JP2023017930A - 免疫調節タンパク質発現のための多重遺伝子構築物および使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】免疫調節タンパク質発現のための多重遺伝子構築物および使用方法の提供。【解決手段】ＩＬ－１２ ｐ３５およびＩＬ－１２ ｐ４０タンパク質をコードする発現ベクター構築物が提供され、各タンパク質またはその成分は、適切なプロモーターおよび／または翻訳修飾因子を利用して発現され得る。発現ベクターについての使用方法も提供される。Ｐ－Ａ－Ｔ－Ａ’によって表される式を含む発現ベクターが記載され、Ｐはプロモーターであり、Ａはヒトインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）ｐ３５をコードし、ＴはＰ２Ａ翻訳修飾要素をコードし、Ａ’はヒトＩＬ－１２ｐ４０をコードする。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月１１日に出願された米国仮出願第６２／７７８，０２７号の優先権を主張し、それは参照により本明細書に組み込まれる。

ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
本明細書に添付して電子的に提出された配列表も、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる（ファイル名：５４１４６２＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、作成日：２０１９年１２月１０日、ファイルサイズ：５７ＫＢ）。

治療的に活性な多量体の融合ポリペプチドをコードする３つの遺伝子の腫瘍内送達のための組換え発現ベクターが記載される。翻訳調節要素によって分離されたポリペプチドをコードする核酸が提供される。送達方法も提供される。

Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドは、研究者および業界で使用される組換えＤＮＡ分子の重要な供給源であった。今日、プラスミドＤＮＡは、次世代のバイオテクノロジー製品（例えば、遺伝子医薬品およびＤＮＡワクチン）が臨床試験に、最終的には医薬品市場へと前進するにつれて、益々重要になっている。発現プラスミドＤＮＡは、治療が必要とされる患者における部位、例えば腫瘍に治療的タンパク質を送達するためのビヒクルとしての用途を見出し得る。

この「腫瘍内送達」とは、たびたび腫瘍微小環境への免疫調節剤の送達を含むことがある。免疫療法は、腫瘍を治療するための手術、化学療法、および放射線療法に続く４番目の方法として最近注目を集めている。免疫療法は、ヒトに固有の免疫力を利用しているため、患者の身体的負担は、免疫療法の方が他の療法よりも少ないと言われている。免疫療法として知られる治療的アプローチは、例えば、外因的に誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）または末梢血リンパ球から様々な方法を使用する拡張培養によって得られるリンホカイン活性化細胞、ナチュラルキラーＴ細胞またはγδＴ細胞などの細胞が転移される細胞転移療法、抗原特異的ＣＴＬのインビボ誘導が期待される樹状細胞転移療法またはペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、および様々な効果が期待される遺伝子をエクスビボで上記細胞に導入し、インビボでそれらを転移する免疫遺伝子療法を含む。これらの免疫療法において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞が重要な役割を果たすことが伝統的に知られている。

インビボエレクトロポレーションは、プラスミドＤＮＡを多くの異なる組織に効率的に送達するために首尾よく使用されてきた遺伝子送達技術である。研究によって、Ｂ１６メラノーマおよび他の腫瘍組織にプラスミドＤＮＡを送達するためのインビボエレクトロポレーションの実施が報告されてきた。プラスミドによってコードされる遺伝子またはｃＤＮＡの全身的および局所的発現は、インビボエレクトロポレーションの実施により得ることができる。インビボエレクトロポレーションの使用は、腫瘍組織におけるプラスミドＤＮＡの取り込みを増強し、腫瘍内での発現をもたらし、プラスミドを筋肉組織に送達し、全身のサイトカイン発現をもたらす。

エレクトロポレーションは、インビボでプラスミドＤＮＡを細胞にトランスフェクションするために使用し得ることが示されている。最近の研究は、エレクトロポレーションが抗腫瘍剤としてのプラスミドＤＮＡの送達を増強することができることを示した。エレクトロポレーションは、げっ歯類モデルにおける肝細胞癌、腺癌、乳癌、扁平上皮細胞癌、およびＢ１６．Ｆ１０黒色腫の治療のために施されてきた。Ｂ１６．Ｆ１０マウス黒色腫モデルは、組換えタンパク質として、または遺伝子療法によってサイトカインを含む免疫調節分子を送達するための潜在的な免疫療法プロトコルをテストするために広く使用されている。

当技術分野で知られている様々なプロトコルは、癌の治療のためのインビボエレクトロポレーションを利用する免疫調節タンパク質をコードするプラスミドの送達に利用され得る。当技術分野で知られているプロトコルは、低電圧および長パルス電流を利用する、腫瘍内および筋肉内の両方でのインビボエレクトロポレーション媒介サイトカインベースの遺伝子療法を述べている。

癌免疫サイクルのさまざまな段階を含む併用免疫療法は、腫瘍細胞が免疫系による排除を回避する複数のメカニズムを標的とすることにより、免疫回避を防ぐ能力を高める可能性があり、より広い患者集団において改善された有効性を提供し得る相乗効果を有する。多くの場合、これらの併用治療的免疫調節タンパク質は、１つ以上のホモまたはヘテロ二量体鎖、例えば、ＩＬ－１２、遺伝的アジュバントをコードする融合タンパク質、および腫瘍またはウイルス抗原を含む複雑な分子である。治療学としての複数のタンパク質の投与は、複雑で費用がかかる。発現プラスミドを使用した複数のコードされたタンパク質の腫瘍内送達の使用は、より単純でより費用効果が高い。さらに、適切な翻訳要素および最適化されたエレクトロポレーションパラメーターの使用は、ヘテロ二量体免疫刺激性サイトカインを含む複数のタンパク質の発現の改善をもたらし、プラスミド治療薬の治療的投与の頻度を減らし得る。ただし、現在の発現プラスミド構築物は、各免疫調節タンパク質の適切な産生の必要性に対処していない。適切に配置されたプロモーターおよび翻訳修飾因子を有し、ヘテロ二量体サイトカインＩＬ－１２のみをコードし、腫瘍抗原に融合されたＦＬＴ３リガンドを有する発現ベクターを提供することによってこの必要性に対処する化合物および化合物を使用する方法が記載される。

Ｐ－Ａ－Ｔ－Ａ’によって表される式を含む発現ベクターが記載され、Ｐはプロモーターであり、Ａはヒトインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）ｐ３５をコードし、ＴはＰ２Ａ翻訳修飾要素をコードし、Ａ’はヒトＩＬ－１２ｐ４０をコードする。Ａ、Ｔ、およびＡ’は、単一のプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、発現ベクターはプラスミドである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号８、配列番号１３、または配列番号１４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。腫瘍細胞などの細胞に送達されると、記載の発現ベクターは、単一のポリシストロンメッセージからヒトＩＬ－１２ｐ３５（ｈＩＬ－１２ｐ３５）およびヒトＩＬ－１２ｐ４０（ｈＩＬ－１２ｐ４０）を発現する。ｈＩＬ－１２ｐ３５およびｈＩＬ－１２ｐ４０タンパク質は、細胞から分泌され、活性なＩＬ－１２ｐ７０ヘテロ二本鎖を形成する。

少なくとも１回の腫瘍内エレクトロポレーションパルスを使用して、腫瘍への記載の発現ベクターのうちの１つ以上の送達を含む、対象における腫瘍を治療する方法も記載される。いくつかの実施形態において、腫瘍内エレクトロポレーションパルスは、約２００Ｖ／ｃｍ～１５００Ｖ／ｃｍの場の強度を有する。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、腫瘍は、黒色腫、トリプルネガティブ乳癌、メルケル細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、および頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションパルスは、電気化学的インピーダンス分光法が可能な発生器によって送達される。

インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）をコードする記載の発現ベクターのいずれかを送達する少なくとも１つの低電圧腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）処置を含む対象における腫瘍を治療するための方法が記載される。いくつかの実施形態において、ＩＴ－ＥＰは、２００Ｖ／Ｃｍ～５００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１００μｓ（マイクロ秒）～約５０ｍｓ（ミリ秒）のパルス長である。いくつかの実施形態において、処置は、少なくとも４００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ミリ秒のパルス長での少なくとも１つのＩＴ－ＥＰ処置を含む。ＩＲＥＳモチーフを含むＩＬ－１２コード化プラスミドと比較した場合、Ｐ２Ａを含むＩＬ－１２コード化プラスミドの低電圧ＩＴ－ＥＰ処置が、以下のうちの少なくとも１つを含むことも企図される：ａ）ＩＬ－１２の少なくとも３．６倍高い腫瘍内発現、ｂ）処置された腫瘍病変におけるより低い平均腫瘍体積、ｃ）未処置の対側腫瘍病変におけるより低い平均腫瘍体積、ｄ）腫瘍へのリンパ球のより高い流入、ｅ）循環腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、ｆ）腫瘍におけるリンパ球および単球細胞表面マーカーの発現の増加、ｇ）表２３および２４の遺伝子のうちの１つ以上またはすべてなどのＩＮＦ－ｇ関連遺伝子のｍＲＮＡレベルの増加。

ヒトＩＬ－１２およびＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質の両方を発現させるためのｐＯＭＩ－ＰＩＩＭ（ＯｎｃｏＳｅｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ－Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ＩＬ－１２ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）と呼ばれるベクターのプラスミドマップを示している。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅレポーター細胞を用いて測定したｐＯＭＩ－ＰＩＩＭから発現した分泌型ＩＬ－１２ｐ７０ヘテロダイマーを含む組織培養細胞馴化培地の活性を示している。参照（中和抗ＩＬ１２抗体の添加、トランスフェクションされていない細胞由来の馴化培地）は点線で示されている。 マウスにおける原発性（処置）および対側（未処置）の両方のＢ１６－Ｆ１０腫瘍の増殖を制御するｐＯＭＩ－ＰＩＩＭの腫瘍内エレクトロポレーションの能力を示している（黒線）。比較のために示したｐＵＭＶＣ３（空のベクター参照）の腫瘍内エレクトロポレーション（点線）。 インビトロでヒト樹状細胞を成熟させるｐＯＭＩ－ＰＩＩＭから産生されたＦｌｔ３Ｌ融合タンパク質の能力を示している。空のベクター（ＥＶ）および不活性変異体Ｆｌｔ３Ｌ（Ｈ８Ｒ）参照と比較して、Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１は初代ヒト未成熟樹状細胞でのＡ．ＣＤ８０およびＢ．ＣＤ８６の発現を有意に増加させた：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。 Ａ．ＴＮＦ－α陽性細胞％またはＢ．未処置、ＮＹ－ＥＳＯ－１（１５７－１６５）処置、ＥＶ単独処置、Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１処置、もしくはＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｈ８Ｒ）処置後のＩＦＮ－γ陽性細胞％を示している：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。 ＨＥＫ２９３細胞におけるｐＯＭＩＰ２ＡおよびｐＯＭＩ－ＰＩベクターからのｈＩＬ－１２ｐ７０の発現を示すグラフ。ｐＯＭＩＰ２Ａは、ＩＬ－１２ｐ３５コード配列において、制限酵素部位を除去し、クローニングを容易にするＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を追加した５つのサイレント変異を含む。ｐＯＭＩ－ＰＩは、内因性のＩＬ－１２ｐ３５およびＩＬ－１２ｐ４０コード配列を含み、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を追加せずに作成された。

添付の特許請求の範囲を含めて本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単数形の単語は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、対応する複数の参照を含む。

本明細書で引用されるすべての参考文献は、個々の刊行物、特許出願、または特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により組み込まれる。

Ｉ．定義．
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性、遺伝子発現を刺激する能力、抗原活性、他の分子の活性の調節などと説明し得るまたはそれらを指す。分子の「活性」はまた、細胞と細胞との相互作用、例えば、接着を調節または維持する活性、または細胞の構造、例えば、細胞膜または細胞骨格を維持する活性を指し得る。「活性」はまた、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］などを意味し得る。

本明細書で使用される「翻訳調節要素」または「翻訳修飾因子」は、特定の翻訳開始因子またはリボソームスキッピング制御因子を意味し、新生ポリペプチド鎖におけるピコルナウイルス由来配列が次のアミノ酸との共有アミド結合を妨げる。この配列を組み込みは、翻訳されたポリペプチドのモルレベルが等しいヘテロ二量体タンパク質の各鎖の共発現をもたらす。いくつかの実施形態において、翻訳修飾因子は、リボソームスキッピング制御因子の２Ａファミリーである。変更された２Ａ翻訳は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａであり得るが、これらに限定されず、これらのすべてはＰＧ／Ｐ切断部位を共有する（表５参照）。いくつかの実施形態において、翻訳修飾因子は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。

本発明によれば、当技術分野の技術の範囲内で、従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用し得る。そのような技術は文献で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９」）、ＤＮＡクローニング：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、オリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）、核酸ハイブリダイゼーション（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５））、転写および翻訳（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４））、動物細胞培養（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））、固定化された細胞と酵素（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ
ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。

本明細書で互換的に使用される、「核酸」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは修飾型を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、およびプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学修飾、生化学修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。

「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸における一連のヌクレオチドであり、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。

１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向で、その隣の３’酸素に結合する手法でオリゴヌクレオチドを作製するように、モノヌクレオチドが反応するため、核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、モノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するとしても、５’および３’末端を有するとも言われ得る。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個の要素は、「上流」または「下流」の５’もしくは３’要素であると呼ばれる。

「コード配列」またはＲＮＡまたはペプチド（複数可）（例えば、免疫グロブリン鎖またはＩＬ－１２タンパク質）などの発現産物を「コードする」配列は、発現したときに１つまた複数の産物の産生をもたらす、オリゴヌクレオチド配列である。

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、概して約３００ヌクレオチド以下（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１５０、１７５、２００、２５０または３００）の核酸を指し、それは、目的の遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または他の核酸をコードする、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし得る。オリゴヌクレオチドは通常、一本鎖であるが、二本鎖の場合もある。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐヌクレオチド、３Ｈヌクレオチド、１４Ｃヌクレオチド、３５Ｓヌクレオチド、またはビオチンなどの標識が共有結合でコンジュゲートしているヌクレオチドの組み込みによって標識され得る。いくつかの実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして使用され得る。他の実施形態において、オリゴヌクレオチド（その一方または両方が標識され得る）は、遺伝子の全長または断片をクローニングするため、または核酸の存在を検出するためのＰＣＲプライマーとして使用され得る。一般に、オリゴヌクレオチドは、例えば、核酸合成機で合成的に調製される。

「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列要素）の並列を指す。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、制御配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。

