JP7179744B2

JP7179744B2 - アプタマー変調ＲＮａｓｅＰ切断による遺伝子発現の調節

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Publication number: JP7179744B2
Application number: JP2019547354A
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Inventors: シュエクイ・グオ
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Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2018-03-02
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Description

本発明は、RNAのアプタマー媒介リボヌクレアーゼ切断による遺伝子発現の変調(modulation)のためのポリヌクレオチド構築物、及びアプタマーに結合するリガンドの存在又は非存在に応答して遺伝子発現を変調するために構築物を使用する方法を提供する。アプタマーがリガンドに結合した場合に標的遺伝子発現が起こるように、ポリヌクレオチド構築物は、リボヌクレアーゼ基質配列、並びにエフェクター領域及びアプタマーを含むリボスイッチを含有する。

リボヌクレアーゼP(「RNase P」)は、リボ核タンパク質複合体であり、特定のホスホジエステル結合の加水分解を触媒することによって、tRNA前駆体から5'リーダー配列を除去して成熟tRNAを産生するエンドリボヌクレアーゼとして機能する。RNase Pは、すべての生物界にわたる種において見られ、1つのRNAサブユニット及び1つ(細菌)又は多く(古細菌及び真核生物)のタンパク質からなる。RNase P基質認識についての研究により、この酵素は、基質の主要なヌクレオチド配列よりもむしろ構造を認識し、tRNA前駆体のアクセプターステム、T-ステム、3'トレイル配列及び5'リーダー配列に相当する構造を含有するモデル基質を切断し得ることが明らかになった。

標的mRNAのRNase P切断は、tRNA前駆体に似た、mRNA標的配列とのハイブリッド複合体を形成するように設計した配列である外部ガイド配列(EGS:external guide sequence)を発現することによって達成されている。EGSは、塩基対形成相互作用を通してそのmRNA標的に結合し、mRNA標的のRNase P切断をガイドする。RNase P切断をターゲティングするためのEGS配列の使用は、外因性EGS配列の発現を必要とする。

WO2016/126747(PCT/US2016/016234) PCT/US2017/016303 PCT/US2017/016279 PCT/US2018/019056 WO/2018/025085 米国特許第5,475,096号米国特許第5,270,163号米国特許第5,580,737号米国特許第5,567,588号 PCT/US1207/016279

Sunwooら Genome Research 2009、19:347～359頁 Wiluszら、Genes Dev. 2012、26(21):2392～407頁 Yuan及びAltman、The EMBO Journal(14巻、159～168頁) Flaherty, JTら、Plos One、8巻、e63076、2013 JP Wiebe(Endocrine-Related Cancer(2006)13:717～738頁) Minton, DR及びNanus, DM(Nature Reviews, Urology、12巻、2005) Famulok、Science 9:324～9頁(1999) McKeague, M.及びDeRosa, M.C.J. Nuc. Aci. 2012 Abdullah Ozerら Nuc. Aci. 2014 Konig, J.ら(RNA. 2007,13(4):614～622頁) Nayerossadat, N.ら(Adv Biomed Res. 2012;1:27頁) Kim, S. W.ら A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38、e98(2010) Kirsebom, L. A. RNase P RNA mediated cleavage: substrate recognition and catalysis. Biochimie 89、1183～1194頁(2007) Wilusz, J. E.ら、3' end processing of a long nuclear-retained noncoding RNA yields a tRNA-like cytoplasmic RNA. Cell 135、919～932頁(2008) Mandal, Mら、Cell 113、577～586頁(2003) Nashimoto M.N.ら Long 5' leaders inhibit removal of a 3' trailer from a precursor tRNA by mammalian tRNA 3' processing endoribonuclease. Nucleic Acids Research, 1999;27(13):2770～2776頁 M. Mandal及びR.R. Breaker、Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator. Nature Structural & Molecular Biology. 2004;11:29～35頁 G.R. Zimmermanら Interlocking structural motifs mediate molecular discrimination by a theophylline-binding RNA. Nature Structural Biology. 1997;4:644～649頁

一態様においては、本発明は、リボスイッチに連結したRNase P基質配列を含む標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドカセットであって、リボスイッチが、エフェクター領域及びアプタマーを含み、エフェクター領域が、RNase P基質配列の一部に相補的な(complimentary)配列を含む、ポリヌクレオチドカセットを提供する。一実施形態においては、アプタマーは、小分子リガンドに結合する。

本発明の実施形態においては、エフェクター領域は、リガンドがアプタマーに結合した際にステム構造を形成することができる配列を含み、エフェクター領域ステムは、7～12塩基対である。本発明の実施形態においては、エフェクター領域ステムは、7、8、9、10、11又は12塩基対である。

一実施形態においては、RNase P基質配列は、tRNA前駆体をコードする配列又は相同配列を含む。他の実施形態においては、RNase P標的配列は、RNase P切断を開始し得るtRNA、mascRNA、MENベータtRNA様構造、ウイルスtRNA様構造、RNase Pモデル基質をコードする配列及び相同配列を含む。

一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットのアプタマー配列は、RNase P基質配列に対して5'に位置し、エフェクター領域は、RNase P基質のリーダー配列に相補的な配列を含む。一実施形態においては、アプタマー配列は、RNase P基質配列に対して5'に位置し、エフェクター領域は、RNase P基質配列のリーダー配列のすべて又は部分及び5'アクセプターステム配列のすべて又は部分を含む。更なる実施形態においては、RNase P基質のアクセプターステムとリボスイッチエフェクター領域とは、0、1、2、3又は4個のヌクレオチドだけ隔てられている。他の実施形態においては、エフェクター領域ステムは、リーダー配列(及びその相補体)に加えて、RNase P基質のアクセプターステムの1個又は複数個のヌクレオチド、及びアクセプターステムの1個又は複数個のヌクレオチドに相補的な配列を含む。

