MX2014013475A - Rna de horquilla corta bifuncional (bi-shrna) especifico para mutaciones kras de un solo nucleotido. - Google Patents

Rna de horquilla corta bifuncional (bi-shrna) especifico para mutaciones kras de un solo nucleotido.

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MX2014013475A
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ras
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bifunctional
target
shrna
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MX2014013475A
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Donald Rao
Zhaohui Wang
John J Nemunaitis
Neil Senzer
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Abstract

La presente invención incluye composiciones y métodos para hacer y usar un shRNAs bifuncional capaz de reducir una expresión de un gen K-ras, e.g. un gen K-ras mutado, en donde al menos una secuencia de sitio diana de la molécula de RNA bifuncional se ubica dentro del gen K-ras y en donde la molécula de RNA bifuncional es capaz de activar un complejo de silenciado inducido por un RNA dependiente de escisión y uno independiente de escisión para reducir el nivel de expresión de K-ras.

Description

RNA DE HORQUILLA CORTA BIFUNCIONAL (BI-SHRNA) ESPECIFICO PARA MUTACIONES KRAS DE UN SOLO NUCLEÓTIDO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al campo de tratamiento de cáncer, y más particularmente, a un shRNA bi-funcional que es específico para mutaciones K-ras.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Sin limitar el alcance de la invención, los antecedentes se describen en conexión con K-ras.
El oncogén KRAS (Kirsten -ras) se muta en una proporción significante de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), cánceres colorectales y pulmonares de células no pequeñas (NSCLC). En la mayoría de los pacientes PDAC (70-90%) que transportan mutaciones KRAS, la tasa de supervivencia de cinco años es menor al 5%. KRAS es un miembro de la familia de proteína de enlace nucleótido guanina y es un componente integral de múltiples rutas de señalización intracelular incluyendo receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR). La abrumadora mayoría de mutaciones en KRAS son mutaciones somáticas de un solo nucleótido que resultan en substituciones de un solo aminoácido en los codones 12 o 13. Las mutaciones G12D, G12V, G12R y G12C KRAS comprenden > 90% de mutaciones KRAS que se encuentran en pacientes PADC. Las mutaciones KRAS esencialmente resultan en KRAS activo en forma constitutiva y señalización corriente abajo no regulada.
Agentes diana tales como el anticuerpo Cetuximab (en cáncer colorectal) y el inhibidor molecular pequeño vemurafenib (en melanoma mutante BRAF) , se desempeñan deficientemente en pacientes con mutaciones KRAS. Consecuentemente, una estrategia terapéutica de cáncer efectiva requiere selectividad de mutación KRAS que conserva la funcionalidad de tipo silvestre. Queda una gran necesidad por composiciones, métodos y tratamientos para canceres con mutaciones KRAS.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un modalidad, la presente invención incluye shRNAs bifuncionales capaces de reducir una expresión de un gen K-ras; en donde al menos una secuencia de sitio diana de la molécula RNA bifuncional se ubica dentro del gen K-ras, en donde la molécula RNA bifuncional es capaz de activar un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras. En un aspecto, el shRNA bifuncional comprende al menos una secuencia definida por SEQ ID NOS: 1 a 22. En otro aspecto, el shRNA bifuncional comprende cuando menos una secuencia definida por SEQ ID NOS: 31 a 52, o 53 a 56. En otro aspecto, la secuencia en sitio diana como mínimo está dentro de una secuencia de cDNA de gen K-ras humano (SEQ ID NOS: 27 a 30). En otro aspecto, el K-ras es un K-ras mutado. En otro aspecto, el shRNA bifuncional comprenden insertos triples que hacen diana en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21 o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o a combinación de SEQ ID NOS: 21, 2 y 18.
En un modalidad, la presente invención incluye un vector de expresión que comprende: un promotor; y un inserto de ácido nucleico enlazado operativamente al promotor, en donde el inserto codifica uno o más shRNA capaces de inhibir una expresión de al menos un gen diana que es un gen K-ras mediante interferencia RNA; en donde el uno o más shRNA comprenden una molécula de RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras. En un aspecto, la secuencia de gen diana comprende SEQ ID NO: 1 a 5. En otro aspecto, un arreglo de secuencia para shRNA comprende una diana 5' del tallo de brazo 19 nucleótido, que es una diana nucleótido de bucle-19 nucleótido K-ras-TA-15 secuencia complementaria -3' tallo del brazo-espaciador-5' variante diana de 5' tallo del brazo-19 nucleótido secuencia complementaria de diana nucleótido TA-15 bucle nucleótide-19-tallo del brazo. En otro aspecto, el inserto de ácido nucleico comprende al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 6 a 27. En otro aspecto, el shRNA como mínimo tiene una secuencia de sitio diana que está dentro de una secuencia cDNA de gen K-ras mutado. En otro aspecto, la presente invención incluye un sistema de suministro terapéutico que comprende: un portador de agente terapéutico; y un vector de expresión que comprende un promotor y un inserto de ácido nucleico enlazado operativamente al promotor, el inserto de ácido nucleico codifica uno o más RNA horquilla corta (shRNA) capaces de inhibir una expresión de una secuencia de gen diana que es un gen K-ras mediante interferencia RNA; en donde el uno o más shRNA comprende una molécula RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación, para reducir el nivel de expresión de K-ras. En otro aspecto, el portador de agente terapéutico es una nanopartícula de DNA compactada. En otro aspecto, la nanopartícula de DNA compacta con uno o más policationes. En otro aspecto, el uno o más policationes es un péptido 3-mero cisteína-lisina substituido con polietilen glicol (PEG) de 10 kDA (CK30PEG10k). En otro aspecto, las nanopartículas de DNA compactadas además se encapsulan en un liposoma. En otro aspecto, el liposo a es una vesícula invaginada bilamilar (BIV). En otro aspecto, el liposoma es un liposoma enmascarado en forma reversible. En otro aspecto, el portador de agente terapéutico es un liposoma. En otro aspecto, la secuencia de genes diana comprenden SEQ ID NOS: 27 a 30. En otro aspecto, el inserto de ácido nucleico comprende al menos una de las secuencias selectas de SEQ ID NOS: 31 a 52 o 53 a 56. En otro aspecto, el inserto se elige de SEQ ID NOS: 1-22. En otro aspecto, el shRNA bifuncional comprenden insertos triples que hacen blanco en mutaciones K-ras específicas diana seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21, 55 o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o una combinación de SEQ ID NOS: 21, 2 y 18.
En un modalidad, la presente invención incluye un método para suministrar uno o más shRNAs a un tejido objetivo que expresa un gen K-ras que comprende etapas de: preparar un vector de expresión que comprende un promotor y un inserto de ácido nucleico enlazados operativamente al promotor que codifica el uno o más shRNA, en donde el uno o más shRNA comprenden una molécula de RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras; combinar el vector de expresión con un portador de agente terapéutico, en donde el portador de agente terapéutico comprende un liposoma; y administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del vector de expresión y complejo de portador de agente terapéutico a un paciente que lo requiere. En un aspecto, el portador de agente terapéutico es una nanopartícula de DNA compactada. En otro aspecto, la nanopartícula de DNA se compacta con uno o más policationes, en donde el uno o más policationes comprenden un péptido 3-mero cisteína-U sina substituido con polietilen glicol (PEG) de 10 kDA (CK30PEG10k) o un péptido de condensación de lisina 30-mero. En otro aspecto, las nanopartículas de DNA compactadas además se encapsulan en un liposoma, en donde el liposoma es una vesícula invaginada bilaminar (BIV) y se decora con uno o más porciones diana receptoras "inteligentes". En otro aspecto, la uno o más porciones diana receptoras "inteligentes" son mímicos de giro beta bivalentes de molécula pequeña. En otro aspecto, el liposoma es un liposoma enmascarado en forma reversible. En otro aspecto, el liposoma es una vesícula invaginada bilaminar (BIV). En otro aspecto, el liposoma es un liposoma enmascarado en forma reversible. En otro aspecto, la una o más porciones diana receptoras "inteligentes" son mímicos de giro beta bivalentes de molécula pequeña. En otro aspecto, el inserto de ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56. En otro aspecto, el shRNA bifuncional comprende insertos triples que hacen blanco en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21 o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o una combinación de SEQ ID NOS: 21, 2 y 18.
En un modalidad, la presente invención incluye un método para inhibir una expresión de un gen K-ras en uno o más células diana que comprende las etapas de: seleccionar a una o más células diana; y transfectar la célula diana con un vector que expresa uno o más RNA de horquilla corta (shRNAs) capaces de inhibir una expresión de un gen K-ras en la una o más células diana por interferencia de RNA, en donde uno o más shRNA comprenden una molécula RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras. En otro aspecto, shRNA incorpora siRNA motivos (dependiente de disociación) y miRNA (independiente de disociación). En otro aspecto, el shRNA bifuncional comprenden insertos triples que hacen blancos en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21 o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o una combinación de SEQ ID NOS: 21, 2 y 18.
En una modalidad, la presente invención incluye un método para suprimir un crecimiento de célula de tumor en un sujeto humano que comprende las etapas de: identificar al sujeto humano que requiere supresión del crecimiento de células de tumor; y administrar un vector de expresión en un complejo portador de agente terapéutico al sujeto humano, en una cantidad suficiente para suprimir el crecimiento de células de tumor, en donde el vector de expresión expresa uno o más shRNA capaces de inhibir una a expresión de un gen diana que es K-ras en la una o más células diana por interferencia RNA; en donde el uno o más shRNA comprenden una molécula RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión del gen diana; en donde la inhibición resulta en una apoptosis, una proliferación frenada, o una invasividad reducida de las células de tumor. En otro aspecto, el portador de agente terapéutico comprende una vesícula invaginada bilaminar (BIV). En otro aspecto, el portador de agente terapéutico comprende uno o más porciones diana receptoras "inteligentes" son mímicos de giro beta bivalentes de molécula pequeña. En otro aspecto, la etapa de administrar se elige del grupo que consiste de inyección subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa. En otro aspecto, la etapa de administrar comprende inyección intratumoral. En otro aspecto, la etapa de administrar comprende inyectar con un dna:lipoplex. En otro aspecto, crecimiento de células de tumor exprés de K-ras. En otro aspecto, crecimiento de células de tumor es adenocarcinoma ductal pancreático humano. En otro aspecto, el crecimiento de células de tumor se elige del grupo que consiste de cáncer pulmonar, cáncer de colon, melanoma, insulinoma, mesotelioma, cáncer de ovarios y cáncer pancreático. En otro aspecto, el crecimiento de células de tumor es un cáncer pancreático. En otro aspecto, bishRNA se elige de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56. En otro aspecto, el shRNA bifuncional comprende insertos triplete que hacen blanco en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21, o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o una combinación de SEQ ID NOS: 21, 2 y 18. En otro aspecto, el método además puede comprender una combinación de terapia con un segundo agente anti-neoplásmico. En otro aspecto, el método además comprende una terapia de combinación con cetuximab o vemurafenib.
Otra modalidad de la presente invención incluye un vector de expresión que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75, O 100 insertos shRNAs bifuncionales capaces de reducir una expresión de un gen K-ras mutante; en donde al menos una secuencia de sitio diana de la molécula RNA bifuncional se ubica dentro del gen K-ras, en donde la molécula RNA bifuncional es capaz de activar un complejo de silenciado inducido con RNA dependiente de disociación e independiente de disociación, para reducir el nivel de expresión de K-ras. En un aspecto, shRNA bifuncional se elige de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56. En otro aspecto, el shRNA bifuncional comprende insertos triplete que hacen diana en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de al menos uno de G12D-G12V-G12R, G12C-G12D-G12R, G12D-G12V-G12R, o G12C-G12D-G12R. En otro aspecto, el shRNA bifuncional comprende insertos triplete que hacen blanco en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21, o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o una combinación de SEQ ID NOS: 21, 2 y 18.
Otra modalidad de la presente invención incluye una célula que comprende un vector de expresión que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75, o 100 insertos shRNAs bifuncionales capaces de reducir una expresión de un gen K-ras mutante; en donde al menos una secuencia en sitio diana de la molécula RNA bifuncional se ubica dentro del gen K-ras, en donde la molécula RNA bifuncional es capaz de activar un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras. En un aspecto, el shRNA bifuncional se elige de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56. En otro aspecto, el shRNA bifuncional aumenta la expresión de K-ras no mutado. En otro aspecto, el shRNA bifuncional comprende insertos triplete que hacen blanco o diana en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21, o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o una combinación de SEQ ID NOS:21, 2 y 18.
Otra modalidad de la presente invención incluye un método para evaluar un fármaco candidato que se considera que es útil para tratar células o tejidos que comprenden al menos un K-ras mutado, el método comprende: (a) medir el nivel de expresión de al menos un K-ras de tipo silvestre y uno o más genes K-ras mutados en las células o tejidos; (b) administrar un fármaco candidato a un primer subconjunto de células o tejidos y un placebo a un segundo subconjunto de células o tejidos; (c) repetir la etapa (a) después de la administración del fármaco candidato o el placebo; y (d) determinar si el fármaco candidato reduce la expresión de K-ras mutado en comparación con K-ras de tipo silvestre que es estadísticamente significante en comparación con cualquier reducción que ocurre en el segundo subconjunto de células o tejidos, en donde una reducción estadísticamente significante indica que el fármaco candidato es útil para tratar enfermedad inducida por K-ras. En un aspecto, las células o tejido además expresan uno o más genes detectadles que se han modificado para comprender un K-ras de tipo silvestre y uno o más K-ras mutados, en donde el nivel de expresión de la etiqueta detectable se correlaciona con el efecto de la sustancia candidato en K-ras de tipo silvestre y uno o más K-ras mutadas. En otro aspecto, las células o tejido se han modificado para expresar un shRNAs bifuncional capaz de reducir una expresión de un gen K-ras, en donde al menos una secuencia de sitio diana de la molécula RNA bifuncional se ubica dentro del gen K-ras y en donde la molécula RNA bifuncional es capaz de activar una molécula de silenciado inducida por RNA dependiente de disociación y una independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras.
