CN106661576A - 用于癌症治疗的多靶向RNAi - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于制备和使用能够降低两个或更多个基因的表达的RNAi的组合物和方法，其包括：降低第一靶基因表达的第一RNAi分子；降低所述第一靶基因或第二靶基因的表达的第二RNAi分子；和任选地降低所述第一靶基因、第二靶基因或第三靶基因的表达的第三RNAi分子，其中所述RNAi分子降低例如突变KRAS、SRC‑3、EGFR、PIK3、NCOA3或ERα1的表达水平，并且可以是例如miRNA、shRNA或双功能shRNA。

Description

用于癌症治疗的多靶向RNAi
相关申请的交叉引用
技术领域
本发明一般性地涉及癌症治疗领域，更具体地，涉及用于癌症治疗的RNAi构建体。
序列表引用
本申请根据37 C.F.R.§1.821-1825的要求包括单独以电子形式提交的序列表。
背景技术
在不限制本发明的范围的情况下，结合K-ras和肺癌描述本发明的背景。
KRAS(Kirsten-ras)癌基因在显着比例的胰腺导管腺癌(pancreatic ductaladenocarcinoma，PDAC)、结肠直肠和非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)中突变。在大多数(70％-90％)携带KRAS突变的PDAC患者中，五年存活率小于5％。KRAS是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白家族的成员，并且是多种细胞内信号转导通路(包括表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR))的必需的组成部分。KRAS中绝大多数突变是单核苷酸体细胞突变，导致在密码子12或13处的单个氨基酸替换。G12D、G12V、G12R和G12C的KRAS突变包含＞90％的在PADC患者中发现的KRAS突变。KRAS突变基本上导致组成型活性KRAS和不受调控的下游信号转导。
靶向剂(如抗体西妥昔单抗(在结肠直肠癌中)和小分子抑制剂维罗非尼(在BRAF突变体黑素瘤中))在具有KRAS突变的患者中表现不佳。因此，有效的癌症治疗策略需要KRAS突变选择性地不影响野生型功能。仍然非常需要针对具有KRAS突变的癌症的组合物、方法和治疗。
授予Slack等的美国专利号7,893,034名称为“Regulation of oncogenes bymicroRNAs”。简言之，这些发明人描述了靶向调控人癌基因的天然存在的miRNA及其使用方法。用于该发明人所描述的方法和组合物中的合适的核酸被认为包括但不限于保留了成熟miRNA的生物学活性的pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA或其变体的片段，以及编码pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、其变体或片段的DNA，或miRNA的调控元件。该发明人还讨论了将含有核酸的组合物施用于有治疗或预防癌症的至少一种症状或表现之需要的患者。在一个具体实施方案中，据说将所述组合物以有效量施用以抑制一个或更多个癌基因的基因表达。还描述了用于治疗或预防癌症的至少一种症状或表现的方法。
发明内容
在一个实施方案中，本发明包括能够降低三个或更多个基因表达的双功能shRNA，其包含：降低KRAS表达的第一双功能RNA分子；降低类固醇受体辅激活物-3(steroidreceptor coactivator-3，SRC-3)表达的第二双功能RNA分子；和降低表皮生长因子受体(EGFR)表达的第三双功能RNA分子，其中所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低突变K-ras，SRC-3和EGFR的表达水平。在一个方面，将双功能shRNA剪接到载体中。在另一个方面，将双功能shRNA剪接到由SEQ ID NO：1、3、42或43所限定的载体中。在另一个方面，双功能shRNA包含至少一个由SEQ ID NO：2、4、40或41所限定的序列。在另一个方面，第一双功能RNA的至少一个靶位点是突变KRAS基因，其进一步限定为具有G12C、G12D、G12V或G12R突变中的至少一种的人KRAS基因。在另一个方面，正常RAS的表达不被第一双功能RNA分子降低至低于功能性生理水平。在另一个方面，SRC-3或EGFR中的至少一个是正常人基因。
本发明的另一个实施方案包括表达载体，其包含：启动子；和与所述启动子有效连接的核酸插入片段(nucleic acid insert)，其中所述插入片段包含：降低突变KRAS的表达的第一双功能RNA分子；降低SRC-3的表达的第二双功能RNA分子；和降低表皮生长因子受体(EGFR)的表达的第三双功能RNA分子，其中所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低突变KRAS、SRC-3和EGFR的表达水平，其中所述一个或更多个shRNA包含双功能RNA分子，其激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低KRAS、SRC-3和EGFR的表达水平。在一个方面，所述载体包含至少一个由SEQ IDNO：1、3、42或43所限定的序列。在另一个方面，双功能RNA分子包含SEQ ID NO：2、4、40或41。在另一个方面，第一、第二和第三双功能shRNA的序列排列包含5’茎臂-19核苷酸靶标，其为K-ras-TA-15核苷酸环-19核苷酸靶标互补序列-3’茎臂-间隔区-5’茎臂-19核苷酸靶标变体-TA-15核苷酸环-19核苷酸靶标互补序列-3’茎臂。在另一个方面，所述载体包含选自SEQID NO：1或2的至少一个序列。在另一个方面，核酸插入片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100个拷贝的能够降低一种或更多种突变KRAS以及EGFR和SRC-3的表达的双功能shRNA插入片段。在另一个方面，SRC-3或EGFR中的至少一个是正常人基因。
本发明的另一个实施方案是治疗递送系统，其包含：治疗剂载体；和包含启动子和与所述启动子有效连接的核酸插入片段的表达载体，所述核酸插入片段编码：降低突变KRAS的表达的第一双功能RNA分子；降低SRC-3的表达的第二双功能RNA分子；和降低表皮生长因子受体(EGFR)的表达的第三双功能RNA分子，其中所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低突变KRAS、SRC-3和EGFR的表达水平，其中所述一个或更多个shRNA包含双功能RNA分子，其激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低KRAS、SRC-3和EGFR的表达水平。在另一个方面，治疗剂载体是压缩的DNA纳米颗粒或具有一个或更多个聚阳离子的压缩的DNA纳米颗粒。在另一个方面，所述一个或更多个聚阳离子是10kDA聚乙二醇(PEG)取代的半胱氨酸-赖氨酸3聚体肽(CK30PEG10k)。在另一个方面，将压缩的DNA纳米颗粒进一步包封在脂质体、可逆掩蔽的脂质体(reversibly masked liposome)或双层内陷囊泡(bilamellar invaginated vesicle，BIV)中的至少一种中。在另一个方面，所述载体包含至少一个由SEQ ID NO：1、3、42或43所限定的序列。在另一个方面，所述核酸插入片段包含SEQ ID NO：2、4、40或41。
本发明的另一个实施方案包括将一个或更多个shRNA递送至表达KRAS、SRC-3和EGFR基因的靶组织的方法，其包括以下步骤：制备包含启动子和与所述启动子有效连接的编码所述一个或更多个shRNA的核酸插入片段的表达载体，其中所述一个或更多个shRNA包含与所述启动子有效连接的核酸插入片段，其中所述插入片段包含：降低突变SRC-3的表达的第一双功能RNA分子；降低SRC-3的表达的第二双功能RNA分子；和降低表皮生长因子受体(EGFR)的表达的第三双功能RNA分子，其中所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低突变KRAS、SRC-3和EGFR的表达水平，其中所述一个或更多个shRNA包含双功能RNA分子，其激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低KRAS、SRC-3和EGFR的表达水平；将所述表达载体与治疗剂载体组合，其中所述治疗剂载体包含脂质体；以及向此需要的患者施用治疗有效量的所述表达载体和治疗剂载体复合物。在一个方面，治疗剂载体是压缩的DNA纳米颗粒。在另一个方面，用一个或更多个聚阳离子压缩所述DNA纳米颗粒，其中所述一个或更多个聚阳离子包含10kDA聚乙二醇(PEG)取代的半胱氨酸-赖氨酸3聚体肽(CK30PEG10k)或30聚体赖氨酸缩合肽。在另一个方面，将压缩的DNA纳米颗粒进一步包封在脂质体中，其中所述脂质体是包含一个或更多个受体靶向部分的双层内陷囊泡(BIV)。
本发明的另一个实施方案包括抑制入对象中肿瘤细胞生长的方法，其包括以下步骤：鉴定有抑制肿瘤细胞生长之需要的人对象；并以足以抑制肿瘤细胞生长的量向所述类对象施用处于治疗剂载体复合物中的表达载体，其中所述表达载体包含与启动子有效连接的核酸插入片段，其中所述插入片段包含：降低突变KRAS基因的表达的第一双功能RNA分子；降低SRC-3基因的表达的第二双功能RNA分子；和降低表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达的第三双功能RNA分子，其中所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低突变KRAS、SRC-3和EGFR的表达水平，并且其中所述抑制导致肿瘤细胞的凋亡、增殖停滞或侵袭力降低。在一个方面，所述治疗剂载体包含双层内陷囊泡(BIV)。在另一个方面，治疗剂载体包含含有小分子二价β转角模拟物的一个或更多个受体靶向部分。在另一个方面，施用步骤选自瘤内、皮下、静脉内、腹膜内、肌内和静脉内注射。在另一个方面，施用步骤包括用DNA：脂复合物(lipoplex)注射。在另一个方面，所述肿瘤细胞生长表达突变的KRAS。在另一个方面，所述肿瘤细胞生长是肺癌。在另一个方面，所述方法还包括与第二抗肿瘤剂的联合治疗。
本发明的另一个实施方案包括评价被认为可用于治疗肺癌的候选药物的方法，所述方法包括：(a)测量以下的一种或更多种：至少野生型KRAS和一个或更多个突变KRAS、EGFR和SRC-3基因在肺癌细胞或组织中的表达水平；一个或更多个突变KRAS、EGFR和SRC-3基因在肺癌细胞或组织中的表达降低的细胞环境中，候选基因或候选基因的组的表达水平；候选药物对这种细胞的表型的作用，其包括一个或更多个突变KRAS、EGFR和SRC-3基因在肺癌细胞或组织中的表达降低；(b)将候选药物施用于所述肺癌细胞或组织的第一亚群(subset)，以及将安慰剂施用于所述肺癌细胞或组织的第二亚群；(c)在施用所述候选药物或安慰剂后重复步骤(a)；并且(d)与表达KRAS突变体、EGFR和SRC-3的细胞环境相比，确定所述候选药物在突变KRAS、EGFR和SRC-3的表达降低的细胞环境中是否有效产生确定的表型，其与肺癌细胞或组织的所述第二亚群中发生的任何降低相比是统计学显著的，其中统计学显著的降低表明所述候选药物可用于治疗肺癌。在另一个方面，所述细胞或组织还表达经修饰以包含野生型RAS和一种或更多种突变KRAS的一个或更多个可检测基因，其中可检测标记的表达水平与候选物质对野生型RAS和一种或更多种突变KRAS的作用相关。
本发明的另一个实施方案包括抑制人对象中肿瘤细胞生长的方法，其包括以下步骤：从所述人对象获得肿瘤细胞样品；鉴定有抑制以防止肿瘤细胞生长之需要的所述人对象中的一个或更多个靶基因；构建表达载体，其包含表达特异性靶向在所述肿瘤细胞样品中鉴定到的基因的两个或更多个RNAi核酸区段的插入片段；其中所述插入片段包含：降低在所述肿瘤细胞中鉴定的相同或不同靶基因的表达的第一和第二RNAi核酸；以足以表达所述两个或更多个RNAi核酸区段的量向所述人对象施用处于治疗剂载体复合物中的表达载体；并确定在靶肿瘤细胞中所述基因是否已被所述表达载体敲低(knock-down)，其中所述抑制导致所述肿瘤细胞的凋亡、增殖停滞或侵袭力降低。在一个方面，所述RNAi选自miRNA和shRNA和siRNA或bi-shRNA中的至少一种。在另一个方面，所述第一和第二核酸两者均编码双功能shRNA。在另一个方面，所述第一或第二核酸中的至少一个靶向K-RAS并且选自SEQID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。在另一个方面，所述第一或第二核酸中的至少一个靶向SRC-3并且选自SEQ ID NO：27-36。在另一个方面，所述插入片段还包含3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100个拷贝的能够降低一个或更多个突变或正常基因的表达的RNAi插入片段。
在另一个实施方案中，本发明包括能够降低三个或更多个基因的表达的双功能shRNA组合物，其包含：降低第一靶基因的表达的第一双功能RNA分子；降低第二靶基因的表达的第二双功能RNA分子；和降低第三靶基因的表达的第三双功能RNA分子，其中每个所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平。在另一个方面，每个所述双功能shRNA剪接入载体中。在另一个方面，所述组合物进一步限定为SEQ ID NO：1、3、46或47所限定的载体。在另一个方面，所述双功能shRNA包含SEQ ID NO：2、4、44或45所限定的至少一个核酸序列。在另一个方面，第一双功能RNA的至少一个靶位点选择性地靶向突变KRAS基因，所述突变KRAS基因进一步限定为具有G12C、G12D、G12V或G12R突变中至少一种的人KRAS基因。在另一个方面，所述至少第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。在另一个方面，正常RAS的表达不被所述第一双功能RNA分子降低至低于功能性生理水平。在另一个方面，SRC-3或EGFR中的至少一个是正常人基因。
在另一个实施方案中，本发明包括表达载体，其包含：启动子；和与所述启动子有效连接的核酸插入片段，其中所述插入片段包含：降低第一靶基因的表达的第一双功能RNA分子；降低第二靶基因的表达的第二双功能RNA分子；和降低第三靶基因的表达的第三双功能RNA分子，其中所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平，其中所述一个或更多个shRNA包含双功能RNA分子，所述双功能RNA分子激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平。在另一个方面，所述组合物进一步限定为SEQ ID NO：1、3、46或47所限定的载体。在另一个方面，所述双功能shRNA包含SEQ IDNO：2、4、44或45所限定的至少一个核酸序列。在另一个方面，所述至少一个靶基因包含选择性地靶向突变KRAS基因的双功能shRNA，所述突变KRAS基因进一步限定为具有G12C、G12D、G12V或G12R突变中的至少一种的人KRAS基因。在另一个方面，所述至少第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。在另一个方面，所述核酸插入片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100个拷贝的能够降低一个或更多个突变或正常基因之表达的双功能shRNA插入片段。