一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットのアプタマー配列は、RNase P基質配列に対して3'に位置し、エフェクター領域は、RNase P基質配列の3'アクセプターステムのすべて又は部分に相補的な配列を含む。更なる実施形態においては、RNase P基質の3'アクセプターステムに相補的なエフェクター領域配列は、1～7個のヌクレオチドである。換言すれば、エフェクター領域ステムは、アクセプターステムの1～7個のヌクレオチドを含み、アクセプターステムのこの1～7個のヌクレオチドに相補的な配列を含む。

一実施形態においては、リボスイッチは、RNase P基質の3'に位置し、そのため、エフェクター領域ステムとRNase P基質のアクセプターステムとは重複しない。実施形態においては、エフェクター領域とRNase P基質のアクセプターステムとは、直接隣接する(すなわち、重複していない)。他の実施形態においては、エフェクター領域とRNase P基質のアクセプターステムとは、1、2、3、4、5個又はそれよりも多いヌクレオチドだけ隔てられている。

一実施形態においては、リボスイッチ配列は、RNase P基質配列のステムループ内に位置する。一実施形態においては、リボスイッチ配列は、RNase P基質配列のDステムループ内に位置する。一実施形態においては、リボスイッチ配列は、RNase P基質配列のTステムループ内に位置する。一実施形態においては、リボスイッチ配列は、RNase P基質配列の可変ループに位置する。一実施形態においては、リボスイッチ配列は、RNase P基質配列のアンチコドンステムループ内に位置する。

別の態様においては、本発明は:(a)本発明のポリヌクレオチドカセットを標的遺伝子の非翻訳領域(UTR:untranslated region)に挿入する工程と、(b)ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子を細胞に導入する工程と、(c)細胞を、標的遺伝子の発現を増大するのに有効な量の、アプタマーに特異的に結合するリガンドに曝露する工程とを含む、標的遺伝子の発現を変調する方法を提供する。一実施形態においては、リガンドは、小分子である。

一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子の5'非翻訳領域に挿入される。一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子の3'非翻訳領域に挿入される。一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子のイントロンに挿入される。

一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットのうちの2つ又はそれよりも多くは、標的遺伝子に挿入される。一実施形態においては、2つ又はそれよりも多いポリヌクレオチドカセットは、様々な小分子リガンドに特異的に結合する様々なアプタマーを含む。一実施形態においては、2つ又はそれよりも多いポリヌクレオチドカセットは、同じアプタマーを含む。一実施形態においては、2つ又はそれよりも多いポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子の5'非翻訳領域、3'非翻訳領域又は両方にある。

一態様においては、本発明のポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子の発現の調節のための他の機構と組み合わせて使用される。一実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドカセットは、参照により本明細書に組み込むWO2016/126747(PCT/US2016/016234)において説明されている、選択的スプライシングのアプタマー媒介調節によって標的遺伝子発現を変調する遺伝子調節カセットと組み合わせて使用される。他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドカセットは、参照により本明細書に組み込むPCT/US2017/016303において説明されている、自己切断リボザイムのアプタマー媒介調節によって標的遺伝子発現を変調する遺伝子調節カセットと組み合わせて使用される。他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドカセットは、参照により本明細書に組み込むPCT/US2017/016279において説明されている、ポリアデニル化のアプタマー媒介変調によって標的遺伝子発現を変調する遺伝子調節カセットと組み合わせて使用される。他の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドカセットは、参照により本明細書に組み込むPCT/US2018/019056において説明されている、ポリアデニル化シグナルのアプタマー媒介アクセス可能性によって標的遺伝子発現を変調する遺伝子調節カセットと組み合わせて使用される。

一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子は、標的遺伝子の発現のためのベクターに組み込まれる。一実施形態においては、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態においては、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。

別の態様においては、本発明は、本発明のポリヌクレオチドカセットを含有する標的遺伝子を含むベクターを提供する。一実施形態においては、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態においては、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。

一実施形態においては、ポリヌクレオチドカセットを含む標的遺伝子は、非組織特異的プロモーターを損なう(compromising)発現構築物又はベクターに組み込まれる。他の実施形態においては、プロモーターは、組織特異的である。