Otra modalidad de la presente invención incluye un método para evaluar un fármaco candidato que se considera que es útil para tratar células o tejidos que comprenden al menos un K-ras mutado que se silencia efectivamente, el método comprende: (a) medir uno o más de los siguientes: a. El nivel de expresión de al menos un K-ras de tipo silvestre y uno o más genes K-ras mutados en las células o tejidos; b. El nivel de expresión de un gen candidato o un grupo de genes candidato en ambiente celular con la expresión reducida de uno o más genes K-ras mutados y las células o tejidos de cáncer; c. El efecto de un fármaco candidato y el fenotipo de estas células comprende expresión reducida de uno o más genes K-ras mutados en las células o tejidos de cáncer; (b) administrar un fármaco candidato a un primer subconjunto de las células o tejidos, y un placebo a un segundo subconjunto de las células o tejidos; (c) repetir la etapa (a) después de la administración del fármaco candidato o el placebo; y (d) determinar si el fármaco candidato es efectivo para producir el fenotipo determinado en un ambiente celular con la expresión reducida de K-ras mutada en comparación con K-ras mutante expresa el ambiente celular, que es estadísticamente significante en comparación con cualquier reducción que ocurra en el segundo subconjunto de células o tejidos, en donde una reducción estadísticamente significante indica que el fármaco candidato es útil para tratar enfermedad sin fondo de mutación K-ras significante. En un aspecto, las células o tejido además expresan uno o más genes detectables que se han modificado para comprender un K-ras de tipo silvestre y uno o más K-ras, mutados, en donde el nivel de expresión de la etiqueta detectable se correlaciona con el efecto de la sustancia candidato en el K-ras de tipo silvestre y uno o más K-ras mutados. En otro aspecto, las células o tejido se han modificado para expresar un shRNAs bifuncional capaz de reducir una expresión de un gen K-ras, en donde al menos una secuencia de sitio objetivo o diana de la molécula RNA bifuncional se ubica dentro del gen K-ras y en donde la molécula RNA y funcional es capaz de activar un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación e independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras. En otro aspecto, las células o tejido se han modificado para expresar un shRNA bifuncional que comprende uno o más insertos que hacen blanco en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21, o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o una combinación de SEQ ID NOS: 21, 2 y 18.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente invención, ahora se hace referencia a la descripción detallada de la invención junto con las figuras acompañantes y en donde: La Figura 1 muestra un esquemático de un vector de prueba. Los primeros 17 aminoácidos de un KRAS de tipo silvestre se insertaron en el extremo amino del gen Renilla luciferasa ( hRluc) del vector psiCHECK2 mientras que los primeros 17 aminoácidos de los mutantes G12D, G12V, G12R o G12C KRAS se insertaron en el extremo amino del gen de luciferasa de Luciérnaga ( hluc+ ) en el mismo vector.
La Figura 2 muestra el efecto de expresión de tipo silvestre y mutante de los vectores de prueba. Expresión de tipo silvestre (Wt) y mutante (Mu) de cada uno de los vectores de prueba se compara con el vector psiCHECK2 precursor utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Glo (Promega). La comparación de expresión Wt a Mu se estimó por la proporción de expresión de Renilla (RL) a Luciérnaga (FF).
Las Figuras 3A a 3C son una demostración de un sistema de ensayo de la presente invención. Al co-transfectar un vector de prueba con vectores de expresión shRNA bifuncionales (bi-shRNA) (86, 87, 88, 89, 90, 91 o 92, SEQ ID NOS.: 1 a 7, respectivamente), el silenciamiento génico preferencial de tipo mutante contra silvestre (Figura 3A) puede estimarse rápidamente por una proporción FF a RL (Panel a). Silenciamiento génico de mutante o tipo silvestre puede ser adicionalmente analizado en forma individual al comparar RLU de FF (Figura 3B) o RL (Figura 3C) con el control de vector vacío (C).
La Figura 4 muestra el efecto de posición para diversos mutantes. Construcciones bi-shRNA específicas para el mutante G12D se comparan al colocar la secuencia de nucleótido mutante sencillo en uno de las primeras 11 posiciones de la hebra guía. Por ciento de silenciamiento génico para tipo silvestre (wt) y para mutante (mu) se estiman para cada construcción. (n=3).
La Figura 5 muestra una comparación con ciertos mal apareamientos que se introducen que reducen la eficiencia de silenciamiento génico. Construcciones G12D con nucleótido mutado de la región central (p9, plO y pll) se compararon con construcciones con mal apareamiento adicional ya sea de la región semilla o en la yuxtaposición de nucleótido mutado: tipo silvestre (wt) y para mutante (mu). (n=3).
La Figura 6 muestra silenciamiento génico selectivo en la posición 3 o 4 de las construcciones G12D, G12V, G12R y G12C. Ventaja de silenciamiento génico mutante se compara para todas las posiciones 3 o 4 de construcciones bi-shRNAi para G12D, G12V, G12R y G12C contra todos los vectores de prueba específicos para cada uno de los cuatro mutantes. La proporción de mutante a tipo silvestre sobre la muestra de control de vector vacío (muestra C, la barra transversal) indica fuerte ventaja de silenciamiento génico en alelos mutantes específicos.
Las Figuras 7A a 7C muestran análisis de inmuno transferencia Western de expresión KRAS en Células transfectadas bi-shRNA. HEK-293 (WT), PANC-1 (alelo G12D) y iaPaCa (alelo G12C) se transíectaron con diversas construcciones bi-shRNA dirigidas a mutante. Extractos de células recolectados 48 horas post-transíección, se analizaron en forma semi-cuantitativa con inmuno-transferencias Western. (Figura 7A) célula PANC-1 transfectadas con construcciones que hacen blanco en G12D. (Figura 7B) Compara las construcciones G12D en silenciamiento génico KRAS con 3 líneas celulares. (Figura 7C) Compara construcciones G12C en silenciamiento génico KRAS con 3 líneas celulares.
La Figura 8 es una figura que muestra un enjambre miR-17-92 con 6 miRNAs en tándem.
La Figura 9 muestra el resultado de las triples construcciones probadas con vectores de prueba reporteros para comparar la eficiencia de silenciamiento génico con su contraparte singlete.
La Figura 10 muestra un esquema para producir células que comprenden el uno o más shRNAs bifuncionales de la presente invención.
La Figura 11 muestra los resultados de utilizar triples construcciones con secuencias de espacio miR-17-92 (pGBI-129 y pGBI-130) puede silenciar génicamente mutante (Carriles 4 y 5) mientras que triples construcciones con secuencias de estructura principal miR-17-92 (pGBI-131 y pGBI-132) pueden silenciar génicamente en forma muy eficiente mutante (Carriles 6 y 7).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Mientras que hacer y usar diversas modalidades de la presente invención se discuten en detalle a continuación, deberá apreciarse que la presente invención proporciona muchos conceptos inventivos aplicables que pueden ser incorporados en una amplia variedad de contextos específicos. Las modalidades específicas aquí discutidas son solamente ilustrativas en formas específicas para hacer y usar la invención y no delimitan el alcance de la invención.
Para facilitar la comprensión de esta invención, a continuación se define una cantidad de términos. Términos definidos aquí tienen los significados comúnmente comprendidos por una persona con destreza en las áreas relevantes a la presente invención. Términos tales como "un", "una" y "el/la" no se pretende que se refiera sólo a una entidad singular pero incluyen la clase general de la cual un ejemplo específico puede emplearse para ilustración. La terminología presente se emplea para describir modalidades específicas de la invención, pero su uso no delimita a la invención excepto como se establece en las reivindicaciones.
Las mutaciones de activación en la familia proto-oncogenes ras les hace constitutivamente activos se observa frecuentemente en todos los cánceres humanos. En particular, mutaciones de activación en KRas se observan en más de 90% de cánceres pancreáticos. Mutaciones kras son difíciles de ser blanco específicamente con moléculas pequeñas, de esta manera silenciando las mutaciones Kras sin afectar la expresión wt Kras es un enfoque viable para el tratamiento de cáncer. Todo el silenciamiento génico de mutación Kras basado en RNAi ya está dirigido en una mutación específica o en silenciamiento génico concomitante de la expresión wt. Esta invención describe un diseño y construcción novedosos que son capaces de silenciar genéricamente más de 90% de las mutaciones Kras identificadas en cáncer pancreático sin reducir drásticamente la expresión wt Kras.
RNAi es el descubrimiento ganador del Premio Nobel por Fire y Mello en 1998, que ha estimulado una cantidad exponencial de estudios y publicaciones que impulsan la comprensión de función de genes y estimulan numerosas pruebas clínicas fase I y II. Este mecanismo de silenciar genes de origen natural por pequeñas RNAs, que incluye microRNA endógenos (miRNA), es altamente dependiente de la secuencia de genes; de esta manera, el mecanismo en teoría puede emplearse para inhibir la expresión de cualesquiera genes dirigidos con fuerte especificidad. RNAi no se limita por las restricciones farmacológicas inherentes al desarrollo de moléculas pequeñas que crea una oportunidad para tener acceso a blancos tradicionalmente "no tratables con fármacos" por el tratamiento de enfermedad.
El jugador central de este mecanismo es el Complejo de Silenciado Inducido por RNA (RISC). El proceso empieza con RNA pequeño de doble hebra (compuesto de una hebra pasajera y una hebra guía) que se incorpora en pre-RISC seguido por la liberación dependiente de disociación e independiente de disociación de la hebra pasajera para formar la hebra guía que contiene RISC. La hebra guía (anti-sentido a mRNA) dirige RISC para reconocer el mRNA diana a través de complementariedad de secuencia (completa o parcial extendida). Un componente clave de RISC es la familia de proteínas Argonauta (Ago), Ago 1, 2, 3 y 4 el sistema de mamíferos de los cuales sólo Ago 2 tiene actividad de endonucleasa para permitir disociación del mRNA diana para mayor degradación (ruta dependiente de disociación); todo RISC que contiene Ago puede funcionar a través de una ruta efectora independiente de disociación resultando en represión de traducción y secuestro de mRNA en p-body??p-cuerpo con degradación subsecuente. El proceso efector dependiente de disociación requiere extensa homología entre hebra guía y tanto la hebra pasajera como en mRNA diana, particularmente en la región central; el proceso efector independiente de disociación, por otra parte sólo requiere homología parcial entre la hebra guía y tanto la hebra pasajera como el mRNA objetivo.
La presente invención aprovecha tanto carga dependiente de disociación como independiente de disociación en el complejo RISC no los eventos que están con están corriente abajo del complejo RISC. De esta manera, como se emplea aquí, la frase "independiente de disociación y dependiente de disociación" se refiere al diseño de RNA(s) que se dirigen específicamente a RISC y las actividades dependientes de disociación e independientes de disociación en el complejo RISC, es decir carga. Se ha encontrado aquí y en la solicitud principal para este caso, que estos "shRNAs bifuncionales" tienen una actividad inhibitoria superior que la suma de ser diana en cada parte individual del complejo RISC. De esta manera, la superior actividad inhibitoria de la presente invención.
Interferencia REA puede ser activada ya sea por RNA de interferencia pequeño de doble hebra sintético (siRNA) o por RNA de horquilla corta dirigido por vector RNA (shRNA). Tanto siRNA como shRNA dirigido por vector se ha demostrado que son efectivos en aplicaciones in vitro e in vivo cada una con sus ventajas respectivas. La mayoría de siRNA se diseña estructuralmente para promover incorporación eficiente en RISC que contiene Ago2, el diseño de sustrato Dicer que contiene RNasa III mejora la eficiencia de siRNA al menos 10 veces por asociación inicial y procesamiento en pre-RISC. shRNA dirigido por vector utiliza la ruta de biogénesis microRNA huésped que parece ser más eficiente. siRNA se modifica más fácilmente en forma química mientras que la expresión de shRNA puede modularse y regularse por promotores específicos.
Los presentes inventores desarrollaron la teenología de shRNA dirigida por vector novedosa, shRNA bifuncional (bi-shRNA), para mejorar adicionalmente la eficiencia de RNAi al aprovechar ambas rutas dependientes de disociación e independientes de disociación de carga RISC en una molécula pre-programada. El bi-shRNA dirigido por vector incluye dos estructuras tronco-bucle para cada secuencia diana mRNA, un shRNA tronco-bucle tiene perfecta complementariedad en el tronco y el segundo shRNA tronco-bucle contiene mal apareamientos de la hebra pasajera del tronco (de esta manera difiriendo del RNA mal apareado en la técnica previa que incluye el mal apareamientos en la hebra guía). De manera importante, después de incorporación en RISC, las hebras guía derivadas de cada una de las dos estructuras son completamente complementarias a la secuencia diana mRNA que están asociadas con diferentes RlSCs que contienen Ago. El diseño -shRNA lleva inicio más rápido del silenciamiento génico, superior eficacia y mayor durabilidad cuando se compara ya sea con siRNA o shRNA convencional. Actualmente, terapia de cáncer personalizada con shRNA específico diana transita a la parte clínica de estudios Fase I utilizando un vehículo de suministro de liposomas invaginado bilaminar modificado. Métodos moleculares clave involucrados en diseño, construcción e implementación de bi-shRNA se proporcionan a continuación.
Dependiendo de ese objetivo y las modalidades, varios diferentes vectores, promotores o estructuras principales de plásmido y sistemas de suministro pueden emplearse. Se ha encontrado útil elegir un vector de expresión con eficiente expresión de transgenes. Los presentes inventores reconocen que un vector de expresión con promotores poderosos, por ejemplo un promotor CMV extendido que contiene IE 5'UTR y Intron A parcial (pUMVC3), es más efectivo que aquellos con un sitio de clonación inmediatamente adyacente al promotor CMV. En ciertas modalidades, es benéfico tener un tramo de la transcripción principal antes de las estructuras tronco-bucle. Además, si más de un uso de un vector se planea, una estrategia de lanzadera efectiva deberá ser trabajada de antemano, modificación por amplificación PCR del casete de expresión no es tan eficiente. La selección de promotor también es importante; promotores RNA polimerasa III son mucho más fuertes en expresión pero competitivamente saturan el proceso de maduración de miRNA endógeno en ambas etapas de exportación nuclear como carga RISC resultando en toxicidad letal in vitro e in vivo con ciertos vehículos de suministro. Promotores de RNA polimerasa II aunque menos fuertes en expresión, trabajan eficientemente y son mucho menos tóxicos frente a frente en competencia por la ruta miRNA endógena.
En ciertas modalidades, una secuencia que puede actuar en más de una especie se diseña, particularmente si se utilizan múltiples sistemas de modelos de animales. La mayoría de los genes diana, es posible encontrar tramos de nucleótidos diana que se conservan entre especies. Para encontrar una secuencia que es tanto conservada como óptima para silenciamiento génico, se debe comparar la secuencia apareada en homología con la secuencia de sitios diana selecto.
Programas de computadoras accesibles al público que utilizan diferentes algoritmos (por ejemplo el centro de diseño Dharmacon RNAi (www.dharmacon.com) y IDT (www.idtdna.com) están fácilmente disponibles y pueden emplearse para localizar sitios diana apropiados dentro del gen diana. Una búsqueda con la mayoría de los programas de computadora a menudo produce un primer juego preliminar de dianas para mayor análisis. Algunas publicaciones disponibles ofrecen sugerencias para realizar y no realizar. Una búsqueda BLAST por cada secuencia diana habrá de tomarse a fin de analizar homología cruzada potencial con otros mRNAs dentro de la especie de interés.
Una vez que se elige el sitio de secuencia diana, puede empezar el proceso de diseño bi-shRNA; el proceso de diseño se presenta a continuación. La estructura tronco-bucle bi-shRNA empleada por los inventores emplea la estructura principal miR-30a bien analizada aunque puede emplearse cualquier estructura principal miRNA funcional. El bi-shRNA consiste de las dos estructuras tronco-bucle en la estructura principal miR-30a situada inmediatamente adyacente entre sí con espacio de aproximadamente 10 nucleótidos de largo. Un espacio más largo de nucleótidos puede emplearse en múltiples unidades de bi-sh RNA pueden diseñarse para ensartar en conjunto de una sola transcripción que dirige ya sea un solo gen a múltiples sitios o múltiples genes diferentes simultáneamente.