「プラスミド」または「ベクター」という用語には、細菌送達ベクター、ウイルスベクター送達ベクター、ペプチド免疫療法送達ベクター、ＤＮＡ免疫療法送達ベクター、エピソームプラスミド、組み込み型プラスミド、またはファージベクターを含む、任意の既知の送達ベクターが含まれる。「ベクター」という用語は、宿主細胞において、１つ以上のポリペプチドを送達し、任意に、発現することができる構築物を指す。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、環状ｐＯＭＩＰ２Ａ、ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭ、またはｐＯＭＩ－ＰＩプラスミドである。

「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、または「ポリペプチド配列」、または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドにおける一連の２つ以上のアミノ酸を指す。

本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーが含まれる。

タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われている。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端されたタンパク質またはポリペプチドの開始部に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）によって終端されたアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端部に関する。

「融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合または他の化学結合によって一緒に連結されている２つ以上のペプチドを含むタンパク質を指す。ペプチドは、ペプチドまたは他の化学結合によって直接一緒に連結し得る。例えば、キメラ分子は、一本鎖融合タンパク質として組換え発現され得る。あるいは、ペプチドは、２つ以上のペプチド間の１つ以上のアミノ酸などの「リンカー」または別の適切なリンカーによって一緒に連結し得る。

「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたポリペプチド」という用語には、それぞれ、細胞において、または組換えＤＮＡ発現システムにおいて通常見られる他の成分、またはその他の汚染物質から部分的または完全に分離されたポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子、または混合ポリマー）またはポリペプチドが含まれる。これらの成分は、細胞膜、細胞壁、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分、および外来ゲノム配列を含むが、これらに限定されない。

単離されたポリヌクレオチド（例えば、ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭまたはｐＯＭＩ－ＰＩ）またはポリペプチドは、好ましくは、本質的に分子の均一な組成物であるが、いくらかの不均一性を含み得る。

「宿主細胞」という用語には、細胞による物質の産生、例えば、細胞による遺伝子、環状プラスミド（例えば、ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭまたはｐＯＭＩ－ＰＩ）またはＲＮＡなどのポリヌクレオチド、またはタンパク質の発現または複製のために、任意の方法で選択、改変、トランスフェクション、形質転換、増殖、または使用もしくは操作された任意の生物の任意の細胞を含む。例えば、宿主細胞は、哺乳動物細胞または細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、または記載の発現ベクターを維持し、発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現を促進することができる任意の単離された細胞であり得る。

ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭまたはｐＯＭＩ－ＰＩなどのベクターは、当技術分野で知られている多くの技術、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共－沈殿、リポフェクション、核へのベクターの直接マイクロインジェクション、または特定の宿主細胞型に適したその他の手段のいずれかに従って宿主細胞に導入され得る。

「カセット」または「発現カセット」は、ベクターに挿入され得る、発現産物（例えば、ペプチドまたはＲＮＡ）をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントを指す。発現カセットは、ＤＮＡコード配列に作動可能に連結されたプロモーターおよび／またはターミネーターおよび／またはポリＡシグナルを含み得る。

概して、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼに結合することができ（例えば、直接的に、または他のプロモーター結合タンパク質もしくは物質を介して）、コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、概して、その３’末端で転写開始部位によって境界が定められ、上流（５’方向）に伸びて、任意のレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーターは、エンハンサーを含むがそれに限定されない、転写開始速度に影響を与える１つ以上の追加の領域または要素を含み得る。プロモーター配列内には、転写開始部位と同様にＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが見られ得る。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列、または発現される核酸と作動可能に関連するか、または作動可能に連結され得る。発現制御配列は、それが該プロモーターからの発現を調節する場合、プロモーターに作動可能に関連するか、または作動可能に連結される。

プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、または細胞型特異的プロモーターであり得るが、これらに限定されない。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができる。プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、Ｉｇκプロモーター、ｍＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターであり得るが、これらに限定されない。ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶ前初期プロモーター、ヒトＣＭＶプロモーター、マウスＣＮＶプロモーター、およびサルＣＭＶプロモーターであり得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭまたはｐＯＭＩ－ＰＩにおける遺伝子発現に使用されるプロモーターは、ヒトＣＭＶ前初期プロモーターである（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０（１９８５）、Ｆｏｅｃｋｉｎｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ４５：１０１－１０５（１９８６）。ｈＣＭＶプロモーターは、様々な哺乳動物細胞型で高レベルの発現を提供する。

コード配列は、配列が配列の発現を指示または調節する場合、細胞における転写および翻訳制御配列の「制御下にある」、「機能的に関連する」、「作動可能に連結される」、または「作動可能に関連する」。例えば、遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを介したコード配列のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡへの転写を指示し、次にスプライシングされ得（それがイントロンを含む場合）、任意に、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳され得る。遺伝子に操作可能に連結されたターミネーター／ポリＡシグナルは、遺伝子のＲＮＡへの転写を終結させ、ポリＡシグナルのＲＮＡへの付加を指示する。

「発現する」および「発現」という用語は、遺伝子、ＲＮＡ、またはＤＮＡの配列中の情報を顕在化することを可能にするか、または引き起こすことを意味し、例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に含まれる細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生する。「発現する」および「発現」は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写およびＲＮＡからタンパク質への翻訳を含む。ＤＮＡ配列は、細胞において、または細胞によって発現され、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質などの「発現産物」を生成する。発現産物それ自体は、細胞によって発現されたとも言われ得る。

「形質転換」という用語は、細胞への核酸の導入を意味する。導入された遺伝子または配列は「クローン」と呼ばれ得る。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取る宿主細胞は「形質転換」されており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属または種の細胞を含む任意の供給源から、または異なる属または種の細胞から得られ得る。当技術分野で非常によく知られている形質転換法の例には、リポソーム送達、エレクトロポレーション、ＣａＰＯ_４形質転換、ＤＥＡＥ－デキストラン形質転換、マイクロインジェクションおよびウイルス感染が含まれる。

ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが、本明細書に開示される。「ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、任意で、導入された配列の発現および／または複製を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することができるビヒクル（例えば、プラスミド）を指し得る。

記載のポリヌクレオチドは、発現系で発現され得る。「発現系」という用語は、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入されるタンパク質または核酸を適切な条件下で発現し得る宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、および、哺乳動物宿主細胞およびプラスミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣなどのベクター、および、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスを含む。

「免疫刺激性サイトカイン」または「免疫刺激性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）」という用語は、免疫応答を刺激する能力を有する免疫に関与する細胞によって自然に分泌されるタンパク質を指す。

「抗原」という用語は、本明細書において、対象または生物と接触させた場合に（例えば、対象または生物中に存在する場合に、またはそれによって検出された場合に）、対象または生物から検出可能な免疫応答が生じる物質を指すために本明細書で使用される。「抗原ペプチド」は、対象または生物において存在するか、またはそれによって検出された場合に、対象または生物において免疫応答の開始をもたらすペプチドを指す。例えば、そのような「抗原ペプチド」は、宿主細胞の表面上のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上に負荷され、そこで提示され、宿主の免疫細胞によって認識または検出され得、それによって、そのタンパク質に対する免疫応答の実行をもたらすタンパク質を包含し得る。そのような免疫応答は、同じタンパク質を発現する宿主内の他の細胞、例えば、罹患細胞（例えば、腫瘍または癌細胞）にも広がり得る。

本明細書で使用される「共有腫瘍抗原を含む遺伝的アジュバント」という句は、表１に記載されるように、細胞表面受容体に結合する分子にＡｇを遺伝的に融合することにより、ＤＮＡによってコードされるＡｇを標的とすることを指す。遺伝的アジュバントの追加のターゲティング成分が表２に記載される。本明細書に記載の遺伝的アジュバントは、特定の抗原と組み合わせて使用すると、抗原特異的免疫応答を加速、延長、増強、または変更するように作用し得る。

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基について言及する。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なることが認められ、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合に、保存的置換は、ゼロから１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，マウンテンビュー、カリフォルニア）で実行されるように計算される。

「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を指し、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。特に明記しない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の全長である。

特に明記しない限り、配列同一性／類似性の値は、パラメーター：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を指す。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。

「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、またはグリシンとセリンの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、またはリシンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類を以下で要約する。

「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一か、または実質的に同様である配列を指す。

「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管）内で生じるプロセスまたは反応を指す。

「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。

１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含有し得る。

値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。

文脈から別段に明確ではない限り、「約」という用語は、規定の値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内、または指定の値から±０．５％、±１％、±５％、または±１０％の変化内の値を包含する。

冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「抗原」または「少なくとも１つの抗原」という用語は、それらの混合物を含む、複数の抗原を含み得る。

ＩＩ．総則。
腫瘍微小環境において、インビボ細胞、特に腫瘍細胞または他の細胞、例えば免疫細胞のトランスフェクション後に複数のタンパク質の発現を可能にする発現ベクターが記載される。

それらの有効性および安全性を改善するように設計された、本明細書に記載の改変のいくつかまたはすべてを含むベクターが提供される。ベクターの最適化は、適切なペプチドをコードする配列の組み込み、および遺伝子発現を改善するための部位の調整を含む。ペプチドは、サイズ、および、例えば、グリコシル化およびリン酸化のような、翻訳後修飾されているかどうかに関係なく、任意の翻訳産物であると理解される。

発現される遺伝子配列に作動可能に連結された、１つ以上の翻訳制御要素、例えば、Ｐ２Ａを含む発現ベクターが記載される。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、転写および翻訳される少なくとも２つの核酸配列または発現カセットを含み、翻訳制御要素は、翻訳される配列のうちの少なくとも１つに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、転写および翻訳される少なくとも３つの核酸配列または発現カセットを含み、翻訳制御要素は、翻訳される配列のうちの少なくとも２つに作動可能に連結される。ベクターは、既知であるか、または当業者によって構築され得、以下の本明細書の実施例に示されるように、本明細書に記載の配列に加えて、配列の所望の転写を達成するために必要なすべての発現要素を含む。ベクターは、その用途に応じて、原核生物または真核生物の宿主系における使用のための要素を含む。当業者は、どの宿主系が特定のベクターと互換性があるかを知っているであろう。

組換え遺伝子の発現は、適切な遺伝子の転写およびメッセージの効率的な翻訳に依存する。これらのプロセスのうちのいずれかひとつが正しく実行されないと、特定の遺伝子の発現の失敗、または遺伝子の発現の低下をもたらし得る。単一のプラスミドから複数の遺伝子を発現させることが望ましい場合、これはさらに複雑になる。伝統的に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、発現される遺伝子間で使用されていた。ＩＲＥＳはサイズの制限があり、２番目の遺伝子の翻訳効率は最初の遺伝子よりもはるかに低い。最近の研究では、ピコルナウイルスポリプロテイン２Ａ（「Ｐ２Ａ」）ペプチドを使用は、１対１の化学量論でＰ２Ａペプチドに隣接する複数のタンパク質の発現をもたらすことがわかっている（たとえば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ（２０１１）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ６：３１８５５６を参照）。組換えＤＮＡは、制限酵素部位を追加するまたは削除することによるなど、制限酵素を使用したクローニングを容易にするために配列を変更することによって頻繁に作成される。そのような変更された配列は、核酸配列およびコードされたタンパク質配列を変更し得、またはそれらは、コードするタンパク質配列を変更せずにヌクレオチド配列を変更し得る。転写産物に沿ったまれな、または非定型のコドンの存在は、非効率的な翻訳につながり、異種タンパク質産生のレベルを低下させ得る。さらに、まれな、または非定型のコドンの存在はまた、翻訳精度に影響を与え得る。組換えＤＮＡが治療薬として使用されるべき場合、特にヒトにおける使用については、できるだけ多くの天然コード配列を保持することが望ましい。本明細書に記載の発現ベクターは、制限酵素クローニング以外の方法を使用して作製され、ＩＬ－１２ｐ３５およびＩＬ－１２ｐ４０の内因性コード配列を保持し、単一のポリシストロン契約からの２つのタンパク質の発現に不要な任意の追加のコード配列を最小限に抑える。

いくつかの実施形態において、例えば、ＩＬ－１２（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＮＰ＿０００８７３．２、ＮＰ＿００２１７８．２）などのヘテロ二量体タンパク質および遺伝的アジュバント、例えば、共有腫瘍抗原を含むＦＬＴ３リガンド細胞外ドメイン（ＦＬＴ３Ｌ、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＸＭ＿０１７０２６５３３．１）、例えば、ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質を含む多様な免疫調節剤の発現のための発現ベクターが記載される。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、インビボエレクトロポレーションを介して腫瘍に送達される（腫瘍内送達）。

追加の遺伝的アジュバントも検討されている（表２）。

いくつかの実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号２のアミノ酸配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、および少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号３のアミノ酸配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、および少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現カベクターは、配列番号４のアミノ酸配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、および少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態において、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号２および３のアミノ酸配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、および少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態において、配列番号２、配列番号３、および配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号２、配列番号３、および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号２、配列番号３、および配列番号４のアミノ酸配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号２、配列番号３、および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、および少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態において、配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号９のアミノ酸配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、および少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態において、配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、をコードする発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号１１のアミノ酸配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、および少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドをコードする。

いくつかの実施形態において、配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号５のヌクレオチド配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、これに限定されないが、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターに操作可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号６のヌクレオチド配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、これに限定されないが、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターに操作可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号７のヌクレオチド配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、これに限定されないが、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターに操作可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号８のヌクレオチド配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、これに限定されないが、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターに操作可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、配列番号１４のヌクレオチド配列、または配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号１４のヌクレオチド配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態において、配列番号１０のヌクレオチド配列、または配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号１０のヌクレオチド配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号１０のヌクレオチド配列、または配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに操作可能に連結されている。

いくつかの実施形態において、配列番号１２のヌクレオチド配列、または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号１２のヌクレオチド配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態において、配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号１のヌクレオチド配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

いくつかの実施形態において、配列番号１３のヌクレオチド配列、または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む発現ベクターを記載する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号１３のヌクレオチド配列と７０％超、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号１３のヌクレオチド配列からなる発現ベクターを記載する。

ＩＩＩ．デバイスおよび用途
いくつかの実施形態において、記載の発現ベクターは、腫瘍内遺伝子エレクトロトランスファーによって送達される。記載の発現ベクターは、多量体サイトカインまたは多量体サイトカインの組み合わせ、天然または操作された形態の共刺激分子、共有腫瘍抗原を含む遺伝的アジュバントなどのような、十分な濃度のいくつかの組換え発現免疫調節分子を生成するために使用され得る。組織、例えば腫瘍への発現ベクターの転移を達成するために、エレクトロポレーションデバイスが採用され得る。

本実施形態のデバイスおよび方法は、電気療法を連続的におよび／またはパルスで、ほんの１秒から数日、数週間、および／または数ヶ月の範囲の期間、腫瘍に送達することによって癌性腫瘍を治療するように機能する。いくつかの実施形態において、電気療法は、直流電気療法である。

