CN112011573A - 一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法，涉及生物技术领域，其技术方案要点是：将慢病毒载体pSLenti‑U6‑shRNA‑CMV‑EGFP‑2A‑Puro中的CMV‑EGFP‑2A‑Puro基因元件替换为hSyn‑mNeonGreen基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示，得到载体pSLenti‑U6‑shRNA‑hSyn‑mNeonGreen；将慢病毒载体pSLenti‑U6‑shRNA‑hSyn‑mNeonGreen中的shRNA基因替换为miR30(mmu‑miR‑29a‑3p)基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示，得到慢病毒载体pSLenti‑U6‑miR30(mmu‑miR‑29a‑3p)‑hSyn‑mNeonGreen，能够有效提高小鼠原代神经元的感染能力，增强目的基因转导效率，实现目的基因长期、稳定表达。

Description

一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法。
背景技术
原代细胞(primary cell)是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。然而，目前尚未有转染小鼠原代神经元的慢病毒载体。
因此，如何研究设计一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法是我们目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体及构建方法，能够有效提高小鼠原代神经元的感染能力，增强目的基因转导效率，实现目的基因长期、稳定表达。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，提供了一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体，包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：U6启动子、miR30(mmu-miR-29a-3p)基因、hSyn启动子、mNeonGreen标记基因。
优选的，所述hSyn-mNeonGreen基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述miR30(mmu-miR-29a-3p)基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，提供了一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)将慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-2A-Puro中的CMV-EGFP-2A-Puro基因元件替换为hSyn-mNeonGreen基因，得到载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen，hSyn-mNeonGreen基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen中的shRNA基因替换为miR30(mmu-miR-29a-3p)基因，得到慢病毒载体pSLenti-U6-miR30(mmu-miR-29a-3p)-hSyn-mNeonGreen，miR30核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，在步骤(1)中，将SEQ ID NO.1所示的hSyn-mNeonGreen基因插入到pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-2A-Puro中的上游克隆酶切位点EcoRI、下游克隆酶切位点SpeI之间，基因大小为1199bp。
优选的，所述步骤(1)中PCR扩增的引物核酸序列为：
正向测序引物GL427-F：AGCTACTCCACCACTTGTTC SEQ ID NO.3；
正向测序引物WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA SEQ ID NO.4。
优选的，在步骤(2)中，将SEQ ID NO.2所示的miR30(mmu-miR-29a-3p)基因插入到慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen中的上游克隆酶切位点AgeI、下游克隆酶切位点EcoRI之间，基因大小为331bp。
优选的，所述步骤(2)中PCR扩增的引物核酸序列为：
正向测序引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG SEQ ID NO.5；
反向测序引物H15546-R：GTTGGGTGCTTGTCCAGTG SEQ ID NO.6。
第三方面，一种慢病毒，所述慢病毒包含第一方面任意一项所述的慢病毒载体。
第四方面，一种检测试剂盒，所述检测试剂包含第三方面所述的慢病毒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：在感染能力方面可有效地感染小鼠原代神经元，从而达到良好的的基因治疗效果；对于小鼠原代神经元难转染问题，能大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中GL427空载体图谱；
图2是本发明实施例中H15546载体全图谱；
图3是本发明实施例中H15546空载体图谱；
图4是本发明实施例中H15850载体全图谱；
图5是本发明实施例中H15850感染荧光效果图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图1-5及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
一、H15546载体制备
(1)将慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-2A-Puro中的CMV-EGFP-2A-Puro基因元件替换为hSyn-mNeonGreen基因，得到载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen。
hSyn-mNeonGreen基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体说明如表1所示：
表1
Figure BDA0002594869070000041
Figure BDA0002594869070000051
将SEQ ID NO.1所示的hSyn-mNeonGreen基因插入到pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-2A-Puro中的上游克隆酶切位点EcoRI、下游克隆酶切位点SpeI之间，基因大小为1199bp。
其中，PCR扩增的引物核酸序列为：
正向测序引物GL427-F：AGCTACTCCACCACTTGTTC SEQ ID NO.3；
正向测序引物WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA SEQ ID NO.4。
二、H15850载体制备
将慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen中的shRNA基因替换为miR30(mmu-miR-29a-3p)基因；得到慢病毒载体pSLenti-U6-miR30(mmu-miR-29a-3p)-hSyn-mNeonGreen。
miR30(mmu-miR-29a-3p)基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，PCR扩增的引物核酸序列为：
正向测序引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG SEQ ID NO.6；
反向测序引物H15546-R：GTTGGGTGCTTGTCCAGTG SEQ ID NO.7。
具体说明如表2所示：
表2
Figure BDA0002594869070000052
Figure BDA0002594869070000061
将SEQ ID NO.2所示的miR30(mmu-miR-29a-3p)基因插入到慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen中的上游克隆酶切位点AgeI、下游克隆酶切位点EcoRI之间，基因大小为331bp。
三、目的基因片段的获得
方法一：通过PCR进行扩增得到目的基因
从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI软件进行引物设计。
()PCR扩增目的基因：使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因，反应体系和条件如下：
(1)按下列组分配置PCR反应液
Figure BDA0002594869070000062
＊【50μlPCR反应体系中模板DNA推荐使用量】
Figure BDA0002594869070000063
(2)PCR反应条件
①3Step法
Figure BDA0002594869070000064
②2Step法
Figure BDA0002594869070000065
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
方法二：通过酶切得到目的基因
用限制性内切酶对含有目的基因的质粒进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0做胶回收。
四、线性化表达载体的制备
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
五、目的基因构建入线性化表达载体中
方法一：使用无缝克隆试剂盒(单个目的基因插入片段适用)
将目的基因片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应。反应体系如下：
Figure BDA0002594869070000081
最适插入片段使用量＝[0.04x插入片段碱基数]ng(0.03pmol)；最适线性化载体使用量＝[0.02x线性化载体碱基数]ng(0.03pmol)；混匀后在37℃孵育30分种，然后转移到冰上放置5分钟。直接转化或者置于-20℃保存等需要转化时解冻转化。
方法二：使用无缝组装试剂盒(多个目的基因插入片段适用)
将目的基因片段和线性化载体以摩尔比1:1加到离心管中进行重组反应。反应体系如下：
Figure BDA0002594869070000082
最适插入片段使用量＝[0.02x插入片段碱基数]ng(0.03pmol)；最适线性化载体使用量＝[0.02x线性化载体碱基数]ng(0.03pmol)；混匀后在37℃孵育30分种，然后转移到冰上放置5分钟。直接转化或者置于-20℃保存等需要转化时解冻转化。
方法三：使用T4 DNA连接酶
将目的基因片段和线性化载体以摩尔比3:1加到离心管中进行连接反应。线性化的表达载体一般加入100ng，目的基因片段加入量为300x目的基因碱基对数/线性化的表达载体碱基对数(单位ng)。
试剂 自连对照(μl) 连接组(μl)
目的基因片段 0 摩尔比3
线性化的表达载体 摩尔比1 摩尔比1
10x Buffer 2 2
T4 DNA连接酶 1 1
dd H<sub>2</sub>O Up to 20 Up to 20
混匀后在16℃连接过夜，取10μL反应液体转化到感受态细胞中。
六、感受态细胞的制备和转化
DH5α感受态细胞的制备和转化，详见《精编分子生物学实验指南》②
七、菌落PCR鉴定阳性转化子
挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl作为模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：
PCR反应液组成
Figure BDA0002594869070000091
PCR反应条件
3Step PCR
Figure BDA0002594869070000092
2Step PCR
Figure BDA0002594869070000093
八、阳性克隆送测序
菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
九、质粒小提
测序通过的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。
十、H15850慢病毒滴定测试
滴度(Transducing Units per ml，TU ml-1)的计算公式如下：
TU ml-1＝(C×N×D×1000)/V
其中，C为平均每基因组整合的病毒拷贝数，N为感染时细胞的数目(约为2×105)；D为病毒载体的稀释倍数；V为加入的稀释病毒的体积数(μl)。
测试结果如下：
Figure BDA0002594869070000101
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Figure RE-IDA0002740496740000011
Figure RE-IDA0002740496740000021
Figure RE-IDA0002740496740000031
Figure RE-IDA0002740496740000041