在另一个实施方案中，本发明包括治疗递送系统，其包含：治疗剂载体；以及包含启动子和与所述启动子有效连接的核酸插入片段的表达载体，所述核酸插入片段编码：降低第一靶基因的表达的第一双功能RNA分子；降低第二靶基因的表达的第二双功能RNA分子；和降低第三靶基因的表达的第三双功能RNA分子，其中每个所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平。在一个方面，所述组合物进一步限定为SEQ ID NO：1、3、46或47所限定的载体。在另一个方面，所述双功能shRNA包含SEQ ID NO：2、4、44或45所限定的至少一个核酸序列。在另一个方面，所述至少一个靶基因包含选择性地靶向突变KRAS基因的双功能shRNA，所述KRAS基因进一步限定为具有G12C、G12D、G12V或G12R突变中的至少一种的人KRAS基因。在另一个方面，所述至少第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ IDNO：50-126。在另一个方面，所述核酸插入片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100个拷贝的能够降低一个或更多个突变或正常基因之表达的双功能shRNA插入片段。
在另一个实施方案中，本发明包括将一个或更多个shRNA递送至表达KRAS、SRC-3和EGFR基因的靶组织的方法，其包括以下步骤：制备包含启动子和于所述启动子有效连接的核酸插入片段的表达载体，所述核酸插入片段编码一个或更多个shRNA，其中所述一个或更多个shRNA包含与所述启动子有效连接的核酸插入片段，其中所述插入片段包含：降低第一靶基因的表达的第一双功能RNA分子；降低第二靶基因的表达的第二双功能RNA分子；和降低第三靶基因的表达的第三双功能RNA分子，其中每个所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平；将所述表达载体与治疗剂载体组合，其中所述治疗剂载体包含脂质体；以及向此需要的患者施用治疗有效量的表达载体和治疗剂载体复合物。在另一个方面，所述组合物进一步限定为SEQ ID NO：1、3、46或47所限定的载体。在另一个方面，所述双功能shRNA包含SEQID NO：2、4、44或45所限定的至少一个核酸序列。在另一个方面，所述至少一个靶基因包含选择性地靶向突变KRAS基因的双功能shRNA，所述KRAS基因进一步限定为具有G12C、G12D、G12V或G12R突变中的至少一种的人KRAS基因。在另一个方面，所述至少第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。在另一个方面，所述核酸插入片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100个拷贝的能够降低一个或更多个突变或正常基因之表达的双功能shRNA插入片段。
在另一个实施方案中，本发明包括抑制人对象中肿瘤细胞生长的方法，其包括以下步骤：鉴定有抑制肿瘤细胞生长之需要的人对象；并以足以抑制肿瘤细胞生长的量向所述人对象施用处于治疗剂载体复合物中的表达载体，其中所述表达载体包含与启动子有效连接的核酸插入片段，其中所述插入片段包含：降低突变KRAS基因的表达的第一双功能RNA分子；降低SRC-3基因的表达的第二双功能RNA分子；和降低表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达的第三双功能RNA分子，其中所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低突变KRAS、SRC-3和EGFR的表达水平，并且其中所述抑制导致肿瘤细胞的凋亡、增殖停滞或侵袭力降低。在另一个方面，所述核酸插入片段包含SEQ IDNO：2、4、42或43。在另一个方面，所述至少一个针对K-RAS的核酸插入片段选自SEQ ID NO：5-26。在另一个方面，所述至少一个针对SRC-3的核酸插入片段选自SEQ ID NO：27-36。在另一个方面，所述至少一个针对EGFR的核酸插入片段选自SEQ ID NO：48-49。在另一个方面，所述施用步骤选自瘤内、皮下、静脉内、腹膜内、肌内和静脉内注射。在另一个方面，所述肿瘤细胞生长表达突变的KRAS。在另一个方面，所述肿瘤细胞生长是肺癌。在另一个方面，所述方法还包括与第二抗肿瘤剂的联合治疗。
在另一个实施方案中，本发明包括评价被认为可用于治疗癌症的候选药物的方法，所述方法包括：(a)测量以下的一种或更多种：至少野生型KRAS和一种或更多种突变KRAS以及两个或更多个靶基因在癌细胞或组织中的表达水平；一种或更多种突变KRAS基因和所述两个或更多个靶基因在癌细胞或组织中的表达降低的细胞环境中，候选基因或候选基因的组的表达水平；候选药物对这种细胞的表型的作用，其包括一种或更多种突变KRAS基因和两个或更多个靶基因在癌细胞或组织中的表达降低；(b)将候选药物施用于所述癌细胞或组织的第一亚群，以及将安慰剂施用于所述癌细胞或组织的第二亚群；(c)在施用所述候选药物或安慰剂后重复步骤(a)；并且(d)与正常KRAS表达的细胞环境相比，确定所述候选药物在突变KRAS基因和所述两个或更多个靶基因的表达降低的细胞环境中是否有效产生确定的表型，其与肺癌细胞或组织的所述第二亚群中发生的任何降低相比是统计学显著的，其中统计学显著的降低表明所述候选药物可用于治疗癌症。在另一个方面，所述癌症选自脑癌、膀胱癌、血癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、胃肠癌、内分泌癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌。在另一个方面，所述突变KRAS被选择性地敲低，并且所述两个或更多个靶基因选自SRC-3、EGFR、PIK3、NCOA3或ERα1，且所述插入片段选自RNAi、shRNA或bi-shRNA中的至少一种。
在另一个实施方案中，本发明包括抑制人对象中肿瘤细胞生长的方法，其包括以下步骤：从所述人对象获得肿瘤细胞样品；鉴定有抑制以防止肿瘤细胞生长之需要的所述人对象中的一个或更多个靶基因；构建表达载体，其包含表达特异性靶向在所述肿瘤细胞样品中鉴定到的基因的两个或更多个RNAi核酸区段的插入片段；其中所述插入片段包含：降低在所述肿瘤细胞中鉴定的相同或不同靶基因之表达的第一和第二RNAi核酸；以足以表达所述两个或更多个RNAi核酸区段的量向所述人对象施用处于治疗剂载体复合物中的表达载体；并确定在靶肿瘤细胞中所述基因是否已被所述表达载体敲低，其中所述抑制导致肿瘤细胞的凋亡、增殖停滞或侵袭力降低。在一个方面，所述RNAi选自miRNA和shRNA和siRNA或bi-shRNA中的至少一种。在另一个方面，至少所述第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。在另一个方面，所述插入片段还包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100个拷贝的能够降低一个或更多个突变或正常基因之表达的RNAi插入片段。在另一个方面，所述表达载体进一步限定为包含以下结构：载体-A-B-C-载体，其中A、B和C是三个或更多个RNAi核酸区段，其可以靶向所述一个或更多个靶基因的mRNA的相同区域、一个或更多个靶基因的mRNA的不同区域或来自两个或更多个靶基因的不同mRNA。在一个方面，所述插入片段A-B-C选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细描述以及附图，并且其中：
图1示出了使用设计为靶向SRC-3、EGFR和突变体KRAS(G12C)的多靶向bi-shRNA可以减弱肺癌细胞生长的结果。
图2示出了本发明的一种构建体。
图3示出本发明的另一种构建体。
图4示出了pGBI-162的载体图：其中插入片段包含针对PI3KE545K+SRC-3+ER-α(NR3A1)靶向载体的RNAi，如下所述。
图5示出了pGBI-162：pGBI-163的载体图：SRC-3+ER-α(NR3A1)+PI3K E545K靶向载体。
图6A是示出生长变化的图，图6B是印迹，其示出了使用本发明图5和6所示的构建体对MCF-7乳腺癌细胞系获得的结果，即：pGBI-162：PI3K E545K+SRC-3+ER-α(NR3A1)靶向载体和pGBI-163：SRC-3+ER-α(NR3A1)+PI3K E545K靶向载体。
发明详述
虽然下文详细讨论了本发明的多种实施方案的制造和使用，但是应当理解，本发明提供了可以在多种的具体情景中实施的许多可应用的发明概念。本文所讨论的具体实施方案仅是举例说明制造和使用本发明的一些具体方式，而不限制本发明的范围。
为了促使理解本发明，下面定义了一些术语。本文所定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解相同的含义。没有数词限定的表述不旨在仅指单数实体，而是包括可以用于举例说明的特定实例的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是它们的用法不限制本发明，除非在权利要求中概述。
本发明包括表达载体中的多聚核酸插入片段，其可以具有以下结构：载体-A-B-C-载体，其中A、B和C是siRNA，其可以靶向所述一个或更多个靶基因的mRNA的相同区域、一个或更多个靶基因的mRNA的不同区域或来自两个或更多个靶基因的不同mRNA。技术人员将认识到该多聚体可以不仅包含A、B、C，例如D、E和F...或甚至A′、B′、C′、D′，或组合或多个靶向插入片段，例如，A、B、C、A′、B′、C′、D′、D、E和F...甚至是A、A、B、B′、C、D、D′、D′，等。可以使用本发明的方法确定该组合，例如，从人对象获得肿瘤细胞样品；鉴定有抑制以防止肿瘤细胞生长之需要的人对象中的一个或更多个靶基因；构建表达载体，其包含表达特异性靶向所述肿瘤细胞样品中鉴定的基因的两个或更多个RNAi核酸区段的插入片段；其中所述插入片段包含：降低在所述肿瘤细胞中鉴定的相同或不同靶基因之表达的第一和第二RNAi核酸；以足以表达所述两个或更多个RNAi核酸区段的量向所述人对象施用处于治疗剂载体复合物中的表达载体；并确定在靶肿瘤细胞中所述基因是否已被所述表达载体敲低，其中所述抑制导致肿瘤细胞的凋亡、增殖停滞或侵袭力降低。在某些实例中，插入片段A、B、C、A′、B′、C′、D′、D、E和F...或甚至A、A、B、B′、C、D、D′、D′等选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。
在所有人类癌症中经常观察到ras原癌基因家族中的激活突变使得它们具有组成型活性。特别地，在许多肺癌中观察到激活性K-ras突变。K-ras突变难以用小分子特异性靶向，因此敲低KRAS突变而不影响野生型(wt)RAS表达是癌症治疗的可行方法。所有基于RNAi的KRAS突变敲低是靶向一个特定突变或者伴随地敲低wt RAS表达。
RNAi是使Fire和Mello于1998年获得诺贝尔奖的发现，其促使大量的研究和出版物的出现，从而进一步促进了对基因功能的理解并刺激了许多I期和II期临床试验。这种由包括内源微小RNA(microRNA，miRNA)的小RNA导致的天然存在的基因沉默机制高度依赖于基因序列；因此，理论上，该机制可用于抑制具有强特异性的任何靶基因的表达。RNAi不受限于小分子开发所固有的药理学约束，这产生了获得传统上“不可成药(undruggable)”的用于疾病治疗的靶标的机会。
这种机制的中心作用者是RNA诱导沉默复合物(RNA Induced SilencingComplex，RISC)。该过程以双链小RNA(由过客链和引导链构成)开始，其并入前RISC中，随后通过过客链的切割依赖性或切割非依赖性释放以形成含有RISC的引导链。该引导链(对mRNA反义)引导RISC通过序列互补性(完全或部分延伸)识别靶mRNA。RISC的关键组分是在哺乳动物系统中的Argonaute蛋白(Ago)家族，Ago 1、2、3和4，其中只有Ago 2具有核酸内切酶活性以允许靶mRNA的切割从而进一步降解(切割依赖途径)；所有含Ago的RISC可以通过切割非依赖性的效应物通路起作用，从而导致p小体(P-body)中的翻译抑制和mRNA螯合(sequestration)，以及随后的降解。切割依赖性效应物过程需要在引导链与过客链和靶mRNA两者之间，特别是在中心区域中的广泛同源性；在另一方面，切割非依赖性效应物过程仅需要引导链与过客链和靶mRNA之间的部分同源性。
本发明利用在RISC复合物上的切割依赖性和切割非依赖性加载(loading)，而非RISC复合物下游的事件。因此，如本文所用的短语“切割依赖性和切割非依赖性”指特异性靶向RISC的RNA的设计和在RISC复合物上的切割依赖性和切割非依赖性活性，即加载。在本文和本申请的母案申请中已经发现，这些“双功能shRNA”具有比靶向RISC复合物的每个单独部分的总和更高的抑制活性。因此，本发明的抑制活性更高。
RNA干扰可以通过合成的双链小干扰RNA(siRNA)或通过载体驱动的短发夹RNA(shRNA)触发。已经证明siRNA和载体驱动的shRNA两者均在体外和体内应用中有效，各自具有其分别的优点。大多数siRNA在结构上被设计成促进有效并入含有Ago2的RISC中，含有RNase III的Dicer-底物设计通过在前RISC的初始缔合与加工将siRNA的效率提高了至少10倍。载体驱动的shRNA利用了宿主微小RNA生物发生途径，其似乎更有效。siRNA更容易化学修饰，而shRNA表达可以通过特异性启动子调节和调控。
shRNA和siRNA的设计与合成。设计shRNA和siRNA(两种不同的RNAi方法)的当前方法通常采用一组以计算机实施的规则，其并非总是可靠的且基本上表现为试错法(trial-and-error approach)。如本文所用，“RNAi分子”通常指常规shRNA分子(本领域普通技术人员常规使用的公知shRNA分子)、增强的shRNA(本发明所涵盖的新shRNA分子及其用途，并描述于下文中)和/或siRNA分子。如本文所用，“shRNA/siRNA”、“siRNA/shRNA”和类似术语指常规shRNA、增强的shRNA、siRNA或前述的任意组合。
最近的研究表明了siRNA(和其他RNAi分子)的相当广泛的脱靶效应。尽管靶基因可以被有效地沉默，但是已经报道了在mRNA和蛋白质两者水平上的非特异性作用。因此，对于本文所述的本发明的临床应用，重要的是将RNAi分子与所期望的效力、功效和结合精度与准确性相结合。在本发明的某些实施方案中，RNAi分子优选为常规的或增强的shRNA，因为这样的设计已经示出比siRNA更稳定、持久、有效和适于调控。此外，可以利用递送载体的肿瘤特异性靶向和肿瘤特异性启动子的合并，从而为本发明增添多元对数安全缓冲。
对于每个所选择的靶基因，本发明提供了可以进行文献检索以鉴定已经显示出调节靶基因表达和/或表现出其他优选特征(如效力、功效、结合精度和准确性)的任何市售的shRNA和siRNA编码质粒。关于这样的靶基因、siRNA和/或shRNA的其它信息可优选获自NCI的Cancer Genome Anatomy Project的RNAi网站。如果存在合适的市售的shRNA和/或siRNA编码序列，则这样的组合物或其组分可以用于本发明(假设该组合物满足其它优选标准，例如与效力、功效以及结合精度和准确性相关的那些)。
