JP2017518764A - 癌の処置のための多標的指向RNAi - Google Patents
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Abstract
第1の標的遺伝子の発現を減少させる第1のRNAi分子、第1または第2の標的遺伝子の発現を減少させる第2のRNAi分子、および任意で、第1、第2、または第3の標的遺伝子の発現を減少させる第3のRNAi分子を含み、これらのRNAi分子が、例えば変異KRAS、SRC-3、EGFR、PIK3、NCOA3、またはERalpha1の発現レベルを減少させ、例えばmiRNA、shRNA、または二機能性shRNAであり得る、2つ以上の遺伝子の発現を減少させることができるRNAiを製造および使用するための組成物および方法を、本発明は包含する。
Description
関連出願の相互参照
発明の技術分野
本発明は、概して、癌処置の分野、より具体的には癌の処置に使用されるRNAiコンストラクトに関する。
発明の技術分野
本発明は、概して、癌処置の分野、より具体的には癌の処置に使用されるRNAiコンストラクトに関する。
配列表の参照
本願は、37 C.F.R.§1.821-1825による要求にしたがい別途電子形式で提出された配列表を含んでいる。
本願は、37 C.F.R.§1.821-1825による要求にしたがい別途電子形式で提出された配列表を含んでいる。
発明の背景
本発明の範囲を限定することなく、その背景を、K-rasおよび肺癌に関連して記載する。
本発明の範囲を限定することなく、その背景を、K-rasおよび肺癌に関連して記載する。
KRAS(Kirsten-ras)オンコジーンは、膵管腺癌(PDAC)、結腸直腸、および非小細胞肺癌(NSCLC)の高い割合で変異する。KRAS変異を有する大部分のPDAC(70〜90%)患者において、5年生存率は、5%未満である。KRASは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、上皮成長因子受容体(EGFR)を含む複数の細胞内シグナル伝達経路の不可欠な構成要素である。KRASにおける変異の圧倒的多数は、コドン12または13において単一アミノ酸置換をもたらす単一ヌクレオチド体細胞変異である。G12D、G12V、G12R、およびG12C KRAS変異は、PADC患者において見出されるKRAS変異の>90%を占める。KRAS変異は、原則的に、構成的に活性なKRAS、および調節されない下流シグナル伝達をもたらす。
標的指向薬剤、例えば抗体セツキシマブ(結腸直腸癌の場合)および低分子阻害剤ベムラフェニブ(BRAF変異黒色腫の場合)は、KRAS変異を有する患者においてはほとんど効果がない。結果として、有効な癌治療戦略には、野生型機能は控えてKRAS変異への選択性が必要とされる。KRAS変異を伴う癌のための、組成物、方法、および処置に対する要望はなおも大きいままである。
Slackらに対して発行された米国特許第7,893,034号(特許文献1)は、「Regulation of oncogenes by microRNAs」を表題とするものである。簡潔に述べると、これらの発明者は、ヒトオンコジーンを調節する天然に存在するmiRNAの標的指向およびその使用方法を記載している。発明者らにより記載される方法および組成物において使用するのに適した核酸は、プリmiRNA、プレmiRNA、成熟miRNAまたは成熟miRNAの生物学的活性を保持するそれらの変種のフラグメント、およびプリmiRNA、プレmiRNA、成熟miRNA、それらのフラグメントもしくは変種、またはmiRNAの調節エレメントをコードするDNAを含むがこれらに限定されないと説明されている。発明者らはまた、癌の少なくとも1つの症状または兆候の処置または予防を必要とする患者に対して核酸を含む組成物を投与することを考察している。1つの具体的態様において、組成物は、1つまたは複数のオンコジーンの遺伝子発現を阻害するのに有効な量で投与されることが説明されている。癌の少なくとも1つの症状または兆候の処置または予防方法も記載されている。
1つの態様において、KRASの発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、ステロイド受容体コアクチベーター-3(SRC-3)の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子、および上皮成長因子受容体(EGFR)の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子を含み、二機能性RNA分子が、変異K-ras、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができる、3つ以上の遺伝子の発現を減少させることができる二機能性shRNAを、本発明は含む。1つの局面において、二機能性shRNAは、ベクターに挿入される。別の局面において、二機能性shRNAは、SEQ ID NO:1、3、42、または43により定義されるベクターに挿入される。別の局面において、二機能性shRNAは、SEQ ID NO:2、4、40、または41により定義される少なくとも1つの核酸配列を含む。別の局面において、第1の二機能性RNAの少なくとも1つの標的部位は、G12C、G12D、G12V、またはG12R変異の少なくとも1つを有するヒトKRAS遺伝子としてさらに定義される変異KRAS遺伝子である。別の局面において、正常なRASの発現は、第1の二機能性RNA分子によって機能的な生理学的レベル未満に減少されない。別の局面において、SRC-3またはEGFRの少なくとも一方は、正常なヒト遺伝子である。
本発明の別の態様は、プロモーターおよび当該プロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含む発現ベクターであって、インサートが、変異KRASの発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、SRC-3の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子、および上皮成長因子受容体(EGFR)の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子を含み、二機能性RNA分子が、変異KRAS、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができ、1つまたは複数のshRNAが、KRAS、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させる二機能性RNA分子を含む発現ベクターを含む。1つの局面において、ベクターは、SEQ ID NO:1、3、42、または43により定義される少なくとも1つの配列を含む。別の局面において、二機能性RNA分子は、SEQ ID NO:2、4、40、または41を含む。別の局面において、第1、第2、および第3の二機能性shRNAの配列構成は5'ステムアーム-19ヌクレオチド標的を含み、K-ras-TA-15ヌクレオチドループ-19ヌクレオチド標的相補的配列-3'ステムアーム-スペーサー-5'ステムアーム-19ヌクレオチド標的変種-TA-15ヌクレオチドループ-19ヌクレオチド標的相補的配列-3'ステムアームである。別の局面において、ベクターは、SEQ ID NO:1または2から選択される少なくとも1つの配列を含む。別の局面において、核酸インサートは、1つまたは複数の変異KRASおよびEGFRおよびSRC-3の発現を減少させることができる1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーの二機能性shRNAインサートを含む。別の局面において、SRC-3またはEGFRの少なくとも一方は、正常なヒト遺伝子である。
本発明のさらに別の態様は、治療剤キャリア、ならびにプロモーターおよび当該プロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含む発現ベクターを含む治療送達システムであって、核酸インサートが、変異KRASの発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、SRC-3の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子および上皮成長因子受容体(EGFR)の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子をコードし、二機能性RNA分子が、変異KRAS、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができ、1つまたは複数のshRNAが、KRAS、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化する二機能性RNA分子を含む治療送達システムである。別の局面において、治療剤キャリアは、圧縮DNAナノ粒子または1つもしくは複数のポリカチオンを有する圧縮DNAナノ粒子である。別の局面において、1つまたは複数のポリカチオンは、10 kDAポリエチレングリコール(PEG)置換システイン・リジン3マーペプチド(CK30PEG10k)である。別の局面において、圧縮DNAナノ粒子はさらに、リポソーム、可逆的にマスクされたリポソームまたは二層重積型ベシクル(bilamellar invaginated vesicle; BIV)の少なくとも1つでカプセル化される。別の局面において、ベクターは、SEQ ID NO:1、3、42、または43によって定義される少なくとも1つの配列を含む。別の局面において、核酸インサートは、SEQ ID NO:2、4、40、または41を含む。
本発明のさらに別の態様は、KRAS、SRC-3、およびEGFR遺伝子を発現する標的組織に1つまたは複数のshRNAを送達する方法であって、以下の工程を含む方法を含む:プロモーターおよび当該プロモーターに機能的に連結された1つまたは複数のshRNAをコードする核酸インサートを含む発現ベクターを調製する工程であって、1つまたは複数のshRNAがプロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含み、インサートが、変異SRC-3の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、SRC-3の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子、および上皮成長因子受容体(EGFR)の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子を含み、二機能性RNA分子が、変異KRAS、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができ、1つまたは複数のshRNAが、KRAS、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させる二機能性RNA分子を含む、工程;発現ベクターを治療剤キャリアと組み合わせる工程であって、治療剤キャリアがリポソームを含む、工程;ならびに治療有効量の発現ベクター・治療剤キャリア複合体を、それを必要とする患者に投与する工程。1つの局面において、治療剤キャリアは、圧縮DNAナノ粒子である。別の局面において、DNAナノ粒子は、1つまたは複数のポリカチオンと共に圧縮され、1つまたは複数のポリカチオンは、10 kDAポリエチレングリコール(PEG)置換システイン・リジン3マーペプチド(CK30PEG10k)または30マーリジン縮合ペプチドを含む。別の局面において、圧縮DNAナノ粒子はさらに、リポソームでカプセル化され、リポソームは1つまたは複数の受容体標的指向部分を含む二層重積型ベシクル(BIV)である。
本発明のさらに別の態様は、ヒト対象において腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、以下の工程を含む方法を含む:腫瘍細胞増殖の抑制を必要とするヒト対象を特定する工程;ならびに腫瘍細胞増殖を抑制するのに十分な量の治療剤キャリア複合体中の発現ベクターをヒト対象に投与する工程であって、発現ベクターがプロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含み、核酸インサートが、変異KRAS遺伝子の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、SRC-3遺伝子の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子、および上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子を含み、二機能性RNA分子が、変異KRAS、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができ、この阻害が腫瘍細胞のアポトーシス、増殖停止または浸潤減少をもたらす工程。1つの局面において、治療剤キャリアは、二層重積型ベシクル(BIV)を含む。別の局面において、治療剤キャリアは、低分子二価ベータ・ターン模倣体を含む1つまたは複数の受容体標的指向部分を含む。別の局面において、投与工程は、腫瘍内、皮下、静脈内、腹腔内、筋内、および静脈内注射からなる群より選択される。別の局面において、投与工程は、DNA:リポプレックスの注射を含む。別の局面において、腫瘍細胞増殖は、変異KRASを発現する。別の局面において、腫瘍細胞増殖は肺癌である。別の局面において、この方法はさらに、第2の抗新生物剤との併用療法を含む。
本発明のさらに別の態様は、肺癌の処置に有用であると考えられる候補薬物を評価する方法であって、以下の工程を含む方法を含む:
(a)以下:肺癌細胞または組織における、少なくとも野生型KRASならびに1つまたは複数の変異KRAS、EGFR、およびSRC-3遺伝子の発現のレベル;肺癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS、EGFR、およびSRC-3遺伝子の発現低下を伴う細胞環境下での候補遺伝子または候補遺伝子群の発現のレベル;肺癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS、EGFR、およびSRC-3遺伝子の発現低下を含む細胞の表現型に対する候補薬物の効果、のうち1つまたは複数を測定する工程;
(b)肺癌細胞または組織の第1のサブセットに対して候補薬物を、および肺癌細胞または組織の第2のサブセットに対してプラセボを投与する工程;
(c)候補薬物またはプラセボの投与後に工程(a)を繰り返す工程;ならびに(d)肺癌細胞または組織の第2のサブセットにおいて生じる減少と比べて統計的に有意である、KRAS変異体、EGFR、およびSRC-3を発現する細胞環境と比較して変異KRAS、EGFR、およびSRC-3の発現が減少した細胞環境において決定された表現型を生じさせるのに、候補薬物が効果的であるかどうかを決定する工程であって、統計的に有意な減少が、候補薬物が肺癌の処置に有用であることを示す工程。別の局面において、細胞または組織はさらに、1つまたは複数の検出可能な遺伝子を発現し、それは野生型RASおよび1つまたは複数の変異KRASを含むよう修飾されており、検出可能な標識の発現レベルは、野生型RASおよび1つまたは複数の変異KRASに対する候補物質の効果と相関する。
