ITCH20120016A1 - Sequenze oligonucleotidiche che inibiscono l¿espressione di mrna chimerici che controllano la crescita di cellule tumorali e loro uso in campo medico - Google Patents
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Description
“Sequenze oligonucleotidiche che inibiscono l’espressione di mRNA chimerici che controllano la crescita di cellule tumorali e loro uso in campo medico”
DESCRIZIONE
Stato dell’ arte
Il processing post-trascrizionale di RNA nucleare è un passo essenziale per la generazione di RNA messaggero funzionale (mRNA). Uno degli eventi critici in questo processo di maturazione è lo splicing, cioè l'eliminazione degli introni (regioni non codificanti) e la fusione degli esoni (regioni codificanti e non tradotte 5’ e 3’), per formare una molecola di mRNA continuo. Difetti nel processo di splicing, ad esempio causati da mutazioni nelle sequenze nucleotidiche di regolazione o nel dispositivo di splicing, sono frequenti e causano molte malattie ereditarie [1,2]. Difetti di splicing si trovano anche nei tumori umani, dove possono avere un ruolo causale ed essere associati ad una maggiore aggressività della malattia [3,4],
Il processo di maturazione degli mRNA può anche avvenire attraverso la giunzione di due RNA indipendenti (trans-splicing). Il risultato è la produzione di mRNA chimerici senza ricombinazione a livello del DNA, in contrasto con i riarrangiamenti genomici tipici che sono frequentemente presenti in cellule tumorali umane. In Trypanosoma ogni mRNA inizia con la stessa sequenza leader, che deriva da un processo di trans-splicing [5], Un processo corrispondente di transsplicing è stato descritto in altre specie [6], tra cui i mammiferi [7],
Trascritti chimerici in tumori umani
Molti trascritti chimerici sono stati scoperti in tumori solidi umani, come derivanti da traslocazioni cromosomiche [8], Più della metà dei tumori della prostata contiene sequenze di fusione, per lo più TMPRSS-ERG [9], SLC45A3-ELK4 (famiglia ETS) può essere generato sia da riarrangiamenti cromosomici che da trans-splicing, e si è trovato essere espresso sia nel tessuto prostatico normale che nel cancro della prostata. Alti livelli di SLC45A3-ELK4 mRNA sono limitati ad un sottoinsieme di campioni di cancro alla prostata [10], Una piccola inversione nel cromosoma 2p porta alla formazione di un gene di fusione comprendente EML4-ALK in cancro ai polmoni non a piccole cellule [11], La fusione di MAML2 con CRTC1 o CRTC3 ha un ruolo nello sviluppo di carcinomi mucoepidermoidi [12], Riarrangiamenti dei membri del pathway RAF si verificano nella prostata e nel cancro gastrico [13], e una inversione paracentrica del cromosoma 7q risulta in una fusione inframe tra gli esoni 1-8 del gene AKAP9 e gli esoni 9-18 di BRAF in carcinomi papillari indotti da radiazioni [14], Altri eventi carcinoma tiroideo-specifici includono la fusione dell’ oncogene RET a diversi partner [15], Ulteriori fusioni di oncogeni sono stati rilevati in altri tumori solidi [16,17], Trascrittomi tumorali contengono chimere di mRNA di origine trascrizionale (lunga trascrizione intergenica) o post-trascrizionale (trans-splicing [18]), che possono giocare un ruolo nello sviluppo del tumore. Risultati precedenti hanno dimostrato che trascritti oncogenici possono essere generati post-trascrizionalmente [19-21], La fusione di mRNA della ciclina DI a TROP2 genera l' oncogene CICLINA D1-TROP2, la cui funzione promuovente il tumore è indotta attraverso una stabilità dell'mRNA sensibilmente aumentata [19], L'mRNA oncogenico JAZF1-JJAZ1 chimerico può essere originata da trans-splicing, nonché da una traslocazione cromosomica [20], Allo stesso modo, SLC45A3-ELK4 può essere generato in assenza di riarrangiamenti cromosomici [10,22], Splicing intergenico genera un mRNA chimerico ubiquitario comprendente P2Y11 e SSF1 [23], La generazione di queste chimere appare come un evento regolamentato [19,20], ed è stato dimostrato che si verificano anche nei tessuti normali [10,19,20,23, Li, 2009 #16106,24,25], Molti di questi trascritti chimerici sono stati utilizzati come marcatori diagnostici o prognostici [26], e come bersagli per la terapia anti -neoplastica [16,27,28, Guerra, 2008 #5928],
Strategie di screening per l ’ identificazione in silico di mRNA chimerici
Strategie di screening sono state già definite per l'identificazione in silico di chimere mRNA nelle cellule tumorali [29], Tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) permettono ora di generare dati di sequenza molto più su grande scala [13,24,25,30-32],
Per usufruire di questi progressi tecnici, abbiamo sviluppato una strategia di analisi, per V identificazione ad alta precisione di chimere di mRNA in set di dati di sequenza long-read (Materiale e metodi). Questa strategia ha dimostrato di funzionare in modo efficiente per il riconoscimento di chimere. Abbiamo quindi sequenziato librerie di cDNA di istotipi tumorali principali, e corrispondenti tessuti normali. Ciò ha portato all'identificazione di mRNA chimerici da cellule normali e trasformate. Chimere specifiche per tumori del seno e dell’ ovaio sono state poi utilizzate per confermare l'espressione degli mRNA di fusione identificati: PRKAA-TTC33 (SEQ ID NO:l), SAMM50-PARV (SEQ ID NO:2), P2RX5- TAX1BP3 (SEQ ID NO:3), URB1-C210RF45 (SEQ ID NO: 4), CTBS-GNG5 (SEQ ID NO:5), CHD2-CHMP1A (SEQ ID NO:6), DHX8-ADK (SEQ ID NO:7) (Figura 1). mRNA di fusione, derivino essi da ricombinazione cromosomica nei tumori [8], o siano generati post-trascrizionalmente [19-21], possono svolgere un ruolo nel controllo della crescita tumorale. Abbiamo quindi studiato se gli mRNA di fusione da noi identificati possono controllare la crescita di cellule trasformate. Saggi funzionali in linee cellulari tumorali di seno e ovaie hanno mostrato che le chimere di mRNA regolano la replicazione cellulare. Chimere di mRNA sono state trovate essere espresse dalla maggior parte dei tumori della mammella, ovaio, colon, utero, rene, polmone e stomaco, suggerendo un ruolo importante nello sviluppo del tumore. Abbiamo poi sviluppato efficienti strumenti di inibizione delle chimere (siRNA specifici). Abbiamo quindi mostrato che questi sono mezzi efficaci per inibire la crescita di cellule trasformate.