如果对于所选择的靶基因没有市售的siRNA或shRNA克隆，则可以使用容易获得的RNAi分子设计计算机程序设计适当数目的shRNA和/或siRNA，如两个、三个、四个、五个或更多个shRNA和/或siRNA。HPLC级的合成shRNA/siRNA双链体可以从许多供应商中的任一个购买，如Qiagen或IDT。
如果没有针对靶基因的市售siRNA或shRNA克隆(以及使用计算机软件设计的shRNA和/或siRNA没有证明例如所期望的功效)，可以使用“鸟枪”方法。例如，由SilereTech开发的shRNA表达克隆合成技术使得能够合成用于给定靶序列(例如靶基因)的shRNA表达载体的“鸟枪”文库。鸟枪文库提供了数千沿靶序列随机分布的RNAi候选物。从该鸟枪文库中，可鉴定具有不同效力和功效的许多shRNA表达载体。该鸟枪文库提供了不需要重复合成、测试或载体构建的代表性RNAi分子(例如，shRNA或siRNA)的丰富来源。通过适当的筛选方法，可以容易地鉴定具有期望效力和功效的shRNA和/或siRNA表达载体。
本发明提供了优选地可以将所购买、设计或以其它方式鉴定(使用上述“鸟枪”法)的shRNA和/或siRNA序列对不想要的“脱靶”效应(即结合除预期的靶基因以外的序列)进行检查。例如，可以通过针对NCBI GeneBank数据库的不相关基因序列进行BLAST搜索来分析shRNA或siRNA分子之所预测的“脱靶”效应或缺乏“脱靶”效应。
除了shRNA/siRNA介导的基因表达抑制之外，本发明提供了可以采用其它适当的方法来调节一个或更多个靶基因的表达。尽管在整个本说明书中使用shRNA/siRNA调节基因表达，但是本发明提供除了(或代替)shRNA/siRNA方法之外可以使用的此类其它适当的方法。例如，本发明提供了可以使用其它转录和/或翻译抑制剂来调节靶基因表达。转录调节剂的非限制性实例可包括螺旋-转角-螺旋、锌指、亮氨酸拉链和/或螺旋-环-螺旋蛋白质。翻译抑制剂/调节剂的非限制性实例还可以包括其他形式的反义技术，以及siRNA结合蛋白、miRNA、miRNA结合蛋白、小分子抑制剂(例如茴香霉素、放线菌酮、依米丁、三尖杉酯碱和嘌呤霉素)和类似的组合物。
本发明人还开发了新的载体驱动的shRNA技术，双功能shRNA(bi-shRNA)，以通过利用RISC加载的切割依赖性和切割非依赖性途径两者在一个预编程分子中进一步提高RNAi的效率。载体驱动的bi-shRNA包含针对每个mRNA靶序列的两个茎-环结构，一个茎-环shRNA在茎处具有完全互补性，并且第二茎-环shRNA在茎的过客链上包含错配(因而不同于现有技术的包括引导链上之错配的错配RNA)。重要的是，在并入RISC后，来源自两个结构中每一个的引导链与mRNA靶序列完全互补，但与不同的含有Ago的RISC缔合。与siRNA或常规shRNA相比，bi-shRNA设计导致更快的基因沉默起始、更高的功效和更大的持久性。目前，使用靶特异性bi-shRNA的个体化癌症治疗已转换到使用修饰的双层内陷脂质体递送载剂(vehicle)的I期临床研究中。下文提供了涉及bi-shRNA的设计、构建和实施的关键分子方法。
根据该目的和实施方案，可以使用几种不同的载体、启动子或质粒骨架和递送系统。已经发现选择具有有效转基因表达的表达载体是有用的。本发明人认识到具有强力启动子的表达载体，例如含有IE 5’UTR和部分内含子A(pUMVC3)的延伸CMV启动子比具有紧邻CMV启动子的克隆位点的那些更有效。在某些实施方案中，在茎-环结构之前具有一段前导转录本是有益的。此外，如果计划使用多于一个载体，则应事先制定有效的穿梭策略；通过PCR扩增表达盒的修饰不是那么有效。启动子的选择也很重要；RNA聚合酶III启动子在表达上强得多，但在核输出和RISC加载步骤两者中其竞争性地使内源miRNA成熟过程饱和，从而产生了在体外和体内用某些递送载剂的致死毒性。尽管RNA聚合酶II启动子的表达不太强烈，但是其有效地工作并且对于内源miRNA途径的竞争其毒性小得多。
在某些实施方案中，特别是如果使用多个动物模型系统的情况下，设计了可以在多于一种物种中起作用的序列。对于大多数靶基因，可以找到在物种之间保守的靶核苷酸段。为了找到用于敲低的既保守且最优的序列，必须将同源性匹配的序列与所选靶位点序列进行比较。
使用不同算法的公共可访问计算机程序(例如，Dharmacon RNAi设计中心(www.dharmacon.com)和IDT(www.idtdna.com))是容易获得的，并且可以用于定位所靶向基因内的合适靶位点。用大多数计算机程序的搜索通常会产生初步的第一组靶标以用于进一步分析。一些可用的出版物提供了正面和负面的建议。对每个靶序列进行BLAST搜索以分析与目的物种内其他mRNA的潜在的交叉同源性。
一旦选择了靶位点序列，则可以开始bi-shRNA的设计过程；设计过程如下所示。本发明人使用的bi-shRNA茎-环结构利用经良好分析的miR-30a骨架，尽管可以使用任何功能性miRNA骨架。bi-shRNA由在miR-30a骨架上的两个茎-环结构组成，其位置彼此紧邻，具有约10个核苷酸长的缺口。可以使用更长的核苷酸缺口，并且可以将多个单位的bi-shRNA设计为在单个转录本中串在一起，所述转录本同时靶向多个位点处的单个基因或多个不同基因。
为了构建位于表达载体的多克隆位点中的表达单元，已经开发了使用按顺序连接在一起的合成寡核苷酸的组装策略。或者，也可以将具有特定序列的基因构建体的合成外包给生物技术服务公司。对于寡核苷酸组装过程，设计和合成了重叠的DNA片段。由于在两个茎-环结构中的冗余序列，因此有必要初始连接5’片段和3’片段。然后可以在凝胶上纯化5′片段和3′片段，并进一步与中间连接片段连接。该组装过程是有效的，并且通过仔细设计，许多片段可以重复地用于不同的双功能构建体。
对于每个靶标，最好设计并构建至少三个双功能构建体以进行比较，并从中选择具有高敲低效率的构建体以用于进一步评估。可以在组织培养细胞中体外比较敲低效率。本发明人认识到，通常难以将敲低效率与内源表达的基因进行比较，因为体外转染方法具有广泛不同的效率；当转染效率低时，这特别突出，因为由于来自未转染细胞的背景噪声，难以评估该敲低。
通过bi-shRNA的靶基因敲低的效力和效率可以根据靶标和计划的应用使用多种体外和体内系统来测试。这种体外评估可以于多种培养细胞中在转染bi-shRNA表达质粒后进行。本发明人发现，当使用对照载体或通用随机序列小心控制质粒DNA的量时，通过电穿孔和通过脂质体(例如，Lipofectamine 2000)两者的转染均是高度有效的。对于Lipofectamine或相关试剂，本发明人发现反向转染方法通常比正向转染方法毒性更小。可通过用于靶基因mRNA的qRT-PCR或通过用于靶基因蛋白质的Western和/或ELISA来评估靶基因的敲低。在一种测定方法中，通过茎-环RT-PCR检测成熟shRNA的表达，在另一种测定方法中，通过5’RNA-配体介导的RACE(5’RLM-RACE)检测靶mRNA的切割。茎-环RT-PCR是依赖于所使用的特异性探针引物的敏感方法；此外，可以特异性地检测和定量过客链和引导链两者。对于bi-shRNA，该方法可以对完全互补以及错配(部分互补)过客链进行差异地评分。5’RLM-RACE方法需要将RNA寡聚体连接到切割的mRNA末端上，因此，该方法效率较低。在通常需要多轮扩增的情况下，嵌套引物(nested primer)设计对于确保特异性是必需的。
bi-shRNA的可评价功能依赖于将有效的质粒递送到靶细胞中。本发明人认识到一些体外转染系统通常不会转化到固有更复杂的体内动物模型中。有许多专门为体内全身性应用设计的递送系统。本发明人利用融合的、阳离子DOTAP：胆固醇双层内陷囊泡脂复合物(BIV)用于体内研究，并且已经成功地将其转化入临床。开发了更集中的生物分布、靶向递送和增强的细胞内摄取的修饰策略。有效的脂复合物应当使用没有任何来自宿主大肠杆菌(E.coli)污染物的质粒。虽然通常使用无内毒素质粒纯化试剂盒产生的质粒，但GLP或GMP产生的质粒更有效。不幸的是，荚膜异多糖酸和其它非内毒素相关的多糖通过阴离子交换色谱法和通过氯化铯密度梯度离心与DNA共纯化。因此，内毒素去除不能除去这些污染物，且HPLC也不能检测这些污染物。为了纠正这一点，已经开发了SupercleanTM程序以产生超高质量的质粒DNA，其不合有这些污染物，以用于体内和临床应用。脂质体制备涉及高度专业化的设备；本发明人在GMP设施中常规地产生DOTAP：胆固醇BIV。预制的脂质体可以从合作者获得或从供应商处购买。下文描述了用高质量脂质体和质粒DNA制备脂复合物的过程。脂复合物制剂可以在大多数实验室环境中实现。一旦制备脂复合物，可以通过缓慢的尾静脉注射或使用导管将制剂全身递送至实验动物。可以分别使用用于质粒DNA的PCR方法和用于成熟bi-shRNA的茎-环RT-PCR来分析靶位点载体表达。可以使用针对靶mRNA切割的5′RLM-RACE和使用针对靶蛋白质敲低的Western印迹或IHC来测定bi-shRNA功能。这些分析可以在治疗后约48小时进行。为了功效，通常需要重复递送到实验动物中；给药方案需要通过实验确定和优化。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”指多核苷酸(如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、寡核苷酸、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，以及通过连接、切断、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可以由为天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的α-对映体形式)或这两者的组合的单体构成。经修饰的核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包括例如用卤素、烷基、胺和叠氮基代替一个或更多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以用空间和电子相似的结构代替，例如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其它公知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这种键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包括与聚酰胺骨架连接的天然存在的或经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链的。
如本文所用，术语“表达载体”指编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常，表达载体包含转录启动子、基因和转录终止子。基因表达通常位于启动子的控制之下，并且这样的基因被称为“与启动子有效连接”。类似地，如果调控元件调节核心启动子的活性，则所述调控元件和核心启动子有效连接。术语“启动子”是指这样的任意DNA序列，在适当的生长条件下，与在不存在该启动子序列的情况下的转录，翻译或mRNA稳定性(mRNA的较长半衰期)相比，当其与宿主酵母细胞中的结构基因缔合时，对于该结构性基因，提高了1)转录，2)翻译或3)mRNA稳定性中的一种或更多种。
如本文所用，术语“癌基因”是指允许恶性肿瘤细胞形成和存活的基因(Bradshaw，T.K.：Mutagenesis 1,91-97(1986))。
如本文所用，术语“受体”是指结合称为“配体”的生物活性分子的细胞相关蛋白质。该相互作用介导配体对细胞的作用。受体可以是膜结合的、胞质的或核的；单体的(例如，促甲状腺激素受体、β-肾上腺素受体)或多聚体(例如，PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。膜结合受体的特征在于包含胞外配体结合结构域和通常涉及信号转导的胞内效应物结构域的多结构域结构。在某些膜结合受体中，胞外配体结合结构域和胞内效应物结构域位于包含完整功能性受体的分离的多肽中。
如本文所用，术语“杂交”是指核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何过程。
如本文所用，术语“转染”指将外来DNA引入真核细胞中。转染可以通过本领域已知的多种方式实现，包括例如磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染(lipofection)、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物射弹(biolistic)。
如本文所用，术语“双功能”是指具有两种机械作用途径的shRNA，为siRNA和miRNA的作用途径。术语“传统的”shRNA是指通过siRNA作用机制起作用的DNA转录来源的RNA。术语“双联体”shRNA是指两个shRNA，其各自作用于两种不同基因的表达，但是以“传统”siRNA的模式起作用。双功能shRNA(bi-shRNA)通过在一个预编程的分子中利用RISC加载的切割依赖性和切割非依赖性途径两者来提高RNAi的效率。载体驱动的bi-shRNA包含针对每个mRNA靶序列的两个茎-环结构，一个茎-环shRNA在茎处具有完全互补性，并且第二茎-环shRNA在茎的过客链上包含错配(从而不同于现有技术的包含引导链上之错配的错配RNA)。重要的是，在并入RISC中后，来自两个结构中每一个的引导链与mRNA靶序列完全互补，但与不同的含有Ago的RISC缔合。与siRNA或常规shRNA相比，bi-shRNA设计导致更快的基因沉默起始、更高的功效和更大的持久性。
双功能shRNA具有与由靶基因编码的mRNA转录本的至少一部分互补(优选100％互补)的第一引导链序列。本发明提供了该引导链(其最初结合于过客链以形成双链茎)包含能够结合靶基因的mRNA转录本的核酸序列，并且被呈递至切割依赖性RISC途径。本发明提供了引导链序列与mRNA转录本的这种结合以及向切割依赖性RISC途径的呈递，导致mRNA转录本降解。第二引导链序列与由靶基因编码的mRNA转录本的至少一部分至少部分互补。更具体地，第二引导链序列可以含有与由靶基因编码的mRNA转录本互补(优选100％互补)的第一部分，而引导链序列的第二部分含有与靶基因mRNA转录本的相应序列错配的某些碱基。
如本文所用，“错配的”碱基对指核酸序列内的两个含氮碱基，当彼此结合(或杂交)时所述碱基不遵循碱基配对的Chargaffs规则。Chargaffs规则规定第一核酸序列内的嘌呤腺嘌呤(A)将与第二核酸序列内的嘧啶胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))配对。此外，Chargaffs规则规定第一核酸序列内的嘌呤鸟嘌呤(G)将与第二核酸序列内的嘧啶胞嘧啶(C)配对。因此，不遵循和符合这种规则的两条链(核酸序列)之间的碱基配对将被认为是“错配的”碱基对，例如G和U、A和G、A和C、G和T、G和U等之间的配对。在其中所示的茎-环结构的双链序列内的引导链，其相对于过客链含有一个或更多个“错配的”碱基对，在双链茎序列中产生凸起。
如本文所用，术语“脂质体”指由围绕内部水性空间的脂质双层构成的封闭结构。本文所用的术语“聚阳离子”表示在同一分子中具有多个阳离子部分(如季铵基)的材料，并且包括游离碱及其可药用盐。
因此，双功能shRNA可以包含设计为进入切割依赖性RISC和切割非依赖性RISC两者并与其相互作用的shRNA。与其他目前可用的RNAi方法和组合物(包括siRNA和常规shRNA，即，设计为用于进入切割依赖性RISC或切割非依赖性RISC，但不是两者的shRNA构建体)相比，使用此类双功能shRNA实现了更高水平的基因“敲低”。