図1a。ポリヌクレオチドカセットが標的遺伝子の3'非翻訳領域(UTR)に挿入されている一実施形態の模式図。この実施形態においては、リボスイッチのエフェクター配列は、リーダー配列に相補的な配列を含む。リガンドが存在しない場合、エフェクター配列は、リーダー配列を含むステムを形成しない。リーダー配列は、RNase Pにアクセス可能であり、RNAは切断され、標的遺伝子の分解及び発現の防止(又は低減)をもたらす。図1b。アプタマーに結合したリガンド(◆)を伴う、図1aからのポリヌクレオチドカセットの模式図。リガンドが存在する場合、エフェクター配列は、RNase基質のリーダー配列を含むステムを形成する。リーダー配列は、もはやアクセス可能ではなく、RNase PによるRNAの切断は阻害され、標的遺伝子の発現の増大をもたらす。図2a。mascRNAのノザンブロット分析。mascRNAをコードする配列を、標的遺伝子(GFP)の3'UTRに挿入し、mRNAの切断及びタンパク質発現の低減をもたらした。示される構築物をトランスフェクトしたHeLa細胞を、トランスフェクションの24時間又は48時間後に収集し、RNA抽出した。DIG標識プローブは、ヒト及びマウスmascRNAの両方を認識する。レーン1及びレーン4は、内因性ヒトmascRNAを示し、レーン2及びレーン5は、GFPレポーター遺伝子の3'UTRに挿入されたマウスmascRNAによって生じたmascRNA発現の増大を示す。図2b。5'UTR又は3'UTRのいずれかにおけるmascRNAの挿入は、GFP発現を減少する。HeLa細胞に、示される構築物をトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後にフローサイトメトリー分析に供した。GFP陽性集団の割合(%)及び平均蛍光強度(MFI:mean fluorescence intensity)をグラフで示す。3'UTR(GFP-masc)、5'UTR(masc-GFP)又は5'及び3'UTRの両方(masc-GFP-masc)のmascRNAを伴う構築物をトランスフェクトした細胞は、対照CMV-GFP構築物を有する細胞と比較して、GFP陽性細胞の割合及びMFIの両方における減少を有した。図2c。3'UTRにおけるmascRNAの挿入は、ルシフェラーゼ標的遺伝子発現を減少する。マウスmascRNA(配列番号17)又は変異マウスmascRNA(配列番号18；本明細書においてmasc-mlpと呼ばれる)を、ルシフェラーゼ遺伝子の3'UTRに挿入した。マウスmascRNAの予測されるtRNA様二次構造を上パネル上に示し、UUCからAAGへのT-ループにおける変異を示す。下パネルは、ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。3'UTRにおけるmascRNAの挿入は、ルシフェラーゼ発現の81%の減少をもたらし(Luci-masc)、一方で、mascRNAのT-ループにおける変異を含有する構築物を有する細胞(Luci-masc-mlp)は、ルシフェラーゼ発現の20%のみの低減を示した。図3a。MG1(配列番号1)ポリヌクレオチドカセットからのmRNA転写産物の模式図。図3b。GM1(配列番号2)ポリヌクレオチドカセットからのmRNA転写産物の模式図。図3c。mRNAのRNase P切断のアプタマー媒介変調を通した遺伝子発現の調節。ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。HEK293細胞に、示されるルシフェラーゼ対照構築物であるCon8、又はmascRNA及びグアニンアプタマー配列(MG1、GM1、GM2(配列番号3)及びGM3(配列番号4))の両方を含有する構築物をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、溶媒対照としてのDMSO、又はアプタマーリガンドとしてのグアノシンのいずれかで処理した。グアノシン処理の非存在下では、構築物MG1、GM1又はGM2をトランスフェクトした細胞は、対照構築物をトランスフェクトした細胞と比較して、ルシフェラーゼ発現の低減を示した。MG1、GM1又はGM2を有する細胞のグアノシン処理は、ルシフェラーゼ発現を増大したが、GM3を有する細胞のグアノシン処理は増大しなかった。ルシフェラーゼ活性は、平均値±S.D.(n=3)として表し、誘導倍率は、グアノシンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアノシンの非存在下で得た値で割った商として表した。図4a。アプタマーステムの上流(5')の局所配列における変化は、GM構築物におけるリボスイッチ活性に影響を及ぼす。示される構築物をトランスフェクトし、グアニンあり又はなしで処理したHEK293細胞において、ルシフェラーゼ活性を測定した。GM4(配列番号5)は、GM1からの3個のヌクレオチド変化を有し、アプタマーステムの5'の3個のヌクレオチドは、これらのヌクレオチドによる追加の塩基対形成の可能性を低減するように変えられている。図4b。アプタマーとRNase P基質との間の距離は、GM構築物におけるリボスイッチ活性に影響を及ぼす。GM構築物におけるアプタマー/エフェクター領域の位置を、mascRNAと比較して1ヌクレオチド増分上流(5')に移動し、エフェクター領域(アプタマー)ステムの部分ではないリーダー配列の0～3個のヌクレオチド(それぞれ、構築物GM5～GM8(配列番号7～10))を可能にした。示される構築物をトランスフェクトし、グアニンあり又はなしで処理し、(n=3)のHEK293細胞から、平均値±S.D.として表されるルシフェラーゼ活性を測定した。誘導倍率を、グアニンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアニンの非存在下で得た値で割った商として表した。2つの構造間に空間がないGM5構築物は、構築物GM4より低い基礎レベルのルシフェラーゼ発現によって示される通り、より効率的なRNase P媒介切断を有する。図4c。MG構築物におけるRNase基質のアクセプターステムに相補的なリボスイッチエフェクター領域の長さの効果。mascRNAのアクセプターステムに相補的な、それぞれ、6～3個のヌクレオチドを有するエフェクター領域ステムを有する構築物MG1～MG4(各々、全部で8bpのエフェクター領域ステムを有する)を創出した。MG3(配列番号12)及びMG4(配列番号13)は、わずかにMG1より効率的なRNase P切断、及びグアニンによる処理に際してより効率的なルシフェラーゼ誘導を有する。図5。RNase P基質としてのヒトtRNA^Argを通して媒介されるXpt-グアニンアプタマー変調RNase P切断。対照構築物Con8、GM1(mascRNAを含有する)又はGArg(配列番号14)(ヒトtRNA^Argを含有する)をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞をグアニンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、グアニンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアニンの非存在下で得た値で割った商として表した。図6a。テオフィリンアプタマーを有するリボスイッチは、mascRNA-RNase P媒介mRNA切断を変調した。対照構築物Con8、又はテオフィリンアプタマー及びmascRNAを含有する構築物TheoM(配列番号16)をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞を、3mMテオフィリンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、アプタマーリガンドの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、アプタマーリガンドの非存在下で得た値で割った商として表した。図6b。アデニンアプタマーを有するリボスイッチは、mascRNA-RNase P媒介mRNA切断を変調した。対照構築物Con8、又はydhl-Aアデニンアプタマー及びmascRNAを含有する構築物YM(配列番号15)をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞を、1mMアデニンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、アプタマーリガンドの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、アプタマーリガンドの非存在下で得た値で割った商として表した。図7a。標的遺伝子発現のより厳格な調節を達成するためのRNase P基質ベースのリボスイッチと第2のリボスイッチとの組合せ使用。構築物G15又はGM1-G15をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞を500μMグアニンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、グアニンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアニンの非存在下で得た値で割った商として表した。図7b。標的遺伝子発現のより厳格な調節を達成するためのRNase P基質ベースのリボスイッチと第2のリボスイッチとの組合せ使用。構築物G17又はGM1-G17をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞を500μMグアニンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、グアニンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアニンの非存在下で得た値で割った商として表した。図7c。Epo標的遺伝子発現のより厳格な調節を達成するためのRNase P基質ベースのリボスイッチと第2のリボスイッチとの組合せ使用。構築物G17_2IR3又は構築物GM1-G17_2IR3をトランスフェクトしたHEK293細胞から収集した上清から、ELISAを使用してマウスEpoタンパク質の発現を測定した。Epoの濃度を、平均値±S.D.(n=3)として表し、誘導倍率を、グアニンの存在下で得たEpo濃度を、グアニンの非存在下で得たEpo濃度で割った商として表した。図8。本明細書において説明する構築物の配列。標的遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ)コード配列の3'末端は、大文字であり;mascRNA又はtRNA^Arg配列は、イタリック体の小文字で、灰色で網掛けしており;アプタマー配列は、波下線を引いている。エフェクター領域ステムを形成する配列は、二重下線を引いている。図8。本明細書において説明する構築物の配列。標的遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ)コード配列の3'末端は、大文字であり;mascRNA又はtRNA^Arg配列は、イタリック体の小文字で、灰色で網掛けしており;アプタマー配列は、波下線を引いている。エフェクター領域ステムを形成する配列は、二重下線を引いている。図8。本明細書において説明する構築物の配列。標的遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ)コード配列の3'末端は、大文字であり;mascRNA又はtRNA^Arg配列は、イタリック体の小文字で、灰色で網掛けしており;アプタマー配列は、波下線を引いている。エフェクター領域ステムを形成する配列は、二重下線を引いている。図8。本明細書において説明する構築物の配列。標的遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ)コード配列の3'末端は、大文字であり;mascRNA又はtRNA^Arg配列は、イタリック体の小文字で、灰色で網掛けしており;アプタマー配列は、波下線を引いている。エフェクター領域ステムを形成する配列は、二重下線を引いている。