Problema tecnico
Identificazione di mRNA chimerici
Tecnologie NGS possono fornire informazioni su larga scala per Γ identificazione di sequenze chimeriche [13,24,25,30-32], Tuttavia, la maggior parte degli approcci NGS di seconda generazione produce brevi tag di sequenza altamente multiplexed, che vengono poi condensati in stringhe di probabilità di base-cali, attraverso il fitting probabilistico di set di dati massivamente paralleli. Questo rende l' assemblamento di contig e gli allineamenti a sequenze bersaglio corrispondentemente più difficili [24,30,32,33], Allineamenti a genomi complessi sono ancora più ostacolati, a causa di maggiore complessità di sequenza [34], e di omologia all'interno delle famiglie di geni strettamente correlati e pseudogeni.
Rivelazione e quantificazione di mRNA chimerici
Dato che le chimere sono mRNA di fusione, e che questa può verificarsi anche in assenza di ricombinazione tra i loci dei due geni coinvolti, il metodo di rilevamento della chimera deve partire dall’ RNA di cellule / tessuti, che è molto più instabile e soggetto a degradazione rispetto al DNA. Biopsie di tumori/campioni d’ archivio, che sono stati fissati in formalina tamponata e inclusi in paraffina secondo procedure standard, possono essere utilizzati per l'estrazione di acidi nucleici. La qualità degli acidi nucleici estratti da questi campioni è variabile, ed influenza la qualità di ulteriori analisi. Si è posta quindi l'esigenza di fornire un metodo di rivelazione per rivelare la presenza delle chimere mRNA che potesse essere sensibile, robusta, quantitativa e potenzialmente ad alta efficienza di processazione.
Inibizione dell’espressione di mRNA chimerici
Nelle cellule tumorali che esprimono l'mRNA di fusione, né il DNA né i singoli mRNA che partecipano alla fusione mRNA sono mutati o comunque alterati, ed entrambi gli mRNA parentali sono presenti e funzionalmente importanti in tessuti normali. E interessante notare che le chimere svolgono la loro azione oncogena anche a bassi livelli di espressione. C'era quindi l'esigenza di fornire un metodo altamente efficace che potesse virtualmente abrogare l'espressione delle chimere bersaglio, con elevata specificità verso la molecola di fusione lasciando i due singoli partner mRNA inalterati. Per scopi terapeutici e inibizione efficace / specifica della chimere mRNA, la molecola inibitrice devono essere espressa all'interno delle cellule tumorali. Pertanto, vi era la necessità di sviluppare vettori e protocolli di trasfezione e trasduzione ottimizzati per questo scopo con effetti tossici minimi o assenti.
Ruolo di mRNA chimerici nel controllo di crescita
mRNA chimerici, derivanti da ricombinazione cromosomica nei tumori [8], o generati posttrascrizionalmente [19-21] possono svolgere un molo nel controllo della crescita tumorale. E stato quindi necessario sviluppare metodologie per dimostrare che gli mRNA di fusione possono controllare la crescita di cellule trasformate.
Terapia anti-cancro con siRNA specifici per mRNA chimerici
Per utilizzare a scopo terapeutico gli effetti sulla crescita cellulare di inibizione efficace e specifica del mRNA chimerici, devono essere sviluppati e convalidati approcci corrispondenti di inibizione specifica. La molecola inibitrice deve poi essere diretta in modo efficiente ed espressa nelle cellule e tessuti desiderati. Pertanto, vi è stata la necessità di sviluppare siRNA, vettori e costrutti di trasfezione e protocolli di trasduzione ottimizzati per questo scopo, che mostrassero effetti tossici minimi o assenti.
Soluzione al problema tecnico
Identificazione di mRNA chimerici
Una procedura (FusionMiner) è stato progettata per elaborare analisi di BLAST di sequenze nei confronti di banche dati genomiche, attraverso fasi sequenziali di analisi e di esclusione, o pass-failtest (vedi Materiali e Metodi).
Per scoprire chimere che regolano la crescita cellulare, abbiamo poi effettuato sequenziamento su larga scala e procedure di analisi correlate in trascrittomi di tumori e tessuti normali. Per massimizzare le possibilità di scoperta di chimere che regolano la crescita, sono stati analizzati gli istotipi tumorali più importanti, vale a dire tumori non a piccole cellule del polmone, del seno, della prostata, dell'ovaio e del colon-retto, e i corrispondenti tessuti normali.
Queste sequenze sono state analizzate con FusionMiner. Delle 25 sequenze identificate, le chimere derivate da mammella e ovaio sono state successivamente convalidate da RT-PCR e saggi funzionali.
Rivelazione e quantificazione degli mRNA chimerici
L’spressione di nove chimere dalla libreria di seno e di quattro chimere dalla libreria ovarica è stata analizzata in linee cellulari tumorali di mammella (MCF-7, HBL-100, SK-BR-3, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB -415, MDA-MB -453, MDA-MB-468, HS578, ZR751) e dell'ovaio (Skov-3, IGROV-1, OVCAR-3, OVCA-432) (Figura 1). Sei delle nove chimere sono state correttamente amplificate mediante RT-PCR, usando primer specifici come indicato (da SEQ ID NO:8 a SEQ ID NO:35). Amplificazione da cellule di cancro al seno è stata ottenuta per PRKAA-TTC33 (10/10 linee), SAMM50-PARVB (5/10 linee), P2RX5-TAX1BP3 (3/10 linee) e CHD2-CHMP1A (9/10 linee). Tutti gli ampliconi individuali sono stati verificati per sequenza. Tre di queste chimere sono state rilevate anche in cellule di cancro ovarico: PRKAA-TTC33 (4/4 linee); SAMM50-PARVB (3/4 linee) e CHD2-CHMP1A (4/4 linee). Le chimere URB1-C210RF45 e CTBS-GNG5 dalla libreria ovarica sono state identificate in tutte e quattro le linee di cellule di cancro ovarico. Sono state identificate anche nelle linee di cancro al seno. In particolare, cellule tumorali diverse esprimono diversi livelli di mRNA chimerici; ad esempio CTBS-GNGS era circa 20 volte meno espressa in cellule HBL-100, rispetto a cellule MDA-MB-415 (Figura 1).
