집하고, 3000 rpm에서 5분 동안 회전시켜 임의의 세포 파편을 제거하였다. 깨끗해진 상청액을 새로운 튜브로 옮기고 분취하여 -86℃에서 동결시켰다. 상기 복합체들을 특이적으로 검출하는 ELISA(R&D Systems, Minneapolis MN 카탈로그 번호 DY1270)를 사용하여, 조절 배지에서의 hIL-12p70 이종이량체 단백질의 수준을 정량화하였다. 항-FLT3L 항체(R&D Systems, Minneapolis MN 카탈로그 번호 DY308)를 사용하여 ELISA에 의해 FLT3L-NYESO-1 융합 단백질의 수준을 정량화하였다.
pOMI-PIIM으로 형질감염된 세포로부터 현저한 수준의 p70 IL-12 및 FLT3L 융합 단백질이 생성되었다(표 5).
Figure pct00009
VII. 시험관내 기능 분석.
pOMI-IL12P2A 및 pOMI-PIIM을 발현하는 세포로부터의 조직 배양 상청액에 대해, HEK-Blue 세포를 사용하여 기능성 IL-12 p70의 발현을 시험하였다. 이들 세포는 인간 IL-12 수용체와 STAT4-유도된 분비된 형태의 알칼리 포스파타아제를 발현하도록 조작된다.
이 리포터 분석은 제조업체 프로토콜(HEK-Blue IL-12 세포, InvivoGen 카탈로그 번호 hkb-il12)에 따라 수행되었다. 분비된 알칼리 포스파타아제(SEAP)의 발현은 제조업체의 프로토콜(Quanti-Blue, InvivoGen 카탈로그 번호 rep-qbl)에 따라 측정되었다.
동일한 양의 인간 pOMI-IL12P2A 또는 pUMVC3-IL12(Aldevron)로 형질감염된 HEK293 세포로부터의 배양 상청액의 상이한 희석물들을 이 분석에서 비교하였다. 평균 EC50은 pOMI-IL12P2A 샘플에서 >2배 더 낮았다(n=3, 맨-휘트니(Mann-Whitney); ** p < 0.01). 이 데이터는, 특정 투여량의 플라스미드에 대해, pOMI-IL12P2A는 pUMVC3-IL12보다 더 많은 기능성 인간 IL-12p70 단백질의 생산을 유발했음을 보여준다.
pOMI-PIIM 폴리시스트론 벡터로부터 발현되고 분비된 IL-12 p70 단백질은 또한 SEAP 단백질의 유도에 있어 강한 활성을 나타냈다(도 2). 이 활성은 rhIL-12 단백질 대조군과 유사했으며 중화 IL-12 항체(R&D systems; AB-219-NA)에 의해 차단되었다(도 2).
pOMIP2A 벡터로부터 발현되고 HEK 293 세포의 배양 배지로 분비된 인간 FLT3L 및 FLT3L-NYESO1 융합 단백질에 대해, 표면 THP-1 단핵구 세포 상에 발현된 FLT3 수용체에 대한 결합을 시험하였다.
Mirus TransIT LT-1을 사용하여 pOMIP2A-hFLT3L 또는 pOMIP2A-hFLT3L-NYESO1(80-180aa)로 HEK 세포를 형질감염시켰다. 72시간 후에 상청액을 수집하였다. hFLT3L ELISA(R&D Systems 카탈로그 번호 DY308)를 사용하여, 분비된 FLT3L 단백질의 양을 정량화하였다.
RPMI + 10% FBS + 1% P/S(ATCC, 카탈로그 번호TIB-202)에서 THP-1 단핵구 세포주를 배양하였다. 각 실험에서, 750,000개의 THP-1 세포를 Fc 완충액(PBS + 5% 여과된 FBS + 0.1% NaN3)에서 세척하고, 인간 Fc 블록(TruStain FcX, Biolegend 422301)과 함께 10분 동안 사전 배양한 다음, 150 ng의 재조합 hFLT3L-Fc(R&D Systems, 카탈로그 번호 AAA17999.1) 또는 150 ng hFLT3L 또는 hFLT3L-NYESO1 단백질을 함유하는 HEK 293 조절된 배지와 함께 배양하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 Fc 완충액에서 세척하고 바이오티닐화된 항-hFLT3L 항체(R&D Systems, 카탈로그 번호 BAF308)와 함께 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 Fc 완충액에서 세척하고, 스트렙탁틴-AlexaFluor-647 2o Ab(ThermoFisher, #S32357)와 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포를 다시 세척하고 Red-R 채널에서 Guava 12HT 세포측정기(Millipore)를 사용하여 유세포 분석에 의해 분석하였다. FLT3 수용체를 발현하지 않는 HEK 293 세포가 또한 음성 대조군으로 시험되었다.
Figure pct00010
90% 이상의 THP-1 세포가, pOMIP2A 벡터로부터 발현된 hFLT3L 및 hFLT3L-NYESO1 융합 단백질 둘 모두에 대해 평균 형광 강도 증가를 나타냈으며, 이는 이들 재조합 단백질이 세포 표면 상의 FLT3 수용체에 효율적으로 결합한다는 것을 나타낸다(표 6).
재조합 FLT3L 단백질의 기능을 추가로 시험하기 위해, HEK 293 조절 배지를 사용하여 마우스 비장 세포에서의 수지상 세포 성숙 유도를 시험하였다.
B16-F10 종양 보유 C58/BL6 마우스로부터 비장을 절제하였다. 무균 상태에서, DMEM 배지 중의 비장을 70-마이크론 세포 여과기(Miltenyi)에 넣고, 3 ml 주사기로부터의 플런저의 고무 팁을 사용하여 기계적으로 해리시켰다. 비장이 완전히 해리되면, 10% FBS(PFB)를 갖는 10 ml의 HBSS를 사용하여 여과기를 세척하였다. 원심분리기에서 300 x g에서 10분 동안 통과물을 회전시켜 세포를 펠렛화하였다. 세포를 PFB로 1회 세척하였다. 제조업체의 지침(Thermo Fisher A1049201)에 따라 ACK 용해 완충액으로 적혈구를 용해시켰다. 40-마이크론 세포 여과기를 통해 15 ml 원뿔형 튜브 내로 세포를 여과하고, 원심분리기에서 300 x g에서 회전시켰다. 비장으로부터의 단일 세포 현탁액을 완전 RPMI-10 배지에 재현탁시켰다. 150만개의 비장 세포를 12 웰 플레이트에 도말하고 약 3시간 동안 플레이트에 부착되게 하였다. 비부착 세포를 제거하고 뮤린 GMCSF(100 ng/ml) 및 뮤린 IL-4(50 ng/ml)를 함유하는 2 ml의 완전 RPMI-10 배지를 첨가하였다. 1주 동안 이틀마다 배지를 변경하였다. 3배수의 웰에서 1 ml의 HEK 293 조절된 상청액(100 ng/ml Flt3L-NYESO1 융합 단백질 함유)으로 부착성 수지상 세포를 7일 동안 처리하였다. 100 ng의 인간 FLT3 리간드 재조합 단백질을 양성 대조군으로서 비교하였다(R&D systems, AAA17999.1). 세포를 플레이트에서 부드럽게 긁어 내고 CD11c+ 세포의 수를 유세포 분석에 의해 측정하였다.
