JP6283661B2 - 一塩基ＫＲＡＳ変異に特異的な二機能性低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ＢＩ−ＳＨＲＮＡ，Ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＳｈｏｒｔ−ＨａｉｒｐｉｎＲＮＡ） - Google Patents

Description

本発明は一般的にはがん処置の分野に、さらに詳細にはＫ−ｒａｓ変異に特異的である二機能性ｓｈＲＮＡに関する。

本発明の範囲を限定することなく、Ｋ−ｒａｓに関連してその背景を記載する。

ＫＲＡＳ（キルステン（Kirsten）−ｒａｓ）がん遺伝子は、かなりの割合の膵管腺癌（ＰＤＡＣ，pancreatic ductal adenocarcinoma）、結腸直腸癌及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ，non-small-cell lung cancers）において変異している。ＫＲＡＳ変異を担持している大多数のＰＤＡＣ（７０〜９０％）患者では、５年生存率は５％未満である。ＫＲＡＳはグアニンヌクレオチド結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ，epidermal growth factor receptor）を含む複数の細胞内シグナル伝達経路の不可欠の構成要素である。ＫＲＡＳ内の圧倒的多数の変異がコドン１２又は１３に単一アミノ酸置換を生じる一塩基体細胞変異である。Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃ ＫＲＡＳ変異は、ＰＡＤＣ患者に見出されるＫＲＡＳ変異の９０％超を占める。ＫＲＡＳ変異は基本的に構成的活性ＫＲＡＳ及び制御されない下流シグナル伝達を生じる。

抗体セツキシマブ（結腸直腸がんにおいて）及び小分子阻害剤ベムラフェニブ（ＢＲＡＦ変異黒色腫において）などの標的薬剤はＫＲＡＳ変異を抱えた患者では成績が良くない。したがって、効果的がん療法戦略には、野生型機能性を分け与えるＫＲＡＳ変異選択性が必要である。ＫＲＡＳ変異を有するがんに対する組成物、方法及び処置の大きな必要性が残っている。

一実施形態では、本発明はＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を減少させることができる二機能性ｓｈＲＮＡであって、二機能性ｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つの標的部位配列がＫ−ｒａｓ遺伝子内に位置しており、二機能性ｓｈＲＮＡ分子がＫ−ｒａｓの発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化することができる、二機能性ｓｈＲＮＡを包含する。一態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは、配列番号１〜２２により定義される少なくとも１つの配列を含む。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは、配列番号３１〜５２、又は５３〜５６により定義される少なくとも１つの配列を含む。別の態様では、少なくとも１つの標的部位配列はヒトＫ−ｒａｓ遺伝子ｃＤＮＡ配列（配列番号２７〜３０）内にある。別の態様では、Ｋ−ｒａｓは変異Ｋ−ｒａｓである。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは、配列番号２、１８、２０、２１、又は配列番号２と、配列番号１８と、配列番号２０との組合せ、若しくは配列番号２１と、配列番号２と、配列番号１８との組合せから選択される特異的Ｋ−ｒａｓ変異を標的にするトリプレットインサートを含む。

一実施形態では、本発明は、プロモーターと、ＲＮＡ干渉を通じてＫ−ｒａｓ遺伝子である少なくとも１つの標的遺伝子の発現を阻害することができる１又は２以上のｓｈＲＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートとを含む発現ベクターであって、１又は２以上のｓｈＲＮＡがＫ−ｒａｓの発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する二機能性ｓｈＲＮＡ分子を含む、前記発現ベクターを包含する。一態様では、標的遺伝子配列は配列番号１〜５を含む。別の態様では、ｓｈＲＮＡの配列配置は、Ｋ−ｒａｓ−ＴＡ−１５ヌクレオチドループ−１９ヌクレオチド標的相補的配列−３’ステムアーム−スペーサー−５’ステムアーム−１９ヌクレオチド標的バリアント−ＴＡ−１５ヌクレオチドループ−１９ヌクレオチド標的相補的配列−３’ステムループである、５’ステムアーム−１９ヌクレオチド標的を含む。別の態様では、核酸インサートは、配列番号６〜２７から選択される少なくとも１つの配列を含む。別の態様では、少なくとも１つのｓｈＲＮＡは変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子ｃＤＮＡ配列内にある標的部位配列を有する。別の態様では、本発明は、治療薬担体と、プロモーター及びプロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートを含む発現ベクターであって、核酸インサートがＲＮＡ干渉を通じてＫ−ｒａｓ遺伝子である標的遺伝子の発現を阻害することができる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ，short hairpin RNA）をコードする、前記発現ベクターとを含む治療送達システムであって、１又は２以上のｓｈＲＮＡがＫ−ｒａｓの発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する二機能性ＲＮＡ分子を含む、前記治療送達システムを包含する。別の態様では、治療薬担体は緻密化されたＤＮＡナノ粒子である。別の態様では、ＤＮＡナノ粒子は１又は２以上のポリカチオンで緻密化されている。別の態様では、１又は２以上のポリカチオンは１０ｋＤＡポリエチレングリコール（ＰＥＧ，polyethylene glycol）置換システイン−リジン３ｍｅｒペプチド（ＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）である。別の態様では、緻密化されたＤＮＡナノ粒子はさらにリポソームに被包されている。別の態様では、リポソームは二層陥入ベシクル（ＢＩＶ，bilamellar invaginated vesicle）である。別の態様では、リポソームは可逆的にマスクされたリポソームである。別の態様では、治療薬担体はリポソームである。別の態様では、標的遺伝子配列は配列番号２７〜３０を含む。別の態様では、核酸インサートは、配列番号３１〜５２又は５３〜５６から選択される配列のうちの少なくとも１つを含む。別の態様では、インサートは配列番号１〜２２から選択される。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは、配列番号２、１８、２０、２１、５５、又は配列番号２と、配列番号１８と、配列番号２０との組合せ、若しくは配列番号２１と、配列番号２と、配列番号１８との組合せから選択される特異的Ｋ−ｒａｓ変異を標的にするトリプレットインサートを含む。

一実施形態では、本発明は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子を発現している標的組織に１又は２以上のｓｈＲＮＡを送達するための方法であって、プロモーターと、プロモーターに作動可能に連結され、１又は２以上のｓｈＲＮＡをコードする核酸インサートとを含む発現ベクターであって、１又は２以上のｓｈＲＮＡがＫ−ｒａｓの発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する二機能性ＲＮＡ分子を含む、前記発現ベクターを調製するステップと、発現ベクターを、リポソームを含む治療薬担体と組み合わせるステップと、治療的有効量の発現ベクターと治療薬担体複合体を、それを必要とする患者に投与するステップとを含む、前記方法を包含する。一態様では、治療薬担体は緻密化されたＤＮＡナノ粒子である。別の態様では、ＤＮＡナノ粒子は１又は２以上のポリカチオンで緻密化され、１又は２以上のポリカチオンは１０ｋＤＡポリエチレングリコール（ＰＥＧ）置換システイン−リジン３ｍｅｒペプチド（ＣＫ３０ＰＥＧ１０ｋ）又は３０ｍｅｒリジン濃縮ペプチドを含む。別の態様では、緻密化されたＤＮＡナノ粒子はさらにリポソームに被包されており、リポソームは二層陥入ベシクル（ＢＩＶ）であり、１又は２以上の「スマート（smart）」受容体ターゲティング部分で修飾されている。別の態様では、１又は２以上の「スマート」受容体ターゲティング部分は小分子二価ベータターン（beta-turn）模倣物である。別の態様では、リポソームは可逆的にマスクされたリポソームである。別の態様では、リポソームは二層陥入ベシクル（ＢＩＶ）である。別の態様では、リポソームは可逆的にマスクされたリポソームである。別の態様では、１又は２以上の「スマート」受容体ターゲティング部分は小分子二価ベータターン模倣物である。別の態様では、核酸インサートは配列番号１〜２２又は５３〜５６から選択される配列を含む。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは、配列番号２、１８、２０、２１、又は配列番号２と、配列番号１８と、配列番号２０との組合せ、若しくは配列番号２１と、配列番号２と、配列番号１８との組合せから選択される特異的Ｋ−ｒａｓ変異を標的にするトリプレットインサートを含む。

一実施形態では、本発明は、１又は２以上の標的細胞においてＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、１又は２以上の標的細胞を選択するステップと、標的細胞にＲＮＡ干渉によって、１又は２以上の標的細胞においてＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害することができる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するベクターをトランスフェクトするステップであって、１又は２以上のｓｈＲＮＡがＫ−ｒａｓの発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する二機能性ＲＮＡ分子を含む、ステップとを含む、前記方法を包含する。別の態様では、ｓｈＲＮＡはｓｉＲＮＡ（切断依存性）及びｍｉＲＮＡ（切断非依存性）モチーフを組み込む。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは配列番号２、１８、２０、２１、又は配列番号２と、配列番号１８と、配列番号２０との組合せ、若しくは配列番号２１と、配列番号２と、配列番号１８との組合せから選択される特異的Ｋ−ｒａｓ変異を標的にするトリプレットインサートを含む。

一実施形態では、本発明は、ヒト対象において腫瘍細胞増殖を抑制する方法であって、腫瘍細胞増殖の抑制を必要とするヒト対象を特定するステップと、治療薬担体複合体中の発現ベクターを、腫瘍細胞増殖を抑制するのに十分な量でヒト対象に投与するステップであって、発現ベクターがＲＮＡ干渉によって、１又は２以上の標的細胞においてＫ−ｒａｓである標的遺伝子の発現を阻害することができる１又は２以上のｓｈＲＮＡを発現する、ステップとを含み、１又は２以上のｓｈＲＮＡが標的遺伝子の発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する二機能性ＲＮＡ分子を含み、阻害により腫瘍細胞のアポトーシス、増殖の停止、又は侵襲性の減少をもたらす、前記方法を包含する。別の態様では、治療薬担体は二層陥入ベシクル（ＢＩＶ）を含む。別の態様では、治療薬担体は、小分子二価ベータターン模倣物である１又は２以上の「スマート」受容体ターゲティング部分を含む。別の態様では、投与するステップは、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、及び静脈内注射からなる群から選択される。別の態様では、投与するステップは腫瘍内注射を含む。別の態様では、投与するステップはＤＮＡ：リポプレックスを用いた注射を含む。別の態様では、腫瘍細胞増殖はＫ−ｒａｓを発現する。別の態様では、腫瘍細胞増殖はヒト膵管腺癌である。別の態様では、腫瘍細胞増殖は肺がん、結腸がん、黒色腫、インスリノーマ、中皮腫、卵巣がん、及び膵臓がんからなる群から選択される。別の態様では、腫瘍細胞増殖は膵臓がんである。別の態様では、ｂｉｓｈＲＮＡは配列番号１〜２２、又は５３〜５６から選択される。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは配列番号２、１８、２０、２１、又は配列番号２と、配列番号１８と、配列番号２０との組合せ、若しくは配列番号２１と、配列番号２と、配列番号１８との組合せから選択される特異的Ｋ−ｒａｓ変異を標的にするトリプレットインサートを含む。別の態様では、方法は第２の抗新生物薬との併用療法をさらに含んでいてもよい。別の態様では、方法はセツキシマブ又はベムラフェニブとの併用療法をさらに含んでいてもよい。

本発明の別の実施形態は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２５、５０、７５、又は１００の、変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を減少させることができる二機能性ｓｈＲＮＡインサートを含み、二機能性ｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つの標的部位配列はＫ−ｒａｓ遺伝子内に位置しており、二機能性ｓｈＲＮＡ分子はＫ−ｒａｓの発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化することができる発現ベクターを包含する。一態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは配列番号１〜２２又は５３〜５６から選択される。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは、Ｇ１２Ｄ−Ｇ１２Ｖ−Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ−Ｇ１２Ｄ−Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｄ−Ｇ１２Ｖ−Ｇ１２Ｒ、及びＧ１２Ｃ−Ｇ１２Ｄ−Ｇ１２Ｒのうちの少なくとも１つから選択される特異的Ｋ−ｒａｓ変異を標的にするトリプレットインサートを含む。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは、配列番号２、１８、２０、２１、又は配列番号２と、配列番号１８と、配列番号２０との組合せ、若しくは配列番号２１と、配列番号２と、配列番号１８との組合せから選択される特異的Ｋ−ｒａｓ変異を標的にするトリプレットインサートを含む。

本発明の別の実施形態は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２５、５０、７５、又は１００の、変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を減少させることができる二機能性ｓｈＲＮＡインサートを包含する発現ベクターを含む細胞であって、二機能性ｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つの標的部位配列はＫ−ｒａｓ遺伝子内に位置しており、二機能性ｓｈＲＮＡ分子はＫ−ｒａｓの発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化することができる、前記細胞を包含する。一態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは配列番号１〜２２又は５３〜５６から選択される。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは非変異Ｋ−ｒａｓの発現を増加させる。別の態様では、二機能性ｓｈＲＮＡは、配列番号２、１８、２０、２１、又は配列番号２と、配列番号１８と、配列番号２０との組合せ、若しくは配列番号２１と、配列番号２と、配列番号１８との組合せから選択される特異的Ｋ−ｒａｓ変異を標的にするトリプレットインサートを含む。

本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの変異Ｋ−ｒａｓを含む細胞又は組織を処置するのに有用であると考えられる候補薬物を評価する方法であって、（ａ）細胞又は組織において野生型Ｋ−ｒａｓ及び１又は２以上の変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現のレベルを測定するステップと、（ｂ）細胞又は組織の第１のサブセットに候補薬物を、細胞又は組織の第２のサブセットにプラセボを投与するステップと、（ｃ）候補薬物又はプラセボの投与後にステップ（ａ）を繰り返すステップと、（ｄ）細胞又は組織の第２のサブセットにおいて起こる減少とも比べて統計的に有意である野生型Ｋ−ｒａｓと比べて変異Ｋ−ｒａｓの発現を候補薬物が減少させるかどうかを判定するステップであって、統計的に有意な減少が、候補薬物がＫ−ｒａｓ誘導疾患の処置において有用であることを示す、ステップとを含む、前記方法を包含する。一態様では、１又は２以上の検出可能な遺伝子をさらに発現している細胞又は組織は野生型Ｋ−ｒａｓ及び１又は２以上の変異Ｋ−ｒａｓを含むように改変されており、検出可能な標識の発現のレベルは野生型Ｋ−ｒａｓ及び１又は２以上の変異Ｋ−ｒａｓに対する候補物質の効果と相関している。別の態様では、細胞又は組織はＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を減少させることができる二機能性ｓｈＲＮＡを発現するように改変されており、二機能性ｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つの標的部位配列はＫ−ｒａｓ遺伝子内に位置しており、二機能性ｓｈＲＮＡ分子はＫ−ｒａｓの発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化することができる。