Dimostrazione che gli mRNA chimerici contengono stimolatori della crescita tumorale
Le sei chimere che sono state trovate espresse da linee di cellule bersaglio in coltura sono state saggiate per un ruolo nella crescita cellulare. siRNA rivolti contro il giunto chimerico sono stati usati per inibire l'espressione delle chimere corrispondenti in cellule di carcinoma mammario (Figure 2-4). L’ efficienza di trasfezione è stata ottimizzata utilizzando un plasmide reporter pEYFP co-transfettato (Figura 2); la maggior parte delle cellule bersaglio sono apparse trasferiate con successo. siRNA hanno down-regolato i livelli di chimere mRNA di ~ 75% (Figura 2B). Per garantire l'assenza di effetti off-target, i livelli dei partner chimerici 5 'e 3' sono stati analizzati in parallelo. I livelli di trascrizioni dei partner chimerici sono rimasti inalterati dagli siRNA rivolti alle regioni di giunzione delle chimere (Figure 2-4).
Tre delle chimere testate sono state dimostrate stimolare la crescita delle cellule tumorali, e la loro inibizione ha portato ad una riduzione della crescita cellulare. L'inibizione della crescita più forte in cellule tumorali HBL-100 è stata causata da down-regulation di CHD2-CHMP1A (Figura 2A). Blocco della crescita parallela in cellule MCF-7 è stato osservato dopo l'arresto di PRKAA-TTC33 e SAMM50-PARVB. Monitoraggio di inibizione della crescita cellulare mediante tramite microscopia ottica (Figura 2D) o analisi di immagine (Figura 3), dopo trattamento con siRNA anti-PRKAA-TTC33 o SAMM50-PARVB, ha confermato una riduzione drammatica della crescita cellulare di MCF-7. L'inibizione della crescita dopo down-regulation di PRKAA-TTC33 e SAMM50-PARVB è stata dimostrata anche per cellule HBL-100.
I registri di lettura delle chimere che regolano la crescita sono stati analizzati. In tutti i casi tranne uno, i partner a valle non ha fornito sequenze in-frame, generando code chimeriche per lo più brevi out-of-frame. Questo suggerisce un’ alterata regolazione e / o una funzione dominante negativa di una molecola troncata come meccanismo di azione di questi prodotti chimerici.
Espressione degli mRNA chimerici in tessuti normali
Abbiamo valutato i livelli di presenza e di espressione di chimere in mRNA in tessuti normali (mammella, polmone, placenta, utero, prostata, stomaco, colon, pancreas e reni), usando nested PCR o PCR quantitativa. Le 4 chimere intra-cromosomiche (PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, URB1-C210RF45, CTBS-GNG5) sono stati rilevate in tutti i tessuti normali studiati (Figura 5). Questo era in linea con i risultati precedenti, indicanti l'espressione di chimere mRNA in tessuti normali [10,19,20,23-25,35], D'altra parte, non abbiamo trovato essenzialmente alcuna traccia della chimera CHD2-CHMP1A inter-cromosomica in tessuti normali. CHD2-CHMP1A è espressa da quasi tutte le linee tumorali cellulari (13/14), per cui appare come un importante evento legato al cancro, e come un importante indicatore diagnostico.
Espressione degli mRNA chimerici in tumori
L'RNA totale è stato estratto da tumori del seno, delle ovaie, dello stomaco, del colon, del rene e uterini [19,36], è stato retrotrascritto e amplificato. Candidati amplificati sono stati poi sistematicamente sequenziari. PRKAA-TTC33 è stato rilevato in tutti e 25 tumori; SAMM50-PARVB in 15 tumori; P2RX5-TAX1BP3 in 8 tumori; URB1-C210RF45 in 21 tumori; CTBS-GNG5 è stata rilevata in quasi tutti i tumori (Figura 6, Tabella 1); CHD2-CHMP1 A è stato identificato in 11 tumori (Figura 6B). ADK-DHX8 è stato diagnosticato in 2 tumori (Figura 6C). Di conseguenza, le chimere che regolano la crescita sono ampiamente espressi in tumori umani, anche se in modo eterogeneo. Questo indica una pressione positiva selettiva [37] per un meccanismo di regolamentazione basato su mRNA di fusione durante lo sviluppo del tumore, che sembra operare in modi chimera- e tumore-specifici.
Inibizione dell ’ espressione ed utilizzo terapeutico
Abbiamo istituito un sistema efficace e altamente specifico per inibire l'espressione di chimere che controllano la crescita. Per fare questo, abbiamo sviluppato un approccio basato su RNA silenziatori (siRNA), diretti contro la sequenza della regione di giunzione della chimera. Gli siRNA corrispondenti a queste regioni sono stati clonati come hairpin RNA (vedi Materiali e Metodi) in appropriati vettori (plasmidi e vettori lentivirali). Abbiamo anche sintetizzato e clonato siRNA diretti contro bersagli irrilevanti, per essere utilizzati come controlli negativi. Le sequenze delle coppie di oligonucleotidi per ogni siRNA sono come indicato (da SEQ ID NO:36 a SEQ ID NO: 51).
I livelli di chimera in cellule trasfettate con siRNA sono stati misurati con il metodo che avevamo disegnato in precedenza (analisi PCR quantitativa di campioni di cDNA). In parallelo, abbiamo anche misurato i livelli di espressione di due RNA partner della chimera e di geni housekeeping, ad esempio GAPDH, come controlli, utilizzando una procedura simile. In parallelo, abbiamo monitorato il tasso di crescita delle cellule trasfettate con gli siRNA (Figure 2-4). Le nostre analisi hanno mostrato che il silenziamento delle chimere è efficiente e specifico. L'espressione della chimera è stata completamente inibita dall’ siRNA specifico, mentre i livelli degli mRNA partner di fusione è rimasto invariato, pari a quelle delle celle originali (e dei controlli tecnici comunemente utilizzati, in particolare le cellule trasfettate con siRNA di controllo). In parallelo all'inibizione dell'espressione delle chimere, la crescita cellulare è stata fortemente inibita.