本明細書で使用される「エレクトロポレーション」（すなわち、細胞膜を透過性にする）という用語は、（例えば、医薬品、溶液、遺伝子およびその他の薬剤などの分子を生細胞に拡散させるために）細胞膜に穴を開けるのに十分な任意の期間に患者に送達される任意の量のクーロン、電圧、および／または電流によって引き起こされ得る。

組織への電気療法の送達は、一連の生物学的および電気化学的反応を引き起こす。十分に高い電圧では、細胞構造および細胞代謝は、電気療法の適用によってひどく乱される。癌性および非癌性の細胞の両方が特定のレベルの電気療法で破壊されるが、腫瘍細胞は、非癌性細胞よりも微小環境における変化に敏感である。電気療法の結果として、マクロ要素およびミクロ要素の分布が変化する。エレクトロポレーションの近くの細胞の破壊は、不可逆エレクトロポレーションとして知られている。

可逆的エレクトロポレーションの使用も企図される。可逆的エレクトロポレーションは、電極に印加された電気が標的組織の電場閾値を下回ったときに発生する。印加された電気は細胞の閾値を下回っているため、細胞は、リン脂質二重層を修復し、通常の細胞機能を継続し得る。可逆的エレクトロポレーションは、通常、薬物または遺伝子（または通常は細胞膜を透過しない他の分子）を細胞に取り込むことを含む処置で行われる。（Ｇａｒｃｉａ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）「Ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｅｅｐ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」２０１０ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ：２７４３－６．）

単一電極構成において、電圧は、リード電極および発電機ハウジングの間にほんの数秒から数時間、印加され得、癌性組織の破壊を開始し得る。所与の電圧の印加は、一連のパルスであり得、各パルスはほんの１秒から数分続く。いくつかの実施形態において、パルス持続時間または幅は、約１０μｓ～約１００ｍｓであり得る。低電圧は、ほんの数秒から数分の持続時間で印加され得、それは白血球を腫瘍部位に引き付け得る。このようにして、細胞性免疫系は、死んだ腫瘍細胞を取り除き得、腫瘍細胞に対する抗体を発達させ得る。さらに、刺激された免疫系は、境界腫瘍細胞および転移を攻撃し得る。

宿主種に応じて、免疫応答を増加させるために様々なアジュバントが使用され得、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどの無機塩、さまざまなサイトカイン、リゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョンなどの表面活性物質、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。あるいは、免疫応答は、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、オボアルブミン、コレラ毒素またはそれらの断片などの分子との組み合わせおよびまたはカップリングによって増強され得る。

Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物における選択された組織の細胞への生体分子の導入を容易にするためのモジュラー電極システムおよびそれらの使用について説明している。モジュラー電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電性連結を提供する電気コネクタ、および電源を含む。オペレータは、支持構造に取り付けられた複数の針電極をつかみ、それらを身体または植物における選択された組織にそれらをしっかりと挿入し得る。次に、生体分子は皮下注射針を介して選択された組織に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動し、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞への生体分子の導入を容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物における選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用され得るエレクトロポレーションデバイスを記載している。エレクトロポレーションデバイスは、動作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される動電学的デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を含む。ＥＫＤデバイスは、ユーザー制御およびパルスパラメーターの入力に基づいて、アレイにおける電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを産生し、電流波形データの保存および取得を可能にする。エレクトロポレーションデバイスはまた、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および取り外し可能なガイドディスク（例えば、米国特許公開第２００５／００５２６３０号参照）を含み、参照により本明細書に組み込まれる。

米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されている電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または器官への深い浸透にも適合している。電極アレイの構成により、（選択した生体分子を送達するための）注射針も完全に標的器官に挿入され、注入は、電極によって事前に線引きされた領域で、標的の問題に対して垂直に投与される。

電気化学的インピーダンス分光法（「ＥＩＳ」）を組み込んだエレクトロポレーションデバイスも含まれる。そのようなデバイスは、インビボ、特に腫瘍内エレクトロポレーション効率のリアルタイムの情報を提供し、条件の最適化を可能にする。ＥＩＳを組み込んだエレクトロポレーションデバイスの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６１６１２０１に見出され得る。

他の代替エレクトロポレーション技術もまた企図される。インビボプラスミド送達はまた、コールドプラズマを使用して実施することができる。プラズマは、物質の４つの基本的な状態の１つであり、その他は固体、液体、気体である。プラズマは、結合していない正および負の粒子の電気的に中性の媒体である（つまり、プラズマの全体的な電荷はほぼゼロである）。プラズマは、レーザーまたはマイクロ波発生器を使用して、ガスを加熱する、または強力な電磁場に供することによって作成され得る。これは、電子の数を増減し、イオンと呼ばれる正または負の荷電粒子を生成し（Ｌｕｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｓｍａ ５：２８６８－２８７０）、分子結合が存在する場合はその解離が同時に起こる。

コールドプラズマ（すなわち、非熱プラズマ）は、パルス化された高電圧信号を適切な電極に送達することによって生成される。コールドプラズマデバイスは、ガスジェットデバイスまたは誘電体バリア放電（ＤＢＤ）デバイスの形をとり得る。コールドプラズマは、比較的低いガス温度でプラズマを供給する長所により、多くの熱意と関心を集めてきた。このような温度でのプラズマの供給は、創傷治癒、抗菌プロセス、他のさまざまな医学的治療および滅菌を含む、さまざまな用途にとって興味深いものである。前述のように、コールドプラズマ（すなわち、非熱プラズマ）は、パルス化された高電圧信号を適切な電極に供給することによって生成される。コールドプラズマデバイスは、ガスジェットデバイス、誘電体バリア放電（ＤＢＤ）デバイス、または多周波高調波リッチ電源の形をとり得る。

誘電体バリア放電デバイスは、コールドプラズマを生成するために別のプロセスに依存している。誘電体バリア放電（ＤＢＤ）デバイスは、誘電体層で覆われた少なくとも１つの導電性電極を含む。電気的帰路は、コールドプラズマ処置を受けるターゲット基板によって提供され得る接地によって、または電極に内蔵の接地を提供することによって形成される。誘電体バリア放電デバイスのエネルギーは、上記のような高電圧電源によって提供され得る。より一般的には、エネルギーは、プラズマ放電を形成するために、パルス化されたＤＣ電圧の形で誘電体バリア放電デバイスに入力される。誘電体層の長所により、放電は、導電性電極から分離され、電極のエッチングおよびガス加熱が低減される。パルス化されたＤＣ電圧は、様々な動作領域を達成するために振幅および周波数が変化され得る。コールドプラズマ生成のそのような原理を組み込んだ任意のデバイス（例えば、ＤＢＤ電極デバイス）は、様々な記載の実施形態の範囲内である。

コールドプラズマは、細胞を外来核酸でトランスフェクションするために採用されてきた。特に、腫瘍細胞のトランスフェクション（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１７２９－１７３３、およびＣｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０３：１５－２１参照）。

デバイスは、癌または他の非癌性（良性）増殖に苦しむ患者における使用について企図されている。これらの増殖は、病変、ポリープ、新生物（例えば、乳頭状尿路上皮新生物）、乳頭腫、悪性腫瘍、腫瘍（例えば、クラトスキン腫瘍、肺門腫瘍、非浸潤性乳頭状尿路上皮腫瘍、胚細胞腫瘍、ユーイング腫瘍、アスキン腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍、レイディグ細胞腫瘍、ウィルムス腫瘍、セルトリ細胞腫瘍）、肉腫、癌腫（例えば、扁平上皮細胞癌、総排泄孔癌、腺癌、腺扁平上皮癌、胆管癌、肝細胞癌、浸潤性乳頭状尿路上皮癌、扁平尿路上皮癌）、しこり、または任意の他のタイプの癌性もしくは非癌性の増殖のいずれかとして現れ得る。本実施形態のデバイスおよび方法で治療される腫瘍は、非侵襲性、侵襲性、表在性、乳頭状、平坦、転移性、限局性、単中心性、多中心性、低悪性度、および高悪性度のうちのいずれかであり得る。

デバイスは、多くの種類の悪性腫瘍（すなわち、癌）および良性腫瘍での使用について企図されている。例えば、本明細書に記載のデバイスおよび方法は、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌（例えば、末梢癌（ｐｅｒｉｐｈｉｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）、遠位胆管癌、肝内胆管癌）膀胱癌、良性および癌性骨癌（例えば、骨腫、類骨骨腫、骨芽細胞腫、骨軟骨腫、血管腫、軟骨粘液性線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、骨の巨大細胞腫瘍、脊索腫、リンパ腫、多発性骨髄腫）、脳および中枢神経系癌（例えば、髄膜腫、星状細胞腫（ａｓｔｏｃｙｔｏｍａ）、乏突起神経膠腫、上衣腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、神経節神経膠腫、神経鞘腫、胚細胞腫、頭蓋咽頭腫）、乳癌（例えば、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、女性化乳房症、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ））、キャッスルマン病（例えば、巨大リンパ節過形成、血管濾胞性リンパ節過形成）、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜癌（例えば、子宮内膜腺癌、腺類癌、乳頭状漿液性腺癌、明細胞）食道癌、胆嚢癌（粘液性腺癌、小細胞癌）、消化管カルチノイド腫瘍（例えば、絨毛癌、破壊性絨毛腺腫）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、カポジ肉腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）、肝臓癌（例えば、血管腫、肝細胞腺腫、限局性結節性過形成、肝細胞癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、中皮腫、形質細胞腫、頭頸部の扁平上皮細胞癌（鼻腔および副鼻腔癌（例えば、鼻腔神経芽細胞腫、正中線肉芽腫）、唾液腺癌、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、喉頭および下咽頭癌、口腔癌および口腔咽頭癌を含むが、これらに限定されない）、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、多形性横紋筋肉腫）、皮膚癌、黒色腫および非黒色腫皮膚癌の両方（メルケル細胞癌を含む）、胃癌、精巣癌（例えば、精上皮腫、非精上皮腫胚細胞癌）、胸腺癌、甲状腺癌（例えば、濾胞腺癌、未分化癌、低分化癌、甲状腺髄様癌、甲状腺リンパ腫）、膣癌、外陰癌、および子宮癌（例えば、子宮平滑筋肉腫）における使用が企図される。

ＩＶ．腫瘍内エレクトロポレーションパラメーター
典型的には、インビボ細胞エレクトロポレーション、特に腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）に必要な電場は、概して、インビトロでの細胞に必要な電場の大きさが類似している。いくつかの実施形態において、電場の大きさは、約１０Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍ、約２００Ｖ／ｃｍ～１５００Ｖ／ｃｍ、約２００Ｖ／ｃｍ～８００Ｖ／ｃｍ約２００Ｖ／ｃｍ～５００Ｖ／ｃｍの範囲である。いくつかの実施形態において、場の強度は、約２００Ｖ／ｃｍ～約４００Ｖ／ｃｍである。いくつかの実施形態において、場の強度は約４００Ｖ／ｃｍである。

パルス長または周波数は、約１０μｓ～約１００ｍｓ、約１００μｓ～約５０ｍｓ、約５００μｓ～１０ｍｓであり得る。いくつかの実施形態において、場の強度は約４００Ｖ／ｃｍであり、パルス長は約１０ｍｓである。任意の所望の数のパルスがあり得、典型的には１秒あたり１～１００パルスである。パルスセット間の間隔は、１秒などの任意の所望の時間であり得る。波形、電場強度、およびパルス持続時間はまた、細胞のタイプおよびエレクトロポレーションを介して細胞に入る分子のタイプに依存し得る。

プラスミドにコードされた免疫刺激性サイトカインは、各サイクルまたは交互のサイクルの少なくとも１、２、または３日間のエレクトロポレーションによって送達される。いくつかの実施形態において、サイトカインは、各サイクルの１、５、および８日目に送達される。いくつかの実施形態において、サイトカインは、奇数のサイクルごとの１、３、および８日目に送達される。いくつかの実施形態において、プラスミドがＰ２Ａ翻訳要素を含む場合、プラスミドにコードされたサイトカインは、１日目にのみ単一の処置として送達される。

免疫刺激性サイトカインをコードするプラスミドを含むＰ２Ａは、約１μｇ～１００μｇ、約１０μｇ～約５０μｇ、約１０μｇ～約２５μｇで投与される。いくつかの実施形態において、プラスミドの量は、標的腫瘍体積の計算によって決定され、この体積の１／４のプラスミドを含むＰ２Ａの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液を投与する。

ＩＶ．併用療法
本開示は、ヒト対象における癌を治療する方法を包含し、方法は、治療有効量の記載の発現ベクターのうちの１つ以上を対象に投与するステップ（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、記載の発現ベクターは、エレクトロポレーションと組み合わせて投与される。

いくつかの実施形態において、記載の治療法のいずれかが、１つまたは複数の追加の（すなわち、第２の）治療学または治療と組み合わされる。発現ベクターおよび追加の治療学は、単一の組成物で投与され得、またはそれらは、別々に投与され得る。追加の治療学の非限定的な例は、抗癌剤、抗癌生物製剤、抗体、抗ＰＤ－１阻害剤、抗ＣＴＬＡ４アンタゴニストＡｂ、腫瘍ワクチン、または当技術分野で知られている他の療法を含むが、これらに限定されない。

免疫調節タンパク質をコードするＤＮＡの腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）は、他の治療実体と共に投与され得ることが企図される。表３は可能な組み合わせを提供する。併用療法の実施は、エレクトロポレーションのみ、またはエレクトロポレーションと全身性の送達の組み合わせによって達成され得る。

記載の発現ベクターおよび／または組成物は、癌の治療的処置のための方法において使用され得る。癌は、黒色腫、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、メルケル細胞癌、ＣＴＣＬ、頭頸部扁平上皮細胞癌、または上記の他の癌であり得るが、これらに限定されない。そのような方法は、エレクトロポレーションによる発現ベクターの投与を含む。

いくつかの実施形態において、記載の発現ベクターのうちの少なくとも１つは、腫瘍におけるＩＬ１２およびＦＬＴ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯの発現に利益をもたらすであろう対象の治療のための医薬組成物（すなわち、薬剤）の調製において使用される。いくつかの実施形態において、記載の医薬組成物は、対象における癌を治療するために使用される。