本発明の別の実施形態は、効果的にサイレンシングされている少なくとも１つの変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子を含む細胞又は組織を処置するのに有用であると考えられる候補薬物を評価する方法であって、（ａ）以下のａ．細胞又は組織中の少なくとも野生型Ｋ−ｒａｓ及び１又は２以上の変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現のレベル、ｂ．がん細胞又は組織中の１又は２以上の変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現が低下している細胞環境内の候補遺伝子又は候補遺伝子の群の発現のレベル、ｃ．がん細胞又は組織中の１又は２以上の変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現が低下している細胞の表現型に対する候補薬物の影響（effect）のうちの１又は２以上を測定するステップと、（ｂ）前記細胞又は組織の第１のサブセットに候補薬物を、前記細胞又は組織の第２のサブセットにプラセボを投与するステップと、（ｃ）候補薬物又はプラセボを投与後にステップ（ａ）を繰り返すステップと、（ｄ）前記候補薬物が、Ｋ−ｒａｓ変異体発現細胞環境と比べ、変異Ｋ−ｒａｓの発現が減少している細胞環境において決定された表現型を生じるのに効果的であるかどうかを判定するステップであって、前記Ｋ−ｒａｓ変異体発現細胞環境が、細胞又は組織の前記第２のサブセットにおいて起こる減少と比べて統計的に有意に減少し、統計的に有意な減少が、著しいＫ−ｒａｓ変異バックグラウンドのない疾患を処置するのに候補薬物が有用であることを示す、ステップとを含む、前記方法を包含する。一態様では、１又は２以上の検出可能な遺伝子をさらに発現している細胞又は組織は野生型Ｋ−ｒａｓ及び１又は２以上の変異Ｋ−ｒａｓを含むように改変されており、検出可能な標識の発現のレベルは野生型Ｋ−ｒａｓ及び１又は２以上の変異Ｋ−ｒａｓに対する候補物質の効果と相関している。別の態様では、細胞又は組織はＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を減少させることができる二機能性ｓｈＲＮＡを発現するように改変されており、二機能性ｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つの標的部位配列はＫ−ｒａｓ遺伝子内に位置しており、二機能性ｓｈＲＮＡ分子はＫ−ｒａｓの発現レベルを減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化することができる。別の態様では、細胞又は組織は、配列番号２、１８、２０、２１、又は配列番号２と、配列番号１８と、配列番号２０との組合せ、若しくは配列番号２１と、配列番号２と、配列番号１８との組合せから選択される特異的Ｋ−ｒａｓ変異を標的にする１つ又は２以上のインサートを含む二機能性ｓｈＲＮＡを発現するように改変されている。

本発明の特長及び利点をさらに完璧に理解するために、この時点で添付の図と共に本発明の詳細な説明に言及する。
試験ベクターの１つの概略図である。野生型ＫＲＡＳの最初の１７アミノ酸をｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターのウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲｌｕｃ）のアミノ末端に挿入し、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ又はＧ１２Ｃ ＫＲＡＳ変異体の最初の１７アミノ酸は同じベクター上のホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｈｌｕｃ＋）のアミノ末端に挿入した。 試験ベクターの野生型及び変異体発現の効果を示すグラフである。それぞれの試験ベクターの野生型（Ｗｔ，Wild-type）及び変異体（Ｍｕ，mutant）は、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社製）を使用して親ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターと比較した。Ｗｔ対Ｍｕ発現比較は、ウミシイタケ（ＲＬ，Renilla）対ホタル（ＦＦ，Firefly）の発現比により評価した。 本発明のアッセイシステムの実証実験を示すグラフである。試験ベクターに二機能性ｓｈＲＮＡ（ｂｉ−ｓｈＲＮＡ）発現ベクター（８６、８７、８８、８９、９０、９１又は９２、それぞれ配列番号１〜７）を同時トランスフェクトすることにより、変異体対野生型の優先的ノックダウン（図３Ａ）は、ＦＦ対ＲＬ比によりすばやく評価することができる（パネルａ）。変異体又は野生型のノックダウンは、ＦＦ（図３Ｂ）又はＲＬ（図３Ｃ）のＲＬＵを空ベクター対照（Ｃ）と比較することにより個別にさらに分析することができる。 種々の変異体についての位置効果を示すグラフである。Ｇ１２Ｄ変異体に特異的なｂｉ−ｓｈＲＮＡ構築物は、単一変異ヌクレオチド配列をガイド鎖の最初の１１位までのうちの１つに置くことにより比較した。野生型（ｗｔ）についての及び変異体（ｍｕ）についてのノックダウンの割合は構築物ごとに評価した。（ｎ＝３）。 ノックダウン効率を低下させるある種のミスマッチが導入される場合の比較を示すグラフである。中央領域（ｐ９、ｐ１０及びｐ１１）に変異ヌクレオチドを有するＧ１２Ｄ構築物を、シード領域（seed region）に又は変異ヌクレオチドの近位に追加のミスマッチを有する構築物と比較した：野生型（ｗｔ）及び変異体（ｍｕ）について。（ｎ＝３）。 Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃの構築物の３位又は４位上での選択的ノックダウンを示すグラフである。変異体ノックダウンの利点を、４つの変異体のそれぞれに特異的なすべての試験ベクターに対して、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃについての３位又は４位ｂｉ−ｓｈＲＮＡｉ構築物のすべてについて比較した。空ベクター対照試料（試料Ｃ、水平バー）より上の変異体対野生型比は、特異的変異対立遺伝子上の強力なノックダウン利点を示している。 ｂｉ−ｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞におけるＫＲＡＳ発現のウェスタン免疫ブロット分析を示す図及びグラフである。ＨＥＫ−２９３（ＷＴ）、ＰＡＮＣ−１（Ｇ１２Ｄ対立遺伝子）及びＭｉａＰａＣａ（Ｇ１２Ｃ対立遺伝子）に様々な変異体ターゲティングｂｉ−ｓｈＲＮＡ構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に収穫した細胞抽出物は、ウェスタン免疫ブロットで半定量的に分析した。（図７Ａ）Ｇ１２Ｄターゲティング構築物をトランスフェクトしたＰＡＮＣ−１細胞。（図７Ｂ）ＫＲＡＳノックダウンしたＧ１２Ｄ構築物を３つの細胞株と比較する。（図７Ｃ）ＫＲＡＳノックダウンしたＧ１２Ｃ構築物を３つの細胞株と比較する。 ６つのｍｉＲＮＡが縦一列に並んでいるｍｉＲ−１７−９２クラスターを示す図である。 ノックダウン効率をそのシングレット対応物と比較するためにレポーター試験ベクターを用いて試験されたトリプレット構築物の結果を示すグラフである。 本発明の１又は２以上の二機能性ｓｈＲＮＡを含む細胞を作るための概略図である。 変異体をノックダウンすることができるｍｉＲ−１７−９２ｇａｐ配列（ｐＧＢＩ−１２９及びｐＧＢＩ−１３０）を有するトリプレット構築物（レーン４及び５）を使用することから得られる結果を示しており、ｍｉＲ−１７−９２バックボーン配列（ｐＧＢＩ−１３１及びｐＧＢＩ−１３２）を有するトリプレット構築物は変異体を極めて効率的にノックダウンすることができる（レーン６及び７）。

本発明の様々な実施形態の作製及び使用は下で詳細に考察されるが、本発明は多種多様な特定の文脈において具体化することができる多くの適用可能な発明概念を提供すると認識されるべきである。本明細書で考察される特定の実施形態は、本発明を作製し使用するための特定の方法を単に例示しているだけであり、本発明の範囲の限界を定めるものではない。

本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下に定義する。本明細書で定義される用語は、本発明に関係する分野の当業者により広く理解されている意味を有する。「１つ（a）」、「１つ（an）」及び「その（the）」は単数の実体のみに言及することを意図しておらず、特定の例が説明のために使用されうる一般的部類を包含する。本明細書の用語は本発明に特定の実施形態を説明するために使用するが、その使用は特許請求の範囲に概要を述べる通りを除いて、本発明の限界を定めるものではない。

ｒａｓがん原遺伝子を構成的に活性にするｒａｓがん原遺伝子ファミリー中の活性化変異はすべてのヒトがんにおいて頻繁に観察される。特に、ＫＲａｓ中の活性化変異は膵臓がんの９０％超で観察される。Ｋｒａｓ変異は小分子で特異的に標的にするのが困難であり、したがってｗｔ Ｋｒａｓ発現に影響を及ぼさずにＫｒａｓ変異をノックダウンするのはがんの処置のために実行可能なアプローチである。すべてのＲＮＡｉベースのＫｒａｓ変異ノックダウンは１つの特定の変異をターゲティングする又はｗｔ発現を同時にノックダウンする、のいずれかである。本発明は、膵臓がんにおいて同定されたＫｒａｓ変異の９０％超をｗｔ Ｋｒａｓ発現を劇的に減少させることなくノックダウンすることができる新規の設計及び構築物を開示する。

ＲＮＡｉは１９９８年にFireとMelloによるノーベル賞を受賞した発見であり、このおかげで研究と刊行物は指数関数的に増加し、遺伝子機能の理解を促進し多数の第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験を活気づけている。小ＲＮＡによるこの天然に存在する遺伝子サイレンシング機構は、内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ，microRNA）を包含するが、遺伝子配列に高度に依存しており、したがって、理論的にはその機構を使用して強い特異性のあるいかなる標的遺伝子の発現でも阻害することができる。ＲＮＡｉは、小分子の開発に固有の薬理的制約に限定されず、疾患処置のために従来の「新薬の開発につながらない（undruggable）」標的を利用する機会を生み出している。

この機構で中心的役割を果たしているのが、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ，RNA Induced Silencing Complex）である。このプロセスは、二本鎖小ＲＮＡ（パッセンジャー鎖とガイド鎖で構成されている）で始まり、このＲＮＡはプレＲＩＳＣに組み込まれ、続いてパッセンジャー鎖が切断依存性又は切断非依存性放出されてガイド鎖含有ＲＩＳＣが形成される。ガイド鎖（ｍＲＮＡに対するアンチセンス）がＲＩＳＣを導いて配列相補性（完全な又は拡張部分的に）を通じて標的ｍＲＮＡを認識させる。ＲＩＳＣの重要な成分は、哺乳動物系におけるアルゴノートタンパク質（Ａｇｏ，Argonaute proteins）のファミリー、Ａｇｏ１、２、３及び４であり、このうちＡｇｏ２のみがエンドヌクレアーゼ活性を有していて、さらなる分解のための標的ｍＲＮＡの切断を可能にし（切断依存性経路）、Ａｇｏ含有ＲＩＳＣはすべて切断非依存性エフェクター経路を通じて機能することができ、翻訳抑制及びそれに続く分解でｐ−ボディでのｍＲＮＡ隔離をもたらす。切断依存性エフェクタープロセスには、ガイド鎖とパッセンジャー鎖と標的ｍＲＮＡの両方との間に、特に中心領域に広範な相同性が必要であり、一方、切断非依存性エフェクタープロセスにはガイド鎖とパッセンジャー鎖と標的ｍＲＮＡの両方との間には部分的相同性のみが必要である。

本発明はＲＩＳＣ複合体での切断依存性と切断非依存性負荷の両方を利用し、ＲＩＳＣ複合体から下流にある事象は利用しない。したがって、本明細書で使用するように、語句「切断依存性及び切断非依存性」とはＲＩＳＣに向けて特異的に標的されているＲＮＡの設計並びにＲＩＳＣ複合体での切断依存性及び切断非依存性活性、すなわち、負荷を指す。これらの「二機能性ｓｈＲＮＡ」が、ＲＩＳＣ複合体のそれぞれ個別の部分をターゲティングする合計よりも高い阻害活性を有することは本明細書で及びこの場合には親出願において見出されている。したがって、本発明のより高い阻害活性。

ＲＮＡ干渉は、合成二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，small interfering RNA）により、又はベクター駆動低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のいずれかにより始動させることができる。ｓｉＲＮＡとベクター駆動ｓｈＲＮＡの両方が、インビボ及びインビトロ適用に効果的であり、各々がそのそれぞれの利点を有することが実証されている。大半のｓｉＲＮＡはＡｇｏ２含有ＲＩＳＣへの効率的組込みを促進するように構造的に設計されており、リボヌクレアーゼIII含有ダイサー基質設計は、最初の会合及びプレＲＩＳＣでのプロセシングによりｓｉＲＮＡの効率を少なくとも１０倍改良する。ベクター駆動ｓｈＲＮＡは宿主マイクロＲＮＡ生合成経路を利用し、このほうがより効率的であると思われる。ｓｉＲＮＡのほうが容易に化学修飾され、ｓｈＲＮＡ発現は特異的プロモーターにより調節し制御することができる。

本発明者らは、１つの予めプログラムされた分子におけるＲＩＳＣ負荷の切断依存性と切断非依存性経路の両方を利用することによりＲＮＡｉの効率をさらに改良するために、新規のベクター駆動ｓｈＲＮＡ技術、すなわち、二機能性ｓｈＲＮＡ（ｂｉ−ｓｈＲＮＡ）を開発した。ベクター駆動ｂｉ−ｓｈＲＮＡには、ｍＲＮＡ標的配列ごとに２つのステムループ構造が含まれ、１つのステムループｓｈＲＮＡはステムに完璧な相補性を有し、第２のステムループｓｈＲＮＡはステムのパッセンジャー鎖上にミスマッチを含有する（それによって、ガイド鎖上にミスマッチを含む先行技術のミスマッチＲＮＡとは異なっている）。重要なのは、ＲＩＳＣへの組込みに続いて、２つの構造のそれぞれ由来のガイド鎖はｍＲＮＡ標的配列と完全に相補的であるが、異なるＡｇｏ含有ＲＩＳＣと会合していることである。ｂｉ−ｓｈＲＮＡ設計は、ｓｉＲＮＡ又は従来のｓｈＲＮＡのいずれと比べた場合でも、遺伝子サイレンシングのより急速な開始、より高い有効性、及びより高い耐久性をもたらす。標的特異的ｂｉ−ｓｈＲＮＡを用いた最近個別化されたがん療法は、改変二層陥入リポソーム送達ビヒクルを使用する第Ｉ相臨床試験に移行している。ｂｉ−ｓｈＲＮＡの設計、構築及び実行に関与する重要な分子法を下に供している。