Claims (10)

1.一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体，其特征是，包括基因元件组成的基因片段，所述基因元件按以下顺序顺次连接：U6启动子、miR30(mmu-miR-29a-3p)基因、hSyn启动子、mNeonGreen标记基因。
2.根据权利要求1所述的一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体，其特征是，所述hSyn-mNeonGreen基因片段的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体，其特征是，所述miR30(mmu-miR-29a-3p)基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)将慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-2A-Puro中的CMV-EGFP-2A-Puro基因元件替换为hSyn-mNeonGreen基因，得到载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen，hSyn-mNeonGreen基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen中的shRNA基因替换为miR30(mmu-miR-29a-3p)基因，得到慢病毒载体pSLenti-U6-miR30(mmu-miR-29a-3p)-hSyn-mNeonGreen，miR30核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求4所述的一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体的构建方法，其特征是，在步骤(1)中，将SEQ ID NO.1所示的hSyn-mNeonGreen基因插入到pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-2A-Puro中的上游克隆酶切位点EcoRI、下游克隆酶切位点SpeI之间，基因大小为1199bp。
6.根据权利要求5所述的一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体的构建方法，其特征是，所述步骤(1)中PCR扩增的引物核酸序列为：
正向测序引物GL427-F：AGCTACTCCACCACTTGTTC SEQ ID NO.3；
正向测序引物WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA SEQ ID NO.4。
7.根据权利要求4所述的一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体的构建方法，其特征是，在步骤(2)中，将SEQ ID NO.2所示的miR30(mmu-miR-29a-3p)基因插入到慢病毒载体pSLenti-U6-shRNA-hSyn-mNeonGreen中的上游克隆酶切位点AgeI、下游克隆酶切位点EcoRI之间，基因大小为331bp。
8.根据权利要求7所述的一种转染小鼠原代神经元的慢病毒载体的构建方法，其特征是，所述步骤(2)中PCR扩增的引物核酸序列为：
正向测序引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG SEQ ID NO.5；
反向测序引物H15546-R：GTTGGGTGCTTGTCCAGTG SEQ ID NO.6。
9.一种慢病毒，其特征是，所述慢病毒包含如权利要求1-3任意一项所述的慢病毒载体。
10.一种检测试剂盒，其特征是，所述检测试剂包含如权利要求9所述的慢病毒。
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陈煜等: "RNAi的作用机制及抗病毒研究进展", 《世界华人消化杂志》, vol. 14, no. 21, 28 July 2016 (2016-07-28) *

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