(a)以下:肺癌細胞または組織における、少なくとも野生型KRASならびに1つまたは複数の変異KRAS、EGFR、およびSRC-3遺伝子の発現のレベル;肺癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS、EGFR、およびSRC-3遺伝子の発現低下を伴う細胞環境下での候補遺伝子または候補遺伝子群の発現のレベル;肺癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS、EGFR、およびSRC-3遺伝子の発現低下を含む細胞の表現型に対する候補薬物の効果、のうち1つまたは複数を測定する工程;
(b)肺癌細胞または組織の第1のサブセットに対して候補薬物を、および肺癌細胞または組織の第2のサブセットに対してプラセボを投与する工程;
(c)候補薬物またはプラセボの投与後に工程(a)を繰り返す工程;ならびに(d)肺癌細胞または組織の第2のサブセットにおいて生じる減少と比べて統計的に有意である、KRAS変異体、EGFR、およびSRC-3を発現する細胞環境と比較して変異KRAS、EGFR、およびSRC-3の発現が減少した細胞環境において決定された表現型を生じさせるのに、候補薬物が効果的であるかどうかを決定する工程であって、統計的に有意な減少が、候補薬物が肺癌の処置に有用であることを示す工程。別の局面において、細胞または組織はさらに、1つまたは複数の検出可能な遺伝子を発現し、それは野生型RASおよび1つまたは複数の変異KRASを含むよう修飾されており、検出可能な標識の発現レベルは、野生型RASおよび1つまたは複数の変異KRASに対する候補物質の効果と相関する。
本発明のさらに別の態様は、ヒト対象において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、以下の工程を含む方法を含む:ヒト対象から腫瘍細胞サンプルを得る工程;腫瘍細胞増殖を防止するために抑制を必要とするヒト対象において1つまたは複数の標的遺伝子または遺伝子群を同定する工程;腫瘍細胞サンプルにおいて同定された遺伝子または遺伝子群を特異的に標的指向する2つ以上のRNAi核酸セグメントを発現するインサートを含む発現ベクターを構築する工程であって、インサートが、腫瘍細胞内で同定された同一または異なる標的遺伝子または遺伝子群の発現を減少させる第1および第2のRNAi核酸を含む工程;2つ以上のRNAi核酸セグメントを発現させるのに十分な量の治療剤キャリア複合体中の発現ベクターをヒト対象に投与する工程;ならびに遺伝子または遺伝子群が標的腫瘍細胞において発現ベクターによってノックダウンされたかどうかを決定する工程であって、この阻害が腫瘍細胞のアポトーシス、増殖停止または浸潤減少をもたらす工程。1つの局面において、RNAiは、miRNAおよびshRNAおよびsiRNAまたはbi-shRNAのうち少なくとも1つから選択される。別の局面において、第1および第2の核酸は両方とも二機能性shRNAをコードする。別の局面において、第1または第2の核酸のうち少なくとも一方は、K-RASを標的指向し、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49またはSEQ ID NO:50〜126から選択される。別の局面において、第1または第2の核酸のうち少なくとも一方はSRC-3を標的指向し、SEQ ID NO:27〜36から選択される。別の局面において、インサートはさらに、1つまたは複数の変異遺伝子または正常遺伝子の発現を減少させることができる3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーのRNAiインサートを含む。
別の態様において、第1の遺伝子標的の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、第2の遺伝子標的の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子、および第3の遺伝子標的の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子を含み、二機能性RNA分子の各々が、第1、第2、および第3の遺伝子標的の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができる、3つ以上の遺伝子の発現を減少させることができる二機能性shRNA組成物を、本発明は含む。別の局面において、二機能性shRNAの各々は、ベクターに挿入される。別の局面において、この組成物は、SEQ ID NO:1、3、46、または47により定義されるベクターとしてさらに定義される。別の局面において、二機能性shRNAは、SEQ ID NO:2、4、44、または45により定義される少なくとも1つの核酸配列を含む。別の局面において、第1の二機能性RNAの少なくとも1つの標的部位は、G12C、G12D、G12V、またはG12R変異のうち少なくとも1つを有するヒトKRAS遺伝子としてさらに定義される変異KRAS遺伝子を選択的に標的指向する。別の局面において、少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子が、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される。別の局面において、正常なRASの発現は、第1の二機能性RNA分子によって機能的な生理学的レベル未満に減少されない。別の局面において、SRC-3またはEGFRのうち少なくとも一方は、正常なヒト遺伝子である。
別の態様において、プロモーターおよび当該プロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含む発現ベクターであって、インサートが、第1の標的遺伝子の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、第2の標的遺伝子の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子および第3の標的遺伝子の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子を含み、二機能性RNA分子が、第1、第2、および第3の標的遺伝子の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができ、1つまたは複数のshRNAが、第1、第2、および第3の標的遺伝子の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させる二機能性RNA分子を含む発現ベクターを、本発明は含む。別の局面において、この組成物は、SEQ ID NO:1、3、46、または47により定義されるベクターとしてさらに定義される。別の局面において、二機能性shRNAは、SEQ ID NO:2、4、44、または45により定義される少なくとも1つの核酸配列を含む。別の局面において、少なくとも1つの標的遺伝子は、G12C、G12D、G12V、またはG12R変異のうち少なくとも1つを有するヒトKRAS遺伝子としてさらに定義される変異KRAS遺伝子を選択的に標的指向する二機能性shRNAを含む。別の局面において、少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子は、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される。別の局面において、核酸インサートは、1つまたは複数の変異遺伝子または正常遺伝子の発現を減少させることができる1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーの二機能性shRNAインサートを含む。
別の態様において、本発明は、治療剤キャリアならびにプロモーターおよび当該プロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含む発現ベクターを含む治療送達システムであって、核酸インサートが、第1の遺伝子標的の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、第2の遺伝子標的の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子および第3の遺伝子標的の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子をコードし、二機能性RNA分子の各々が、第1、第2、および第3の遺伝子標的の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができる治療送達システムを含む。1つの局面において、この組成物は、SEQ ID NO:1、3、46、または47により定義されるベクターとしてさらに定義される。別の局面において、二機能性shRNAは、SEQ ID NO:2、4、44、または45により定義される少なくとも1つの核酸配列を含む。別の局面において、少なくとも1つの遺伝子標的は、G12C、G12D、G12V、またはG12R変異のうち少なくとも1つを有するヒトKRAS遺伝子としてさらに定義される変異KRAS遺伝子を選択的に標的指向する二機能性shRNAを含む。別の局面において、少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子は、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される。別の局面において、核酸インサートは、1つまたは複数の変異遺伝子または正常遺伝子の発現を減少させることができる1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーの二機能性shRNAインサートを含む。
別の態様において、本発明は、KRAS、SRC-3、およびEGFR遺伝子を発現する標的組織に1つまたは複数のshRNAを送達する方法であって、以下の工程を含む方法を含む:プロモーターおよび当該プロモーターに機能的に連結された1つまたは複数のshRNAをコードする核酸インサートを含む発現ベクターを調製する工程であって、1つまたは複数のshRNAがプロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含み、インサートが、第1の遺伝子標的の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、第2の遺伝子標的の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子および第3の遺伝子標的の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子を含み、二機能性RNA分子の各々が、第1、第2、および第3の遺伝子標的の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができる、工程;発現ベクターを治療剤キャリアと組み合わせる工程であって、治療剤キャリアがリポソームを含む、工程;ならびに治療有効量の発現ベクター・治療剤キャリア複合体を、それを必要とする患者に投与する工程。別の局面において、この組成物は、SEQ ID NO:1、3、46、または47により定義されるベクターとしてさらに定義される。別の局面において、二機能性shRNAは、SEQ ID NO:2、4、44、または45により定義される少なくとも1つの核酸配列を含む。別の局面において、少なくとも1つの遺伝子標的は、G12C、G12D、G12V、またはG12R変異のうち少なくとも1つを有するヒトKRAS遺伝子としてさらに定義される変異KRAS遺伝子を選択的に標的指向する二機能性shRNAを含む。別の局面において、少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子は、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される。別の局面において、核酸インサートは、1つまたは複数の変異遺伝子または正常遺伝子の発現を減少させることができる1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーの二機能性shRNAインサートを含む。
別の態様において、本発明は、ヒト対象において腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、以下の工程を含む方法を含む:腫瘍細胞増殖の抑制を必要とするヒト対象を特定する工程;ならびに腫瘍細胞増殖を抑制するのに十分な量の治療剤キャリア複合体中の発現ベクターをヒト対象に投与する工程であって、発現ベクターがプロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含み、核酸インサートが、変異KRAS遺伝子の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子、SRC-3遺伝子の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子、および上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子を含み、二機能性RNA分子が、変異KRAS、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができ、この阻害が腫瘍細胞のアポトーシス、増殖停止または浸潤減少をもたらす工程。別の局面において、核酸インサートは、SEQ ID NO:2、4、42、または43を含む。別の局面において、K-RASに対する少なくとも1つの核酸インサートは、SEQ ID NO:5〜26から選択される。別の局面において、SRC-3に対する少なくとも1つの核酸インサートは、SEQ ID NO:27〜36から選択される。別の局面において、EGFRに対する少なくとも1つの核酸インサートは、SEQ ID NO:48〜49から選択される。別の局面において、投与工程は、腫瘍内、皮下、静脈内、腹腔内、筋内、および静脈内注射からなる群より選択される。別の局面において、腫瘍細胞増殖は、変異KRASを発現する。別の局面において、腫瘍細胞増殖は、肺癌である。別の局面において、この方法は、第2の抗新生物剤との併用療法をさらに含む。
別の態様において、本発明は、癌の処置に有用であると考えられる候補薬物を評価する方法であって、以下の工程を含む方法を含む:
(a)以下:癌細胞または組織における、少なくとも野生型KRASおよび1つまたは複数の変異KRASならびに2つ以上の標的遺伝子の発現のレベル;癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS遺伝子および2つ以上の標的遺伝子の発現低下を伴う細胞環境における候補遺伝子または候補遺伝子群の発現のレベル;癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS遺伝子および2つ以上の標的遺伝子の発現低下を含む細胞の表現型に対する候補薬物の効果、のうち1つまたは複数を測定する工程;