CD3(-) CD11c(+) 수지상 세포의 수를 표로 작성했을 때, pOMI-FLT3L-NYESO1 플라스미드로 형질감염된 세포로부터의 조절 배지는, 형질감염되지 않은 세포로부터의 조절 배지와 함께 배양된 비장 세포에 비해, 이들 세포의 수에 있어 현저한 증가를 일으켰다.
이 결과는 FLT3L-NYESO1 융합 단백질이 마우스 비장 세포에서 생체외에서 FLT3 수용체-매개된 수지상 세포 성숙을 자극하도록 기능할 수 있음을 나타냈다.
VIII. 종양 및 마우스
6 내지 8주령의 암컷 C57Bl/6J 또는 Balb/c 마우스를 Jackson Laboratories로부터 입수하여 AALAM 지침에 따라 수용하였다.
10% FBS 및 50 μg/ml 젠타마이신이 보충된 맥코이(McCoy)의 5A 배지(2 mM L-글루타민)를 사용하여 B16-F10 세포를 배양하였다. 0.25% 트립신으로 세포를 수확하고 행크 균형 염 용액(Hank's balanced salt solution; HBSS)에 재현탁시켰다. 마취된 마우스에 대해, 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 총 부피 0.1 ml의 100만개의 세포를 피하 주입하였다. 각 마우스의 왼쪽 옆구리에 총 부피 0.1 ml의 25만개의 세포를 피하 주입하였다.
8일째부터 평균 종양 부피가 약 100 mm3에 도달할 때까지, 디지털 캘리퍼스 측정에 의해 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 목적하는 부피에 다다르면, 매우 크거나 작은 종양을 갖는 마우스를 도태시켰다. 나머지 마우스는, 오른쪽 옆구리에 이식된 종양 부피에 따라 무작위로, 각각 10마리씩의 그룹으로 나뉘었다.
C57Bl/6J 마우스의 B16OVA뿐만 아니라 Balb/c 마우스의 CT26 및 4T1을 비롯한 추가 종양 세포 유형을 시험하였다.
이 프로토콜은 치료된 종양(원발성) 및 치료되지 않은 종양(대측성)에 대한 효과를 동시에 시험하기 위한 표준 모델로 사용되었다. 또한 4T1 종양을 보유하는 Balb/c 마우스에서의 폐 전이를 정량화하였다.
IX. 종양내 치료
치료를 위해 이소플루란으로 마우스를 마취시켰다. 멸균 0.9% 식염수에서 1 μg/μl로 원형 플라스미드 DNA를 희석하였다. 26 Ga 바늘을 갖는 1 ml 주사기를 사용하여 원발성 종양에 50 μl의 플라스미드 DNA를 중앙 주입하였다. 주입 직후 전기천공을 수행하였다. 1500 V/cm, 100 μs 펄스, 0.5 cm 및 6-바늘 전극의 임상 전기천공 매개변수를 갖는 Medpulser를 사용하여 DNA의 전기천공을 달성하였다. 사용된 대안적인 매개변수는 전술된 바와 같이, 임피던스 분광법을 도입한 생성기 또는 BTX 생성기를 사용하여, 400 V/cm 및 10-ms 펄스였다. 종양 부피를 매주 2회 측정하였다. 원발성 및 대측성의 총 종양 부담이 2000 mm3에 도달할 때 마우스를 안락사시켰다.
X. 종양내 발현
생체외 이미징. 광학 이미징 시스템(Lago, Spectral Instruments)을 사용하여, 이전에 pOMI-Luc2p-P2A-mCherry 플라스미드로 치료된 종양의 발광을 정량화하였다. 다양한 시점에서 마우스를 이미징하였다. 이미징을 수행하기 위해, 500 ml/분의 산소에서 2% 이소플루란에 노출시켜 동물을 마취시켰다. 마취가 되면, 멸균 D-PBS 중에 제조된 D-루시페린(Gold Bio)의 15 mg/ml 용액 200 μl를 27-게이지 주사기로 복강 주입하여 투여하였다. 그런 다음, 동물을 37℃ 가열된 스테이지 상의 마취 매니폴드로 옮겼고, 여기서 이들은 500 ml/분의 산소에서 2% 이소플루란을 계속 공급받았다. -90℃로 냉각된 CCD 카메라에 대한 5초 노출을 사용하여, 주입 후 20분째에 발광 이미지를 획득하였다. 0.5 cm 반경의 관심 영역을 사용하여 후처리함으로써(AmiView, Spectral Instruments), 각 종양으로부터 방출된 총 광자를 측정하였다.
Figure pct00011
저전압 조건 하에서의 EP를 사용한 pOMI-Luc2p-P2A-mCherry 플라스미드의 도입은, 생체내 이미징으로 시각화된 바와 같이 전기천공된 종양에서 거의 10배 더 높은 수준의 루시페라아제 활성을 유도한다(표 7).
유세포 분석을 위한 종양 해리. B16-F10 종양으로부터 단일 세포 현탁액을 제조하였다. CO2로 마우스를 희생시키고 종양을 조심스럽게 절제하였으며, 피부와 비종양 조직은 남겨두었다. 절제된 종양은 추가 처리를 위해 얼음처럼 차가운 HBSS(Gibco)에 보관하였다. 종양을 다지고, 1.25 mg/ml 콜라게나아제 IV, 0.125 mg/ml 히알루로니다아제 및 25 U/ml DNA 분해효소 IV를 함유하는 5 ml의 HBSS에서 37℃에서 20 내지 30분 동안 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 효소 해리 후, 현탁액을 40 μm 나일론 세포 여과기(Corning)에 통과시키고, ACK 용해 완충액(Quality Biological)으로 적혈구를 제거하였다. PBS 유동 완충액(PFB: 2% FCS 및 1 mM EDTA를 함유하는 Ca++ 및 Mg++를 포함하지 않는 PBS)으로 단일 세포를 세척하고, 원심분리에 의해 펠렛화하고, 즉각적인 유세포 분석을 위해 PFB에 재현탁시켰다.