その目的と実施形態に応じて、いくつかの異なるベクター、プロモーター、又はプラスミド骨格及び送達システムを使用することができる。効率的トランス遺伝子発現をする発現ベクターを選択するのが有用であることが見出されている。本発明者らは、強力なプロモーター、例えば、ＩＥ ５’ＵＴＲ及びイントロンＡを含有する伸長ＣＭＶプロモーター（ｐＵＭＶＣ３）を有する発現ベクターのほうがクローニング部位がＣＭＶプロモーターに直に接する発現ベクターよりも効果的であることを認識した。ある種の実施形態では、ステムループ構造の前に一続きのリード転写物を有するのが有益である。さらに、１よりも多いベクター使用が計画されている場合、効果的なシャトル戦略を予め案出しておくべきであり、発現カセットのＰＣＲ増幅による改変ではそれほど効率的ではない。プロモーターの選択も重要であり、ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターは発現がはるかに強いが、核外輸送とＲＩＳＣ負荷ステップの両方で内在性ｍｉＲＮＡ成熟プロセスを競合的に飽和させ、ある種の送達ビヒクルではインビトロ及びインビボで致死毒性を生じる。ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターは、発現はそれほど強くないが、効率的に働き、内在性ｍｉＲＮＡ経路を求める競合に対してはるかに毒性は低い。

ある種の実施形態では、特に複数の動物モデル系が利用される場合には、１つよりも多い種において作用することができる配列が設計される。大半の標的遺伝子では、種間で保存されている一続きの標的ヌクレオチドを見つけることが可能である。保存されておりノックダウンに最適でもある配列を見つけるためには、相同性適合配列と選択された標的部位配列を比較しなければならない。

様々なアルゴリズムを使用する公的にアクセス可能なコンピュータプログラム（例えば、Dharmacon RNAi design center（www.dharmacon.com）及びIDT（www.idtdna.com））は容易に利用可能であり、これを使用して標的遺伝子内で適切な標的部位の位置を突き止めることができる。大半のコンピュータプログラムを用いた検索により、さらなる解析のための標的の予備的一次セットが得られることが多い。いくつかの入手可能な刊行物は提案してくれるものとそうでないものがある。それぞれの標的配列のＢＬＡＳＴ検索は、所望の種内で他のｍＲＮＡとの潜在的交雑相同性を解析するために考慮すべきである。

標的部位配列が選択されると、ｂｉ−ｓｈＲＮＡ設計プロセスは開始することができ、設計プロセスは下に提示されている。本発明者らが使用するｂｉ−ｓｈＲＮＡステムループ構造はよく分析されているｍｉＲ−３０ａ骨格を用いるが、いかなる機能的ｍｉＲＮＡ骨格でも使用することができる。ｂｉ−ｓｈＲＮＡは約１０ヌクレオチド長のギャップがある互いに直に近接する位置にあるｍｉＲ−３０ａ骨格上の２つのステムループ構造からなる。さらに長いヌクレオチドギャップを使用することができ、ｂｉ−ｓｈＲＮＡの複数のユニットを、つなぎ合わせて、複数部位で単一遺伝子を標的にする又は複数の異なる遺伝子を同時に標的にする単一転写物にするよう設計することができる。

発現ベクターの複数のクローニング部位に置かれる発現ユニットを構築するため、順次互いに連結される合成オリゴヌクレオチドを使用する組立戦略を開発した。代わりに、特定化された配列を有する遺伝子構築物の合成をバイオテクノロジーサービス会社に外注してもよい。オリゴヌクレオチド組立工程では、重複するＤＮＡ断片が設計され合成された。２つのステムループ構造の配列が重複しているために、最初に５’断片と３’断片をライゲートする必要がある。次に、５’断片と３’断片をゲル上で精製して中間の連結断片にさらにライゲートすることができる。この組立工程は効率的であり、慎重な設計で、多くの断片を異なる二機能性構築物のために繰り返し使用することができる。

標的ごとに、少なくとも３つの二機能性構築物を設計し構築して比較し、そこからさらなる評価のために、高いノックダウン効率の構築物を選択するのが最もよい。ノックダウン効率は組織培養細胞においてインビトロで比較することができる。本発明者らは、インビトロトランスフェクション法が広く異なる効率を有するためにノックダウン効率を内在的に発現される遺伝子と比較するのは一般には困難であることを認識した。ノックダウンが非トランスフェクト細胞由来のバックグラウンドノイズにより評価しにくいためにトランスフェクション効率が低い場合は特に前述のことが言える。

ｂｉ−ｓｈＲＮＡによる標的遺伝子ノックダウンの有効性及び効率は、標的及び計画された適用に応じて種々のインビトロ及びインビボシステムを用いて試験することができる。このインビトロ評価は、種々の培養細胞においてｂｉ−ｓｈＲＮＡ発現プラスミドのトランスフェクションに続いて行うことができる。本発明者らは、エレクトロポレーションによる及びリポソーム（例えば、Lipofectamine 2000）による両方のトランスフェクションは、プラスミドＤＮＡの量が対照ベクター又はユニバーサルランダム配列を使用して慎重に制御されている場合には、極めて効果的であることを見出した。リポフェクタミン又は関連する作用薬では、本発明者らは、リバーストランスフェクション法は一般に、フォワードトランスフェクション法よりも毒性が低いことを見出した。標的遺伝子ノックダウンは、標的遺伝子ｍＲＮＡではｑＲＴ−ＰＣＲにより、又は標的遺伝子タンパク質ではウェスタン及び／若しくはＥＬＩＳＡにより評価することができる。一アッセイ法では、ステムループＲＴ−ＰＣＲによる成熟ｓｈＲＮＡの発現は検出され、別のアッセイ法では、標的ｍＲＮＡ切断は５’ＲＮＡリガンド媒介ＲＡＣＥ（５’ＲＬＭ−ＲＡＣＥ，5’ RNA-Ligand Mediated RACE）により検出される。ステムループＲＴ−ＰＣＲは、使用される特異的プローブプライマーに依存する感度の良い方法であり、さらに、パッセンジャー鎖とガイド鎖の両方を特異的に検出し定量することができる。ｂｉ−ｓｈＲＮＡでは、方法は、完全に相補的な鎖並びにミスマッチした（部分的に相補的な）パッセンジャー鎖の両方を差次的にスコアー化することができる。５’ＲＬＭ−ＲＡＣＥ法は、切断されたｍＲＮＡ末端へのＲＮＡオリゴマーのライゲーションが必要であり、したがって、その方法は効率が低くなる。多くの場合、多数のラウンドの増幅が必要になる限り、入れ子になったプライマー設計は特異性を確保するには不可欠である。

ｂｉ−ｓｈＲＮＡの評価可能な機能性は、標的細胞への効果的なプラスミド送達に頼っている。本発明者らは、一部のインビトロトランスフェクションシステムは本質的により複雑なインビボ動物モデルには翻訳されないことが多いことを認識している。特にインビボでの全身適用のために数多くの送達システムが設計されている。本発明者らは、インビボ研究のために膜融合性陽イオン性ＤＯＴＡＰ：コレステロール二層陥入ベシクルリポプレックス（ＢＩＶ）を利用し、そのリポプレックスを臨床に合わせて翻訳させることに成功している。さらに集中した体内分布、標的された送達、及び増強された細胞内取り込みのための改変戦略が開発されている。効果的なリポプレックスは、宿主大腸菌（E.coli）由来のいかなる汚染物質もないプラスミドを使用するべきである。エンドフリー（endo-free）プラスミド精製キット作製プラスミドは一般に使用されているが、ＧＬＰ又はＧＭＰ作製プラスミドのほうがより効果的である。残念なことに、コラン酸及び他の非エンドトキシン関連多糖は、陰イオン交換クロマトグラフィーにより及び塩化セシウム密度勾配遠心法によりＤＮＡと一緒に同時精製する。したがって、エンドトキシン除去はこれらの汚染物質を除去せず、ＨＰＬＣはこれらの汚染物質を検出することができない。これを是正するため、インビボ及び臨床適用のためにこれらの汚染物質を洗浄した超高品質プラスミドＤＮＡを作製するためのSuperclean（商標）法が開発された。リポソーム調製は高度に特殊化された装置を必要とし、本発明者らはＧＭＰ施設で日常的にＤＯＴＡＰ：コレステロールＢＩＶを作製している。予め作られたリポソームは、共同研究者から入手することもあれば、供給業者から購入することもある。高品質リポソーム及びプラスミドＤＮＡを有するリポプレックスを調製する工程は下に記載されている。リポプレックス製剤は大半の研究所環境で実現することができる。リポプレックスが作られると、製剤は実験動物に遅い尾部静脈注射により又はカテーテルを用いてのいずれかで全身的に送達することができる。標的部位ベクター発現は、それぞれプラスミドＤＮＡではＰＣＲ法、成熟ｂｉ−ｓｈＲＮＡではステムループＲＴ−ＰＣＲを使用して分析することができる。ｂｉ−ｓｈＲＮＡ機能性は、標的ｍＲＮＡ切断では５’ＲＬＭ−ＲＡＣＥを用いて、標的タンパク質ノックダウンではウェスタンブロット又はＩＨＣを用いてアッセイすることができる。これらの分析は処置後約４８時間で実施することが可能である。有効性では、実験動物への繰り返し送達が必要であることが多く、投与計画は実験的に決定し最適化する必要がある。

本発明では、標的遺伝子特異的ｓｈＲＮＡを、切断依存性ＲＩＳＣ及び切断非依存性ＲＩＳＣ経路に入れて相互作用させるように設計することを規定している。本明細書で使用されるように、用語「二機能性ｓｈＲＮＡ」は、それぞれが別々のステムループ構造のステム部分内に属する二本鎖配列を含む１又は２以上のＲＮＡ分子を一般的には意味し、第１のＲＮＡ分子は切断依存性ＲＩＳＣ経路に提示されるように設計され、第２のＲＮＡ分子は切断非依存性ＲＩＳＣ経路に提示されるように設計されている。ある種の実施形態では、ｂｉ−ｓｈＲＮＡはすべて単一鎖上に存在する。

さらに具体的には、第１のガイド鎖配列は、標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的である、好ましくは１００％相補的である。本発明は、このガイド鎖（最初はパッセンジャー鎖に結合して二本鎖ステムを形成する）は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物に結合することができる核酸配列を含み、切断依存性ＲＩＳＣ経路に提示されることを規定している。本発明は、ｍＲＮＡ転写物へのガイド鎖配列のそのような結合と切断依存性ＲＩＳＣ経路への提示によりｍＲＮＡ転写物が分解されることを規定している。

特定の実施形態では、第２のガイド鎖配列は標的遺伝子にコードされているｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的であることが規定されている。さらに詳しくは、第２のガイド鎖配列は標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ転写物に相補的である、好ましくは１００％相補的である第１の部分を含有していることがあり、ガイド鎖配列の第２の部分は標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の対応する配列とミスマッチしているある種の塩基を含有する。

本明細書で使用されるように、「ミスマッチ」塩基対とは、互いに結合している（ハイブリダイズしている）ときに塩基対合のシャルガフソ則に従わない核酸配列内の２つの窒素含有塩基を指す。シャルガフ則は、第１の核酸配列内のプリンアデニン（Ａ，adenine）は第２の核酸配列内のピリミジンチミン（Ｔ，thymine）（又はウリジン（Ｕ，uridine））と対合すると規定している。さらに、シャルガフ則は、第１の核酸配列内のプリングアニン（Ｇ，guanine）は第２の核酸配列内のピリミジンシトシン（Ｃ，cytosine）と対合すると規定している。したがって、そのような規則に従って適合しない２つの鎖（核酸配列）間の塩基対合、例えば、ＧとＵ、ＡとＧ、ＡとＣ、ＧとＴ、ＧとＵ、等の間の対合があれば、「ミスマッチ」塩基対と見なされることになる。その中に示されるステムループ構造の二本鎖配列内のガイド鎖は、パッセンジャー鎖と比べて１又は２以上の「ミスマッチ」塩基対を含有するが、二本鎖ステム配列においてバルジを作り出す。

本明細書で使用されるように、用語「核酸」又は「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ，deoxyribonucleic acid）又はリボ核酸（ＲＮＡ，ribonucleic acid）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，polymerase chain reaction）により作製される断片、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより作製される断片を指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）若しくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体）、又は両方の組合せであるのモノマーで構成することができる。改変されたヌクレオチドは、糖部分に及び／又はピリミジン若しくはプリン塩基部分に変化を有することがある。糖の改変には、例えば、１若しくは２以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基での置換が含まれる、又は糖はエーテル若しくはエステルとして官能性を持たせることができる。さらに、糖部分全体を、アザ−糖（aza-sugar）及び炭素環式糖類似体などの立体的に及び電子的に類似する構造体で置き換えることができる。塩基部分の改変の例には、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環式置換体が含まれる。核酸モノマーは、リン酸ジエステル結合又はそのような連鎖の類似体により連結することができる。リン酸ジエステル連鎖の類似体には、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデートなどが含まれる。用語「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も含まれ、これはポリアミド骨格に結合している天然に存在する又は改変された核酸塩基を含む。核酸は一本鎖でも二本鎖でも可能である。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される用語「発現ベクター」には、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子が含まれる。典型的には、発現ベクターは転写プロモーター、遺伝子、及び転写終結因子を含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような遺伝子はプロモーターに「作動可能に連結されている」と言われる。同様に、制御エレメント及びコアプロモーターは、制御エレメントがコアプロモーターの活性を調節していれば動作可能に連結されている。用語「プロモーター」とは、宿主酵母細胞において構造遺伝子と会合すると、その構造遺伝子では、適切な増殖条件下プロモーター配列の非存在下での転写、翻訳又はｍＲＮＡ安定性（ｍＲＮＡのより長い半減期）と比べて、１）転写、２）翻訳又は３）ｍＲＮＡ安定性のうちの１又は２以上を増加させる任意のＤＮＡ配列を指す。

本明細書で使用される用語「がん遺伝子」とは、悪性新生細胞の形成及び生存を可能にする遺伝子を指す（Bradshaw, T.K.: Mutagenesis 1, 91-97 (1986)）。

本明細書で使用されるように、用語「受容体」は、「リガンド」と呼ばれる生物活性分子に結合する細胞結合型タンパク質を意味する。この相互作用は細胞に対するリガンドの効果を媒介する。受容体は、細胞質ゾルであれ核であれ；単量体（例えば、甲状腺刺激ホルモン受容体、ベータアドレナリン受容体）であれ多量体（例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体及びＩＬ−６受容体）であれ、膜結合型でありうる。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン及び典型的にはシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを含むマルチドメイン構造を特徴とする。ある種の膜結合受容体では、細胞外リガンド結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含む別々のポリペプチドに位置している。

用語「ハイブリダイズする」とは、核酸の鎖が塩基対合を通じて相補的鎖に結合する任意のプロセスを指す。

用語「トランスフェクション」とは、真核細胞中に外来ＤＮＡを導入することを指す。トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、及び遺伝子銃を含む当技術分野で公知の種々の手段により実現しうる。