本明細書で使用される場合、医薬組成物または薬剤は、薬理学的有効量の記載の発現ベクターの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物または薬剤は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。薬学的に許容される賦形剤（賦形剤）とは、医薬品有効成分（ＡＰＩ、治療薬、発現ベクターなど）以外の物質であり、安全性が適切に評価されており、薬物送達システムに意図的に含まれている。賦形剤は、意図された投与量で治療効果を発揮しないか、または発揮することが意図されていない。賦形剤は、ａ）製造の際に薬物送達システムの処理を助け、ｂ）ＡＰＩの安定性、生物学的利用能、もしくは患者の許容性を保護、支援、もしくは強化し、ｃ）製品の識別を補助し、および／またはｄ）保存もしくは使用の際にＡＰＩの全体的な安全性、有効性、送達の任意の他の属性を強化するために作用し得る。薬学的に許容される賦形剤は、不活性物質であり得るか、またはそうではないことがある。

賦形剤は、吸収促進剤、付着防止剤、消泡剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、送達促進剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香料、流動促進剤、保湿剤、潤滑剤、油、ポリマー、保存剤、生理食塩水、塩、溶剤、糖、懸濁化剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、撥水剤、および湿潤剤を含むが、これらに限定されない。

医薬組成物は、医薬組成物に一般的に見られる他の追加の成分を含み得る。そのような追加の成分は、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔薬、または抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン剤、ジフェンヒドラミンなど）を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載の発現ベクターを発現または含む細胞は「医薬組成物」として使用され得ることもまた想定される。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」、または単に「有効量」は、意図された薬理学的、治療的または予防的結果を生じるための発現ベクターのその量を指す。

いくつかの実施形態において、記載の発現ベクターは、処置された腫瘍病変における平均腫瘍体積をより低くし、未処置の対側腫瘍病変における均腫瘍体積をより低くし、腫瘍へのリンパ球の流入を誘発し、循環腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を誘発し、腫瘍におけるリンパ球および単球の細胞表面マーカーの発現を増加させ、および／または表２３および２４のＩＮＦ－γ関連遺伝子のいずれかのｍＲＮＡレベルを増加させるために使用され得る。

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２の腫瘍内発現は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％増加する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２の腫瘍内発現は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも３．６倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加する。

いくつかの実施形態において、処置された腫瘍病変における平均腫瘍体積は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％減少する。

いくつかの実施形態において、未処置の対側腫瘍病変における平均腫瘍体積は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％減少する。

いくつかの実施形態において、腫瘍へのリンパ球の流入は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％増加する。いくつかの実施形態において、腫瘍へのリンパ球の流入は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加する。

いくつかの実施形態において、対象における循環腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％増加する。いくつかの実施形態において、対象における循環腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加する。

いくつかの実施形態において、腫瘍におけるリンパ球および単球の細胞表面マーカーの発現は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％増加する。いくつかの実施形態において、腫瘍におけるリンパ球および単球の細胞表面マーカーの発現は、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加する。

いくつかの実施形態において、腫瘍における表２３および２４のＩＮＦ－γ関連遺伝子のいずれかのｍＲＮＡレベルは、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％増加する。いくつかの実施形態において、腫瘍における表２３および２４のＩＮＦ－γ関連遺伝子のいずれかのｍＲＮＡレベルは、発現ベクターを投与される前の対象または発現ベクターを受けていない対象と比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも５倍増加する。

いくつかの実施形態において、記載の発現ベクターまたは発現ベクターを含む組成物は、エレクトロポレーションによって腫瘍または腫瘍病変に送達され得る。概して、核酸分子を（インビトロまたはインビボ）送達するために当技術分野で認識されている任意の適切なエレクトロポレーション方法は、記載の発現ベクターでの使用に適合させ得る。

記載の発現ベクターおよび本明細書に開示の発現ベクターを含む医薬組成物は、キット、容器、パック、またはディスペンサーに梱包され得るまたは含まれ得る。発現ベクターおよび発現ベクターを含む医薬組成物は、事前に充填された注射器またはバイアルに梱包され得る。キットは、本明細書に開示の方法を実施する際に利用される試薬を含み得る。キットはまた、本明細書に開示される組成物、ツール、または器具を含み得る。例えば、そのようなキットは、記載の発現ベクターのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の記載の発現ベクターおよびエレクトロポレーションデバイスを含む。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の記載の発現ベクター、ならびに１つ以上の電極ディスク、針電極、および注射針を含む。モデルキットを以下に説明するが、他の有用なキットの内容は、本開示を考慮して明白であるであろう。

上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。本明細書に記載の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、別段に他の指示がない限り、任意の他のものと組み合わせて使用され得る。実施形態は、明瞭さおよび理解の目的のために、図表および例を手段としていくらか詳細に記載されるが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変更および修正が実施され得ることは明らかであろう。

実施形態の列挙
本明細書に開示される主題には、以下の実施形態が含まれるが、これらに限定されない。

１．配列番号１の核酸配列を含む、発現ベクター。

２．配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコードする核酸を含む、発現ベクター。

３．ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載の発現ベクター。

４．核酸が、配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態２または３に記載の発現ベクター。

５．核酸が、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載の発現ベクター。

６．核酸が、Ｐ２Ａ翻訳修飾要素をコードする核酸および少なくとも１つの抗原に融合したＦＬＴ－３Ｌペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている、実施形態４または５に記載の発現ベクター。

７．抗原が、ＮＹＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１のアミノ酸８０～１８０、Ｎｙ－ＥＳＯ－１のアミノ酸１５７～１６５、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＳＳＸ－２、ＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、Ｇｐ１００、サバイビン、ＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＰＳＭＡ、ＰＲＳ ｐａｎ－ＤＲ、Ｂ７－Ｈ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７、ＨＰＶ１１ Ｅ６、ＨＰＶ６ｂ／１１ Ｅ７、ＨＣＶ－ＮＳ３、インフルエンザＨＡ、インフルエンザＮＡ、ポリオーマウイルスＭＣＰｙＶ
ＬＴＡ、ポリオーマウイルスＶＰ１、ポリオーマウイルスＬＴＡ、ポリオーマウイルスＳＴＡ、ＯＶＡ、ＲＮＥＵ、Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＬＡＧＥ－１、ＣＥＡペプチドＣＡＰ－１、およびＨＰＶワクチンペプチド、またはそれらの抗原性ペプチドからなる群から選択される、実施形態６に記載の発現ベクター。

８．抗原が、ＮＹＥＳＯ－１である、実施形態７に記載の発現ベクター。

９．核酸が、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態２～８のいずれか１つに記載の発現ベクター。

１０．ポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２～９のいずれか１つに記載の発現ベクター。

１１．ポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載の発現ベクター。

１２．核酸が、配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１０または１１に記載の発現ベクター。

１３．核酸が、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、実施形態１２に記載の発現ベクター。

１４．核酸が、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１２または１３に記載の発現ベクター。

１５．発現ベクターが、配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１４に記載の発現ベクター。

１６．発現ベクターが、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、実施形態１５に記載の発現ベクター。

１７．少なくとも１回の腫瘍内エレクトロポレーションパルスを使用して、発現ベクター実施形態１～１６のいずれか１つを腫瘍に送達することを含む、対象における腫瘍を治療する、方法。

１８．腫瘍内エレクトロポレーションパルスが、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの場の強度を有する、実施形態１７に記載の方法。

１９．対象が、ヒトである、実施形態１７または１８に記載の方法。

２０．腫瘍が、黒色腫、トリプルネガティブ乳癌、メルケル細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、および頭頸部扁平上皮細胞癌の群から選択される、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の方法。

２１．エレクトロポレーションパルスが、電気化学的インピーダンス分光法が可能な発生器によって送達される、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載の方法。

２２．以下を含む発現ベクターを送達する少なくとも１つの低電圧腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）処置を施すことを含む、対象における腫瘍を治療する、方法：
ａ．配列番号１、配列番号８、配列番号１０、もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列、
ｂ．配列番号１、配列番号８、配列番号１０、もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ．配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
ｄ．配列番号９もしくは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。

２３．ＩＴ－ＥＰ処置が、約２００Ｖ／ｃｍ～約５００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１００μｓ～約５０ｍｓのパルス長を含む、実施形態２２に記載の方法。

２４．処置が、１つのＩＴ－ＥＰ処置であり、約３５０～４５０Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を含む、実施形態２３に記載の方法。

２５．処置が、１つのＩＴ－ＥＰ処置であり、約４００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を含む、実施形態２４に記載の方法。

２６．処置が、１～１０回の１０ｍｓのエレクトロポレーションパルスを含む、実施形態１７～２５のいずれか１つに記載の方法。

２７．処置が、５～１０回の１０ｍｓのエレクトロポレーションパルスを含む、実施形態２６に記載の方法。

２８．処置が、８回の１０ｍｓのエレクトロポレーションパルスを含む、実施形態２７に記載の方法。

２９．処置が、ＩＲＥＳモチーフを含むＩＬ－１２をコードするプラスミドでの低電圧ＩＴ－ＥＰ処置と比較した場合、以下のうちの１つ以上またはすべてをもたらす、実施形態１７～２８のいずれか１つに記載の方法：
ａ．ＩＬ－１２の少なくとも３．６倍高い腫瘍内発現、
ｂ．処置された腫瘍病変におけるより低い平均腫瘍体積、
ｃ．未処置の対側腫瘍病変におけるより低い平均腫瘍体積、
ｄ．腫瘍へのリンパ球のより高い流入、
ｅ．循環腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、
ｆ．腫瘍におけるリンパ球および単球の細胞表面マーカーの発現の増加、ならびに
ｇ．表２３および２４のＩＮＦ－ｇ関連遺伝子のｍＲＮＡレベルの増加。

３０．治療が、少なくとも１回の腫瘍内エレクトロポレーションパルスを使用して発現ベクターを腫瘍に送達することを含む、対象における腫瘍の治療に使用するための実施形態１～１６のいずれかに記載の発現ベクター。

３１．腫瘍内エレクトロポレーションパルスが、少なくとも１つの低電圧腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）処置を含む、実施形態３０に記載の発現ベクター。

３２．ＩＴ－ＥＰ処置が、２００Ｖ／ｃｍ～５００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１００μｓ～約５０ｍｓのパルス長を含む、実施形態３１に記載の発現ベクター。

３３．処置が、１つのＩＴ－ＥＰ処置であり、３５０～４５０Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を含む、実施形態３２に記載の発現ベクター。

３４．処置が、１つのＩＴ－ＥＰ処置であり、約４００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を含む、実施形態３３に記載の発現ベクター。

３５．処置が、１～１０回の１０ｍｓのエレクトロポレーションパルスを含む、実施形態３０～３４のいずれかに記載の発現ベクター。

３６．処置が、５～１０回の１０ｍｓのエレクトロポレーションパルスを含む、実施形態３５に記載の発現ベクター。

３７．処置が、８回の１０ｍｓのエレクトロポレーションパルスを含む、実施形態３６に記載の発現ベクター。

３８．以下の式によって定義される複数の発現カセットを含む発現プラスミド：
Ｐ－Ａ－Ｔ－Ａ’－Ｔ－Ｂであって、
式中、
ａ）ＰがヒトＣＭＶプロモーターであり、
ｂ）ＡおよびＡ’がそれぞれインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）ｐ３５およびＩＬ－１２ ｐ４０であり、
ｃ）Ｂが表１の少なくとも１つの抗原に融合したＦＬＴ－３Ｌであり、
ｄ）ＴがＰ２Ａ翻訳修飾要素である、発現プラスミド。

３９．発現プラスミドが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、実施形態３８に記載の発現プラスミド。

４０．発現プラスミドが、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、実施形態３９または４０に記載の発現プラスミド。

４１．プラスミドが、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、実施形態３８～４０のいずれかに記載の発現プラスミド。

４２．抗原が、ＮＹＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１のアミノ酸８０～１８０、Ｎｙ－ＥＳＯ－１のアミノ酸１５７～１６５、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＳＳＸ－２、ＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、Ｇｐ１００、サバイビン、ＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＰＳＭＡ、ＰＲＳ ｐａｎ－ＤＲ、Ｂ７－Ｈ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７、ＨＰＶ１１ Ｅ６、ＨＰＶ６ｂ／１１ Ｅ７、ＨＣＶ－ＮＳ３、インフルエンザＨＡ、インフルエンザＮＡ、ポリオーマウイルスＭＣＰｙＶ ＬＴＡ、ポリオーマウイルスＶＰ１、ポリオーマウイルスＬＴＡ、ポリオーマウイルスＳＴＡ、ＯＶＡ、ＲＮＥＵ、Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＬＡＧＥ－１、ＣＥＡペプチドＣＡＰ－１、およびＨＰＶワクチンペプチド、またはそれらの抗原性ペプチドからなる群から選択される、実施形態３８および３９のいずれかに記載の発現ベクター。

４３．抗原が、ＮＹＥＳＯ－１である、実施形態４２に記載の発現ベクター。

４４．少なくとも１回の腫瘍内エレクトロポレーションパルスを使用して、実施形態３８～４３のいずれかに記載の発現プラスミドを腫瘍に送達することを含む、対象における腫瘍を治療する、方法。

４５．腫瘍内エレクトロポレーションパルスが、約２００Ｖ／ｃｍ～１５００Ｖ／ｃｍの場の強度を有する、実施形態４４に記載の方法。

４６．対象がヒトである、実施形態４４または４５に記載の方法。

４７．腫瘍が、黒色腫、トリプルネガティブ乳癌、メルケル細胞癌、ＣＴＣＬ、および頭頸部扁平上皮細胞癌の群から選択される、実施形態４４～４６のいずれかに記載の方法。

４８．エレクトロポレーションパルスが、電気化学的インピーダンス分光法が可能な発生器によって送達される、実施形態４４～４７のいずれかに記載の方法。

４９．インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）をコードする発現プラスミドを送達する少なくとも１つの低電圧腫瘍内エレクトロポレーション（ＩＴ－ＥＰ）処置を含む、対象の腫瘍を治療する方法であって、プラスミドがＰ２Ａエクソンスキッピングモチーフを含む、方法。

５０．ＩＴ－ＥＰ処置が、２００Ｖ／ｃｍ～５００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１００μｓ～約５０ｍｓのパルス長を含む、実施形態４９に記載の方法。

５１．処置が、１つのＩＴ－ＥＰ処置であり、少なくとも４００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を含む、実施形態５０に記載の方法。

５２．Ｐ２Ａを含むＩＬ－１２コード化プラスミドのＩＴ－ＥＰ処置が、ＩＲＥＳモチーフを含むＩＬ－１２コード化プラスミドと比較した場合、以下のうちの少なくとも１つを含む、実施形態４９～５１のいずれかに記載の方法：
ａ）ＩＬ－１２の少なくとも３．６倍高い腫瘍内発現、
ｂ）処置された腫瘍病変におけるより低い平均腫瘍体積、
ｃ）未処置の対側腫瘍病変におけるより低い平均腫瘍体積、
ｄ）腫瘍へのリンパ球のより高い流入、
ｅ）循環腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、
ｆ）腫瘍におけるリンパ球および単球の細胞表面マーカーの発現の増加、ならびに
ｇ）表２３および２４のＩＮＦ－ｇ関連遺伝子のｍＲＮＡレベルの増加。