Figure pct00012
RFP 리포터 유전자를 사용하였을 때 볼 수 있듯이, 고전압 조건은 약2%의, 상기 단백질을 발현하는 종양 세포를 유발했고, 저전압 및 더 긴 펄스 조건은 >8%의, 상기 단백질을 발현하는 세포를 유발하였다. 저전압 조건의 백분율은 바이러스 벡터의 형질 도입 효율에 접근하고 있다(Currier, M. A. et al., Cancer Gene Ther 12, 407-416, doi:10.1038/sj.cgt.7700799 (2005).
단백질 추출을 위한 종양 용해. IT-EP(400 v/cm, 8회의 10-ms 펄스) 후 1일, 2일 또는 7일째에, 이식 유전자의 발현을 측정하기 위해, 희생된 마우스로부터 종양 조직을 단리하였다. 마우스로부터 종양을 절개하고 액체 질소 중의 저온 튜브로 옮겼다. 동결된 종양을 300 μL의 종양 용해 완충액(50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% 트리톤 X-100, 프로테아제 억제제 칵테일)을 함유하는 4 ml 튜브로 옮기고, 얼음 위에 놓고 30초 동안 균질화하였다(LabGen 710 균질화기). 용해물을 1.5 ml 원심분리 튜브로 옮기고 4℃에서 10분 동안 10,000 x g에서 회전시켰다. 상청액을 새 튜브로 옮겼다. 회전 및 이동 절차를 3회 반복하였다. 종양 추출물은 제조업체 지침(마우스 사이토카인/케모카인 자기 비드 패널(Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel) MCYTOMAG-70K, Millipore)에 따라 즉시 분석하거나 -80℃에서 동결하였다. 포획용 항-FLT3L 항체(R&D Systems, Minneapolis MN 카탈로그 번호 DY308) 및 검출용 오브알부민 항체(ThermoFisher, 카탈로그 번호 PA1-196)를 사용하여 표준 ELISA 프로토콜(R&D systems)에 의해 재조합 Flt3L-OVA 단백질을 검출하였다.
Figure pct00013
본 발명자들의 FLT3L-추적 항원-융합 단백질의 발현과 기능을 시험하기 위해, 본 발명자들은 OMIP2A 벡터에서 오브알부민 유전자로부터의 펩타이드와 FLT3L(세포 외 도메인)의 융합체를 구축하고 상기와 같이 종양내에서 전기천공하였다.
Figure pct00014
상기 면역조절 단백질의 마우스 상동체를 함유하는 pOMIP2A 벡터의 종양내 전기천공 후, 종양 균질물에서 현저한 수준의 IL-12p70(표 9) 및 FLT3L-OVA 재조합 단백질(표 10)을 ELISA에 의해 검출할 수 있었다.
XI. 종양 퇴행
마우스 Il-12를 포함하는 OMIP2A 플라스미드를 동시에 생성하였으며, 전임상 마우스 모델에서 종양 퇴행 및 숙주 면역계에 대한 변화 측면에서 생체내 생물학적 활성을 시험하는 데 사용하였다.
치료된 종양(원발성) 및 치료되지 않은 종양(대측성)에 대한 효과를 동시에 시험하기 위해, 대향하는 옆구리들에 2개의 종양을 갖는 마우스를 생성하기 위한 전술된 프로토콜을 표준 모델로 사용하였다. 또한 4T1 종양을 보유하는 Balb/c 마우스에서의 폐 전이를 정량화하였다.
Figure pct00015
표 11의 데이터는, 고전압에서의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 사용과 비교하여, P2A 엑손 스키핑 모티프와 함께 IL12 서브유닛을 발현하는 새로운 플라스미드 디자인을 사용한 IT-EP가, 보다 효율적인 발현으로부터 예상되는 바와 같이, 종양 성장(치료된 원발성 종양 및 치료되지 않은 원격 종양 둘 모두)의 더 나은 조절을 제공했음을 입증한다(표 4).
Figure pct00016
표 12의 데이터는 전기천공이 더 낮은 전압 및 더 긴 펄스 조건으로 수행된 경우, 전기천공된 종양 병변뿐만 아니라 치료되지 않은 원격 병변 모두에서, 특히 치료되지 않은 원격 종양에서, 더 나은 종양 성장 억제가 나타났음을 보여준다. 이 데이터는 더 높은 전압 및 더 짧은 펄스 조건에 비해 우수한 전신 종양 면역이 생성되었음을 시사하였다.
상기 새로운 플라스미드 디자인과 더 낮은 전압 EP 매개변수를 사용하여, 본 발명자들은 종양 세포 접종 후 10일째에서의 단 한 번의 투여 후 다양한 투여량의 pOMI-IL12P2A 플라스미드를 시험하였다.
Figure pct00017
증가하는 투여량의 pOMI-mIL12P2A 플라스미드의 전기천공에 따라, 치료된 원발성 종양 및 치료되지 않은 원격 종양 둘 모두의 퇴행 정도가 증가하였다. pOMI-IL12P2A를 사용한 경우, 10 μg의 플라스미드가 최대 효과를 위해 충분했으며, 상기 새로운 플라스미드 설계를 사용한 단일 투여량 치료 및 더 낮은 전압의 전기천공 조건에서 현저한 종양 성장 조절이 존재하였다.
Figure pct00018
pIL12-P2A + 저전압 치료된 마우스에서의 원발성(치료된) 및 대측성(치료되지 않은) 종양 둘 모두 종양 성장의 향상된 억제를 나타냈다. EP 저전압을 갖는 pOMI-IL12P2A의 종양내 전기천공의 개선된 치료 효과는 통계적으로 유의한 생존률 장점에도 또한 반영되었다(pOMI-IL12P2A/낮은 V의 경우 연구 종료시까지 5/6 마우스가 생존한 반면 pUMVC3-IL12/높은 V의 경우 1/6이 생존하였다).
표 14의 데이터는, 최적화된 전기천공 매개변수와 결합된 새로운 플라스미드 디자인의 경우, 현저한 종양 성장 조절뿐만 아니라 치료되지 않은 대측성 종양에 대한 효과에 의해 측정하였을 때 전신 종양 면역이 단일 EP 치료로 달성되었음을 보여준다.
Balb/c 마우스에서 4T1 원발성 종양 성장 및 폐 전이에 영향을 미치는 pOMI-mIL12P2A의 IT-EP 능력을 또한 시험하였다.