本明細書で使用されるように、用語「二機能性」とは、２つの機構的作用経路、ｓｉＲＮＡの作用経路とｍｉＲＮＡの作用経路を有するｓｈＲＮＡを指す。用語「従来の」ｓｈＲＮＡとは、ｓｉＲＮＡ作用機構により機能するＤＮＡ転写由来ＲＮＡを指す。用語「二重」ｓｈＲＮＡとは、それぞれが２つの異なる遺伝子の発現に対して機能するが「従来の」ｓｉＲＮＡモードで機能する２つのｓｈＲＮＡのことである。

本明細書で使用されるように、用語「リポソーム」とは、内部水性空間を取り囲む脂質二重層で構成された閉鎖構造物を指す。本明細書で使用される用語「ポリカチオン」は、同じ分子に第４級アンモニウムラジカルなどの複数のカチオン部分を有する物質を意味し、遊離塩基並びに薬学的に許容されるその塩を含む。

したがって、二機能性ｓｈＲＮＡは、切断依存性ＲＩＳＣと切断非依存性ＲＩＳＣの両方に入り込み相互作用をするよう設計されているｓｈＲＮＡを含みうる。ｓｉＲＮＡ及び従来のｓｈＲＮＡ（すなわち、切断依存性ＲＩＳＣ又は切断非依存性ＲＩＳＣに入るが両方には入らないように設計されているｓｈＲＮＡ構築物）を含む、他の現在利用できるＲＮＡｉ法及び組成物と比べて、より高いレベルの遺伝子「ノックダウン」はそのような二機能性ｓｈＲＮＡを使用して達成される。

本明細書で使用されるように、遺伝子「ノックダウン」とは、発現の効果的な量的及び永続的阻害を指す。そのような遺伝子「ノックダウン」は、標的遺伝子ｍＲＮＡ翻訳の抑制、標的細胞アポトーシスの増加及び／又は細胞死において明らかにされる、及び／又は明白になることがある。

本明細書で使用されるように、「標的遺伝子」とは、その配列の発現を二機能性ｓｈＲＮＡを使用して特異的及び効果的に調節しうる細胞中の核酸配列を指す。ある種の実施形態では、標的遺伝子は個体のがんの成長（増殖）、維持（生存）、及び／又は遊走（転移）挙動に関わっていることがある。しかし、本発明は、標的遺伝子は他の任意の疾患又は医学的状態に関わっていることがあり、がんに関わっている遺伝子に限定されないと規定している。例えば、標的遺伝子は研究者又は臨床医がサイレンシングしたい（すなわち、そのような標的遺伝子の発現レベルを減少させたい）と思ういかなる配列でも表しうる。

ベクター配列は、二機能性ｓｈＲＮＡをコードする配列に直接的に又は間接的に動作可能に連結（又は接続）されているプロモーターを含みうる。そのようなプロモーターは宿主細胞及び求められる効果に基づいて選択しうる。適切なプロモーターの非限定的例には、誘導性ＲＮＡポリメラーゼII（ｐｏｌ II）ベースのプロモーターなどの構成的誘導性プロモーターが含まれる。適切なプロモーターの非限定的例には、テトラサイクリン誘導性又は抑制プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩ又はIIIベースのプロモーター、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターなどのｐｏｌ II依存性ウイルスプロモーター、並びにｐｏｌ III Ｕ６及びＨ１プロモーターがさらに含まれる。バクテリオファージＴ７プロモーターも使用しうる（その場合、Ｔ７ポリメラーゼも存在しなければならないことは認識されるであろう）。特に、本発明は組み込まれたｓｈＲＮＡシングレットを含むがこれに限定されない２又は３以上の二機能性ｓｈＲＮＡ（すなわち、エフェクターの組合せ）を含むことがあるので、本発明をいかなる単一のプロモーターの使用にも限定させない。それぞれの組み込まれたプロモーターは、ｓｈＲＮＡシングレット成分のうちの１つ、又はいかなる組合せでも制御しうる。

ある種の実施形態では、プロモーターは標的細胞において優先的に活性があることがあり、例えば、腫瘍細胞特異的プロモーターを使用して腫瘍細胞において二機能性ｓｈＲＮＡ分子を優先的に発現させることが望ましいことがある。そのような構築物の宿主細胞内への導入は、別々のＲＮＡ分子（それぞれがそれ自体のステムループ構造を含む）がその後に内在性リボヌクレアーゼによりそのような前駆転写物から切り取られるように、二機能性ｓｈＲＮＡ前駆転写物内に含有される２又は３以上のＲＮＡ分子が最初は単一の一次転写物内に属する条件下で、成し遂げられる。本発明は、スプライスドナー及びアクセプター配列が戦略的に一次転写物配列内に置かれてスプライソソーム媒介核プロセシングを促進することをさらに規定している。次に、こうして得られる成熟ｓｈＲＮＡは、細胞内で産生される標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の分解及び／又は翻訳抑制を誘導しうる。代わりに、それぞれの前駆ステムループ構造は別々の転写物の一部として産生されることがあり、その場合それぞれのｓｈＲＮＡコード配列は好ましくはそれ自体のプロモーター及び転写終結配列を含むことになる。さらに、二機能性ｓｈＲＮＡ前駆転写物は単一の一次転写物内に属していることがあり、この転写物は、任意選択で、１又は２以上の機能的哺乳動物タンパク質をコードする１又は２以上のｍＲＮＡ配列をさらに含んでいてもよい。例えば、１又は２以上のｍＲＮＡ配列は患者の免疫系を増強する、又は別の方法で二機能性ｓｈＲＮＡと並行して機能することになるある予防効果及び／又は治療効果を与えることが知られているある種のタンパク質をコードしていることがある。

本明細書に記載されるｓｈＲＮＡ分子のステムループ構造は、約４０〜１００ヌクレオチド長又は好ましくは約５０〜７５ヌクレオチド長でありうる。ステム領域は約１９〜４５ヌクレオチド長（若しくはそれよりも多い）、又はさらに好ましくは約２０〜３０ヌクレオチド長でありうる。ステムは完全に相補的な二重鎖を含むことがある（いかなる３’テールも別として）が、ステムのどちらかのアーム上にバルジ又は内部ループが存在していることがあり、好ましくさえある。そのようなバルジ及び非対称内部ループの数は、数が少ないほうが好ましく（例えば、１，２又は３）、サイズは約３ヌクレオチド又はそれよりも少ない。末端ループ部分は約４又は５以上のヌクレオチドを含むこともあるが、好ましくは約２５以下である。さらに詳しくは、ループ部分は好ましくはサイズが６〜１５ヌクレオチドになる。

本明細書に記載されるように、二機能性ｓｈＲＮＡのステム領域はパッセンジャー鎖及び標的遺伝子によりコードされている標的ｍＲＮＡ転写物に相補的である配列を含有するガイド鎖を含む。好ましくは、ガイド鎖とパッセンジャー鎖のＧ−Ｃ含有量及び適合は、エンドヌクレアーゼ切断のある又はなしの熱力学的に有利な鎖巻き戻し活性のために慎重に設計されている。さらに、ガイド鎖の特異性はＢＬＡＳＴ検索（www.ncbi.nim.nih.qov/BLAST）により確かめるのが好ましい。

複数の標的遺伝子の発現レベルは、本明細書に記載される方法及び二機能性ｓｈＲＮＡを使用して調節しうる。例えば、本発明は、第１のセットの二機能性ｓｈＲＮＡは第１の標的遺伝子の発現レベルを減少させるように設計されている配列（ガイド鎖）を含むように設計し、第２のセットの二機能性ｓｈＲＮＡは第２の標的遺伝子の発現レベルを減少させるように設計されている配列（ガイド鎖）を含むように設計しうることを規定している。異なるセットの二機能性ｓｈＲＮＡは、同じ、又は別々の予備転写物内で発現されてそこに属してもよい。ある種の実施形態では、そのような多重アプローチ、すなわち、２又は３以上の標的遺伝子の発現レベルを調節するための本明細書に記載される二機能性ｓｈＲＮＡの使用は、患者に対して増強された治療効果を及ぼしうる。例えば、がんを処置する、予防する又はその効果を寛解するために本明細書に記載される二機能性ｓｈＲＮＡを患者が与えられる場合、患者のがんに関わりのある複数の遺伝子の発現レベルを減少させるように設計されている２又は３以上の種類の二機能性ｓｈＲＮＡを患者には与えるのが好ましいことがある。

ある種の実施形態では、本発明は、二機能性ｓｈＲＮＡ配列が天然に存在するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０、線虫（C. elegans）ｌｅｔ−７及び／又はｌｉｎ−４）のステム配列を含みうることをさらに規定している。例えば、ｍｉＲ−３０ループの存在は望ましいことがあるが、本発明は、そのような構造の変動は許容され、例えば、ｍｉＲ−３０配列に対して７２％よりも大きな、好ましくは７９％よりも大きな、さらに好ましくは８６％よりも大きな、最も好ましくは９３％よりも大きな同一性であるループを使用しうる（ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711）などの周知のコンピュータプログラムを使用して決定される）ことを規定している。

二機能性ｓｈＲＮＡをコードする前駆体配列（又は構築物）は、当技術分野で周知の種々の技法及び送達媒介物のいずれかを使用して宿主細胞内に導入しうる。例えば、１又は２以上の構築物を含むウイルスベクターを用いた感染を実行することができ、そのようなウイルスベクターには好ましくは、複製欠損レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、レンチウイルスベクター、又は麻疹ベクターが含まれる。さらに、１又は２以上の構築物を含むプラスミドでのトランスフェクションを用いてもよい。そのようなプラスミドはネイキッドＤＮＡとして存在していても、例えば、リポソーム（例えば、免疫リポソーム）と会合して存在していてもよい。さらに、送達媒介物は免疫リポプレックス、標的ナノ粒子、標的リポソーム、シクロデキストリン、ナノ粒子、アプタマー、デンドリマー、キトサン、又はそのペグ化誘導体からなることもある。送達媒介物の性質は標的宿主細胞に応じて変わることがある。

二機能性ｓｈＲＮＡコード構築物のインビボ送達は、標的組織に応じて、種々の技法のうちのいずれか１つを使用して実行しうる。送達は、例えば、直接注入、吸入、静脈内注射又は他の物理的方法（組織の目に見える到達可能な領域を標的にするマイクロプロジェクタイル（micro-projectile）によるもの（例えば、ネイキッドＤＮＡを用いるもの）を含む）により達成しうる。投与は、必要に応じて、注射針、トロカール、カニューレ、カテーテル、等によりさらに達成しうる。

本明細書に記載される二機能性ｓｈＲＮＡを使用する方法に加えて、ｓｈＲＮＡそれ自体も提供される。したがって、追加の態様には、２又は３以上のＲＮＡ分子を個別に又は併せてコードする単一の連続する配列又は複数の別個の配列を含むことがある核酸配列が含まれる。そのような実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ転写物の一部に相補的であるガイド鎖配列を包含する二本鎖配列を含むことになり、第２のＲＮＡ分子はそのようなｍＲＮＡ転写物の一部に部分的の相補的である第２のガイド鎖配列を包含する第２の二本鎖配列を含む。好ましくは、第２のＲＮＡ分子の第２のガイド鎖配列は、標的遺伝子にコードされるｍＲＮＡ転写物の核酸配列とミスマッチしている１又は２以上の塩基を含む。さらなる態様によれば、核酸配列を含む発現ベクターが提供され、これを使用して方法を実行し、本明細書に記載される二機能性ｓｈＲＮＡを発現させることができる。

さらに、限定せずに様々な種類のがんを含む、１又は２以上の医学的状態の効果を予防する、処置する及び／又は寛解するために、核酸配列及び二機能性ｓｈＲＮＡを使用する方法が本明細書に記載される。例えば、本発明は、本明細書に記載される二機能性ｓｈＲＮＡを使用して、がん細胞増殖、生存、及び／又は転移に関わっている１又は２以上の標的遺伝子の発現レベルを減少させることができることをもたらす。例えば、下の実施例に示されているように、二機能性ｓｈＲＮＡを使用して、がん細胞において過剰発現されていることが見つかっているスキャフォールドタンパク質をコードするある種の標的遺伝子の発現レベルを減少させることができる。そのような標的遺伝子の非限定的例にはＫ−ｒａｓが含まれる。

ＲＮＡ干渉：動物及び植物細胞への人工二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入により、相補的配列を有する標的ｍＲＮＡ分子の分解を誘導することができる。このプロセスはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ，RNA interference）として知られている（Sharp 2001; Hutvagner and Zamore 2002; Zamore 2002）（米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい）。ＲＮＡｉは、治療応用への強い可能性のある有用な実験ツールとして登場した（Fire, Xu et al. 1998; Hammond, Bernstein et al. 2000; Elbashir, Harborth et al. 2001; Senzer, Rao et al. 2009; Wang Z 2011）。しかし、哺乳動物細胞では、ｓｈＲＮＡを使用するＲＮＡｉの誘導にはＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクションが必要であり、これは、効果的サイレンシングの持続期間がビヒクル分解時間とｓｉＲＮＡ生物学的半減期により限定されて非効率的になることがある。これらの限界にもかかわらず、第Ｉ相臨床試験の最近の早期結果発表では、Davisと同僚たちは、リボヌクレオチドレダクターゼのＭ２サブユニット（ＲＲＭ２，M2 subunit of ribonucleotide reductase）を標的にするペグ化トランスフェリン修飾シクロデキストリンベースのｓｉＲＮＡの全身送達での標的特異的サイレンシング及び部位特異的切断を説得力を持って実証している（ＣＡＬＡＡ−０１）（Davis, Zuckerman et al. 2010）。生検利用可能黒色腫を有する３人の報告されている患者は、用量漸増第Ｉ相試験による処置を受け、２１日サイクルの１、３、８及び１０日目に静脈内注射により１８、２４、又は３０ｍｇ／ｍ２ ＣＡＬＡＡ−０１を受けた。自発的生検は、それぞれにおいてサイクル１の最終投与後に、記録された腫瘍と比較され及びサイクル１後の一月目に（サイクル２の開始に先立って）及びサイクル２の最終投与の日に３０ｍｇ／ｍ２で処置された患者において実施された。ＲＲＭ２ ｍＲＮＡ減少は、３０ｍｇ／ｍ２でのサイクル２の後と前の組織試料を比較するｑＲＴ−ＰＣＲにより確かめられた。同じ患者で、サイクル１の前と後の免疫組織化学及びウェスタンブロットは、ＭＭＲ２タンパク質の５倍の減少を示した。提唱されている作用機序を支持して、５’−ＲＬＭ−ＲＡＣＥ（相補的ＤＮＡ末端の５’−ＲＮＡ−リガーゼ媒介急速増幅）により、予想された切断部位が確かめられた。全身送達に続く、標的腫瘍細胞侵入のこのファーストインヒューマン実証（透過型電子顕微鏡を使用して）並びにｍＲＮＡ及びタンパク質発現減少は、予想された部位特異的ｓｉＲＮＡ切断と共に、ＲＮＡｉの翻訳応用に弾みをつける。