本出願は、その全体を本明細書に組み込む2016年3月2日出願の米国仮出願第62/466,138号の優先権を主張する。本出願は、以下に列挙する配列番号を提供する配列リストを参照し、当該配列リストは、電子文書として本明細書と共に提供され、その全体を参照により本明細書に組み込む。

標的遺伝子(例えば治療用トランスジーン)の発現の調節は、様々な状況において有用又は必要である。治療用の遺伝子発現に関連して、トランスジーンの発現の調節を可能にする技術は、発現レベル及び発現のタイミングを調節することによって安全性を向上する可能性を有する。タンパク質発現を制御するように調節された系は、安全で有効な治療適用のための実用的、且つ一部の場合、本質的な役割を有する。本発明は、標的遺伝子のRNAのアプタマー媒介リボヌクレアーゼ切断による標的遺伝子発現の変調のためのポリヌクレオチドカセット、及びアプタマーに結合するリガンドの存在又は非存在に応答して標的遺伝子発現を変調するためにポリヌクレオチドカセットを使用する方法を提供する。mRNAのヌクレオチド鎖切断は、例えば5'キャップ又は3'ポリAテールの喪失をもたらし、RNAエキソソーム経路を通したmRNAの分解をもたらす。したがって、本発明は、アプタマーリガンドを提供することによって標的遺伝子の発現を調節するために使用され得る遺伝子調節カセットを提供する。そのような方法は、例えば細胞、組織及び生物における標的遺伝子発現の研究のために、又は治療用タンパク質の発現レベルの調節のために、有用である。

遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子のDNAに組み込まれた場合に、生ずるRNAのアプタマー/リガンド媒介リボヌクレアーゼ切断によって標的遺伝子発現を調節する能力を提供する、組換えDNA構築物を指す。本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチドカセット又は構築物は、様々な供給源(例えば様々な生物、同じ生物からの様々な遺伝子等)に由来するエレメントを含む核酸(例えばDNA又はRNA)である。ポリヌクレオチドカセットは、リボスイッチ及びリボヌクレアーゼ基質配列を含む。本発明に関連するリボスイッチは、センサー領域(例えばアプタマー)及びエフェクター領域を含有し、これらは共に、センサー領域に結合するリガンドの存在を感知し、リボヌクレアーゼによるリボヌクレアーゼ基質配列の切断を変える役割を有する。一実施形態においては、標的遺伝子の発現は、アプタマーリガンドが存在する場合に増大し、リガンドが非存在である場合に減少する。

リボヌクレアーゼ基質
リボスイッチに連結したリボヌクレアーゼ基質配列は、遺伝子調節ポリヌクレオチドカセットの部分として標的遺伝子に挿入された場合に、リボヌクレアーゼが標的RNAを切断するようにターゲティングする任意のリボヌクレアーゼ基質であり得る。一実施形態においては、リボヌクレアーゼ基質は、RNase P基質配列、例えばtRNA前駆体又は相同配列である。他の実施形態においては、RNase P基質配列は、RNase P切断を開始し得るmascRNA;MENベータtRNA様構造(両方とも参照により本明細書に組み込む、Sunwooら Genome Research 2009、19:347～359頁;Wiluszら、Genes Dev. 2012、26(21):2392～407頁を参照のこと)、ウイルスtRNA様構造、RNase Pモデル基質をコードする配列及び相同配列を含む。Yuan及びAltmanは、The EMBO Journal(14巻、159～168頁、参照により本明細書に組み込む)において公開された論文において、例えばD-ループ又はアンチコドンループが欠失したチロシンtRNA前駆体を含むモデルRNase P基質配列を説明している(例えばYuan及びAltmanの図1～図4、表1及び関連する本文を参照のこと)。