Descrizione della presente invenzione
Oggetti dell'invenzione qui presentata sono le sequenze delle chimere mRNA SAMM50-PARVB e CHD2-CHMP1A, cone stimolatori della crescita.
Altri oggetti dell'invenzione sono i metodi per la rilevazione e la quantificazione degli RNA chimerici in cellule normali e tumorali e tessuti. Questo include le procedure per l'amplificazione del RNA da chimere cellule che esprimono la chimera, in particolare mediante PCR quantitativa o PCR da cDNA ottenuto da cellule e tessuti.
Un altro oggetto del trovato qui presentato è l'uso degli mRNA chimerici come bersagli per la terapia antitumorale. Questa invenzione include gli acidi nucleici (siRNA e costrutti che esprimono gli siRNA) in grado di inibire in modo efficace e specifico l'espressione degli mRNA chimerici. Questo include le modifiche ed i derivati degli acidi nucleici corrispondenti, compresi i plasmidi e vettori lentivirali che li contengono. Inoltre, l'invenzione comprende le modalità di generazione e l'uso di questi vettori.
I bersagli degli siRNA descritti sopra sono parte della presente invenzione, in particolare le molecole chimeriche PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP1A, come elementi diagnostici, indicatori prognostici e bersagli terapeutici.
Gli oggetti dell'invenzione qui presentati includono le procedure per la preparazione di siRNA e loro derivati.
Gli oggetti dell'invenzione qui presentati includono i metodi per la diagnosi di malattie neoplastiche e non neoplastiche che contengono i bersagli degli siRNA e derivati sopra descritti.
Un'altra rivendicazione dell'invenzione qui presentata è un metodo per il trattamento di un tumore che esprime le chimere mRNA, prima o dopo la rimozione chirurgica del tumore stesso, attraverso la somministrazione di agenti antineoplastici, come siRNA o loro derivati, da soli o in combinazione con altri modalità terapeutiche.
Gli oggetti dell'invenzione qui presentata comprendono le modalità di impiego in terapia, in particolare le modalità di somministrazione degli siRNA e loro derivati, o sistemica o locoregionale, ad esempio intraperitoneale, intra-epatica o intratumorale. Un elenco indicativo, ma non esaustivo, di bersagli di terapie basate su siRNA diretti contro mRNA chimeri comprende tumori che esprimono le chimere PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP1A, una lista esemplificativa e non esaustiva comprendendo tumori di seno, ovaio, stomaco, colon, rene e utero (Tabella 1)
Gli oggetti dell'invenzione qui presentati sono anche le composizioni terapeutiche contenenti siRNA o loro derivati, compresi i vettori lentivirali. In particolare, l'agente silenziante sarà incluso in composizioni farmaceutiche o kit diagnostici.
Attività inventiva
Hanno carattere di novità, a titolo di principi, applicazioni e modi d’ uso, come descritto in questo brevetto:
• le sequenze nucleotidiche degli mRNA chimerici SAMM50-PARVB e CHD2-CHMP1A;
• Γ uso degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP 1 A come nuovi marcatori tumorali e strumenti diagnostici;
• Γ uso degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP 1 A come nuovi bersagli di terapia antitumorale;
• i metodi per la rivelazione degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP1A nelle cellule, nei tessuti e nei tumori umani, comprese le sequenze dei primer utilizzati; • i metodi per inibire l' espressione degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP 1 A in vitro e in vivo ;
• le sequenze degli siRNA con attività inibitoria nei confronti degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP1A, i vettori plasmidici e lentivirali contenenti tali sequenze;
• Γ uso degli siRNA con attività inibitoria nei confronti degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP1A e dei loro derivati nella terapia di tumori o di altre malattie non tumorali;
• le modalità di utilizzo degli siRNA con attività inibitoria nei confronti degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP1A.
Applicazione industriale e forme di attuazione
Un metodo di realizzazione della presente invenzione è attraverso metodi per la rilevazione o la diagnostica di malattie neoplastiche, pre-neoplastiche e non, esprimenti gli mRNA chimerici oggetto della presente invenzione, che ne permettano Γ identificazione e quantificazione. Gli acidi nucleici, ed in particolare l' RNA, possono essere estratti e purificati a partire da cellule e tessuti freschi e congelati da ricercatori esperti nell’ arte applicando tecniche note. Kit e strumentazione per estrazione e purificazione possono essere acquisiti da fonti commerciali (per esempio Qiagen, Olanda; Applied Biosystems, California).
La rivelazione e quantificazione degli RNA chimerici attraverso sintesi del cDNA a partire dall’ RNA (RT) e PCR quantitativa in tempo reale, come descritto nella presente invenzione, possono essere effettuate secondo tecniche note nell’ arte. Reagenti e strumentazione per RT-PCR quantitativa in tempo reale sono disponibili sul mercato (per esempio Applied Biosystems; Roche, Svizzera) .
Una processività più alta nella fase di rivelazione della presenza degli RNA chimerici può essere raggiunta mediante l' utilizzo di stazioni robotizzate presenti sul mercato (per esempio TECAN, Svizzera).