ｓｉＲＮＡは、血清安定性、細胞取り込み及び作用持続期間を増加させるためには化学修飾が必要である。代わりに、ｓｉＲＮＡは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として構築することができる。ｓｈＲＮＡは、プラスミド構築物上のＲＮＡポリメラーゼIII（又は、それほど頻繁には使用されないが、ＲＮＡポリメラーゼII）プロモーターから細胞内で転写することができるステムループ構造からなる（Miyagishi and Taira 2002; Yu, DeRuiter et al. 2002）。染色体から独立しているプラスミドからのｓｈＲＮＡの構成的発現は、合成ｓｉＲＮＡを超える利点を与える。ｓｈＲＮＡ発現ユニットは、細胞内送達及び核輸送のために種々のプラスミド及びウイルスベクター内に組み込むことができる。さらに、ベクターベースのｓｈＲＮＡ発現も制御又は誘導することができる（Gossen and Bujard 1992; Gupta, Schoer et al. 2004; Dickins, Hemann et al. 2005）。ｓｈＲＮＡは合成ｓｉＲＮＡとは反対に、細胞の核において合成され、次にプロセシングされて細胞質に輸送され、活性のためにＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に組みこまれる（Cullen 2005）。効果的であるためには、ｓｈＲＮＡは内在性細胞マイクロＲＮＡ生合成機械を利用するように設計しなければならない。

二機能性ｓｈＲＮＡ：上記のように、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、転写、転写後及び翻訳機構を阻害し、それによって遺伝子発現を調節することができる天然の細胞制御過程である。ｍｉＲ３０−スキャフォードを使用して、本発明者らは、翻訳抑制、及びｐ−ボディでの［ＧＷ１８２媒介］隔離（保持貯蔵所としての又はキャップ除去、脱アデニル化及びｍＲＮＡ分解を促進する）（切断非依存性）並びに転写後ｍＲＮＡ ｍＲＮＡ切断（切断依存性）を同時に誘導することにより、標的遺伝子発現のより効果的なサイレンシングを示す「二機能性」ＲＮＡｉ戦略を開発した（Rao DD, Maples PB, Senzer N, Kumar P, Wang Z, Pappen BO, Yu Y, Haddock C, Jay C, Phadke AP, Chen S, Kuhn J, Dylewski D, Scott S, Monsma D, Webb C, Tong A, Shanahan D, Nemunaitis J. Enhanced target gene knockdown by a bifunctional shRNA: a novel approach of RNA interference. Cancer Gene Ther. 2010 Nov;17(11):780-91）。

本発明者らは、新規の二機能性ｓｈＲＮＡ（ｂｉ−ｓｈＲＮＡｉ）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術を開発した。ｂｉ−ｓｈＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ切断、分解、及び翻訳抑制を同時にもたらし、他のＲＮＡｉ介在物質よりも高い有効性及び長期の持続期間を生じるプログラムされたエンドヌクレアーゼ及び非エンドヌクレアーゼアルゴノート（Ａｇｏ）含有ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）負荷を可能にする。ＫＲＡＳ変異体選択的ノックダウンにおけるｂｉ−ｓｈＲＮＡｉの潜在力を調査するため、インビトロ二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを確立して、同じアッセイ環境における変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子のノックダウン活性を体系的に比較した。本発明には、例えば、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の処置のためにＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃに特異的な治療薬の開発が包含される。

ガイド鎖のそれぞれの位置に単一ヌクレオチド変異のある、Ｇ１２Ｄを標的にする一連のｂｉ−ｓｈＲＮＡ発現ベクター構築物のうち、２〜４位に変異ヌクレオチドを置くことにより変異対立遺伝子の最も際立ったノックダウン活性が生じたことを見出した。ガイド鎖の他の位置での追加のミスマッチのノックダウン効果を調べることにより、そのプロセスが配列特異的であることを断定した。Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃ変異について類似の構築物を作製し、これらの構築物はそのそれぞれの標的変異対立遺伝子のノックダウンに効果的である。Ｇ１２Ｒ特異的構築物はＧ１２Ｃ変異体と交差反応する。

本発明の構築物は、ＨＥＫ−２９３細胞（ｗｔ／ｗｔ）、ＰＡＮＣ−１細胞（ｗｔ／Ｇ１２Ｄ対立遺伝子）及びＭｉａＰａＣａ２細胞（ｗｔ／Ｇ１２Ｃ対立遺伝子）を使用してＫＲＡＳノックダウンに関して対照ベクターと比較した。Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｃ選択的ｂｉ−ｓｈＲＮＡ発現ベクターは、それぞれＰＡＮＣ−１細胞及びＭｉａＰａＣａ２細胞におけるＫＲＡＳ発現の減少と対照的に、ＨＥＫ−２９３ではＫＲＡＳ発現を減少させなかった。例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃをノックダウンすることができる多量体ｂｉ−ｓｈＲＮＡユニットを有する単一の発現構築物がインビトロ及びインビボでの有効性及び特異性について試験されることになっていることが分かっていた。

ＫＲＡＳ（キルステン−ｒａｓ）がん遺伝子は膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、結腸直腸がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）のかなりの部分で変異している（Downward J, Nat Rev Cancer. 2003;3:11-22.）。ＫＲＡＳ変異を担持するＰＤＡＣ患者の大多数（７０〜９０％）で、５年生存率は５％未満である（Saif MW et al. World J Gastroenterol. 2007;13;4423-4430）。ＫＲＡＳはグアニンヌクレオチド結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む複数の細胞内シグナル伝達経路の不可欠の構成要素である。ＫＲＡＳ内の圧倒的多数の変異がコドン１２又は１３に単一アミノ酸置換を生じる一塩基体細胞変異である。Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃ ＫＲＡＳ変異は、ＰＡＤＣ患者に見出されるＫＲＡＳ変異の９０％超を占める（COSMIC Database, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/）。ＫＲＡＳ変異は基本的に構成的活性ＫＲＡＳ及び制御されない下流シグナル伝達を生じる（Schubbert S, et al. Nat Rev Cancer. 2007; 7: 295-308）。さらに、抗体セツキシマブ（結腸直腸がんにおいて）及び小分子阻害剤ベムラフェニブ（ＢＲＡＦ変異黒色腫において）などの標的薬剤はＫＲＡＳ変異を抱えた患者では成績が良くない（Karapetis CS, et al. N Engl J Med 2008; 259 (17): 1757-1765）。したがって、効果的がん療法戦略には、野生型機能性を分け与えるＫＲＡＳ変異選択性が必要である。本発明者らは、新規の二機能性ｓｈＲＮＡ ＲＮＡ干渉（ｂｉ−ｓｈＲＮＡｉ）技術を最近開発した。ｂｉ−ｓｈＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ切断、分解、及び翻訳抑制を同時にもたらし、他のＲＮＡｉ介在物質よりも高い有効性及び長期の持続期間を生じるプログラムされたエンドヌクレアーゼ及び非エンドヌクレアーゼアルゴノートタンパク質（Ａｇｏ）含有ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）負荷を可能にする。ＫＲＡＳ変異体選択的ノックダウンにおけるｂｉ−ｓｈＲＮＡｉの潜在力を調査するため、インビトロ二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを確立して、同じアッセイ環境における変異対立遺伝子と野生型対立遺伝子のノックダウン活性を体系的に比較した。本プロジェクトの目標は、ＰＤＡＣの処置のためにＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃ変異対立遺伝子を特異的に標的にする単一の治療薬を開発することである。

対立遺伝子特異的ノックダウンについて一塩基異なる遺伝子間を識別するｓｉＲＮＡが体系的に分析された（Ohnishi Y, Tokunaga K, Kaneko K, Hohjoh H. Assessment of allele-specific gene silencing by RNA interference with mutant and wild-type reporter alleles. J RNAi Gene Silencing. 2006 Feb 28;2(1):154-60、Huang H, Qiao R, Zhao D, Zhang T, Li Y, Yi F, Lai F, Hong J, Ding X, Yang Z, Zhang L, Du Q, Liang Z. Profiling of mismatch discrimination in RNAi enabled rational design of allele-specific siRNAs. Nucleic Acids Res. 2009 Dec;37(22):7560-9、Schwarz DS, Ding H, Kennington L, Moore JT, Schelter J, Burchard J, Linsley PS, Aronin N, Xu Z, Zamore PD. Designing siRNA that distinguish between genes that differ by a single nucleotide. PLoS Genet. 2006 Sep 8;2(9):e140、Geng CM, Ding HL. Design of functional small interfering RNAs targeting amyotrophic lateral sclerosis-associated mutant alleles. Chin Med J (Engl). 2011 Jan;124(1):106-10）。変異対立遺伝子特異的ノックダウンは、アルツハイマー病、ハンチントン病及びパーキンソン病などの疾患についてのモデルシステムを用いてインビトロで実証されてきた（Sierant M, Paduszynska A, Kazmierczak-Baranska J, Nacmias B, Sorbi S, Bagnoli S, Sochacka E, Nawrot B. Specific Silencing of L392V PSEN1 Mutant Allele by RNA Interference. Int J Alzheimers Dis. 2011 Apr 7;2011:809218、de Ynigo-Mojado L, Martin-Ruiz I, Sutherland JD. Efficient allele-specific targeting of LRRK2 R1441 mutations mediated by RNAi. PLoS One. 2011;6(6):e21352、Takahashi M, Watanabe S, Murata M, Furuya H, Kanazawa I, Wada K, Hohjoh H. Tailor-made RNAi knockdown against triplet repeat disease-causing alleles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 14;107(50):21731-6、Pfister EL, Kennington L, Straubhaar J, Wagh S, Liu W, DiFiglia M, Landwehrmeyer B, Vonsattel JP, Zamore PD, Aronin N. Five siRNAs targeting three SNPs may provide therapy for three-quarters of Huntington's disease patients. Curr Biol. 2009 May 12;19(9):774-8）。ＫＲＡＳ変異に関する対立特異的遺伝子サイレンシングは、単一のＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ又はＧ１２Ｖ ＫＲＡＳ変異について報告されている（Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell. 2002 Sep;2(3):243-7、Fleming JB, Shen GL, Holloway SE, Davis M, Brekken RA. Molecular consequences of silencing mutant K-ras in pancreatic cancer cells: justification for K-ras-directed therapy. Mol Cancer Res. 2005 Jul;3(7):413-23、Zhang Z, Jiang G, Yang F, Wang J. Knockdown of mutant K-ras expression by adenovirus-mediated siRNA inhibits the in vitro and in vivo growth of lung cancer cells. Cancer Biol Ther. 2006 Nov;5(11):1481-6、Smakman N, Veenendaal LM, van Diest P, Bos R, Offringa R, Borel Rinkes IH, Kranenburg O. Dual effect of Kras(D12) knockdown on tumorigenesis: increased immune-mediated tumor clearance and abrogation of tumor malignancy. Oncogene. 2005 Dec 15;24(56):8338-42、Zhang YA, Nemunaitis J, Samuel SK, Chen P, Shen Y, Tong AW. Antitumor activity of an oncolytic adenovirus-delivered oncogene small interfering RNA. Cancer Res. 2006 Oct 1;66(19):9736-43）。単一薬剤で複数のＫＲＡＳ変異体ノックダウンを達成する試みは報告されなかった。本発明には、ＰＤＡＣの４つの重要なＫＲＡＳ変異体について最も効果的なｂｉ−ｓｈＲＮＡｉノックダウン組合せを発見する体系的アプローチが包含される。

（配列番号１）Ｇ１２Ｄ、２位。ｍｉＲ−３０ａ骨格配列は下線部付である。

（配列番号２）Ｇ１２Ｄ、３位。ｍｉＲ−３０ａ骨格配列は下線部付である。

（配列番号３）Ｇ１２Ｄ、４位。ｍｉＲ−３０ａ骨格配列は下線部付である。

（配列番号４）Ｇ１２Ｄ、５位。ｍｉＲ−３０ａ骨格配列は下線部付である。

（配列番号５）Ｇ１２Ｄ、６位。ｍｉＲ−３０ａ骨格配列は下線部付である。

（配列番号６）Ｇ１２Ｄ、７位。ｍｉＲ−３０ａ骨格配列は下線部付である。

（配列番号７）Ｇ１２Ｄ、８位。ｍｉＲ−３０ａ骨格配列は下線部付である。

（配列番号８）Ｇ１２Ｄ、９位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGGAGCTGATGGCGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGAAGCACGTGGTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号９）Ｇ１２Ｄ、１０位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTGATGGCGTAGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTATAGGTCTAGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１０）Ｇ１２Ｄ、１１位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGATGGCGTAGGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGTATGCGTTCGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１１）Ｇ１２Ｄ、９位、ｍｏｄ４。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGGAGCTGATGGCGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTATGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGAAGCACGTGGTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTATGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１２）Ｇ１２Ｄ、１０位，ｍｏｄ５。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTGATGGCGTAGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCTATGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTATAGGTCTAGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCTATGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１３）Ｇ１２Ｄ、１１位、ＭＯＤ６。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGATGGCGTAGGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTATGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGTATGCGTTCGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTATGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１４）Ｇ１２Ｄ、９位、ＭＯＤ１０。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGGAGCTCATGGCGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCCATGAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGAAGCACGTGGTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCCATGAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１５）Ｇ１２Ｄ、１０位、ｍｏｄ１１。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCttggagctCAtggcgtaggTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGCCATGAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCttggagctATAggTCtaggTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGCCATGAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１６）Ｇ１２Ｄ、１１位、ｍｏｄ１２。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTCATGGCGTAGGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACGCCATGAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGTATGCGTTCGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACGCCATGAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１７）Ｇ１２Ｖ、３位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTGTTGTAGTGAAGCCACAGATGTACAACAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTCTTAGCTATTGTAGTGAAGCCACAGATGTACAACAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１８）Ｇ１２Ｖ、４位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTGGAGCTGTTGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCAACAGCTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTACTGCTATTGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCAACAGCTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号１９）Ｇ１２Ｒ、３位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGTTGGAGCTCGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACGAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGACTGAGCTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACGAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号２０）Ｇ１２Ｒ、４位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTCGTGTAGTGAAGCCACAGATGTACACGAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTACTAGCTAGTGTAGTGAAGCCACAGATGTACACGAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号２１）Ｇ１２Ｃ、３位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGTTGGAGCTTGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACAAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGACTGAGCTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACAAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