如本文所用，基因“敲低”是指有效的、定量的和持久的表达抑制。这种基因“敲低”在靶基因mRNA翻译的抑制、增加的靶细胞凋亡和/或细胞杀伤中可以被表现和/或是明显的。
如本文所用，“靶基因”指细胞中的核酸序列，其中使用双功能shRNA可以特异性且有效地调节序列的表达。在某些实施方案中，靶基因可能涉及个体癌症的生长(增殖)、维持(存活)和/或迁移(转移)行为。然而，本发明提供了靶基因可能涉及任何其他疾病或医学状况，并且不限于涉及癌症的基因。例如，靶基因可以代表研究者或临床医师希望沉默(即降低这种靶基因的表达水平)的任何序列。
载体序列可以包含启动子，其与编码双功能shRNA的序列直接或间接地有效连接(或联系)。可以基于宿主细胞和所寻求的效果来选择这样的启动子。合适的启动子的非限制性实例包括组成型和诱导型启动子，如诱导型基于RNA聚合酶II(pol II)的启动子。合适的启动子的非限制性实例还包括四环素诱导型或阻抑型启动子、基于RNA聚合酶I或III的启动子、pol II依赖性病毒启动子如CMV-IE启动子，和pol III U6和H1启动子。也可以使用噬菌体T7启动子(在这种情况下，应当理解，T7聚合酶也必须存在)。本发明不应限于使用任何单一启动子，特别是因为本发明可包含两个或更多个双功能shRNA(即效应物的组合)，包括但不限于并入的shRNA单一体(singlet)。每个并入的启动子可以控制shRNA单一体组分的一种或任何组合。
在某些实施方案中，启动子可以优先在靶细胞中具有活性，例如，可能需要使用肿瘤细胞特异性启动子优先在肿瘤细胞中表达双功能shRNA分子。将这种构建体引入宿主细胞中可以在这样的条件下完成，其中包含在双功能shRNA前体转录本内的两个或更多个RNA分子初始位于单一初级转录本内，以使得单独的RNA分子(每个包含其自身的茎-环结构)随后被内源性核糖核酸酶从此类前体转录本中切除。本发明还提供了剪接供体和接纳体(acceptor)序列可以策略性地放置在初级转录本序列内以促进剪接体介导的核加工。所得到的成熟shRNA之后可以诱导细胞中产生的靶基因mRNA转录本的降解和/或翻译抑制。或者，每个前体茎-环结构可以作为单独转录本的一部分产生，在这种情况下，每个shRNA编码序列将优选包含其自身的启动子和转录终止子序列。另外，双功能shRNA前体转录本可以位于单个初级转录本内，其任选地还包含编码编码一个或更多个功能哺乳动物蛋白质的一个或更多个mRNA序列。例如，所述一个或更多个mRNA序列可以编码已知支持患者免疫系统的某些蛋白质，或者提供将与双功能shRNA平行起作用的一些预防和/或治疗效果。
本文所述的shRNA分子的茎-环结构可以是约40至100个核苷酸长，或优选约50至75个核苷酸长。茎区长度可以是约19-45个核苷酸(或更多)，或更优选约20-30个核苷酸。茎可以包含完全互补的双链体(但是对于任何3’尾)，然而，可以存在凸起或内部环，甚至其优选在茎的任一臂上。这种凸起和不对称内部环的数目优选为数目很少(例如，1、2或3)，并且大小为约3个核苷酸或更小。末端环部分可以包含约4个或更多个核苷酸，但优选不大于约25个核苷酸。更具体地，环部分的大小优选为6-15个核苷酸。
如本文所述，双功能shRNA的茎区包含过客链和引导链，其中引导链含有与由靶基因编码的靶mRNA转录本互补的序列。优选地，仔细设计引导链和过客链的G-C含量和匹配以用于热力学上有利的链解旋活性，其具有或不具有核酸内切酶切割。此外，引导链的特异性优选通过BLAST搜索(www.ncbi.nim.nih.qov/BLAST)确认。
可以使用本文所述的方法和双功能shRNA调节多个靶基因的表达水平。例如，本发明提供了第一组双功能shRNA可以设计为包含被设计成降低第一靶基因的表达水平的序列(引导链)，而第二组双功能shRNA可以设计为包含被设计成降低第二靶基因的表达水平的序列(引导链)。不同组的双功能shRNA可以表达并存在于相同或单独的初步转录本中。在某些实施方案中，此类多重方法(即使用本文所述的双功能shRNA调节两个或更多个靶基因的表达水平)可以对患者具有增强的治疗效果。例如，如果向患者提供本文所述的双功能shRNA以治疗、预防或减轻癌症的影响，则可能需要为患者提供两种或更多种类型的双功能shRNA，其被设计为降低与患者癌症有关的多个基因的表达水平。
在某些实施方案中，本发明还提供双功能shRNA序列可以包含天然存在的miRNA(例如miR-30、秀丽隐杆线虫(C.elegans)let-7和/或lin-4)的茎序列。虽然例如miR-30环的存在可能是期望的，但是本发明提供了可以容忍该结构的变体，其中可以使用与例如miR-30序列的同一性大于72％，优选大于79％，更优选大于86％，最优选大于93％的环(使用例如BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，用于Unix的第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575 ScienceDrive，Madison，Wis.53711)的公知计算机程序确定)。
可以使用本领域公知的多种技术和递送载剂中的任一种将编码双功能shRNA的前体序列(或构建体)引入宿主细胞中。例如，可以以包含一个或更多个构建体的病毒载体进行感染，其中这样的病毒载体优选包括复制缺陷型逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关载体、慢病毒载体或麻疹载体。此外，可以使用包含一个或更多个构建体的质粒进行转染。这样的质粒可以以裸DNA存在，或者可以与例如脂质体(例如免疫脂质体)联合存在。此外，递送载剂可以由免疫脂复合物、靶向的纳米颗粒、靶向的脂质体、环糊精、纳米颗粒、适配体、树枝状聚合物、壳聚糖、或其聚乙二醇化衍生物组成。递送载剂的性质可以根据靶宿主细胞而变化。
根据靶组织，可以使用多种技术中的任一种来进行双功能shRNA编码构建体的体内递送。递送可以例如通过直接注射、吸入、静脉内注射或其它物理方法(包括通过微弹(micro-projectile)靶向组织的可见和可接近区域(例如，用裸DNA))实现。如果适当，还可以通过注射器针头、套针、套道、导管等来实现施用。
除了使用本文所述的双功能shRNA的方法，还提供了shRNA本身。因此，另外的方面包括核酸序列，其可以包含单个连续序列或多个不同序列，其单独地或共同地编码两个或更多个RNA分子。根据这样的实施方案，第一RNA分子将包含双链序列，其包含与由靶基因编码的mRNA转录本的一部分互补的引导链序列，而第二RNA分子包含第二双链序列，其包含与这样的mRNA转录本的一部分部分互补的第二引导链序列。优选地，第二RNA分子的第二引导链序列包含与由靶基因编码的mRNA转录本的核酸序列错配的一个或更多个碱基。根据另一些方面，提供了包含核酸序列的表达载体，并且其可以用于实施本文所述的方法并表达双功能shRNA。
另外，本文描述了使用核酸序列和双功能shRNA的方法以预防、治疗和/或减轻一种或更多种医学状况(包括但不限于各种类型的癌症)的作用。例如，本发明提供了本文所述的双功能shRNA可用于降低涉及癌细胞生长、存活和/或转移的一个或更多个靶基因的表达水平。例如，如下文实施例中所证明的，双功能shRNA可用于降低编码骨架蛋白的某些靶基因的表达水平，已发现所述骨架蛋白在癌细胞中过表达。这种靶基因的非限制性实例包括K-ras。
RNA干扰：将人工双链小干扰RNA(siRNA)引入动物和植物细胞中可以诱导具有互补序列的靶mRNA分子的降解；该过程称为RNA干扰(RNAi)(Shard 2001；Hutvagner和Zamore2002；Zamore 2002)(参见美国专利号6,506,559)。RNAi已经作为有用的实验工具出现，其具有治疗应用的巨大潜力(Fire，Xu等1998；Hammond，Bernstein等2000；Elbashir，Harborth等2001；Senzer，Rao等2009；Wang Z 2011)。然而，在哺乳动物细胞中，使用shRNA的RNAi诱导需要进行RNA寡核苷酸的转染，其受到载剂分解时间和siRNA生物半衰期的限制，在有效沉默的持续时间方面可能是低效的。尽管有这些限制，在最近的临床I期研究的早期结果公开中，Davis和同事已经通过经聚乙二醇化、转铁蛋白装饰、靶向核糖核苷酸还原酶M2亚基(RRM2)的基于环糊精之siRNA的全身性递送令人信服地证明了靶特异性沉默和位点特异性切割(CALAA-01)(Davis，Zuckerman等2010)。三个经报告患有组织活检可及的黑素瘤(biopsy accessible melanoma)之根据剂量递增I期研究进行治疗的患者，在21天循环中的第1、3、8和10天通过静脉内输注接受18、24或30mg/m2的CALAA-01。在每个患者循环1的最终剂量后，以及在以30mg/m2治疗的患者的循环1之后的1个月(循环2开始之前)和循环2的最终剂量的当天，进行自愿的组织活检，并与存档的肿瘤比较。RRM2 mRNA的降低通过qRT-PCR比较30mg/m2的循环2之后和循环2之前的组织样品得到确认。在相同的患者中，在循环1前和循环1后免疫组化学和Western印迹示出MMR2蛋白降低五倍。5’-RLM-RACE(5’-RNA-连接酶介导的互补DNA末端的快速扩增)确认了所预测的切割位点，支持所提出的作用机制。这首次在人中证明靶向的肿瘤细胞进入(使用透射电子显微术)和随着全身递送之后所预测的位点特异性siRNA切割的mRNA与蛋白质表达的降低导致了对RNAi的翻译应用的推动的增加。
siRNA需要化学修饰以提高血清稳定性、细胞摄取和作用持续时间。或者，siRNA可以构建为短发夹RNA(shRNA)。shRNA由可从在质粒构建体上的RNA聚合酶III(或不常使用的RNA聚合酶II)启动子在细胞中转录的茎-环结构组成(Miyagishi和Taira 2002；Yu，DeRuiter等2002)。独立于染色体的质粒的shRNA的组成型表达提供了优于合成siRNA的优势。shRNA表达单元可以并入用于细胞内递送和核输入的多种质粒和病毒载体中。此外，还可以调控或诱导基于载体的shRNA表达(Gossen和Bujard 1992；Gupta，Schoer等2004；Dickins，Hemann等2005)。与合成的siRNA相反，shRNA在细胞核中合成，然后被加工并转运到细胞质以并入RNA诱导沉默复合物(RISC)中从而具有活性(Cullen 2005)。为了有效，shRNA必须被设计为利用内源细胞微小RNA的生物发生机制。
双功能shRNA：如上所述，RNA干扰(RNAi)是能够抑制转录、转录后和翻译机制从而调节基因表达的天然细胞调控过程。使用miR30-骨架，本发明人开发了“双功能”RNAi策略，通过同时诱导翻译抑制和[GW182介导的]p小体中的螯合(作为保持储库或促进脱帽、去腺苷化和mRNA降解)(切割非依赖性)以及转录后mRNA mRNA切割(切割依赖性)，证明其更有效地沉默靶基因表达(Rao D 2010)。
本发明人开发了新的双功能shRNA(bi-shRNAi)RNA干扰(RNAi)技术。Bi-shRNAi允许含有RISC(RNA诱导沉默复合物)加载的程序化核酸内切酶和非核酸内切酶Argonaute(Ago)同时影响mRNA切割、降解和翻译抑制，从而导致比其他RNAi介体更高的效力和经过更长的持续时间。为了探索bi-shRNAi在KRAS突变体选择性敲低的潜力，建立了体外双荧光素酶报道子测定系统，以在相同测定环境中系统地比较突变等位基因和野生型等位基因的敲低活性。本发明包括对用于治疗例如胰腺导管腺癌(PDAC)的G12D、G12V、G12R和G12C具有特异性的治疗剂的开发。
在引导链的每个位置具有单核苷酸突变之靶向G12D的一系列bi-shRNA表达载体构建体中，发现了通过在2-4位上放置突变核苷酸所产生的突变等位基因的最突出敲低活性。通过检查在引导链其他位置处的额外错配的敲低效应，确定该过程是序列特异性的。针对G12V、G12R和G12C突变制备了类似的构建体，并且它们在其各自的靶突变等位基因的敲低中是有效的。G12R特异性构建体与G12C突变体交叉反应。
使用HEK-293细胞(wt/wt)、PANC-1细胞(wt/G12D等位基因)和MiaPaCa2细胞(wt/G12C等位基因)将本发明的构建体与KRAS敲低的对照载体进行比较。G12D和G12C选择性bi-shRNA表达载体未降低HEK-293中的KRAS表达，与PANC-1细胞和MiaPaCa2细胞中KRAS表达的降低相反。发现例如具有能够敲低G12D、G12V、G12R和G12C的多聚体bi-shRNA单元的单一表达构建体将在体外和体内测试其有效性和特异性。
KRAS(Kirsten-ras)癌基因在显着比例的胰腺导管腺癌(PDAC)、结肠直肠和非小细胞肺癌(NSCLC)中突变(Downward J，Nat Rev Cancer.2003；3：11-22)。在大多数(70％-90％)携带KRAS突变的PDAC患者中，五年存活率小于5％(Saif MW等，World JGastroenterol.2007；13；4423-4430)。KRAS是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白家族的成员，并且是多种细胞内信号转导通路(包括表皮生长因子受体(EGFR))的必需组分。KRAS中的绝大多数突变是导致在密码子12或13处的单个氨基酸替换的单核苷酸体细胞突变。G12D、G12V、G12R和G12C KRAS突变包含＞90％的在PADC患者中发现的KRAS突变(COSMIC数据库，www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)。KRAS突变基本上导致组成型活性的KRAS和不受调控的下游信号转导(Schubbert S，等Nat Rev Cancer.2007；7：295-308)。此外，靶向剂例如抗体西妥昔单抗(在结肠直肠癌中)和小分子抑制剂维罗非尼(在BRAF突变体黑素瘤中)在具有KRAS突变的患者中表现不佳(Karapetis CS，等，N Engl J Med 2008；259(17)：1757-1765)。因此，有效的癌症治疗策略需要KRAS突变选择性不影响野生型功能。本发明人最近开发了新的双功能shRNA RNA干扰(bi-shRNAi)技术。Bi-shRNAi允许程序化的含有RISC(RNA诱导沉默复合物)加载的核酸内切酶和非核酸内切酶Argonaute蛋白(Ago)同时影响mRNA切割、降解和翻译抑制，从而导致比其他RNAi介体更高的效力和经过更长的持续时间。
本发明人靶向作为关键的致癌核受体辅激活物的SRC-3；核激素受体辅激活物是核受体作为转录因子起作用和作为决定对类固醇激素的生物学相应的幅度的变阻器(rheostat)起关键作用所需的；在乳腺癌1中扩增的类固醇受体辅激活物-3(SRC-3)的过表达涉及广泛范围的癌症，并且常常在激素依赖性癌症如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和前列腺癌，以及其他癌症包括胰腺癌、食管癌、鼻咽癌、膀胱上皮癌和结肠直肠癌中以高百分比过表达。在首次表征的乳腺癌和卵巢癌中，SRC-3基因在约10％的乳腺癌中扩增，其mRNA在约64％的时间内过表达；并且SRC-3的升高表达也与对他莫昔芬治疗的抗性和不良的疾病结果相关。
SRC-3在美国每年在估计的322,000个新癌症病例和91,000个癌症死亡中过表达，并且SRC-3的实验性靶向限制了乳腺癌细胞生长并恢复SERM阻断癌细胞生长的能力；siRNA介导的BT-474乳腺癌细胞中SRC-3表达的破坏恢复了4-羟基他莫昔芬的生长抑制作用；siRNA介导的SRC-3表达的破坏也损害多种细胞系中的表皮生长因子(EGF)活性；并且SRC-3的siRNA靶向导致E2F的转录活性降低，从而损害了对于进入S期重要的基因的表达。