Una molecola di acido nucleico che codifichi per gli mRNA chimerici o loro derivati o per gli RNA inibitori corrispondenti, oggetto della presente invenzione, può essere generata da un esperto nell’ arte usando tecnologie note, es. sintesi di oligonucleotidi o amplificazione per PCR. La molecola di acido nucleico, una volta sintetizzata, può essere clonata in un vettore plasmi dico o virale come noto nell’ arte. Vettori che sono stati usati con successo per il silenziamento di mRNA specifici mediati da siRNA sono il pSUPER [38] ed i vettori lentivirali PLKO.l [39] e pGIPZ (Open BioSystems, Alabama); in quest’ ultimo l' siRNA è inserito all’ interno della sequenza di un microRNA, e può venire processato in maniera più efficace dall’ apparato cellulare. Questi vettori possono essere inseriti nelle cellule per mezzo di metodi noti nell’ arte, es. per trasfezione o trasduzione nel caso di particelle virali. Kit per la trasfezione e per la preparazione e la trasduzione di particelle lentivirali possono essere acquistati da fonti commerciali (ad esempio Addgene, Massachusetts ; Open Biosystems, Alabama; Invitrogen, California). Per impedire la formazione di virus in grado di replicarsi, e renderne quindi sicuro 1’ utilizzo, la preparazione di particelle virali viene effettuata tipicamente mediante la complementazione di proteine prodotte da plasmidi diversi (fisicamente disgiunti tra loro), che forniscono ciascuno solamente una parte del corredo proteico necessario per la ricostituzione della particella in grado di infettare la cellula bersaglio.
Un altro metodo di realizzazione dell’ invenzione è la somministrazione ai pazienti con malattia neoplastica di acidi nucleici in grado di silenziare gli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB, CHD2-CHMP 1 A come terapia anti-tumorale, ad esempio facendo uso di vettori lentivirali. I metodi per realizzare queste modalità terapeutiche sono conosciuti in arte (vedi ad esempio [40,41]).
Materiale e metodi
Colture cellulari. Le line cellulari MCF-7, MCF-7/Almac, HBL-100, SK-BR-3, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-415, MDA-MB-453, MDA-MB-468, HS578, ZR751, SKOV-3, IGROV-1, OVCAR-3, OVCA-432 sono state fatte crescere in terreno RPMI 1640; al terreno è stato aggiunto il 10% di siero fetale bovino, con 100 IU/ml penicillina, 100 μg/ml streptomicina (Euroclone, Milano).
Saggi di crescita cellulare. Cellule MCF-7, HBL-100, SK-OV-3, IGROV-1 e OVCAR-3 sono state seminate a 1-10 x 10<3>cellule / pozzetto in piastre da 96 pozzetti (cinque repliche per punto dati). Numeri cellulari sono stati quantificati con colorazione con cristal violetto [42], Curve di crescita standard per ciascuna linea cellulare sono state generate mediante semina di diluizioni seriali di numeri cellulari noti. Curve standard con cristal violetto hanno mostrato buone risposte lineari (R2> 0,998, in tutti i casi) (Figura 3). La quantificazione è stata effettuata anche mediante analisi di immagini (Image J). Le immagini digitali sono state prese da 96 pozzetti dopo fissazione. Il rumore dell’ immagine è stato rimosso con software GIMP, dopo il campionamento casuale di cell-free pixel. ImageJ è stato poi utilizzato per quantificare le aree ‘nere’ in ogni cultura, dopo la conversione dell’ immagine in una scala di grigi. ImageMaster Platinum 2D (GE Healthcare) è stato poi utilizzato per enumerare i nuclei delle cellule dopo la colorazione con DAPI; i nuclei sono stati individuati come spot di segnale.
Trasfezione di DNA. Le cellule sono state trasfettate con DNA in Lipofectamine 2000 (HBL-100, Skov-3, Igrov-1, OVCAR-3) o LTX (Invitrogen) [43], seguendo le istruzioni del produttore. pEYFP è stata usata per quantificare l'efficienza di trasfezione [44] (espressione di EYFP, misurata mediante citometria a flusso).
Citometria a flusso. Citometria di flusso è stata eseguita come descritto in precedenza [45,46] (FACScalibur, Becton-Dickinson, Sunnyvale, CA). Per migliorare la rilevazione di trasfettanti EYFP, sottrazione di autofluorescenza cellulare e spostamento di trasfettanti nel canale rosso sono state eseguite come descritto [44,47],
Procedura di rilevazione degli mRNA chimerici. Abbiamo progettato il flusso di lavoro del software FusionMiner, per elaborare analisi BLAST di sequenze di interrogazione nei confronti di banche dati genomiche, tramite fasi sequenziali di analisi e di esclusione. Le chimere candidate sono state cross-validate, rispetto alle sequenze sperimentalmente verificate e mediante RT-PCR.
Allineamenti rispetto ad assembly genomici sono stati analizzati per rimuovere dati spuri sulla base della lunghezza e identità percentuale (> 98%, > 95% della lunghezza del candidato). I singoli allineamenti filtrati sono stati poi raggruppati e concatenati attraverso le interruzioni di allineamento e le regioni introniche, sulla base di un criterio di distanza ammissibile, per identificare il loro contesto genomico. Sequenze allineate ad uno o due cromosomi sono state segregate e trattate separatamente, come candidati chimerici intra-cromosomici (che più frequentemente derivano da trascrizione inter-genica) e inter-cromosomici (che più frequentemente derivano da traslocazioni cromosomiche o trans-splicing), rispettivamente.
Il punto di fusione (FP) per candidati inter-cromosomici è atteso corrispondere al punto in cui una sequenza cessa di allinearsi con un cromosoma e inizia ad allinearsi con il secondo. Allineamenti su entrambi i lati di un FP sono stati valutati sulla base della lunghezza e percentuale di identità (default ≥ 100 lunghezza bp, ≥ 98% di identità), a seguito di clustering degli allineamenti originali e calcolo della media ponderata delle identità percentuali. Questo per garantire che solo dati di alta qualità di allineamento siano utilizzati nella rilevazione di chimere, mentre sequenze di qualità bassa o allineamenti spuri vengono scartati. FP sono stati poi esaminati e filtrati, in base al grado di sovrapposizione in questa posizione (default ≤ 10 bp). Permettendo questo grado di errore viene garantita la ritenzione di chimere vere con piccole aree di omologia di sequenza casuale attraverso l'altro lato del FP. Una procedura di filtrazione parallela è stata applicata per lacune nel FP (default < 10 bp), che ha permesso di compensare per errori di sequenziamento possibili in questa posizione. I candidati sono stati poi controllati per corrispondenza degli FP con esoni noti, utilizzando i dati di coordinate genomiche da Ensembl. Quando FP candidati sono risultati corrispondere a un confine esone-esone, i candidati sono stati accettati. Candidati intra-cromosomici sono stati trattati in modo corrispondente. Una soglia di errore ammissibile (default 3 bp) è stato applicato in questa fase, per compensare gli errori di sequenziamento o perdite di allineamento dovuti a piccole aree di omologia locale su entrambi i lati di un FP.
