CN102917709A - 弗林蛋白酶敲减和gm-csf增强的（fang）癌症疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明包括用于癌症治疗的组合物和方法。更具体而言，本发明描述了经基因修饰用于弗林蛋白酶敲减和GM-CSF表达的自体癌症疫苗。本文所述疫苗通过使用双功能shRNA敲减癌细胞中的弗林蛋白酶表达来减弱TGF-β的免疫抑制活性，并通过GM-CSF转基因的表达增强肿瘤抗原的表达，呈递和加工。
Description
技术领域
本发明大体上涉及疫苗开发领域，更具体而言，涉及制备和使用经基因修饰以敲减弗林蛋白酶并表达GM-CSF的自体癌症疫苗的方法和组合物的开发。
发明背景
在不限制本发明范围的前提下，结合基因修饰的全细胞癌症疫苗的开发来描述本发明的背景。更具体而言，本发明涉及能够通过GM-CSF转基因的表达增强肿瘤抗原表达、呈递和处理，以及通过弗林蛋白酶双功能shRNA转基因诱导的敲减来减弱分泌免疫抑制活性的疫苗。
对于癌症疫苗的免疫耐受的流行假说包括肿瘤细胞的低免疫原性，缺乏专职抗原呈递细胞的合适呈递，抗原缺失变异体的免疫选择，肿瘤诱导的免疫抑制，和肿瘤诱导的隔离部位。全癌细胞疫苗可潜在地引起针对明确和不明确的肿瘤抗原的广泛、多价的免疫应答，从而通过下调和/或选择抗原缺失变异体来解决肿瘤耐药性的可能性。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，通常缩写为GM-CSF，为巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞所分泌的蛋白。当整合为细胞因子转基因时，GM-CSF提高癌症疫苗肽，肿瘤细胞裂解物，或来自自体患者肿瘤细胞或确立的异基因肿瘤细胞系的全肿瘤细胞的呈递。GM-CSF诱导造血前体的分化并将其吸引至接种位点。GM-CSF也充当树突细胞成熟和活化过程的佐剂。然而，由肿瘤细胞产生和/或分泌的转化因子β（TGF-β）的不同同工型可抑制GM-CSF介导的免疫致敏。多功能蛋白的TGF-β家族具有众所周知的免疫抑制活性。三种已知的TGF-β配体（TGF-β1、β2和β3）普遍存在于人类癌症中。TGF-β的过表达与肿瘤进展及不良预后相关。肿瘤微环境中TGF-β水平升高与无免疫性的肿瘤反应相关。TGF-β直接和间接抑制GM-CSF诱导的树突细胞的成熟及其表达II类MHC和共刺激分子。TGF-β对GM-CSF介导的免疫活化的负面影响支持在基于GM-CSF的癌细胞疫苗中消耗TGF-β分泌的依据。
所有TGF-β成熟的同工型需要弗林蛋白酶介导的限制性蛋白酶切以获得适当活性。弗林蛋白酶是一种钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，为枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的成员。弗林蛋白酶最为知名的是通过相应的免疫调节分支对TGF-β进行功能活化。除了前述的肿瘤分泌的TGF-β的免疫抑制活性，已发现T淋巴细胞中内源性表达的弗林蛋白酶的条件性缺失允许T细胞正常发育，但损坏调节和效应T细胞的功能，从而产生较少的TGF-β1。T细胞表达的弗林蛋白酶表现为在维持外周耐受中不可缺少，这至少部分由于其在调节TGF-β1产生中具有非重复的必需的功能。
已证明几乎在所有癌细胞系中均有高水平的弗林蛋白酶。发明人和其他人员发现人类结肠直肠癌，肺癌和黑色素瘤细胞产生高达10倍的较高水平的TGF-β1，并可能较高幅度地影响免疫耐受状态。肿瘤细胞中弗林蛋白酶的存在很可能显著有助于维持肿瘤引导的TGF-β介导的外周免疫耐受。因此弗林蛋白酶敲减代表优化GM-CSF介导的免疫致敏的新颖并具吸引力的方法。
干扰素-γ（γIFN）为重要的免疫调节细胞因子，其在宿主固有和适应性免疫应答和肿瘤控制中起关键作用。γIFN也称为II型干扰素，为表达在多个水平上受到调节的单拷贝基因。γIFN通过免疫相关基因的转录调节与各种不同系列的细胞程序相关。最初认为CD4+辅助性T细胞1型（Th1）淋巴细胞，CD8+细胞毒性的淋巴细胞，和NK细胞专有地产生γIFN。然而，现在有证据显示其它细胞，如B细胞，NKT细胞和专职性抗原呈递细胞（APC）分泌γIFN。由局部作用的专职性APC[单核细胞/巨噬细胞，树突细胞（DC）]产生γIFN在细胞自活化及附近细胞的活化中可以是重要的。由NK细胞和可能的专职APC分泌γIFN很可能在针对感染的早期宿主防御中起重要作用，而T淋巴细胞成为适应性免疫应答中γIFN的主要来源。此外，已确定γIFN在预防原发性和移植肿瘤的发展中的作用。γIFN产生受APC分泌的细胞因子控制，尤其是白细胞介素(IL)-12和IL-18。γIFN产生的负调节物包括IL-4、IL-10、糖皮质激素和TGF-β。
发明概述
本发明还提供了自体（即患者特异性的）癌症疫苗组合物（FANG疫苗），其包括治疗有效量的具有shRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体的细胞。该载体包括编码GM-CSF的第一核酸，所述的GM-CSF其可以是人GM-CSF，和第二核酸插入物，其编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物的区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。两个核酸插入物均可操作地连接于启动子。所述的shRNA可以是双功能的，同时包含（剪切依赖性）RISC（RNA诱导的沉默复合物）格式化siRNA和（非剪切依赖性的RISC格式化的）miRNA或miRNA样基序。在本发明的一个实施方案中，所述的shRNA为弗林蛋白酶表达的RISC剪切依赖性和RISC非剪切依赖性抑制剂。此外，所述表达载体可包含插入至第一和第二核酸插入物之间的小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽（skip peptide），并且所述的启动子可以是包含增强子序列和内含子的CMV哺乳动物启动子。双功能shRNA所靶向的mRNA序列不限于编码序列；在一个实施方案中，shRNA可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的3’非翻译区域（3’-UTR）序列，以及在一个实施方案中可同时靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的编码序列和3’-UTR序列。用于制备疫苗的细胞可为自体肿瘤细胞，但也可使用异种移植扩增的自体肿瘤细胞，异基因肿瘤细胞，异种移植扩增的异基因肿瘤细胞或其组合。给予患者的疫苗剂量包含1x 107个至2.5x 107个细胞。所述的FANG疫苗可与治疗有效量的γIFN（γ干扰素）联合给予。γIFN的剂量范围可为50或100μg/m2。
本发明描述了自体细胞疫苗组合物，其包括：bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒和一种或多种任选的疫苗。所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物和可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的cDNA，以及其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。在一个方面中，所述的GM-CSF为人的。在另一个方面中所述的shRNA包括siRNA（剪切依赖性RISC格式化的）和miRNA或miRNA样（非剪切依赖性的RISC格式化的）模体。如本文所述的shRNA可以是弗林蛋白酶表达的剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化抑制剂，并进一步限定为双功能shRNA。
在另一个方面中，将小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽插入至第一和第二核酸插入物之间。在再另一个方面中，所述启动子为包含CMV IE 5’UTR增强子序列和CMV IE内含子A的CMV哺乳动物启动子。在一个相关方面中CMV哺乳动物启动子。在其它方面中，shRNA所靶向的区域为弗林蛋白酶mRNA转录物的3’UTR区域序列，并且shRNA所靶向的区域为弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域。
本发明提供了预防，治疗和/或减轻患者癌症症状的方法，其包括步骤：确定需要预防，治疗和/或减轻癌症症状的患者，并给予自体细胞疫苗，所述自体细胞疫苗包含bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，可操作地连接于启动子的第二核酸插入物和一种或多种任选的疫苗佐剂，其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）cDNA，其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。
该方法进一步包括步骤：通过测量一个或多个癌细胞中的转化生长因子beta（TGF-beta或TGF-β）和GM-CSF的水平来监控治疗进展和根据TGF-β和GM-CSF的水平改变自体细胞疫苗的给予，其中TGF-β水平下降和GM-CSF水平升高表明治疗成功。按照本发明所述方法，TGF-β选自TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3中至少一种。在一个方面中，癌症选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤以及来自患者的产生TGF-β的其他癌症。在另一个方面中，shRNA包含siRNA（剪切依赖性RISC格式化的）和miRNA或miRNA样（非剪切依赖性RISC格式化的）基序，并且shRNA为弗林蛋白酶表达的剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化抑制剂。在又一个方面中，将shRNA进一步限定为双功能shRNA。
在另一个实施方案中，本发明公开了自体弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）增强（FANG）的癌症疫苗组合物，其包括：bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，可操作地连接于启动子的第二核酸插入物和一种或多种任选的疫苗佐剂其中所述第一插入物编码GM-CSF cDNA，以及其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。本发明所述组合物用于预防，治疗和/或减轻癌症症状，其中所述癌症选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤以及来自患者的产生TGF-β的其他癌症。