（配列番号２２）Ｇ１２Ｃ、４位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTTGTGTAGTGAAGCCACAGATGTACACAAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTCTTAGCTTATGTAGTGAAGCCACAGATGTACACAAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

試験ベクターの概略図。野生型ＫＲＡＳの最初の１７アミノ酸は、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターのウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲｌｕｃ）のアミノ末端に挿入し、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ又はＧ１２Ｃ ＫＲＡＳ変異体の最初の１７アミノ酸は同じベクター上のホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｈｌｕｃ＋）のアミノ末端に挿入した。

ウミシイタケ遺伝子又はホタル遺伝子へのＫＲＡＳ配列の挿入：ヒトＫＲＡＳ野生型配列の最初の１７アミノ酸：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGT（配列番号５８）は、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２のウミシイタケ遺伝子配列中の翻訳開始ＡＴＧに挿入した。ＫＲＡＳ（ＷＴ）配列の挿入後のその領域におけるヌクレオチド配列は以下の通りである（ＫＲＡＳ配列は下線が施されている）：
（配列番号２３）

手短に言えば、命名法は以下の通りである：イタリック体はウミシイタケ又はホタルコード配列であり、黒色の太字下線部は挿入されたＫＲＡＳ配列であり、太字はＧ１２及びＧ１３のトリプレットコドンであり、二重下線部は、ウミシイタケでは黒で現れることを除いて、サブクローニングのために使用される制限部位である。

ヒトＫＲＡＳ変異体配列（Ｇ１２Ｄ）の最初の１７アミノ酸：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGT（配列番号２４）は、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２のホタル遺伝子配列中の翻訳開始ＡＴＧに挿入した。ＫＲＡＳ（ｍｕｔａｎｔ）配列の挿入後のその領域におけるヌクレオチド配列は以下の通りである（ＫＲＡＳ配列は下線が施されている）：
（配列番号２５）

試験ベクターの構築：適切な挿入のあるＤＮＡ断片は遺伝子合成プロセスを用いて作製した。合成ＤＮＡ断片はｐｓｉＣＨＥＣＫ２に挿入され、下に収載される試験ベクターを作製した。遺伝子合成及びベクター構築は、Epoch Life Sciences社 (Missouri City, TX)による請負で作製された。

（ｐＧＢＩ７０）ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴ（ＧＧＴＧＧＣ）：ｈＲｌｕｃにおけるＫＲＡＳ（ＷＴ）の複合物をNheI及びDraIIIで消化し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２のNheI及びDraIII部位に挿入してｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴを形成する。

（ｐＧＢＩ７１）ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴ／Ｇ１２Ｄ（ＧＡＴＧＧＣ）：ｈｌｕｃ＋におけるＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）の複合物をMluI及びPspOMIで消化し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴのMluI及びPspOMI部位に挿入してｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴ／Ｇ１２Ｄを形成する。

（ｐＧＢＩ７２）ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴ／Ｇ１２Ｖ（ＧＴＴＧＧＣ）：ｈｌｕｃ＋におけるＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）の複合物をMluI及びPspOMIで消化し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴのMluI及びPspOMI部位に挿入してｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴ／Ｇ１２Ｖを形成する。

（ｐＧＢＩ７３）ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴ／Ｇ１２Ｒ（ＣＧＴＧＧＣ）：ｈｌｕｃ＋におけるＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）の複合物をMluI及びPspOMIで消化し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴのMluI及びPspOMI部位に挿入してｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴ／Ｇ１２Ｒを形成する。

（ｐＧＢＩ７４）ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴ／Ｇ１２Ｃ（ＴＧＴＧＧＣ）：ｈｌｕｃ＋におけるＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）の複合物をMluI及びPspOMIで消化し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴのMluI及びPspOMI部位に挿入してｐｓｉＣＨＥＣＫ２−ＫＲＡＳ−ＷＴ／Ｇ１２Ｃを形成する。

ｂｉ−ｓｈＲＮＡｉ設計及び構築。ｂｉ−ｓｈＲＮＡ設計は基本的に既に公表されている通りに成し遂げられた（Rao DD, Maples PB, Senzer N, Kumar P, Wang Z, Pappen BO, Yu Y, Haddock C, Jay C, Phadke AP, Chen S, Kuhn J, Dylewski D, Scott S, Monsma D, Webb C, Tong A, Shanahan D, Nemunaitis J. Enhanced target gene knockdown by a bifunctional shRNA: a novel approach of RNA interference. Cancer Gene Ther. 2010 Nov;17(11):780-91、Rao DD, Senzer N, Wang Z, Kumar P, Jay CM, Nemunaitis J. Bi-functional Short Hairpin RNA (bi-shRNA): Design and Pathway to Clinical Application. Methods Mol Biol. 2012）。それぞれのｂｉ−ｓｈＲＮＡ発現ユニットは遺伝子合成により組み立てられ、ｐＵＭＶＣ３ベクターの複数のクローニング部位のSalＩ及びNotＩ部位に挿入された。

細胞トランスフェクション。細胞のトランスフェクションはエレクトロポレーション（Gene Pulser MX Cell, BIO-RAD社製）により又はリポフェクタミンLTX（Invitrogen社製）により実施した。ＨＥＫ−２９３細胞のエレクトロポレーション条件は基本的に製造業者により機器に記憶させたプリセット条件に従う。リポフェクタミンLTXでのトランスフェクションは製造業者により推奨され、インプットＤＮＡ濃度とリポフェクタミン比を調節することによりさらに最適化された提案に従う。リバーストランスフェクション法はすべてのリポフェクタミントランスフェクションについて使用した。大半の同時トランスフェクションは、ＤＮＡの最適化された全濃度とリポフェクタミン比で、試験ベクターとｂｉ−ｓｈＲＮＡｉベクターを１対１比で実施した。試験ベクター対ｂ−ｓｈＲＮＡｉベクター比を試験し最適化もした。

二重ルシフェラーゼアッセイ：二重ルシフェラーゼアッセイはDual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社製）を使用して実施し、基本的には製造業者が提供する使用説明書に従う。発光測定はLuminoskan Ascent Microplate Luminometer（Thermo Scientific社製）を用いて９６ウェルフォーマットにおいて行った。基本的に、細胞は９６ウェルプレートでトランスフェクトする又はトランスフェクション後に９６ウェルに蒔いた。トランスフェクトされた細胞はトランスフェクション後２４時間又は４８時間でアッセイした。

細胞増殖阻害アッセイ：細胞増殖阻害アッセイは、製造業者推奨の手順に従うことにより、Cell Titer-Blue細胞生死判定試験試薬又はCell Titer-Glo発光細胞生死判定試験試薬（Promega社製）のいずれかを用いて行った。使用したそれぞれの細胞株は先ずアッセイ開発時間に最適化した。

ウェスタン免疫ブロットにより評価するＫＲＡＳノックダウン：細胞は溶解バッファーCelLytic-M（Sigma社製）で溶解し、培養皿の表面から擦り取り、低速の振盪機の上で、室温で３０分間インキュベートし、短時間遠心分離した。Coomassie Bradford Plus Assayによるタンパク質濃度推定のための小アリコートを標準としてＢＳＡで採取した。SoftMaxProソフトウェアを使用して値を計算し標準曲線をプロットした。等量のタンパク質（通常５〜２０μｇ）を、Mini-Protein II Cellシステム（Bio-Rad社製）を使用して予め組み立てられた１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）上で分離した。電気泳動に続いて、分離されたタンパク質は標準条件でＰＶＤＦ膜に電気移動させた。移された膜は先ずＤＰＢＳ−Ｔ中５％脱脂粉ミルクを含有するブロッキングバッファーを用いて４℃で一晩ブロックした。洗浄バッファーを２回変えた後、タンパク質は先ず確定された希釈度の一次抗体（ＫＲＡＳ及びβアクチンでは、Santa Cruz Biotechnology社製）で、次にＨＲＰコンジュゲート二次抗体でタグ付けした。化学発光検出は、G:BOX Chemi XT16自動化学発光画像解析装置（Syngene社製, Frederick, MD）を用いてECL Plusウェスタンブロッティング検出試薬により行った。膜は剥がし異なる抗体又はβアクチンなどのハウスキーピングタンパク質を用いて再探索することができる。

変異対立遺伝子ごとの試験ベクターはウミシイタケ対ホタル発現比を保持する。焦点は、ＰＤＡＣにおいて最も高頻度で見られる４つのＫＲＡＳ変異を標的にする対立遺伝子特異的ノックダウンｂｉ−ｓｈＲＮＡを設計することであった。Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ又はＧ１２Ｃ変異対立遺伝子を個別に試験するために４種の試験ベクターを構築した。それぞれの試験ベクター構築物を調べて、ＫＲＡＳ配列を挿入しても、ウミシイタケ（ＲＬ）又はホタル（ＦＦ）ルシフェラーゼの発現にも活性にも差次的に影響しないことを確認した。Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃ変異に対する試験ベクターはすべて親ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターと類似するＲＬ対ＦＦ比を保持していた（図２）。ＫＲＡＳ ｗｔ配列のみがＲＬルシフェラーゼに挿入されているベクター（ｐＧＢＩ７０）が示すＲＬ対ＦＦ比は減少しており、挿入によりＲＬルシフェラーゼ活性が影響を受けたことを示しており（データは示していない）、ＲＬ対ＦＦ比が試験ベクターを含有する変異体において保持されたことは、ＦＦルシフェラーゼ中へのＫＲＡＳ変異体配列の挿入によりＲＬと同様にＦＦ活性が影響を受けたことを示している。

図１は試験ベクターの概略図を示している。野生型ＫＲＡＳの最初の１７アミノ酸はｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターのウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲｌｕｃ）のアミノ末端に挿入し、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ又はＧ１２Ｃ ＫＲＡＳ変異体の最初の１７アミノ酸は同じベクター上のホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｈｌｕｃ＋）のアミノ末端に挿入した。

変異体ごとの試験ベクターはウミシイタケ対ホタル発現比を保持していることが見出された。図２は試験ベクターの野生型及び変異体発現を示している。それぞれの試験ベクターの野生型（Ｗｔ）及び変異体（Ｍｕ）発現は、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社製）を使用して親ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターと比較した。Ｗｔ対Ｍｕ発現比較はウミシイタケ（ＲＬ）対ホタル（ＦＦ）の発現比により評価した。

アッセイシステムを試験するため、Ｇ１２Ｄ変異を標的にするいくつかのｂｉｓｈＲＮＡ発現構築物を構築し、ｗｔ（ＲＬ）配列及びＧ１２Ｄ変異体（ＦＦ）配列を含有する試験ベクターで同時トランスフェクション実験を実施した。それぞれの構築物がガイド鎖の様々な位置に変異対立遺伝子配列の相補体を有する、７つのｂｉｓｈＲＮＡ構築物を試験した。それぞれのｂｉｓｈＲＮＡ構築物にＧ１２Ｄ試験ベクターを同時トランスフェクトし、二重トランスフェラーゼアッセイをトランスフェクション後４８時間で行った。収集したデータは、図３ａに例示される野生型対変異体比により、又はホタル（図３ｂ）若しくはウミシイタケ（図３ｃ）の相対的発光単位（ＲＬＵ，relative luminescence unit）により解析することができる。マイクロプレートルミノメーターは、増幅因子を増やすことなくそれぞれのウェルの小領域から発光シグナルをサンプリングする。３通りのデータでは通常、標準偏差は非常に小さく、実験は実験ごとの再現性がある。野生型対変異体比から、それぞれのｂｉｓｈＲＮＡ構築物の変異体対野生型ノックダウンがすばやく見られる。空ベクター対照を超える野生型対変異体比（図３ａ、レーンｃ）は変異体ノックダウンの優位性を示し、対照に等しい又はそれよりも下であることは優位性がないことを示している。それぞれの構築物による野生型又は変異体対立遺伝子のいずれかのノックダウン効率も空ベクター対照と比較することができる。それぞれのｂｉｓｈＲＮＡ構築物は、野生型又は変異体ノックダウン効率に関して異なる特徴を示している。

変異体対ＷＴに関する比較ノックダウン効率は相対的発光単位（ＲＬＵ）又はウミシイタケ（ＲＬ）対ホタル（ＦＦ）比により評価することができることを見出した。図３：アッセイシステムの実証。試験ベクターに二機能性ｓｈＲＮＡ（ｂｉ−ｓｈＲＮＡ）発現ベクター（８６、８７、８８、８９、９０、９１又は９２）を同時トランスフェクトすることにより、変異体対野生型の優先的ノックダウンはＦＦ対ＲＬ比によりすばやく評価することができる（パネルａ）。変異体又は野生型のノックダウンは、ＦＦ（パネルｂ）又はＲＬ（パネルｃ）のＲＬＵを空ベクター対照（Ｃ）と比較することによりさらに個別に解析することができる。

次に、比較ノックダウン効率を決定し、変異体配列をｂｉ−ｓｈＲＮＡ構築物のガイド鎖の様々な位置に置くと効率が変化することを見出した。それぞれのｂｉｓｈＲＮＡ構築物は図３に示されるように野生型と変異対立遺伝子ノックダウンにおいて異なる特徴を示す。他の論文では中央領域がｓｉＲＮＡ媒介ＲＮＡｉの対立遺伝子特異性に重要であることが示されている。本発明者らの二機能性戦略の特異性を試験し理解するため、Ｇ１２Ｄ変異ヌクレオチドの相補体をガイド鎖の２〜１１位に置いて一連の構築物を作りそれぞれの構築物の特異性と有効性を体系的に解析した。２〜１１位はシード領域と中央領域の両方を包含していた。変異ヌクレオチドを５位と１０位に置くと（図４、Ｐ５及びＰ１０）、野生型にも変異体にもノックダウンは示されず、一方、７、８、９及び１１位（図４、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９及びＰ１１）は野生型ノックダウンと変異体ノックダウンの両方に高度に効果的である。シード領域の２、３及び４位（図４、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４）は野生型及び変異体ノックダウンにおいて最良の区別を示した。したがって、シード領域、特に３及び４位はノックダウンの特異性において最も効果的である。

図４は、本発明の二機能性ｓｈＲＮＡの位置効果を示している。Ｇ１２Ｄ変異体に特異的なｂｉ−ｓｈＲＮＡ構築物は、単一の変異ヌクレオチド配列をガイド鎖の最初の１１位までの１つに置くことにより比較した。野生型（ｗｔ）の及び変異体（ｍｕ）のノックダウンの割合は構築物ごとに評価した（ｎ＝３）。