Entrambi i partner di mRNA chimerici sono stati selezionati per occorrenza di orientamento corrispondente a quello di mRNA noti (orientamento ‘plus’) [29],
Campioni umani per il sequenziamento del trascrittoma tumorale. Librerie di cancro al polmone non a piccole cellule (NSCLC) sono state generate da un insieme di campioni di tessuto congelato, un totale di 65 campioni di tumore (30 adenocarcinomi, 20 carcinomi a cellule squamose, 15 altre morfologie) dalla Roy Castle Lung Cancer Research Institute (Università di Liverpool) e Queens University di Belfast. Per massimizzare le possibilità di scoperta di mRNA chimerici, si è proceduto a generare librerie dal tessuto sia tumorale che normale. RNA polmonare normale è stato ottenuto da molteplici fornitori commerciali (Ambion, Austin, TX, BIOCAT, Heidelberg, Germania, Stratagene, La Jolla, CA, Cybrdi, Rockville, MD, Origene, Rockville, MD), nel complesso da 16 donatori di etnia diversa.
La biblioteca di cancro ovarico A comprende 64 tumori ovarici (31 sierosa, 14 endometroide, 6 mucinoso, 5 a cellule chiare e 8 tumori indifferenziati, 52 erano allo stadio III / IV e 12 erano allo stadio I / II). Per la biblioteca ovarica B, RNA da tessuto ovarico normale è stato ottenuto da fornitori commerciali (Ambion e AMS Biotecnologie, Bioggio, Svizzera). La biblioteca è stata generata con uguali quantità di RNA di diverse etnie (asiatici, caucasici e afro-americani), con 23 donatori complessivi. Per la libreria ovarica C, RNA da tumore ovarico totale è stato ottenuto da vari fornitori commerciali (Ambion, Clontech, Biocat, Cytomyx, Lexington, MA, Asterand, Detroit, MI). La biblioteca era composta da uguali quantità di RNA di etnia diversa (asiatiche, afro-americana e caucasica), con 37 donatori complessivi.
Per il cancro alla prostata la biblioteca è stata costruita da 30 tumori (74% caucasici e 26% afroamericani), 8 RNA da prostate normali forniti da Clontech, Biotecnologie AMS e Cybridi, e 56 tessuti normali adiacenti ai tumori ottenuti da St. Vincent Hospital, Dublino. La biblioteca di cancro al seno era composta di 90 tumori e 18 campioni normali [48-50],
La biblioteca del colon-retto comprendeva 40 campioni tumorali e 40 tessuti normali.
Set di tumori di validazione. cDNA è stato sintetizzato da 25 tumori umani primari (10 seno, 6 colon, 3 stomaco, 2 ovaio, 2 rene e 2 dell'utero), che erano indipendenti da quelli utilizzati per la costruzione delle librerie di cDNA. Questi 25 campioni sono stati utilizzati come un insieme di test per convalidare T espressione di chimere sia con PCR convenzionale / sequenziamento che con realtime RT-PCR.
Tessuti normali. RNA normali del seno, colon, utero, prostata, placenta, polmone, rene, pancreas e stomaco sono stati ottenuti da Clontech.
Costruzione di librerie di cDNA. Tutti i tessuti tumorali congelati sono stati omogeneizzati in RNA STAT-60 (Tel-Test, Friendswood, TX), e l'RNA è stato estratto secondo le istruzioni del produttore. Uguali quantità di RNA totale sono stati raggruppati, e l'mRNA è stato isolato usando pMACS kit di isolamento di mRNA (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania), come descritto dal produttore. Librerie di cDNA polmonari sono state costruite da 3 mg di mRNA, utilizzando il kit cDNA ™ CloneMiner (Invitrogen), secondo le istruzioni del produttore. cDNA sono stati inseriti nel vettore pDONR 222 da Invitrogen. Titolo e media dimensione dell'inserto in ogni libreria di cDNA sono state determinate secondo le istruzioni del produttore. Preparazioni di plasmidi da cloni individuali sono state effettuate utilizzando un metodo Montage di lisi alcalina (Millipore, Billerica, MA), che incorpora piastre di chiarificazione MultiScreen ® Plasmid384 Miniprep.
Sequenziamento di librerie di cDNA. Automazione per il sequenziamento di singole colonie è stata implementata (QPix colony picker, Biomek liquid-handler). Le reazioni di sequenziamento a ciclo sono state eseguite in volumi di 10 ul utilizzando una diluizione 1/16 di mix Big Dye Terminator v3.1 in Big Dye tampone di sequenziamento (Applied Biosystems Ine.), 5 pM M13 primer, e 100 ng DNA stampo. Il ciclo di sequenziamento è stato effettuato per 40 cicli a 95 ° C per 10 s, 50 ° C per 5 s e 60 ° C per 2,5 min. L'eccesso di colorante è stato rimosso utilizzando CleanSEQ (Corporation Agencourt Bioscience, Beverly, MA). Piastre di sequenziamento sono state analizzate su Applied Biosystems 3730/3730 x Analizzatori di DNA utilizzando 1 Applied Biosystems software Sequence Analysis. M13 forward primer sono stati usati per la sequenza 5' delle librerie colon e della mammella; MI 3 reverse primer sono stati usati per sequenziamento 3' del polmone normale e librerie prostata; primer MI 3 sia forward che reverse sono stati usati per sequenziamento 5 'e 3' dei tumori polmonari e librerie di cancro ovarico.