在又一个实施方案中，本发明为通过给予弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）增强（FANG）的癌症疫苗来治疗、预防和/或减轻患者的非小细胞肺癌（NSCLC）症状的方法，其包括步骤：确定需要预防，治疗和/或减轻NSCLC症状的患者，和给予FANG疫苗，所述FANG疫苗包括bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，可操作地连接于启动子的第二核酸插入物和一种或多种任选的疫苗佐剂，其中所述第一插入物编码GM-CSFcDNA，以及其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。本发明所述方法进一步包括步骤：通过测量一个或多个NSCLC细胞中的转化生长因子β（TGF-beta或TGF-β）和GM-CSF的水平来监控治疗进展和根据TGF-β和GM-CSF的水平改变自体细胞疫苗的给予，其中TGF-β水平下降和GM-CSF水平升高表明治疗成功。在本发明的一个方面中，TGF-β选自TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3中的至少一种。
在又一个实施方案中，本发明描述了制备弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞聚落刺激因子（GM-CSF）增强（FANG）的癌症疫苗，其包括步骤：（i）从患者中无菌采集一个或多个癌细胞，（ii）将所采集的细胞置于无菌容器中的抗生素溶液中，（iii）由所采集的溶液形成细胞悬浮液，其中细胞形成（iv）悬浮液通过酶分解，机械解聚或两者来实现，（v）通过对细胞悬浮液进行电穿孔而对细胞进行基因修饰，以制备具有bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒的疫苗，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物和可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第一插入物编码GM-CSF cDNA，以及其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达，（vi）收获该疫苗，（vii）辐照该疫苗和（vii）冷冻该疫苗。
在该方法的一个方面中，一个或多个癌细胞采集自患有癌症的患者，所述癌症选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤以及来自患者的产生TGF-β的其他癌症。在另一个方面中，通过辐照使基因修饰的细胞无法增殖。在又一个方面中，基因修饰的细胞为自体、异基因或异种移植扩增细胞。
在一个方面中，异基因细胞为确立细胞系。在另一个方面中，将基因修饰的细胞每月给予受试者一次，剂量可达12次，其中给予受试者的基因修饰细胞的剂量为1x 107个细胞/次注射至5x 107个细胞/次注射，并且基因修饰细胞的给予是与另一种治疗剂联合治疗的部分。在再另一个方面中，用于联合治疗的另一种治疗药物为γIFN，其中在联合治疗中给予受试者的γIFN的剂量为50或100μg/m2。本发明的方法进一步包括转染后使用γIFN温育基因修饰的细胞的步骤，其中转染后施加于基因修饰的细胞的γIFN的剂量为250U/ml（500U/ml施加24小时至100U/ml施加48小时）。
本发明的另一个实施方案为通过敲减弗林蛋白酶来抑制转化生长因子β（TGF-β）表达的siRNA介导的方法。该方法包括选择靶细胞并使用表达载体转染该靶细胞的步骤，所述的表达载体包括启动子以及可操作地连接于该启动子的核酸插入物。该插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。shRNA可为双功能的，即其可同时包含siRNA（剪切依赖性RISC格式化的）和miRNA或miRNA样（非剪切依赖性RISC格式化的）基序，并以剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化两者的方式抑制弗林蛋白酶表达。另外，表达载体可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域，或其可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的3’UTR区域序列，或其可同时靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域和3’UTR序列两者。
本发明还提供了在靶细胞中增强抗原表达、呈递和处理，以及减弱转化生长因子β（TGF-beta或TGF-β）的分泌免疫抑制活性的方法。该方法包括选择靶细胞并使用包括两个插入物的表达载体转染靶细胞的步骤。用于转染靶细胞的技术可为质粒载体电穿孔。第一核酸插入物编码GM-CSF，而第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。两种插入物均可操作地连接于启动子。敲减弗林蛋白酶表达可阻止其活化的TGF-β同工型包括TGF-β-1，TGF-β-2和TGF-β-3。靶细胞可以包括自体或异基因细胞，其可为确立的人类细胞系。
本发明也包括通过给予患者FANG疫苗而预防、治疗和/或减轻癌症症状的方法。该方法包括步骤：（i）确定需要治疗的受试者；（ii）从受试者中采集癌组织样本；（iii）对所采集的癌症样本中的癌细胞进行基因修饰；和（iv）将治疗有效量的基因修饰的细胞给予受试者。用于转染细胞的表达载体包括两个核酸插入物。第一核酸插入物编码GM-CSF并可操作地连接于启动子。第二核酸插入物也可操作地连接于启动子，并且其编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。在本发明的一个实施方案中，靶向治疗的癌症为人黑色素瘤或非小细胞肺癌。为使基因修饰的细胞无法增殖，可对其进行辐照。在FANG疫苗中的基因修饰的细胞可为自体细胞、异基因细胞、异种移植扩增细胞、确立的人类细胞系或这些细胞类型的组合。将细胞每月给予受试者一次以进行接种，剂量可达12次，各剂量含有1x107个细胞至2.5x107个细胞。剂量增加至5x107个细胞显示安全。
基因修饰细胞可作为独立疗法进行给予；然而其也可作为联合治疗的部分进行给予。在本发明的该实施方案中，FANG疫苗可与另外的一种治疗剂（或多种治疗剂）组合给予，所述治疗剂例如但不限于IL-12、IL-15和/或γIFN。当使用FANG疫苗的治疗中包括γIFN时，方法包括在转染后分别使用约100U/ml的γIFN温育基因修饰的细胞48小时，或使用500U/ml温育24小时的另一步骤。在联合治疗中，将细胞每月一次，多达12剂地给予受试者，各个剂一般地含有1x107个细胞至2.5x107个细胞（虽然高达5x107个细胞的剂量显示安全）加上剂量为50或100μg/m2的γIFN。该方法进一步包括在转染后使用γIFN温育基因修饰的细胞的步骤，其中转染后施加于基因修饰的细胞的γIFN的剂量为约250U/ml。
本发明包括通过RNA干扰弗林蛋白酶来抑制TGF-β的独特方法，所述弗林蛋白酶为前蛋白转化酶，其关键性地参与所有TGF-β同工型的功能性加工。FANG载体独特地包括特异性地敲减弗林蛋白酶的双功能小发夹构建体（shRNA弗林蛋白酶）。本发明所述双功能shRNA弗林蛋白酶包括具有miR-30a骨架的两个茎环结构。第一茎环结构为siRNA前体组分，而第二茎环结构为miRNA样前体组分。在该实施方案中，策略为使用RNA干扰的剪切和螯合两者机制的单一靶向位点。在一个实施方案中，策略为使用两个不同的靶向位点，其中一个用于剪切，一个用于螯合组分，分别包括但不限于mRNA转录物的编码区域和mRNA转录物的3’UTR区域。在该实施方案中，双功能shRNA弗林蛋白酶由具有miR-30a骨架的两个茎环结构组成；第一茎环结构具有完全互补的引导链（guiding strand）和乘客链（passengerstrand），而第二茎环结构在乘客链的9至11位具有三个碱基对（bp）错配。在一个实施方案中，双功能shRNA弗林蛋白酶由具有miR-30a骨架的两个茎环结构组成；第一茎环结构具有完全互补的引导链和乘客链，而第二茎环结构在引导链的9至11位具有三个碱基对（bp）错配。在其它实施方案中，碱基对（bp）错配可占据防止Ago 2介导的剪切的位置，使其在热力学上有利于乘客链脱离。在其它实施方案中，碱基对错配会占据引导链的位置。FANG构建体包含GM-CSF和在驱动整个盒的哺乳动物启动子（CMV）控制下的双功能shRNA弗林蛋白酶转录物。该构建体用于产生经基因修饰以敲减弗林蛋白酶并表达GM-CSF的自体（即患者特异性）癌症疫苗。
本发明中用于制备FANG疫苗的构建体包括包含两个核酸插入物的双功能shRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒。第一核酸插入物可操作地连接于启动子，并且编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的cDNA。第二核酸插入物也可操作地连接于启动子，并且编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。本发明所述双功能shRNA具有两种作用机制途径，siRNA的作用机制途径和miRNA的作用机制途径。因此，本发明所述双功能shRNA与传统shRNA不同，即通过siRNA作用机制发挥作用的DNA转录衍生的RNA，或与“成对shRNA”不同，所述成对shRNA指各自针对两种不同基因的表达但以传统siRNA模式发挥作用的两个shRNA。在本发明的一个实施方案中，GM-CSF为人的。shRNA为双功能的，并同时包括siRNA（剪切依赖性RISC格式化的）和miRNA或miRNA样（非剪切依赖性RISC格式化的）基序之一。在本发明的一个实施方案中，shRNA为弗林蛋白酶表达的剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化抑制剂。表达载体可包含插入至第一和第二核酸插入物之间的小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽，并且启动子可为包含CMV IE 5’UTR增强子序列和CMV IE内含子A的CMV哺乳动物启动子。双功能shRNA所靶向的mRNA序列不限于编码序列；在一个实施方案中，shRNA可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的3’未翻译区域（UTR）序列，在一个实施方案中可同时靶向编码序列和弗林蛋白酶mRNA转录物的3’UTR序列。
本发明也包括可用于特异性敲减靶细胞中弗林蛋白酶表达的载体。该shRNA弗林蛋白酶表达载体包括可操作地连接于启动子的核酸插入物。该插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。双功能shRNA可同时包括siRNA（剪切依赖性RISC格式化）和miRNA或miRNA样（非剪切依赖性RISC格式化）基序，并以剪切依赖性RISC格式化和非剪切依赖性RISC格式化方式抑制弗林蛋白酶表达。此外，表达载体可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域，或其可靶向弗林蛋白酶mRNA转录物的3’UTR区域序列，或其可同时靶向编码序列和弗林蛋白酶mRNA转录物的3’UTR序列。
附图的简要说明
为了更全面地了解本发明的特征和优点，在此参照本发明的详述以及附图，其中：