Para construir la unidad de expresión a colocarse en los sitios de clonación múltiples de un vector de expresión, la estrategia de ensamblado utilizando oligonucleótidos sintéticos enlazados secuencialmente en conjunto, se ha desarrollado. En forma alterna, también se puede tercerizar la síntesis de la construcción de genes con la secuencia específica a una compañía de servicios de bioteenología. Para el proceso de ensamblado de oligonucleótidos, se diseñaron y sintetizaron fragmentos de DNA superpuestos. Debido a las secuencias redundantes en las estructuras de tronco-bucle, es necesario ligar inicialmente los fragmentos 5' y fragmentos 3'. El fragmento 5' y el fragmento 3' pueden entonces ser purificados en gel y además ligados a los fragmentos de enlace medios. Este proceso de ensamblado es eficiente y con diseño cuidadoso muchos fragmentos pueden ser empleados en forma repetida para diferentes construcciones bifuncionales. Para cada diana, es mejor diseñar y construir al menos tres construcciones bifuncionales para comparar y de las cuales seleccionar una construcción con alta eficiencia de silenciamiento génico para mayor evaluación. La eficiencia de silenciamiento génico puede ser comparada in vitro en células de cultivo de te ido. Los presentes inventores reconocen que en general es difícil comparar deficiencias de silenciamiento génico con genes expresados en forma endógena debido a que los métodos de transfección in vitro tienen deficiencias ampliamente diferentes; esto es particularmente así cuando la eficiencia de transfección es baja ya que el silenciamiento génico es difícil de estimar debido a la interferencia de fondo de células no transíectadas.
La eficacia y eficiencia de silenciamiento génico de diana o de bi-shRNA pueden probarse con la variedad de sistemas in vitro e in vivo dependiendo de la aplicación diana y planeada. De esta manera, evaluación in vitro puede realizarse siguiendo transfección de los plásmidos de expresión bi-shRNA en una variedad de células cultivadas. Los presentes inventores encontraron que transfecciones tanto por electroporación como por liposoma (por ejemplo, Lipofectamina 2000) son altamente efectivas, cuando la cantidad de ADN plásmido controla cuidadosamente utilizando un vector de control o secuencia aleatoria universal. Para Lipofectamina o un agente relacionado, los presentes inventores encontraron que el método de transfección inversa en general es menos tóxico que el método de transfección directa. Silenciamiento génico diana puede ser evaluado ya sea por qRT-PCR para mRNA de gen diana o por Western y/o ELISA para proteína de gen diana. En métodos de un ensayo, la expresión de shRNA maduro por RT-PCR de tronco-bucle se detecta, en otro método de ensayo, la disociación de mRNA diana se detecta por RACE Mediado por Ligando-RNA 5' (5' RLM-RACE). RT-PCR de tronco-bucle es un método sensible dependiendo del cebador de sonda específico empleado; además, se puede detectar y cuantificar específicamente tanto la hebra pasajera como la hebra guía. Para bi-shRNA, el método puede calificar en forma diferencial tanto una hebra totalmente complementaria así como la mal apareada pasajera (parcialmente complementaria). El método 5' RLM-RACE requiere ligación de un oligómero RNA en el extremo mRNA disociado consecuentemente, el método se hace menos eficiente . En cuanto a una cantidad de rondas de amplificaciones se requiere a menudo, un diseño de cebador encajado es esencial para asegurar la especificidad.
La funcionalidad evaluable de bi-shRNA se basa en suministro de plásmido efectivo en células diana. Los inventores reconocen que algunos sistemas de transfección in vitro a menudo no se traducen en modelos de animales in vivo inherentemente más complejos. Hay numerosos sistemas de suministro diseñados específicamente para aplicaciones sistémicas in vivo. El presente inventor utiliza lipoplex de vesícula invaginada bilaminar catiónico DOTAP: colesterol fusogénico (BIV) para estudios in vivo y se ha trasladado exitosamente a la clínica. Estrategias de modificación para una biodistribución más enfocada, suministro dirigido y captación intracelular mejorada se desarrollan. Un lipoplex efectivo deberá utilizar plásmidos carentes de contaminantes del huésped E. coli. Aunque los plásmidos producidos por el equipo de purificación de plásmidos endo-libres en general se emplean, plásmidos producidos por, GLP o GMP son más efectivos. Desafortunadamente, el ácido colánico y otros polisacáridos no asociados a endotoxina co-purifican con DNA por cromatografía de intercambio de aniones y por centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio. Por lo tanto, la eliminación de endotoxina no retira estos contaminantes y HPLC no puede detectar estos contaminantes.
Para corregir esto, el procedimiento Superclean™ se ha desarrollado para generar ADN plásmido de ultra alta calidad limpio de estos contaminantes, para aplicaciones in vivo y clínicos. La preparación de liposomas involucra equipo altamente especializado, los presentes inventores rutinariamente generan el DOTAP:colesterol BIV en una instalación GMP. Liposoma previamente elaborado puede ser obtenido de un colaborador o adquirido de un distribuidor. El proceso de preparar lipoplex con liposoma de alta calidad y DNA plásmido se describirá a continuación. La formulación de lipoplex puede lograrse en la mayoría de los ambientes de laboratorio. Una vez que se elabora lipoplex, la formulación puede ser suministrada en forma sistémica a animales experimentales ya sea a través de inyección lenta en la vena de la cola o con catéteres. Expresión de vector de sitio diana puede ser analizada utilizando el método PCR para DNA plásmido y RT-PCR de tronco-bucle para bi-shRNA maduro, respectivamente. Funcionalidad bi-shRNA puede ser ensayada con 5' RLM-RACE para disociación mRNA diana y con transferencia Western o IHC para silenciamiento génico de proteína diana. Estos análisis pueden realizarse aproximadamente a 48 horas post tratamiento. Para eficacia, suministro repetido en el animal experimental se requiere a menudo. El programa de dosis requiere ser determinado y optimizado experimentalmente.
La invención proporciona que shRNAs específicos de genes diana puede diseñarse para participar e interactuar con las rutas RISC dependiente de disociación y RISC independiente de disociación. Como se emplea aquí, el término "shRNA bifuncional" en general significa una o más moléculas de RNA, cada una de las cuales incluye una secuencia de doble hebra que reside dentro de una porción tronco de estructuras tronco-bucle separadas, en donde una primer molécula de RNA se diseña para presentarse a una ruta RISC dependiente de disociación y una segunda molécula de RNA se diseña para presentarse a una ruta RISC independiente de disociación. En ciertas modalidades, bi-shRNA todo está en una sola hebra.
En forma más específica, una primer secuencia de hebra guía es complementaria, de preferencia es 100% complementaria cuando menos una porción de una transcripción mRNA codificada a un gen diana. La invención proporciona esta hebra guía (que inicialmente se une en la hebra pasajera para formar el tronco de doble hebra) comprende una secuencia de ácido nucleico que es capaz de ligar a la transcripción mRNA del gen diana, y se presenta a la ruta RISC dependiente de disociación. La invención proporciona que este enlace de la secuencia de hebra guía a la transcripción mRNA, y presentación de la ruta RISC dependiente de disociación, provoca degradación de la transcripción mRNA.
En modalidades particulares, se proporciona que la segunda secuencia de hebra guía al menos es parcialmente complementaria a cuando menos una porción de la transcripción mRNA codificada por el gen diana. Más particularmente, la segunda secuencia de hebra guía puede contener una primer porción que es complementaria de preferencia 100% complementaria, a la transcripción mRNA codificada por el gen diana, mientras que una segunda porción de la secuencia de hebra guía contiene ciertas bases que están mal apareadas con secuencias correspondientes de la transcripción mRNA del gen diana.
Como se emplea aquí, un par base "mal apareado" se refiere a dos bases nitrogenosas dentro de una secuencia de ácido nucleico que, cuando se enlazan (o hibridizan) entre sí, no siguen las reglas Chargaffs de apareamiento base. Las reglas Chargaffs disponen que la purina adenina (A) dentro de una primer secuencia de ácido nucleico apareada con la pirimidina timina (T) (o uridina (U)) dentro de una segunda secuencia de ácido nucleico. Además, las reglas Chargaffs disponen que la purina guanina (G) dentro de una primer secuencia de ácido nucleico apareara con la pirimidina citosina (C) dentro de una segunda secuencia de ácido nucleico. De esta manera, apareamiento base entre dos hebras (secuencias de ácido nucleico) que no siguen y cumplen con estas reglas, se considerará un par base "mal apareado", por ejemplo un apareamiento entre G y U, A y G, A y C, G y T, G y U, y así en adelante. Una hebra guía dentro de la secuencia de dobles hebras de las estructuras de tronco-bucle ahí mostradas, que contienen uno o más pares base "mal apareados" respecto a la hebra pasajera crean un abultamiento en la secuencia de tronco de doble hebra.
Como se emplea aquí, el término "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (DNA) o ácido ribonucleico (RNA), oligonucleótidos, fragmentos generados por reacción de cadena polimerasa (PCR), y fragmentos generados por cualquiera de migración, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Moléculas de ácido nucleico que pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos de origen natural (tales como DNA y RNA), o análogos de nucleótido de origen natural (por ejemplo, formas a-enantioméricas de nucleótidos de origen natural), o una combinación de ambos. Nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en porciones azúcar y/o en porciones base pirimidina o purina. Estas modificaciones incluyen por ejemplo reemplazos de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido o azúcares que pueden ser funcionalizados como éteres o ásteres. Aún más, toda la porción azúcar puede ser reemplazada con estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcar carbocíclico. Ejemplos de modificaciones en una porción base incluyen purinas y piridinas alquiladas, purinas y pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Monómeros de ácido nucleico pueden estar enlazados por uniones fosfodiéster o análogos de estas uniones. Análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, y semejantes. El término "molécula de ácido nucleico" también incluyen los así llamados "péptido ácidos nucleicos" comprenden bases de ácido nucleico de origen natural o modificadas conectadas a una estructura principal de poliamida. Ácidos nucleicos ya pueden ser de una sola hebra o de doble hebra.
El término "vector de expresión" como se emplea aquí en la especificación y reivindicaciones incluye moléculas de ácido nucleico que codifican un gen que se expresa en una célula huésped. Típicamente, un vector de expresión comprende un promotor de transcripción, un gen y un terminador de transcripción. La expresión génica usualmente se coloca bajo el control de un promotor, y este gen se dice que esta "enlazado operativamente a" el promotor. De manera similar, un elemento regulatorio y un promotor núcleo se enlazan operativamente si el elemento regulatorio modula la actividad del promotor núcleo. El término "promotor" se refiere a cualquier secuencia de DNA que cuando se asocia con un gen estructural en una célula de doble hebra anfitriona, aumenta para ese gen estructural uno o más de 1) transcripción, 2) traducción o 3) estabilidad de mRNA, en comparación con la transcripción, traducción o estabilidad de mRNA (más larga vida media de mRNA) en la ausencia de la secuencia promotora bajo condiciones de crecimiento apropiadas.
El término "oncogén" como se emplea aquí, se refiere a genes que permiten la formación y supervivencia de células neoplásticas malignas (Bradshaw, T.K.: Mutagenesis 1, 91-97 (1986).
Como se emplea aquí, el término "receptor" denota una proteína asociada a célula que enlaza a una molécula bioactiva denominada un "ligando". Esta interacción media el efecto de ligando en la célula. Los receptores pueden estar ligados a membrana, citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor de hormona de estímulo de tiroides, receptor beta-adrenérgico) o receptor multimérico (por ejemplo, receptor PDGF, receptor de hormona de crecimiento, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor IL-6). Receptores ligados a membrana se caracterizan por una estructura de múltiples dominios que comprende un dominio de enlace y un ligando extracelular y un dominio efector intracelular que típicamente están involucrados en transducción de señal. En ciertos receptores ligados a membrana el dominio de enlace-ligando extracelular y el dominio efector intracelular se ubican en polipéptidos separados que comprenden el receptor funcional completo.
El término "hibridizar" se refiere a cualquier proceso por el cual una hebra de ácido nucleico liga una hebra complementaria a través de apareamiento base.
El término "transíección" se refiere a la introducción de ADN ajeno en células eucarióticas. La transfección puede lograrse con una variedad de medios conocidos en la téenica incluyendo co-precipitación de DNA-fosfato de calcio, transfección mediada de DEAE-dextrano, transfección mediada por polibreno, electroporación, microinyección, fusión de liposoma, lipofección, fusión de protoplastos, infección retroviral y biolística.
Como se emplea aquí, el término "bi-funcional" se refiere a un shRNA que tiene dos rutas de acción mecanísticas, la de siRNA y la de miRNA. El término shRNA "tradicional" se refiere a un RNA derivado de transcripción de DNA que actúa por el mecanismo de acción siRNA. El término shRNA "doble" se refiere a dos shRNAs, cada uno que actúa contra la expresión de dos diferentes genes pero en el modo siRNA "tradicional".
Como se emplea aquí, el término "liposoma" se refiere a una estructura cerrada compuesta por bicapas de lípidos que circundan un espacio acuoso interno. El término "policatión" como se emplea aquí, denota un material que tiene múltiples porciones catiónicas tales como radicales de amonio cuaternario, la misma molécula se incluyen las bases libres así como sus sales farmacéuticas aceptables.
De acuerdo con esto, los shRNAs bifuncionales pueden comprender shRNAs diseñados para entrar en e interactuar tanto con RISC dependiente de disociación como RISC independiente de disociación. Un nivel superior de "silenciamiento" génico se logra utilizando estos shRNAs bifuncionales en comparación con otros métodos y composiciones de RNAi actualmente disponibles, incluyendo siRNAs y shRNAs convencionales (es decir, construcciones shRNA diseñadas para entrar al RISC dependiente de disociación o RISC independiente de disociación, pero no ambos).
Como se emplea aquí, "silenciamiento" génico se refiere a inhibición de expresión cuantitativa efectiva y durable. Éste "silenciamiento" génico puede ser manifestado y/o aparente en la supresión de traducción de mRNA gen objetivo, incrementada apoptosis de células objetivo y/o exterminio celular.