リボスイッチ
「リボスイッチ」という用語は、本明細書において使用するとき、RNAポリヌクレオチドの調節セグメント、又はRNAポリヌクレオチドの調節セグメントをコードするDNA配列を指す。本発明に関連するリボスイッチは、センサー領域(例えばアプタマー)及びエフェクター領域を含有し、これらは共に、リガンド(例えば小分子)の存在を感知し、リボヌクレアーゼによる切断についてのリボヌクレアーゼ基質配列の好適性を変調する役割を有する。一実施形態においては、リボヌクレアーゼは、RNase Pである。一実施形態においては、リボスイッチは、組換えであり、2つ又はそれよりも多い供給源からのポリヌクレオチドを利用する。「合成」という用語は、リボスイッチに関連して本明細書において使用するとき、天然ではないリボスイッチを指す。一実施形態においては、センサー及びエフェクター領域は、ポリヌクレオチドリンカーによって連結される。一実施形態においては、ポリヌクレオチドリンカーは、RNAステム(すなわち、二本鎖であるRNAポリヌクレオチドの領域)を形成する。

リボスイッチのアプタマー部分は、RNase P基質の5'末端、3'末端及び/又はステムループ内に位置し得る。アプタマーがRNase P基質配列の5'末端に連結する場合、リボスイッチのエフェクター領域は、RNase P基質リーダー配列のすべて又は部分に相補的な配列を含み得る(例えば図1a、図1b及び図3bを参照のこと)。この配置(すなわち、基質の5'末端のリボスイッチ)において、また、リボスイッチのエフェクター領域は、(例えばGM1及びGM2構築物におけるように)RNase P基質の5'アクセプターステム配列のすべて又は部分に相補的な配列を含み得る。

リボスイッチのアプタマー部分が(MG1～4構築物におけるように)RNase P基質の3'末端に位置する場合、エフェクター領域は、RNase P基質の3'アクセプターステム配列のすべて又は部分に相補的な配列を含む。他の実施形態においては、リボスイッチのアプタマー部分は、RNase P基質配列のステムループに位置する。一部の実施形態においては、リボスイッチ配列のアプタマー部分は、RNase P基質配列のDステムループ、Tステムループ、アンチコドンステムループ又は可変ループに位置する。リボスイッチがDステムループに位置する場合、エフェクター領域は、Dステムのすべて又は部分を含み得る。同様に、アプタマーがTステムループ、アンチコドンステムループ又は可変ループに位置する場合、エフェクター領域は、それぞれ、Tステム、アンチコドンステム又は可変ループステムのすべて又は部分を含み得る。

エフェクター領域
リボスイッチのエフェクター領域は、センサー領域(例えばアプタマー)へのリガンド結合に応答してリボヌクレアーゼ基質のリボヌクレアーゼ切断への感受性を変えるRNA配列を含む。一実施形態においては、エフェクター領域は、RNase P基質配列のリーダー配列のすべて又は部分を含む。この実施形態においては、エフェクター領域ステムは、リーダー配列の一部又はすべて、及びリーダー配列の一部又はすべてに相補的な配列を含む。アプタマーがそのリガンドに結合した場合、エフェクター領域は、リーダー配列を含むステムを形成し、それによってRNase Pによる標的RNAの切断を防止する(例えば図1bを参照のこと)。ある特定の条件下では(例えば、アプタマーがそのリガンドに結合していない場合)、エフェクター領域は、リーダー配列へのアクセスを提供し、RNase Pによる切断をもたらす状態にある(例えば図1a及び図3bを参照のこと)。他の実施形態においては、エフェクター領域ステムは、リーダー配列(及びその相補体)に加えて、(GM1及びGM2構築物におけるように)RNase P基質のアクセプターステムの1つ又は複数のヌクレオチド、及びアクセプターステムの1つ又は複数のヌクレオチドに相補的な配列を含む。実施形態、他の実施形態においては、エフェクター領域ステムの部分ではないRNase P基質の3'リーダー配列の1つ又は複数のヌクレオチドが存在する(例えば構築物GM6、GM7及びGM8を参照のこと)。換言すれば、これらの実施形態においては、エフェクター領域ステムを形成する配列とRNase P基質のアクセプターステムを形成する配列とは重複せず、0、1、2、3又は4個のヌクレオチドだけ隔てられていることがある。

一部の実施形態においては、エフェクター領域は、RNase P基質配列のアクセプターステムの一部又はすべてを含む(例えば図3aを参照のこと)。この実施形態においては、エフェクター領域ステムは、アクセプターステム配列の一部又はすべて、及びアクセプターステム配列の一部又はすべてに相補的な配列を含む。アプタマーがそのリガンドに結合した場合、エフェクター領域は、アクセプターステム配列を含むステムを形成し、それによってアクセプターステム構造を破壊し、RNase Pによる標的RNAの切断を防止する。ある特定の条件下では(例えば、アプタマーがそのリガンドに結合していない場合)、エフェクター領域は、アクセプターステム構造を可能にし、RNase Pによる切断をもたらす状態にある。本発明の実施形態においては、エフェクター領域ステムは、RNase P基質のアクセプターステムの1、2、3、4、5又は6個のヌクレオチド、及び相補配列を含む。他の実施形態においては、エフェクター領域は、Dステムループ、Tステムループ、可変ループ又はアンチコドンステムループのステムのすべて又は部分を含む。