图1A-1C为图表，其显示FANG质粒转染前后（1A）TGF-β1，（1B）-β2，和（1C）GMCSF蛋白产生的概况。第4天起测定的人造自体癌细胞产生细胞因子14天ELISA值。数据代表由经历FANG加工的10名患者独立生成的自体疫苗（FANG 001-010）。
图2A-2F为图表，其显示：FANG cGMP质粒转染前后FANG-004肿瘤细胞中的（2A）TGF-β1，（2B）TGF-β2，和（2C）GMCSF表达，及TAG cGMP质粒转染前后TAG-004肿瘤细胞中的（2D）TGF-β1，（2E）TGF-β2，和（2F）GMCSF表达。FANG-004和TAG-004来自相同肿瘤并依次在相同的两天中进行加工以表示为可比的表达谱；
图3A-3C为图表，其显示患者肿瘤细胞中的FANG质粒（cGMP疫苗制造过程）与TAG质粒的电穿孔的并排比较，证明（3C）产生GMCSF蛋白并随附显示（3A）由FANG并非TAG敲减的TGF-β1表达，和（3B）FANG和TAG两者敲减的TGF-β2（重合线）；
图4A为示意图，其显示bi-shRNA弗林蛋白酶包括具有miR-30a骨架的两个茎环结构（SEQ ID NO.:1）；第一茎环结构具有完全互补的引导链和乘客链，而第二茎环结构在乘客链的9至11位具有三个碱基对（bp）错配；
图4B显示弗林蛋白酶mRNA的siRNA靶向区域。弗林蛋白酶mRNA的3’UTR和编码区域中可能的siRNA靶向区域和各siRNA所靶向的序列；
图5为显示TAG表现为显著应答后，患者进行11个循环的PET CT的图像。用MRI扫描及活检追踪L 2处的残余摄取，显示无恶性肿瘤；
图6A-6C显示对GMCSF表达和TGF-β1和-β2敲减的评估，总结为：FANG或TAG（TAG 004）质粒转染前后的（6A）TGF-β1，（6B）TGF-β2，（6C）GM-CSF蛋白产生。值代表经FANG转染的所采集的自体癌细胞中细胞因子产生的ELISA测定值。数据代表由经历FANG加工的9名患者独立产生的自体疫苗（FANG 001–009）。一名患者具有足以构建FANG（蓝色）和TAG疫苗（红色）的组织（FANG 004/TAG 004）；
图7显示了在FANG转染前后/辐照的肿瘤细胞中由RT-qPCR测得的GMCSF mRNA。某些泳道中缺少条带是由于RNA降解。（FANG-009中的额外条带是载样两次的第0天样品）；
图8显示了来自患者转染和辐照mRNA前和转染和辐照mRNA后，由PCR测得的FANG疫苗细胞。在转染前后的样品中未检测到TGF-β2的信号；
图9显示了转染mRNA前和转染/辐射mRNA后由PCR测得的FANG-009疫苗细胞；
图10显示了晚期患者的群组1与群组2和3的总生存率（n=61；P=.0186）；
图11显示了GM-CSF-TGF-β2反义（TAG）质粒的示意图；
图12显示了包含pUMVC3-GM-C SF-2A-TGF-β2反义载体的NCI-H-460鳞状细胞和NCI-H-520大细胞（NSCLC）中的GM-CSF的体外表达；
图13显示具有pUMVC3-GM-CSF-2A-TGF-β2反义（TAG）载体的NCI-H-460鳞状细胞和NCI-H-520大细胞（NSCLC）中TGF-β2水平降低；
图14显示251个碱基对的探针特异性检测在NCI-H-460和NCI-H-520细胞中体外表达的GM-CSF-2A-TGF-β2（TAG）转录物（第6和10道）；
图15显示GM-CSF在TAG疫苗中的表达；
图16显示TGF-β1在TAG疫苗中的表达；
图17显示TGF-β2在TAG疫苗中的表达；
图18A和18B显示在siRNA弗林蛋白酶敲减后（14A）TGF-β1和（14B）TGF-β2在人类癌细胞系中的表达；和
图19显示FANG的质粒构建体。
发明详述
虽然以下详细讨论本发明的各种实施方案的制备和使用，但应认识到本发明提供了许多在多种特定环境中可实现的适用的发明构思。本文所讨论的具体实施方案仅描述制备和使用本发明的具体方式，并不限定本发明的范围。
为了便于理解本发明，以下定义了多个术语。本文所定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员一般地理解的含义。术语如“一个（a）”，“一个（an）”和“该（the）”不仅指单个实体，而且包括一般类别，其中使用特定实例进行说明。本文所述术语用于描述本发明的具体实施方案，但除了在权利要求中概述外，其使用不限定本发明。
考虑可实施本说明书所讨论的关于本发明的任何方法，试剂盒，试剂，或组合物的任何实施方案，反之亦然、此外，本发明所述组合物可用于实现本发明所述方法。
表1：缩写表
弗林蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的成员（人类弗林蛋白酶登录号NM_002569）。该家族的成员为将潜伏的前体蛋白加工成其生物活性产物的内切蛋白酶（PC）。弗林蛋白酶为钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，有效地按照Arg-X-K/Arg-Arg（RXK/RR）的共有序列在成对碱性氨基酸加工位点剪切前体蛋白，其中-RXXR-构成最小剪切位点。与许多其它蛋白酶一样，PC合成为具有N-端前片段延伸的非活性酶原，该延伸在内质网中自催化去除以得到功能。
已证明几乎在所有癌细胞系中均有高水平的弗林蛋白酶。人类结肠直肠癌、肺癌和黑色素瘤细胞可产生10倍的更高水平的TGF-β1，并可能较高幅度地影响免疫耐受状态。转化生长因子β类（TGF-β）为具有众所周知的免疫抑制活性的多功能蛋白家族。三种已知的TGF-β配体（TGF-β1-3，登录号分别为NM_000660，NM_003238，NM_003239.2）普遍存在于人类癌症中。TGF-β的过表达与肿瘤进展及不良预后相关。肿瘤微环境中TGF-β水平升高与无肿瘤反应相关。肿瘤细胞中弗林蛋白酶的存在可能显著有助于维持肿瘤引导的TGF-β介导的外周免疫耐受。因此弗林蛋白酶敲减代表了新颖并具吸引力的将免疫致敏优化的方法。
用于人黑色素瘤和肺癌的弗林蛋白酶敲减和GM-CSF增强的（FANG）自体癌症疫苗：FANG独特地包括特异性地敲减弗林蛋白酶的双功能小发夹构建体（shRNA弗林蛋白酶），所述弗林蛋白酶为关键性地参与所有TGF-β同工型的功能性加工的前蛋白转化酶。本发明人的前期工作已证明FANG可有效在人癌细胞系中产生CM-CSF表达和消耗TGF-β1和TGF-β2。本文表明将双功能shRNA弗林蛋白酶与hGM-CSF组合并入自体细胞疫苗可根据其对免疫应答传入支的影响来促进和提高免疫应答。
如本文所使用的，术语“双功能”是指shRNA具有两种作用机制途径，siRNA的作用机制途径，和miRNA（不与mRNA转录物互补的引导链）或miRNA样（与mRNA转录物互补的引导链）之一的作用机制途径。术语“传统”shRNA是指通过siRNA作用机制发挥作用的DNA转录衍生的RNA。术语“成对shRNA”是指两个shRNA，各自针对两种不同基因的表达但以传统siRNA模式发挥作用。
使用二线化疗治疗后，患晚期NSCLC的患者的存活时间为7个月或更短，所述NSCLC为涉及男性和女性的常见癌症。此癌症相关的有限的生存获益和与癌症和治疗相关的毒性通常迫使患者拒绝进一步治疗。使用本文所述的本发明的新颖而成熟的技术显示安全性和广泛的临床依据，包括与“靶向”免疫刺激和内源性免疫抑制的抑制相关的明显应答的实例，可提供安全和潜在有效的临床评估的机会。本发明所述RNA干扰技术和疫苗生产的商业扩张将提供通向管理NSCLC和可能的其它实体肿瘤的机会，特别是黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌和乳腺癌。
使用癌症疫苗战胜免疫耐受是有希望但较困难的探索。主要基于动物研究的免疫耐受的流行假说包括肿瘤细胞的低免疫原性，缺乏专职抗原呈递细胞的合适呈递，抗原缺失变异体的免疫选择，肿瘤诱导的免疫抑制，和肿瘤诱导的特权位点[1]。然而最近基于转基因表达全癌细胞疫苗的临床试验已获得有希望的结果[2-5]。全癌细胞疫苗可潜在地引起针对明确和不明确的肿瘤抗原的广泛、多价的免疫应答，从而通过下调和/或选择抗原缺失变异体来解决肿瘤耐药性的可能性[6,7]。
Dranoff和Jaffee在动物模型中显示[8]，与其它细胞因子相比，经基因修饰以分泌GM-CSF的肿瘤细胞始终显示为最强力地诱导抗肿瘤免疫。当整合为细胞因子转基因时，GM-CSF可提高癌症疫苗肽，肿瘤细胞裂解物，或来自自体或确立的异基因肿瘤细胞系的全肿瘤细胞的呈递[9]。GM-CSF诱导造血前体分化为专职抗原呈递（APC）树突细胞（DC）并将其吸引至接种位点[8,10]。GM-CSF也充当DC成熟和肿瘤抗原捕获、加工和呈递的活化过程的佐剂，上调其共刺激分子的表达及其迁移至第二淋巴组织的能力，以活化CD4+、CD8+T细胞，CD1d限制的恒定自然杀伤细胞T（NKT），和产生抗体的B细胞[11]。
最近，Hodi[12]报导了GVAX接种，接着定期输注抗-CTLA-4抗体来调节效应子和T调节细胞功能，可在大多数转移性黑色素瘤患者中产生具有临床意义的抗肿瘤免疫。这些研究结果与以下论点一致：使用GM-CSF增强的自体癌症疫苗接种，特别是与辅助治疗联合时能够成功产生免疫介导的肿瘤破坏，所述辅助治疗可消耗FoxP3+Tregs活性，增强MHC I型A链（MICA）的肿瘤表达从而活化自然杀伤细胞（NK）和T细胞，并提高中枢记忆T细胞CD4+和CD8+应答。
发明人在10名患者的自体疫苗中的研究结果一致表明TGF-β1和TGF-β2水平降低和GM-CSF水平升高（图1A-1C和图2A-2F），这可支持本发明的FANG方法。在癌细胞系（CCL-247结肠直肠癌，CRL-1585黑色素瘤细胞系）中，通过使用弗林蛋白酶抑制剂癸酰基-Arg-Val-Lys-Arg-CMK（Dec-RVKR-CMK）进行的主要文件的证明可确证弗林蛋白酶消耗方法的稳定性。Dec-RVKR-CMK为肽基氯甲基酮，其不可逆地结合于弗林蛋白酶的催化位点并阻断其活性[59]。Dec-RVKR-CMK完全或部分降低弗林蛋白酶底物BASE（β-位点APP剪切酶），MT5-MMP和Boc-RVRR-AMC的活性[60]。本发明人通过特异性免疫分析发现CCL-247和CRL-1585癌细胞系中的TGF-β1和TGF-β2活性显著降低，证实了弗林蛋白酶阻断TGF-β同工型表达的有效性。
用于转染自体细胞的FANG质粒（图19）来自TAG质粒[74]，通过使用bi-shRNA弗林蛋白酶DNA序列替换人TGFβ2反义序列而来。除此之外这两个质粒是相同的（经DNA测序证实）。bi-shRNA弗林蛋白酶由具有miR-30a骨架的两个茎环结构构成；第一茎环结构具有完全互补的引导链和乘客链，而第二茎环结构在乘客链的9至11位具有三个bp错配（图4A）。本发明人采取使用单一靶向位点用于剪切和螯合的策略。编码shRNA能够容纳装载于一种以上类型的RISC的成熟shRNA[65]。集中于单一位点的依据是多位点靶向会提高“种子序列”诱导的脱靶效应的概率[66]。两个茎环双链DNA序列通过DNA连接与10个合成的互补且互连的寡核苷酸碎片装配。将两端都具有Bam HI位点的含241个碱基对的完整DNA代替TGFβ2反义序列插入TAG表达载体的Bam HI位点中。通过用于筛选shRNA插入物和定向的PCR引物对来筛选所插入DNA的定向。FANG构建体具有驱动整个盒的单一哺乳动物启动子（CMV），其中插入的2A核糖体跳跃肽位于GM-CSF和弗林蛋白酶双功能shRNA转录物之间，接着为兔聚A尾。在GM-CSF转录物末端有终止密码子。将小核糖核酸病毒2A序列插入mRNA中可导致核糖体在2A和下游序列的连接处跳过肽键的形成，导致由单一开放阅读框架产生两个蛋白[67]。然而，在shRNA或反义表达为第二转录物（作为例子）的情况下，仅翻译第一转录物。发明人发现2A连接子可有效产生与TAG疫苗水平大致相等的GM-CSF和抗TFG-β转录物，并选择使用与FANG相同的设计。