５３．ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されたＩＬ１２ ｐ３５－Ｐ２Ａ－ＩＬ１２ｐ４０についてのコード配列を含む発現プラスミドであって、ＩＬ１２ ｐ３５－Ｐ２Ａは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、発現プラスミド。

５４．プラスミドが、配列番号３のアミノ酸配列をさらにコードする、実施形態５３に記載の発現プラスミド。

５５．プラスミドが、配列番号４のアミノ酸配列をさらにコードする、実施形態５４に記載の発現プラスミド。

５６．プラスミドが、配列番号９のアミノ酸配列をコードする、実施形態５３に記載の発現プラスミド。

５７．プラスミドが、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする、実施形態５３に記載の発現プラスミド。

５８．発現プラスミドを送達することが、初代未成熟ヒト樹状細胞の成熟をもたらす、実施形態４４に記載の方法。

５９．配列番号１３の核酸配列を含む、発現ベクター。

６０．発現ベクターが、配列番号１３の核酸配列からなる、実施形態５９に記載の発現ベクター。

６１．配列番号９のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、発現ベクター。

６２．核酸配列が、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、実施形態６１に記載の発現ベクター。

６３．核酸が、配列番号８のヌクレオチド配列、または配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む、実施形態６１に記載の発現ベクター。

６４．核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の発現ベクター。

６５．プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、Ｉｇκプロモーター、ｍＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターからなる群から選択される、実施形態６４に記載の発現ベクター。

６６．プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、実施形態６５に記載の発現ベクター。

６７．発現ベクターが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、実施形態６６に記載の発現ベクター。

６８．実施形態５８～６７のいずれか１つの発現ベクターの治療有効量を含む、医薬組成物。

６９．実施形態６８の医薬組成物を腫瘍に注射することと、腫瘍に少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すこととを含む、対象における腫瘍を治療する、方法。

７０．エレクトロポレーションパルスが、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの場の強度を有する、実施形態６９に記載の方法。

７１．エレクトロポレーションパルスが、約１００μｓ～約５０ｍｓのパルス長を有する、実施形態７０に記載の方法。

７２．少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すことが、１～１０回のパルスを施すことを含む、実施形態７１に記載の方法。

７３．少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すことが、６～８回のパルスを施すことを含む、実施形態７２に記載の方法。

７４．エレクトロポレーションパルスが、２００Ｖ／ｃｍ～５００Ｖ／ｃｍの場の強度および１００μｓ～５０ｍｓのパルス長を有する、実施形態７０に記載の方法。

７５．エレクトロポレーションパルスが、約３５０～４５０Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を有する、実施形態７４に記載の方法。

７６．腫瘍に少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すことが、約４００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を有する８回のエレクトロポレーションパルスを施すことを含む、実施形態６９に記載の方法。

７７．エレクトロポレーションパルスが、電気化学的インピーダンス分光法が可能な発生器によって送達される、実施形態６９～７６のいずれか１つに記載の方法。

７８．対象が、ヒトである、実施形態６９～７７のいずれか１つに記載の方法。

７９．腫瘍が、黒色腫、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、メルケル細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、および頭頸部扁平上皮細胞癌の群から選択される、実施形態６９～７８のいずれか１つに記載の方法。

８０．対象における癌の治療に使用するための実施形態６８に記載の医薬組成物。

８１．癌を治療するための薬剤の製造における実施形態６８に記載の医薬組成物の、使用。

８２．医薬組成物が、腫瘍への注射および少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスの実施による腫瘍への送達のために製剤化される、実施形態６８に記載の医薬組成物。

配列識別子

上記で提供された実施形態および項目は、以下の非限定的な実施例で示されている。

Ｉ．一般的な方法。
分子生物学の標準的な方法が記載される。Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ （２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｌｓｏ ａｐｐｅａｒ ｉｎ Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、それは、細菌細胞のクローニングとＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞および酵母でのクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質とタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、バイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を記載している。

免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製の方法が記載されている。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、およびタンパク質のグリコシル化が記載される。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５－１６．２２．１７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．、ｐｐ．４５－８９、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４－３９１を参照されたい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製、および断片化が記載される。Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、前出。リガンド／受容体の相互作用を特徴づけるための標準的な技術が利用可能である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。

蛍光活性化セルソーティング検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含むフローサイトメトリーの方法が利用可能である。例えば、Ｏｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ
ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。例えば診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、および抗体を含む、核酸を修飾するのに適した蛍光試薬が利用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．

免疫系の組織学の標準的な方法が記載される。例えば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（ｅｄ．）（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｉａｔｔ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，Ｐａ．、Ｌｏｕｉｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。

例えば、抗原性断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能的ドメイン、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ （Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＥＣＹＰＨＥＲ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖ．）、Ｍｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１－７４２、Ｍｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１－７４２、Ｗｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７－１８１、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７－２１、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３－４６９０を参照されたい。

ＩＩ．ヒトＩＬ－１２ｐ３５およびｐ４０サブユニットのｐＯＭＩＰ２Ａへのサブクローニング。
ｐＵＭＶＣ３骨格は、Ａｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ、ＮＤ）から購入された。インフレームでｈＩＬ１２ｐ４０（Ｐ２Ａ－ｈＩＬ１２ｐ４０）に連結された翻訳調節要素Ｐ２Ａをコードする１０７１ｂｐ ＤＮＡ断片（遺伝子ブロック）は、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入された。ｐ４０遺伝子ブロックは、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ、イプスウィッチＭＡ、カタログ番号Ｍ０５３０Ｓ）を使用してＰＣＲ増幅され、標準の制限酵素ペアリングおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ、カタログ番号１５２２４－０１７）を使用して、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの下流のｐＵＭＶＣ３にライゲーションされた。Ｐ２Ａ－ｈＩＬ１２ｐ４０／ｐＯＭＩＰ２Ａの陽性クローンは、制限酵素消化によって同定され、ＤＮＡシーケンシングで検証された。

ヒトｐ３５は、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）からクローニングを容易にするために内部のＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、およびＸｂａ１部位が削除された７８９ｂｐの遺伝子ブロックとして注文された。ｐ３５遺伝子ブロックは、上記のようにＰＣＲ増幅され、Ｐ２Ａ－ｈＩＬ１２ｐ４０／ｐＯＭＩＰ２Ａにおけるｐ４０遺伝子ブロックの上流にライゲーションされた。ｈＩＬ１２ｐ３５－Ｐ２Ａ－ｐ４０／ｐＯＭＩＰ２Ａの陽性クローンは、制限酵素消化によって同定され、ＤＮＡシーケンシングで検証された。

インビボイメージングおよびエクスビボフローサイトメトリー用のレポーター遺伝子を含む同様の構築物が作製された。ｐＯＭＩ－Ｌｕｃ２ｐ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙを生成するために、Ｌｕｃ２Ｐは、ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）からＰＣＲ増幅され、ｍＣｈｅｒｒｙは、遺伝子ブロック断片（ＩＤＴ）から増幅された。増幅されたＤＮＡ断片は、精製され、消化され、ｐＵＭＶＣ３にライゲーションされた。陽性クローンは、制限酵素消化によって同定され、ＤＮＡシーケンシングで検証された。

ＩＩＩ．ＦＬＴ３Ｌ－抗原融合タンパク質構築物の生成
ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）は、Ｔ細胞への優先的提示のために抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に向けることが示されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍ．２０１４，Ｋｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１，７１：６１３２）。可溶性の分泌型のＦＬＴ３Ｌは、様々なタンパク質またはペプチド抗原に融合されている（表１、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍ．２０１４）。

ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１融合タンパク質構築物を生成するためのプロトコル例を示す。３つの遺伝子ブロックがＩＤＴから得られ、それぞれはＩｇκシグナルペプチド配列、それに続くＦＬＴ３ＬのＥＣＤ、短いヒンジ領域、およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗原の３つの異なるセグメントを含む。隣接する制限部位を追加し、これら３つの融合タンパク質構築物をｐＵＭＶＣ３に導入するためにＰＣＲが使用された。ＦＬＴ３Ｌは、マウスでの前臨床試験のために、オボアルブミン遺伝子からのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド抗原を含む３つのペプチドのコンカテマーにも融合された。ｐＵＭＶＣ３から、これらの融合構築物がｐＯＭＩＰ２Ａに導入される（以下で説明）。

他の共有腫瘍またはウイルス抗原を使用する代替融合タンパク質（表１）は、同じ方法を使用して構築される。

同定された共有腫瘍抗原に加えて、患者特異的新生抗原が同定され得、その患者に合わせた免疫原性ペプチド抗原が、腫瘍内エレクトロポレーションを介した個別治療のためにＦＬＴ３Ｌに融合され得る（例えば、Ｂｅｃｋｈｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１０，１２０：２２３０を参照されたい）。

すべての免疫調節タンパク質のバージョンは、マウスホモログ配列を使用して並行して構築され、前臨床試験で使用される。

ＩＶ．単一の転写産物から３つのタンパク質を発現させるためのｐＯＭＩ－２ｘＰ２Ａの生成。
サブクローニングプロトコルの例は、ＩＬ－１２ヘテロダイマーサイトカインおよびＦＬＴ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１について示されている。ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ－１をコードするＤＮＡ遺伝子ブロック（ＩＤＴ）は、上流のＰ２Ａ部位および隣接する制限部位でＰＣＲ増幅され、ｈＩＬ－１２ｐ４０の下流でライゲーションされた。ｐ４０の３’側の停止部位を削除するためにＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、米国）が実行された。陽性クローンは、制限酵素消化によって同定され、ＤＮＡシーケンシングで検証された。

４番目の遺伝子は、同じ方法を使用して、ポリシストロンメッセージにすでに含まれている３つの遺伝子の上流または下流に追加され得る。

Ｖ．ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭの生成
ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭプラスミドの概略図を図１に示す。ＯＭＩ－ＰＩＩＭは、ＯｎｃｏＳｅｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ－Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ＩＬ－１２ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒの略である。３つの遺伝子はすべて同じプロモーターから発現され、エクソンスキッピングモチーフが介在して、３つのタンパク質すべてが単一のポリシストロンメッセージから生成されるようにする。

ベクターｐＵＭＶＣ３は、Ｋｐｎ１制限酵素消化によって線形化された。ｈＩＬ１２ｐ３５は、線形化されたｐＵＭＶＣ３の５’配列に一致する２４ｂｐのオーバーラップおよび３’部分Ｐ２Ａ配列を有して、臨床ｈＩＬ１２－ＩＲＥＳ／ｐＵＭＶＣ３プラスミドＡｌｄｅｖｒｏｎ（Ｆａｒｇｏ、ＮＤ）からのＰＣＲによって増幅された。ｈＩＬ１２ｐ４０は、５’Ｐ２Ａ配列および線形化されたｐＵＭＶＣ３との３’２４ｂｐオーバーラップを有して、ｈＩＬ１２－２Ａ／ｐＵＭＶＣ３プラスミド（上記）からのＰＣＲによって増幅された。ｐ３５－Ｐ２Ａ（部分的）およびＰ２Ａ－ｐ４０ ＰＣＲ産物の間の配列のオーバーラップは１４ｂｐであった。３つの部品のギブソンアセンブリは、製造元の推奨事項（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｅ２６１１Ｓ／Ｌ）に従って実行され、ｈＩＬ１２－２Ａ－ｓｅａｍｌｅｓｓ／ｐＵＭＶＣ３の陽性クローンは、制限酵素消化によってスクリーニングされ、ＤＮＡ配列によって検証された。ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭ発現プラスミドは、前のプラスミド（ｐＯＭＩＰ２Ａ、実施例ＩＩを参照）に存在するＩＬ－１２ ｐ３５コード配列と比較して、ＩＬ－１２ ｐ３５コード配列に５つのサイレントコドン変化を含む。ＩＬ－１２ ｐ３５コード配列のクローニングを容易にするために、ｐＯＭＩＰ２Ａにおいて５つのサイレント点変異が作成された。これらの５つの点変異により、内因性ＩＬ－１２ｐ３５ヌクレオチド配列に存在する制限酵素部位が除去された。これらの変異を持たないｈＩＬ－１２発現ベクターを生成するために、ギブソンアセンブリクローニング法を使用した。ギブソンクローニング法を使用すると、制限部位の除去が不要であり、内因性ＩＬ－１２ｐ３５コード配列を使用してポリシストロンｈＩＬ－１２発現ベクターを作成することができた。内因性配列の使用は、クローニングの目的で作成された非最適化コドンの代わりに最適化された内因性コドンを使用することにより、ヒト被験者におけるＩＬ－１２ｐ３５および下流のＩＬ－１２ｐ４０配列の発現の改善につながり得る。ギブソンアセンブリはさらに、ＰＴ２要素に隣接するＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位を追加せずにｐＯＭＩ－ＰＩＩＭ発現プラスミドを作成することを可能にした。ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位は、Ｐ２Ａコード領域の前後にそれぞれＧＣＧＧＣＣＧＣＡ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ認識サイト）およびＧＧＡＴＣＣ配列を追加した。ＧＣＧＧＣＣＧＣＡ配列は、ｐＯＭＩＰ２Ａプラスミドから発現するＩＬ－１２ｐ３５およびＩＬ－１２ｐ４０タンパク質のＣ末端にＡｌａ－Ａｌａ－Ａｌａトリペプチドを追加し、ＧＧＡＴＣＣ配列は、ＩＬ－１２ｐ４０およびＦｌｔ３－Ｌタンパク質のＮ末端シグナル配列にＧｌｙ－Ｓｅｒジペプチドを追加した。これらの配列は通常、ＩＬ１２ ｐ３５、ＩＬ１２ ｐ４０、またはＦｌｔ３リガンドには存在せず、インビボで発現したＩＬ－１２ｐ３５、ＩＬ－１２ ｐ４０、またはＦｌｔ３－Ｌタンパク質の発現、フォールディング、活性、または分泌を変化させ得る。追加のアミノ酸が、発現したタンパク質に対する免疫反応を引き起こし得る可能性がある。ギブソンアセンブリクローニングの使用は、サイレント核酸配列変異または余分なアミノ酸を含まない発現ベクターを生成するために使用され、その機能は不明であり、その存在は不要であり、潜在的に阻害的である。続いて、この構築物は、Ｎｏｔ１で消化され、ｈＩＬ１２ｐ４０停止部位の３’側で線形化された。テンプレートとしてｈＩＬ１２～ｈＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１を使用して（上記）、Ｐ２Ａ－ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ（８０－１８０ａａ）は、ｈＩＬ１２ｐ４０の末端との５’２８ｂｐオーバーラップ（停止部位を削除）および線形化されたｐＵＭＶＣ３との３’２８ｂｐオーバーラップを有して、ＰＣＲにより増幅された。ギブソンアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｅ２６１１Ｓ／Ｌ）はメーカーの推奨に従って実行され、ｈＩＬ１２～ｈＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ（８０－１８０ａａ）－ｓｅａｍｌｅｓｓ／ｐＵＭＶＣ３の陽性クローンは制限酵素消化によってスクリーニングされ、ＤＮＡシーケンシング（ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭ、配列番号１）によって検証された。