SRC-3的过表达促进前列腺癌细胞生长，而在SRC-3敲除小鼠中，AKT信号转导被下调；并且过表达SRC-3的转基因小鼠发生自发性恶性乳房肿瘤；相反，SRC-3敲除小鼠对化学致癌物诱导和病毒诱导的乳房肿瘤发生具有抗性；此外，SRC-3-/-小鼠对诱导的前列腺癌进展有抗性。本发明人还理解，许多晚期激素难治性乳腺癌停止表达ERα，并且降低SRC-3细胞蛋白质浓度的药剂更具包容性并且能够在ERα阳性或阴性乳腺癌中起抗癌剂的作用。
设计为靶向SRC-3、EGFR和突变体KRAS(G12C)的多靶向bishRNA可以减弱肺癌细胞生长。图1示了使用设计为靶向SRC-3、EGFR和突变体KRAS(G12C)的多靶向bishRNA可以减弱肺癌细胞生长的结果。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，将表达SRC-3、EGFR和KRAS突变体形式(G12C)的H358肺癌细胞系用靶向这三种癌基因的两种不同的三重靶向bishRNA(pGBI-160或pGBI-161)瞬时转染，或仅转染对照脂复合物(lipo)。在第1、2和3天使用比色MTS测定来测定细胞增殖，且以在转染当天(第0天)测定的MTS值归一化。在第4天，收获细胞并通过Western印迹分析评估SRC-3敲低的程度。
材料和方法：H358肺癌细胞：H358肺癌细胞获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)(Manassas，VA)。将细胞维持在补充有10％胎牛血清、青霉素和链霉素(100U/ml)的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′s modifiedEagle′s medium，DMEM)中，并在37℃，5％CO2下培养。
细胞生长测定：将上述所有细胞系接种在96孔板中，并用与Lipofectamine 2000复合的bishRNA载体处理或仅用Lipofectamine 2000处理作为对照。一天、两天或三天后，使用MTS测定(Promega)根据制造商的说明书测定细胞生长。
图2示出了本发明的一个构建体：pGBI-160。
三重靶向bi-shRNA，靶向KRAS G12C突变、SRC-3和EGFR。Bi-shRNA序列为大写字母，pUMVC3序列为小写字母。
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactccaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgTCGACAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCACCTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTTGTGGTAGTTGGAGCTTGTGATATGTGCATCTACAAGCTCCAACTACCACACATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCTGTGGTAGCAAGAGCTAGTAGTGAAGTAGATTAGCATCTACAAGCTCCAACTACCACACATAAGAAGTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAATAGTTTTTGTTTGCAGTCCTCTGTTGGAAATGAGATGACAGTATAGAAGAATGTAGTATACTGTCATCTCATTTCCTGGTGGCCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCTGCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGTAGCACGGAAATGATGCGACACTATGTGTTTAGTTATCTATACTGTCATCTCATTTCCTACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGTTCACCTGCGTGAAGAAGTGTTGTGTGATATTCTGCACACTTCTTCACGCAGGTGCTGTGGTAGTGAAAAGTCTGTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCCTTTCTACACCACCTGCGACTAGAAGAGTGTGTTTCTGTATGGACACTTCTTCACGCAGGTGTGAGTTTGGTGGGGATTGTGACCAGAAGATTTTGAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCGCggccgcggatccAgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccattcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactcggggggggggggcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttccccccccccccattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcagattggctat(SEQ IDNO：：1).
双功能序列106
TCGACAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCACCTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTTGTGGTAGTTGGAGCTTGTGATATGTGCATCTACAAGCTCCAACTACCACACATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCTGTGGTAGCAAGAGCTAGTAGTGAAGTAGATTAGCATCTACAAGCTCCAACTACCACACATAAGAAGTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAATAGTTTTTGTTTGCAGTCCTCTGTTGGAAATGAGATGACAGTATAGAAGAATGTAGTATACTGTCATCTCATTTCCTGGTGGCCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCTGCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGTAGCACGGAAATGATGCGACACTATGTGTTTAGTTATCTATACTGTCATCTCATTTCCTACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGTTCACCTGCGTGAAGAAGTGTTGTGTGATATTCTGCACACTTCTTCACGCAGGTGCTGTGGTAGTGAAAAGTCTGTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCCTTTCTACACCACCTGCGACTAGAAGAGTGTGTTTCTGTATGGACACTTCTTCACGCAGGTGTGAGTTTGGTGGGGATTGTGACCAGAAGATTTTGAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCGC(SEQ ID NO：：2).
图3示出了本发明的一个构建体：pGBI-161。
三重靶向bi-shRNA，靶向EGFR、KRAS G12C突变和SRC-3。Bi-shRNA序列为大写字母，pUMVC3序列为小写字母。
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactccaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgTCGACAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCACCTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTCACCTGCGTGAAGAAGTGTGATATGTGCATCTACACTTCTTCACGCAGGTGCATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCCACCTGCGACTAGAAGAGTAGTGAAGTAGATTAGCATCTACACTTCTTCACGCAGGTGCATAAGAAGTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAATAGTTTTTGTTTGCAGTCCTCTGTTTGTGGTAGTTGGAGCTTGTAGAAGAATGTAGTACAAGCTCCAACTACCACATGGTGGCCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCTGCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGTAGCACTGTGGTAGCAAGAGCTAGTGTGTTTAGTTATCTACAAGCTCCAACTACCACATACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGTTGGAAATGAGATGACAGTATTGTGTGATATTCTGCATACTGTCATCTCATTTCCCTGTGGTAGTGAAAAGTCTGTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCCTTTCTACACGGAAATGATGCGACACTATGTGTTTCTGTATGGATACTGTCATCTCATTTCCTGAGTTTGGTGGGGATTGTGACCAGAAGATTTTGAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCGCggccgcggatccagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccattcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactcggggggggggggcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttccccccccccccattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcagattggctat(SEQ IDNO：：3).
双功能序列161：
TCGACAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCACCTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTCACCTGCGTGAAGAAGTGTGATATGTGCATCTACACTTCTTCACGCAGGTGCATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCCACCTGCGACTAGAAGAGTAGTGAAGTAGATTAGCATCTACACTTCTTCACGCAGGTGCATAAGAAGTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAATAGTTTTTGTTTGCAGTCCTCTGTTTGTGGTAGTTGGAGCTTGTAGAAGAATGTAGTACAAGCTCCAACTACCACATGGTGGCCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCTGCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGTAGCACTGTGGTAGCAAGAGCTAGTGTGTTTAGTTATCTACAAGCTCCAACTACCACATACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGTTGGAAATGAGATGACAGTATTGTGTGATATTCTGCATACTGTCATCTCATTTCCCTGTGGTAGTGAAAAGTCTGTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCCTTTCTACACGGAAATGATGCGACACTATGTGTTTCTGTATGGATACTGTCATCTCATTTCCTGAGTTTGGTGGGGATTGTGACCAGAAGATTTTGAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCGC(SEQ ID NO：：4).
KRAS(Kirsten-ras)癌基因在显著比例的胰腺导管腺癌(PDAC)，结肠直肠和非小细胞肺癌(NSCLC)中突变。在大多数(70％-90％)携带KRAS突变的PDAC患者中，五年存活率小于5％(Saif MW等，World J Gastroenterol.2007；13；4423-4430)。KRAS是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白家族的成员，并且是多种细胞内信号转导通路(包括表皮生长因子受体(EGFR))的必需组分。KRAS中的绝大多数突变是导致在密码子12或13处的单个氨基酸替换的单核苷酸体细胞突变。G12D、G12V、G12R和G12C KRAS突变包含＞90％的在PADC患者中发现的KRAS突变。KRAS突变基本上导致组成型活性KRAS和不受调控的下游信号转导。此外，靶向剂如抗体西妥昔单抗(在结肠直肠癌中)和小分子抑制剂维罗非尼(在BRAF突变体黑素瘤中)在具有KRAS突变的患者中表现不佳。因此，有效的癌症治疗策略需要KRAS突变选择性不影响野生型功能。本发明人最近开发了新的双功能shRNA RNA干扰(bi-shRNAi)技术。Bi-shRNAi允许程序化的含有RISC(RNA诱导沉默复合物)加载的核酸内切酶和非核酸内切酶Argonaute蛋白(Ago)同时影响mRNA切割、降解和翻译抑制，从而导致比其他RNAi介体更高的效力和经过更长的持续时间。为了探索bi-shRNAi在KRAS突变体选择性敲低中的潜力，建立了体外双荧光素酶报道子测定系统，以在相同测定环境中系统地比较突变等位基因和野生型等位基因的敲低活性。该项目的目标是开发特异性靶向G12D、G12V、G12R和G12C突变等位基因的单一治疗剂以用于治疗PDAC。
siRNA区分因单个核苷酸而不同的基因，以用于等位基因特异性敲低，其已被系统性地分析。已经报道了对于单个G12C、G12D或G12VKRAS突变，等位基因特异性基因对KRAS突变的沉默。然而，没有报道尝试用单一试剂实现多个KRAS突变体的敲低。本发明包括影响PDAC的四个关键KRAS突变体之mRNA和蛋白质表达敲减组合的多聚体方法。以下是可以与本发明一起使用的特异性插入片段的实例，以靶向作为所教导的多聚体一部分的K-RAS。本发明包括这些插入片段，例如，每个插入片段可以靶向k-ras mRNA内的相同突变，或者可以靶向不同的K-RAS突变，或其组合。在插入片段为三聚体的情况下，一个或更多个RNAi靶向插入片段可以是标准shRNA或RNAi插入片段，或者一个或更多个RNAi靶向插入片段可以是bi-shRNA，或其组合，每个靶向k-ras mRNA的相同部分或者相同突变或不同突变的不同部分。以下是可以靶向K-RAS不同突变体的插入片段的非限制性实例。