마우스의 오른쪽 옆구리에 1백만개의 4T1 세포를 피하 주입하였고 왼쪽 옆구리에 25만개의 4T1 세포를 주입하였다. 오른쪽 옆구리의 더 큰 종양에는 빈 벡터(pUMVC3, Aldevron) 또는 pOMI-mIL12P2A를 사용한 IT-EP를 적용하였다. 종양 부피를 이틀마다 측정하고, 19일째에 마우스를 희생시키고, 폐를 절제하고 칭량하였다.
Figure pct00019
전신 IL-12 치료는 4T1 종양을 갖는 마우스에서 폐 전이를 감소시킬 수 있다는 것이 이전에 보고되었다(Shi et al., J Immunol. 2004, 172:4111). 본 발명자들의 연구 결과는 종양의 국소 IT-EP 치료가 이 모델에서 폐로의 이들 종양 세포의 전이를 감소시켰음을 나타낸다(표 15).
B16F10 종양 외에도, pOMI-mIL12P2A의 전기천공은 또한 원발성(치료된) 및 대측성(치료되지 않은) B16OVA 및 CT26 종양 둘 모두의 퇴행을 유발한다. 4T1 종양 모델에서, EP/pOMI-mIL12P2A 후 원발성 종양이 퇴행했으며, 마우스는 폐 중량의 현저한 감소를 나타냈고, 이는 폐 전이 감소를 나타낸다. 본 발명자들은 OMI-mIL12P2A의 IT-EP가 마우스의 2개의 상이한 균주에서의 4개의 상이한 종양 모델에서 종양 부담을 감소시킬 수 있음을 입증하였다.
Figure pct00020
Figure pct00021
마우스 IL-12 p70 및 인간 FLT3L-NY-ESO-1 융합 단백질 둘 모두를 발현하는 pOMI-PIIM의 전기천공은 단일 치료만으로, 치료된 원발성 종양 및 치료되지 않은 원격 종양 둘 모두의 성장을 유의하게 감소시켰다(표 17 및 도 3).
원발성 및 대측성 종양 둘 모두의 부피는 빈 벡터 대조군의 전기천공과 비교하여, 전기천공에 의해 면역조절 유전자가 도입된 마우스에서 현저하게 감소되었으며, 이는 치료된 종양 미세환경 내에서의 국소 효과뿐만 아니라 전신 면역의 증가를 나타낸다.
XII. 유세포 분석
IT-pIL12-EP 치료 후 다양한 시점에서, 마우스를 희생시키고 종양과 비장 조직을 외과적으로 제거하였다.
70-마이크론 필터를 통해 비장을 눌러 비장 세포를 단리한 다음, 적혈구 용해(RBC 용해 완충액, VWR, 420301OBL) 및 림포라이트(lympholyte)(Cedarlane CL5035) 분별을 수행하였다. 림프구를 SIINFEKL-사량체(MBL International T03002)로 염색한 후, 항-CD3(Biolegend 100225), 항-CD4(Biolegend 100451), 항-CD8a(Biolegend 100742), 항-CD19(Biolegend 115546), 및 생체 염색(라이브-데드 아쿠아(live-dead Aqua); Thermo-Fisher L-34966)을 함유하는 항체 칵테일로 염색하였다. 세포를 고정하고 LSR II 유세포 분석기(Beckman)에서 분석하였다.
종양용 Gentle-MACS(Miltenyi 종양 해리 키트 130-096-730, C-튜브, 130-093-237)를 사용하여 종양을 해리하고, 가열기(130-096-427)를 갖는 Miltenyi gentleMACS™ Octo Dissociator를 사용하여 균질화하였다. 800 x g 및 4℃에서 5분 동안 세포를 펠렛화하고, 5 mL의 PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA(PFB) 중에 재현탁시키고, 5 mL의 림포라이트-M(Cedarlane) 위에 오버레이하였다. 원심분리기에서 1500 x g 및 실온에서 20분 동안 중단 없이 림포라이트 컬럼을 회전시켰다. 림프구 층을 PBF로 세척하였다. Fc 블록(BD Biosciences 553142)을 갖는 500 μL의 PFB 중에서 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁시켰다. 96-웰 플레이트에서, B16OVA 종양에서의 면역우세 항원을 나타내는 SIINFEKL 사량체(MBL)의 용액과 세포를 제조업체 지침에 따라 혼합하고, 실온에서 10분 동안 배양하였다. 항-CD45-AF488(Biolegend 100723), 항-CD3-BV785(Biolegend 100232), 항-CD4-PE(eBioscience12-0041), 항-CD8a-APC(eBioscience 17-0081), 항-CD44-APC-Cy7(Biolegend 103028), 항-CD19-BV711(Biolegend 11555), 항-CD127(135010), 및 항-KLRG1(138419)을 함유하는 항체 염색 칵테일을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 PFB로 3회 세척하였다. 얼음 위에서 1분 동안 1% 파라포름알데히드를 갖는 PFB 중에 세포를 고정하였다. 세포를 PFB로 2회 세척하고 암소에서 4℃에서 보관하였다. LSR II 유세포 분석기(Beckman)에서 샘플을 분석하였다.
Figure pct00022
종양 성장을 감소시키는 것 외에도, pOMI-mIL12P2A/EP 낮은 V는 pUMVC3-mIL12/EP 높은 V와 비교하여, 치료된 원발성 종양에서 림프구 유입을 증가시키고, TIL 집단 내 CD4+/CD8+ 비율을 감소시켰다.
pOMI-IL12P2A/EP 낮은 V 치료 후 전신 종양 면역이, 비장 및 치료되지 않은 원격 종양에서 추가로 평가되었다.
Figure pct00023
IT-pOMI-mIL12P2A-EP는 B16OVA 종양에서 우세한 항원인 오브알부민으로부터의 SIINFEKL 펩타이드에 대한 순환 CD8+ T 세포의 증가를 유도한다. 이 데이터는 국소 IL-12 요법이 마우스에서 전신 종양 면역을 유발할 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00024
OMI-mIL12P2A를 원발성 종양으로 전기천공하면 치료되지 않은 대측성 종양 내에서의 TIL의 조성을 현저하게 변경할 수 있다(표 20). 이 결과는 OMI-mIL12P2A를 사용한 종양내 치료가 치료되지 않은 종양의 면역 환경에 영향을 미칠 수 있음을 보여주며, 이는 국소 치료가 전신 항종양 면역 반응을 유발한다는 것을 나타낸다. 이러한 결론은 비장에서의 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증가된 검출(표 19), 대측성 종양 퇴행(표 11, 12, 13, 14) 및 폐 전이의 감소(표 15)에 의해 확증된다.