Como se emplea aquí, el "gen objetivo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico en una célula, en donde la expresión de la secuencia puede ser modulada en forma específica y efectiva utilizando el shRNA bifuncional. En ciertas modalidades, el gen objetivo puede estar implicado en el crecimiento (proliferación), mantenimiento para supervivencia y/o comportamiento migratorio (metastásico) del cáncer de un individuo. La invención proporciona sin embargo que el gen objetivo puede estar implicado en cualquier otra condición médica o enfermedad, y no se limita a genes implicados en cáncer. Por ejemplo, el gen diana puede representar cualquier secuencia que un investigador o clínico desea silenciar (es decir reducir el nivel de expresión de este gen objetivo). La secuencia de vector puede comprender un promotor, que se enlaza operativamente (o conecta) en forma directa o indirecta a una secuencia que codifica los shRNAs bifuncionales. Estos promotores pueden ser seleccionados con base en la célula huésped y el efecto buscado. Ejemplos no limitantes de promotores convenientes incluyen promotores constitutivos e inducibles tales como promotores basados en polimerasa RNA inducible II (pol II). Ejemplos no limitantes de promotores convenientes además incluyen el promotor inducible o reprecible con tetracielina, promotores basados en RNA polimerasa I o III, en los promotores virales dependientes de pol II tales como promotor CMV-IE y los promotores pol III U6 y H1. El promotor T7 bacteriófago también puede emplearse (en cuyo caso se apreciará que la polimerasa T7 también debe estar presente).
La invención no deberá restringirse al uso de cualquier promotor sencillo, en especial ya que la invención puede comprender dos o más shRNAs bifuncionales (es decir, una combinación de efectores), incluyendo pero no limitada a incorporar singletes de shRNA. Cada promotor incorporado puede controlar uno o cualquier combinación de componentes singletes shRNA.
En ciertas modalidades, el promotor puede ser preferencialmente activo en las células dirigidas o diana, por ejemplo puede ser conveniente expresar preferencialmente las moléculas de shRNA bifuncional en células de tumor utilizando un promotor específico de células de tumor. La introducción de estas construcciones en células huésped puede ser efectuada bajo condiciones con lo que las dos o más moléculas de RNA que están contenidas dentro de la transcripción de precursor shRNA bifuncional, inicialmente residen dentro de una transcripción primaria sencilla, tal que las moléculas RNA separadas (cada una que comprende su propia estructura de tronco-bucle) se cortan subsecuentemente de esta transcripción de precursor con un ribonucleasa endógena. La invención además proporciona que las secuencias donadora y aceptora de corte puedan ser colocadas estratégicamente dentro de la secuencia de transcripción primaria para promover procesamiento nuclear mediado splicesome??espliceosoma. Los shRNAs maduros resultantes pueden entonces inducir degradación y/o represión de traducción de transcripciones de mRNA de gen diana producidas en la célula. En forma alterna, cada estructura de tronco-bucle precursora puede ser producida como parte de una transcripción separada en cuyo caso cada secuencia que codifica y shRNA- de preferencia incluirá sus propias secuencias terminadoras de transcripción y promotoras. Adicionalmente, la transcripción precursora shRNA bifuncional puede residir dentro de una sola transcripción primaria que, opcionalmente además comprende una o más secuencias mRNA que codifican una o más proteínas de mamífero funcionales. Por ejemplo, la una o más secuencias de mRNA puede codificar ciertas proteínas que se conoce que refuerzan al sistema inmune del paciente, o de otra manera proporcionan algún efecto preventivo y/o terapéutico que operan en paralelo con el shRNA bifuncional.
Las estructuras de tronco-bucle de las moléculas shRNA aquí descritas pueden ser de aproximadamente 40 a 100 nucleótidos de largo o de preferencia aproximadamente 50 a 75 nucleótidos de largo. La región de tronco puede ser de aproximadamente 19-45 nucleótidos de longitud (o más), o más preferiblemente de 20-30 nucleótidos de longitud aproximadamente. El tronco?? puede comprender un dúplex perfectamente complementario (pero para cualquier 3'-cola), sin embargo pueden estar presentes bucles interiores o abultamientos y aún se prefieren, en cualquier brazo del tronco. El número de estos abultamientos y bucles interiores asimétricos de preferencia son pocos en número (por ejemplo, 1, 2 o 3) y son de aproximadamente 3 nucleótidos o menos de tamaño. La porción de bucles terminal puede comprender aproximadamente 4 o más nucleótidos, pero de preferencia no mayor a aproximadamente 25. En forma más particular, la porción de bucles de preferencia será de 6-15 nucleótidos en tamaño.
Como se describe aquí, las regiones tronco de shRNAs bifuncionales comprenden hebras pasajeras y hebras guía, con lo que las hebras guía contienen secuencias complementarias a la transcripción mRNA diana codificada por el o los genes diana. De preferencia, el contenido de G-C y el apareamiento de hebra guía y hebra pasajera se diseñan cuidadosamente para actividad de desembobinado de hebra termodinámicamente favorable con o sin disociación de endonucleasa. Además, la especificidad de la hebra guía de preferencia se confirma por una búsqueda BLAST (www.ncbi.nim.nih.qov/BLAST).
El nivel de expresión de múltiples genes diana puede ser modulado utilizando los métodos y shRNAs bifuncionales aquí descritos. Por ejemplo, la invención proporciona que en un primer juego de shRNAs bifuncionales puede ser diseñado para incluir una secuencia (una hebra guía) que se diseña para reducir el nivel de expresión de un primer gen diana, con lo que un segundo juego de shRNAs bifuncionales puede diseñarse para incluir una secuencia (una hebra guía) que se diseña para reducir el nivel de expresión de un segundo gen diana. Los diferentes juegos de shRNAs bifuncionales pueden ser expresados y residen dentro de las mismas o separadas transcripciones preliminares. En ciertas modalidades, este enfoque múltiple, es decir el uso de los shRNAs bifuncionales aquí descritos para modular el nivel de expresión de dos o más genes diana puede tener un efecto terapéutico mejorado en un paciente. Por ejemplo, si un paciente se le proporciona los shRNAs bifuncionales aquí descritos para tratar, evitar o mejorar los efectos de cáncer, puede ser conveniente proporcionar al paciente con dos o más tipos de shRNAs bifuncionales, que se diseñan para reducir el nivel de expresión de múltiples genes implicados en el cáncer del paciente.
En ciertas modalidades, la invención además proporciona que las secuencias shRNA bifuncionales pueden comprender secuencias tronco de miRNAs de origen natural (por ejemplo, miR-30, C. elegans let-7 y/o lin-4). Mientras que la presencia de un bucle miR-30, por ejemplo, puede ser conveniente, la invención proporciona que pueden ser toleradas variaciones de esa estructura, en donde pueden emplearse bucles que son mayores a 72%, de preferencia mayores a 79%, más preferiblemente mayores a 86%, y más preferiblemente mayores que 93% idénticos a, por ejemplo, la secuencia miR-30 (determinado utilizando programas de computadora bien conocidos tales como el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis.53711)).
Las secuencias precursoras (o construcciones) que codifican los shRNAs bifuncionales pueden ser introducidas en células huésped utilizando cualquiera de una variedad de téenicas y vehículos de suministro bien conocidos en la especialidad. Por ejemplo, la infección con un vector viral que comprende uno o más construcciones, puede llevarse a cabo, en donde estos vectores virales de preferencia incluyen vectores retrovirales defectuosos en replicación, vectores adenovirales, vectores aleloasociados, vectores lentivirales o vectores de sarampión. Además, la transfección con un plásmido que comprende una o más construcciones puede ser empleada. Estos plásmidos pueden estar presentes como DNA desnudo, o pueden estar presentes en asociación por ejemplo con un liposoma (por ejemplo un inmunoliposoma). Aún más, el vehículo de suministro puede consistir de inmunolipoplexos, nanopartículas diana, liposomas diana, ciclodextrinas, nanopartículas, aptámeros, dendrímeros, quitosana o sus derivados pegilados. La naturaleza del vehículo de suministro puede variar dependiendo de la célula anfitriona diana.
Suministro ?h-vivo de las construcciones que codifican shRNA disfuncional puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de una variedad de téenicas, dependiendo del tejido diana. El suministro puede ser por ejemplo logrado por inyección directa, inhalación, inyección intravenosa u otros métodos físicos (incluyendo por micro-proyectiles para hacer diana en regiones visibles y accesibles del tejido) por ejemplo con DNA desnudo)). La administración además puede lograrse por agujas de jeringa, trocares, cánulas, catéteres, etc. según sea apropiado.
Además de los métodos que utilizan los shRNAs bifuncionales aquí descritos, se proporcionan en los shRNAs mismos. De acuerdo con esto, aspectos adicionales incluyen secuencias de ácido nucleico, que pueden comprender una sola secuencia contigua, múltiples secuencias distintas que en forma individual o colectiva codifican dos o más moléculas de RNA. De acuerdo con estas modalidades, una primer molécula de RNA comprenderá una secuencia de doble hebra que incluye una secuencia de hebra guía que es complementaria con una porción de una transcripción de mRNA codificada por un gen diana, en donde una segunda molécula de RNA comprende una segunda secuencia de doble hebra que incluye una segunda secuencia de hebra guía que es parcialmente complementaria con una porción de esa transcripción mRNA. En forma preferencial, la segunda secuencia de hebra guía de la segunda molécula RUA comprende una o más bases que están mal apareadas con una secuencia de ácido nucleico de la transcripción mRNA codificada por el gen diana. De acuerdo con adicionales aspectos, vectores de expresión se proporcionan que comprenden las secuencias de ácido nucleico y pueden emplearse para llevar a cabo los métodos y expresar los shRNAs bifuncionales aquí descritos.
Aún más, métodos para utilizar las secuencias de ácido nucleico y shRNAs bifuncionales se describen aquí para evitar, tratar y/o mejorar los efectos de una o más condiciones médicas incluyendo sin limitación diversos tipos de cáncer. Por ejemplo, la invención proporciona que los shRNAs bifuncionales aquí descritos puedan ser empleados para reducir el nivel de expresión de uno o más genes diana que están implicados en crecimiento, supervivencia y/o metástasis en células de cáncer. Por ejemplo, como se demuestra en los siguientes ejemplos, los shRNAs bifuncionales pueden ser empleados para reducir el nivel de expresión de ciertos genes diana que codifican proteínas estructurales o andamio que se ha encontrado sobreexpresan en células de cáncer. Ejemplos no limitantes de estos genes diana incluyen K-ras.
Interferencia de RNA: La introducción de RNAs es de interferencia pequeños de doble hebra artificiales (siRNAs) en células de plantas y animales puede inducir la degradación de moléculas de mRNA diana con una secuencia complementaria; el proceso se conoce como interferencia de RNA (RNAi) (Sharp 2001; Hutvagner and Zamore 2002; Zamore 2002) (ver Patente de los E.U.A. Número 6,506,559). RNAi ha emergido como una herramienta experimental útil con fuerte potencial para aplicaciones terapéuticas (Fire, Xu et al. 1998; Hammond, Bernstein et al . 2000; Elbashir, Harborth et al . 2001; Senzer, Rao efc al . 2009; Wang Z 2011). Sin embargo, en células de mamífero, la inducción de RNAi utilizando shRNAs requiere la transfección de oligonucleótidos RNA, que puede ser ineficiente con la duración de silenciado efectivo limitado por el tiempo de desarmado de vehículo y la vida media biológica de siRNA. A pesar de estas limitaciones, en la publicación de resultados recientes primeros de un estudio de fase clínica I, Davis y colegas han demostrado en forma convincente que el silenciado específico de diana y la disociación específica de sitio con el suministro sistémico de un siRNA basado en ciclodextrina decorado con transferina, pegilado que hace blanco a la subunidad M2 de ribonucleótido reductasa (RRM2) (CALAA-01) (Davis, Zuckerman et al . 2010). En tres pacientes reportados con melanoma accesible a biopsia quienes fueron tratados de acuerdo con el estudio de Fase I escalado en dosis, recibieron 18, 24, o 30 mg/m2 de CALAA-01 por infusión intravenosa los días 1, 3, 8, y 10 de un ciclo de 21 días. Biopsias voluntarias se realizaron después de la dosis final del ciclo 1 en cada uno y compararon con el tumor archivado, y a 1 mes posterior al ciclo 1 (antes de inicio del ciclo 2) y el día de dosis final del ciclo 2 en el paciente tratado con 30 mg/m2. La reducción de RRM2 mRNA se confirmó por qRT-PCR comparando muestras de tejidos post- y pre- ciclo 2 en 30 mg/m2. En el mismo paciente, inmunohistoquímica y transferencia Western pre- y post- ciclo 1 mostraron una primer reducción cinco veces en proteína MMR2. Soportando el mecanismo de acción propuesto, 5'- RLM-RACE (amplificación rápida mediada por 5 RNA-ligasa de extremos de DNA complementarios) confirman el sitio de disociación pronosticado. Esta primera demostración en humanos de entradas de células de tumor diana (utilizando microscopía electrónica de transmisión) y mRNA y reducción de expresión de proteína junto con disociación de RNA específica de sitio pronosticada después de suministro sistémico lograron ímpetu agregado a aplicaciones de traducción de RNAi. siRNA requiere modificación química para incrementar la estabilidad en suero, captación celular y duración de acción. En forma alterna, siRNA puede construirse como un RNA de horquilla corta (shRNA). shRNA consiste de una estructura de tronco-bucle que puede transcribirse en células de promotor RNA polimerasa III (o, menos frecuentemente empleado, RNA polimerasa II) en una construcción de plásmido (Miyagishi and Taira 2002; Yu, DeRuiter et al. 2002). Expresión constitutiva de shRNA de un plásmido independientemente del cromosoma proporciona una ventaja sobre siRNA sintético. Las unidades de expresión de shRNA pueden ser incorporadas en una variedad de plásmidos y vectores virales para suministro intracelular e importación nuclear. Además, expresión de shRNA basada en vector también puede ser regulada o inducida (Gossen and Bujard 1992; Gupta, Schoer et al . 2004; Dickins, Hemann et al . 2005). shRNAs, en oposición a siRNAs sintéticos, se sintetizan en el núcleo de las células, después procesan y transportan al citoplasma para incorporarse en el complejo de silenciado inducido por RNA (RISC) para actividad (Cullen 2005). Para ser efectivo, shRNA debe diseñarse para utilizar la maquinaria de biogénesis de microRNA celular endógena. shRNA bifuncional: Como se describió anteriormente, la interferencia de RNA (RNAi) es un proceso regulatorio celular natural capaz de inhibir mecanismos de transcripción, post-transcripción y traducción de esta manera modulando la expresión de genes. Utilizando un andamio miR30, los presentes inventores han desarrollado una estrategia de RNAi "bifuncional" que demuestra un silenciado más efectivo de expresión de gen diana al inducir de manera concurrente la expresión de traducción y secuestrado [mediado por GW182-] en el cuerpo de procesamiento o p-body (como un depósito de reclusión o promover desencapuchado, desadenilación y degradación de mRNA) (independiente de disociación) así como disociación de mRNA post-transcripción de mRNA (dependiente de disociación) (Rao D 2010).
Los presentes inventores han desarrollado una teenología de interferencia de RNA (RNAi) (shRNA) shRNAi bifuncional (bi-shRNAi). Bi-shRNAi permite que Argonauta endonucleasa y no endonucleasa programado (Ago) que contiene RISC (complejos de silenciado inducidos por RNA) carga para efectuar disociación de mRNA simultánea, degradación, y reparación de traducción resultando en su primer potencia y duración aún mayor que otros mediadores RNAi. Para explorar el potencial de bi-shRNAi en silenciamiento génico selectivo de mutante KRAS, se estableció un sistema de ensayo reportero luciferasa dual in vitro para comparar sistemáticamente la actividad de silenciamiento génico del alelo mutante y del alelo tipo silvestre en el mismo ambiente de ensayo. La presente invención incluye el desarrollo de agentes terapéuticos específicos para G12D, G12V, G12R y G12C para el tratamiento de por ejemplo de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC).