(SEQ ID NO：5)G12D，2位。下划线为miR-30a骨架序列
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGTTGGAGCTGATTAGTGAAGCCACAGATGTAATCAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGGAAGAGATGATTAGTGAAGCCACAGATGTAATCAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：6)G12D，3位。下划线为miR-30a骨架序列
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTGATGTAGTGAAGCCACAGATGTACATCAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTCTTAGCTAATGTAGTGAAGCCACAGATGTACATCAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：7)G12D，4位。下划线为miR-30a骨架序列
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTGGAGCTGATGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCATCAGCTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTACTGCTAATGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCATCAGCTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：8)G12D，5位。下划线为miR-30a骨架序列
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGGTAGTTGGAGCTGATGGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCATCAGCTCCAACTACCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGGTAGTTGTCTCTGATAGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCATCAGCTCCAACTACCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：9)G12D，6位。下划线为miR-30a骨架序列
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGTGAAGCCACAGATGTACGCCATCAGCTCCAACTACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGTGAAGCCACAGATGTACGCCATCAGCTCCAACTACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：10)G12D，7位。下划线为miR-30a骨架序列
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTTGGAGCTGATGGCGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACGCCATCAGCTCCAACTAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTTGGATGAGATGACGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACGCCATCAGCTCCAACTAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：11)G12D，8位。下划线为miR-30a骨架序列
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCAGTTGGAGCTGATGGCGTATAGTGAAGCCACAGATGTATACGCCATCAGCTCCAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCAGTTGGAGACTATGGAGTATAGTGAAGCCACAGATGTATACGCCATCAGCTCCAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：12)G12D，9位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGGAGCTGATGGCGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTTGAAGCACGTGGTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：13)G12D，10位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTGATGGCGTAGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTTGGAGCTATAGGTCTAGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：14)G12D，11位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCtggagctgAtggcgtaggcTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCtggagctgTATgcgtTCgcTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：15)G12D，9位，修饰4(mod 4)。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCgttggagctgAtggcgtagTAGTGAAGCCACAGATGTACTATGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCgttgaagcACGtgGTgtagTAGTGAAGCCACAGATGTACTATGCCATCAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：16)G12D，10位，修饰5。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCttggagctgAtggcgtaggTAGTGAAGCCACAGATGTACCTATGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCttggagctATAggTCtaggTAGTGAAGCCACAGATGTACCTATGCCATCAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：17)G12D，11位，修饰6。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCtggagctgAtggcgtaggcTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTATGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCtggagctgTATgcgtTCgcTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTATGCCATCAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：18)G12D，9位，修饰10。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCgttggagctCAtggcgtagTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCCATGAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCgttgaagcACGtgGTgtagTAGTGAAGCCACAGATGTACTACGCCATGAGCTCCAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：19)G12D，10位，修饰11。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCttggagctCAtggcgtaggTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGCCATGAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCttggagctATAggTCtaggTAGTGAAGCCACAGATGTACCTACGCCATGAGCTCCAAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：20)G12D，11位，修饰12。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTCATGGCGTAGGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACGCCATGAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGAGCTGTATGCGTTCGCTAGTGAAGCCACAGATGTAGCCTACGCCATGAGCTCCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：21)G12V，3位置。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTGTTGTAGTGAAGCCACAGATGTACAACAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTCTTAGCTATTGTAGTGAAGCCACAGATGTACAACAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：22)G12V，4位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTGGAGCTGTTGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCAACAGCTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGGTAGTTACTGCTATTGGTAGTGAAGCCACAGATGTACCAACAGCTCCAACTACCAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：23)G12R，3位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGTTGGAGCTCGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACGAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGACTGAGCTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACGAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：24)G12R，4位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTCGTGTAGTGAAGCCACAGATGTACACGAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTACTAGCTAGTGTAGTGAAGCCACAGATGTACACGAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：25)G12C，3位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGTTGGAGCTTGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACAAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTGTGGTAGACTGAGCTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACAAGCTCCAACTACCACAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
(SEQ ID NO：26)G12C，4位。
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTTGGAGCTTGTGTAGTGAAGCCACAGATGTACACAAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGTGGTAGTCTTAGCTTATGTAGTGAAGCCACAGATGTACACAAGCTCCAACTACCACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC
SRC-3 bishRNA I40(SEQ ID NO：27)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTATTGTATCTATATTGACAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTATTGTATCTATATTGA CAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC.双下划线序列区对应于有义序列(核苷酸1090-1108)，其中下划线区对应于反义序列。
SRC-3 bishRNA I41(SEQ ID NO：28)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAT TTCGGAAGAGTTTGCTTTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTATTTCGGAAGAGTTTGCTTTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC.双下划线序列区对应于有义序列(核苷酸1304-1322)，其中下划线区对应于反义序列。