XIII. 마우스 유전자 발현 분석
pOMI-mIL12P2A, pOMI-PIIM(마우스 IL-12 버전) 및 pOMI-FLT3L-NYESO1 플라스미드의 IT-EP에 의해 유도된 치료된 원발성 종양 및 치료되지 않은 원격 종양에서의 유전자 발현의 변화를 분석하기 위해 NANOSTRING®을 사용하였다. 메스를 사용하여 마우스로부터 종양 조직을 조심스럽게 수확하고 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 저울(Mettler Toledo, Model ML54)을 사용하여 조직을 칭량하였다. 1 ml의 트리졸(Trizol)(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 조직에 첨가하고 얼음 위에서 프로브 균질기를 사용하여 균질화시켰다. 제조업체의 지침에 따라 Trizol로부터 RNA를 추출하였다. DNA 분해효소(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 EN0525) 처리에 의해 오염 DNA를 제거하였다. NanoDrop ND-1000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 총 RNA 농도를 측정하였다. NANOSTRING® 기술을 사용하여 유전자 발현 프로파일링을 수행하였다. 요약하면, 50 ng의 총 RNA를 NCOUNTER®(마우스 면역 'v1' 발현 패널 NANOSTRING® 기술)와 96℃에서 밤새 혼성화하였다. 이 패널은 561개의 면역학 관련 마우스 유전자뿐만 아니라 두 가지 유형의 내장 대조군(built-in control), 즉 양성 대조군(전체 분석 성능을 평가하기 위한 다양한 농도에서의 스파이크된 RNA) 및 15개의 음성 대조군(총 RNA 입력의 차이에 대해 정규화하기 위함)을 프로파일링한다. 이어서, nCounter SPRINT™ 프로파일러를 사용하여 각 RNA 종의 빈도에 대해 디지털 방식으로, 혼성화된 샘플을 분석하였다. NSOLVER™ 분석 소프트웨어 2.5 팩을 사용하여 원시 mRNA 풍부도 빈도를 분석하였다. 이 과정에서, 하우스키핑 유전자의 기하 평균, 음성 대조군의 평균, 및 양성 대조군의 기하 평균으로부터 도출된 정규화 인자를 사용하였다.
Figure pct00025
Figure pct00026
pOMI-mIL12P2A 전기천공 후 4T1 및 MC-38 종양 모델에서의 치료된 원발성 종양 및 치료되지 않은 원격 종양으로부터의 추출물에 대한 추가 NANOSTRING® 유전자 발현 분석은, 림프구 및 단핵구 세포 표면 마커뿐만 아니라 INF-γ 조절된 유전자의 유사한 상향조절을 나타냈으며, 이는 종양 미세환경에 대한 IL-12의 이러한 효과가 복수의 마우스 종양 모델로 일반화될 수 있음을 나타낸다.
치료된 원발성 종양 및 치료되지 않은 원격 종양의 조직에 대한 유전자 발현 분석은 pOMIP2A-mIL12의 IT-EP에서의 종양 TIL의 강력한 증가를 보여주는 유세포 분석을 뒷받침한다. 또한, 인터페론 감마 조절된 유전자의 증가는 종양 내의 면역자극 환경의 유도를 암시한다. 체크포인트 단백질 발현의 현저한 증가는, IT-pOMI-mIL12P2A-EP가 조합하여 사용되는 체크포인트 억제제의 작용을 위한 기질을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
400 V/cm 및 8회의 10-ms 펄스를 사용하여 pOMI-PIIM으로 B16-F10 종양을 종양내 전기천공한 후 7일째에, 종양을 외과적으로 제거하고, IL-12및 FLT3L-NYESO1 종양내 발현의 조합에 의해 매개되는 유전자 발현 변화의 분석을 위해 RNA를 추출하였다.
Figure pct00027
복수의 유전자의 발현을 위한 플라스미드의 전기천공 후 IL-12 단백질의 종양내 발현은 여전히, 강력한 적응 면역 반응과 관련된 유전자 발현의 현저한 변화를 유도하였다. FLT3L-NYESO1 융합 단백질의 종양내 발현의 추가는 치료된 종양에서 항원 제시와 관련된 유전자의 발현의 측정 가능한 증가를 유도하였다.
Figure pct00028
mIL-12 및 FLT3L-NYESO1 둘 모두를 암호화하는 플라스미드의 종양내 전기천공은, 국소 및 전신 항종양 면역 둘 모두의 증가와 일치하는 종양내 유전자 발현의 현저한 변화를 나타냈으며, 이 마우스 모델에서의 치료된 원발성 종양 및 치료되지 않은 원격 종양 둘 모두의 성장 조절에 대한 이 요법의 강력한 효과를 확증한다(표 17 및 도 3).
인간 FLT3L-NYESO1 융합 단백질만을 암호화하는 OMI 플라스미드의 종양내 전기천공 또한 종양 퇴행 및 종양 TIL의 면역 표현형에 대한 변화에 영향을 미쳤다.
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Flt3L-NYESO1 융합 단백질의 발현을 위한 플라스미드의 종양내 전기천공은 IL-12 공동발현 부재시 면역 세포 및 APM 관련 유전자 발현에 대한 측정 가능한 효과를 나타냈으며, 이는 Flt3L-NYESO1이 IT-EP에 의해 도입된 경우 종양내 면역조절에 대해 독립적인 효과를 달성함을 나타낸다(표 26, 27, 28, 29).
XIV. 유세포 분석에 의한 추적 항원에 대한 숙주 반응의 검출
Flt3L에 융합된 추적 항원을 암호화하는 플라스미드의 전기천공에 대한 숙주 반응을 시험하기 위해, B16-F10 종양을 pOMI-mIL12P2A-FLT3L-OVA로 전기천공하고 OVA 항원에 대한 숙주 반응을 측정하였다. 마우스 오른쪽 옆구리에 1백만개의 B16-F10 세포를 주입하였다. 7일 후, 종양을 pOMI-mIL12P2A-FLT3L-OVA 또는 빈 벡터로 전기천공하거나, 또는 치료하지 않은 채로 방치하였다. 전기화학적 임피던스 감지(Electrochemical Impedance Sensing; EIS)(예를 들어 WO2016161201 참조), 400V/cm 및 8회의 10-ms 펄스를 갖는 발생기를 사용하여 전기천공을 수행하였다. 마우스 IL-12를 함유하는 pOMI-PIIM과 마찬가지로(표 17), pOMI-mIL12P2A-FLT3L-OVA에서의 종양 퇴행이 이 실험에서 관찰되었다.
종양으로의 mIL12 및 FLT3L-OVA 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드의 IT-EP 후 7일째에, 사타구니 림프절에서, 마우스에서의 항원-특이적 CD8+ T 세포를 추적하는 검출을 시험하였다.