ＦＬＴ３受容体に結合できないＦＬＴ３Ｌの変異型は、機能研究のための対照として生成された（Ｇｒａｄｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１７６２６）。Ｇｒａｄｄｉｓ（上記）に記載の点変異およびテンプレートとしてのｐＯＭＩ－ＰＩＩＭを作成するために、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、米国）が使用された。

並行して、前臨床試験のために、マウスＩＬ－１２でｐＯＭＩ－ＰＩＩＭのバージョンが構築された。

ＶＩＩａ．ｐＯＭＩ－ＰＩの生成。
ポリシストロンベクター上でｈＩＬ－１２ｐ３５およびｈＩＬ１２－ｐ４０をコードするｐＯＭＩ－ＰＩは、２番目のＰＴ２要素およびｈＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１コード配列の代わりにＩＬ－１２ ｐ４０コード配列の直後に終止コドンが挿入されたことを除いて、ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭと同様の方法で作成された。したがって、ｐＯＭＩ－ＰＩ発現ベクターは、内因性ｈＩＬ－１２ ｐ３５コード配列、Ｐ２Ａ要素コード配列、および内因性ｈＩＬ－１２ ｐ４０コード配列を含む。ｈＩＬ－１２ ｐ３５、Ｐ２Ａ要素、ｈＩＬ－１２ ｐ４０コード配列は、単一のプロモーターから転写される。ｐＯＭＩ－ＰＩは、ＰＴＡ要素の前後にｐＯＭＩＰ２Ａに存在するＧＣＧＧＣＣＧＣＡおよびＧＧＡＴＣＣ配列を含まないため、翻訳されたＩＬ－１２ ｐ３５タンパク質のＣ末端にＡｌａ－Ａｌａ－Ａｌａトリペプチドを、または翻訳されたＩＬ－１２ ｐ４０のＮ末端シグナル配列にＧｌｙ－Ｓｅｒジペプチドを追加しない。ＥＬＩＳＡ分析は、ｈＩＬ－１２ ｐ７０がインビトロでＨＥＫ２９３細胞においてｐＯＭＩ－ＰＩ発現ベクターから効率的に発現されたことを示した（図６参照）。

ＶＩ．ＥＬＩＳＡ
ｐＵＭＶＣ３－ＩＬ１２（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、ファーゴ、ＮＤ）およびｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２Ａは、ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ－１（Ｍｉｒｕｓ、マディソン ＷＩ、カタログ番号ＭＩＲ２３００）を使用して、製造元の推奨に従ってＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションされた。２日後、上清が回収され、３０００ｒｐｍで５分間回転させ、細胞の破片をすべて除去した。清澄化した上清は等分され、－８６℃で凍結された。馴化培地中のｈＩＬ－１２ｐ７０ヘテロ二量体タンパク質のレベルは、複合体を特異的に検出するＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス ＭＮ カタログ番号ＤＹ１２７０）を使用して定量化された。

ｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２Ａは、一定量のトランスフェクションされたプラスミドについての培養上清においてｐＵＭＶＣ３－ＩＬ１２よりも３．６倍多くのヒトＩＬ１２ｐ７０分泌タンパク質を生成した。

ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭのクローンは、ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ－１（Ｍｉｒｕｓ、マディソン ＷＩ、カタログ番号ＭＩＲ２３００）を使用して、製造元の推奨に従って、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションされた。２日後、上清が回収され、３０００ｒｐｍで５分間回転させ、細胞の破片をすべて除去した。清澄化した上清は新しいチューブに移され、分注して－８６℃で凍結された。馴化培地中のｈＩＬ－１２ｐ７０ヘテロ二量体タンパク質のレベルは、複合体を特異的に検出するＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス ＭＮ カタログ番号ＤＹ１２７０）を使用して定量化された。ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ－１融合タンパク質のレベルは、抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス ＭＮ、カタログ番号ＤＹ３０８）を使用したＥＬＩＳＡによって定量化された。

顕著なレベルのｐ７０ ＩＬ－１２およびＦＬＴ３Ｌ融合タンパク質の両方が、ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭでトランスフェクションされた細胞から産生された（表５）

ＶＩＩ．インビトロ機能アッセイ
ｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２ＡおよびｐＯＭＩ－ＰＩＩＭを発現する細胞からの組織培養上清は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞を使用して機能的なＩＬ－１２ ｐ７０の発現について試験された。これらの細胞は、ヒトＩＬ－１２受容体、およびＳＴＡＴ４駆動の分泌型のアルカリホスファターゼを発現するように設計されている。

このレポーターアッセイは、製造元のプロトコル（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎカタログ番号ｈｋｂ－ｉｌ１２）に従って実行された。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現は、製造元のプロトコル（Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎカタログ番号ｒｅｐ－ｑｂｌ）に従って測定された。

同量のヒトｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２ＡまたはｐＵＭＶＣ３－ＩＬ１２（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）のいずれかでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞からの培養上清の異なる希釈物が、このアッセイで比較された。平均ＥＣ５０は、ｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２Ａ試料において＞２倍低かった（ｎ＝３、マンホイットニー、＊＊ｐ＜０．０１）これらのデータは、所定の用量のプラスミドについて、ｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２ＡがｐＵＭＶＣ３－ＩＬ１２よりもより機能的なヒトＩＬ－１２ｐ７０タンパク質の産生をもたらしたことを示している。

ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭポリシストロンベクターから発現および分泌されたＩＬ－１２ ｐ７０タンパク質もまた、ＳＥＡＰタンパク質の誘導において強い活性を示した（図２）。この活性は、ｒｈＩＬ－１２タンパク質対照に匹敵し、中和ＩＬ－１２抗体（Ｒ＆Ｄシステム、ＡＢ－２１９－ＮＡ）によって遮断された（図２）。

ｐＯＭＩＰ２Ａベクターから発現され、ＨＥＫ２９３細胞の培地に分泌されたヒトＦＬＴ３ＬおよびＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質は、表面ＴＨＰ－１単球細胞に発現したＦＬＴ３受容体への結合について試験された。

Ｍｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ－１を使用して、ＨＥＫ細胞は、ｐＯＭＩＰ２Ａ－ｈＦＬＴ３ＬまたはｐＯＭＩＰ２Ａ－ｈＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１（８０－１８０ａａ）をトランスフェクションされた。上清は、７２時間後に回収された。分泌されたＦＬＴ３Ｌタンパク質の量は、ｈＦＬＴ３Ｌ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号ＤＹ３０８）を使用して定量化された。

ＴＨＰ－１単球細胞株は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＴＩＢ－２０２）中で培養された。各実験について、７５０，０００個のＴＨＰ－１細胞が、Ｆｃバッファー（ＰＢＳ＋５％フィルター処理ＦＢＳ＋０．１％ＮａＮ３）で洗浄され、ヒトＦｃブロック（ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４２２３０１）と１０分間プレインキュベートされた後、１５０ｎｇの組換えｈＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＡＡ１７９９９．１）で、または１５０ｎｇのｈＦＬＴ３ＬもしくはｈＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１タンパク質を含み、４℃で１時間インキュベートしたＨＥＫ２９３馴化培地で、インキュベートした。次に、細胞は、Ｆｃバッファーで洗浄され、ビオチン化抗ｈＦＬＴ３Ｌ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ３０８）で１時間インキュベートされた。次に、細胞は、Ｆｃバッファーで洗浄され、ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７ ２^ｏＡｂ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、番号Ｓ３２３５７）で１時間インキュベートした。細胞は、再度洗浄され、Ｒｅｄ－ＲチャネルでＧｕａｖａ １２ＨＴサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したフローサイトメトリーによって分析された。ＦＬＴ３受容体を発現しないＨＥＫ２９３細胞も陰性対照として試験された。

ＴＨＰ－１細胞の９０％以上が、ｐＯＭＩＰ２Ａベクターから発現したｈＦＬＴ３ＬおよびｈＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質の両方で平均蛍光強度の増加を示し、これらの組換えタンパク質が細胞表面のＦＬＴ３受容体に効率的に結合することを示している（表６）。

組換えＦＬＴ３Ｌタンパク質の機能をさらに試験するために、ＨＥＫ２９３馴化培地が使用され、マウス脾細胞における樹状細胞成熟の誘導について試験した。

脾臓は、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍を有するＣ５８／ＢＬ６マウスから切除された。無菌条件下で、脾臓は７０ミクロンセルストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に入れたＤＭＥＭ培地に入れられ、プランジャーのゴム製チップを使用して３ｍｌ注射器から機械的に分離された。脾臓が完全に解離されたら、１０％ＦＢＳ（ＰＦＢ）ワッド（ｗａｄ）を含む１０ｍｌのＨＢＳＳがストレーナーを洗浄するために使用された。フロースルーは、遠心分離機で３００×ｇで１０分間回転させ、細胞をペレット化した。細胞は、ＰＦＢで１回洗浄された。赤血球は、製造元の指示（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ａ１０４９２０１）に従ってＡＣＫ溶解バッファーで溶解された。細胞は、４０ミクロンのセルストレーナーを通して１５ｍｌのコニカルチューブにろ過され、３００×ｇの遠心分離機で回転させた。脾臓からの単一細胞懸濁液は、完全ＲＰＭＩ－１０培地に再懸濁された。１５０万個の脾細胞は、１２ウェルプレートに播種され、約３時間プレートに接着させた。非接着細胞が除去され、マウスＧＭＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびマウスＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む２ｍｌの完全ＲＰＭＩ－１０培地が加えられた。培地は１週間２日ごとに交換された。接着樹状細胞は、３つのウェルで１ｍｌのＨＥＫ２９３馴化上清（１００ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質を含む）で７日間処置された。１００ｎｇのヒトＦＬＴ３リガンド組換えタンパク質は、陽性対照として比較された（Ｒ＆Ｄシステム、ＡＡＡ１７９９９．１）。細胞は、プレートから静かにこすり取られ、ＣＤ１１ｃ^＋細胞の数はフローサイトメトリー分析によって決定された。

ＣＤ３（－）ＣＤ１１ｃ（＋）樹状細胞の数を表にすると、ｐＯＭＩ－ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１プラスミドでトランスフェクションされた細胞からの馴化培地は、トランスフェクションされていない細胞からの馴化培地でインキュベートされた脾細胞と比較して、これらの細胞の数を有意に増加させた。

この結果は、ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質が、マウス脾細胞においてエクスビボでＦＬＴ３受容体を介した樹状細胞の成熟を刺激するように機能し得ることを示した。

ＶＩＩＩ．腫瘍およびマウス
６～８週齢の雌のＣ５７Ｂｌ／６ＪまたはＢａｌｂ／ｃマウスは、ジャクソン研究所から入手され、ＡＡＬＡＭガイドラインに従って飼育された。

Ｂ１６－Ｆ１０細胞は、１０％ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したマッコイの５Ａ培地（２ｍＭ Ｌ－グルタミン）で培養された。細胞は、０．２５％トリプシンで回収され、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁された。麻酔をかけたマウスは、各マウスの右脇腹に総量０．１ｍｌの１００万個の細胞を皮下注射された。総量０．１ｍｌの０．２５百万個の細胞が、各マウスの左脇腹に皮下注射された。

腫瘍の成長は、平均腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に達するまで、８日目からデジタルノギス測定によって観察された。腫瘍が所望の体積に分類分けされると、非常に大きなまたは小さな腫瘍を有するマウスが淘汰された。残りのマウスは、それぞれ１０匹のマウスのグループに分けられ、右脇腹に移植された腫瘍体積によって無作為化された。

Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスのＢ１６ＯＶＡと同様にＢａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６および４Ｔ１を含む追加の腫瘍細胞型が試験された。

このプロトコルは、処置された腫瘍（原発）と未処置（対側）への影響を同時に試験するための標準モデルとして使用された。肺転移は、４Ｔ１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスでも定量化された。

ＩＸ．腫瘍内処置
マウスは、処置のためにイソフルランで麻酔された。環状プラスミドＤＮＡは、滅菌０．９％生理食塩水で１μｇ／μｌに希釈された。２６Ｇａの針を備えた１ｍｌの注射器を使用して、５０μｌのプラスミドＤＮＡが原発腫瘍の中心に注射された。注射直後にエレクトロポレーションが行われた。ＤＮＡのエレクトロポレーションは、１５００Ｖ／ｃｍ、１００μｓパルス、０．５ｃｍ、６針電極の臨床エレクトロポレーションパラメーターを備えたＭｅｄｐｕｌｓｅｒを使用して達成された。使用された代替パラメーターは、４００Ｖ／ｃｍ、１０ｍｓパルスであり、上記のように、ＢＴＸジェネレーターまたはインピーダンス分光法を組み込んだジェネレーターのいずれかを使用した。腫瘍体積は、週に２回測定された。一次および対側の総腫瘍量が２０００ｍｍ^３に達したとき、マウスを安楽死させた。

Ｘ．腫瘍内発現
インビボイメージング。先にｐＯＭＩ－Ｌｕｃ２ｐ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドで処置された腫瘍の発光を定量化するために光学イメージングシステム（Ｌａｇｏ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）が使用された。マウスは、様々な時点でイメージ化された。イメージングを実行するために、動物は、５００ｍｌ／分の酸素中２％イソフルランに曝露されることによって麻酔された。麻酔をかけた後、滅菌Ｄ－ＰＢＳで調製された１５ｍｇ／ｍｌのＤ－ルシフェリン（ゴールドバイオ）溶液の２００μｌが、２７ゲージ注射器を用いた腹腔内注射によって投与された。次に、動物は、３７℃の加熱ステージでの麻酔マニホールドに移され、５００ｍｌ／分の酸素中２％イソフルランを受け続けた。発光画像は、－９０℃に冷却されたＣＣＤカメラへの５秒間の露光を使用して、注射の２０分後に取得された。各腫瘍から放出された総光子は、半径０．５ｃｍの関心領域を使用した後処理（ＡｍｉＶｉｅｗ、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって決定された。

低電圧条件下のＥＰでのｐＯＭＩ－Ｌｕｃ２ｐ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドの導入は、インビボイメージングで視覚化されるように、エレクトロポレーションされた腫瘍においてほぼ１０倍高いレベルのルシフェラーゼ活性に至った（表７）。