De una serie de construcciones de vector de expresión bi-shRNA que hacer blanco de G12D con una sola mutación nucleótido en cada posición de la hebra guía, se encontró que la actividad de silenciamiento génico más discriminante para el alelo mutante producida al colocar un nucleótido mutante en posición 2-4. Al examinar el efecto de silenciamiento génico de malos apareamientos adicionales en otras posiciones de la hebra guía, se determinó que el proceso fue específico de secuencia. Construcciones similares se hicieron para mutaciones G12V, G12R y G12C y son efectivas en el silenciamiento génico de sus alelos mutantes diana respectivos. Construcciones específicas de G12R reacciona en forma cruzada con mutantes G12C.
Las construcciones de la presente invención se compararon con vector de control en silenciamiento génico KRAS utilizando células HEK-293 (wt/wt), células PANC-1 (wt/alelo G12D) y células MiaPaCa2 (wt/alelo G12C). Los vectores de expresión bi-shRNA selectivos de G12D y G12C no reducen la expresión de KRAS en HEK-293 en contraste con reducción de expresión KRAS en célula PANC-1 y célula MiaPaCa2, respectivamente. Se encontró que, por ejemplo una sola construcción de expresión con unidades bi-shRNA multiméricas capaces de silenciamiento de G12D, G12V, G12R y G12C va a probarse para efectividad y especificidad in vitro e in vivo.
El oncogén KRAS (Kirsten-ras) se muta en una proporción significante de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), cánceres colorectal y pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) (Downward J, Nat Rev Cáncer.2003;3:11-22.). En la mayoría de pacientes PDAC (70-90%) que portan mutaciones KRAS, la proporción de supervivencia a cinco años es menor a 5% (Saif MW et al . World J Gastroenterol.2007;13;4423-4430). KRAS es un miembro de la familia de proteína de enlace guanina nucleótido y es un componente integral de múltiples rutas de señalización intracelular, incluyendo receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR). La abrumadora mayoría de mutaciones en KRAS son mutaciones somáticas de un solo nucleótido que resultan en sustituciones de un solo aminoácido en los codones 12 o 13. Las mutaciones KRAS G12D, G12V, G12R y G12C comprenden > 90% de mutaciones KRAS que se encuentran en pacientes PADC (COSMIC Database, www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Las mutaciones KRAS esencialmente resultan en KRAS activo constitutivo y señalización corriente abajo no regulada (Schubbert S, et al. Nat Rev Cáncer.2007; 7: 295-308). Además, agentes dirigidos tales como el anticuerpo Cetuximab (en cáncer colorectal) y el inhibidor de molécula pequeña vemurafenib (en melanoma mutante BRAF), desempeñan deficientemente en pacientes con mutaciones KRAS (Karapetis CS, et al. N Engl J Med 2008; 259 (17): 1757-1765). Consecuentemente una estrategia terapéutica de cáncer efectiva requiere selectividad de mutación KRAS probando la funcionalidad de tipo silvestre. Los presentes inventores recientemente han desarrollado una teenología de interferencia de RNA shRNA bifuncional novedosa (bi-shRNAi). Bi-shRNAi permite que la proteína Argonauta de endonucleasa no-endonucleasa programada (Ago) que contiene RISC (complejos de silenciado inducidos por RNA) carga para efectuar simultáneamente disociación, degradación y represión de traducción de mRNA resultando en mayor potencia y duración excesivamente mayor que otros mediadores RNAi. A fin de explorar el potencial de bi-shRNAi en silenciamiento génico selectivo mutante en KRAS, un sistema de ensayo reportero luciferasa dual in vitro se estableció para comparar sistemáticamente la actividad de silenciamiento génico del alelo mutante el alelo tipo silvestre en el mismo ambiente de ensayo. La meta de este proyecto es desarrollar un agente terapéutico sencillo que hace blanco específicamente en alelos mutantes G12D, G12V, G12R y G12C para el tratamiento de PDAC. siRNA distingue entre genes que difieren por un solo nucleótido para silenciamiento génico específico alélico, se ha analizado sistemáticamente (Ref. 1-4). El silenciamiento génico específico de alelo mutante se ha demostrado in vitro con el sistema de modelo para enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson (Ref.10-13). El silenciado del gen específico alélico en mutaciones KRAS se ha reportado para mutación KRAS G12C, G12D o G12V sencilla (Ref.5-9). No se ha reportado intento para lograr silenciamiento génico mutante KRAS múltiple con un solo agente. La presente invención incluye un enfoque sistemático para descubrir las combinaciones del silenciamiento génico bi-shRNAi más efectivo para los cuatro mutantes KRAS clave de PDAC.
(SEQ ID NO: 1) G12D, posición 2. Con subraya son las secuencias de estructura principal miR-30a.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGTTGGAGCTGATTAGTGAAGCCACAGATGT AATCAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGGAAGAGATGATTAGTGAAGCCACAGATGTAATCAGCT CCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 2) G12D, posición 3. With underline are miR-30a backbone sequences.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTGATGTAGTGAAGCCACAGATGT ACATCAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTCTTAGCTAATGTAGTGAAGCCACAGATGTACATCAGC TCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 3) G12D, posición 4. With underline are miR-30a backbone sequences.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTGGAGCTGATGGTAGTGAAGCCACAGATGT ACCATCAGCTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTACTGCTAATGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCATCAG CTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 4) G12D, posición 5. With underline are miR-30a backbone sequences.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGGTAGTTGGAGCTGATGGCTAGTGAAGCCACAGATGT AGCCATCAGCTCCAACTACCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCGGTAGTTGTCTCTGATAGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCATCA GCTCCAACTACCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 5) G12D, posición 6. With underline are miR-30a backbone sequences.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGTGAAGCCACAGATGT ACGCCATCAGCTCCAACTACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGTGAAGCCACAGATGTACGCCATC AGCTCCAACTACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 6) G12D, posición 7. With underline are miR-30a backbone sequences.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTTGGAGCTGATGGCGTTAGTGAAGCCACAGATGT AACGCCATCAGCTCCAACTAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTAGTTGGATGAGATGACGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACGCCAT CAGCTCCAACTAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 7) G12D, posición 8. With underline are miR-30a backbone sequences.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCAGTTGGAGCTGATGGCGTATAGTGAAGCCACAGATGT ATACGCCATCAGCTCCAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCAGTTGGAGACTATGGAGTATAGTGAAGCCACAGATGTATACGCCA TCAGCTCCAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 8) G12D, posición 9.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGGAGCTGATGGCGTAGTAGTGAAGCCACAGATGT ACTACGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCGTTGAAGCACGTGGTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCC ATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 9) G12D, posición 10. TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTGATGGCGTAGGTAGTGAAGCCACAGATGT ACCTACGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTATAGGTCTAGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGC CATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 10) G12D, posición 11.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGATGGCGTAGGCTAGTGAAGCCACAGATGT AGCCTACGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGTATGCGTTCGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACG CCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 11) G12D, posición 9, mod 4.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGGAGCTGATGGCGTAGTAGTGAAGCCACAGATGT ACTATGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCGTTGAAGCACGTGGTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTATGCC ATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 12) G12D, posición 10, mod 5.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTGATGGCGTAGGTAGTGAAGCCACAGATGT ACCTATGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTATAGGTCTAGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCTATGC CATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 13) G12D, POSICIÓN 11, MOD 6.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGATGGCGTAGGCTAGTGAAGCCACAGATGT AGCCTATGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGTATGCGTTCGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTATG CCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 14) G12D, POSICIÓN 9, MOD 10.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGGAGCTCATGGCGTAGTAGTGAAGCCACAGATGT ACTACGCCATGAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCGTTGAAGCACGTGGTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCC ATGAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 15) G12D, posición 10, mod 11.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCttggagctCAtggcgtaggTAGTGAAGCCACAGATGT ACCTACGCCATGAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCttggagctATAggTCtaggTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGC CATGAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 16) G12D, posición 11, mod 12.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTCATGGCGTAGGCTAGTGAAGCCACAGATGT AGCCTACGCCATGAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGTATGCGTTCGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACG CCATGAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 17) G12V, posición 3.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTGTTGTAGTGAAGCCACAGATGT ACAACAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTCTTAGCTATTGTAGTGAAGCCACAGATGTACAACAGC TCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 18) G12V, posición 4.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTGGAGCTGTTGGTAGTGAAGCCACAGATGT ACCAACAGCTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTACTGCTATTGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCAACAG CTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 19) G12R, posición 3.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGTTGGAGCTCGTTAGTGAAGCCACAGATGT AACGAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGACTGAGCTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACGAGCT CCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 20) G12R, posición 4.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTCGTGTAGTGAAGCCACAGATGT ACACGAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTACTAGCTAGTGTAGTGAAGCCACAGATGTACACGAGC TCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 21) G12C, posición 3.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGTTGGAGCTTGTTAGTGAAGCCACAGATGT AACAAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGACTGAGCTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACAAGCT CCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C (SEQ ID NO: 22) G12C, posición 4.
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTTGTGTAGTGAAGCCACAGATGT ACACAAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGC TGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTCTTAGCTTATGTAGTGAAGCCACAGATGTACACAAGC TCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGG C Esquemático de los Vectores de Prueba. Los primeros 17 aminoácidos de KRAS de tipo silvestre se insertaron en el extremo amino del gen Renilla luciferasa ( hRluc) del vector psiCHECK2 mientras que los primeros 17 aminoácidos de los mutantes KRAS G12D, G12V, G12R o G12C se insertaron en el extremo amino del gen luciferasa de Luciérnaga ( hluc+ ) en el mismo vector.
La inserción de Secuencias KRAS en el gen Renilla o el gen de Luciérnaga: Primeros 17 aminoácidos de secuencias de tipo silvestre KRAS humanas: ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGT (SEQ ID NO: 58) se insertó en las secuencias del gen Renilla de psiCHECK2 en el inicio de traducción ATG. Las secuencias de nucleótido en la región después de inserción de secuencias KRAS (WT) son como sigue (se subrayan las secuencias KRAS) : GCTAGCCACCATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGT GCTTCCAAGGTGTACGACCCCGAGCAACGCAAACGCATGATCACTGGGCCTCAGTGGTGGG CTCGCTGCAAGCAAATGAACGTGCTGGACTCCTTCATCAACTACTATGATTCCGAGAAGCA CGCCGAGGAGGCACGTCGTGCCTCA (SEQ ID NO:23).
Brevemente, la nomenclatura es como sigue: itálicas son secuencias de codificación de renilla o de luciérnaga, negritas subrayado en negro son secuencia KRAS insertada, negritas son triple codón para G12 y G13 y doble subrayas son sitios de restricción empleados para sub-clonación excepto aparecen en negro para Renilla.
Primeros 17 aminoácidos de secuencia mutante KRAS humana (G12D): ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGT (SEQ ID NO:24) se inserta en las secuencias de gen de Luciérnaga de psiCHECK2 en el inicio de traducción ATG. Las secuencias de nucleótido en la región después de inserción de las secuencias KRAS (mutante) son como sigue (se subrayan las secuencias KRAS): CACTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCGACCCG CTTAAAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGACTGAATATAAACTTGTG GTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCGATGCTAAGAACATTAAGAAGGGCCC TG CTCCCTTCTACCCTCTGGAGGATGG (SEQ ID NO:25).
Construcción de Vectores de Prueba: Los fragmentos de DNA con inserción apropiada se generaron con el proceso de síntesis de genes. Fragmentos de DNA sintético se insertaron en psiCHECK2 para generar vectores de prueba como se cita a continuación. Síntesis de genes y construcción de vector se realizaron bajo contrato por Epoch Life Sciences Inc. (Missouri City, TX). (pGBI70) psiCHECK2-KRAS-WT (GGTGGC): Digestión del compuesto de KRAS(WT) en hRluc con Nhel y DralII e inserción en los sitios Nhel y DralII de psiCHECK2 para formar psiCHECK2-KRAS-WT. (pGBI71) psiCHECK2-KRAS-WT/G12D (GATGGC): Digestión del compuesto de KRAS(G12D) en hluc+ con MluI y PspOMI e inserción en los sitios MluI y PspOMI de psiCHECK2-KRAS-WT para formar psiCHECk2-KRAS-WT/G12D. (pGBI72) psiCHECK2-KRAS-WT/G12V (GTTGGC): Digestión del compuesto de KRAS(G12D) en hluc+ con MluI y PspOMI e insertar en los sitios MluI y PspOMI de psiCHECK2-KRAS-WT para formar psiCHECK2-KRAS-WT/G12V. (pGBI73) psiCHECK2-KRAS-WT/G12R (CGTGGC): Digestión del compuesto de KRAS(G12D) en hluc+ con MluI y PspOMI e insertar en los sitios MluI y PspOMI de psiCHECK2-KRAS-WT para formar psiCHECK2-KRAS-WT/G12R. (pGBI74) psiCHECK2-KRAS-WT/G12C (TGTGGC): Digestión del compuesto de KRAS(G12D) en hluc+ con MluI y PspOMI e insertar en los sitios MluI y PspOMI de psiCHECK2-KRAS-WT para formar psiCHECK2-KRAS-WT/G12C.
Diseño y construcción de bi-shRNAi. Diseño de bi-shRNA se logró esencialmente como se publicó con anterioridad (Ref. 14-15). Cada unidad de expresión bi-shRNA se reunió por síntesis de genes e inserta en los sitios Sal I y Not I de los sitios de clonación múltiples del vector pUMVC3.
Transfección de células. La transfección de células se realizó ya sea por electroporación (Gene Pulser MX Cell, BIO-RAD) o por Lipofectamina LTX (Invitrogen). La condición de electroporación para células HEK-293 esencialmente sigue la condición preestablecida almacenada en el instrumento por el fabricante. La transfección con Lipofectamina LTX sigue la sugerencia recomendada por el fabricante y además optimizada al modular la concentración del DNA de alimentación y proporción de Lipofectamina. Método de transfección inversa se emplea para toda la transfección de Lipofectamina. La mayoría de las co-transfecciones se realiza con la concentración total optimizada de la proporción de DNA y Lipofectamina con el vector de prueba y el vector bi-shRNAi a una proporción 1 a 1. La proporción del vector de prueba al vector b-shRNAi se probó y optimizó por igual.
Ensayo dual de luciferasa: El ensayo dual de luciferasa se realiza utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Glo (Promega) y esencialmente siguiendo la instrucción que se proporciona por el fabricante. La medida de luminiscencia se lleva a cabo en formato de 96 pozos con Luminoskan Ascent Microplate Luminometer (Thermo Scientific). Esencialmente, células se transíectaron en placas de 96 pozos o revistieron en placas de 96 pozos posterior a transfección. Células transfectadas se ensayaron ya sea a 24 horas o 48 horas post-transfección.