发明人证实了siRNA介导的弗林蛋白酶敲减在抑制人TGF-β同工型表达中的适用性。通过Tuschl和同事发表的建议以及整合了人和小鼠基因组数据库的BLAST检索的其它选择参数来确定弗林蛋白酶mRNA序列中预期的siRNA靶向位点（图4B）[73]。测试了siRNA靶向的合格编码和3’UTR位点（图4B）。对CCL-247，CRL-1585U87和H460细胞进行脂转染后，6种siRNA弗林蛋白酶构建体均显示为使培养物上清液中的TGF-β1和TGF-β2水平显著降低，而未有害地影响细胞生存。因此，siRNA介导的弗林蛋白酶敲减可有效消耗TGF-β1和-β2同工型。
本发明人尝试通过免疫印迹法和流式细胞法在细胞系中检测内源性弗林蛋白酶蛋白。针对免疫印迹法筛选了五种不同的市售抗体，针对流式细胞法筛选一种预标记的抗体。所有研究均得到阴性结果。进一步对市售抗体进行研究后，针对弗林蛋白酶蛋白的片段（或肽）开发了所有抗体特异型。免疫印迹研究表明在所筛选的5种抗体中的4种中优先检测到60kDa的变异体。最后一种抗体未在所测试的免疫印迹条件下检测到弗林蛋白酶蛋白。供应商所提供的对照裂解物与内部细胞系样品产生类似的结果。用于流式细胞法的预标记的抗体在弗林蛋白酶染色中未显示显著转变（即，未鉴别出阳性弗林蛋白酶群体）。因此，流式细胞法不能用于证明弗林蛋白酶敲减。
作为弗林蛋白酶蛋白检测的替代，发明人也针对弗林蛋白酶酶活性对样品进行筛选。使用基于荧光测定的分析，针对通过弗林蛋白酶转化以释放荧光团（AMC）的底物（Pyr-Arg-Thr-Lys-Arg-AMC）来筛选细胞系。然而，所释放的AMC的检测信号太低而不能准确显示弗林蛋白酶酶活性的显著敲减。该分析的第二个障碍是底物被枯草杆菌蛋白酶样前激素转化酶（PC）家族中的所有丝氨酸蛋白酶剪切。因此，我们的FANG shRNA不能靶向的类似蛋白酶仍具有活性并在分析中剪切荧光底物，从而降低检测弗林蛋白酶敲减的能力。
双功能shRNA弗林蛋白酶的其它应用包括：（1）通过肿瘤（±肿瘤细胞外基质（ECM））选择性修饰的（靶向的），潜在的两层内陷脂质体（BIV）进行全身输送以增强免疫应答的传出支；（2）通过肿瘤选择性修饰的（靶向的），潜在的两层内陷脂质体（BIV）进行全身输送以直接破坏弗林蛋白酶靶分子的肿瘤促进/维持作用，包括但不限于TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、IGF-II、IGF-1R、PDGF A，并且在某些肿瘤类型中不限于为MT1-MMP；（3）通过肿瘤选择性修饰的（靶向的），的两层内陷脂质体（BIV）进行全身输送以直接破坏假定癌症肝细胞中的NOTCH/p300途径；（4）通过肿瘤选择性修饰的（靶向的），潜在的两层内陷脂质体（BIV）进行全身输送以抑制与炭疽，志贺菌，白喉，破伤风，肉毒中毒和埃博拉及马尔堡病毒相关的毒素的活化，和/或（5）全身和/或吸入输送两层内陷脂质体（BIV）（±修饰和可逆性掩蔽/潜在的）以抑制假单胞菌外毒素A的产生，其可在患有假单胞菌介导的发病率和死亡率的风险提高的疾病的患者中作为抗生素治疗的辅助，所述疾病为例如囊性纤维化。
TGF-β敲减：转化生长因子β（TGF-β）为具有众所周知的免疫抑制活性的多功能蛋白家族[13]。三种已知的TGF-β配体（TGF-β1、β2和β3）广泛存在于人癌症中。TGF-β过表达与肿瘤进展和不良预后相关[14,15]。肿瘤微环境中TGF-β水平升高与无肿瘤反应相关[14，16-21]。TGF-β抑制GM-CSF诱导的DC的成熟[22]及其II类MHC和共刺激分子的表达[23]。Ardeshna[24]表明脂多糖（LPS）诱导的单核细胞衍生的DC参与p38应激活化蛋白激酶（p38SAPK），细胞外信号调节蛋白激酶（ERK），磷酸肌醇3-OH-激酶（PI3激酶）/Akt，和核因子（NF）-κB途径的活化。GM-CSF可通过快速、短暂的MAP激酶1/2和ERK 1/2的磷酸化同时发挥刺激髓系造血干细胞和白血病细胞系增殖的活性，而TGF-β通过PI3-激酶-Akt途径抑制切断GM-CSF-诱导的ERK信号[25]。
在传出水平上，不成熟DC的抗原呈递促使T细胞无能[26]。TGF-β相似地抑制巨噬细胞活化[27]及其抗原呈递功能[28,29]。TGF-β通过减弱高亲和性的IL-2受体表达和功能来抑制细胞毒性的T细胞的活化[30,31]。TGF-β2也可通过诱导转录因子FOXP3将原态T细胞转化为Treg细胞[32]，并且Treg的出现导致免疫活化的停止[33]。根据Polak[34]，致耐受性DC和抑制性T淋巴细胞存在于黑色素瘤的所有阶段。这些免疫细胞类型表达TGF-β受体I，并且致耐受活性依赖于TGF-β1或-β2结合。
在固有免疫应答水平上，TGF-β对NK细胞具有拮抗性并下调淋巴因子活化的杀伤（LAK）细胞诱导和增殖[30,35-39]。Penafuerte[40]最近表明在免疫活性B16黑色素瘤细胞模型中，肿瘤分泌的TGF-β抑制由GM-CSF+IL2（GIFT2）介导的NK细胞免疫致敏。体内阻断TGF-β的B16产生提高存活率，所述存活率另外会受到非GIFT2表达的旁观肿瘤的损害。这些研究结果进一步证实在体内TGF-β对GM-CSF介导的免疫活化具有负面影响，并进而支持在基于GM-CSF的癌细胞疫苗中消耗TGF-β分泌的原理。
本发明人利用具有TGF-β2敲减活性的肿瘤细胞疫苗（Belagenpumatucel-L）在患有非小细胞肺癌的患者中进行的试验证实了其安全性是可接受的，和应答随机对照患者和历史经验的剂量相关的存活率提高。与类似患者的第2年的存活率小于10%的历史数据有利地相比，对于接受>2.5×107个细胞/次注射的患者，晚期（IIIB/IV）患者的两年存活率为52%。所研究的患者也显示细胞因子的产生（IFN-γ，p=0.006；IL-6，p=0.004；IL4，p=0.007）和针对疫苗HLA抗原的抗体效价（p=0.014）显著提高，表示有免疫活化的结果[41]。
TGF-β敲减和GM-CSF表达的癌细胞疫苗（TAG）：采集三十六名患者以用于TAG疫苗。GM-CSF表达和TGF-β2敲减符合产品放行标准。三名（所有具有管腔入口的胃肠道肿瘤）有细菌污染因此不能放行。一名细胞不足。治疗了十九名晚期难治的癌症患者[42-44]。未观察到与治疗相关的3级毒性作用。17名可评价的患者中有11名（65%）在至少3个月中维持稳定的疾病。通过成像标准测得一名患者达到CR（图4；黑色素瘤）。因此TAG疫苗表现为安全的并且有证据显示其具有临床疗效。
然而，鉴于人癌症中普遍产生TGF-β配体的所有三种已知同工型（TGF-β1，-β2，和-β3），TAG疫苗的潜在局限性是针对TGF-β2的有限的特异性。特别地，人结肠直肠癌、肺癌和黑色素瘤细胞可产生高达10倍的高水平的TGF-β1。TGF-β1在抗原呈递树突细胞（DC）和调节T细胞（Treg）中的致耐受性作用已较好地确立，并且该活性不受TGF-β2反义处理的影响。
弗林蛋白酶：TGF-β的所有成熟同工型需要限制性蛋白水解剪切以获得适当活性。TGF-β的蛋白水解活性的主要功能由弗林蛋白酶介导。弗林蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的成员。该家族的成员为内切蛋白酶（PC），可将潜伏的前体蛋白加工成其生物活性产物。弗林蛋白酶为钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，可有效地在共有序列为-Arg-X-K/Arg-Arg（RXK/RR）的成对碱性氨基酸加工位点剪切前体蛋白，其中-RXXR-构成最小剪切位点[53]。与许多其它蛋白酶一样，PC合成为具有N-端前片段延伸的非活性酶原，所述延伸在内质网中自催化去除以实现功能[52]。
弗林蛋白酶最为知名的是通过相应的免疫调节分支对TGF-β进行功能活化[54,55]。除了前述的肿瘤分泌的TGF-β的免疫抑制活性，已发现T淋巴细胞中内源性表达的弗林蛋白酶的条件性缺失允许T细胞正常发育，但损坏调节和效应子T细胞的功能，所述的调节和效应子T细胞产生较少的TGF-β1。缺乏弗林蛋白酶的Treg在T细胞转移结肠炎模型中具有较低的保护性并且不能诱导正常T细胞中的Foxp3。此外，缺乏弗林蛋白酶的效应子细胞固有地活性过高并抵抗野生型Treg细胞的抑制活性。在APC中，反面高尔基体隔室中的细胞毒性的T淋巴细胞敏感的表位由弗林蛋白酶和不常见的非TAP依赖性途径加工[56]。因此T细胞的弗林蛋白酶表达表现为在维持外周耐受中不可缺少，这至少部分由于其在调节TGF-β1产生中具有非冗余的必需功能。
已证明在几乎所有癌细胞系中均具有高水平的弗林蛋白酶[45-52]。本发明人和其他人员发现人结肠直肠癌、肺癌和黑色素瘤细胞产生高达10倍的较高水平的TGF-β1，并可能较高幅度地影响免疫耐受状态[34,57,58]。肿瘤细胞中弗林蛋白酶的存在可能显著有助于维持肿瘤引导的TGF-β1介导的外周免疫耐受[54]。因此弗林蛋白酶敲减代表用于优化免疫致敏的新颖并具吸引力的方法。
FANG（弗林蛋白酶shRNA和GMCSF）：本发明人构建了下一代疫苗，称为FANG。FANG疫苗的新颖性在于通过弗林蛋白酶敲减消耗多种免疫抑制TGF-β同工型的组合方法，从而使合并的GM-CSF转基因对自体肿瘤抗原致敏的免疫增强作用最大化。
所有成熟的TGF-β同工型需要弗林蛋白酶进行蛋白水解活化。使用弗林蛋白酶敲减确定了在数个癌细胞系中（H460、CCL-247、CRL-1585、U87）实现多种TGF-β同工型活性伴随性消耗的可行性，并且本发明人成功地在9名癌症患者中（乳腺癌-1；结肠癌-2；黑色素瘤-4；胆囊癌-1；NSCLC-1）完成了FANG疫苗的GMP生产。GMCSF表达和TGF-β1和-β2敲减的评估如图1A-1C和图2A-2F所示。
FANG质粒电穿孔至患者肿瘤细胞中证实了如所预期地产生GMCSF蛋白并伴随TGF-β1和-β2敲减。图3A-3C描绘了FANG转染的NSCLC肿瘤表达谱（FANG-004）与使用cGMP TAG疫苗方法处理的来自相同肿瘤的组织（标记为TAG-004）在第7天的分析数据。TGFβ2表达相似地降低（图3B；由于数据重合而显示为单线）而GMCSF表达相似地增加（图3C）。然而，虽然FANG可完全抑制TGFβ1表达，但由于TGFβ2反义不能阻断TGFβ1表达，因此其不受TAG影响（图3A）。
图5为晚期黑色素瘤患者在11次TAG疫苗治疗后的PET CT影像，其显示了显著的临床应答。用MRI扫描及活检追踪L2的残余摄取，显示无恶性肿瘤。因此患者具有七个月以上的完全应答（无疾病迹象）。FANG敲减TGF-β1和-β2的能力得到前9名经历疫苗构建的患者的研究结果的支持（图6A-6C）。所有9种疫苗制剂显示GM-CSF水平显著升高（培养第4天为80-1870pg/ml，中值为739pg/ml）。所有9名患者显示TGF-β2下降>50%，内源性TGF-β1产生>100pg的7名患者中的6名也显示该细胞因子降低>50%。在一名患者（NSCLC）中最好地证实了FANG的扩展靶效应，所述患者具有足够的肿瘤组织以产生自体疫苗的TAG（TAG-004A）和FANG（FANG-004）版本，使用FANG制剂（FANG-004）将TGF-β1（以及TGF-β2）从1840pg/ml的初始浓度消耗至可检测水平以下，而使用TAG制剂（TAG-004A）未改变该高水平的TGF-β1，但预期会消耗TGF-β2。这些研究结果支持FANG疫苗制剂的潜在优势。