(b)癌細胞または組織の第1のサブセットに対して候補薬物を、および癌細胞または組織の第2のサブセットに対してプラセボを投与する工程;
(c)候補薬物またはプラセボの投与後に工程(a)を繰り返す工程;ならびに
(d)肺癌または組織の第2のサブセットにおいて生じる減少と比べて統計的に有意である、正常KRASを発現する細胞環境と比較して変異KRASおよび2つ以上の標的遺伝子の発現が減少した細胞環境において決定された表現型を生じさせるのに、候補薬物が効果的であるかどうかを決定する工程であって、統計的に有意な減少が、候補薬物が癌の処置に有用であることを示す工程。別の局面において、癌は、脳、膀胱、血液、骨、乳房、子宮頸部、結腸直腸、胃腸、内分泌、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または甲状腺から選択される。別の局面において、変異KRASは選択的にノックダウンされ、2つ以上の標的遺伝子はSRC-3、EGFR、PIK3、NCOA3、またはERalpha 1から選択され、インサートがRNAi、shRNAまたはbi-shRNAのうち少なくとも1つから選択される。
(a)以下:癌細胞または組織における、少なくとも野生型KRASおよび1つまたは複数の変異KRASならびに2つ以上の標的遺伝子の発現のレベル;癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS遺伝子および2つ以上の標的遺伝子の発現低下を伴う細胞環境における候補遺伝子または候補遺伝子群の発現のレベル;癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS遺伝子および2つ以上の標的遺伝子の発現低下を含む細胞の表現型に対する候補薬物の効果、のうち1つまたは複数を測定する工程;
(b)癌細胞または組織の第1のサブセットに対して候補薬物を、および癌細胞または組織の第2のサブセットに対してプラセボを投与する工程;
(c)候補薬物またはプラセボの投与後に工程(a)を繰り返す工程;ならびに
(d)肺癌または組織の第2のサブセットにおいて生じる減少と比べて統計的に有意である、正常KRASを発現する細胞環境と比較して変異KRASおよび2つ以上の標的遺伝子の発現が減少した細胞環境において決定された表現型を生じさせるのに、候補薬物が効果的であるかどうかを決定する工程であって、統計的に有意な減少が、候補薬物が癌の処置に有用であることを示す工程。別の局面において、癌は、脳、膀胱、血液、骨、乳房、子宮頸部、結腸直腸、胃腸、内分泌、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または甲状腺から選択される。別の局面において、変異KRASは選択的にノックダウンされ、2つ以上の標的遺伝子はSRC-3、EGFR、PIK3、NCOA3、またはERalpha 1から選択され、インサートがRNAi、shRNAまたはbi-shRNAのうち少なくとも1つから選択される。
別の態様において、本発明は、ヒト対象において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって:ヒト対象から腫瘍細胞サンプルを得る工程;腫瘍細胞増殖を防止するために抑制を必要とするヒト対象において1つまたは複数の標的遺伝子または遺伝子群を同定する工程;腫瘍細胞サンプルにおいて同定された遺伝子または遺伝子群を特異的に標的指向する2つ以上のRNAi核酸セグメントを発現するインサートを含む発現ベクターを構築する工程であって、インサートが、腫瘍細胞内で同定された同一または異なる標的遺伝子または遺伝子群の発現を減少させる第1および第2のRNAi核酸を含む工程;2つ以上のRNAi核酸セグメントを発現させるのに十分な量の治療剤キャリア複合体中の発現ベクターをヒト対象に投与する工程;ならびに遺伝子または遺伝子群が標的腫瘍細胞において発現ベクターによってノックダウンされたかどうかを決定する工程であって、この阻害が腫瘍細胞のアポトーシス、増殖停止または浸潤減少をもたらす工程を含む方法を含む。1つの局面において、RNAiは、miRNAおよびshRNAおよびsiRNAまたはbi-shRNAのうち少なくとも1つから選択される。別の局面において、少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子は、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される。別の局面において、インサートはさらに、1つまたは複数の変異遺伝子または正常遺伝子の発現を減少させることができる3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーのRNAiインサートを含む。別の局面において、発現ベクターは、ベクター-A-B-C-ベクター という構造を含む点でさらに定義され、ここで、A、B、およびCは、1つもしくは複数の標的遺伝子のmRNAの同一領域、1つもしくは複数の標的遺伝子のmRNAの異なる領域または2つ以上の標的遺伝子由来の異なるmRNAを標的指向することができる3つ以上のRNAi核酸セグメントである。1つの局面において、インサートA-B-Cは、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される。
本発明の特徴および利点のより完全な理解のために、ここからは、発明の詳細な説明の参照を、添付図面と共に行う。
SRC-3、EGFRおよび変異KRAS(G12C)を標的指向するよう設計された多標的指向bi-shRNAの使用が肺癌細胞増殖を軽減することができるという結果を示している。
本発明の1つのコンストラクトを示している。
本発明の別のコンストラクトを示している。
pGBI-162のベクターマップを示しており;インサートは、以下で説明されているように、PI3K E545K + SRC-3 + ER-α(NR3A1)標的指向ベクターに基づくRNAiを含む。
pGBI-162: pGBI-163:SRC-3 + ER-α(NR3A1)+ PI3K E545K標的指向ベクターのベクターマップを示している。
図6Aは、増殖の変化を示すグラフであり、図6Bは、本発明の図5および6に示されたコンストラクト、すなわちpGBI-162: PI3K E545K + SRC-3 + ER-α(NR3A1)標的指向ベクターおよびpGBI-163: SRC-3 + ER-α(NR3A1) + PI3K E545K標的指向ベクター、を用いてMCF-7乳癌細胞株に対して得られた結果を示すブロットである。
発明の詳細な説明
以下では本発明の様々な態様の作製および使用について詳細に議論されているが、本発明は、幅広い様々な特定状況下で具現化することができる多くの応用可能な発明思想を提供することを理解されたい。本明細書で議論されている具体的態様は、本発明を作製および使用する具体的方法の例にすぎず、発明の範囲を限定するものではない。
以下では本発明の様々な態様の作製および使用について詳細に議論されているが、本発明は、幅広い様々な特定状況下で具現化することができる多くの応用可能な発明思想を提供することを理解されたい。本明細書で議論されている具体的態様は、本発明を作製および使用する具体的方法の例にすぎず、発明の範囲を限定するものではない。
本発明の理解を容易にするため、以下で多くの用語が定義されている。本明細書で定義されている用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」等の用語は、単数の実体のみを参照することを意図したものではなく、例示のために使用され得る具体例の一般的クラスを含むものである。本明細書における専門用語は、発明の具体的態様を説明するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲に示されるものを除いて、発明を限定するものではない。
本発明は、発現ベクター中に多量体核酸インサートを含み、これは、ベクター-A-B-C-ベクター という構造を有し得、ここでA、B、およびCは、1つもしくは複数の標的遺伝子のmRNAの同一領域、1つもしくは複数の標的遺伝子のmRNAの異なる領域または2つ以上の標的遺伝子由来の異なるmRNAを標的指向することができるsiRNAである。当業者は、この多量体が、A、B、C以外、例えばD、EおよびF・・・またはA'、B'、C'、D'さえも、または組み合わせもしくは複数の標的指向インサート、例えばA、B、C、A'、B'、C'、D'、D、EおよびF・・・、またはA、A、B、B'、C、D、D'、D'等さえも含み得ることに気付くであろう。組み合わせは、例えば、ヒト対象から腫瘍細胞サンプルを得;腫瘍細胞増殖を防止するために抑制を必要とするヒト対象において1つまたは複数の標的遺伝子または遺伝子群を同定し;腫瘍細胞サンプルにおいて同定された遺伝子または遺伝子群を特異的に標的指向する2つ以上のRNAi核酸セグメントを発現するインサートを含む発現ベクターであって、インサートが腫瘍細胞内で同定された同一または異なる標的遺伝子または遺伝子群の発現を減少させる第1および第2のRNAi核酸を含む発現ベクターを構築し;2つ以上のRNAi核酸セグメントを発現させるのに十分な量の治療剤キャリア複合体中の発現ベクターをヒト対象に投与し;そして遺伝子または遺伝子群が標的腫瘍細胞において発現ベクターによってノックダウンされたかどうかを決定し、この阻害が腫瘍細胞のアポトーシス、増殖停止または浸潤減少をもたらす、本発明の方法を用いて決定され得る。特定の例において、インサート、A、B、C、A'、B'、C'、D'、D、EおよびF・・・またはA、A、B、B'、C、D、D'、D'等は、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49またはSEQ ID NO:50〜126から選択される。
rasプロト・オンコジーンファミリーにおける活性化変異がそれらに構成的活性を付与することは、すべてのヒト癌において頻繁に観察されている。特に、活性化K-ras変異は、多くの肺癌において観察される。K-ras変異は、癌の処置のための実行可能なアプローチとして、低分子を用いて特異的に標的指向させ、それによって野生型(wt)RAS発現に影響を及ぼすことなくKRAS変異をノックダウンさせることは困難である。すべてのRNAiに基づくKRAS変異のノックダウンは、1つの特定の変異を標的指向するか、またはwtRAS発現を同時にノックダウンさせるかのいずれかである。
RNAiは、1998年のFireおよびMelloによる、ノーベル賞を受賞した発見であり、これは、遺伝子機能の理解を深め、多くの第IおよびII相臨床試験を刺激する飛躍的な数の研究および刊行物を触発した。内因性マイクロRNA(miRNA)を含む小さなRNAによるこの天然の遺伝子サイレンシング機構は、遺伝子配列に高度に依存し;したがってその機構は、理論上、任意の標的化された遺伝子の発現を強い特異性で阻害するのに使用することができる。RNAiは、低分子の開発に特有の薬理学的制約によっては制限されず、疾患処置にとって伝統的に「製薬化不可能(undruggable)」である標的にアクセスする機会を生み出す。
この機構の中心選手は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)である。このプロセスは、(パッセンジャー鎖およびガイド鎖から構成される)二重鎖低分子RNAがプレRISCに組み込まれ、その後にパッセンジャー鎖が切断依存的または切断非依存的に放出され、ガイド鎖を含むRISCが形成されることから開始される。(mRNAに対してアンチセンスである)ガイド鎖は、RISCが(完全なまたは部分的に延びる)配列相補性を通じて標的mRNAを認識するよう誘導する。RISCの鍵となる要素は、哺乳動物システムにおいてはアルゴノート(Argonaute)タンパク質(Ago)のファミリーであるAgo 1、2、3、および4であり、そのうちAgo 2のみがエンドヌクレアーゼ活性を有し、標的mRNAをさらなる分解(切断依存性経路)のために切断することができ;すべてのAgo含有RISCが、切断非依存性エフェクター経路を通じて機能することができ、その後の分解により翻訳抑制およびpボディによるmRNA回収がもたらされる。切断依存性エフェクタープロセスは、特にその中心領域において、ガイド鎖とパッセンジャー鎖および標的mRNAの両方との間で高い相同性を必要とし;他方、切断非依存性エフェクタープロセスは、ガイド鎖とパッセンジャー鎖および標的mRNAの両方との間で部分的な相同性しか必要としない。
本発明は、RISC複合体から下流のイベントではなく、RISC複合体における切断依存性および切断非依存性の両方の積み込み(loading)を利用する。したがって、本明細書で使用される場合、「切断依存性および切断非依存性」というフレーズは、RISCに対して特異的に標的指向されるRNAのデザインならびにRISC複合体における切断依存性および切断非依存性の活性、すなわち積み込みを表す。ここで、本件の場合は本願において、これらの「二機能性shRNA」が、RISC複合体の各個別部分の標的指向の和よりも高い阻害活性を有することが見出された。したがって、本発明のより高い阻害活性。
RNA干渉は、合成された二重鎖低分子干渉RNA(siRNA)によってまたはベクター由来ショートヘアピンRNA(shRNA)によってのいずれによっても誘発され得る。siRNAおよびベクター由来shRNAは両方とも、インビトロおよびインビボ用途で有効であり、各々がそれぞれの利点を有することが実証されている。ほとんどのsiRNAは、構造的に、Ago2含有RISCへの効率的な組み込みが促進されるよう設計されており、RNaseIII含有Dicer基質の設計は、プレRISCにおける初期会合およびプロセシングによってsiRNAの効率を少なくとも10倍改善する。ベクター由来shRNAは、宿主のマイクロRNA生合成経路を利用し、こちらがより効率的なようである。siRNAはより容易に化学修飾され、一方shRNAの発現は特定のプロモーターによって調整および調節され得る。
shRNAおよびsiRNAの設計および合成。shRNAおよびsiRNA(RNAiの2つの異なる方法)を設計する現在の方法は、多くの場合、コンピュータにより実行されるルールを利用するものであるが、これらは必ずしも信頼できるものではなく、本質的に試行錯誤的アプローチである。本明細書で使用される場合、「RNAi分子」は、概ね、従来的なshRNA分子(当業者により慣用的に使用されている周知のshRNA分子)、強化されたshRNA(本発明に包含され以下で説明される新規のshRNA分子およびその使用)ならびに/またはsiRNA分子を表す。本明細書で使用される場合、「shRNA/siRNA」、「siRNA/shRNA」およびその類語は、従来的なshRNA、強化されたshRNA、siRNAまたは上記の任意の組み合わせを表す。
最近の研究は、siRNA(および他のRNAi分子)のかなり広い標的外効果(off-target effect)を示した。標的遺伝子は効果的に抑制され得るものの、mRNAおよびタンパクレベルの両方で非特異的効果が報告されている。したがって、本明細書に記載される発明の臨床適用のためには、望ましい効果、効能ならびに結合精度および確度を有するRNAi分子を組み込むことが重要である。本発明の特定の態様において、RNAi分子は、好ましくは、そのようなデザインがsiRNAよりも安定性が高く、耐久性があり、強力でありかつ調節を受けやすいことが示されているという理由で、従来的なまたは強化されたshRNAである。加えて、送達ベクターの腫瘍特異的標的指向および腫瘍特異的プロモーターの組み込みが利用され、それによって本発明に数ログの安全バッファーが付与され得る。