Ensayo de inhibición de crecimiento celular: Ensayo de inhibición de crecimiento de células se llevó a cabo ya sea con el Reactivo de Ensayo de Viabilidad Celular Cell Titer-Blue o el Reactivo de Ensayo de Viabilidad Celular Cell Titer-Glo Luminescent (Promega) al seguir el procedimiento recomendado por el fabricante. Cada una de las líneas celulares empleadas al menos se optimizaron en tiempo de desarrollo de ensayo.
Silenciamiento génico KRAS estimado por inmuno transferencia Western: Las células se Usaron con amortiguador de lisis CelLytic-M (Sigma) y rasparon de la superficie del plato de cultivo, incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos en un agitador lento y centrifugaron brevemente. Una pequeña alícuota para estimación de concentración de proteína por Ensayo Coomassie Bradford Plus se tomó con BSA como estándar. El programa SoftMaxPro se empleó para calcular los valores y trazar la curva estándar. Cantidades iguales de proteína (usualmente 5-20 ug) se separaron en un sistema de electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% previamente ensamblado (PAGE) utilizando el sistema Mini-Proteína II Cell (Bio-Rad). Después de electroforesis, las proteínas separadas fueron electro-transferidas a una membrana PVDF con condición estándar. Membranas transferidas primero se bloquearon con amortiguador de bloqueo que contiene leche deshidratada sin grasa al 5% en DPBS-T durante la noche a 4o C. Después de dos cambios de amortiguador de lavado, las proteínas se etiquetaron primero con dilución determinada de anticuerpo primario (para KRAS y b-Actina, Santa Cruz Biotechnology) y después con anticuerpo secundario conjugado con HRP. Detección quimioluminiscente se realizó por reactivos ECL Plus Western Blotting Detection con el analizador de imagen quimioluminiscente automatizado G:BOX Chemi XT16 (Syngene, Frederick, MD). Membranas se desprendieron y volvieron a sondear con un anticuerpo diferente o proteína de mantenimiento tal como b-Actina.
Vectores de Prueba para Cada Alelo Mutante Retienen la Proporción de Expresión de Renilla a Luciérnaga. El foco era diseñar silenciamiento génico y específico que dirige bi-shRNA cuatro mutaciones KRAS que es más predominante en PDAC. Cuatro vectores de prueba se construyen para probar alelos mutantes G12D, G12V, G12R o G12C individualmente. Cada construcción de vector de prueba se examina para asegurar la inserción de las secuencias KRAS no afecta en forma diferencial la expresión o actividad de cualquier luciferasa de Luciérnaga (FF) o Renilla (RL). Vectores de prueba para mutaciones G12D, G12V, G12R y G12C todos retienen la proporción similar RL a FF como el vector psiCHECK2 precursor (Figura 2). El vector con soló secuencias KRAS wt insertado en luciferasa RL (pGBI70) muestra reducida proporción RL a FF indicando la actividad de luciferasa RL afectada por inserción (Datos no mostrados), la proporción RL a FF se retuvo en vectores de prueba que contienen mutante indican la inserción de secuencias mutante KRAS en actividad FF afectada por FF luciferasa similar a RL.
La Figura 1 muestra un esquemático de los Vectores de Prueba. Los primeros 17 aminoácidos de KRAS de tipo silvestre se insertan en el extremo amino del gen Renilla luciferasa (hRluc) del vector psiCHECK2 mientras que los primeros 17 aminoácidos de mutantes G12D, G12V, G12R o G12C KRAS se insertan en el extremo amino del gen luciferasa de Luciérnaga (hluc+) en el mismo vector.
Se encontró que los vectores de prueba por cada mutante retienen la proporción de expresión de Renilla a luciérnaga. La Figura 2 muestra una expresión de tipo silvestre y mutante de los vectores de prueba. Expresión de tipo silvestre (Wt) y mutante (Mu) de cada uno de los vectores de prueba se compara con el vector psiCHECK2 precursor utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Glo (Promega). La comparación de expresión Wt a Mu se estima por la proporción de expresión de Renilla (RL) a Luciérnaga (FF).
Para probar el sistema de ensayo, varias construcciones de expresión bishRNA se realizaron dirigidas a la mutación G12D y realizan el experimento de co-transfección con el vector de prueba que contiene las secuencias wt (RL) y las secuencias mutante G12D (FF). Siete construcciones bishRNA se probaron, cada una de las construcciones tiene el complemento de la secuencia de alelo mutante en diversas posiciones de la hebra guía. Cada una de las construcciones bishRNA se co-transfectan con el vector de prueba G12D y el ensayo dual de luciferasa se realiza a 48 horas post-transfección. Los datos recolectados pueden ser analizados ya sea por la proporción de tipo silvestre a mutante, como se ejemplifica en la Figura 3a, o por la unidad de luminiscencia relativa (RLU) de Luciérnaga (Figura 3b) o Renilla (Figura 3c). El luminómetro de microplacas muestrea señales de luminiscencia de una pequeña área en cada pozo sin multiplicar los factores de amplificación. Los triplicados de datos usualmente tienen muy pequeña desviación estándar y los experimentos son reproducibles de experimento a experimento. La proporción de tipo silvestre a mutante proporciona una vista rápida de cada una de las construcciones bishRNA en silenciamiento génico de tipo mutante contra silvestre. La proporción de tipo silvestre a mutante sobre el control de vector vacío (Figura 3a, carril c) indica ventaja para silenciamiento génico de mutante mientras que igual o por debajo del control no indica ventaja. Eficiencia de silenciamiento génico de cualquier alelo de tipo silvestre o mutante por cada construcción también puede ser comparada con el control de vector vacío. Cada una de las construcciones bishRNA muestra diferentes características en términos de eficiencias de silenciamiento génico mutante o tipo silvestre.
Se encontró que eficiencia de silenciamiento génico comparativa en mutante contra WT se estimó por Unidades de Luminiscencia Relativa o proporción (RLU) o Renilla (RL) a Luciérnaga (FF). La Figura 3A-3C: Demostración del Sistema de Ensayo. Al co-transíectar un vector de prueba con vectores de expresión shRNA bifuncionales (bi-shRNA) (86, 87, 88, 89, 90, 91 o 92), el silenciamiento génico preferencial de mutante contra tipo silvestre puede ser estimado rápidamente por la proporción FF a RL (Panel a). El silenciamiento génico de mutante o tipo silvestre además puede analizarse en forma individual al comparar RLU de FF (Panel b) o RL (Panel c) con el control de vector vacío (C).
A continuación, una eficiencia de silenciamiento génico comparativo se determina y se encontró que la eficiencia varía cuando se coloca secuencia mutante en diversas posiciones de la hebra guía de construcciones bi-shRNA. Cada construcción bishRNA muestra diferentes características en silenciamiento génico de alelo mutante y tipo silvestre como se ilustra en la Figura 3A-3C. Otras publicaciones han mostrado que las regiones centrales son importantes para especificidad alélica de RNAi mediada por siRNA. Para probar y comprender la especificidad de nuestra estrategia bifuncional, una serie de construcciones se realiza colocando el complemento de nucleótido mutado G12D y la posición 2 a 11 de la hebra guía y analizar sistemáticamente la especificidad y eficacia de cada construcción. Las posiciones 2 a 11 abarcan tanto la región de semilla como la región central. El colocar el nucleótido mutado en las posiciones 5 y 10 (Figura 4, P5 y PIO) no mostró silenciamiento génico ni de tipo silvestre o mutante, por otra parte, las posiciones 7, 8, 9 y 11 (Figura 4, P7, P8, P9 y Pll) son altamente efectivas en tanto en silenciamiento génico de tipo silvestre y mutante. Las posiciones 2, 3 y 4 (Figura 4, P2, P3 y P4) en la región semilla mostraron la mejor discriminación en silenciamiento génico de tipo silvestre y mutante. De esta manera, la región semilla particularmente las posiciones 3 y 4 son las más efectivas en especificidad de silenciamiento génico.
La Figura 4 muestra el efecto de posición de shRNAs bifuncionales de la presente invención. Construcciones bi-shRNA específicas para mutante G12D se comparan al colocar la secuencia nucleótido mutada sencilla en una de las primeras 11 posiciones de la hebra guía. Por ciento de silenciamiento génico para tipo silvestre (wt) y para mutante (mu) se estima para cada construcción. (n=3) Mal apareamientos adicionales se introducen en la hebra guía. Se encontró que introducir mal apareamientos adicionales en la hebra guía reduce significativamente la eficiencia de silenciamiento génico. Ohnishi y colaboradores reportaron el introducir mal apareamientos en la región semilla mejora el reconocimiento de mutante-alelo en la región central (1). Construcciones bishRNA con mal apareamiento en región de semilla adicional se realizaron para las construcciones de región central (nucleótido mutado en P9, PIO y Pll de la hebra guía). Construcciones bishRNA también se realizaron con yuxtaposición de mal apareamiento al nucleótido mutado para probar la potencia de silenciamiento génico de dos alelos mutantes con una construcción. Datos de co-transfección con el vector de prueba G12D muestran mal apareamiento de la región semilla reduce tanto la eficiencia de silenciamiento génico tipo silvestre como mutante (Figura 5, carril P9+P4 contra carril P9; carril pl0+p5 contra plO; carril pll+p6 contra pll) con sólo ligera mejora en el reconocimiento de mutante. Introducir yuxtaposición de mal apareamiento a nucleótido mutado reduce dramáticamente la eficiencia de silenciamiento génico tanto para tipo mutante como para silvestre (Figura 5, carril P9+P10 contra carril P9; carril P10+P11 contra carril P10; carril P11+P12 contra carril Pll).
La Figura 5 demuestra el efecto de introducir mal apareamientos en eficiencia de silenciamiento génico. Ohnishi y colaboradores reportaron introducir mal apareamientos en la región semilla mejora reconocimiento mutante en la región central (1). Construcciones G12D con nucleótido mutado en la región central (p9, plO y pll) se compararon con construcciones con mal apareamiento adicional ya sea en la región semilla o en la yuxtaposición al nucleótido mutado: tipo silvestre (wt) y mutante (mu). (n=3) Para ampliar el efecto posible y hacer blanco de shRNA bifuncional, un shRNA se dirige a una posición específica de la diana tal que puedan ser posibles efectos de superposición. Se encontró que las construcciones con nucleótido mutado Ya Sea en las Posiciones 3 o 4 también es selectivo para G12V, G12R y G12C. Más construcciones con nucleótido mutado ya sea en la posición 3 o 4 para mutaciones G12V, G12R y G12C se probaron junto con construcciones G12D contra todos los cuatro vectores de prueba. La construcción de la posición 3 para G12D es más efectiva que la construcción de la posición 4 (Figura 6, carriles G12D) con poca o ninguna actividad hacia otros mutantes (Figura 6, carriles G12D). La construcción de la posición 4 para G12V, por otra parte, es más efectiva que la construcción de la posición 3 (Figura 6, carriles G12V) y tiene poca o ninguna actividad hacia otros mutantes (Figura 6, carriles G12V). Las construcciones G12R no son tan selectivas, con una actividad ligeramente mejor en mutante hacia G12D, G12R y G12C más bien uniforme (Figura 6, carriles G12R). Para G12C, la posición 3 es mejor que la posición 4 con poca o ninguna actividad hacia otros mutantes (Figura 6, carriles G12C). Las eficiencias de silenciamiento génico para tipo silvestre o mutante para cada construcción se resumen en la tabla 1.
La Figura 6 demuestra el silenciamiento génico selectivo en las Construcciones de Posición 3 o 4 para G12D, G12V, G12R y G12C. La ventaja de silenciamiento génico mutante se comparó para todas las construcciones de posición 3 o 4 bi-shRNAi para G12D, G12V, G12R y G12C contra todos los vectores de prueba específicos para cada uno de los cuatro mutantes. La proporción de mutante a tipo silvestre sobre la muestra de control de vector vacío (muestra C, la barra transversal) indica fuerte ventaja de silenciamiento génico en alelo mutante específico.
La Tabla 1 muestra la eficiencia de silenciamiento génico de alelo tipo silvestre y mutante de construcciones bi-shRNA clave. Tabla 1 resumen secuencia diana, secuencias de hebra guía, para construcciones bi-shRNA clave y cada eficiencia de silenciamiento génico respectivo en alelos mutantes o de tipo silvestre, SEQ ID NO.: 26-52, respectivamente.
Tabla 1 es un Resumen de Efecto de Posición en Silenciamiento Génico SEQ ID NO.: 26-52. i : : i i : : I i : A continuación, las construcciones se probaron por efectividad en células de cáncer. Las construcciones de prueba con la línea celular de tipo silvestre y líneas celulares de cáncer pancreático KRAS con alelos mutantes se probaron. No hay anticuerpo disponible para reconocer en forma diferencial proteína KRAS mutante contra proteína KRAS de tipo silvestre, tres diferentes líneas celulares se emplearon con tres diferentes genotipos para probar silenciamiento génico diferencial de cada una de las construcciones. HEK-293 es la línea de células de riñón embriónico humano con KRAS (KRAS+/+) de tipo silvestre, PANC1 es línea de células de cáncer pancreático humano con KRAS heterocigótico (KRAS+/G12D) y MiaPaCa2 es línea celular de cáncer pancreático humano con KRAS heterocigótico (KRAS+/G12C). Las construcciones de las posiciones 2, 3 y 4 fueron capaces de silenciamiento génico de expresión KRAS con eficiencia variada (Figura 7A). Silenciamiento génico más bien no es eficiente, 65 a 70% de control no transfectado puede deberse a eficiencia de transfección y la presencia de KRAS y tipo silvestre. La eficiencia de silenciamiento génico además se compara para las construcciones de posición 3 y/o 4 para mutantes K12D y K12C con tres diferentes líneas celulares. Las construcciones G12D no parecen silenciar KRAS en células HEK293 (Figura 7B), más efectivas en silenciar KRAS en células PANC1 (Figura 7B) y baja actividad de silenciamiento génico KRAS en células MiaPaCa2 (Figura 7B). Por otra parte, las construcciones G12C no fueron efectivas en silenciamiento génico KRAS tanto en células HEK293 (Figura 7C) como células PANC1 (Figura 7C), pero efectivas en silenciamiento génico KRAS en células MiaPaCa2 (Figura 7C).
Las Figuras 7A a 7C muestran un análisis de inmunotransferencia Western de expresión KRAS en células transfectadas bi-shRNA. HEK-293 (WT), PANC-1 (alelo G12D) y MiaPaCa (alelo G12C) se transíectaron con diversas construcciones bi-shRNA dirigidas a mutante. Extractos celulares recolectados 48 horas posteriores a transfección se analizaron en forma semicuantitativa con inmunotransferencias Western. (a) Las células PANC-1 transfectadas con construcciones que hacen diana en G12D. La Figura 7B compara construcciones G12D en silenciamiento génico KRAS con 3 líneas celulares. La Figura 7C compara construcciones G12C en silenciamiento génico KRAS con 3 líneas celulares.