个体化cGMP FANG疫苗的生物活性的验证：可通过使用编码GM-CSF的质粒载体和经优化以敲减弗林蛋白酶的双功能短发夹（bi-sh）RNA实现基因修饰。已经在cGMP条件下生成了癌症患者自体FANG疫苗，用于患有晚期实体癌症的患者的临床试验。测量GM-CSF和TGF-β1、-β2和-β3mRNA和蛋白表达以作为质量保证过程的一部分。FANG修饰后的细胞因子生物活性由在本发明人在先前研究中利用的GM-CSF和TGF-β依赖性细胞系的生长结果确定。加工的疫苗将经历蛋白组基因组筛选以证明FANG修饰后的抗原完整性。
表征CTLA-4阻断的增强作用：鉴于FANG免疫仅影响传入免疫致敏过程，其它促进肿瘤特异性免疫效应应答的方法可进一步促进抗肿瘤结果。通过阻断细胞毒性的T淋巴细胞-4（CTLA-4）的功能来干扰Treg抑制和/或增强T效应（Teff）可提高FANG疫苗临床成功的可能性。
对十个FANG疫苗样品进行RT-qPCR分析（FANG-003无足够的mRNA进行分析）。在电穿孔前和电穿孔后，辐照后培养样品长达14天。在不同的时间点从每个样品中提取总RNA并通过逆转录（RT）转化为cDNA。进行定量PCR（qPCR）以评估每个时间点每个样品中存在的模板量。相对于内源性GapDH归一化弗林蛋白酶、TGFβ1和TGFβ2的qPCR样品以产生相对循环阈（Ct）值。针对外标曲线定量GMCSF以产生相对于标准曲线的Ct值。GMCSF mRNA检测如图7所示。转染后，在所有疫苗中均检测到GMCSFmRNA，但一个持久的问题是值根据mRNA质量而变化。表1说明了来自两个FANG疫苗的代表性数据（图8和9）。对所有样品将电穿孔前的Ct值减去归一化的电穿孔后与辐照后的Ct值（前-后）归一化计算以计算得deltaCt（ΔCt）。所计算的ΔCt<0.00代表模板DNA降低，所计算的ΔCt>0.00代表模板DNA升高。ΔCt值用于估算表达的变化百分数（%表达）。值小于100%代表DNA降低（由前至后），值大于100%代表DNA升高（由前至后）。shRNA/siRNA的沉默性质可最佳地降低90%的模板DNA，相当于ΔCt=-3.3（ΔCt=-1.0相当于50%的敲减）。因此，以下数据表明FANG质粒DNA能够使内源性弗林蛋白酶降低80–26%（平均=48%），使下游靶TGFβ1和TGFβ2降低98–30%（平均=75%）。弗林蛋白酶双功能shRNA的作用机制是在转录后和翻译后水平上阻断弗林蛋白酶蛋白产生。弗林蛋白酶蛋白水平降低也（通过反馈调节）影响TGFβ1和TGFβ2 mRNA的表达，TGFβ1和TGFβ2蛋白前体向其各自蛋白成熟（活性）形式的转化[75]，并通过干扰TGFβ→弗林蛋白酶扩增环来进一步抑制弗林蛋白酶自身的表达[76]。TGF蛋白的前体的积累也可能会反馈抑制其TGF基因的转录。
表1：FANG疫苗的RT-qPCR分析（电穿孔前对电穿孔后）
FANG-008
| 弗林蛋白酶 | ||
| 时间点 | ΔCt | %表达 |
| 第0天 | -1.52 | 35% |
| 第1天 | -1.52 | 35% |
| 第2天 | -1.48 | 36% |
| 第4天 | -1.50 | 35% |
| 第7天 | -1.22 | 43% |
| 第10天 | -1.41 | 38% |
| TGFB1 | ||
| 时间点 | ΔCt | %表达 |
| 第0天 | -0.09 | 94% |
| 第1天 | -0.10 | 93% |
| 第2天 | -0.08 | 95% |
| 第4天 | -0.05 | 97% |
| 第7天 | -0.08 | 95% |
| 第10天 | -0.11 | 93% |
| TGFB2 | ||
| 时间点 | ΔCt | %表达 |
| 第0天 | 0.00 | n/a* |
| 第1天 | 0.00 | n/a* |
| 第2天 | 0.00 | n/a* |
| 第4天 | 0.00 | n/a* |
| 第7天 | 0.00 | n/a* |
| 第10天 | 0.00 | n/a* |
FANG-009
| 弗林蛋白酶 | ||
| 时间点 | ΔCt | %表达 |
| 第0天 | -0.66 | 63% |
| 第1天 | -0.69 | 62% |
| 第2天 | -0.34 | 79% |
| 第4天 | -0.31 | 80% |
| 第7天 | -1.93 | 26% |
| 第10天 | 0.00 | n/a* |
| TGFB1 | ||
| 时间点 | ΔCt | %表达 |
| 第0天 | -0.54 | 69% |
| 第1天 | -0.49 | 71% |
| 第2天 | -0.42 | 75% |
| 第4天 | -0.31 | 81% |
| 第7天 | -0.04 | 98% |
| 第10天 | -1.29 | 41% |
| TGFB2 | ||
| 时间点 | ΔCt | %表达 |
| 第0天 | -0.53 | 69% |
| 第1天 | -0.47 | 72% |
| 第2天 | -0.45 | 73% |
| 第4天 | -0.52 | 70% |
| 第7天 | -1.70 | 31% |
| 第10天 | -1.74 | 30% |
ΔCt基线=0.00
%表达基线=100%
*n/a=由于模板低于检测限而不适用
FANG系统使用9名患者的自体疫苗，其一致地证实了TGF-β1和TGF-β2降低而GM-CSF水平升高（图6A-6C）。通过特异性免疫分析测定的TGF-β1和TGF-β2的活性也显示在这些癌细胞系中显著降低，证实了弗林蛋白酶阻断对TGF-β同工型表达的作用。本发明人证实了siRNA介导的弗林蛋白酶敲减在抑制TGF-β同工型表达中的适用性。通过Tuschl和同事发表的建议以及整合了人和小鼠基因组数据库（jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext）的BLAST检索的其它选择参数来确定弗林蛋白酶mRNA序列中预期的siRNA靶向位点。测试了siRNA靶向的合格翻译和3’UTR位点（图4B）。弗林蛋白酶mRNA的FANG质粒DNA敲减的证明如图8和9所示。这仅可在两个疫苗中检测到，是因为容易检测到的弗林蛋白酶mRNA仅存在于转染前的这两个肿瘤中。bi-shRNA弗林蛋白酶的作用机制是在转录后和翻译后水平上阻断弗林蛋白酶蛋白产生。弗林蛋白酶蛋白水平降低也（通过反馈调节）影响TGFβ1和TGFβ2mRNA的表达，TGFβ1和TGFβ2蛋白前体向其各自蛋白成熟（活性）形式的转化[75]，并通过干扰TGFβ→弗林蛋白酶环来进一步抑制弗林蛋白酶自身的表达[76]。TGF蛋白的前体的积累会反馈并抑制其TGF基因的转录的可能性不应以任何方式解释为限制本发明。在一名患者（NSCLC）中最好地显示了FANG的扩展靶效应，所述患者具有足够的肿瘤组织以产生自体疫苗的TAG（TAG-004）和FANG（FANG-004）版本。使用FANG制剂（FANG-004）将TGF-β1（以及TGF-β2）从1840pg/ml的初始浓度消耗至可检测水平以下。而使用TAG制剂（TAG-004）未改变该高水平的TGF-β1，但预期会消耗TGF-β2（图1A-1C和图2A-2F）。这些研究结果支持FANG疫苗制剂的机制优势。
对CCL-247，CRL-1585U87和H460细胞进行脂转染后，6种siRNA弗林蛋白酶构建体各个均显示培养物上清液中的TGF-β1和TGF-β2水平显著降低，而未有害地影响细胞生存。因此，siRNA介导的弗林蛋白酶敲减可有效消耗TGF-β1和-β2同工型。
FANG的设计和构建：使用包括siRNA和miRNA样功能性组分的“双功能”载体以优化基因敲减[61]。将siRNA组分编码为发夹且包括乘客链和引导链的完全匹配序列。当乘客链被RNA诱导的沉默复合物（RISC）的Argonaute-2（Ago 2）剪切后，引导链结合并剪切互补的靶mRNA序列，所述Argonaute-2为具有核糖核酸酶H样活性的内切酶。不同的是，“双功能”载体的miRNA样组分在编码shRNA短发夹内的乘客链和引导链之间包含错配以获得较低的热力学稳定性。该构造允许乘客链无需剪切（非剪切依赖性过程），并且不依赖Ago 2即可脱离RISC[62,63]，并且miRNA引导组分通过胞质加工小体（P小体）中部分互补的靶mRNA的翻译抑制，mRNA降解及螯合来下调其靶点。
发明人之前已证明双功能shRNA敲减stathmin（STMN1；癌蛋白18）的有效性升高，所述stathmin为调节细胞骨架快速微管重塑的蛋白，并发现其在高比例的患有实体癌症的患者中上调[64]。双功能shRNA构建体可实现针对STMN-1的有效敲减，与针对相同基因靶点的siRNA寡核苷酸相比可引起5-log剂量增强的肿瘤细胞杀伤效力。
相似设计的双功能shRNA用于引起弗林蛋白酶敲减。bi-sh-弗林蛋白酶由具有miR-30a骨架的两个茎环结构构成；第一茎环结构具有完全互补的引导链和乘客链，而第二茎环结构在乘客链的9至11位具有三个bp错配。发明人采取使用单一靶向位点用于剪切和螯合过程的策略。提出了编码shRNA允许成熟shRNA装载于一种以上类型的RISC[65]。发明人集中于单一位点是由于多位点靶向会提高“种子序列”诱导的脱靶效应的概率[66]。
使用10个互补且通过DNA连接互连的寡核苷酸碎片将两个茎环双链结构相连。通过用于筛选shRNA插入物和定向的PCR引物对来筛选所插入DNA的定向。选择阳性克隆并在SeqWright,Inc.（Houston,TX）确证序列。根据siRNA的发现构建了三个双功能shRNA。确定了最佳靶向序列。
FANG构建体具有驱动整个盒的单一哺乳动物启动子（CMV），其具有位于GM-CSF和弗林蛋白酶双功能shRNA转录物之间的插入的2A核糖体跳跃肽，接着为兔的聚A尾部。在GM-CSF转录物末端有终止密码子。
将小核糖核酸病毒2A序列插入mRNA中导致核糖体在2A和下游序列的连接处跳过肽键的形成，导致由单一开放阅读框架产生两个蛋白[67]。发明人发现2A连接子可有效产生与TAG疫苗水平大致相等的GM-CSF和抗TFG-β转录物，并选择使用与FANG相同的设计。
生产FANG疫苗：在手术区无菌采集患者的肿瘤，置于无菌样品容器中的庆大霉素盐溶液中并包装以在湿冰上运输至cGMP生产设备。将样品送入生产套件中，酶分解和机械解聚以形成细胞悬浮液并洗涤以除去残渣。对肿瘤细胞进行计数后，取QC等份，使用FANG质粒对剩余细胞进行电穿孔并温育过夜以允许载体转基因表达。收获细胞并使用伽马射线辐照以阻止细胞生长，然后在取出最终的QC等份和疫苗控制速率冷冻之前进行计数。两天生产过程之后为几乎三周的QC测试阶段，在该阶段之后后并且在放行疫苗用于患者治疗前评估所有疫苗分析数据。经历FANG生产的所有9名最初的患者通过所有QC测试标准。
cGMP FANG疫苗：在cGMP条件下癌症患者自体FANG疫苗以用于临床试验。在FANG修饰前后测量GM-CSF和TGF-β1、-β2和-β3mRNA和蛋白表达，通过在我们之前表征的GM-CSF和TGF-β依赖性人细胞系中的生长结果确定细胞因子生物活性。各个患者的加工的疫苗会经历蛋白组基因组筛选以确证FANG修饰后的抗原完整性。