SRC-3 bishRNA I42(SEQ ID NO：29)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTATT GTATCTATATTGACAACGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAACTGACCTGGTTCTTCCTCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC.双下划线序列区对应于有义序列，其中下划线区对应于反义序列。
SRC-3 bishRNA I43(SEQ ID NO：30)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTATT TCGGAAGAGTTTGCTTTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAACTGACCTGGTTCTTCCTCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC.双下划线序列区对应于有义序列，其中下划线区对应于反义序列。
SRC-3 bishRNA I44(SEQ ID NO：31)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAT ATTGCTCTACCATATAGGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTATATTGCTCTACCATATAGGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC.双下划线序列区对应于有义序列，其中下划线区对应于反义序列。
SRC-3 bishRNA I45(SEQ ID NO：32)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAA TACTGTCATCTCATTTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAATACTGTCATCTCATTTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC.双下划线序列区对应于有义序列(核苷酸1090-1108)，其中下划线区对应于反义序列。
SRC-3 bishRNA I46(SEQ ID NO：33)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAATATTCCTGTACCTTCCATGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAATATTCCTGTACCTTCCATGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC.双下划线序列区对应于有义序列(核苷酸1684-1702)，其中下划线区对应于反义序列。
SRC-3 bishRNA I47(SEQ ID NO：34)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAA TGATATGAATTCCCATGAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAATGATATGAATTCCCATGAGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC双下划线序列区对应于有义序列(核苷酸1331-1349)，其中下划线区对应于反义序列。
SRC-3 bishRNA I48(SEQ ID NO：35)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAT ACTGTTTCTGATTGGTGGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTATACTGTTTCTGATTGGTGGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC.双下划线序列区对应于有义序列(核苷酸2791-2809)，其中下划线区对应于反义序列。
SRC-3 bishRNA I49(SEQ ID NO：36)：
TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAGGCTCTATCAATCTCCTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCTAGTGAAGCCACAGATGTAGGCTCTATCAATCTCCTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC.双下划线序列区对应于有义序列(核苷酸3361-3381)，其中下划线区对应于反义序列。
乳腺癌，构建体。产生以下构建体：产生PI3K E545K+SRC-3+ER-α(NR3A1)靶向载体。
图4示出pGBI-162的载体图：其中插入片段包含针对PI3K E545K+SRC-3+ER-α(NR3A1)靶向载体的RNAi，如下所述。
P13K E545K：
AAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGA SEQ ID NO：37
有义：5’TCTCTCTGAAATCACTAAG 3’SEQ ID NO：38
反义：5’CTTAGTGATTTCAGAGAGA 3’SEQ ID NO：39
bi-shRNA-NCOA3-5(pGBI-48)3’UTR区
有义序列：5’GGAAATGAGATGACAGTAT 3’SEQ ID NO：40
反义序列：5’ATACTGTCATCTCATTTCC 3’SEQ ID NO：41
雌激素受体1α：
有义：5’CCAGTGCACCATTGATAAA 3’SEQ ID NO：42
反义：5’TTTATCAATGGTGCACTGG3’SEQ ID NO：43
插入序列：如上所述，插入片段加粗(PI3K-E545K)、斜体(NCOAA3-5)或加下划线(ER1α)。
图5示出了pGBI-162：pGBI-163的载体图：SRC-3+ER-α(NR3A1)+PI3K E545K靶向载体：
bi-shRNA-NCOA3-5(pGBI-48)：3’UTR区
有义序列：5’GGAAATGAGATGACAGTAT 3’SEQ ID NO：40
反义序列：5’ATACTGTCATCTCATTTCC 3’SEQ ID NO：41
雌激素受体1α：
有义：5’CCAGTGCACCATTGATAAA 3’SEQ ID NO：42
反义：5’TTTATCAATGGTGCACTGG3’SEQ ID NO：43
PI3K E545K：
AAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGA SEQ ID NO：37
有义：5’TCTCTCTGAAATCACTAAG 3’SEQ ID NO：38
反义：5’CTTAGTGATTTCAGAGAGA3’SEQ ID NO：39
插入序列：如上所述，插入片段加粗(NCOA3-5)、斜体(ER1α)或加下划线(PI3K-E545K)。
pGBI-162：完整序列，插入片段为大写
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactccaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgTCGACAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCACCTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTTCTCTCTGAAATCACTAAGGATATGTGCATCTCTTAGTGATTTCAGAGAGACATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCTCTCTCTGCTGTCACTTAGAGTGAAGTAGATTAGCATCTCTTAGTGATTTCAGAGAGACATAAGAAGTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAATAGTTTTTGTTTGCAGTCCTCTGTTGGAAATGATGCGACACTATAGAAGAATGTAGTATACTGTCATCTCATTTCCTGGTGGCCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCTGCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGTAGCACGGAAATGAGATGACAGTATGTGTTTAGTTATCTATACTGTCATCTCATTTCCTACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGTTCCAGTGCACCATTGATAAATGTGTGATATTCTGCTTTATCAATGGTGCACTGGCTGTGGTAGTGAAAAGTCTGTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCCTTTCTACACCCAGTGCATGCTTGATAAAGTGTTTCTGTATGGTTTATCAATGGTGCACTGGTGAGTTTGGTGGGGATTGTGACCAGAAGATTTTGAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCGCGGCCGCGGATCCAgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccattcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactcggggggggggggcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttccccccccccccattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcagattggctat SEQ IDNO：46
pGBI-163：完整序列 完整序列，插入片段为大写
tggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtgacgtaagtaccgcctatagactctataggcacacccctttggctcttatgcatgctatactgtttttggcttggggcctatacacccccgcttccttatgctataggtgatggtatagcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactccaacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagacataatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcgTCGACAATTATCTATTTCAAATTTAGCAGGAAAAAAGAGAACATCACCTTGTAAAACTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTGGAAATGATGCGACACTATGATATGTGCATCTATACTGTCATCTCATTTCCCATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAGCCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCGGAAATGAGATGACAGTATAGTGAAGTAGATTAGCATCTATACTGTCATCTCATTTCCCATAAGAAGTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAATAGTTTTTGTTTGCAGTCCTCTGTTCCAGTGCACCATTGATAAAAGAAGAATGTAGTTTTATCAATGGTGCACTGGTGGTGGCCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAATTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCTGCCTGGTCTATCTGATGTGACAGCTTCTGTAGCACCCAGTGCATGCTTGATAAAGTGTTTAGTTATCTTTTATCAATGGTGCACTGGTACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTTACTGAACACTGTTCTATGGTTTCTCTCTGAAATCACTAAGTGTGTGATATTCTGCCTTAGTGATTTCAGAGAGACTGTGGTAGTGAAAAGTCTGTAGAAAAGTAAGGGAAACTCAAACCCCTTTCTACACTCTCTCTGCTGTCACTTAGGTGTTTCTGTATGGCTTAGTGATTTCAGAGAGATGAGTTTGGTGGGGATTGTGACCAGAAGATTTTGAAAATTAAATATTACTGAAGATTTCGACTTCGCGGCCGCGGATCCAgatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccattcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactcggggggggggggcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttccccccccccccattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcagattggctat SEQ IDNO：47
EGFR靶标基于人(Homo sapiens)表皮生长因子受体(EGFR)，转录本变体1，mRNA，NCBI参照序列：NM_005228.3。
EGFR靶序列：5’CACCTGCGTGAAGAAGTGT 5’SEQ ID NO：48
EGFR靶引导链：5’ACACTTCTTCACGCAGGTG 3’SEQ ID NO：49
靶向SRC-3的双功能shRNA的非限制性实例是高度有效的并且具有在显著低于常规shRNA或siRNA的浓度下产生RNAi的优点。本发明人开发了bishRNA以最佳地靶向SRC-3以降低其表达。图5示出进行细胞生长测定以检查SRC-3和SRC-1 bi-shRNA载体阻断乳腺癌细胞生长的能力。用SRC-1和SRC-3 bio-shRNA载体转染MCF-7细胞，并在四天后(图6A和6B)通过MTT测定测量它们对细胞增殖的作用。与阴性对照(siGFP)相比，所有SRC靶向载体能够有效地降低细胞生长。类似地，在用SRC-1和SCR-3 bi-shRNA载体转染的MDA-MB-231细胞上也观察到生长的抑制。这些结果证实基于bi-shRNA的SRC-1和SRC-3靶向可以在体外减少乳腺癌细胞生长。