La Tabla 2 resume el requerimiento de dosis entre estándar antisentido, siRNA estándar, shRNA estándar y el shRNA bifuncional de la presente invención.
MTD= dosis máxima tolerada ¨pronosticado con base en estudios en animales De una serie de construcciones de vector de expresión bi-shRNA que hacen diana en G12D con una sola mutación de nucleótido en cada posición de la hebra guía, se encontró que la actividad de silenciamiento génico más discriminante para el alelo mutante producido al colocar un nucleótido mutante en la posición 2-4. Al examinar el efecto de silenciamiento génico de mal apareamientos adicionales en otras posiciones de la hebra guía, se determinó que el proceso fue específico de secuencia.
El análisis sistemático del silenciamiento génico shRNA bifuncional de la presente invención coloca las posiciones discriminantes más efectivas en las posiciones 2-4 (la región semilla) de la hebra guía, en contraste con mayoría de RNAi basados en siRNA colocando la posición discriminante de nucleótido sencillo más efectiva en la región central de la hebra guía.
Construcciones similares se realizaron para mutaciones G12V, G12R y G12C y son efectivas en el silenciamiento génico de sus alelos mutantes diana respectivos. Construcciones específicas de G12R reaccionan en forma cruzada con mutantes G12C y todas se encontraron funcionales.
Construcciones selectas además se comparan con vector de control de silenciamiento génico KRAS utilizando células HEK-293 de tipo silvestre (wt), células PANC-1 (alelo G12D) y células MiaPaca2 (alelo G12C). Los vectores de expresión bi-shRNA selectivos G12D y G12C no reducen la expresión KRAS en células HEK-293 en contraste con reducción de la expresión KRAS en células PANC-1 y células MiaPaca2, respectivamente.
Utilizando las presentes enseñanzas además se prueba que pueden realizarse construcciones y utilizarse con líneas celulares que expresan mutante KRAS apropiado a nivel de silenciamiento génico de proteína en nivel de transducción de señal para prueba adicional de especificidad de silenciamiento génico.
Una sola construcción de expresión con unidades bi-shRNA multiméricas de silenciamiento génico de G12D, G12V, G12R y G12C se va a probar para efectividad y especificidad in vitro e in vivo.
La construcción de bi-shRNA multiméricos con triple capacidad de silenciamiento génico en un vector utilizando secuencias de enjambre miR-17-92. La Figura 8 muestra el enjambre miR-17-92 que tiene 6 miRNAs en tándem.
La secuencia en la región se obtiene de gi | 47076873 | dbj | AB176708.1 | Homo sapiens C13orf25 v_2 mRNA, cds completos, micro RNA miR-91-precursor-13, microRNA miR-91, microRNA miR-17, micro RNA miR-18-Precursor-13, microRNA miR-18, microRNA miR-19a-precursor-13, microRNA miR-19a, microRNA miR-20, microRNA miR-19b-precursor-13, microRNA miR-19b, microRNA miR-92-Precursor-13, microRNA miR-92. TTTCTTCCCCATTAGGGATTATGCTGAATTTGTATGGTTTATAGTTGTTAGAGTTTGAGGT GTTAATTCT AATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCACCTTGTAAAACTGAAGATTG TGACCAGTC AGAATAATGTCAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTGATATGTGCATCTACTGCAGTGAAGGC ACTTGTAGC ATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATG TTGAGTGCT TTrTGTTCTAAGGTGCATCTAGTGCAGATAGTGAAGTAGATTAGCATCTACTGCCCTAAGT GCTCCTTCT GGCATAAGAAGTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAA TAGTTTTTG TrreCAGTCCTCTGTTAGTTTTGCATAGTTGCACTACAAGAAGAATGTAGTTGTGCAAATC TATGCAAAA CTGATGGTGGCCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTAT TGTGTCGAT GTAGAATCTGCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGTAGCACTAAAGTGCTTAT!AGTGC AGGTAGTGT TTAGTTATCTACTGCATTATGAGCACTTAAAGTACTGCTAGCTGTAGAflCrCCAGCTTCGG CCTGTCGCC CAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGTTAGTTTTGCAGGTTTGCATCCAG CTGTGTGAT ATTCTGCTGTGCAAATCCATGCAAAACTGACTGTGGTAGTGAAAAGrCTGTAGAAAAGTAA GGGAAACTC AAACCCCTTTCTACACAGGTTGGGATCGGTTGCAATGCTGTGTTTCTGTATGGTATTGCAC TTGTCCCGG CCTGTTGAGTTTGGTGGGGATTGTGACCAGAAGATTTTGAAAATTAAATATTACTGAAGAT TTCGACTTC CACTGTTAAATGTACAAGATACATGAAATATTAAAGAAAATGTGTAACTTTTTGTGTAAAT ACATCTTGT SEQ ID NO.:57 Las regiones con negritas y subrayadas son secuencias de micro RNA y las regiones en itálicas son secuencias de espacio entre cada cistrón micro RNA.
Los juegos de triples construcciones multiméricas bi-shRNA se realizaron para probar el silenciamiento génico en tres diferentes mutaciones KRAS. El primer juego mantiene una estructura tronco-bucle estructura principal miR-30a y utilizando las secuencias de espacio de enjambre miR-17-92. El segundo juego es utilizar la estructura principal de estructura tronco-bucle nativa de enjambre miR-17-92 y sustituir secuencias miRNA con secuencias diana bi-shRNA. Dos combinaciones de triple se construyeron para cada juego, pGBI-129 y pGBI-130 están con una estructura principal miR30a en secuencias de espacio miR-17-92, mientras que pGBI-131 y pGBI-132 están con la estructura principal miR-17-92 y secuencias de espacio. El orden de bi-shRNA son G12D-G12V-G12R para pGBI-129 y pGBI-131. El orden de bi-shRNA son G12C-G12D-G12R para pGBI-130 y pGBI-132. Las secuencias se muestran a continuación.
Utilizando la secuencia de espacio miR-17-92 con la estructura principal miR-30a, las letras con negritas son secuencias de estructura principal miR30a, las letras en "Courier New" son secuencias de espacio miR-17-92, las letras subrayadas con itálicas y negritas son secuencias diana KRAS, las secuencias con minúsculas en cada extremo son secuencias de sitio de restricción. pGBI-129 (G12D-G12V-G12R): cgtcgtcgacTTTCTTCCCCATTAGGGATTATGCTGAATTTGTATGGTTTATAGTTGTTAG AGTTTGAGGTGTTAATTCTAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCAC CTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCATCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGrAGTTGGA GCrGATGTAGTGAAGCCACAGATGTACArCAGC!TCCAACrACCACGTTGCCTACTGCCTCG GAAGCAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGT GCTTTTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGrAGrCrrAGCTAArGTAGTGAAGCCACAGATGT ACATCAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATT TTCATTGGCTAAGAAGTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGT TTTAATAGTTTTTGTTTTCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCrGGTAGTTGGAGCTGTTGGT AGTGAAGCCACAGATGTACCAACAGCrCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTAT TTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCT GCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGrrACrGCrA rTGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCAACAGCrCCAACrACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAA GCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCG CCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAATCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGrAGrrGG AGCrCGTGTAGTGAAGCCACAGATGTACACGAGCrCCAACrACCACGTTGCCTACTGCCTC GGAAGCAAAAGTCTGTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCGCTGTTGAAGTGAGCGCCGr GGrAGrACTAGCrAGrGTAGTGAAGCCACAGATGTACACGAGCrCCAACTACCACGTTGCC TACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGCTGGGGATTGTGACCAGA AGATTTTGAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCCACTGTTAAATGTACAAGATAC ATGAAATATTAAAGAAAATGTGTAACTTTTTGTGTAAATACATCTTGTgcggccgcggat (SEQ ID NO.:53) pGBI-130 (G12C-G12D-G12R): cgtcgtcgacTTTCTTCCCCATTAGGGATTATGCTGAATTTGTATGGTTTATAGTTGTTAG AGTTTGAGGTGTTAATTCTAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCAC CTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCATCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCrGTGGrAGrrGG AGCTTGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACAAGCTCCAACrACCACAGTTGCCTACTGCCTCG GAAGCAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGT GCTTTTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGACrGAGCrAGrTAGTGAAGCCACAGATGT AACAAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATT TTCATTGGCTAAGAAGTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGT TTTAATAGTTTTTGTTTTCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGrGGTAGTTGGAGCTGArGT AGTGAAGCCACAGATGTACArCAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTAT TTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCT GCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCG CCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAATCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCrGGrAGTrGGA GCrGTTGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCAACAgCTCCAACrACCAGTTGCCTACTGCCTC GGAAGCAAAAGTCTGTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCGCTGTTGAAGTGAGCGCCrg GrAgrrACrGCrArrggTAGTGAAGCCACAGATGTACCAACAgC1-CCAACrACCAgTTGCC TACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGCTGGGGATTGTGACCAGA AGATTTTGAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCCACTGTTAAATGTACAAGATAC ATGAAATATTAAAGAAAATGTGTAACTTTTTGTGTAAATACATCTTGTgcggccgcggat (SEQ ID NO.:54) Utilizando la estructura miR-17-92, las letras con negritas son secuencias diana KRAS reemplazando las secuencias diana miR-17-92. Las letras minúsculas en cada extremo son las secuencias de restricción de la inserción del sitio de enzima. pGBI-131 (G12D-G12V-G12R): cgtcgtcgacTTTCTTCCCCATTAGGGATTATGCTGAATTTGTATGGTTTATAGTTGTTAG AGTTTGAGGTGTTAATTCTAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCAC CTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTGTGGTAGTTGGAGCTGATGTGAT ATGTGCATCTCATCAGCTCCAACTACCACCATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAG TTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCGTGGTAGTCTTAGC TAATGTGAAGTAGATTAGCATCTCATCAGCTCCAACTACCACCATAAGAAGTTATGTATTC ATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAATAGTTTTTGTTTGCAGTCCTC TGTTTGGTAGTTGGAGCTGTTGGAGAAGAATGTAGTCCAACAGCTCCAACTACCATGGTGG CCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATG TAGAATCTGCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGTAGCACTTGGTAGTTACTGCTATT GGTGTTTAGTTATCTCCAACAGCTCCAACTACCATACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTC GGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGTTGTGGTAGTTGG AGCTCGTGTGTGTGATATTCTGCCACGAGCTCCAACTACCACCTGTGGTAGTGAAAAGTCT GTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCCTTTCTACACGTGGTAGTACTAGCTAGTGGTGTT TCTGTATGGCACGAGCTCCAACTACCACTGAGTTTGGTGGGGATTGTGACCAGAAGATTTT GAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCCACTGTTAAATGTACAAGATACATGAAAT ATTAAAGAAAATGTGTAACTTTTTGTGTAAATACATCTTGTgcggccgcggat (SEQ ID NO.:55) pGBI-132 (G12C-G12D-G12R): cgtcgtcgacTTTCTTCCCCATTAGGGATTATGCTGAATTTGTATGGTTTATAGTTGTTAG AGTTTGAGGTGTTAATTCTAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCAC CTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTTGTGGTAGTTGGAGCTTGTTGAT ATGTGCATCTACAAGCTCCAACTACCACACATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAG TTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCTGTGGTAGACTGAG CTAGTTGAAGTAGATTAGCATCTACAAGCTCCAACTACCACACATAAGAAGTTATGTATTC ATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAATAGTTTTTGTTTGCAGTCCTC TGTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGAGAAGAATGTAGTCATCAGCTCCAACTACCACTGGTGG CCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATG TAGAATCTGCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGTAGCACTGTGGTAGTCTTAGCTAA TGTGTTTAGTTATCTCATCAGCTCCAACTACCACTACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTC GGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGTTTGGTAGTTGGA GCTGTTGGTGTGTGATATTCTGCCCAACAGCTCCAACTACCACTGTGGTAGTGAAAAGTCT GTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCCTTTCTACACTGGTAGTTACTGCTATTGGGTGTT TCTGTATGGCCAACAGCTCCAACTACCATGAGTTTGGTGGGGATTGTGACCAGAAGATTTT GAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCCACTGTTAAATGTACAAGATACATGAAAT ATTAAAGAAAATGTGTAACTTTTTGTGTAAATACATCTTGTgcggccgcggat (SEQ ID NO.:56) Construcciones de múltiples insertos. Las secuencias de insertos mostradas anteriormente se sintetizaron en su totalidad por método de síntesis génica y clonaron en vector pUMVC3. En un ejemplo, construcciones triples primero se probaron con vectores de prueba reporteros para comparar eficiencia de silenciamiento génico con su contraparte singlete. La Figura 9 muestra que las construcciones triples pueden silenciar génicamente en forma efectiva el reportero G12D así como la construcción singlete (panel izquierdo superior, 8-llesima bar contra 2-3era bar). El pGBI-131 (panel de punta derecha, ioesima bar) puede silenciar G12V así como el singlete (quinta bar). El triple para G12R no desempeña silenciamiento génico así como el singlete (panel izquierdo inferior, 8 a nes;Lma bar contra séptima bar). Los tres de los triples se desempeñaron mejor que el singlete para G12C (panel derecho inferior, 9-iiesiina ar contra sexta bar). La persona con destreza reconocerá que las construcciones pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75, o 100 insertos. Los insertos pueden incluirse en l, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 diferentes vectores que tienen diferentes tipos (o superposición) de promotores, orígenes de replicación, antibióticos u otros genes de resistencia, dominios o genes de selectividad, dominios de expresión variable, dominios de recombinación, y otros dominios necesarios para la expresión de la construcción y propagación de los vectores. En general, las triples construcciones aquí mostradas pueden realizar silenciamiento génico así como el singlete. La eficiencia de silenciamiento génico varía entre las cuatro construcciones triplete probadas.
En combinación probamos la eficiencia de silenciamiento génico del triplete con células PANC-1. Las células PANC-1 tienen el genotipo KRASwt / G12D con un alelo de tipo silvestre y un alelo mutante G12D. Probamos si los triples son efectivos en silenciamiento génico de la expresión G12D mientras que no afectan la expresión de tipo silvestre. Así a fin de probar toda la población celular, establecimos transformantes con el vector resistente a G418. La mayoría de los transformantes resistentes a G418 en el acervo deberá expresar en forma constitutiva el bi-sh-KRAS. La Figura 10 muestra el esquema para establecer transformantes.