各々の選択された標的遺伝子または遺伝子群に関して、本発明は、標的遺伝子の発現を調整することおよび/または他の好ましい特徴(例えば、効果、効能ならびに結合精度および角度)を示すことが示されている任意の市販のshRNAおよびsiRNAコードプラスミドを特定するために文献検索が実施され得ることを提案する。そのような標的遺伝子、siRNAおよび/またはshRNAに関する追加情報は、好ましくは、NCIのThe Cancer Genome Anatomy Project's RNAiのサイトから入手され得る。適当な市販のshRNAおよび/またはsiRNAコード配列が存在する場合、そのような組成物またはその要素が、(そのような組成物が他の好ましい基準、例えば効果、効能ならびに結合精度および確度に関するそれ、を満たすことを前提に)本発明において使用され得る。
選択された標的遺伝子に対して市販のsiRNAまたはshRNAクローンが存在しない場合、適当数のshRNAおよび/またはsiRNA、例えば2、3、4、5、またはそれより多いshRNAまたはsiRNAが、容易に利用可能なRNAi分子設計コンピュータプログラムを用いて設計され得る。HPLC等級の合成されたshRNA/siRNA二重鎖は、多くの供給元のいずれか、例えばQiagenまたはIDTから購入され得る。
標的遺伝子に対して市販のsiRNAまたはshRNAクローンが存在しない場合(ならびにコンピュータソフトウェアを用いて設計されるshRNAおよび/またはsiRNAが、例えば、望ましい効能を示さない場合)、「ショットガン」アプローチが利用され得る。例えば、SilereTechによって開発されたshRNA発現クローン合成技術は、特定の標的配列(例えば、標的遺伝子)に関するshRNA発現ベクターの「ショットガン」ライブラリの合成を可能にする。このショットガンライブラリは、標的配列に沿って無作為にちらばる数千のRNAi分子を提供する。このショットガンライブラリから、様々な効果および効能を有する多くのshRNA発現ベクターが同定され得る。ショットガンライブラリは、合成、試験またはベクター構築の繰り返しを必要としない代表的なRNAi分子(例えば、shRNAまたはsiRNA)の豊かな供給源を提供する。適当なスクリーニングプロセスによって、所望の効果および効能のshRNAおよび/またはsiRNA発現ベクターが、容易に同定され得る。
本発明は、購入された、設計されたまたはそうでなければ(上記の「ショットガン」アプローチを用いて)同定されたshRNAおよび/またはsiRNA配列を、好ましくは、望ましくない「標的外」効果(すなわち、意図される標的遺伝子以外の配列への結合)について評価することを提案する。例えば、shRNAまたはsiRNA分子の予想される「標的外」効果またはその欠如は、NCBI GeneBankデータベースの非関連遺伝子配列に対してBLAST検査を行うことによって分析され得る。
遺伝子発現のshRNA/siRNA媒介阻害に加えて、本発明は、1つまたは複数の標的遺伝子の発現を調整するために他の適当な方法が利用され得ることを提案する。遺伝子発現を調整するためのshRNA/siRNAの使用が本明細書を通じて使用されているが、本発明は、shRNA/siRNA法に加えて(またはそれに代えて)そのような他の適当な方法が使用され得ることを提案する。例えば、本発明は、標的遺伝子発現を調整するために他の転写および/または翻訳阻害剤が利用され得ることを提案する。転写調整剤の非限定的な例は、ヘリックス-ターン-ヘリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパーおよび/またはヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質を含み得る。翻訳阻害剤/調整剤の非限定的な例は、他の形態のアンチセンス技術ならびにsiRNA結合タンパク質、miRNA、miRNA結合タンパク質、低分子阻害剤(例えば、アニソマイシン、シクロヘキシミド、エメチン、ハリントニン、およびピューロマイシン)および類似組成物をさらに含み得る。
本発明者らはまた、1つの予めプログラムされた分子におけるRISC積み込みの切断依存性および切断非依存性の両方の経路を利用することによりRNAiの効能をさらに改善する新規のベクター由来shRNA技術である二機能性shRNA(bi-shRNA)を開発した。このベクター由来bi-shRNAは、1つのステムループshRNAが完全な相補性をステム部分に有し、第2のステムループshRNAがステムのパッセンジャー鎖上にミスマッチを含む(それによってガイド鎖上にミスマッチを含む先行技術のミスマッチRNAと区別される)、各mRNA標的配列につき2つのステムループ構造を含む。重要なことは、RISCへの組み込み後に、2つの構造の各々由来のガイド鎖が、mRNA標的配列に対して完全に相補的であるが、異なるAgo含有RISCと会合することである。このbi-shRNAの設計は、siRNAまたは従来的なshRNAのいずれと比較しても、より速い遺伝子サイレンシングの発生、より高い効果およびより大きな耐久性をもたらす。標的特異的なbi-shRNAによって今回パーソナライズされた癌療法は、修飾された二層重積型リポソーム送達ビヒクルを用いる第I相研究の臨床に移される。bi-shRNAの設計、構築および実施に関係する鍵となる分子的方法は、以下に提供される。
その目的および態様に依存して、様々な異なるベクター、プロモーターまたはプラスミド骨格および送達システムが使用され得る。効率的なトランスジーン発現を示す発現ベクターを選択することが有用であることが見出された。本発明者らは、強力なプロモーター、例えばIE 5'UTRおよび部分イントロンAを含む拡張CMVプロモーターを有する発現ベクター(pUMVC3)が、CMVプロモーターに直接隣接するクローニング部位を有するものよりも効果的であることを認めた。特定の態様において、ステムループ構造の前にリード転写物のストレッチを有することが有益である。加えて、2つ以上のベクターの利用が計画される場合、効果的なシャトル戦略が事前に計画されるべきであり、発現されたカセットのPCR増幅による修飾は効果的でない。プロモーターの選択もまた重要であり;RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、発現の点ではずっと強力であるが、核輸出およびRISC積み込みの両工程で内因性のmiRNA成熟プロセスを競合的に飽和させ、特定の送達ビヒクルによってはインビトロおよびインビボで致死的な毒性を生じる。RNAポリメラーゼIIプロモーターは、発現の点ではそれより強力ではないが、効率的に作動し、内因性のmiRNA経路との競合に関してずっと低い毒性である。
特定の態様において、特に複数の動物モデルシステムが利用される場合、2つ以上の種において作動することができる配列が設計される。大部分の標的遺伝子に関して、種間で保存されている標的ヌクレオチドのストレッチを見出すことが可能である。保存されかつノックダウンに最適である配列を見出すために、相同性で一致した配列を選択された標的部位配列と比較する必要がある。
異なるアルゴリズムを用いる公衆利用可能なコンピュータプログラム(例えば、Dharmacon RNAiデザインセンター(www.dharmacon.com)およびIDT(www.idtdna.com))が容易に入手可能であり、標的指向された遺伝子内の適当な標的部位を特定するために使用することができる。大部分のコンピュータプログラムによる検索は、しばしば、さらなる分析のための予備的な第1標的セットを生成するであろう。いくつかの入手可能な刊行物が、実施する示唆およびしない示唆(do and do-not suggestions)を提供する。関心対象の種内の他のmRNAとの潜在的交差相同性を分析するために各標的配列のBLAST検索が採用され得る。
標的部位配列が選択された後、bi-shRNA設計プロセスが開始され得る;設計プロセスは以下に示される。本発明者らによって使用されるbi-shRNAステムループ構造は、よく分析されたmiR-30a骨格を利用するものであるが、任意の機能性miRNA骨格を使用することができる。bi-shRNAは、相互に直接隣接して位置するmiR-30a骨格上の2つのステムループ構造と約10ヌクレオチド長のギャップからなる。それより長いヌクレオチドギャップが使用され得、複数ユニットのbi-shRNAが、複数部位の単一遺伝子または複数の異なる遺伝子のいずれかを同時に標的指向する単一転写物内に同時に並べられるよう設計され得る。
発現ベクターのマルチクローニング部位に配置される発現ユニットを構築するために、順々にひとつに連結された合成オリゴヌクレオチドを用いるアセンブリ戦略が開発された。あるいは、特定の配列を有する遺伝子コンストラクトの合成をバイオテクノロジーサービス会社に委託することもできる。オリゴヌクレオチドアセンブリプロセスのために、重複するDNAフラグメントを設計し合成した。2つのステムループ構造内に冗長配列が存在するために、最初に5'フラグメントおよび3'フラグメントを連結する必要がある。5'フラグメントおよび3'フラグメントは、その後、ゲル上で精製され、そして中間連結フラグメントにさらに連結され得る。このアセンブリプロセスは効率的であり、慎重な設計によって、多くのフラグメントを異なる二機能性コンストラクトのために繰り返し使用することができる。
各標的に対して、少なくとも3つの比較のための二機能性コンストラクトを設計および構築し、その中からさらなる評価のために高いノックダウン効率を有するコンストラクトを選択することが最良である。ノックダウン効率は、組織培養細胞中でインビトロ比較され得る。インビトロトランスフェクション方法は大きく異なる効率を有するため、本発明者らは、内因的に発現される遺伝子とノックダウン効率を比較することは一般に困難であると認識している:これは特に、非トランスト細胞からのバックグラウンドノイズが原因でノックダウンを評価するのが困難であるためトランスフェクション効率が低くなる場合に当てはまる。
bi-shRNAによる標的遺伝子ノックダウンの効果および効率は、標的および計画される用途に依存して、様々なインビトロおよびインビボシステムを用いて試験することができる。このインビトロ評価は、様々な培養細胞におけるbi-shRNA発現プラスミドのトランスフェクションの後に実施され得る。本発明者らは、対照ベクターまたはユニバーサルランダム配列を用いてプラスミドDNAの量が慎重に制御される場合、エレクトロポレーションおよびリポソーム(例えば、リポフェクタミン2000)の両方によるトランスフェクションが非常に効率的であることを見出した。リポフェクタミンまたは関連物質に関して、本発明者らは、リバーストランスフェクション法が概ねフォワードトランスフェクション法よりも低毒性であることを見出した。標的遺伝子ノックダウンは、標的遺伝子mRNAについてはqRT-PCRによってまたは標的遺伝子タンパク質についてはウェスタンおよび/もしくはELISAによってのいずれかで評価され得る。1つのアッセイ法において、ステムループRT-PCRによる成熟shRNAの発現が検出され、別のアッセイ法において、標的mRNA切断が5'RNA・リガンド媒介RACE(5'RLM-RACE)によって検出される。ステムループRT-PCRは、使用される個々のプローブプライマーに依存する高感度な方法であり;加えて、パッセンジャー鎖およびガイド鎖の両方を特異的に検出および定量することができる。bi-shRNAに関して、この方法は、完全に相補的なおよびミスマッチを有する(部分的に相補的な)パッセンジャー鎖の両方を示差的に採点することができる。5'RLM-RACE法は、切断されたmRNA末端へのRNAオリゴマーの連結を必要とし、その結果、この方法が低効率となる。複数回の増幅がしばしば必要とされる場合、特異性の確保のために入れ子状プライマー設計が必須である。
bi-shRNAの評価可能な機能は、標的細胞への効果的なプラスミド送達に依存する。本発明者らは、いくつかのインビトロトランスフェクションシステムは、しばしば、本質的により複雑なインビボ動物モデルに移行しないと認識している。多くの送達システムが、特にインビボでの全身適用のために設計される。本発明者らは、インビボ研究のために融合性、カチオン性のDOTAP:コレステロール二層重積型ベシクルであるリポプレックス(BIV)を利用し、それを臨床に移すことに成功した。より集中的な生体内分布、標的指向送達および強化された細胞内取り込みのための改良戦略が開発される。効果的なリポプレックスは、宿主大腸菌(E.coli)由来のいかなる混入物質も伴わないプラスミドを使用するべきである。エンドフリー(endo-free)プラスミド精製キットにより生成されたプラスミドが通常使用されるが、GLPまたはGMP製造されたプラスミドがより効果的である。残念ながら、コラン酸および他の非内毒素付随多糖が、アニオン交換クロマトグラフィーによりおよび塩化セシウム密度勾配遠心分離によりDNAと共に同時精製される。したがって、内毒素の除去は、これらの混入物質を除去せず、HPLCはこれらの混入物質を検出することができない。この点を修正するため、インビボおよび臨床用途のためにこれらの混入物質が排除された超高品質プラスミドDNAを生成するSuperclean(商標)手順が開発された。リポソームの調製は、高度に専門化された装置を必要とし;本発明者らは、通常、GMP施設内でDOTAP:コレステロールBIVを作製する。既製リポソームは、共同研究者から入手または販売元から購入され得る。高品質リポソームおよびプラスミドDNAを含むリポプレックスを調製するプロセスは、以下に記載されている。リポプレックスの配合は、ほとんどの研究室環境で達成され得る。リポプレックスが作製された後、その配合物が、緩やかな尾静脈注射を通じてまたはカテーテルを用いてのいずれかで実験動物に全身送達され得る。標的部位でのベクター発現は、プラスミドDNAについてはPCR法を、成熟bi-shRNAについてはステムループRT-PCRをそれぞれ用いて分析され得る。bi-shRNA機能は、標的mRNA切断については5'RLM-RACEを用いて、標的タンパク質ノックダウンについてはウェスタンブロットまたはIHCを用いてアッセイされ得る。これらの分析は、処置から約48時間後に実施され得る。効能に関しては、実験動物への反復送達がしばしば必要とされ;投薬スケジュールは、実験的に決定され最適化される必要がある。