追加のミスマッチをガイド鎖に導入した。ガイド鎖に追加のミスマッチを導入するとノックダウン効率が著しく減少することを見出した。Ohnishiと同僚らは、シード領域にミスマッチを導入すると中央領域で変異対立遺伝子認識が増強されることを報告していた（Ohnishi Y, Tokunaga K, Kaneko K, Hohjoh H. Assessment of allele-specific gene silencing by RNA interference with mutant and wild-type reporter alleles. J RNAi Gene Silencing. 2006 Feb 28;2(1):154-60）。追加のシード領域ミスマッチを有するｂｉｓｈＲＮＡ構築物を中央領域構築物（ガイド鎖のＰ９、Ｐ１０及びＰ１１に変異ヌクレオチド）に対して作製した。１つの構築物で２つの変異対立遺伝子をノックダウンする潜在力を試験するためにミスマッチが変異ヌクレオチドの近位にあるｂｉｓｈＲＮＡも作製した。Ｇ１２Ｄ試験ベクターを用いた同時トランスフェクションデータによれば、シード領域ミスマッチにより野生型と変異体両方のノックダウン効率が減少し（図５、レーンＰ９＋Ｐ４対レーン９；レーンｐ１０＋ｐ５対レーンｐ１０；レーンｐ１１＋ｐ６対レーンｐ１１）変異体認識増強がごくわずか改善されていることが示されている。変異ヌクレオチドの近位にミスマッチを導入すると変異体でも野生型でもノックダウン効率が劇的に減少した（図５、レーンＰ９＋Ｐ１０対レーン９；レーンＰ１０＋Ｐ１１対レーンＰ１０；レーンＰ１１＋Ｐ１２対レーンＰ１１）。

図５は、ノックダウン効率に対するミスマッチ導入の効果を示している。Ohnishiと同僚らは、シード領域にミスマッチを導入すると中央領域で変異体認識が増強されることを報告していた（Ohnishi Y, Tokunaga K, Kaneko K, Hohjoh H. Assessment of allele-specific gene silencing by RNA interference with mutant and wild-type reporter alleles. J RNAi Gene Silencing. 2006 Feb 28;2(1):154-60）。変異ヌクレオチドが中央領域にある（ｐ９、ｐ１０及びｐ１１）Ｇ１２Ｄ構築物を、追加のミスマッチがシード領域又は変異ヌクレオチドのいずれかの近位にある構築物と比較した：野生型（ｗｔ）及び変異体（ｍｕ）。（ｎ＝３）。

二機能性ｓｈＲＮＡの可能な効果及びターゲティングを広げるために、ｓｈＲＮＡを、重なり合う効果が可能になるように、標的の特定の位置に標的した。変異ヌクレオチドが３位又は４位のいずれかにある構築物はＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃにも選択的であることを見出した。Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃ変異について変異ヌクレオチドが３位又は４位のいずれかにある構築物を、４種の試験ベクターすべてに対してＧ１２Ｄ構築物と共に試験した。Ｇ１２Ｄについての３位構築物は４位構築物よりも効果的であり（図６、Ｇ１２Ｄレーン）他の変異体に対してはほとんど又は全く活性はない（図６、Ｇ１２Ｄレーン）。一方、Ｇ１２Ｖについての４位構築物は３位構築物よりも効果的であり（図６、Ｇ１２Ｖレーン）他の変異体に対してはほとんど又は全く活性はない（図６、Ｇ１２Ｖレーン）。Ｇ１２Ｒ構築物はそれほど選択性はなく、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃに対して変異体に僅かにより活性がありむしろ一様である（図６、Ｇ１２Ｒレーン）。Ｇ１２Ｃでは、３位は４位よりも良好であり、他の変異体に対してはほとんど又は全く活性はない（図６、Ｇ１２Ｃレーン）。構築物ごとの野生型又は変異体についてのノックダウン効率は表１にまとめている。

図６はＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃについて３又は４位構築物に対する選択的ノックダウンを示している。４種の変異体それぞれに特異的なすべての試験ベクターに対してＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃについて３又は４位ｂｉ−ｓｈＲＮＡｉ構築物すべてについて、変異ノックダウンの優位性を比較した。空ベクター対照試料（試料Ｃ、水平バー）より上の変異体対野生型比は、特異的変異対立遺伝子に関する強いノックダウン優位性を示している。

表１は、重要なｂｉ−ｓｈＲＮＡ構築物の野生型及び変異対立遺伝子ノックダウン効率を示している。表１は、標的配列、重要なｂｉ−ｓｈＲＮＡ構築物のガイド鎖配列及び変異又は野生型対立遺伝子、それぞれ配列番号２６〜５２への各自それぞれのノックダウン効率をまとめている。

表１はノックダウン配列番号２６〜５２に対する位置効果の要約である。

次に、がん細胞における有効性について構築物を試験した。ＫＲＡＳ野生型細胞株及び変異対立遺伝子を有する膵臓がん細胞株での試験構築物を試験した。変異体ＫＲＡＳタンパク質対野生型ＫＲＡＳタンパク質を差次的に認識するのに利用できる抗体はなく、３つの異なる遺伝子型を有する３つの異なる細胞株を使用してそれぞれの構築物の差次的ノックダウンを試験した。ＨＥＫ−２９３は野生型ＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ＋／＋）を有するヒト胚性腎臓がん細胞株であり、ＰＡＮＣ１はヘテロ接合ＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ＋／Ｇ１２Ｄ）を有するヒト膵臓がん細胞株であり、ＭｉａＰａＣａ２はヘテロ接合ＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ＋／Ｇ１２Ｃ）を有するヒト膵臓がん細胞株である。２、３及び４位構築物は変動する効率でＫＲＡＳ発現をノックダウンすることができた（図７Ａ）。ノックダウンは効率的なほうではなく、非トランスフェクト対照の６５〜７０％はトランスフェクション効率と野生型ＫＲＡＳノックダウンの存在に起因する可能性がある。ノックダウン効率は、Ｋ１２Ｄ及びＫ１２Ｃ変異体の３及び／又は４位構築物について３つの異なる細胞株とさらに比較した。Ｇ１２Ｄ構築物はＨＥＫ２９３細胞ではＫＲＡＳをノックダウンするとは思われず（図７Ｂ）、ＰＡＮＣ１細胞でＫＲＡＳのノックダウンに最も効果的であり（図７Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ２細胞ではＫＲＡＳノックダウン活性は低かった（図７Ｂ）。一方、Ｇ１２Ｃ構築物はＨＥＫ２９３細胞（図７Ｃ）でもＰＡＮＣ１細胞（図７Ｃ）でもＫＲＡＳノックダウンに効果的ではなく、ＭｉａＰａＣａ２細胞ではＫＲＡＳノックダウンに効果的であった（図７Ｃ）。

図７Ａ〜７Ｃは、ｂｉ−ｓｈＲＮＡトランスフェクト細胞におけるＫＲＡＳ発現のウェスタン免疫ブロット解析を示している。ＨＥＫ２９３（ＷＴ）、ＰＡＮＣ−１（Ｇ１２Ｄ対立遺伝子）及びＭｉａＰａＣａ２（Ｇ１２Ｃ対立遺伝子）に様々な変異体ターゲティングｂｉ−ｓｈＲＮＡ構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に収穫した細胞抽出物はウェスタン免疫ブロットで半定量的に解析した。（ａ）Ｇ１２Ｄターゲティング構築物をトランスフェクトしたＰＡＮＣ−１細胞。図７ＢはＫＲＡＳノックダウンに関してＧ１２Ｄ構築物を３種の細胞株と比較している。図７ＣはＫＲＡＳノックダウンに関してＧ１２Ｃを３種の細胞株と比較している。

表２は標準アンチセンス、標準ｓｉＲＮＡ、標準ｓｈＲＮＡ及び本発明の二機能性ｓｈＲＮＡの間の用量要件をまとめている。

単一のヌクレオチド変異がガイド鎖のそれぞれの位置にある、Ｇ１２Ｄを標的にする一連のｂｉ−ｓｈＲＮＡ発現ベクター構築物中、変異対立遺伝子についての最も際立ったノックダウン活性は変異ヌクレオチドを２〜４位に置くことにより生じたことを見出した。ガイド鎖の他の位置での追加のミスマッチのノックダウン効果を調べることにより、そのプロセスが配列特異的であることを断定した。

本発明の二機能性ｓｈＲＮＡノックダウンの体係的解析は、ガイド鎖の中央領域に最も効果的な単一ヌクレオチドに際立った位置を置く大半のｓｉＲＮＡベースのＲＮＡｉとは対照的に、ガイド鎖の２〜４位（シード領域）に最も効果的な際立った位置を置く。

Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃ変異について類似する構築物を作り、これらの構築物はそのそれぞれの標的変異対立遺伝子のノックダウンに効果的である。Ｇ１２Ｒ特異的構築物はＧ１２Ｃ変異体と交差反応し、すべてが機能することが分かった。

ＨＥＫ−２９３細胞野生型（ｗｔ）、ＰＡＮＣ−１細胞（Ｇ１２Ｄ対立遺伝子）及びＭｉａＰａＣａ２細胞（Ｇ１２Ｃ対立遺伝子）を使用してＫＲＡＳノックダウンに関して選択された構築物を対照ベクターとさらに比較した。Ｇ１２Ｄ及びＧ１２Ｃ選択性ｂｉ−ｓｈＲＮＡ発現ベクターはＨＥＫ−２９３においてＫＲＡＳ発現を減少させず、それぞれＰＡＮＣ−１細胞及びＭｉａＰａＣａ２細胞におけるＫＲＡＳ発現の減少とは対照的であった。

本明細書の教示を使用して、さらに試験構築物を作り、タンパク質ノックダウンレベルで及びシグナル伝達レベルで適切なＫＲＡＳ変異体発現細胞株にこれを使用して、ノックダウンの特異性をさらに試験することができる。

Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｃをノックダウンすることができる多量体ｂｉ−ｓｈＲＮＡユニットを有する単一発現構築物は、有効性及び特異性についてインビトロ及びインビボで試験することになっている。

ｍｉＲ−１７−９２クラスター配列を使用する１つのベクター中にトリプレットのノックダウン能力のある多量体ｂｉ−ｓｈＲＮＡの構築。図８はｍｉＲ−１７−９２クラスターが６つのｍｉＲＮＡを縦一列に有することを示している。

領域中の配列は、ｇｉ｜４７０７６８７３｜ｄｂｊ｜ＡＢ１７６７０８．１｜ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｃ１３ｏｒｆ２５ ｖ＿２ ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ、ｍｉＲ−９１−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１３ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ−９１、ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１８−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１３ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１９ａ−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１３ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−１９ｂ−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１３ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−９２−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１３ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ−９２から得られる。
配列番号５７

太字及び下線部領域はマイクロＲＮＡ配列並びにイタリック体領域はそれぞれのマイクロＲＮＡシストロン間のギャップ配列である。

２セットのトリプレットｂｉ−ｓｈＲＮＡ多量体構築物を作って、３つの異なるＫＲＡＳ変異のノックダウンを試験した。第１のセットはｍｉＲ−３０ａ骨格ステムループ構造を維持し、ｍｉＲ−１７−９２クラスターギャップ配列を使用する。第２のセットはｍｉＲ−１７−９２クラスター天然ステムループ構造骨格を使用し、ｍｉＲＮＡ配列をｂｉ−ｓｈＲＮＡターゲティング配列と置き換える。トリプルの２つの組合せをセットごとに構築し、ｐＧＢＩ−１２９とｐＧＢＩ−１３０はｍｉＲ−１７−９２ギャップ配列中のｍｉＲ−３０ａ骨格と組み合わせ、ｐＧＢＩ−１３１とｐＧＢＩ−１３２はｍｉＲ−１７−９２骨格及びギャップ配列中と組み合わせる。ｂｉ−ｓｈＲＮＡの順序は、ｐＧＢＩ−１２９とｐＧＢＩ−１３１ではＧ１２Ｄ−Ｇ１２Ｖ−Ｇ１２Ｒである。ｂｉ−ｓｈＲＮＡの順序は、ｐＧＢＩ−１３０とｐＧＢＩ−１３２ではＧ１２Ｃ−Ｇ１２Ｄ−Ｇ１２Ｒである。その配列は下に示している。

ｍｉＲ−１７−９２ギャップ配列をｍｉＲ−３０ａ骨格と一緒に使用して、太字はｍｉＲ−３０ａ骨格配列であり、クーリエ新文字はｍｉＲ−１７−９２ギャップ配列であり、太字イタリック体下線部文字はＫＲＡＳターゲティング配列であり、それぞれの末端の小文字配列は挿入制限部位配列である。

ｐＧＢＩ−１２９（Ｇ１２Ｄ−Ｇ１２Ｖ−Ｇ１２Ｒ）：
（配列番号５３）

ｐＧＢＩ−１３０（Ｇ１２Ｃ−Ｇ１２Ｄ−Ｇ１２Ｒ）：
（配列番号５４）

ｍｉＲ−１７−９２骨格を使用して、太字はｍｉＲ−１７−９２ターゲティング配列に取って代わるＫＲＡＳターゲティング配列である。それぞれの末端の小文字は挿入制限酵素部位配列である。

ｐＧＢＩ−１３１（Ｇ１２Ｄ−Ｇ１２Ｖ−Ｇ１２Ｒ）：
（配列番号５５）

ｐＧＢＩ−１３２（Ｇ１２Ｃ−Ｇ１２Ｄ−Ｇ１２Ｒ）：
（配列番号５６）

複数インサート構築物。上に示すインサート配列はその全体を遺伝子合成法により合成し、ｐＵＭＶＣ３ベクターにクローニングした。一例では、トリプレット構築物を先ずレポーター試験ベクターで試験してそのシングレット対応物とノックダウン効率を比較した。図９は、トリプレット構築物がＧ１２Ｄレポーターをシングレット構築物と同程度に効果的にノックダウンをすることができることを示している（左上パネル、８〜１１番目のバー対２〜３番目のバー）。ｐＧＢＩ−１３１（右上パネル、１０番目のバー）はＧ１２Ｖをシングレット（５番目のバー）と同程度にノックダウンすることができる。Ｇ１２Ｒのトリプレットはシングレットほどには十分にノックダウンを実施しなかった（左下パネル、８〜１１番バー対７番バー）。トリプレットの３つはＧ１２Ｃについてはシングレットよりもよい成績であった（右下パネル、９〜１１番目のバー対６番目のバー）。当業者であれば、構築物が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２５、５０、７５又は１００インサートを含むことができるのを認識するであろう。インサートは、異なる種類の（又は重複する）プロモーター、複製起点、抗生物質若しくは他の耐性遺伝子、選択性ドメイン若しくは遺伝子、可変発現ドメイン、組換えドメイン、並びに構築物の発現及びベクターの増殖に必要な他のドメインを有する１、２、３、５、６、７、８、９又は１０の異なるベクターに含むことができる。一般に、ここに示されるトリプレット構築物はシングレットと同程度にノックダウンを実施することができる。ノックダウン効率は、試験される４種のトリプレット構築物間で変動する。