마우스를 희생시키고, 사타구니 림프절을 절제하고, PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA(PFB) 중에서 으깬 다음, 70 마이크로 필터를 통해 걸렀다. 원심분리기에서 4℃ 및 300 x g에서 세포를 펠렛화하고, PFB에서 세척하고, 셀로미터(Cellometer)(Nexcelom)에서 계수하였다.
Fc 블록(BD Biosciences 553142)을 갖는 PFB 중에서 림프절 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁시켰다. 이어서, SIINFEKL 사량체(MBL)의 용액과 세포를 제조업체 지침에 따라 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 라이브/데드 아쿠아(Thermo Fisher L34966), 항-CD3(Biolegend 100228), 항-CD19(Biolegend 115555), 항-CD127(Biolegend), 항-CD8a(MBL D271-4), 항-CD44(Biolegend 103028), 항-PD-1(Biolegend 109110), 항-CD4(Biolegend 100547), 항-KLRG1(138419), 및 항-CD62L(Biolegend 104448)을 함유하는 항체 염색 칵테일을 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 PFB로 세척하였다. 얼음 위에서 1분 동안 1% 파라포름알데히드를 갖는 PFB 중에 세포를 고정하였다. 세포를 PFB로 3회 세척하고, 유세포 분석(LSR Fortessa X-20)으로 분석하였다.
Figure pct00034
마우스에서 대리 추적 항원으로 OVA를 사용하여, 본 발명자들은 FLT3L-융합 단백질로서 종양으로 전기천공된 추적 항원에 대한 순환 T 세포를 쉽게 검출할 수 있음을 입증하였다(표 30).
XV. 마우스 꼬리 정맥으로의 유체 역학 주입에 의한 플라스미드의 도입
C57Bl/6J 마우스의 꼬리 정맥으로의 5 μg의 플라스미드의 유체 역학 주입에 의해, OMI 플라스미드로부터 발현된 FLT3L 융합 단백질의 생체내 활성을 시험하였다. 7일 후, 마우스를 희생시키고, 비장을 절제하고 칭량하고, 유세포 분석에 의한 세포 조성의 변화 분석을 위해 해리시켰다.
전술한 바와 같이 비장 세포를 단리하고, PFB로 세척하고 Fc 블록(BD Biosciences 553142)을 갖는 PFB 중에 재현탁시키고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 항 NK1.1(Biolegend108731), 라이브/데드 아쿠아(Thermo Fisher L34966), 항-CD4(Biolegend 100547), 항-F4/80(Biolegend 123149), 항-CD19(Biolegend 115555), 항-I-A/I-E(Biolegend 107645), 항-CD8(MBL International D271-4), 항-CD80(Biolegend 104722), 항-CD3(Biolegend 117308), 항-CD40(Biolegend 124630), 항-GR-1(Biolegend 108424), 항-CD11c(Biolegend 117324), 항-CD86(Biolegend 105024, 및 항-CD11b(Biolegend 101212)을 함유하는 항체 칵테일을 첨가하였다. 37℃에서 배양한다. 세포를 PFB로 3회 세척하고, 유세포 분석(LSR Fortessa X-20)으로 분석하였다.
Figure pct00035
NY-ESO-1 단백질의 일부(80-180 aa)에 융합된 인간 FLT3L 또는 인간 FLT3L을 암호화하는 플라스미드의 도입은 비장에서 CD11c+ 수지상 세포(DC)를 증가시킨다(표 31). 더욱이, 이들 DC의 대부분은 높은 수준의 MHC 클래스 II를 나타냈으며, 이는 이들이 성숙한 DC임을 나타낸다. 또한, 이들 DC의 일부는 더 높은 수준의 세포 표면 CD86 발현을 나타냈으며, 이는 이들이 활성화되었음을 나타낸다.
이 데이터는 이들 플라스미드로부터 발현되고 생체내에서의 DC 성숙 및 활성화를 유발하는 활성 FLT3 리간드에 대한 노출과 일치한다(Maraskovsky et al., 2000. Blood 96:878).
XVI. Flt3L-융합 단백질을 사용한 시험관내에서의 인간 수지상 세포의 성숙
pOMI-PIIM으로부터 발현된 인간 Flt3L-NY-ESO1 융합 단백질에 대해, 생체외 배양된 미성숙 인간 DC를 성숙시키는 능력을 시험하였다. 이를 달성하기 위해, 표준 프로토콜(Pollack SM JR et al., (2013) Tetramer Guided Cell Sorter Assisted Production of NY-ESO-1 Specific Cells for the Treatment of Synovial Sarcoma 및 Myxoid Round Cell Liposarcoma. Connective Tissue Oncology Society Meeting)을 사용하여 DC를 배양했으며, 먼저 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단핵구를 분리한 다음, 치료 전 5-7일 동안 GM-CSF 및 IL-4와 함께 무혈청 배지에서 단핵구를 배양하였다. 이어서, 이들 미성숙 DC를 치료하지 않은 채로 두거나, 또는 pOMI-PIIM, 빈 음성 대조군 벡터(EV), 또는 Flt3에 결합할 수 없으며 따라서 비활성인 Flt3L-NYESO1 융합 단백질의 발현을 위한 돌연변이된 유전자를 갖는 대조군 벡터(Flt3L-NY-ESO-1(H8R))뿐만 아니라 양성 대조군으로 사용된 재조합 정제된 FLT3L로 이전에 형질감염된 HEK 293 세포에 의해 조절된 배지로 48시간 동안 치료하였다.
유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, CD80 및 CD86 세포 표면 마커는 CD11c+DC-SIGN+인 모든 세포에 대한 FLT3L-매개된 DC 활성에 대한 주요 지표로 사용되었다. pOMI-PIIM으로 형질감염된 세포로부터의 조절된 배지는, 빈 벡터 또는 Flt3L(H8R) 불활성 돌연변이체를 암호화하는 벡터를 갖는 세포로부터의 배지에 비해, CD80 및 CD86 둘 모두를 현저하게 더 많이 유도하였다(도 4). pOMI-PIIM 플라스미드로 형질감염된 세포로부터의 배양 상청액은 양성 대조군으로 사용된 재조합 Flt3L 단백질과 비교하여 유사한 활성을 가졌다. 재현성을 보장하기 위해 이들 연구를 반복하였다. 치료되지 않은 것과 비교하여 대조군 상청액(임의의 플라스미드 유래 단백질을 포함하지 않음)을 첨가한 경우에서, CD80/CD86 발현의 일부 비특이적 유도가 관찰되었다.