Acervos establecidos de transformantes se probaron para población KRAS RNA . Utilizamos el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) para discriminar las transcripciones de tipo silvestre contra las transcripciones mutantes. El sitio de restricción BstXI se introduce durante amplificación PCR, así como el resultado BstXI cortará los fragmentos de tipo silvestre, mientras que dejan intactos fragmentos que contienen mutación. Productos PCR digeridos con BstXI se separan en un gel de agarosa al 4%, la banda superior representa la población mutante y la banda inferior representa la población de tipo silvestre. La Figura 11 muestra que las construcciones triples con secuencias de espacio miR-17-92 (pGBI-129 y pGBI-130) pueden sólo silenciar génicamente en forma leve el mutante (carriles 4 y 5), mientras que las construcciones triples con secuencias de estructura principal miR-17-92 (pGBI-131 y pGBI-132) pueden silenciar génicamente en forma muy eficiente el mutante (carriles 6 y 7). De manera interesante e inesperada, pGBI-131 y pGBI-132 no sólo reducen enormemente la población RNA mutante, sino también mejoran la expresión de RNAm de tipo silvestre. Las construcciones triples pGBI-131 y pGBI-132 pueden reducir en forma efectiva y selectiva el mRNA mutante G12D y regresar a la expresión de tipo silvestre a nivel normal.
Se contempla que cualquier modalidad discutida en esta especificación puede ser implementada con respecto a cualquier método, equipo, reactivo, o composición de la invención, y viceversa. Además, las composiciones de la invención pueden emplearse para lograr los métodos de la nvenc n .
Se entenderá que modalidades particulares aquí descritas se muestran a manera de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención pueden ser empleadas en diversas modalidades sin apartarse del alcance de la invención. Aquellos con destreza en la téenica reconocerán o serán capaces de evaluar utilizando no más que experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos aquí descritos. Estos equivalentes se consideran dentro del alcance de esta invención y están cubiertos por las reivindicaciones.
Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación, son indicativas del nivel de destreza de aquellos con destreza en la especialidad a la cual se refiere esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes aquí se incorporan por referencia en la misma proporción como si cada publicación individual o solicitud de patente se indicara en forma específica e individual como incorporada por referencia.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se emplea en conjunto con el término "comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación, puede significar "uno", o "una", pero también es consistente con el significado de "uno o más", " "aall mmeennooss uunnoo"" y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se emplea para significar "y/o" menos que se indique de forma explícita que se refiere a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción soporta una definición que se refiere a solo alternativas y "y/o". A través de esta solicitud, el término "aproximadamente" se emplea para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.
Como se emplea en esta especificación y reivindicaciones, las palabras "comprende" (y cualquier forma de comprende tal como "que comprende" y/o "consiste"), "tiene" (y cualquier forma de tener tal como "tienen"), "incluyendo" (y cualquier forma de incluyendo tal como, "incluye" y "que incluye") o "contiene" (y cualquier forma de contiene tal como "contiene" y "que contiene") son incluyentes o de extremo abierto y no excluyen elementos o etapas de método adicionales no descritos.
El término "o sus combinaciones", como se emplea aquí, se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los ítems citados precedentes al término. Por ejemplo, "A, B, C, o sus combinaciones" pretende que incluya al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, ACB, ACB, ACB, BAC, o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más ítems o termino, tal como BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y así en adelante. La persona con destreza comprenderá que típicamente no hay límite en la cantidad de ítems o términos en cualquier combinación, a menos que de otra forma sea aparente en contexto.
Como se emplea aquí, palabras de aproximación tales como, limitación "aproximadamente", "sustancial" o "sustancialmente" se refieren a una condición que cuando así se modifica se entiende que no necesariamente es absoluta o perfecta pero se considerará suficientemente cercana para aquellos con destreza ordinaria en la téenica para garantizar el designar la condición que está presente. La medida en la cual puede variar la descripción dependerá de qué tan grande puede instituirse un cambio y todavía tener a una persona con destreza ordinaria en la técnica que reconoce la característica modificada que todavía tiene las características y capacidades requeridas de la característica sin modificar. En general, pero sujeto a la discusión precedente, un valor numérico aquí que se modifica por una palabra de aproximación tal como "aproximadamente" puede variar del valor establecido en al menos +1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14 o 15%.
Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados aquí pueden hacerse y ejecutarse sin indebida experimentación a la luz de la presente descripción. Mientras que las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será aparente para aquellos con destreza en la téenica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o métodos en las etapas o de la secuencia de etapas del método aquí descrito sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Todos estos sustitutos y modificaciones similares aparentes a aquellos con destreza en la técnica, se consideran dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.
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Claims (49)

REIVINDICACIONES
1. Un shRNAs bifuncional capaz de reducir una expresión de un gen K-ras, en donde al menos una secuencia de sitio objetivo de la molécula RNA bifuncional se ubica dentro del gen K-ras y en donde la molécula RNA bifuncional es capaz de activar un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación e independiente de disociación, para reducir el nivel de expresión de K-ras.
2. Los shRNAs bifuncionales de conformidad con la reivindicación 1, en donde el shRNA bifuncional comprende cuando menos una secuencia definida por SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56.
3. Los shRNAs bifuncionales de conformidad con la reivindicación 1, en donde el shRNA bifuncional comprende al menos una secuencia definida por SEQ ID NOS: 31 a 52.
4. Los shRNAs bifuncionales de conformidad con la reivindicación 1, en donde al menos una secuencia de sitio diana está dentro de una secuencia cDNA de gen K-ras humano (SEQ ID NOS: 27 a 30).
5. Los shRNAs bifuncionales de conformidad con la reivindicación 1, en donde K-ras es un K-ras mutado.
6. Un vector de expresión que comprende: un promotor; y un inserto de ácido nucleico enlazado operativamente al promotor, en donde el inserto codifica uno o más shRNA capaces de inhibir una expresión de cuando menos un gen diana es un gen K-ras por interferencia RNA; en donde el uno o más shRNA comprende una molécula RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras.
7. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, en donde la secuencia de gen diana comprende SEQ ID NO: 1 a 5.
8. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, en donde un arreglo de secuencia para shRNA comprende una diana de nucleótido 5' tronco brazo-19, una secuencia complementaria de diana nucleótido K-ras-TA-15 nucleótido bucle-19, variante diana de nucleótido 3' tronco brazo-espaciador 5' tronco brazo 19-secuencia complementaria diana de nucleótido diana 15 nucleótido bucle 19-3' tronco brazo.
9. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, en donde el inserto de ácido nucleico comprende cuando menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 6 a 27 o 53 a 56.
10. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, en donde el vector comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75, o 100 copias de insertos shRNAs bifuncionales capaces de reducir una expresión de uno o más genes K-ras mutados.
11. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6, en donde cuando menos un shRNA tiene una secuencia de sitio diana que está dentro de una secuencia cDNA de gen K-ras mutado.
12. Un sistema de suministro terapéutico que comprende: un portador de agente terapéutico; y un vector de expresión que comprende un promotor y un inserto de ácido nucleico enlazado operativamente al promotor, el inserto de ácido nucleico codifica una o más RNA de horquilla corta (shRNA) capaz de inhibir una expresión de la secuencia de gen diana que es gen K-ras mediante interferencia RNA; en donde uno o más shRNA comprenden una molécula RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras.
13. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 12, en donde el portador de agente terapéutico es una nanopartícula de DNA compactada, o una nanopartícula de DNA compactada o uno o más policationes.
14. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 13, en donde el uno o más policationes es un péptido 30méro de cisteína-lisina sustituido con polietilen glicol (PEG) de 10 kDA (CK30PEG10k).
15. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 13, en donde las nanopartículas de DNA compactadas además se encapsulan en cuando menos uno de un liposoma, un liposoma enmascarado en forma reversible o una vesícula invaginada bilaminar (BIV).
16. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 12, en donde la secuencia de gen diana comprende SEQ ID NOS: 27 a 30.
17. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 12, en donde el inserto de ácido nucleico comprende al menos una de las secuencias seleccionadas de SEQ ID NOS: 31 a 52.
18. El sistema de suministro de conformidad con la reivindicación 12, en donde el inserto de ácido nucleico se elige de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56.
19. Un método para suministrar uno o más shRNAs a un tejido diana que expresa un gen K-ras, que comprende las etapas de: preparar un vector de expresión que comprende un promotor y un inserto de ácido nucleico enlazado operativamente al promotor que codifica el uno o más shRNA, en donde el uno o más shRNA comprenden una molécula RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación e independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras; combinar el vector de expresión con un portador de agente terapéutico, en donde el portador de agente terapéutico comprende un liposoma; y administrar una cantidad terapéutica efectiva del vector de expresión y complejo portador de agente terapéutico a un paciente que lo requiere.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde el portador de agente terapéutico es una nanopartícula de DNA compactada.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la nanopartícula de DNA se compacta con uno o más policationes, en donde el uno o más policationes comprende un péptido 3méro cisteína-lisina sustituido con polietilen glicol (PEG) de 10 kDA (CK30PEG10k) o un péptido de condensación de lisina 30-méro.
22. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde las nanopartículas de DNA compactadas además se encapsulan en un liposoma, en donde el liposoma es una vesícula invaginada bilaminar (BIV) que comprende una o más porciones diana de receptor.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde una o más porciones que hacen blanco en el receptor comprenden mímicos de giro-beta bivalentes de molécula pequeña.
24. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde el inserto de ácido nucleico comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56.
25. Un método para inhibir una expresión de un gen K-ras en una o más células diana, que comprende las etapas de: seleccionar la una o más células diana; y transfectar la célula diana con un vector que expresa uno o más RNA de horquilla corta RNA (shRNAs) capaz de inhibir una expresión de un gen K-ras en una o más células diana mediante interferencia RNA, en donde uno o más shRNA comprende una molécula de RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde shRNA incorpora motivos siRNA (dependiente de disociación) y miRNA (independiente de disociación).
27. Un método para suprimir un crecimiento de célula de tumor en un sujeto humano que comprende las etapas de: identificar al sujeto humano que requiere suprimir el crecimiento de célula de tumor; y administrar un vector de expresión en un complejo portador de agente terapéutico al sujeto humano, en una cantidad suficiente para suprimir el crecimiento de células de tumor, en donde el vector de expresión expresa uno o más shRNA capaces de inhibir una expresión de un gen diana que es un K-ras mutado en una o más células diana mediante interferencia RNA; en donde el uno o más shRNA comprende una molécula RNA bifuncional que activa un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión del gen diana; en donde la inhibición resulta en una apoptosis, una proliferación de freno o una invasividad reducida de las celulas de tumor.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde el portador de agente terapéutico comprende una vesícula invaginada bilaminar (BIV).
29. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde el portador de agente terapéutico comprende una o más porciones dirigidas al receptor que comprenden mímicos de giro-beta bivalentes de molécula pequeña.
30. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la administración se elige del grupo que consiste de inyección intratumoral, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa.
31. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la administración comprende inyectar con un DNA:lipoplex.
32. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde el crecimiento de células de tumor expresa un K-ras mutado.
33. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde el crecimiento de células de tumor es un adenocarcinoma ductal pancreático humano.
34. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde el crecimiento de células de tumor se elige del grupo que consiste de cáncer pulmonar, cáncer de colon, melanoma, insulinoma, mesotelioma, cáncer de ovarios y cáncer pancreático.
35. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde bishRNA se elige de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56.
36. El método de conformidad con la reivindicación 27, que además comprende una terapia de combinación con un segundo agente anti-neoplásmico.
37. El método de conformidad con la reivindicación 27, que además comprende una terapia de combinación con cetuximab o vemurafenib.
38. Un vector de expresión que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75, o 100 insertos de shRNAs bifuncionales capaces de reducir una expresión de un gen K-ras mutante; en donde al menos una secuencia de sitio diana de la molécula de RNA funcional se ubica dentro del gen K-ras, en donde la molécula RNA bifuncional es capaz de activar un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras.
39. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 38, en donde el shRNA bifuncional se elige de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56.
40. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 38, en donde el shRNA bifuncional comprende insertos triplete que hacen blanco en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de al menos uno de G12D-G12V-G12R, G12C-G12D-G12R, G12D-G12V-G12R, o G12C-G12D-G12R.
41. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 38, en donde el shRNA bifuncional comprende insertos triplete que hacen blanco en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21, o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o una combinación de SEQ ID NOS: 21, 2 y 18.
42. Una célula que comprende una unidad de expresión que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 25, 50, 75, o 100 insertos shRNAs bifuncionales capaces de reducir una expresión de un gen K-ras mutante; en donde al menos una secuencia de sitio diana de la molécula RNA bifuncional, se ubica dentro del gen K-ras, en donde la molécula RNA bifuncional es capaz de activar un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras.
43. La célula de conformidad con la reivindicación 42, en donde el shRNA bifuncional se elige de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56.
44. La célula de conformidad con la reivindicación 42, en donde el shRNA bifuncional aumenta la expresión de le ras de tipo silvestre.
45. Un método para evaluar un fármaco candidato que se considera útil para tratar células o tejidos, que comprende cuando menos un k-ras mutado que se silencia en forma efectiva, el método comprende: (a) medir uno o más de los siguientes: a. el nivel de expresión de al menos un K-ras de tipo silvestre y uno o más genes K-ras mutados en las células o tejidos; b. el nivel de expresión de un gen candidato a un grupo de genes candidatos en un ambiente celular con la expresión reducida de uno o más genes K-ras mutados en las células o tejidos de cáncer; c. el efecto de un fármaco candidato en el fenotipo de estas células que comprende expresión reducida de uno o más genes K-ras mutados en las células o tejidos de cáncer; (b) administrar un fármaco candidato a un primer subconjunto de las células o tejidos; y un placebo a un segundo subconjunto de las células o tejidos; (c) repetir la etapa (a) después de administrar el fármaco candidato o el placebo; y (d) determinar si el fármaco candidato es efectivo para producir fenotipo determinado en ambiente celular con reducida expresión de K-ras mutado en comparación con un ambiente celular que expresa mutante K-ras que es estadísticamente significante en comparación con cualquier reducción que ocurre en el segundo subconjunto de células o tejidos, en donde la reducción estadísticamente significante indica que el fármaco candidato es útil para tratar enfermedad sin significante fondo de mutación K-ras.
46. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde las células o tejidos además expresan uno o más genes detectables que se han modificado para comprender un le ras de tipo silvestre y uno o más K-ras mutados, en donde el nivel de expresión de la etiqueta detectable se correlaciona con el efecto de la sustancia candidato en el K-ras de tipo silvestre y uno o más K-ras mutados.
47. El método de conformidad con la reivindicación 24, en donde las células o tejido se han modificado para expresar un shRNAs bifuncional capaz de reducir una expresión de un gen K-ras, en donde al menos una secuencia de sitio diana de la molécula RNA bifuncional, se ubica dentro del gen K-ras y en donde la molécula RNA bifuncional es capaz de activar un complejo de silenciado inducido por RNA dependiente de disociación y uno independiente de disociación para reducir el nivel de expresión de K-ras.
48. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde las células o tejidos se han modificado para expresar shRNAs bifuncionales seleccionados de SEQ ID NOS: 1 a 22 o 53 a 56.
49. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde las células o tejidos se han modificado para expresar un shRNA bifuncional que comprende uno o más insertos que hacen blanco en mutaciones K-ras específicas seleccionadas de SEQ ID NO.: 2, 18, 20, 21, o una combinación de SEQ ID NOS: 2, 18 y 20; o una combinación de SEQ ID NOS: 21, 2 y 18.
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