图6A是示出生长变化的图，且图6B是印迹，其示出了使用本发明的图5和6所示的构建体对MCF-7乳腺癌细胞系获得的结果，所述构建体即：pGBI-162：PI3K E545K+SRC-3+ER-α(NR3A1)靶向载体和pGBI-163：SRC-3+ER-α(NR3A1)+PI3K E545K靶向载体。
表1.用于多聚靶向载体的另外的shRNA靶向序列
预期本说明书中讨论的任何实施方案可以对于本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
应当理解，本文所述的具体实施方案通过举例说明的方式示出，而不作为对本发明的限制。在不脱离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于多个实施方案中。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的具体方法的许多等同方案。这样的等同方案被认为处于本发明的范围内并且被权利要求所覆盖。
说明书中提及的所有出版物和专利申请都代表本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，词语“一个/种”的使用可以意指“一个/种”，但是它也与“一个/种或更多个”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。除非明确指示仅指代替代方案，或者替代方案是互相排斥的，否则权利要求中术语“或”的使用用于意指“和/或”，尽管本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括用于确定该值的方法、装置之误差的固有变化或存在于研究对象之间的变化。
如在本说明书和权利要求中所使用，词语“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
如本文所使用的术语“或其组合”是指在术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一个，并且如果顺序在特定上下文中重要，则也指BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，其明确包括含有一个或更多个项目或术语的重复的组合(如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等)。技术人员将理解，除非从上下文中明显，否则通常对于任何组合中的项目或术语的数量没有限制。
如本文所使用，表示大约的词，例如但不限于“约”、“基本上”或“基本上地”是指这样的情况：当这样修饰时，应当理解其不一定是绝对的或完全的，而被认为对于本领域普通技术人员足够接近以保证指定该条件存在。该描述可以变化的程度将取决于可以进行多大的改变，并且仍然使本领域普通技术人员认识到所修改的性质仍然具有未修改性质的所需特征和能力。一般来说，但是受到前述讨论的约束，本文中通过表示大约的词(如“约”)修饰的数值可以与所述值至少相差±0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15％。
根据本公开内容，可以制备和执行本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法而无需过度实验。虽然已经根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以将变化应用于本文所述的组合物和/或方法以及步骤或方法之步骤的顺序。对于本领域技术人员明显的是，所有这些类似的替代和修改都被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (43)

1.能够降低三个或更多个基因表达的双功能shRNA组合物，其包含：
降低第一靶基因的表达的第一双功能RNA分子；
降低第二靶基因的表达的第二双功能RNA分子；和
降低第三靶基因的表达的第三双功能RNA分子，其中每个所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平。
2.权利要求1所述的双功能shRNA，其中每个所述双功能shRNA剪接入载体中。
3.权利要求1所述的双功能shRNA，其中所述组合物进一步限定为由SEQ ID NO：1、3、42或43所限定的载体。
4.权利要求1所述的双功能shRNA，其中所述双功能shRNA包含至少一个由SEQ ID NO：2、4、40或41所限定的核酸序列。
5.权利要求1所述的双功能shRNA，其中所述第一双功能RNA的至少一个靶位点选择性地靶向突变KRAS基因，所述突变KRAS基因进一步限定为具有G12C、G12D、G12V或G12R突变中至少一种的人KRAS基因。
6.权利要求1所述的双功能shRNA，其中至少所述第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ IDNO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。
7.权利要求1所述的双功能shRNA，其中正常RAS的表达不被所述第一双功能RNA分子降低至低于功能性生理水平。
8.权利要求1所述的双功能shRNA，其中SRC-3或EGFR中的至少一个是正常人基因。
9.表达载体，其包含：
启动子；和
与所述启动子有效连接的核酸插入片段，其中所述插入片段包含：
降低第一靶基因的表达的第一双功能RNA分子；
降低第二靶基因的表达的第二双功能RNA分子；和
降低第三靶基因的表达的第三双功能RNA分子，其中所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平，其中所述一个或更多个shRNA包含激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物的双功能RNA分子，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平。
10.权利要求9所述的表达载体，其中所述组合物进一步限定为由SEQ ID NO：1、3、46或47所限定的载体。
11.权利要求9所述的表达载体，其中所述双功能shRNA包含至少一个由SEQ ID NO：2、4、44或45所限定的核酸序列。
12.权利要求9所述的表达载体，其中至少一个靶基因包含选择性靶向突变KRAS基因的双功能shRNA，所述突变KRAS基因进一步限定为具有G12C、G12D、G12V或G12R突变中至少一种的人KRAS基因。
13.权利要求9所述的表达载体，其中至少所述第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。
14.权利要求9所述的表达载体，其中所述核酸插入片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100个拷贝的能够降低一个或更多个突变或正常基因之表达的双功能shRNA插入片段。
15.治疗递送系统，其包含：
治疗剂载体；和
表达载体，其包含启动子和与所述启动子有效连接的核酸插入片段，所述插入片段编码：
降低第一靶基因的表达的第一双功能RNA分子；
降低第二靶基因的表达的第二双功能RNA分子；和
降低第三靶基因的表达的第三双功能RNA分子，其中每个所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平。
16.权利要求15所述的递送系统，其中所述组合物进一步限定为由SEQ ID NO：1、3、46或47所限定的载体。
17.权利要求15所述的递送系统，其中所述双功能shRNA包含至少一个由SEQ ID NO：2、4、44或45所限定的核酸序列。
18.权利要求15所述的递送系统，其中至少一个靶基因包含选择性地靶向突变KRAS基因的双功能shRNA，所述突变KRAS基因进一步限定为具有G12C、G12D、G12V或G12R突变中至少一种的人KRAS基因。
19.权利要求15所述的递送系统，其中至少所述第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQ ID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQID NO：50-126。
20.权利要求15所述的递送系统，其中所述核酸插入片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或个100拷贝的能够降低一个或更多个突变或正常基因之表达的双功能shRNA插入片段。
21.将一个或更多个shRNA递送至表达KRAS、SRC-3和EGFR基因的靶组织的方法，其包括以下步骤：
制备包含启动子和与所述启动子有效连接的编码所述一个或更多个shRNA的核酸插入片段的表达载体，其中所述一个或更多个shRNA包含与所述启动子有效连接的核酸插入片段，其中所述插入片段包含：
降低第一靶基因的表达的第一双功能RNA分子；
降低第二靶基因的表达的第二双功能RNA分子；和
降低第三靶基因的表达的第三双功能RNA分子，其中每个所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述第一、第二和第三靶基因的表达水平；
将所述表达载体与治疗剂载体组合，其中所述治疗剂载体包含脂质体；并且
向有此需要的患者施用治疗有效量的所述表达载体和所述治疗剂载体复合物。
22.权利要求21所述的方法，其中所述组合物进一步限定为由SEQ ID NO：1、3、46或47所限定的载体。
23.权利要求21所述的方法，其中所述双功能shRNA包含至少一个由SEQ ID NO：2、4、44或45所限定的核酸序列。
24.权利要求21所述的方法，其中至少一个靶基因包含选择性地靶向突变KRAS基因的双功能shRNA，所述突变KRAS基因进一步限定为具有G12C、G12D、G12V或G12R突变中至少一种的人KRAS基因。
25.权利要求21所述的方法，其中至少所述第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。
26.权利要求21所述的方法，其中所述核酸插入片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100个拷贝的能够降低一个或更多个突变或正常基因之表达的双功能shRNA插入片段。
27.抑制人对象中肿瘤细胞生长的方法，其包括以下步骤：
鉴定有抑制所述肿瘤细胞生长之需要的人对象；并且
以足以抑制所述肿瘤细胞生长的量向所述人对象施用处于治疗剂载体复合物中的表达载体，其中所述表达载体包含与所述启动子有效连接的核酸插入片段，其中所述插入片段包含：
降低突变KRAS基因的表达的第一双功能RNA分子；
降低SRC-3基因的表达的第二双功能RNA分子；和
降低表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达的第三双功能RNA分子，其中所述双功能RNA分子能够激活切割依赖性和切割非依赖性的RNA诱导沉默复合物，以降低所述突变KRAS、SRC-3和EGFR的表达水平，并且其中所述抑制导致肿瘤细胞的凋亡、增殖停滞或侵袭力降低。
28.权利要求27所述的方法，其中所述核酸插入片段包含SEQ ID NO：2或4。
29.权利要求27所述的方法，其中至少一个针对K-RAS的核酸插入片段选自SEQ ID NO：5-26。
30.权利要求27所述的方法，其中至少一个针对SRC-3的核酸插入片段选自SEQ ID NO：27-36。
31.权利要求27所述的方法，其中至少一个针对EGFR的核酸插入片段选自SEQ ID NO：48-49。
32.权利要求27所述的方法，其中施用选自瘤内、皮下、静脉内、腹膜内、肌内和静脉内注射。
33.权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤细胞生长表达突变的KRAS。
34.权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤细胞生长是肺癌。
35.权利要求27所述的方法，其还包括与第二抗肿瘤剂的联合治疗。
36.评估被认为可用于治疗癌症的候选药物的方法，所述方法包括：
(a)测量以下的一种或更多种：
至少野生型KRAS和一种或更多种突变KRAS以及两个或更多个靶基因在癌细胞或组织中的表达水平；
一种或更多种突变KRAS基因和所述两个或更多个靶基因在癌细胞或组织中的表达降低的细胞环境中，候选基因或候选基因的组的表达水平；
候选药物对这种细胞的表型的作用，其包括一种或更多种突变KRAS基因和两个或更多个靶基因在癌细胞或组织中的表达降低；
(b)将候选药物施用于所述癌细胞或组织的第一亚群，以及将安慰剂施用于所述癌细胞或组织的第二亚群；
(c)在施用所述候选药物或安慰剂后重复步骤(a)；并且
(d)与正常KRAS表达的细胞环境相比，确定所述候选药物在突变KRAS基因和所述两个或更多个靶基因的表达降低的细胞环境中是否有效产生确定的表型，其与肺癌细胞或组织的所述第二亚群中发生的任何降低相比是统计学显著的，其中统计学显著的降低表明所述候选药物可用于治疗癌症。
37.权利要求36所述的方法，其中所述癌症选自脑癌、膀胱癌、血癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、胃肠癌、内分泌癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌。
38.权利要求36所述的方法，其中所述突变KRAS被选择性地敲低，并且所述两个或更多个靶基因选自SRC-3、EGFR、PIK3、NCOA3或ERα1，且所述插入片段选自RNAi、shRNA或bi-shRNA中的至少一种。
39.抑制人对象中肿瘤细胞生长的方法，其包括以下步骤：
从所述人对象获得肿瘤细胞样品；
鉴定有抑制以防止肿瘤细胞生长之需要的所述人对象的一个或更多个靶基因；
构建表达载体，其包含表达特异性靶向在所述肿瘤细胞样品中鉴定到的基因的两个或更多个RNAi核酸区段的插入片段；其中所述插入片段包含：
降低在所述肿瘤细胞中鉴定的相同或不同靶基因之表达的第一和第二RNAi核酸；
以足以表达所述两个或更多个RNAi核酸区段的量向所述人对象施用处于治疗剂载体复合物中的所述表达载体；并且
确定在靶肿瘤细胞中所述基因是否已被所述表达载体敲低，其中所述抑制导致所述肿瘤细胞的凋亡、增殖停滞或侵袭力降低。
40.权利要求39所述的方法，其中所述RNAi选自miRNA和shRNA和siRNA或bi-shRNA中的至少一种。
41.权利要求39所述的方法，其中至少所述第一、第二或第三双功能RNA分子选自SEQID NO：5-26、SEQ ID NO：27-36、SEQ ID NO：38-39、SEQ ID NO：40-41、SEQ ID NO：42-43、SEQ ID NO：48-49或SEQ ID NO：50-126。
42.权利要求39所述的方法，其中所述插入片段还包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、25、50、75或100个拷贝的能够降低一个或更多个突变或正常基因的表达的RNAi插入片段。
43.权利要求39所述的方法，其中所述表达载体进一步限定为包含以下结构：载体-A-B-C-载体，其中A、B和C是三个或更多个RNAi核酸区段，所述核酸区段能靶向所述一个或更多个靶基因的mRNA的相同区域、所述一个或更多个靶基因的mRNA的不同区域或来自两个或更多个靶基因的不同mRNA。
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