FANG的cGMP生产：通过确立的人细胞系的质粒载体电穿孔生成FANG疫苗。所选的FANG质粒载体呈递含有弗林蛋白酶shRNA的构建体，已对所述弗林蛋白酶shRNA进行预验证以最佳下调TGF-β。
在注射到患者中之前，在室温下解冻冷冻的小瓶（剂量）并在生物安全罩中处理。在加盖的1mL注射器中输送细胞悬浮液。以每次注射为1x107或2.5x107个细胞的剂量，将所制备的疫苗皮内注射至患者体内。
本发明人准备并研究了两个全规模临床前生产过程和八个临床生产过程。表2描绘了所处理肿瘤的类型（肿瘤3至10为临床疫苗）。
表2：肿瘤质量与细胞产量
| 所处理的肿瘤 | 疫苗ID | 组织肿瘤(克) | 细胞#/剂量 | 小瓶数量 |
| 1 | FANG-001 | 12.72 | 1.0x107 | 40 |
| 2 | FANG-002 | 27.41 | 1.0x107 | 28 |
| 3 | FANG-003 | 6.04 | 2.5x107 | 9 |
| 4 | FANG-004 | 41.08 | 2.5x107 | 11 |
| 5 | FANG-005 | 6.96 | 2.5x107 | 8 |
| 6 | FANG-006 | 12.48 | 1.0x107 | 8 |
| 7 | FANG-007 | 10.90 | 2.5x107 | 15 |
| 8 | FANG-008 | 9.80 | 2.5x107 | 13 |
| 9 | FANG-009 | 6.80 | 1.0x107 | 6 |
| 10 | FANG-010 | 13.00 | 2.5x107 | 12 |
如表3所示，所处理的肿瘤的尺寸以及类型和所得的活细胞产率有很大差别。根据生产第2天的总活细胞计数，以1.0x107个细胞（剂量群组1）或2.5x107细胞（剂量群组2）将所有疫苗装入瓶中。采集多个肿瘤的患者允许合并小瓶以具备最低临床剂量要求的资格。在群组2剂量水平下最多可以将12次剂量用于患者治疗。由于肿瘤细胞产率因肿瘤质量，细胞结构和处理兼容性而高度可变，因此包括最低剂量数量和较低剂量群组（群组1）。
表3：最终产品活性（第2天，辐照前）
| 所处理的肿瘤 | 疫苗ID | %活性 |
| 1 | FANG-001 | 78 |
| 2 | FANG-002 | 90 |
| 3 | FANG-003 | 94 |
| 4 | FANG-004 | 89 |
| 5 | FANG-005 | 94 |
| 6 | FANG-006 | 91 |
| 7 | FANG-007 | 96 |
| 8 | FANG-008 | 95 |
| 9 | FANG-009 | 95 |
| 10 | FANG-010 | 93 |
10个所处理肿瘤的第4天的表达谱描绘于图1A-1C中。注意到所有三种细胞因子的y轴刻度不同。这些数据代表14天的分析（剩余数据未显示）。平均转染前TGFβ1为1251±1544pg/1x106个细胞/ml；中值为778pg。平均转染后TGFβ1为191±455pg/1x106个细胞/ml；中值为13pg。TGFβ1的平均敲减百分比为85%。平均转染前TGFβ2为232±164pg/1x106个细胞/ml；中值为225pg。平均转染后TGFβ2为1319pg/1x106个细胞/ml；中值为5pg。TGFβ2的平均敲减百分比为94%。转染后的平均GM-CSF表达为543±540pg/1x106个细胞/ml；中值为400pg。这些数据表明与TGF β2敲减一样，GMCSF表达与TAG疫苗一致。相比之下，FANG疫苗使TGFβ1表达降低五倍以上。TGFβ1的最小可检测量约为4.6pg/ml（R&D Systems，QuantikineHuman TGFβ1）。TGFβ2的最小可检测量约为7pg/ml（R&D Systems，Quantikine Human TGFβ2）。GMCSF的最小可检测量约为3pg/ml（R&DSystems，Quantikine Human GMC SF）。
先前已描述在转染前后针对自体肿瘤细胞疫苗建立培养物以测试GMCSF、TGFβ1和TGFβ2表达的方案（Maples等，2009）。简言之，由市售ELISA试剂盒（R&D Systems）来测定GMCSF、TGFβ1和TGFβ2的表达。根据生产商的说明书进行ELISA分析。转染前样品（4x106个细胞）在第1天取得。生产完成后，将样品从生产设备中移出，使之可建立细胞培养物以生成用于ELISA的样品。第2天，取转染后、辐照后、冷冻前的样品（4x106个细胞）。生产完成后，将样品从生产设备中移出，使之可建立细胞培养物以生成用于ELISA的样品。
生产了十种（10种）疫苗（FANG-001至-010）作为临床前鉴定过程的一部分。使用转染后、辐照后的样品与转染前、辐照前的样品进行比较，以评价这些疫苗的GM-CSF，TGFβ1和TGFb2mRNA（根据FDA综述，TAG疫苗，BB-IND 13650）。此外，通过数种方法尝试弗林蛋白酶蛋白的检测。通过qRT-PCR检测弗林蛋白酶mRNA。
本发明人通过免疫印迹法和流式细胞术检测细胞系中的内源性弗林蛋白酶蛋白。针对免疫印迹法筛选五（5）种不同的市售抗体（来自3个不同供应商），针对流式细胞术筛选一（1）种预标记的抗体。所有实验均得到阴性结果（数据未显示）。
所有生产过程的所有ELISA数据的总结（表4）表明GMCSF表达的中值水平为约400皮克/ml，平均为543皮克/ml。此外，GMCSF的水平倾向于随时间升高。虽然表达水平在生产过程中（肿瘤类型）可变化，但在所有生产的产品中均观察到GMCSF表达。除了所记录的生产过程之间的GMCSF表达水平变化，使用FANG疫苗实现的表达水平被视为与以下临床相关：1）质粒而非病毒载体在消除引发的抗病毒中和抗体的模糊作用中的用途，2）质粒同样地在防止干扰长期基因表达的引发的抗体的形成中的用途，以及3）弗林蛋白酶、TGFβ1和TGFβ2的同时抑制将使GMCSF诱导的树突细胞成熟的肿瘤相关抑制最小化[25]。
表4：在生产后表达分析14天FANG疫苗1-10的TGFβ1，TGFβ2和GM-CSF表达
GM-CSF和TGF-β表达的定量：通过细胞因子特异性比色法测定GM-CSF和TGF-β1和-β2的表达[68]。
生物活性的验证：在髓系白血病细胞系中观察到与髓系造血干细胞相似的GM-CSF诱导的增生活性，其由快速并短暂的MAP激酶1/2和ERK 1/2的磷酸化介导。相比之下，TGF-β通过抑制PI3-激酶-Akt途径切断GM-CSF-诱导的ERK信号[25]。GM-CSF和TGF-β对髓系白血病细胞的生长调节作用被用作体外替代模型以验证所制备的FANG疫苗培养上清液中的细胞因子的生物活性。
通过与红白血病CD34+TF-1a细胞[69]共培养研究来验证FANG（或对照转染）疫苗培养上清液中的细胞因子活性，并且如果有必要可使用双表型B单核细胞性白血病CD10+CD15+MV4-11细胞[70]（ATCC,Rockville,MD）证实。这些细胞系均显示在ng/ml的量下应答GM-CSF的正增殖作用和TGF-β的负抑制活性[25]。将通过Easycount Viasure分析（Immunicon）及MTT分析测定增殖活性[68]。
FANG修饰的表型谱分析：除了TGF-β下调外，弗林蛋白酶敲减可能影响其它具有靶序列的蛋白底物的表达[51]。如果该信息可用于理解接种患者中的任何差异的临床结果，则从癌症患者中测定FANG加工的自体疫苗抗原谱。
高通量遗传识别用于开发针对癌症患者的个体化疗法。进行高通量基因表达阵列分析以比较FANG转染的和对照载体转染的癌细胞的差异基因表达谱。
将差异标记的FANG和对照制剂组合，并使用强阳离子交换柱（SCX）和第二维RP纳米柱通过高效液相色谱（Dionex）分馏。在准备使用AppliedBiosystems 4800MALDI TOF/TOFTM分析仪进行质谱分析时，将馏分点样于Opti-TOFTM LC/MALDI插入（123x81mm）板（Applied Biosystems）上。通过GeneGo，MetaCore软件套件评估蛋白和基因表达数据。
进行蛋白组基因组分析以测定FANG加工前后的自体癌症疫苗的抗原谱。除了弗林蛋白酶敲减的验证，特别的注意力集中于1）弗林蛋白酶底物蛋白的基线和差异表达；2）标志性肿瘤相关抗原（TAA；如黑色素瘤的gp100，Mart1，MAGE-1，酪氨酸酶；非小细胞肺癌的MAGE-3，MUC-1）[71，72]及其它报导的TAA的表达；3）HLA抗原和共刺激分子（CD80/86）的表达；4）与上述类别无关，但在FANG转染后发生2倍或更高的差异表达的蛋白。
图10显示了晚期患者的群组1与群组2和3的总生存率（n=61；P=.0186）。GM-CSF-TGF-β2反义质粒的示意图如图11所示。包含pUMVC3-GM-CSF-2A-TGF-β2反义载体的NCI-H-460鳞状细胞和NCI-H-520大细胞（NSCLC）中GM-CSF的体外表达描绘于图12中。TGF-β2水平在具有pUMVC3-GM-CSF-2A-TGF-β2反义载体的NCI-H-460鳞状细胞和NCI-H-520大细胞（NSCLC）中降低。该降低见图13所示的数据。图14显示了251个碱基对的探针特异性检测在NCI-H-460和NCI-H-520细胞中体外表达的GM-CSF-2A-TGF-β2转录物（第6和10泳道）；图12和图13分别显示了TAG疫苗中的GM-CSF和TGF-β2的表达。图18A和18B显示了siRNA弗林蛋白酶敲减后人癌细胞系中的TGF-β1和TGF-β2表达。最后，图19为FANG质粒构建体的示意图。
由TAG疫苗生产数据（n=33疫苗；第7天的值，疫苗生产后的TGFβ1分析）生成的TGFβ1表达数据（图16）清楚地表明TAG不干扰TGFβ1表达。阻断TGFβ1和TGFβ2（图17），以及TGFβ3（数据未显示）的临床意义是将其假定为肿瘤表达的重要负免疫调节剂。TAG疫苗中的GM-CSF表达如图15所示。这些TGFβ同工型普遍存在并在大多数肿瘤中表达[77]。包括乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、SCLC和NSCLC在内的许多肿瘤产生高水平的一种或多种活性TGFβ同工型[78,14,15,79-84]。此外，TGFβ的过表达与肿瘤进展和不良预后相关[14,15]。TGFβ水平升高也与传入支与传出支的免疫抑制相关[14,16-21]。此外，TGFβ对自然杀伤（NK）细胞以及淋巴因子活化杀伤（LAK）细胞的诱导和增殖具有拮抗作用[30,35-39]。
因此，TGFβ的免疫抑制功能可能在调节癌细胞疫苗的功效中发挥主要作用。对于来自骨髓的树突细胞（DC），TGFβ抑制GMCSF诱导其成熟[22]以及II类MHC和共刺激分子的表达[23]。已显示不成熟DC的抗原呈递导致T细胞无反应[26]。TGFβ也抑制活化的巨噬细胞[27]，包括其抗原呈递功能[28,29]。因此在本发明的自体癌症疫苗治疗方法中，表达的普遍存在以及TGFβ对GMCSF的免疫调节功能的抑制作用支持所有肿瘤TGFβ的敲减。
因此，TGFβ的免疫抑制功能很可能在调节癌细胞疫苗的功效中发挥主要作用。在来自骨髓的树突细胞（DC）中TGFβ抑制GMCSF诱导其的成熟[25]以及II类MHC和共刺激分子的表达[26]。已显示不成熟DC的抗原呈递导致T细胞无反应[27]。TGFβ也抑制活化的巨噬细胞[28]，包括其抗原呈递功能[29,30]。因此在该自体癌症疫苗治疗方法中，表达的普遍存在以及TGFβ对GMCSF的免疫调节功能的抑制作用支持所有肿瘤TGFβ的敲减。