Plasmidi. Il vettore di espressione pEYFP (Clontech, Palo Alto, CA) è stato utilizzato per esprimere YFP. Il vettore pSUPER [38] è stato utilizzato per RNA interference.
siRNA. La progettazione degli siRNA ha seguito quattro strategie complementari, vale a dire criteri di Tuschl (posizione nel mRNA, contenuto di GC, composizione in basi, sequenze fi ancheggianti) [51], algoritmi Invitrogen (rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/) (composizione sequenza, contenuto nucleotide, proprietà termodinamiche, la convalida sperimentale), procedure di screening del Whitehead Institute (jura.wi.mit.edu / BIOC / siRNAext /) (criteri di Tuschl, le previsioni di energie di legame, BLAST filtro di cross-ibridazione sequenze) [52], e le ricerche Sonnhammer (data mining su siRNA validati in banche dati, utilizzando le regole di motif e parametri energetici) [53] (www.sirnawizard.com / design advanced.php).
Oligo siRNA annealed sono stati subclonati nel vettore pSUPER. Costrutti di espressione per siRNA sono stati trasfettati in cellule MCF-7, HBL-100, Skov-3, IGROV-1, OVCAR-3. siRNA targeting per livelli di trascrizione sono stati quantificati mediante real-time PCR. siRNA di controllo sono stati diretti verso obiettivi irrilevanti; questi ultimi sono stati scelti dopo numerosi test per mancanza di effetti off-target sulla crescita cellulare.
RT-PCR quantitativa. Sequenze ibride in linee cellulari tumorali e campioni tumorali sono state amplificate mediante RT-PCR quantitativa. RNA totale è stato retrotrascritto con l'M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI) secondo protocolli standard. cDNA è stato quantificato mediante fluorescenza in soluzione con etidio bromuro [54], RT-PCR quantitativa è stata eseguita con un sistema ABI-PRISM 7900HT Sequence Detection (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), utilizzando Sybr Green come sonda (Applied Biosystems). I campioni sono stati analizzati come replica e il metodo 1,83-ΔΔCΤ è stato utilizzato per calcolare le relative variazioni nell'espressione genica [19], Il gene housekeeping GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. Per i set-up delle curve, ΔCT (CT, gene target - CT, GAPDH) sono stati calcolati per ogni diluizione di cDNA. I dati sono stati analizzati come regressione lineare di minimi quadratici. L’ efficienza di amplificazione è stata lineare su tutta la gamma di quantità di RNA utilizzati. Questo ha permesso di utilizzare curve di amplificazione per calcolare i valori di cross-over per ogni campione. Per verificare la correttezza delle bande amplificate, prodotti di amplificazione sono stati analizzati su gel di agarosio al 3%. Prodotti amplificati sono stati purificati e sequenziati ampiamente (BMR-Genomics, Padova, Italia). RT-PCR quantitativa è stata effettuata anche con PrimeTime ® (IDT, Integrated DNA Technologies, Bologna, Italia, www.idtdna.com), per rilevare in modo affidabile con una maggiore sensibilità la fusione inter-cromosomica CHD2-CHMP1 A.
PCR diagnostica. Le chimere inter-cromosomiche CHD2-CHMP1A, ADK-DHX8, intracromosomiche PRKAA1-TTC33, SAMM50-PARVB e P2RX5-TAX1BP3, URBl-C21orf45, CTBS-GNG5 sono state amplificate in 10 linee di cellule di tumore al seno e 4 di cancro ovarico, e in 25 campioni tumorali, usando nested PCR. mRNA chimerici sono stati amplificati per 35 cicli di amplificazione (30 s a 94 ° C per la denaturazione, 30 s a 60 ° C per annealing, 30 s a 72 ° C per l'estensione). Hot master Taq-polimerasi 0,7 unità (Eppendorf) e 12,8 pmoli di primer forward e reverse sono stati utilizzati per la reazione di amplificazione. Tutti i prodotti amplificati sono stati purificati e sequenziati (BMR-Genomics, Padova, Italia).
Analisi statistica. ANOVA a due vie e t test con post-hoc correzione di Bonferroni sono stati utilizzati per il confronto della curva di crescita. I dati sono stati analizzati utilizzando Sigma Stat (SPSS Science Software UK Ltd, Birmingham, Regno Unito) e GraphPad Prism (GraphPad Software Ine., La Jolla, CA).
Tabella 1: Espressione di mRNA chimerici in diversi tumori.
Chimera Seno<a>Ovaio Stomaco Colon Rene Utero n/10 (%) n/2 (%) n/2 (%) n/7 (%) n/2 (%) n/2 (%)
PRKAA-TTC33 8 (80) 2 (100) 2 (100) 7 (100) 2 (100) 2 (100) SAMM50-PAR VB 5 (50) 1 (50) 5 (71) 2 (100) 1 (50) P2RX5- TAXI BP3 2 (20) 5 (71) 1 (50) 1 (50) URBI -C21 ORF 45 8 (80) 1 (100) 7 (100) 2 (100) 2 (100) CTBS-GNG5 8 (80) 1 (50) 2 (100) 7 (100) 2 (100) 2 (100) CHD2-CHMP1A 3 (30) 2 (100) 2 (28) 1 (50) 2 (100) DHX8-ADK 1 (14) 1 (50)
<a>: Tumori; i numeri complessivi sono indicati sotto ciascun tipo di tumore.
Non rilevato.
Legende alle figure
Figura 1. Espressione di mRNA chimerici in linee tumorali
(A) Espressione di chimere identificate dalle librerie dei tessuti tumorali e normali; elettroforesi su agarosio di prodotti di PCR. Linee cellulari tumorali di mammella e ovaio sono indicate; *: SK-BR-3. (B) URB1-C210RF45 (in alto) e CTBS-GNG5 (in basso) espressione in linee di cellule di cancro al seno per RT-PCR quantitativa; i risultati sono espressi come valori percentuali (MCF-7 = 100), 3 campioni sono stati analizzati per replica ad ogni punto. Barre: SD.
(C) CHD2-CHMP1A. Sequenza dell'amplicone PCR contro quella della chimera isolata dalla libreria di seno.
(D) Struttura degli mRNA chimerici convalidati. Partner 5 'e 3' vengono mostrati; le giunzioni degli esoni sono indicate.
Figura 2. Curve di crescita cellulari - analisi di immagine
(A) curve standard di ciascuna linea cellulare in spettrofotometria.