フローサイトメトリー分析のための腫瘍の解離。単細胞懸濁液は、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍から調製された。マウスは、ＣＯ_２で屠殺され、腫瘍は慎重に皮膚および背後の非腫瘍組織を残して切除された。次に、切除された腫瘍は、さらなる処理のために氷冷ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）に保存された。腫瘍は、細かく切り刻まれ、１．２５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ、０．１２５ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼおよび２５Ｕ／ｍｌ ＤＮａｓｅ ＩＶを含む５ｍｌのＨＢＳＳ中で、３７℃で２０～３０分間穏やかに攪拌しながらインキュベートされた。酵素的解離後、懸濁液は、４０μｍナイロンセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通し、赤血球はＡＣＫ溶解バッファー（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）で除去された。単一細胞は、ＰＢＳフローバッファー（ＰＦＢ：２％ＦＣＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含み、Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含まないＰＢＳ）で洗浄され、遠心分離によってペレット化され、即時フローサイトメトリー分析のためにＰＦＢに再懸濁された。

ＲＦＰレポーター遺伝子を使用して見られるように、高電圧条件はタンパク質を発現する腫瘍細胞の約２％をもたらし、低電圧、より長いパルス条件はタンパク質を発現する細胞の８％超をもたらした。低電圧条件での割合は、ウイルスベクターの形質導入効率に近づいている（Ｃｕｒｒｉｅｒ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １２，４０７－４１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｃｇｔ．７７００７９９（２００５）。

タンパク質抽出のための腫瘍溶解。ＩＴ－ＥＰ（４００ｖ／ｃｍ、８回の１０ｍｓパルス）の１日後、２日後、または７日後に、腫瘍組織は屠殺したマウスから単離され、導入遺伝子の発現を決定した。腫瘍は、マウスから解剖され、液体窒素中のクライオチューブに移された。凍結した腫瘍は、３００μＬの腫瘍溶解バッファー（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル）を含む４ｍｌチューブに移され、氷上に置いて、３０秒ホモジナイズされた（ＬａｂＧｅｎ ７１０ホモジナイザー）。溶解液は、１．５ｍｌの遠心チューブに移され、１０，０００×ｇで１０分間４℃で回転させた。上清は、新しいチューブに移された。回転および移す手順は、３回繰り返された。腫瘍抽出物は、製造元の指示（マウスサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネルＭＣＹＴＯＭＡＧ－７０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って直ちに分析されるか、または－８０℃で凍結された。組換えＦｌｔ３Ｌ－ＯＶＡタンパク質は、捕捉用の抗ＦＬＴ３Ｌ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス ＭＮ、カタログ番号ＤＹ３０８）および検出用のオボアルブミン抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＰＡ１－１９６）を使用した標準ＥＬＩＳＡプロトコル（Ｒ＆Ｄシステム）によって検出された。

ＦＬＴ３Ｌ追跡抗原融合タンパク質の発現および機能を試験するために、ＯＭＩＰ２ＡベクターにおけるＦＬＴ３Ｌ（細胞外ドメイン）およびのオボアルブミン遺伝子からのペプチドの融合を構築し、上記のように腫瘍内エレクトロポレーションした。

免疫調節タンパク質のマウスホモログを含むｐＯＭＩＰ２Ａベクターの腫瘍内エレクトロポレーション後、ＥＬＩＳＡによって腫瘍ホモジネートにおいて有意なレベルのＩＬ－１２ｐ７０（表９）およびＦＬＴ３Ｌ－ＯＶＡ組換えタンパク質（表１０）が検出された。

ＸＩ．腫瘍退縮
マウスＩｌ－１２を含むＯＭＩＰ２Ａプラスミドは、並行して生成され、前臨床マウスモデルにおける腫瘍退縮および宿主免疫系の変化に関してインビボ生物学的活性を試験するために使用された。

反対側の脇腹に２つの腫瘍を持つマウスを作成するための上記のプロトコルが、処置された腫瘍（原発）と未処置（対側）への影響を同時に試験するための標準モデルとして使用された。肺転移は、４Ｔ１腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスでも定量化された。

表１１のデータは、Ｐ２Ａエクソンスキッピングモチーフを持つＩＬ１２サブユニットを発現する新しいプラスミドデザインを使用したＩＴ－ＥＰは、高電圧での内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の使用と比較して、より効率的な発現により、予想通り、腫瘍増殖（処置された原発腫瘍および遠隔の未処置腫瘍の両方）のより良い制御が得られたことを示している（表４）。

表１２のデータは、エレクトロポレーションがより低い電圧、より長いパルス条件で実行された場合、エレクトロポレーションされた腫瘍病変だけでなく遠隔の未処置の病変の両方で、特に遠隔の未処置の腫瘍でより良い腫瘍増殖阻害が見られたことを示している。これらのデータは、より高い電圧、より短いパルス条件と比較して、優れた全身性腫瘍免疫が生成されたことを示唆した。

新しいプラスミド設計および低電圧ＥＰパラメーターを使用して、腫瘍細胞移植後１０日目に１回だけ投与した後、さまざまな投与量のｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２Ａプラスミドを試験した。

原発の処置された腫瘍および遠隔の未処置の腫瘍の両方の退縮の程度は、ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａプラスミドの用量を増加させるエレクトロポレーションで増加した。ｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２Ａでは、最大の効果を得るには１０μｇのプラスミドで十分であり、新しいプラスミド設計および低電圧エレクトロポレーション条件による単回投与で有意な腫瘍増殖制御が見られた。

ｐＩＬ１２－Ｐ２Ａ＋低電圧処置マウスにおいて原発（処置）および対側（未処置）の腫瘍の両方が、腫瘍増殖の抑制の増強を示した。ＥＰ低電圧での腫瘍内エレクトロポレーションｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２Ａの改善された治療効果は、統計的に有意な延命効果にも反映された（ｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２Ａ／低Ｖでは５／６マウスが研究終了まで生存したのに対してｐＵＭＶＣ３－ＩＬ１２／高Ｖについては１／６であった）。

表１４のデータは、新しいプラスミド設計と最適化されたエレクトロポレーションパラメーターとの組み合わせで、有意な腫瘍増殖制御だけでなく、対側の未処置の腫瘍への影響によって測定される全身腫瘍免疫が、単一のＥＰ処置で達成されたことを示している。

ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２ＡのＩＴ－ＥＰがＢａｌｂ／ｃマウスにおける４Ｔ１原発腫瘍増殖および肺転移に影響を及ぼす能力も試験された。

１００万個の４Ｔ１細胞がマウスの右側腹部に皮下注射され、０．２５万個の４Ｔ１細胞が左側腹部に注射された。右側腹部のより大きな腫瘍は、空のベクター（ｐＵＭＶＣ３、Ａｌｄｅｖｒｏｎ）またはｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２ＡでのＩＴ－ＥＰの対象であった。腫瘍体積を２日ごとに測定し、１９日目にマウスを犠牲にし、肺を切除して体重を測定した。

全身性ＩＬ－１２処置が４Ｔ１腫瘍を有するマウスにおける肺転移を減少させ得ることが以前に報告されている（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２：４１１１））。我々の発見は、腫瘍の局所ＩＴ－ＥＰ処置もまた、このモデルにおいてこれらの腫瘍細胞の肺への転移を減少させたことを示している（表１５）。

Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に加えて、ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａのエレクトロポレーションはまた、原発（処置）および対側（未処置）のＢ１６ＯＶＡおよびＣＴ２６腫瘍の両方の退縮をもたらす。４Ｔ１腫瘍モデルにおいて、原発腫瘍はＥＰ／ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａの後に退縮し、マウスは、肺転移の減少を示す肺重量の有意な減少を示した。ＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２ＡのＩＴ－ＥＰは、２つの異なる系統のマウスにおける４つの異なる腫瘍モデルにおいて、腫瘍量を減少し得ることを示している。

マウスＩＬ－１２ｐ７０およびヒトＦＬＴ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１融合タンパク質の両方を発現するｐＯＭＩ－ＰＩＩＭのエレクトロポレーションは、単一の処置で原発の処置された腫瘍および遠隔の未処置腫瘍の両方の増殖を有意に減少させた（表１７および図３）。

エレクトロポレーションによって免疫調節遺伝子が導入されたマウスにおいて、空のベクター対照のエレクトロポレーションと比較して、原発腫瘍および対側腫瘍の両方の体積が大幅に減少し、処置された腫瘍微小環境内の局所効果だけでなく、全身免疫の増加も示している。

ＸＩＩ．フローサイトメトリー
ＩＴ－ｐＩＬ１２－ＥＰ処置後の様々な時点で、マウスは屠殺され、腫瘍および脾臓の組織が外科的に切除された。

脾臓細胞は、７０ミクロンのフィルターを通して脾臓を圧搾し、続いて赤血球溶解（ＲＢＣ溶解バッファー、ＶＷＲ、４２０３０１ＯＢＬ）、およびｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ ＣＬ５０３５）分画によって、単離された。リンパ球は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ－テトラマー（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔ０３００２）で染色された後、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００２２５）、抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ
１００４５１）、抗ＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００７４２）、抗ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１５５４６）、および生体染色（ｌｉｖｅ－ｄｅａｄ Ａｑｕａ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｌ－３４９６６）を含む抗体カクテルで染色された。細胞は、固定され、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で分析された。

腫瘍は、腫瘍用Ｇｅｎｔｌｅ－ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ腫瘍解離キット１３０－０９６－７３０、Ｃ－ｔｕｂｅｓ、１３０－０９３－２３７）を使用して解離し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ ｗｉｔｈ
Ｈｅａｔｅｒｓ（１３０－０９６－４２７）を使用してホモジナイズされた。細胞は、４℃で５分間、８００×ｇでペレット化され、５ｍＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＦＢ）に再懸濁され、５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ－Ｍ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）に重層された。Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅカラムは、遠心分離機で１５００×ｇ、室温、ブレーキなしで２０分間回転させた。リンパ球層は、ＰＢＦで洗浄された。細胞ペレットは、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５３１４２）を有する５００μＬのＰＦＢに穏やかに再懸濁された。９６ウェルプレートにおいて、細胞は、製造元の指示に従って、Ｂ１６ＯＶＡ腫瘍における免疫優勢抗原を表すＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマー（ＭＢＬ）の溶液と混合され、室温で１０分間インキュベートされた。以下の抗ＣＤ４５－ＡＦ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００７２３）、抗ＣＤ３－ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００２３２）、抗ＣＤ４－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １２－００４１）、抗ＣＤ８ａ－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １７－００８１）、抗ＣＤ４４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０３０２８）、抗ＣＤ１９－ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１５５５）、抗ＣＤ１２７（１３５０１０）、抗ＫＬＲＧ１（１３８４１９）を含む抗体染色カクテルが添加され、室温で３０分間インキュベートされた。細胞は、ＰＦＢで３回洗浄された。細胞は、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＦＢ中で、氷上で１分間固定された。細胞は、ＰＦＢで２回洗浄され、暗所で４℃で保存された。試料は、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で分析された。

腫瘍増殖の減少に加えて、ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａ／ＥＰ低Ｖは、ｐＵＭＶＣ３－ｍＩＬ１２／ＥＰ高Ｖと比較して、原発の処置された腫瘍におけるリンパ球の流入も増加させ、ＴＩＬ集団内のＣＤ４＋／ＣＤ８＋比を減少させた。

ｐＯＭＩ－ＩＬ１２Ｐ２Ａ／ＥＰ低Ｖ処置後の全身性腫瘍免疫は、脾臓および遠隔の未処置腫瘍でさらに評価された。

ＩＴ－ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａ－ＥＰは、Ｂ１６ＯＶＡ腫瘍の優性抗原であるオボアルブミンに由来するＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対して向けられた循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を誘導する。これらのデータは、局所的なＩＬ－１２療法がマウスの全身性腫瘍免疫につながり得ることを示している。

原発腫瘍へのＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａのエレクトロポレーションは、対側の未処置腫瘍内のＴＩＬの組成を大幅に変え得る（表２０）。これらの結果は、ＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａによる腫瘍内処置が未処置の腫瘍の免疫環境に影響を与え得、局所処置が全身性の抗腫瘍免疫応答につながることを示している。この結論は、脾臓における腫瘍抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の検出の増加（表１９）、対側腫瘍退縮（表１１、１２、１３、１４）、および肺転移の減少（表１５）によって裏付けられている。

ＸＩＩＩ．マウス遺伝子発現の分析
ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（登録商標）は、ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａ、ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭ（マウスＩＬ－１２を使用したバージョン）、およびｐＯＭＩ－ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１プラスミドのＩＴ－ＥＰによって誘発された、原発の処置された、および遠隔の未処置腫瘍における遺伝子発現の変化の分析のために使用された。腫瘍組織は、手術用メスを使用してマウスから注意深く採取され、液体窒素で瞬間冷凍された。組織は、天びん（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、モデルＭＬ５４）を使用して重さを量られた。１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム ＭＡ）が組織に添加され、氷上でプローブホモジナイザーを使用してホモジナイズされた。ＲＮＡは、製造元の指示を使用してＴｒｉｚｏｌから抽出された。混入しているＤＮＡは、ＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＥＮ０５２５）処置によって除去された。全ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定された。遺伝子発現プロファイリングは、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（登録商標）技術を使用して実行された。簡単に説明すると、５０ｎｇの全ＲＮＡは、９６℃で一晩ＮＣＯＵＮＴＥＲ（登録商標）（マウス免疫「ｖ１」発現パネルＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（登録商標）技術）とハイブリダイズされた。このパネルでは、５６１の免疫学関連マウス遺伝子と２種類の組み込み対照（陽性対照（アッセイ全体のパフォーマンスを評価するための様々な濃度のスパイクＲＮＡ）および１５の陰性対照（全ＲＮＡ入力の違いを正規化するため））をプロファイルする。次に、ハイブリダイズした試料は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ ＳＰＲＩＮＴ（商標）プロファイラーを使用して各ＲＮＡ種の頻度についてデジタル分析された。生のｍＲＮＡ存在頻度は、ＮＳＯＬＶＥＲ（商標）分析ソフトウェア２．５パックを使用して分析された。このプロセスにおいて、ハウスキーピング遺伝子の幾何平均、陰性対照の平均、および陽性対照の幾何平均から導出された正規化係数が使用された。

ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａエレクトロポレーション後の４Ｔ１およびＭＣ－３８腫瘍モデルにおける原発の処置された、および遠隔の未処置の腫瘍からの抽出物の追加のＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（登録商標）遺伝子発現分析は、リンパ球および単球細胞表面マーカーだけでなくＩＮＦ－γ調節遺伝子の同様の上方制御を明らかにし、腫瘍微小環境でのＩＬ－１２のこれらの効果は、複数のマウス腫瘍モデルに一般化できることを示している。