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成されるフラグメントならびに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成されるフラグメントを表す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)もしくは天然に存在するヌクレオチドのアナログ(例えば、天然に存在するヌクレオチドのα鏡像異性体形態)または両者の組み合わせである単量体から構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分におよび/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に、変更を有し得る。糖修飾は、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による1つもしくは複数のヒドロキシル基の置換を含み、または糖はエーテルもしくはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分全体が、立体的および電子的に類似する構造、例えばアザ糖および炭素環式糖アナログで置換され得る。塩基部分における修飾の例は、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジンまたは他の周知の複素環置換を含む。核酸単量体は、ホスホジエステル連結またはそのような連結のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル連結のアナログは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリダート、ホスホルアミダート等を含む。「核酸分子」という用語はまた、ポリアミド骨格に付加された天然に存在するまたは修飾された核酸塩基を含むいわゆる「ペプチド核酸」を含む。核酸は、単鎖または二重鎖のいずれかであり得る。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、宿主細胞内で発現される遺伝子をコードする核酸分子を表す。典型的に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結」されていると称される。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、その調節エレメントがコアプロモーターの活性を調整する場合、機能的に連結されている。「プロモーター」という用語は、宿主酵母細胞内で構造遺伝子と結合された場合に、その構造遺伝子に関して、適当な増殖条件下で、1)転写、2)翻訳または3)mRNA安定性のうち1つまたは複数を、そのプロモーター配列の非存在下での転写、翻訳またはmRNA安定性(mRNAのより長い半減期)と比較して増加させる任意のDNA配列を表す。
本明細書で使用される場合、「オンコジーン」という用語は、悪性新生物細胞の形成および生存を可能にする遺伝子を表す(Bradshaw, T.K.: Mutagenesis 1, 91-97(1986))。
本明細書で使用される場合、「受容体」という用語は、「リガンド」と呼ばれる生物活性分子に結合する細胞関連タンパク質を表す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を媒介する。
受容体は、膜結合性、細胞質性または核性の単量体(例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータ・アドレナリン受容体)または多量体(例えば、PDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSF受容体、G-CSF受容体、エリスロポエチン受容体およびIL-6受容体)であり得る。膜結合受容体は、典型的にシグナル伝達に関与する細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインを含む多ドメイン構造により特徴付けられる。特定の膜結合受容体において、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別のポリペプチド内に位置する。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズ」という用語は、核酸の鎖が塩基対形成を通じて相補的な鎖と結合する任意のプロセスを表す。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、真核生物細胞への外来DNAの導入を表す。トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム・DNA共沈、DEAE・デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染およびバイオリスティクスを含む当技術分野で公知の様々な手段によって達成され得る。
本明細書で使用される場合、「二機能性」という用語は、2つの機構的作用経路を有するshRNA、siRNAのそれおよびmiRNAのそれを表す。「従来的な」shRNAという用語は、siRNA作用機構によって作用するDNA転写由来RNAを表す。「二重」shRNAという用語は、各々が2つの異なる遺伝子の発現に対して作用するがそれは「従来的」なsiRNA様式においてである2つのshRNAを表す。二機能性shRNA(bi-shRNA)は、1つの予めプログラムされた分子におけるRISC積み込みの切断依存性および切断非依存性の両方の経路を利用することによってRNAiの効果を改善する。ベクター由来bi-shRNAは、1つのステムループshRNAが完全な相補性をステム部に有し、第2のステムループshRNAがステムのパッセンジャー鎖上にミスマッチを含む(それによってガイド鎖上にミスマッチを含む先行技術のミスマッチRNAと区別される)、各mRNA標的配列につき2つのステムループ構造を有する。重要なことは、RISCへの組み込み後に、2つの構造の各々由来のガイド鎖が、mRNA標的配列に対して完全に相補的であるが、異なるAgo含有RISCと会合されることである。このbi-shRNAの設計は、siRNAまたは従来的なshRNAのいずれと比較しても、より速い遺伝子サイレンシングの発生、より高い効果およびより大きな耐久性をもたらす。
二機能性shRNAは、標的遺伝子によってコードされるmRNA転写物の少なくとも一部に対して相補的、好ましくは100%相補的である第1のガイド鎖配列を有する。本発明は、(当初は、二重鎖ステムを形成するようパッセンジャー鎖に結合されている)このガイド鎖が標的遺伝子のmRNA転写物に結合することができる核酸配列を含み、切断依存性RISC経路に供されることを提案する。本発明は、mRNA転写物に対するガイド鎖配列のそのような結合および切断依存性RISC経路への提示が、mRNA転写物の分解を引き起こすことを提案する。第2のガイド鎖配列は、標的遺伝子によってコードされるmRNA転写物の少なくとも一部に対して少なくとも部分的に相補的である。より具体的に、第2のガイド鎖配列は、標的遺伝子によってコードされるmRNA転写物に対して相補的、好ましくは100%相補的である第1の部分を含み得るが、ガイド鎖配列の第2の部分は標的遺伝子のmRNA転写物の対応する配列に対してミスマッチする特定の塩基を含む。
本明細書で使用される場合、「ミスマッチ」する塩基対は、相互に結合(またはハイブリダイズ)させた場合に、塩基対形成のシャルガフ則にしたがわない核酸配列内の2つの含窒素塩基を表す。シャルガフ則は、第1の核酸配列内のプリンであるアデニン(A)が第2の核酸配列内のピリミジンであるチミジン(T)(またはウリジン(U))と対形成することを提案する。さらに、シャルガフ則は、第1の核酸配列内のプリンであるグアニン(G)が第2の核酸配列内のピリミジンであるシトシン(C)と対形成することを提案する。したがって、そのような法則にしたがわず適合しない2つの鎖(核酸配列)間の塩基対形成、例えば、GとU、AとG、AとC、GとT、GとU等の間の対形成は、「ミスマッチ」する塩基対とみなされる。パッセンジャー鎖に対して1つまたは複数の「ミスマッチ」する塩基対を含む、そこに示されるステムループ構造の二重鎖配列内のガイド鎖は、二重鎖ステム配列において突出部を形成する。
本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、内部の水性空間を取り囲む脂質二重層から構成される閉鎖構造体を表す。本明細書で使用される「ポリカチオン」という用語は、同一分子中に複数のカチオン性部分、例えば第4級アンモニウムラジカルを有する物質を表し、その遊離塩基および薬学的に許容される塩を含む。
したがって、二機能性shRNAは、切断依存性RISCおよび切断非依存性RISCの両方に侵入しそれらと相互作用するよう設計されたshRNAを含み得る。高レベルの遺伝子「ノックダウン」は、siRNAおよび従来的なshRNA(すなわち、切断依存性RISCまたは切断非依存性RISCに侵入するが両方には侵入しないように設計されたshRNAコンストラクト)を含む他の現在利用可能なRNAi法および組成物と比較して、そのような二機能性shRNAを用いて達成される。
本明細書で使用される場合、遺伝子「ノックダウン」は、発現の効果的な量的および持続的な阻害を表す。そのような遺伝子「ノックダウン」は、標的遺伝子mRNA翻訳の抑制、標的細胞アポトーシスおよび/または細胞殺傷の増加の点で発現および/または顕在化され得る。
本明細書で使用される場合、「標的遺伝子」は、その配列の発現が二機能性shRNAを用いて特異的かつ効率的に調整され得る細胞内の核酸配列を表す。特定の態様において、標的遺伝子は、個体の癌の成長(増殖)、維持(生存)および/または遊走(転移)挙動に関連し得る。本発明は、しかし、標的遺伝子が、任意の他の疾患または医学的状態に関連し得、癌に関連する遺伝子に限定されないことを提案する。例えば、標的遺伝子は、調査者または臨床医が抑制すること(すなわち、そのような標的遺伝子の発現レベルの減少)を望む任意の配列を表し得る。
ベクター配列は、二機能性shRNAをコードする配列に直接的または間接的に機能的に連結(または接続)されるプロモーターを含み得る。そのようなプロモーターは、調査される宿主細胞および効果に基づき選択され得る。適当なプロモーターの非限定的な例は、構成性および誘導性のプロモーター、例えば誘導性RNAポリメラーゼII(pol II)ベースのプロモーターを含む。適当なプロモーターの非限定的な例はさらに、テトラサイクリン誘導性または抑制性プロモーター、RNAポリメラーゼIまたはIIIベースのプロモーター、pol II依存性ウイルスプロモーター、例えばCMV-IEプロモーター、ならびにpol III U6およびH1プロモーターを含む。バクテリオファージT7プロモーターもまた使用され得る(その場合、T7ポリメラーゼも存在しなければならないことが理解されるであろう)。本発明は、特に本発明が組み込まれた単体shRNAを含むがこれに限定されない2つ以上の二機能性shRNA(すなわち、エフェクターの組み合わせ)を含み得る点から、任意の単一のプロモーターの使用に限定されるべきでない。各々の組み込まれたプロモーターは、単体shRNA要素のうち1つまたは任意の組み合わせを制御し得る。
特定の態様において、プロモーターは、標的化された細胞内で優先的に活性となり得る、例えば、腫瘍細胞特異的プロモーターを用いて腫瘍細胞において二機能性shRNA分子を優先的に発現させることが望ましい場合があり得る。そのようなコンストラクトの宿主細胞への導入は、二機能性shRNA前駆体転写物内に含まれる2つ以上のRNA分子が当初は単一の一次転写物内に存在し、その後に(各々独自のステムループ構造を含む)別個のRNA分子が内因性リボヌクレアーゼによってそのような前駆体転写物から切り出される条件下で行われ得る。本発明はさらに、スプライスドナーおよびアクセプター配列が、戦略的に、スプライソソーム媒介核プロセシングを促進するよう一次転写物配列内に配置され得ることを提案する。得られる成熟shRNAは、その後、細胞内で産生される標的遺伝子mRNA転写物の分解および/または翻訳抑制を誘導し得る。あるいは、各前駆体ステムループ構造は、別個の転写物の一部として生成され得、この場合、各shRNAコード配列は、好ましくは、それ独自のプロモーターおよび転写ターミネーター配列を含むであろう。加えて、二機能性shRNA前駆体転写物は、任意で1つまたは複数の機能的哺乳動物タンパク質をコードする1つまたは複数のmRNA配列をさらに含む、単一の一次転写物内に存在し得る。例えば、1つまたは複数のmRNA配列は、患者の免疫系を強化するまたはそうでなければ二機能性shRNAと並行して作用する一定の予防的および/もしくは治療的効果を提供することが知られている特定のタンパク質をコードし得る。
本明細書に記載されるshRNA分子のステムループ構造は、約40〜100ヌクレオチド長または好ましくは約50〜75ヌクレオチド長であり得る。ステム領域は、約19〜45ヌクレオチド長(もしくはそれ以上)またはより好ましくは約20〜30ヌクレオチド長であり得る。ステムは、(任意の3'テイルを別にすれば)完全に相補的な二重鎖を含み得るが、突出部または内部ループが、より好ましくはステムのいずれかのアーム上に、存在し得る。そのような突出部および非対称の内部ループの数は、好ましくは数個程度の数(例えば、1、2、または3個)および約3ヌクレオチドもしくはそれ未満のサイズである。末端ループ部分は、約4以上のヌクレオチドを含み得るが、好ましくは約25以下である。より具体的に、ループ部分は、好ましくは、6〜15ヌクレオチドのサイズであろう。
本明細書に記載されるように、二機能性shRNAのステム領域は、パッセンジャー鎖およびガイド鎖を含み、ガイド鎖は標的遺伝子(群)によってコードされる標的mRNA転写物に対して相補的な配列を含む。好ましくは、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖のG-C含量およびマッチングは、エンドヌクレアーゼ切断によるまたはよらない熱力学的に好ましい鎖ほどき活性の点で慎重に設計される。さらに、ガイド鎖の特異性は、好ましくは、BLAST検索(www.ncbi.nim.nih.qov/BLAST)を通じて確認される。
複数の標的遺伝子の発現レベルが、本明細書に記載される方法および二機能性shRNAを用いて調整され得る。例えば、本発明は、第1の二機能性shRNAセットが第1の標的遺伝子の発現レベルを減少させるよう設計された配列(ガイド鎖)を含むよう設計され得、第2の二機能性shRNAセットが、第2の標的遺伝子の発現レベルを減少させるよう設計された配列(ガイド鎖)を含むよう設計され得ることを提案する。異なる二機能性shRNAセットは、同一または別個の予備的転写物内で発現されそのような転写物内に存在し得る。特定の態様において、そのような多重アプローチ、すなわち、2つ以上の標的遺伝子の発現レベルを調整する本明細書に記載される二機能性shRNAの使用は、患者に対する強化された治療効果を有し得る。例えば、癌を処置、予防またはその影響を緩和するために患者に本明細書に記載される二機能性shRNAが提供される場合、患者の癌に関係する複数の遺伝子の発現レベルを減少させるよう設計された2つ以上のタイプの二機能性shRNAを患者に提供することが望ましい場合がある。
特定の態様において、本発明はさらに、二機能性shRNA配列が天然に存在するmiRNA(例えば、miR-30、C.エレガンス(C.elegans)let-7および/またはlin-4)のステム配列を含み得ることを提案する。例えば、miR-30ループの存在が望ましい場合があり得るが、本発明は、その構造のバリエーションが許容され得、例えばmiR-30配列に対して(周知のコンピュータプログラム、例えばBESTFITプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)を用いて決定された場合に)72%超、好ましくは79%超、より好ましくは86%超、最も好ましくは93%超同一であるループが使用され得ることを提案する。