(B, C) Foto di cellule in piastre di crescita sono state prese nei punti temporali indicati, dopo la colorazione con cristal violetto. Dall'alto verso il basso: immagini originali, le immagini convertite, immagini background- sub ctracted. (B) cellule MCF-7 (da sinistra a destra siRNA controllo negativo, siRNA anti-PRKAAl TTC33, siRNA anti-SAMM50 PARVB). (C) cellule HBL-100 (a sinistra: controllo negativo, a destra: siRNA anti-CHD2-CHMP1A).
Figura 3. Regolazione della crescita cellulare da parte degli mRNA chimerici
(A) Controlli e chimera-targeting siRNA sono indicati da diverse tonalità di grigio, (in alto, a sinistra) MCF-7; PRKAA-TTC33, SAMM50 -PARVB, controllo, (in alto, a destra) HBL-100; CHD2-CHMP1A, controllo, (in basso, a sinistra) OVCAR-3; URB1-C210RF45, CTBS-GNG5. (in basso, a destra) HBL-100 trattati con siRNA per chimere provenienti dalle librerie ovari che; URB1-C210RF45, CTBS-GNG5. Bar: SD. Barre: valore P di ANOVA a due vie; significatività al t test di Bonferroni: * = < 0,05; ***: < 0,001.
(B) Real-Time PCR di cellule trasfettate con siRNA. (in alto) RNA chimerici (da sinistra a destra: PRKAA-TTC33 e SAMM50 -PARVB in MCF-7; URB1-C210RF45 e CTBS-GNG5 in OVCAR-3, (in basso) espressione di mRNA partner dopo il trattamento con siRNA (da sinistra a destra: PRKAA-TTC33 e SAMM50 -PARVB in MCF-7).
(C) Analisi in citometria di flusso di cellule HBL-100 e MCF7 trasfettate; YFP è stato utilizzato come parametro di riferimento per efficienza di trasfezione. (a sinistra) HBL-100; LTX o Lipofectamine-2000. (a destra) MCF-7; trasfezione con LTX.
(D) il blocco della crescita delle cellule MCF-7 dopo PRKAA-TTC33 o trattamento con siRNA SAMM50-PARVB-targeting (giorno 6 dopo la trasfezione).
Figura 4. Curve di crescita cellulari ed analisi con PCR quantitativa dei livelli di mRNA chimerici
(A) HBL-100 trasfettate con siRNA anti-PRKAAl-TTC33 o anti-SAMM50-PARVB.
(B) IGROV-1 trasfettate con siRNA anti-CTBS-GNG5.
(C) Da sinistra a destra: siRNA targeting SAMM50-PARVB in HBL-100; URB21-CORF45 in Skov-3; CTBS-GNG5 in IGROV-1; CTBS-GNG5 in Skov-3.
(D) le curve di amplificazione del mRNA URB21-CORF45 chimerico in cellule trasfettate con la siRNA specifico per la fusione: siRNA di controllo, siRNA contro fusioni.
(E) le curve di temperatura di fusione di frammenti di amplificazione di chimere che regolano la crescita. Barre: valore P di ANOVA a due vie; significatività t test di Bonferroni: *: < 0,05; ***: < 0,001.
Figura 5. Espressione degli mRNA chimerici in tessuti normali
(A) (sinistra) analisi elettroforetica su agarosio di prodotti di PCR quantitativa (SYBR Green reaaltime PCR). (a destra) Analisi real-time PCR del mRNA chimerico CHD2-CHMP1A nei tessuti normali (PrimeTime real-time PCR). HBL-100 celi cDNA è stato utilizzato come controllo positivo, (in basso) Amplificazione di mRNA CHD2-CHMP1A in cellule di cancro al seno HBL-100 e tessuto mammario normale. CHD2-CHMP1A (corsie superiori) e GAPDH (corsie in basso) sono stati amplificati in duplicato.
(B) prodotti di PCR di PRKAA1-TTC33, SAMM50-PARVB, CTBS-GNG5 e URBl-C21orf45 nei tessuti normali.
Figura 6. Espressione degli mRNA chimerici in tumori
(A, B) analisi elettroforetica in agarosio dei prodotti di amplificazione. Origine tumorale e numeri di campione sono indicati.
(A) chimere intra-cromosomiche sono state analizzate mediante real-time PCR. PRKAA1-TTC33 e CTBS-GNG5 sono stati diagnosticati in tutti e 25 i tumori; SAMM50-PARVB chimerico è stato trovato in 15 tumori; P2RX5-TAX1BP3 in 8 tumori; URBl-C21orf45 in 21 tumori.
(B) ampliconi PCR della chimera inter-cromosomica CHD2-CHMP1A. (C) chimera inter-cromosomica ADK-DHX8. Temperatura di fusione e curve di amplificazione realtime.
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Claims (7)
- RIVENDICAZIONI 1. Oggetti della presente invenzione sono gli mRNA chimerici regolatori della crescita SAMM50-PARVB e CHD2-CHMP1A.
- 2. Un metodo secondo cui gli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB e CHD2-CHMP1A sono usati a scopo di diagnosi e prognosi dei tumori.
- 3. Un metodo secondo cui gli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB e CHD2-CHMP1A sono usati come bersaglio terapeutico nei tumori e malattie non tumorali.
- 4. Un metodo per la rivelazione e quantificazione degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB e CHD2-CHMP1A nelle cellule, nei tessuti e nei tumori umani, comprese le sequenze dei primer utilizzati a questo scopo.
- 5. Un metodo per inibire l' espressione degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB e CHD2-CHMP1 A.
- 6. Le sequenze degli siRNA inibitori dell’ espressione degli mRNA chimerici PRKAA-TTC33, SAMM50-PARVB e CHD2-CHMP1A, inclusi i vettori plasmidici e virali che le contengono, ed il loro uso in terapia, in particolare anticancro.
- 7. Le composizioni farmaceutiche contenenti gli siRNA inibitori e vettori di cui al punto 6 o loro derivati e diluenti o carrier relativi, accettabili per uso farmaceutico, incluse le modalità di somministrazione delle stesse. Kit comprendenti componenti di cui ai punti 4-7.
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| US20070202076A1 (en) * | 2004-09-23 | 2007-08-30 | Triche Timothy J | Methods and compositions for the targeted delivery of therapeutics |
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2012
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Patent Citations (2)
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