リガンドがアプタマーに結合した際にステムを形成することができるエフェクター領域の部分は、リガンドがアプタマーに結合した際に基質のリボヌクレアーゼ切断を実質的に防止し、一方でまた、リガンドが十分な量で存在していない場合にリボヌクレアーゼ基質がリボヌクレアーゼによって切断されることを可能にするのに十分な長さ(及びGC含有量)のものであるべきである。本発明の実施形態においては、エフェクター領域のステム部分は、リボヌクレアーゼ基質配列に加えてステム配列及びその相補配列を含む。一部の実施形態においては、この追加のステム配列は、アプタマーステムからの配列を含む。エフェクター領域ステムの長さ及び配列は、リガンドが存在していない場合に標的遺伝子の許容可能なバックグラウンド発現を可能にし、リガンドが存在している場合に標的遺伝子の許容可能な発現レベルを可能にするステムを特定するために、公知の技術を使用して改変することができる。エフェクター領域ステムが、例えば長すぎる場合、それはリーダー配列へのアクセスを覆い隠すか、又は代わりに基質がリガンドの存在下若しくは非存在下でリボヌクレアーゼによって切断されることを防止し得る。ステムが短すぎる場合、それは、リーダー配列を隔離することができる安定なステムを形成しない場合があり(又は代わりに基質のコンフォメーションを変えない場合があり)、その場合、標的RNAは、リガンドの存在下又は非存在下で切断される。一実施形態においては、エフェクター領域ステムの全長は、約7塩基対～約20塩基対である。一部の実施形態においては、ステムの長さは、約8塩基対～約11塩基対である。一部の実施形態においては、ステムの長さは、8塩基対～11塩基対である。ステムの長さに加えて、ステムのGC塩基対含有量は、ステムの安定性を改変するために変えることができる。

アプタマー/リガンド
一実施形態においては、センサー領域は、アプタマーを含む。「アプタマー」という用語は、本明細書において使用するとき、リガンドに特異的に結合するRNAポリヌクレオチドを指す。「リガンド」という用語は、アプタマーが特異的に結合する分子を指す。一実施形態においては、リガンドは、例えば脂質、単糖、セカンドメッセンジャー、補因子、金属イオン、他の天然生成物及び代謝産物、核酸並びにほとんどの治療用薬物を含む小分子、すなわち、低分子量(約1,000ダルトン未満の)分子である。一実施形態においては、リガンドは、2個又はそれよりも多いヌクレオチド塩基を有するポリヌクレオチドである。

一実施形態においては、リガンドは、8-アザグアニン、アデノシン5'-一リン酸一水和物、アムホテリシンB、エバーメクチンB1、アザチオプリン、クロルマジノン酢酸塩、メルカプトプリン、モリシジン塩酸塩、N6-メチルアデノシン、ナダイド、プロゲステロン、プロマジン塩酸塩、ピルビニウムパモ酸塩、スルファグアニジン、テストステロンプロピオン酸エステル、チオグアノシン、チロキサポール及びボリノスタットからなる群から選択される。

また、アプタマーリガンドは、発癌性形質転換等の特異的生理学的/病理学的状態下で顕著に増大する細胞内因性成分である場合があり、これらは、セカンドメッセンジャー分子、例えばGTP又はGDP、カルシウム;脂肪酸又は乳がんにおける13-HODE等の不正確に代謝された脂肪酸(参照により本明細書に組み込むFlaherty, JTら、Plos One、8巻、e63076、2013);アミノ酸又はアミノ酸代謝産物;通常がん細胞において、又は代謝疾患においては正常細胞においてより高レベルを有する解糖経路における代謝産物;及びがん関連分子、例えばRas又は変異Rasタンパク質、肺がんにおける変異EGFR、多くの種類のがんにおけるインドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO:indoleamine-2,3-dioxygenase)を含み得る。内因性リガンドは、JP Wiebe(参照により本明細書に組み込むEndocrine-Related Cancer(2006)13:717～738頁)によって開示されている乳がんにおけるプロゲステロン代謝産物を含む。また、内因性リガンドは、Minton, DR及びNanus, DM(参照により本明細書に組み込むNature Reviews, Urology、12巻、2005)によって開示されている、腎がんにおいてキー代謝酵素における変異から生ずるレベルの増大を有する代謝産物、例えば乳酸塩、グルタチオン、キヌレニンを含む。

アプタマーは、意図される標的分子(すなわち、リガンド)と複合体を形成することができる結合領域を有する。結合の特異性は、アプタマーの非関連分子についての解離定数と比較した、アプタマーのそのリガンドについての相対的解離定数(Kd)の点で定義することができる。したがって、リガンドは、非関連材料に対してよりも大きなアフィニティでアプタマーに結合する分子である。典型的に、アプタマーのそのリガンドについてのKdは、非関連分子でのアプタマーのKdより少なくとも約10倍小さい。他の実施形態においては、Kdは、少なくとも約20倍小さく、少なくとも約50倍小さく、少なくとも約100倍小さく、少なくとも約200倍小さい。アプタマーは典型的に、長さが約15～約200個のヌクレオチドである。より通常には、アプタマーは、長さが約30～約100個のヌクレオチドである。

リボスイッチの部分として組み込まれ得るアプタマーは、天然アプタマー若しくはその改変、又は新規に設計し、且つ/若しくはexponential enrichment(SELEX)法によるリガンドの系統的発展若しくは他のスクリーニング方法を通してスクリーニングしたアプタマーであり得る。小分子リガンドに結合するアプタマーの例として、テオフィリン、ドパミン、スルホローダミンB、セロビオース、カナマイシンA、リビドマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンB、バイオマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、サイトカイン、細胞表面分子及び代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。小分子を認識するアプタマーの概略については、例えばFamulok、Science 9:324～9頁(1999)並びにMcKeague, M.及びDeRosa, M.C.J. Nuc. Aci. 2012(それらの両方を参照により本明細書に組み込む)を参照されたい。別の実施形態においては、アプタマーは、相補的ポリヌクレオチドである。