要理解的是，本文所述的具体实施方案是通过举例说明的方式来显示而不是为了限制本发明。本发明的主要特征可以在不脱离本发明范围的情况下用于各种实施方案中。本领域技术人员将认识到，或者能够仅仅利用不超过常规的实验确定本文所述具体步骤的许多等同物。这样的等同物被认为是在本发明的范围内，且被权利要求所涵盖。
本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所涉及领域的技术人员的水平。所有的出版物和专利申请均引入本文作为参考，其引入的程度如同各个独立的出版物或专利申请具体并独立地被指明引入作为参考。
词语“一个（a）”或“一种（an）”当与权利要求和/或说明书中的术语“包含（comprising）”结合使用时，可以指“一种”，但其也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或多于一种”的意思相一致。在权利要求中所使用的术语“或者”是指“和/或”，除非明确指明仅仅是指替代物，或替代物为相互排斥的，尽管公开内容支持仅仅指替代物及“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“大约”用来说明这样的值，其包括用来测定所述值的装置和方法的误差的固有变化，或者研究受试者之间存在的变化。
词语“一个（a）”或“一种（an）”当与权利要求和/或说明书中的术语“包含（comprising）”结合使用时，可以指“一种”，但其也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或多于一种”的意思相一致。在权利要求中所使用的术语“或者”是指“和/或”，除非明确指明仅仅是指替代物，或替代物为相互排斥的，尽管公开内容支持仅仅指替代物及“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“大约”用来说明这样的值，其包括用来测定所述值的装置和方法的误差的固有变化，或者研究受试者之间存在的变化。
如在本说明书和权利要求（或多项权利要求）中所使用的，词语“包含（comprising）”（以及任何形式的“包含”，如“包含（comprise）和包含（comprises）”），“具有（having）”（以及任何形式的“具有”，如“具有（have）”和“具有（has）”），“包括（including）”（以及任何形式的“包括”，如“包括（includes）”和“包括（include）”）或“含有（containing）”（以及任何形式的“含有”，如“含有（contains）”和“含有（contain）”）是包括的或开放式的，且不排除额外的，未述及的元素或方法步骤。
本文所使用的术语“或它们的组合”是指在该术语之前所列举项目的全部排列和组合。例如，“A、B、C或它们的组合”意在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一种，并且如果在特定的上下文中顺序是重要的，那么还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个例子，明显包括的是包含一种或多种项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解的是，通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制，除非从上下文中另外是明显的。
如本文所使用的，表示近似的词语如但不限于“约”、“基本的”或者“基本上”指这样的情况，当这样修饰时理解为并非必须是绝对的或者完美的，而应认为是很接近本领域技术人员认为与当前的情况一样可以使用的情况。说明书可以变化的程度取决于进行多大的变化之后，仍然使得本领域技术人员认为改变后的特征仍然具有所需的性质和未经改变的特征所具有的能力。总地来说，与前面的讨论一致地，使用表示近似的词语如“约”修饰的数值可以从所宣称的数值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或者15%。
根据本发明的公开内容，在不过度的实验下可以制备和实施本文所公开和要求保护的全部组合物和/或方法。尽管以经以优选的实施方案的形式描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以改变本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或方法的步骤的顺序。对本领域技术人员而言明显的所有这样相似的取代和修饰被认为是在所附的权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。
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Claims (76)
1.一种疫苗组合物，其包括：
bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括：
可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的cDNA；
可操作地连接于所述启动子的第二核酸插入物，其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达；和
一种或多种任选的疫苗佐剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述GM-CSF为人的。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述shRNA包含siRNA（剪切依赖性的）和miRNA（非剪切依赖性的）基序。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述shRNA为弗林蛋白酶表达的剪切依赖性的和非剪切依赖性的抑制剂。
5.如权利要求1所述的组合物，其中将所述shRNA进一步限定为双功能shRNA。
6.如权利要求1所述的组合物，其中将小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽插入至第一和第二核酸插入物之间。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述启动子为CMV哺乳动物启动子。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述CMV哺乳动物启动子包含CMV IE 5’UTR增强子序列和CMV IE内含子A。
9.如权利要求1所述的组合物，其中shRNA所靶向的区域为弗林蛋白酶mRNA转录物的3’UTR区域序列。
10.如权利要求1所述的组合物，其中shRNA所靶向的区域为弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域。
11.一种预防、治疗和/或减轻患者癌症的症状的方法，其包括以下步骤：
确定需要预防、治疗和/或减轻癌症症状的患者；和
给予自体细胞疫苗，所述自体细胞疫苗包括bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，可操作地连接于启动子的第二核酸插入物和一种或多种任选的疫苗佐剂；其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）cDNA，所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包括步骤：
通过测量一个或多个癌细胞中的转化生长因子beta（TGF-beta或TGF-β）和GM-CSF的水平来监控治疗进展，其中TGF-β水平下降和GM-CSF水平升高表明治疗成功；和
根据TGF-β和GM-CSF的水平改变自体细胞疫苗的给予。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述TGF-β选自TGF-β1，TGF-β2或TGF-β3中至少一种。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症选自：黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述shRNA包含siRNA（剪切依赖性的）和miRNA（非剪切依赖性的）基序。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述shRNA为弗林蛋白酶表达的剪切依赖性的和非剪切依赖性的抑制剂。
17.如权利要求11所述的方法，其中将所述shRNA进一步限定为双功能shRNA。
18.自体弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）增强（FANG）的疫苗组合物，其包括：
bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括
可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，其中所述第一插入物编码GM-CSF cDNA；
可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达；和
一种或多种任选的疫苗佐剂。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述组合物用于预防、治疗和/或减轻癌症症状，其中所述癌症选自：黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤。
20.通过给予弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）增强（FANG）的癌症疫苗来治疗、预防和/或减轻患者的非小细胞肺癌（NSCLC）症状的方法，其包括步骤：
确定需要预防，治疗和/或减轻NSCLC症状的患者；和
给予FANG疫苗，所述FANG疫苗包括bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，可操作地连接于启动子的第二核酸插入物和一种或多种任选的疫苗佐剂，其中所述第一插入物编码GM-CSF cDNA，所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。
21.如权利要求20所述的方法，进一步包括步骤：
通过测量一个或多个NSCLC细胞中的转化生长因子beta（TGF-beta或TGF-β）和GM-CSF的水平来监控治疗进展，其中TGF-β水平下降和GM-CSF水平升高表明治疗成功；和
根据TGF-β和GM-CSF的水平改变自体细胞疫苗的给予。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述TGF-β选自人的TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3中的至少一种。
23.制备弗林蛋白酶敲减和粒细胞巨噬细胞聚落刺激因子（GM-CSF）增强（FANG）的癌症疫苗，其包括步骤：