次に、本発明者らは、ＰＡＮＣ−１細胞を用いてトリプレットのノックダウン効率を試験する。ＰＡＮＣ−１細胞はＫＲＡＳ^{ｗｔ／Ｇ１２Ｄ}遺伝子型を有し、１つは野生型対立遺伝子、１つはＧ１２Ｄ変異対立遺伝子である。本発明者らは、トリプレットが野生型発現に影響を与えずにＧ１２Ｄ発現のノックダウンに効果的であるかどうかを試験した。すべての細胞集団を試験するために、本発明者らはＧ４１８耐性ベクターを有する形質転換体を確立した。プール中のＧ４１８耐性形質転換体の大多数がｂｉ−ｓｈ−ＫＲＡＳを構成的に発現するはずである。図１０は、形質転換体を確立するための概略図を示している。

形質転換体の確立させたプールはＫＲＡＳ ｍＲＮＡ集団について試験した。本発明者らは制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を使用して野生型転写物対変異体転写物を識別した。BstXI制限部位をＰＣＲ増幅中に導入し、その結果BstXIは野生型断片を切断し、変異を含有する断片は無傷のままにしておくことになる。BstXI消化ＰＣＲ産物は４％アガロースゲル上で分離させ、上のバンドは変異体集団を表し、下のバンドは野生型集団を表す。図１１は、ｍｉＲ−１７−９２ギャップ配列（ｐＧＢＩ−１２９及びｐＧＢＩ−１３０）を有するトリプレット構築物が変異体を極わずかにノックダウンでき（レーン４及び５）、ｍｉＲ−１７−９２骨格配列（ｐＧＢＩ−１３１及びｐＧＢＩ−１３２）を有するトリプレット構築物は変異体を極めて効率的にノックダウンすることができる（レーン６及び７）ことを示す。興味深く思いがけないことに、ｐＧＢＩ−１３１及びｐＧＢＩ−１３２は変異体ｍＲＮＡ集団を大幅に減少させるだけではなく、野生型ｍＲＮＡ発現を増強もした。トリプレット構築物ｐＧＢＩ−１３１及びｐＧＢＩ−１３２はＧ１２Ｄ変異体ｍＲＮＡを効果的で選択的に減少させ、野生型発現を正常レベルに戻すことができる。

本明細書において考察されるいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、キット、試薬、又は組成物に関しても実行することができる、その逆も同じであることが企図されている。さらに、本発明の組成物を使用して本発明の方法を達成することができる。

本明細書に記載される特定の実施形態は、本発明を限定するものとしてではなく、説明のために示されていることは理解されるであろう。本発明の主要な特長は、本発明の範囲を逸脱することなく様々な実施形態において用いることができる。当業者であれば、通例の実験法だけを使用して、本明細書に記載される特定の手順と同等の数多くのものを認識し、又は確かめることができるであろう。そのような同等のものは本発明の範囲内にあると考えられ、特許請求の範囲により扱われている。

本明細書において言及されているすべての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の技術のレベルを示している。刊行物及び特許出願はすべて、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的に個別に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。

単語「１つ（a）」又は「１つ（an）」の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む（comprising）」と併せて使用される場合、「１つ」を意味することがあるが、「１又は２以上」、「少なくとも１つ」及び「１又は１よりも多い」の意味とも一致している。特許請求の範囲における用語「又は（or）」の使用は、代替物のみに言及することを明白に指示していなければ又は代替物が相互に排他的でなければ、「及び／又は（and/or）」を意味するために使用されるが、本開示は代替物及び「及び／又は（and/or）」のみに言及する定義を支持する。本出願全体を通じて、用語「約（about）」は、値がその値を決めるのに用いられている装置、方法についての誤差の固有の変動、又は研究対象中に存在する変動を含むことを示すために使用される。

本明細書及び特許請求の範囲において使用されるように、単語「含んでいる（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの含んでいる（comprising）のいかなる形態も）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」などの有する（having）のいかなる形態も）、「包含する（including）」（並びに「包含する（includes）」及び「包含する（include）」などの包含する（including）のいかなる形態も）又は「含有する(containing)」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」などの含有する（containing）のいかなる形態も）は包括的であり又は制約がなく、追加される非列挙の要素も方法ステップも排除しない。

本明細書で使用される用語「又はその組合せ」とはその用語に先行する列挙される項目のすべての順列と組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はその組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、及び特定の文脈で順序が重要な場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢのうちの少なくとも１つを含むことも意図している。この例に続いて、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ、その他などの１又は２以上の項目又は用語の繰り返しを含有する組合せが明確に包含される。当業者であれば、文脈から他の方法で明白でない限り、典型的にはいかなる組合せでも項目又は用語の数に制限はないことを理解するであろう。

本明細書で使用されるように、制限なく、「約（about）」、「実質的な（substantial）」又は「実質的に（substantially）」などの近似の単語とは、そのように修飾された場合に、必ずしも絶対である又は完全であるわけではないと理解されているが、当業者には存在している状態を指定することを保証するほど近いと見なされる状態のことを指す。記述がどの程度変化しうるかは、変化をどれくらいの大きさに設けることができるかに依存し、それでも当業者たちに修飾された特長を、修飾されていない特長の求められる特徴及び能力をそれでも有すると認識させることになる。一般に、しかし先行する考察に従って、「約（about）」などの近似の単語に修飾される本明細書の数値は、記述された値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％変化することがある。

本明細書に開示され主張されるすべての組成物及び／又は方法は、本開示に照らせば不適当な実験をせずに作製し実行することができる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態の点から説明してきたが、本明細書に記載される組成物及び／又は方法に、並びに方法のステップにおいて又は連続する方法のステップにおいて、本発明の発想、精神及び範囲から逸脱することなく変化を適用しうることは当業者には明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似する代替物及び修飾物はすべて、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲及び発想内であると見なされる。

（参考文献）
１．Ohnishi Y, Tokunaga K, Kaneko K, Hohjoh H. Assessment of allele-specific gene silencing by RNA interference with mutant and wild-type reporter alleles. J RNAi Gene Silencing. 2006 Feb 28;2(1):154-60
２．Huang H, Qiao R, Zhao D, Zhang T, Li Y, Yi F, Lai F, Hong J, Ding X, Yang Z, Zhang L, Du Q, Liang Z. Profiling of mismatch discrimination in RNAi enabled rational design of allele-specific siRNAs. Nucleic Acids Res. 2009 Dec;37(22):7560-9
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８．Smakman N, Veenendaal LM, van Diest P, Bos R, Offringa R, Borel Rinkes IH, Kranenburg O. Dual effect of Kras(D12) knockdown on tumorigenesis: increased immune-mediated tumor clearance and abrogation of tumor malignancy. Oncogene. 2005 Dec 15;24(56):8338-42
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１５．Rao DD, Senzer N, Wang Z, Kumar P, Jay CM, Nemunaitis J. Bi-functional Short Hairpin RNA (bi-shRNA): Design and Pathway to Clinical Application. Methods Mol Biol. 2012

Claims (16)

1. ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現を選択的に減少させる二機能性ｓｈＲＮＡであって、前記二機能性ｓｈＲＮＡのガイド鎖が、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の標的部位配列に完全に相補的であり、
   ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる変異ヌクレオチドが、前記二機能性ｓｈＲＮＡ内のシード配列の２、３又は４位に位置し、
   前記二機能性ｓｈＲＮＡのパッセンジャー鎖の１つが、前記二機能性ｓｈＲＮＡのガイド鎖と比較して１又は２以上のミスマッチを含み、
   前記二機能性ｓｈＲＮＡ分子が、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現レベルを選択的に減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する、
   前記二機能性ｓｈＲＮＡ。
2. 配列番号２、３、１７〜２２、又は５３〜５６により定義される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の二機能性ｓｈＲＮＡ。
3. ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子ｃＤＮＡ配列内の少なくとも１つの標的部位配列が、配列番号３２、３３又は４７〜５２により定義される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の二機能性ｓｈＲＮＡ。
4. プロモーターと、
   ＲＮＡ干渉によって、ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる少なくとも１つの変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現を選択的に阻害する１又は２以上のｓｈＲＮＡをコードする、前記プロモーターに作動可能に連結されている核酸インサートと
   を含む発現ベクターであって、
   前記１又は２以上のｓｈＲＮＡが、二機能性ｓｈＲＮＡ分子を含み、
   前記二機能性ｓｈＲＮＡのガイド鎖が、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の標的部位配列に完全に相補的であり、
   ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる変異ヌクレオチドが、前記二機能性ｓｈＲＮＡ内のシード配列の２、３又は４位に位置し、
   前記二機能性ｓｈＲＮＡのパッセンジャー鎖の１つが、前記二機能性ｓｈＲＮＡのガイド鎖と比較して１又は２以上のミスマッチを含み、
   前記二機能性ｓｈＲＮＡが、前記少なくとも１つの変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現を選択的に減少させるために切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する、
   前記発現ベクター。
5. ｓｈＲＮＡのための二機能性配列配置が、Ｋ−ｒａｓ−ＴＡ−１５ヌクレオチドループ−１９ヌクレオチド標的相補的配列−３’ステムアーム−スペーサー−５’ステムアーム−１９ヌクレオチド標的バリアント−ＴＡ−１５ヌクレオチドループ−１９ヌクレオチド標的相補的配列−３’ステムアームである、５’ステムアーム−１９ヌクレオチド標的を含む、請求項４に記載の発現ベクター。
6. 核酸インサートが、配列番号２、３、１７〜２２、又は５３〜５６から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むか、標的部位配列が、配列番号３２、３３、又は４７〜５２から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項４又は５に記載の発現ベクター。
7. １、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０コピーの二機能性ｓｈＲＮＡインサートを含む、請求項４〜６のいずれかに記載の発現ベクター。
8. 治療薬担体と、
   請求項４〜７のいずれかに記載の発現ベクターと
   を含む治療送達システム。
9. 治療薬担体が、緻密化されたＤＮＡナノ粒子であるか、或いは１若しくは２以上のポリカチオンで緻密化されたＤＮＡナノ粒子である、請求項８に記載の送達システム。
10. １又は２以上の変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物を発現している標的組織に１又は２以上のｓｈＲＮＡを送達するための方法に使用するための、請求項８又は９に記載の治療送達システムであって、
    前記方法が、
    請求項４〜７のいずれかに記載の発現ベクターを調製するステップと、
    前記発現ベクターを、リポソームを含む治療薬担体と組み合わせるステップと、
    治療的有効量の前記発現ベクターと治療薬担体複合体を、それを必要とする患者に投与するステップと
    を含む、
    前記治療送達システム。
11. １又は２以上の標的細胞において、ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現をインビトロで阻害する方法であって、
    選択された１又は２以上の標的細胞にＲＮＡ干渉を通じて前記１又は２以上の標的細胞において、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現を阻害することができる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するベクターをトランスフェクトするステップを含み、
    前記１又は２以上のｓｈＲＮＡが、二機能性ｓｈＲＮＡ分子を含み、
    前記二機能性ｓｈＲＮＡのガイド鎖が、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の標的部位配列に完全に相補的であり、
    ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる変異ヌクレオチドが、前記二機能性ｓｈＲＮＡ内のシード配列の２、３又は４位に位置し、
    前記二機能性ｓｈＲＮＡのパッセンジャー鎖の１つが、前記二機能性ｓｈＲＮＡのガイド鎖と比較して１又は２以上のミスマッチを含み、
    前記１又は２以上の二機能性ｓｈＲＮＡが、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現を選択的に減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する、
    前記方法。
12. ヒト対象において腫瘍細胞増殖を抑制する方法に使用するための、請求項４〜７のいずれかに記載の発現ベクターであって、
    前記方法が、
    腫瘍細胞増殖の抑制を必要とするヒト対象を特定するステップと、
    治療薬担体複合体中の前記発現ベクターを、前記腫瘍細胞増殖を抑制するのに十分な量で前記ヒト対象に投与するステップとを含む、
    前記発現ベクター。
13. ｉ）投与が、腫瘍内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、及びＤＮＡ：リポプレックスを用いた注射からなる群から選択されるか、
    ii）腫瘍細胞が変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物を発現しているか、
    iii）腫瘍が、ヒト膵管腺癌、肺がん、結腸がん、黒色腫、インスリノーマ、中皮腫、卵巣がん、及び膵臓がんからなる群から選択されるか、
    iv）二機能性ｓｈＲＮＡが配列番号２、３、１７〜２２、又は５３〜５６から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むか、及び／或いは
    ｖ）方法が、第２の抗新生物薬との併用療法をさらに含む、
    請求項１２に記載の使用するための発現ベクター。
14. ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現を選択的に減少させる、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の二機能性ｓｈＲＮＡをコードする核酸インサートを含む発現ベクターであって、
    前記二機能性ｓｈＲＮＡ分子が、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の標的部位配列に完全に相補的であるガイド鎖ｓｈＲＮＡを含み、
    ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる変異ヌクレオチドが、前記二機能性ｓｈＲＮＡ内のシード配列の２、３又は４位に位置し、
    前記二機能性ｓｈＲＮＡのパッセンジャー鎖の１つが、前記二機能性ｓｈＲＮＡのガイド鎖と比較して１又は２以上のミスマッチを含み、
    前記１又は２以上の二機能性ｓｈＲＮＡが、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現を選択的に減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する、
    前記発現ベクター。
15. ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現を選択的に減少させる、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の二機能性ｓｈＲＮＡインサートを包含する発現ユニットを含む細胞であって、
    前記二機能性ｓｈＲＮＡ分子の少なくとも１つの標的部位配列が、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子内に位置しており、
    前記二機能性ｓｈＲＮＡ分子が、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子の標的部位配列に完全に相補的であるガイド鎖を含み、
    ＫＲＡＳのコドン１２にアミノ酸置換変異を生じる変異ヌクレオチドが、前記二機能性ｓｈＲＮＡ内のシード配列の２、３又は４位に位置し、
    前記二機能性ｓｈＲＮＡのパッセンジャー鎖の１つが、前記二機能性ｓｈＲＮＡのガイド鎖と比較して１又は２以上のミスマッチを含み、
    前記二機能性ｓｈＲＮＡが、前記変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子産物の発現を選択的に減少させるための切断依存性及び切断非依存性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を活性化する、
    前記細胞。
16. 二機能性ｓｈＲＮＡが配列番号２、３、１７〜２２、又は５３〜５６から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むか、或いは、野生型Ｋ−ｒａｓの発現を増加させる、請求項１５に記載の細胞。