二機能性shRNAをコードする前駆体配列(またはコンストラクト)は、当技術分野で周知の様々な技術および送達ビヒクルのいずれかを用いて宿主細胞に導入され得る。例えば、1つまたは複数のコンストラクトを含むウイルスベクターを用いる感染が実施され得、そのようなウイルスベクターは、好ましくは、複製欠損レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、レンチウイルスベクターまたははしかベクターを含む。加えて、1つまたは複数のコンストラクトを含むプラスミドを用いるトランスフェクションが利用され得る。そのようなプラスミドは、裸のDNAとして存在し得、または例えばリポソーム(例えば、イムノリポソーム)に付随して存在し得る。なおさらに、送達ビヒクルは、イムノリポプレックス、標的指向ナノ粒子、標的指向リポソーム、シクロデキストリン、ナノ粒子、アプタマー、デンドリマー、キトサンまたはそれらのペグ化誘導体からなり得る。送達ビヒクルの性質は、標的宿主細胞に依存して様々であり得る。
二機能性shRNAをコードするコンストラクトのインビボ送達は、標的組織に基づいて、様々な技術の任意の一つを用いて実行され得る。送達は、例えば、直接注射、吸入、静脈内注射または他の物理的方法(組織の視認可能かつアクセス可能な領域を標的指向する(例えば、裸のDNAの)マイクロ入射(micro-projectile)を通じたものを含む)であり得る。投与はさらに、適当な場合、注射針、トロカール、カニューレ、カテーテル等を通じて達成され得る。
本明細書に記載される二機能性shRNAを用いる方法に加えて、shRNA自体が提供される。したがって、さらなる局面は、個別にまたは全体で2つ以上のRNA分子をコードする単一の連続配列または複数の別個の配列を含み得る核酸配列を含む。そのような態様にしたがい、第1のRNA分子は、標的遺伝子によってコードされるmRNA転写物の一部に相補的なガイド鎖配列を含む二重鎖配列を含み、第2のRNA分子は、そのようなmRNA転写物の一部に部分的に相補的である第2のガイド鎖配列を含む第2の二重鎖配列を含む。好ましくは、第2のRNA分子の第2のガイド鎖配列は、標的遺伝子によってコードされるmRNA転写物の核酸配列とミスマッチする1つ以上の塩基を含む。さらなる局面にしたがい、本明細書に記載される核酸配列を含み、本明細書に記載される方法を実行するために使用され得、本明細書に記載される二機能性shRNAを発現する発現ベクターが提供される。
なおさらに、様々なタイプの癌を含むがこれらに限定されない1つまたは複数の医学的状態を予防、処置および/またはその影響を緩和するために核酸配列および二機能性shRNAを用いる方法が、本明細書に記載される。例えば、本発明は、本明細書に記載される二機能性shRNAが癌細胞増殖、生存および/または転移に関係する1つまたは複数の標的遺伝子の発現レベルを減少させるために使用され得ることを提案する。例えば、以下の実施例で実証されているように、二機能性shRNAは、癌細胞において過剰発現されることが見出されているスキャホールドタンパク質をコードする特定の標的遺伝子の発現レベルを減少させるために使用され得る。そのような標的遺伝子の非限定的な例は、K-rasを含む。
RNA干渉:動物および植物細胞への人工二重鎖低分子干渉RNA(siRNA)の導入は、相補的配列を有する標的化されたmRNA分子の分解を誘導することができ;このプロセスは、RNA干渉(RNAi)として公知となっている(Sharp 2001; Hutvagner and Zamore 2002; Zamore 2002)(米国特許第6,506,559号を参照のこと)。RNAiは、治療用途で大きな可能性を有する有用な実験ツールであることが分かっている(Fire, Xu et al. 1998; Hammond, Bernstein et al. 2000; Elbashir, Harborth et al. 2001; Senzer, Rao et al. 2009; Wang Z 2011)。しかし、哺乳動物細胞において、shRNAを用いるRNAiの誘導は、RNAオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを必要とし、これは、非効率的であり得、有効なサイレンシングの期間がビヒクルの崩壊時間およびsiRNAの生物学的半減期によって制限される。これらの制限にもかかわらず、第I相臨床研究の最近の早期結果の報告において、Davisらは、リボヌクレオチドレダクターゼのM2サブユニット(RRM2)を標的指向するペグ化、トランスフェリン修飾されたシクロデキストリンベースのsiRNA(CALAA-01)の全身送達による標的特異的なサイレンシングおよび部位特異的な切断を、説得力をもって実証した(Davis, Zuckerman et al. 2010)。用量増加第I相研究により処置された生検検査可能な黒色腫を有する3名の報告されている患者は、21日周期の第1、3、8、および10日に静脈内注入によって、18、24、または30 mg/m2のCALAA-01を投与された。任意の生検は、各々において、第1周の最終投薬後に行われ、保管されていた腫瘍と比較され、そして30 mg/m2で処置された患者においては、第1周の1ヶ月後(第2周の開始前)および第2周の最終投薬日に行われた。RRM2 mRNAの減少は、30 mg/m2で、第2周後および前の組織サンプルを比較するqRT-PCRによって確認された。同じ患者において、第1周の前および後の両方の免疫組織化学およびウェスタンブロットは、MMR2タンパク質の5分の1減少を示した。提案された作用機構を支持するように、5'-RLM-RACE(相補的DNA末端の5'-RNA-リガーゼ媒介高速増幅)は、予想された切断部位を確認した。この、(透過型電子顕微鏡を用いた)標的化された腫瘍細胞への侵入ならびにmRNAおよびタンパク質発現の減少および全身送達後の推定部位特異的siRNA切断の、ヒトにおける最初の実証は、RNAiの移行適用に推進力を与えた。
siRNAは、血清安定性、細胞取り込みおよび作用期間を増加させる化学修飾を必要とする。あるいは、siRNAは、ショートヘアピンRNA(shRNA)として構築され得る。shRNAは、細胞内でプラスミドコンストラクト上のRNAポリメラーゼIII(または低頻度で使用されるRNAポリメラーゼII)プロモーターから転写され得るステムループ構造からなる(Miyagishi and Taira 2002; Yu, DeRuiter et al. 2002)。染色体から独立したプラスミドからのshRNAの構成的発現は、合成されたsiRNAを凌ぐ利点を提供する。shRNA発現ユニットは、細胞内送達および核輸入のための様々なプラスミドおよびウイルスベクターに組み込まれ得る。加えて、ベクターベースのshRNA発現はまた、調節または誘導することができる(Gossen and Bujard 1992; Gupta, Schoer et al. 2004; Dickins, Hemann et al. 2005)。合成されたsiRNAとは対照的に、shRNAは、細胞の核内で合成され、次いでプロセシングを受け、そして細胞質に輸送されて、活性のためにRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれる(Cullen 2005)。効果的であるために、shRNAは、内因性細胞性マイクロRNA生合成機構を利用するよう設計される必要がある。
二機能性shRNA:上記のように、RNA干渉(RNAi)は、転写、転写後および翻訳機構を阻害し、それによって遺伝子発現を調整することができる天然の細胞調節プロセスである。miR30スキャホールドを用いて、本発明者らは、翻訳抑制および(保持リザバーとしてのまたは脱キャップ、脱アデニル化およびmRNA分解を促進する)pボディによる[GW182媒介]押収(切断非依存性)ならびに転写後mRNA mRNA切断(切断依存性)(Rao D 2010)を同時に誘導することにより標的遺伝子発現のより効果的なサイレンシングを実証した「二機能性」RNAi戦略を開発した。
本発明者らは、新規の二機能性shRNA(bi-shRNAi)RNA干渉(RNAi)技術を開発した。bi-shRNAiは、mRNA切断、分解および翻訳抑制を同時にもたらし他のRNAiメディエーターよりも効力が高く持続期間が長いプログラムされたエンドヌクレアーゼおよび非エンドヌクレアーゼアルゴノート(Ago)含有RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)積み込みを実現する。KRAS変異選択的ノックダウンにおけるbi-shRNAiの効力を調査するため、同じアッセイ環境において変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子のノックダウン活性を体系的に比較するインビトロデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを構築した。本発明は、例えば膵管腺癌(PDAC)の処置のためのG12D、G12V、G12R、およびG12Cに特異的な治療剤の開発を含む。
ガイド鎖の各位置に単一ヌクレオチド変異を有するG12Dを標的指向するbi-shRNA発現ベクターコンストラクトのシリーズの中で、変異対立遺伝子に対する最も際立ったノックダウン活性が、2〜4位に変異ヌクレオチドを配置することによって得られることが見出された。ガイド鎖の他の位置におけるさらなるミスマッチのノックダウン効果を試験することによって、このプロセスが配列特異的であることが決定された。同様のコンストラクトを、G12V、G12R、およびG12C変異に対して作製し、それらはそれらのそれぞれの標的変異対立遺伝子のノックダウンに関して効果的である。G12R特異的コンストラクトは、G12C変異と交差反応する。
本発明のコンストラクトを、HEK-293細胞(wt/wt)、PANC-1細胞(wt/G12D対立遺伝子)、およびMiaPaCa2細胞(wt/G12C対立遺伝子)を用いて、KRASノックダウンに関して対照ベクターと比較した。G12DおよびG12C選択的bi-shRNA発現ベクターは、PANC-1細胞およびMiaPaCa2細胞におけるそれぞれのKRAS発現の減少とは対照的に、HEK-293においてKRAS発現を減少させなかった。例えば、G12D、G12V、G12R、およびG12Cをノックダウンすることができる多量体bi-shRNAユニットを有する単一の発現コンストラクトがインビトロおよびインビボで有効性および特異性に関して試験されるべきであることが見出された。
KRAS(Kirsten-ras)オンコジーンは、膵管腺癌(PDAC)、結腸直腸および非小細胞肺癌(NSCLC)の高い割合で変異する(Downward J, Nat Rev Cancer. 2003;3:11-22)。KRAS変異を有する大部分のPDAC(70〜90%)患者において、5年生存率は、5%未満である(Saif MW et al. World J Gastroenterol. 2007;13;4423-4430)。KRASは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、上皮成長因子受容体(EGFR)を含む複数の細胞内シグナル伝達経路の不可欠な構成要素である。KRASにおける変異の圧倒的多数は、コドン12または13において単一アミノ酸置換をもたらす単一ヌクレオチド体細胞変異である。G12D、G12V、G12R、およびG12C KRAS変異は、PADC患者において見出されるKRAS変異の>90%を占める(COSMIC Database, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)。KRAS変異は、原則的に、構成的に活性なKRASおよび調節されない下流シグナル伝達をもたらす(Schubbert S, et al. Nat Rev Cancer. 2007; 7: 295-308)。加えて、標的指向薬剤、例えば抗体セツキシマブ(結腸直腸癌の場合)および低分子阻害剤ベムラフェニブ(BRAF変異黒色腫の場合)は、KRAS変異を有する患者においてはほとんど効果がない(Karapetis CS, et al. N Engl J Med 2008; 259 (17): 1757-1765)。結果として、効果的な癌治療戦略には、野生型機能は控えてKRAS変異への選択性が必要とされる。本発明者らは最近、新規の二機能性shRNA RNA干渉(bi-shRNAi)技術を開発した。bi-shRNAiは、mRNA切断、分解および翻訳抑制を同時にもたらし他のRNAiメディエーターよりも効力が高く持続期間が長いプログラムされたエンドヌクレアーゼおよび非エンドヌクレアーゼアルゴノートタンパク質(Ago)含有RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)積み込みを実現する。
本発明者らは、鍵となるオンコジーン核受容体コアクチベーターとしてSRC-3を標的化した;この核ホルモン受容体コアクチベーターは、核受容体が転写因子として機能し、ステロイドホルモンに対する生物学的応答の大きさを決定するレオスタットとして鍵となる役割を果たすのに必要とされる;ステロイド受容体コアクチベーター-3/乳癌内増幅体1(steroid receptor coactivator-3/amplified in breast cancer 1; SRC-3)の過剰発現は、幅広い癌に関連し、ホルモン依存性癌、例えば乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、および前立腺癌、ならびに膵臓癌、食道癌、鼻咽頭癌、尿路上皮癌、および結腸直腸癌を含む他の癌において高い比率で頻繁に過剰発現される。それが最初に特徴づけられた乳癌、および卵巣癌において、SRC-3遺伝子は、乳癌のおよそ10%で増幅され、そのmRNAはおよそ64%の期間で過剰発現され、そしてSRC-3の発現上昇はまたタモキシフェン療法に対する抵抗性および良くない疾患結果に関連する。
SRC-3は、米国において毎年推定322,000の新規の癌の症例および91,000の癌死で過剰発現され、SRC-3の試験的標的化は、乳癌細胞増殖を制限し、癌細胞増殖を阻止するSERMの能力を回復し、BT-474乳癌細胞におけるSRC-3発現のsiRNA媒介破壊は、4-ヒドロキシタモキシフェンの増殖阻害効果を回復し、SRC-3発現のsiRNA媒介破壊はまた、様々な細胞系において上皮成長因子(EGF)活性を低下させ、そしてSRC-3のsiRNA標的化はE2Fの転写活性を減少させ、S期への移行に重要な遺伝子の発現を低下させる。
SRC-3の過剰発現は、前立腺癌細胞の増殖を促進し、それに対してSRC-3ノックアウトマウスにおいてはAKTシグナル伝達が下方調節され、SRC-3を過剰発現するトランスジェニックマウスは自然発生的な悪性乳腺腫瘍を生じ、対照的に、SRC-3ノックアウトマウスは化学発癌物質により誘導されるおよびウイルスにより誘導される乳腺腫瘍発生に対する耐性を有し、さらに、SRC-3-/-マウスは、誘導された前立腺癌の進行に対する耐性を有する。本発明者らはまた、多くの進行型ホルモン抵抗性乳癌がERαの発現を停止することおよびSRC-3の細胞内タンパク質濃度を減少させる薬剤がより包括的であり、ERα陽性または陰性の両方の乳癌において抗癌剤として機能することを見出している。