アプタマー/リガンドを特定するための方法
一実施形態においては、アプタマーは、特定の小分子リガンドに結合するように設計される。特定のリガンドに結合するアプタマーを設計及び選択するための方法は、参照により本明細書に組み込むWO/2018/025085において開示されている。アプタマーをスクリーニングするための他の方法として、例えば、SELEX法が挙げられる。SELEX法を使用して小分子を選択的に結合するアプタマーを設計するための方法は、例えば参照により本明細書に組み込む米国特許第5,475,096号、同第5,270,163号及びAbdullah Ozerら Nuc. Aci. 2014において開示されている。SELEX法の改変は、参照により本明細書に組み込む米国特許第5,580,737号及び同第5,567,588号において説明されている。

アプタマーを特定するための選択技術は一般的に、ランダム化又は突然変異誘発される領域を含有する所望の長さのDNA又はRNA分子の大きなプールを調製することを含む。例えば、アプタマー選択のためのオリゴヌクレオチドプールは、約15～25個のヌクレオチド長であり、PCRプライマーの結合に有用である定義された配列の領域に隣接した、20～100個のランダム化ヌクレオチドの領域を含有し得る。オリゴヌクレオチドプールを、標準のPCR技術、又は選択した核酸配列の増幅を可能にする他の手段を使用して増幅する。RNAアプタマーが所望される場合、DNAプールをin vitroで転写して、RNA転写産物のプールを生成してもよい。その後、RNA又はDNAオリゴヌクレオチドのプールを、所望のリガンドに特異的に結合するそれらの能力に基づいた選択に供する。選択技術として、例えばアフィニティクロマトグラフィーが挙げられるが、別の分子に特異的に結合するそれらの能力に基づいた核酸の選択を可能にする任意のプロトコールを使用してもよい。小分子に結合し、細胞内で機能するアプタマーを特定するための選択技術は、細胞ベースのスクリーニング法を含み得る。アフィニティクロマトグラフィーの場合、オリゴヌクレオチドを、カラム内の、又は磁気ビーズ上の基質上に固定した標的リガンドと接触させる。オリゴヌクレオチドを好ましくは、正常生理学条件を模倣する塩濃度、温度及び他の条件の存在下でリガンド結合について選択する。リガンドに結合するプール中のオリゴヌクレオチドを、カラム又はビーズ上に保持し、非結合配列を洗い流す。その後、リガンドに結合するオリゴヌクレオチドを、(通常、溶離後に)PCRによって(RNA転写産物を利用した場合、逆転写後に)増幅する。選択した配列について、全部で約3～10回の反復ラウンドの選択手技分、選択方法を繰り返す。その後、得られたオリゴヌクレオチドを増幅し、クローニングし、標準の手技を使用して配列決定して、標的リガンドに結合することができるオリゴヌクレオチドの配列を特定する。アプタマー配列を特定すると、突然変異誘発したアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドのプールから開始する追加のラウンドの選択を行うことによって、アプタマーを更に最適化してもよい。

1又は複数ラウンドのin vitro選択(例えばSELEX法)の後に、in vivoアプタマースクリーニングを使用してもよい。例えば、Konig, J.ら(参照により本明細書に組み込むRNA. 2007,13(4):614～622頁)は、SELEX法と、アプタマーのin vivo選択のための酵母3ハイブリッド系とを組み合わせることを説明している。

標的遺伝子
本発明の遺伝子調節カセットは、標的細胞、組織又は生物において発現され得る任意の標的遺伝子の発現を調節するために使用され得るプラットホームである。「標的遺伝子」という用語は、適切な条件下で細胞に導入し、RNAに転写、翻訳及び/又は発現することができるポリヌクレオチドを指す。或いは、標的遺伝子は、標的細胞にとって内因性であり、本発明の遺伝子調節カセットは、標的遺伝子に(例えば内因性標的遺伝子の5'又は3'UTRに)位置付けられる。標的遺伝子の例は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。別の実施形態においては、標的遺伝子は、RNA、例えばmiRNA、rRNA、小又は長非コードRNA、ショートヘアピンRNA(shRNA)及び任意の他の調節RNAをコードする。一実施形態においては、標的遺伝子は、組換えDNA構築物が転写される細胞にとって外因性である。別の実施形態においては、標的遺伝子は、組換えDNA構築物が転写される細胞にとって内因性である。

本発明による標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であっても、非タンパク質コードRNAをコードする配列であってもよい。標的遺伝子は、例えば、構造タンパク質、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、ホルモン、輸送タンパク質、増殖因子、サイトカイン、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、受容体分子、RNA結合タンパク質、DNA結合タンパク質、転写因子、翻訳装置、チャネルタンパク質、モータータンパク質、細胞接着分子、ミトコンドリアタンパク質、代謝酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、交換因子、シャペロンタンパク質及びこれらのうちのいずれかのモジュレーターをコードする遺伝子であってもよい。実施形態においては、標的遺伝子は、エリスロポエチン(Epo:erythropoietin)、ヒト成長ホルモン(hGH:human growth hormone)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN:transcription activator-like effector nucleases)、ヒトインスリン、CRISPR関連タンパク質9(cas9)、又は例えば治療用抗体を含む免疫グロブリン(又はその部分)をコードする。

発現構築物
本発明は、標的遺伝子をコードし、本明細書において説明する遺伝子調節カセットを含有するポリヌクレオチドの標的細胞への導入のための組換えベクターの使用を企図する。多くの実施形態においては、本発明の組換えDNA構築物は、ホスト細胞におけるDNAの複製及びその細胞における適切なレベルでの標的遺伝子の発現を提供するDNAセグメントを含む追加のDNAエレメントを含む。当業者は、発現制御配列(プロモーター、エンハンサー等)は、標的細胞において標的遺伝子の発現を促進するそれらの能力に基づいて選択されることを理解する。「ベクター」は、in vitro又はin vivoのいずれかでホスト細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミド、酵母人工染色体(YAC:yeast artificial chromosome)、ミニ染色体、DNAミニサークル又はウイルス(ウイルス由来配列を含む)を意味する。一実施形態においては、組換えベクターは、ウイルスベクター又は多数のウイルスベクターの組合せである。