Flt3L-NYESO 형질 도입된 DC와의 공동배양에 의한 NY-ESO-1 특이적 T 세포의 자극. 형질 도입된 DC(섹션 XVI에 기술됨)를 사용하여, 미리 형성된 NY-ESO-1 특이적 CTL 계통을 자극한 다음, 세포내 사이토카인, TNFα 및 INF-γ에 대한 유세포 분석 염색에 의해 분석하였다. 이 데이터는, 비활성 돌연변이체(Flt3L-NY-ESO-1(H8R))가 아닌 플라스미드 유래 Flt3L-NY-ESO-1로 펄스화되었지만 DC가 NY-ESO-1 특이적 CTL 계통을 활성화할 수 있음을 보여준다(도 5).
이 데이터는 pOMI-PIIM으로부터 발현된 인간 Flt3L-NY-ESO1 융합 단백질이 1차 미성숙 인간 수지상 세포의 성숙을 유도할 수 있음을 보여주었다.
SEQUENCE LISTING <110> OncoSec Medical Incorporated Canton, David A. <120> MULTIGENE CONSTRUCT FOR IMMUNE-MODULATORY PROTEIN EXPRESSION AND METHODS OF USE <130> 066914/541462 <150> 62/778,027 <151> 2018-12-11 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6752 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid sequence with recombinant human gene sequences within <400> 1 tggccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca 60 acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 120 tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 180 cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240 gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300 cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360 ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420 cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc 480 aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 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gtacggtggg aggtctatat aagcagagct 660 cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 720 agacaccggg accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc 780 cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt 840 atgcatgcta tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg 900 tgatggtata gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctccaacggt 960 ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt tgctgccgcg cgcgccacca gacataatag 1020 ctgacagact aacagactgt tcctttccat gggtcttttc tgcagtcacc gtcgtcgacg 1080 gtatcgataa gcttgatatc gaattcacgt gggcccggta ccaccatgtg gccccctggg 1140 tcagcctccc agccaccgcc ctcacctgcc gcggccacag gtctgcatcc agcggctcgc 1200 cctgtgtccc tgcagtgccg gctcagcatg tgtccagcgc gcagcctcct ccttgtggct 1260 accctggtcc tcctggacca cctcagtttg gccagaaacc tccccgtggc cactccagac 1320 ccaggaatgt tcccatgcct tcaccactcc caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg 1380 ctccagaagg ccagacaaac tctagaattt tacccttgca cttctgaaga gattgatcat 1440 gaagatatca caaaagataa aaccagcaca gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc 1500 aagaatgaga gttgcctaaa ttccagagag acctctttca taactaatgg gagttgcctg 1560 gcctccagaa agacctcttt tatgatggcc ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg 1620 aagatgtacc aggtggagtt caagaccatg aatgcaaagc ttctgatgga tcctaagagg 1680 cagatctttc tagatcaaaa catgctggca gttattgatg agctgatgca ggccctgaat 1740 ttcaacagtg agactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact 1800 aaaatcaagc tctgcatact tcttcatgct ttcagaattc gggcagtgac tattgataga 1860 gtgatgagct atctgaatgc ttccggatct ggggccacca acttttcatt gctcaagcag 1920 gcgggcgatg tggaggaaaa ccctggcccc tgtcaccagc agttggtcat ctcttggttt 1980 tccctggttt ttctggcatc tcccctcgtg gccatatggg aactgaagaa agatgtttat 2040 gtcgtagaat tggattggta tccggatgcc cctggagaaa tggtggtcct cacctgtgac 2100 acccctgaag aagatggtat cacctggacc ttggaccaga gcagtgaggt cttaggctct 2160 ggcaaaaccc tgaccatcca agtcaaagag tttggagatg ctggccagta cacctgtcac 2220 aaaggaggcg aggttctaag ccattcgctc ctgctgcttc acaaaaagga agatggaatt 2280 tggtccactg atattttaaa ggaccagaaa gaacccaaaa ataagacctt tctaagatgc 2340 gaggccaaga attattctgg acgtttcacc tgctggtggc tgacgacaat cagtactgat 2400 ttgacattca gtgtcaaaag cagcagaggc tcttctgacc cccaaggggt gacgtgcgga 2460 gctgctacac tctctgcaga gagagtcaga ggggacaaca aggagtatga gtactcagtg 2520 gagtgccagg aggacagtgc ctgcccagct gctgaggaga gtctgcccat tgaggtcatg 2580 gtggatgccg ttcacaagct caagtatgaa aactacacca gcagcttctt catcagggac 2640 atcatcaaac ctgacccacc caagaacttg cagctgaagc cattaaagaa ttctcggcag 2700 gtggaggtca gctgggagta ccctgacacc tggagtactc cacattccta cttctccctg 2760 acattctgcg ttcaggtcca gggcaagagc aagagagaaa agaaagatag agtcttcacg 2820 gacaagacct cagccacggt catctgccgc aaaaatgcca gcattagcgt gcgggcccag 2880 gaccgctact atagctcatc ttggagcgaa tgggcatctg tgccctgcag ttagcgtata 2940 ctctagagcg gccgcggatc cagatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat 3000 gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt 3060 gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa 3120 acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccattctt ccgcttcctc 3180 gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 3240 ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 3300 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 3360 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 3420 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 3480 gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 3540 tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 3600 tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 3660 gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 3720 cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 3780 cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 3840 agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 3900 caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 3960 ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 4020 aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 4080 tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 4140 agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc gggggggggg ggcgctgagg 4200 tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag 4260 ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat 4320 tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc 4380 cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc cgtcccgtca agtcagcgta 4440 atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc aattctgatt agaaaaactc atcgagcatc 4500 aaatgaaact gcaatttatt catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt 4560 ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat 4620 cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa 4680 ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa 4740 agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa 4800 tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg 4860 cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca ggaatcgaat gcaaccggcg caggaacact 4920 gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa tcaggatatt cttctaatac ctggaatgct 4980 gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc 5040 ttgatggtcg gaagaggcat aaattccgtc agccagttta gtctgaccat ctcatctgta 5100 acatcattgg caacgctacc tttgccatgt ttcagaaaca actctggcgc atcgggcttc 5160 ccatacaatc gatagattgt cgcacctgat tgcccgacat tatcgcgagc ccatttatac 5220 ccatataaat cagcatccat gttggaattt aatcgcggcc tcgagcaaga cgtttcccgt 5280 tgaatatggc tcataacacc ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt 5340 catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga cacaacgtgg 5400 ctttcccccc ccccccatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 5460 atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 5520 gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt 5580 atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg 5640 cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt 5700 cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag 5760 cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 5820 aaataccgca tcagattggc tat 5843 <210> 14 <211> 2832 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12 expression cassette <400> 14 tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300 tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420 ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480 aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540 gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc 600 tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccgcggccg ggaacggtgc 660 attggaacgc ggattccccg tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag actctatagg 720 cacacccctt tggctcttat gcatgctata ctgtttttgg cttggggcct atacaccccc 780 gcttccttat gctataggtg atggtatagc ttagcctata ggtgtgggtt attgaccatt 840 attgaccact ccaacggtgg agggcagtgt agtctgagca gtactcgttg ctgccgcgcg 900 cgccaccaga cataatagct gacagactaa cagactgttc ctttccatgg gtcttttctg 960 cagtcaccgt cgtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcacgtgg gcccggtacc 1020 accatgtggc cccctgggtc agcctcccag ccaccgccct cacctgccgc ggccacaggt 1080 ctgcatccag cggctcgccc tgtgtccctg cagtgccggc tcagcatgtg tccagcgcgc 1140 agcctcctcc ttgtggctac cctggtcctc ctggaccacc tcagtttggc cagaaacctc 1200 cccgtggcca ctccagaccc aggaatgttc ccatgccttc accactccca aaacctgctg 1260 agggccgtca gcaacatgct ccagaaggcc agacaaactc tagaatttta cccttgcact 1320 tctgaagaga ttgatcatga agatatcaca aaagataaaa ccagcacagt ggaggcctgt 1380 ttaccattgg aattaaccaa gaatgagagt tgcctaaatt ccagagagac ctctttcata 1440 actaatggga gttgcctggc ctccagaaag acctctttta tgatggccct gtgccttagt 1500 agtatttatg aagacttgaa gatgtaccag gtggagttca agaccatgaa tgcaaagctt 1560 ctgatggatc ctaagaggca gatctttcta gatcaaaaca tgctggcagt tattgatgag 1620 ctgatgcagg ccctgaattt caacagtgag actgtgccac aaaaatcctc ccttgaagaa 1680 ccggattttt ataaaactaa aatcaagctc tgcatacttc ttcatgcttt cagaattcgg 1740 gcagtgacta ttgatagagt gatgagctat ctgaatgctt ccggatctgg ggccaccaac 1800 ttttcattgc tcaagcaggc gggcgatgtg gaggaaaacc ctggcccctg tcaccagcag 1860 ttggtcatct cttggttttc cctggttttt ctggcatctc ccctcgtggc catatgggaa 1920 ctgaagaaag atgtttatgt cgtagaattg gattggtatc cggatgcccc tggagaaatg 1980 gtggtcctca cctgtgacac ccctgaagaa gatggtatca cctggacctt ggaccagagc 2040 agtgaggtct taggctctgg caaaaccctg accatccaag tcaaagagtt tggagatgct 2100 ggccagtaca cctgtcacaa aggaggcgag gttctaagcc attcgctcct gctgcttcac 2160 aaaaaggaag atggaatttg gtccactgat attttaaagg accagaaaga acccaaaaat 2220 aagacctttc taagatgcga ggccaagaat tattctggac gtttcacctg ctggtggctg 2280 acgacaatca gtactgattt gacattcagt gtcaaaagca gcagaggctc ttctgacccc 2340 caaggggtga cgtgcggagc tgctacactc tctgcagaga gagtcagagg ggacaacaag 2400 gagtatgagt actcagtgga gtgccaggag gacagtgcct gcccagctgc tgaggagagt 2460 ctgcccattg aggtcatggt ggatgccgtt cacaagctca agtatgaaaa ctacaccagc 2520 agcttcttca tcagggacat catcaaacct gacccaccca agaacttgca gctgaagcca 2580 ttaaagaatt ctcggcaggt ggaggtcagc tgggagtacc ctgacacctg gagtactcca 2640 cattcctact tctccctgac attctgcgtt caggtccagg gcaagagcaa gagagaaaag 2700 aaagatagag tcttcacgga caagacctca gccacggtca tctgccgcaa aaatgccagc 2760 attagcgtgc gggcccagga ccgctactat agctcatctt ggagcgaatg ggcatctgtg 2820 ccctgcagtt ag 2832

Claims (23)

  1. 발현 벡터로서, 서열 번호 13의 핵산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 발현 벡터가 서열 번호 13의 핵산 서열로 구성된, 발현 벡터.
  3. 발현 벡터로서, 서열 번호 9의 아미노산 서열로 구성된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열 번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
  5. 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 프로모터에 작동적으로 연결된, 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터, Igκ 프로모터, mPGK 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, α-액틴 프로모터, SRα 프로모터, 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복부(long terminal repeat; LTR) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter; Ad MLP), 라우스 육종 바이러스(rous sarcoma virus; RSV) 프로모터 및 EF1α 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터인, 발현 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 발현 벡터가 서열 번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터.
  9. 약학적 조성물로서, 치료적 유효 투여량의, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는, 약학적 조성물.
  10. 대상체에서 종양을 치료하는 방법으로서, 제9항의 약학적 조성물을 종양으로 주입하는 단계 및 적어도 하나의 전기천공 펄스를 종양에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 약 200 V/cm 내지 약 1500 V/cm의 전계 강도를 갖는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 약 100 μs 내지 약 50 ms의 펄스 길이를 갖는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 적어도 하나의 전기천공 펄스를 투여하는 단계는 1 내지 10회의 펄스를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 적어도 하나의 전기천공 펄스를 투여하는 단계는 6 내지 8회의 펄스를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 200 V/cm 내지 500 V/cm의 전계 강도 및 100 μs 내지 50 ms의 펄스 길이를 갖는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 약 350 내지 450 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이를 갖는, 방법.
  17. 제10항에 있어서, 적어도 하나의 전기천공 펄스를 종양에 투여하는 단계가 약 400 V/cm의 전계 강도 및 약 10 ms의 펄스 길이를 갖는 8회의 전기천공 펄스를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기천공 펄스는 전기화학적 임피던스 분광법이 가능한 발생기에 의해 전달되는, 방법.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 흑색종, 유방암, 삼중 음성 유방암, 메르켈 세포 암종, 피부 T-세포 림프종(CTCL) 및 두경부 편평세포 암종의 군으로부터 선택되는, 방법.
  21. 제9항에 있어서, 대상체에서 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  22. 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서의, 제9항의 약학적 조성물의 용도.
  23. 제9항에 있어서, 상기 약학적 조성물이, 적어도 하나의 전기천공 펄스의 투여에 의한 종양으로의 주입 및 종양으로의 전달을 위해 제형화된, 약학적 조성물.
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