SRC-3、EGFR、および変異KRAS(G12C)を標的指向するよう設計された多標的指向bi-shRNAは、肺癌細胞増殖を弱めることができる。図1は、SRC-3、EGFR、および変異KRAS(G12C)を標的指向するよう設計された多標的指向bi-shRNAの使用により肺癌細胞増殖を弱めることができる結果を示している。SRC-3、EGFR、および変異形態のKRAS(G12C)を発現するH358肺癌細胞株を、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いて、これらの3つのオンコジーンを標的指向する2つの異なる三標的指向bi-shRNA(pGBI-160もしくはpGBI-161)またはリポプレックスのみ対照(lipo)を、一過的にトランスフェクトした。細胞増殖を、第1、第2、および第3日に、比色MTSアッセイを用いてアッセイし、トランスフェクション日(第0日)に決定されたMTS値に対して標準化した。第4日に、細胞を収集し、SRC-3ノックダウンの程度をウェスタン分析によってアッセイした。
材料および方法:H358肺癌細胞:H358肺癌細胞は、American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA)から入手した。細胞を、10%ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン(100 U/ml)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で維持し、5% CO2下、37℃で培養した。
細胞増殖アッセイ:上記のすべての細胞株を、96ウェルプレートに播種し、リポフェクタミン2000と複合体化させたbi-shRNAベクター、または対照としてのリポフェクタミン2000のみで処置した。1、2、または3日後、細胞増殖を、製造元の指示にしたがいMTSアッセイ(Promega)を用いて決定した。
図2は、本発明の1つのコンストラクト、pGBI-160を示している。
図3は、本発明の1つのコンストラクト、pGBI-161を示している。
KRAS(Kirsten-ras)オンコジーンは、膵管腺癌(PDAC)、結腸直腸および非小細胞肺癌(NSCLC)の高い割合で変異する。KRAS変異を有する大部分のPDAC(70〜90%)患者において、5年生存率は、5%未満である(Saif MW et al. World J Gastroenterol. 2007;13;4423-4430)。KRASは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、上皮成長因子受容体(EGFR)を含む複数の細胞内シグナル伝達経路の不可欠な構成要素である。KRASにおける変異の圧倒的多数は、コドン12または13において単一アミノ酸置換をもたらす単一ヌクレオチド体細胞変異である。G12D、G12V、G12R、およびG12C KRAS変異は、PADC患者において見出されるKRAS変異の>90%を占める。KRAS変異は、原則的に、構成的に活性なKRASおよび調節されない下流シグナル伝達をもたらす。加えて、標的指向薬剤、例えば抗体セツキシマブ(結腸直腸癌の場合)および低分子阻害剤ベムラフェニブ(BRAF変異黒色腫の場合)は、KRAS変異を有する患者においてはほとんど効果がない。結果として、効果的な癌治療戦略には、野生型機能は控えてKRAS変異への選択性が必要とされる。本発明者らは最近、新規の二機能性shRNA RNA干渉(bi-shRNAi)技術を開発した。bi-shRNAiは、mRNA切断、分解、および翻訳抑制を同時にもたらし他のRNAiメディエーターよりも効力が高く持続期間が長いプログラムされたエンドヌクレアーゼおよび非エンドヌクレアーゼアルゴノートタンパク質(Ago)含有RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)積み込みを実現する。KRAS変異選択的ノックダウンにおけるbi-shRNAiの効力を調査するため、同じアッセイ環境において変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子のノックダウン活性を体系的に比較するインビトロデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを構築した。このプロジェクトの目的は、PDACの処置のためのG12D、G12V、G12R、およびG12C変異対立遺伝子を特異的に標的指向する単一治療剤を開発することである。
siRNAが対立遺伝子特異的ノックダウンに関して単一ヌクレオチド相違する遺伝子間を区別するかどうかは、体系的に分析されている。KRAS変異に対する対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングは、単一のG12C、G12D、またはG12V KRAS変異に関して報告されている。しかし、単一の薬剤によって複数のKRAS変異のノックダウンを達成する試みは、報告されていない。本発明は、PDACの4つの鍵となるKRAS変異に関してmRNAおよびタンパク質発現のノックダウンの組み合わせをもたらす多量体アプローチを含む。以下は、本明細書で教示される多量体の一部としてK-RASを標的指向するために本発明において使用することができる具体的なインサートの例である。本発明は、これらのインサートを含み、例えば、各インサートは、k-ras mRNA内の同一変異を標的指向し得、または異なるK-RAS変異を標的指向し得、またはその組み合わせを標的指向し得る。三量体インサートの場合、RNAi標的指向インサートのうち1つもしくは複数は、標準的なshRNAもしくはRNAiインサートであり得、または1つもしくは複数はbi-shRNAであり得、またはその組み合わせであり得、各々が同一の変異遺伝子または異なる変異の、k-ras mRNAの同一部分または異なる部分を標的指向する。以下は、K-RASの異なる変異を標的指向することができるインサートの非限定的な例である。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド1090〜1108)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド1304〜1322)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド1090〜1108)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド1684〜1702)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド1331〜1349)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド2791〜2809)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド3361〜3381)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド1304〜1322)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド1090〜1108)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド1684〜1702)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド1331〜1349)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド2791〜2809)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
二重下線配列領域はセンス配列(ヌクレオチド3361〜3381)に対応し、下線領域はアンチセンス配列に対応する。
乳癌コンストラクト。以下のコンストラクトを作製した:PI3K E545K + SRC-3 + ER-α(NR3A1)標的指向ベクターの作製。
SRC-3を標的指向する二機能性shRNAの非限定的な例は、非常に効果的でありかつ従来的なshRNAまたはsiRNAよりも有意に低い濃度でRNAiをもたらすという利点を有する。本発明者らは、SRC-3を最適に標的指向しその発現を減少させるbi-shRNAを開発した。図5は、細胞増殖アッセイを実施し、乳癌細胞増殖を阻止するSRC-3およびSRC-1 bi-shRNAベクターの能力を試験したことを示している。MCF-7細胞にSRC-1およびSRC-3 bio-shRNAベクターをトランスフェクトし、4(図6Aおよび6B)日後にMTTアッセイを通じて細胞増殖に対するそれらの効果を測定した。すべてのSRC標的指向ベクターは、陰性対照(siGFP)とは対照的に細胞増殖を効果的に減少させることができた。同様に、増殖の阻害は、SRC-1およびSRC-3 bi-shRNAベクターをトランスフェクトしたMDA-MB-231細胞においても観察された。これらの結果は、SRC-1およびSRC-3のbi-shRNAベースの標的指向がインビトロで乳癌細胞増殖を減少させることができることを裏付けるものである。
図6Aは、増殖の変化を示すグラフであり、図6Bは、本発明の図5および6に示されるコンストラクト、すなわち、pGBI-162: PI3K E545K + SRC-3 + ER-α(NR3A1)標的指向ベクターおよびpGBI-163: SRC-3 + ER-α(NR3A1) + PI3K E545K標的指向ベクターを用いてMCF-7乳癌細胞株において得られた結果を示すブロットである。
本明細書で議論されている任意の態様が本発明の任意の方法、キット、試薬または組成物との関係で実施され得ることが想定されており、その逆も同様である。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。
本明細書に記載されている具体的態様は、例示目的で示されており、本発明の限定として示されているのではないことが理解されるであろう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な態様において用いられ得る。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書に記載される具体的手順の多くの等価物を認識するまたは確認することができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であるとみなされ、特許請求の範囲に包含される。
本明細書で言及されているすべての刊行物および特許出願は、本発明の属する技術の分野における当業者のレベルを示している。すべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されているかのごとく、参照により本明細書に組み入れられる。
「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語の使用は、特許請求の範囲および/または明細書において「含む」という用語に関連して使用される場合、「1つ」を意味し得るが、それはまた「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つまたは2つ以上」の意味でも用いられる。本開示は択一選択肢のみおよび「および/または、ならびに/または、および/もしくは、ならびに/もしくは」を表す定義をサポートしているものの、特許請求の範囲における「または、もしくは」という用語の使用は、択一選択肢のみを表すことが明示的に示されていない限りまたは択一選択肢が相互に排他的でない限り、「および/または、ならびに/または、および/もしくは、ならびに/もしくは」を意味するよう使用される。本願を通じて、「約」という用語は、値が、その値を決定するために用いられる装置、方法に関して固有の誤差、または研究対象間に存在するばらつきを含むことを示すために使用される。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「含む(comprising)」(および含むの任意の形態、例えば、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」)、「有する(having)」(および有するの任意の形態、例えば、「有する(have)」および「有する(has)」)、「含む(including)」(および含むの任意の形態、例えば、「含む(includes)」および「含む(include)」)または含む(containing)(および含むの任意の形態、例えば、「含む(contains)」および「含む(contain)」)は、包括的かつオープンエンド型であり、さらなる言外の要素または方法の工程を排除しない。
「またはそれらの組み合わせ」という用語は、本明細書で使用される場合、その用語の前に列挙されている事項のすべての順列および組み合わせを表す。例えば、「A、B、C、またはその組み合わせ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABC、および特定の状況下で順序が重要である場合は、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABのうち少なくとも1つを含むことが意図される。この例に関連して、1つまたは複数の事項または項の繰り返し、例えば、BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等を含む組み合わせも明示的に含まれる。当業者は、典型的に、そうでないことが文脈から明らかでない限り、任意の組み合わせにおける項目または項の数に関して制限がないことを理解するであろう。
本明細書で使用される場合、近似の単語、例えば、非限定的に、「約」、「実質的」または「実質的に」は、そのように修飾された場合に、必ずしも絶対的または完全ではないことが理解されるが、当業者がその条件を存在しているままに指定するのを保証するのに十分近いとみなされる条件を表す。記述にばらつきがあり得る範囲は、どのくらい大きな変化が想定され得るかに依存し、当業者は、必要とされる特徴をなおも有する修飾された特徴および未修飾の特徴の能力をなおも認識するであろう。一般論として、しかし既出の議論に適用されるが、近似の単語、例えば「約」によって修飾されている本明細書の数値は、表示されている値から少なくとも±0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15%変動し得る。
本明細書で開示され特許請求されているすべての組成物および/または方法は、本願に照らせば、過度の実験を行うことなく作製および実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様の観点で記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物および/または方法に対してならびに方法の工程においてまたは一連の工程においてバリエーションが適用され得ることが当業者に明らかであろう。当業者に明らかなすべてのそのような類似の代替物および修飾物は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
Claims (43)
- 第1の遺伝子標的の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子;