从患者中无菌采集一个或多个癌细胞；
将所采集的细胞置于无菌容器中的抗生素溶液中；
由所采集的溶液形成细胞悬浮液，其中通过酶分解，机械解聚或两者实现细胞悬浮液的形成；
通过对细胞悬浮液进行电穿孔而对细胞进行基因修饰，以制备具有bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒的疫苗，其中所述载体质粒包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，其中所述第一插入物编码GM-CSFcDNA，可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达，
收获该疫苗；
辐照该疫苗；和
冷冻该疫苗。
24.如权利要求23所述的方法，其中一个或多个癌细胞采集自患有癌症的患者，所述癌症选自：黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤。
25.如权利要求23所述的方法，其中通过辐照使基因修饰的细胞无法增殖。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述基因修饰的细胞为自体细胞。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述基因修饰的细胞为异种移植扩增细胞。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述基因修饰的细胞为异基因细胞。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述异基因细胞为确立细胞系。
30.如权利要求23所述的方法，其中将所述基因修饰的细胞每月给予受试者一次，最高可达12个剂量。
31.如权利要求23所述的方法，其中所给予受试者的基因修饰细胞的剂量为1x107个细胞/次注射至5x107个细胞/次注射。
32.如权利要求31所述的方法，其中基因修饰细胞的给予是与另一种治疗药物联合治疗的一部分。
33.如权利要求32所述的方法，其中用于联合治疗的另一种治疗药物为γIFN。
34.如权利要求33所述的方法，其中在联合治疗中给予受试者的γIFN的剂量为50或100μg/m2。
35.如权利要求23所述的方法，进一步包括转染后使用γIFN温育基因修饰的细胞的步骤。
36.如权利要求35所述的方法，其中转染后施加于基因修饰的细胞的γIFN的剂量为大约250U/ml。
37.通过敲减弗林蛋白酶来抑制转化生长因子beta（TGF-beta或TGF-β）表达的siRNA介导的方法，所述方法包括步骤：
选择靶细胞；和
使用表达载体转染靶细胞，所述表达载体包括启动子以及可操作地连接于该启动子的核酸插入物，其中该插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰来抑制弗林蛋白酶表达。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述shRNA包含siRNA（剪切依赖性的）和miRNA（非剪切依赖性的）基序。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述shRNA为弗林蛋白酶表达的剪切依赖性的和非剪切依赖性的抑制剂。
40.如权利要求37所述的方法，其中将所述shRNA进一步限定为双功能shRNA。
41.如权利要求37所述的方法，其中所述shRNA所靶向的区域为弗林蛋白酶mRNA转录物的3’UTR区域序列。
42.如权利要求37所述的方法，其中所述shRNA所靶向的区域为弗林蛋白酶mRNA转录物的编码区域。
43.在靶细胞中增强抗原表达、呈递和处理以及减弱转化生长因子beta（TGF-beta或TGF-β）的分泌免疫抑制活性的方法，所述方法包括步骤：
选择靶细胞；和
使用表达载体转染靶细胞，所述表达载体包括可操作连接于启动子的第一核酸插入物，其中所述第一插入物编码GM-CSF cDNA，和可操作连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述靶细胞为自体细胞。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述靶细胞为异基因细胞。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述异基因细胞为确立的人细胞系。
47.如权利要求43所述的方法，其中通过质粒载体电穿孔转染靶细胞。
48.如权利要求43所述的方法，其中所述TGF-β选自：TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3中的至少一种。
49.治疗癌症的方法，其包括步骤：
确定需要治疗的受试者；
从受试者中采集癌组织样本；
通过使用表达载体转染细胞来对所采集的癌症样本中的癌细胞进行基因修饰，其中所述表达载体包括可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，其中所述第一插入物编码GM-CSF cDNA；和可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第二插入物编码一个或多个短发夹RNA（shRNA），所述短发夹RNA能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达；和
将治疗有效量的基因修饰的细胞以足以治疗或减轻癌症症状的量给予受试者。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述癌症选自以下癌症：黑色素瘤、非小细胞肺癌、胆囊癌、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肝癌转移和尤因氏肉瘤。
51.如权利要求49所述的方法，其中通过辐照使基因修饰的细胞无法增殖。
52.如权利要求49所述的方法，其中所述基因修饰的细胞为自体细胞。
53.如权利要求49所述的方法，其中所述基因修饰的细胞为异基因细胞。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述异基因细胞为确立细胞系。
55.如权利要求49所述的方法，其中所述基因修饰的细胞为异种移植扩增细胞。
56.如权利要求49所述的方法，其中将所述基因修饰的细胞每月给予受试者一次，最高可达12个剂量。
57.如权利要求49所述的方法，其中所给予受试者的基因修饰细胞的剂量为1x107个细胞/次注射至5x107个细胞/次注射。
58.如权利要求49所述的方法，其中基因修饰细胞的给予是与另一种治疗药物联合治疗的一部分。
59.如权利要求58所述的方法，其中用于联合治疗的另一种治疗药物为γIFN。
60.如权利要求59所述的方法，其中在联合治疗中给予受试者的γIFN的剂量为50或100μg/m2。
61.如权利要求49所述的方法，进一步包括转染后使用γIFN温育基因修饰的细胞的步骤。
62.如权利要求61所述的方法，其中转染后施加于基因修饰的细胞的γIFN的剂量约为250U/ml。
63.通过RNA干扰来抑制弗林蛋白酶表达而用于癌症治疗的自体细胞疫苗组合物，其包括：
bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括：
可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞聚落刺激因子（GM-CSF）cDNA；
可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第二插入物编码一个或多个提供RNA干扰的剪切和螯合机制的单一靶向位点的双功能短发夹RNA（shRNA弗林蛋白酶），其中所述双功能shRNA弗林蛋白酶包括包含完全互补的引导链和乘客链的第一茎环结构，和包含一个或多个乘客链的碱基对错配的第二茎环结构，并能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达；和
一种或多种任选的疫苗佐剂。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所述第二茎环结构包括三个碱基对错配。
65.如权利要求63所述的组合物，其中所述碱基对错配位于乘客链的9至11位。
66.通过RNA干扰来抑制弗林蛋白酶表达而用于癌症治疗的自体细胞疫苗组合物，其包括：
bishRNA弗林蛋白酶/GMCSF表达载体质粒，其中所述载体质粒包括
可操作地连接于启动子的第一核酸插入物，其中所述第一插入物编码粒细胞巨噬细胞聚落刺激因子（GM-CSF）的cDNA；
可操作地连接于启动子的第二核酸插入物，其中所述第二插入物编码一个或多个提供RNA干扰的剪切和螯合机制的单一靶向位点的双功能短发夹RNA（shRNA弗林蛋白酶），其中所述双功能shRNA弗林蛋白酶包括包含完全互补的引导链和乘客链的第一茎环结构，和包含一个或多个引导链的碱基对错配的第二茎环结构，并能够杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达；和
一种或多种任选的疫苗佐剂。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述第二茎环结构包括三个碱基对错配。
68.如权利要求66所述的组合物，其中所述碱基对错配位于引导链的9至11位。
69.通过RNA干扰来抑制靶细胞中弗林蛋白酶表达的方法，所述方法包括步骤：
选择靶细胞；和
使用包括一个或多个GM-CSF和双功能短发夹（shRNA）弗林蛋白酶的构建体转染靶细胞，其中所述双功能shRNA弗林蛋白酶包括包含完全互补的引导链和乘客链的第一茎环结构，和包含一个或多个乘客链的碱基对错配的第二茎环结构，其中所述双功能shRNA弗林蛋白酶杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述第二茎环结构包括三个碱基对错配。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述碱基对错配位于乘客链的9至11位。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述碱基对错配通过防止Ago 2介导的剪切而引发乘客链脱离。
73.如权利要求69所述的方法，其中所述碱基对错配占据引导链的位置。
74.通过RNA干扰来抑制靶细胞中弗林蛋白酶表达的方法，所述方法包括步骤：
选择靶细胞；和
使用包括一个或多个GM-CSF和双功能短发夹（shRNA）弗林蛋白酶的构建体转染靶细胞，其中所述双功能shRNA弗林蛋白酶包括包含完全互补的引导链和乘客链的第一茎环结构，和包含一个或多个引导链的碱基对错配的第二茎环结构，其中所述双功能shRNA弗林蛋白酶杂交至编码弗林蛋白酶的mRNA转录物区域，从而通过RNA干扰抑制弗林蛋白酶表达。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述第二茎环结构包括三个碱基对错配。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述碱基对错配位于引导链的9至11位。
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