原発の処置された、および遠隔の未処置の腫瘍からの組織の遺伝子発現分析は、ｐＯＭＩＰ２Ａ－ｍＩＬ１２のＩＴ－ＥＰによる腫瘍ＴＩＬの堅牢な増加を示すフローサイトメトリー分析を裏付けている。さらに、インターフェロンガンマ調節遺伝子の増加は、腫瘍内の免疫刺激環境の誘導を示唆している。チェックポイントタンパク質の発現の顕著な増加は、ＩＴ－ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａ－ＥＰが組み合わせて使用されるチェックポイント阻害剤の作用についての基質を増加させ得ることを示している。

４００Ｖ／ｃｍおよび８回の１０ｍｓパルスを使用したｐＯＭＩ－ＰＩＩＭによるＢ１６－Ｆ１０腫瘍の腫瘍内エレクトロポレーションの７日後、腫瘍は外科的に除去され、ＩＬ－１２およびＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１腫瘍内発現の組み合わせによって媒介される遺伝子発現変化の分析のために抽出されたＲＮＡ。

複数の遺伝子を発現させるためのプラスミドのエレクトロポレーション後のＩＬ－１２タンパク質の腫瘍内発現は、堅牢な適応免疫応答に関連する遺伝子発現の顕著な変化を依然として誘発した。ＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質の腫瘍内発現の追加は、処置された腫瘍における抗原提示に関連する遺伝子の発現の測定可能な増加を誘発した。

ｍＩＬ－１２およびＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１の両方をコードするプラスミドの腫瘍内エレクトロポレーションは、局所および全身の両方の抗腫瘍免疫の増加と一致する腫瘍内遺伝子発現の有意な変化を示し、このマウスモデルにおける原発の処置された、および遠隔の未処置の腫瘍の両方の増殖の制御に対するこの療法の強力な効果を裏付ける（表１７および図３）。

ヒトＦＬＴ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質のみをコードするＯＭＩプラスミドの腫瘍内エレクトロポレーションも、腫瘍の退縮および腫瘍ＴＩＬの免疫表現型の変化に影響を及ぼした。

Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質を発現するためのプラスミドの腫瘍内エレクトロポレーションは、ＩＬ－１２共発現の非存在下で免疫細胞およびＡＰＭ関連遺伝子発現に測定可能な効果を示し、ＩＴ－ＥＰによって導入された場合にＦｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１は腫瘍内免疫調節に対して独立した効果を有することを示している（表２６、２７、２８、２９）。

ＸＩＶ．フローサイトメトリーによる追跡抗原に対する宿主応答の検出
Ｆｌｔ３Ｌに融合した追跡抗原をコードするプラスミドのエレクトロポレーションに対する宿主応答を試験するために、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍は、ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａ－ＦＬＴ３Ｌ－ＯＶＡでエレクトロポレーションされ、ＯＶＡ抗原に対する宿主応答が測定された。マウスは、右側腹部に１００万個のＢ１６－Ｆ１０細胞を注射された。７日後、腫瘍は、ｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａ－ＦＬＴ３Ｌ－ＯＶＡ、空のベクターをエレクトロポレーションされるか、未処置のままにされた。エレクトロポレーションは、電気化学インピーダンスセンシング（ＥＩＳ）を備えたジェネレーター、例えば、ＷＯ２０１６／１６１２０１を参照、４００Ｖ／ｃｍ、８回の１０ｍｓのパルスを使用して行われた。マウスＩＬ－１２を含むｐＯＭＩ－ＰＩＩＭと同様に（表１７）、この実験においてｐＯＭＩ－ｍＩＬ１２Ｐ２Ａ－ＦＬＴ３Ｌ－ＯＶＡで腫瘍の退縮が観察された。

マウスにおける追跡抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出は、腫瘍へのｍＩＬ１２およびＦＬＴ３Ｌ－ＯＶＡ融合タンパク質をコードするプラスミドのＩＴ－ＥＰの７日後に鼠径部リンパ節において試験された。

マウスは屠殺され、鼠径部リンパ節が切除され、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＦＢ）中ですりつぶされ、７０マイクロフィルターで濾された。細胞は、４℃、３００×ｇの遠心分離機でペレット化され、ＰＦＢで洗浄され、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）で数えられた。

リンパ節細胞ペレットは、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５３１４２）を有するＰＦＢに穏やかに再懸濁された。次に、製造業者の指示に従って、細胞は、ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマー（ＭＢＬ）の溶液と混合され、室温で１０分間インキュベートされた。以下Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｌ３４９６６）、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００２２８）、抗ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１５５５５）、抗ＣＤ１２７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ８ａ（ＭＢＬ Ｄ２７１－４）、抗ＣＤ４４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０３０２８）、抗ＰＤ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０９１１０）、抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００５４７）、抗ＫＬＲＧ１（１３８４１９）、抗ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０４４４８）を含む抗体染色カクテルが添加され、４°で３０分間インキュベートされた。細胞は、ＰＦＢで洗浄された。細胞は、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＦＢ中で、氷上で１分間固定された。細胞は、ＰＦＢで３回洗浄され、フローサイトメトリー（ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０）によって分析された。

マウスの代理追跡抗原としてＯＶＡを使用して、ＦＬＴ３Ｌ融合タンパク質として腫瘍にエレクトロポレーションされた追跡抗原に対して向けられた循環Ｔ細胞を容易に検出し得ることを示す（表３０）。

ＸＶ．マウスの尾静脈への流体力学的注射によるプラスミドの導入
ＯＭＩプラスミドから発現されたＦＬＴ３Ｌ融合タンパク質のインビボ活性は、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの尾静脈への５μｇのプラスミドの流体力学的注射によって試験された。７日後、マウスは屠殺され、脾臓は切除され、重さを量られ、そしてフローサイトメトリーによる細胞組成の変化の分析のために解離された。

脾細胞は、上記のように単離され、ＰＦＢで洗浄され、Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５３１４２）を有するＰＦＢに再懸濁され、室温で１０分間インキュベートされた。以下抗ＮＫ１．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０８７３１）、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｌ３４９６６）、抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １００５４７）、抗Ｆ４／８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １２３１４９）、抗ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１５５５５）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０７６４５）、抗ＣＤ８（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄ２７１－４）、抗ＣＤ８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０４７２２）、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１７３０８）、抗ＣＤ４０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １２４６３０）、抗ＧＲ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０８４２４）、抗ＣＤ１１ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １１７３２４）、抗ＣＤ８６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０５０２４）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ １０１２１２）を含む抗体カクテルが添加された。３７℃でインキュベート。細胞は、ＰＦＢで３回洗浄され、フローサイトメトリー（ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０）によって分析された。

ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質の一部（８０－１８０ａａ）に融合したヒトＦＬＴ３ＬまたはヒトＦＬＴ３Ｌをコードするプラスミドの導入は、脾臓におけるＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞（ＤＣ）の増加をもたらす（表３１）。さらに、これらのＤＣの大部分は、高レベルのＭＨＣクラスＩＩを示し、成熟したＤＣであることを示している。さらに、これらのＤＣの一部は、より高いレベルの細胞表面ＣＤ８６発現を示し、それらが活性化されたことを示している。

これらのデータは、これらのプラスミドから発現され、インビボでのＤＣ成熟および活性化をもたらす活性ＦＬＴ３リガンドへの曝露と一致している（Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ
ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｂｌｏｏｄ ９６：８７８）

ＸＶＩ．Ｆｌｔ３Ｌ融合タンパク質でのインビトロヒト樹状細胞の成熟
ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭから発現されたヒトＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ１融合タンパク質は、エクスビボ培養された未成熟なヒトＤＣを成熟させる能力について試験された。これを達成するために、ＤＣは、標準プロトコル（Ｐｏｌｌａｃｋ ＳＭ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｇｕｉｄｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｙｎｏｖｉａｌ Ｓａｒｃｏｍａ ａｎｄ Ｍｙｘｏｉｄ Ｒｏｕｎｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ．Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｍｅｅｔｉｎｇ）を使用して培養され、最初に健康なドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単球を分離し、次にそれらの単球をＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を有する無血清培地で５～７日間培養してから処置した。次に、これらの未成熟ＤＣは、未処置のままか、またはｐＯＭＩ－ＰＩＩＭ、空の陰性対照ベクター（ＥＶ）、もしくは、Ｆｌｔ３に結合できず、ゆえに不活性であるべきであるＦｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ１融合タンパク質の発現の変異遺伝子（Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｈ８Ｒ）を持つ対照ベクターのいずれかで事前にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞で馴化した培地で、同様に陽性対照として使用した組換え精製ＦＬＴ３Ｌで、４８時間処置された。

フローサイトメトリーによって測定されたとおり、ＣＤ８０およびＣＤ８６細胞表面マーカーは、ＣＤ１１ｃ^＋ＤＣ－ＳＩＧＮ^＋であるすべての細胞に対するＦＬＴ３Ｌを介したＤＣ活性についての主要な測定基準として使用された。ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭでトランスフェクションされた細胞由来の馴化培地は、空のベクターまたはＦｌｔ３Ｌ（Ｈ８Ｒ）不活性変異体をコードするベクターを有する細胞由来のいずれかの培地と比較して、ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方の誘導が顕著に多かった（図４）。ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭプラスミドでトランスフェクションされた細胞からの培養上清は、陽性対照として使用された組換えＦｌｔ３Ｌタンパク質と比較して同様の活性を有した。これらの研究は、再現性を確保するために繰り返された。未処置と比較して、対照上清（任意のプラスミド由来タンパク質を含まない）の添加で、いくつかのＣＤ８０／ＣＤ８６発現の非特異的誘導が観察された。

Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹＥＳＯ形質導入ＤＣとの共培養によるＮＹ－ＥＳＯ－１特異的Ｔ細胞の刺激。事前に確立されたＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＣＴＬ系統は、形質導入されたＤＣ（セクションＸＶＩで説明）を使用して刺激され、細胞内サイトカイン、ＴＮＦαおよびＩＮＦ－γについてフローサイトメトリー染色によって分析された。これらのデータは、プラスミド由来のＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１でパルスされたＤＣは、不活性な変異体（Ｆｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｈ８Ｒ））ではなく、ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＣＴＬ株を活性化し得ることを示している（図５）。

これらのデータは、ｐＯＭＩ－ＰＩＩＭから発現されたヒトＦｌｔ３Ｌ－ＮＹ－ＥＳＯ１融合タンパク質は、初代未成熟ヒト樹状細胞の成熟を誘導し得ることを示した。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１３の核酸配列を含む、発現ベクター。
（項目２）
発現ベクターが、前記配列番号１３の核酸配列からなる、項目１に記載の発現ベクター。
（項目３）
配列番号９のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、発現ベクター。
（項目４）
前記核酸配列が、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、項目３に記載の発現ベクター。
（項目５）
前記核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、項目３または４に記載の発現ベクター。
（項目６）
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、Ｉｇκプロモーター、ｍＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターからなる群から選択される、項目５に記載の発現ベクター。
（項目７）
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、項目６に記載の発現ベクター。
（項目８）
前記発現ベクターが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む、項目７に記載の発現ベクター。
（項目９）
項目１～８のいずれか一項に記載の治療有効量の発現ベクターを含む、医薬組成物。
（項目１０）
項目９に記載の医薬組成物を腫瘍に注射することと、前記腫瘍に少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すこととを含む、対象における腫瘍を治療する、方法。
（項目１１）
前記エレクトロポレーションパルスが、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの場の強度を有する、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記エレクトロポレーションパルスが、約１００μｓ～約５０ｍｓのパルス長を有する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すことが、１～１０回のパルスを施すことを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すことが、６～８回のパルスを施すことを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記エレクトロポレーションパルスが、２００Ｖ／ｃｍ～５００Ｖ／ｃｍの場の強度および１００μｓ～５０ｍｓのパルス長を有する、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記エレクトロポレーションパルスが、約３５０～４５０Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を有する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記腫瘍に少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すことが、約４００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を有する８回のエレクトロポレーションパルスを施すことを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１８）
前記エレクトロポレーションパルスが、電気化学的インピーダンス分光法が可能な発生器によって送達される、項目１０～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記対象が、ヒトである、項目１０～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記腫瘍が、黒色腫、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、メルケル細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、および頭頸部扁平上皮細胞癌の群から選択される、項目１０～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
対象における癌の治療において使用するための、項目９に記載の医薬組成物。
（項目２２）
癌を治療するための薬剤の製造における、項目９に記載の医薬組成物の、使用。
（項目２３）
前記医薬組成物が、前記腫瘍への注射、および少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスの実施による前記腫瘍への送達のために製剤化される、項目９に記載の医薬組成物。

Claims (19)

1. 配列番号９のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、発現ベクター。
2. 前記核酸配列が、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の発現ベクター。
3. 前記核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１または２に記載の発現ベクター。
4. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、Ｉｇκプロモーター、ｍＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、α－アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターからなる群から選択される、請求項３に記載の発現ベクター。
5. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項４に記載の発現ベクター。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の治療有効量の発現ベクターを含む、医薬組成物。
7. 対象における腫瘍を治療するための請求項６に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物を前記腫瘍に注射することと、前記腫瘍に少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すこととを特徴とする、医薬組成物。
8. 前記エレクトロポレーションパルスが、約２００Ｖ／ｃｍ～約１５００Ｖ／ｃｍの場の強度を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記エレクトロポレーションパルスが、約１００μｓ～約５０ｍｓのパルス長を有する、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すことが、１～１０回のパルスを施すことを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すことが、６～８回のパルスを施すことを含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記エレクトロポレーションパルスが、２００Ｖ／ｃｍ～５００Ｖ／ｃｍの場の強度および１００μｓ～５０ｍｓのパルス長を有する、請求項８に記載の医薬組成物。
13. 前記エレクトロポレーションパルスが、約３５０～４５０Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を有する、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 前記腫瘍に少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスを施すことが、約４００Ｖ／ｃｍの場の強度および約１０ｍｓのパルス長を有する８回のエレクトロポレーションパルスを施すことを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
15. 前記エレクトロポレーションパルスが、電気化学的インピーダンス分光法が可能な発生器によって送達される、請求項７～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
16. 前記対象が、ヒトである、請求項７～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
17. 前記腫瘍が、黒色腫、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、メルケル細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、および頭頸部扁平上皮細胞癌の群から選択される、請求項７～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
18. 対象における癌の治療において使用するための、請求項６に記載の医薬組成物。
19. 前記医薬組成物が、腫瘍への注射、および少なくとも１回のエレクトロポレーションパルスの実施による前記腫瘍への送達のために製剤化される、請求項６に記載の医薬組成物。
    

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