第2の遺伝子標的の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子;および
第3の遺伝子標的の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子
を含み、二機能性RNA分子の各々が、第1、第2、および第3の遺伝子標的の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができる、3つ以上の遺伝子の発現を減少させることができる二機能性shRNA組成物。 - 二機能性shRNAの各々がベクターに挿入されている、請求項1記載の二機能性shRNA。
- 組成物が、SEQ ID NO:1、3、42、または43により定義されるベクターとしてさらに定義される、請求項1記載の二機能性shRNA。
- 二機能性shRNAが、SEQ ID NO:2、4、40、または41により定義される少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項1記載の二機能性shRNA。
- 第1の二機能性RNAの少なくとも1つの標的部位が、G12C、G12D、G12V、またはG12R変異のうち少なくとも1つを有するヒトKRAS遺伝子としてさらに定義される変異KRAS遺伝子を選択的に標的指向する、請求項1記載の二機能性shRNA。
- 少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子が、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される、請求項1記載の二機能性shRNA。
- 正常なRASの発現が、第1の二機能性RNA分子によって機能的な生理学的レベル未満に減少されない、請求項1記載の二機能性shRNA。
- SRC-3またはEGFRのうち少なくとも一方が正常なヒト遺伝子である、請求項1記載の二機能性shRNA。
- プロモーター;ならびに
該プロモーターに機能的に連結された核酸インサート
を含む発現ベクターであって、該インサートが、
第1の標的遺伝子の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子;
第2の標的遺伝子の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子;および
第3の標的遺伝子の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子
を含み、二機能性RNA分子が、第1、第2、および第3の標的遺伝子の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができ、1つまたは複数のshRNAが、第1、第2、および第3の標的遺伝子の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させる二機能性RNA分子を含む、発現ベクター。 - 組成物が、SEQ ID NO:1、3、46、または47によって定義されるベクターとしてさらに定義される、請求項9記載の発現ベクター。
- 二機能性shRNAが、SEQ ID NO:2、4、44、または45によって定義される少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項9記載の発現ベクター。
- 少なくとも1つの遺伝子標的が、G12C、G12D、G12V、またはG12R変異のうち少なくとも1つを有するヒトKRAS遺伝子としてさらに定義される変異KRAS遺伝子を選択的に標的指向する二機能性shRNAを含む、請求項9記載の発現ベクター。
- 少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子が、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される、請求項9記載の発現ベクター。
- 核酸インサートが、1つまたは複数の変異遺伝子または正常遺伝子の発現を減少させることができる1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーの二機能性shRNAインサートを含む、請求項9記載の発現ベクター。
- 治療剤キャリア;ならびに
プロモーターおよび該プロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含む発現ベクター
を含む治療送達システムであって、該核酸インサートが、
第1の遺伝子標的の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子;
第2の遺伝子標的の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子;および
第3の遺伝子標的の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子
をコードし、二機能性RNA分子の各々が、第1、第2、および第3の遺伝子標的の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができる、治療送達システム。 - 組成物が、SEQ ID NO:1、3、46、または47によって定義されるベクターとしてさらに定義される、請求項15記載の送達システム。
- 二機能性shRNAが、SEQ ID NO:2、4、44、または45によって定義される少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項15記載の送達システム。
- 少なくとも1つの遺伝子標的が、G12C、G12D、G12V、またはG12R変異のうち少なくとも1つを有するヒトKRAS遺伝子としてさらに定義される変異KRAS遺伝子を選択的に標的指向する二機能性shRNAを含む、請求項15記載の送達システム。
- 少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子が、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される、請求項15記載の送達システム。
- 核酸インサートが、1つまたは複数の変異遺伝子または正常遺伝子の発現を減少させることができる1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーの二機能性shRNAインサートを含む、請求項15記載の送達システム。
- KRAS、SRC-3、およびEGFR遺伝子を発現する標的組織に1つまたは複数のshRNAを送達する方法であって、以下の工程を含む、方法:
プロモーターおよび該プロモーターに機能的に連結された1つまたは複数のshRNAをコードする核酸インサートを含む発現ベクターを調製する工程であって、1つまたは複数のshRNAがプロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含み、該インサートが、
第1の遺伝子標的の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子;
第2の遺伝子標的の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子;および
第3の遺伝子標的の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子
を含み、二機能性RNA分子の各々が、第1、第2、および第3の遺伝子標的の発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができる、工程;
発現ベクターを治療剤キャリアと組み合わせる工程であって、治療剤キャリアがリポソームを含む、工程;ならびに
治療有効量の発現ベクター・治療剤キャリア複合体を、それを必要とする患者に投与する工程。 - 組成物が、SEQ ID NO:1、3、46、または47によって定義されるベクターとしてさらに定義される、請求項21記載の方法。
- 二機能性shRNAが、SEQ ID NO:2、4、44、または45によって定義される少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項21記載の方法。
- 少なくとも1つの遺伝子標的が、G12C、G12D、G12V、またはG12R変異のうち少なくとも1つを有するヒトKRAS遺伝子としてさらに定義される変異KRAS遺伝子を選択的に標的指向する二機能性shRNAを含む、請求項21記載の方法。
- 少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子が、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される、請求項21記載の方法。
- 核酸インサートが、1つまたは複数の変異遺伝子または正常遺伝子の発現を減少させることができる1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーの二機能性shRNAインサートを含む、請求項21記載の方法。
- ヒト対象において腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、以下の工程を含む、方法:
腫瘍細胞増殖の抑制を必要とするヒト対象を特定する工程;ならびに
腫瘍細胞増殖を抑制するのに十分な量の治療剤キャリア複合体中の発現ベクターをヒト対象に投与する工程であって、発現ベクターがプロモーターに機能的に連結された核酸インサートを含み、該インサートが、
変異KRAS遺伝子の発現を減少させる第1の二機能性RNA分子;
SRC-3遺伝子の発現を減少させる第2の二機能性RNA分子;および
上皮増殖因子受容体(EGFR)遺伝子の発現を減少させる第3の二機能性RNA分子
を含み、二機能性RNA分子が、変異KRAS、SRC-3、およびEGFRの発現レベルを減少させる切断依存性および切断非依存性RNA誘導サイレンシング複合体を活性化させることができ、この阻害が腫瘍細胞のアポトーシス、増殖停止または浸潤減少をもたらす、工程。 - 核酸インサートが、SEQ ID NO:2または4を含む、請求項27記載の方法。
- K-RASに対する少なくとも1つの核酸インサートが、SEQ ID NO:5〜26から選択される、請求項27記載の方法。
- SRC-3に対する少なくとも1つの核酸インサートが、SEQ ID NO:27〜36から選択される、請求項27記載の方法。
- EGFRに対する少なくとも1つの核酸インサートが、SEQ ID NO:48〜49から選択される、請求項27記載の方法。
- 投与が、腫瘍内、皮下、静脈内、腹腔内、筋内、および静脈内注射からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
- 腫瘍細胞増殖が変異KRASを発現する、請求項27記載の方法。
- 腫瘍細胞増殖が肺癌である、請求項27記載の方法。
- 第2の抗新生物剤との併用療法をさらに含む、請求項27記載の方法。
- 癌の処置に有用であると考えられる候補薬物を評価する方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)以下:
癌細胞または組織における、少なくとも野生型KRASおよび1つまたは複数の変異KRAS、ならびに2つ以上の標的遺伝子の発現のレベル;
癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS遺伝子および2つ以上の標的遺伝子の発現低下を伴う細胞環境における候補遺伝子または候補遺伝子群の発現のレベル;
癌細胞または組織における、1つまたは複数の変異KRAS遺伝子および2つ以上の標的遺伝子の発現低下を含む細胞の表現型に対する候補薬物の効果
のうち1つまたは複数を測定する工程;
(b)癌細胞または組織の第1のサブセットに対して候補薬物を、および癌細胞または組織の第2のサブセットに対してプラセボを投与する工程;
(c)候補薬物またはプラセボの投与後に工程(a)を繰り返す工程;ならびに
(d)肺癌細胞または組織の第2のサブセットにおいて生じる減少と比べて統計的に有意である、正常KRASを発現する細胞環境と比較して変異KRASおよび2つ以上の標的遺伝子の発現が減少した細胞環境において決定された表現型を生じさせるのに、候補薬物が効果的であるかどうかを決定する工程であって、統計的に有意な減少が、候補薬物が癌の処置に有用であることを示す、工程。 - 癌が、脳、膀胱、血液、骨、乳房、子宮頸部、結腸直腸、胃腸、内分泌、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または甲状腺から選択される、請求項36記載の方法。
- 変異KRASが選択的にノックダウンされ、2つ以上の標的遺伝子がSRC-3、EGFR、PIK3、NCOA3、またはERalpha 1から選択され、インサートがRNAi、shRNA、またはbi-shRNAのうち少なくとも1つから選択される、請求項36記載の方法。
- ヒト対象において腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、以下の工程を含む、方法:
ヒト対象から腫瘍細胞サンプルを得る工程;
腫瘍細胞増殖を防止するために抑制を必要とするヒト対象において1つまたは複数の標的遺伝子または遺伝子群を同定する工程;
腫瘍細胞サンプルにおいて同定された遺伝子または遺伝子群を特異的に標的指向する2つ以上のRNAi核酸セグメントを発現するインサートを含む発現ベクターを構築する工程であって、インサートが、腫瘍細胞内で同定された同一または異なる標的遺伝子または遺伝子群の発現を減少させる第1および第2のRNAi核酸を含む、工程;
2つ以上のRNAi核酸セグメントを発現させるのに十分な量の治療剤キャリア複合体中の発現ベクターをヒト対象に投与する工程;ならびに
遺伝子または遺伝子群が標的腫瘍細胞において発現ベクターによってノックダウンされたかどうかを決定する工程であって、この阻害が腫瘍細胞のアポトーシス、増殖停止または浸潤減少をもたらす、工程。 - RNAiが、miRNAおよびshRNAおよびsiRNAまたはbi-shRNAのうち少なくとも1つから選択される、請求項39記載の方法。
- 少なくとも第1、第2、または第3の二機能性RNA分子が、SEQ ID NO:5〜26、SEQ ID NO:27〜36、SEQ ID NO:38〜39、SEQ ID NO:40〜41、SEQ ID NO:42〜43、SEQ ID NO:48〜49、またはSEQ ID NO:50〜126から選択される、請求項39記載の方法。
- インサートが、1つまたは複数の変異遺伝子または正常遺伝子の発現を減少させることができる3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75、または100コピーのRNAiインサートをさらに含む、請求項39記載の方法。
- 発現ベクターが、ベクター-A-B-C-ベクター という構造を含むようにさらに定義され、A、B、およびCが、1つもしくは複数の標的遺伝子のmRNAの同一領域、1つもしくは複数の標的遺伝子のmRNAの異なる領域、または2つ以上の標的遺伝子由来の異なるmRNAを標的とすることができる3つ以上のRNAi核酸セグメントである、請求項39記載の方法。
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