標的細胞、組織又は生物における標的遺伝子のアプタマー媒介発現のためのウイルスベクターは、本分野で公知であり、アデノウイルス(AV:adenoviral)ベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV:adeno-associated virus)ベクター、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター並びに単純ヘルペスウイルス1型(HSV1:Herpes simplex type 1)ベクターを含む。

アデノウイルスベクターは、例えば、E1及びE3領域における欠失を通して複製欠損にしたヒトアデノウイルス2型及びヒトアデノウイルス5型に基づくベクターを含む。転写カセットを、E1領域に挿入し、組換えE1/E3欠失AVベクターを産出してもよい。また、アデノウイルスベクターは、ウイルスコード配列を含有しない、ヘルパー依存性高性能アデノウイルスベクター(高性能「gutless」又は「gutted」ベクターとしても知られる)を含む。これらのベクターは、ウイルスDNA複製及びパッケージングに必要なシス作用エレメント、主に末端逆位配列(ITR:inverted terminal repeat sequence)及びパッケージングシグナル(ψ)を含有する。これらのヘルパー依存性AVベクターゲノムは、数百塩基対～最大で約36kbの外来DNAを運搬する可能性を有する。

組換えアデノ随伴ウイルス「rAAV(recombinant adeno-associated virus)」ベクターは、非限定的にAAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-7及びAAV-8、AAV-9、AAV-10等を含む、任意のアデノ随伴ウイルス血清型に由来する任意のベクターを含む。rAAVベクターは、全体的又は部分的に欠失したAAV野生型遺伝子のうちの1つ又は複数、好ましくはRep及び/又はCap遺伝子を有し得るが、機能的隣接ITR配列を保持している。機能的ITR配列は、AAVゲノムのレスキュー、複製、パッケージング及び染色体組込みの可能性のために保持される。ITRは、配列が機能的レスキュー、複製及びパッケージングを提供する限り、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、(例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって)変えてもよい。

或いは、他の系、例えばレンチウイルスベクターを、本発明の実施形態において使用することができる。レンチウイルスベースの系は、非分裂及び分裂細胞、例えばCNSの非分裂細胞に形質導入し、細胞をターゲティング適用に有用にさせることができる。レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスに由来し、そのウイルスと同様に、宿主ゲノムに組み込まれ、長期遺伝子発現の可能性を提供する。

また、遺伝子調節カセットを含有する標的遺伝子を運搬するプラスミド、YAC、ミニ染色体及びミニサークルを含むポリヌクレオチドは、例えば担体としてカチオン性脂質、ポリマー又は両方を使用する非ウイルスベクター系によって細胞又は生物に導入することができる。また、コンジュゲートしたポリ-L-リジン(PLL:poly-L-lysine)ポリマー及びポリエチレンイミン(PEI:polyethylenimine)ポリマー系は、ベクターを細胞に送達するために使用することができる。ベクターを細胞に送達するための他の方法は、細胞培養物及び生物両方について、ハイドロダイナミック注入法及びエレクトロポレーション法並びに超音波の使用を含む。遺伝子送達のためのウイルス及び非ウイルス送達系の概略については、参照により本明細書に組み込むNayerossadat, N.ら(Adv Biomed Res. 2012;1:27頁)を参照されたい。

標的遺伝子の発現を変調する方法
一態様においては、本発明は、(a)本発明の遺伝子調節カセットを標的遺伝子に挿入する工程;(b)遺伝子調節カセットを含む標的遺伝子を細胞に導入する工程;(c)細胞をアプタマーに結合するリガンドに曝露する工程による、標的遺伝子(例えば治療用遺伝子)の発現を変調する方法を提供する。一実施形態においては、リガンドは、小分子である。態様においては、標的細胞における標的遺伝子の発現は、それが導入された細胞に所望の特性を与えるか、又は代わりに所望の治療結果をもたらす。標的細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。実施形態においては、標的細胞は、例えば脂肪、中枢神経系(CNS:central nervous system)、筋肉、心臓、眼、肝臓等を含む標的組織からのヒト細胞である。

好ましい実施形態においては、1つ又は複数の遺伝子調節カセットを、標的遺伝子の5'及び/又は3'非翻訳領域に挿入する。一実施形態においては、単一の遺伝子調節カセットを、標的遺伝子に挿入する。他の実施形態においては、2、3、4つ又はそれよりも多い遺伝子調節カセットを、標的遺伝子に挿入する。一実施形態においては、2つの遺伝子調節カセットを、標的遺伝子に挿入する。多数の遺伝子調節カセットを標的遺伝子に挿入する場合、多数のカセットのリボヌクレアーゼ切断を変調するために単一のリガンドを使用し、それによって標的遺伝子発現を変調することができるように、それら各々は、同じアプタマーを含有し得る。他の実施形態においては、多数の遺伝子調節カセットが、標的遺伝子に挿入され、多数の様々な小分子リガンドへの曝露が標的遺伝子発現を変調するように、各々が、様々なアプタマーを含有してもよい。他の実施形態においては、多数の遺伝子調節カセットが、標的遺伝子に挿入され、各々は、様々なリボヌクレアーゼ基質配列を含有する。これは、組換えを低減すること、及びウイルスベクターへの組込みの容易さを改善することにおいて有用であり得る。

本発明のポリヌクレオチドカセットは、標的遺伝子の発現の調節のための他の機構と組み合わせて使用してもよい。一実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドカセットを、参照により本明細書に組み込むWO2016/126747において説明されている選択的スプライシングのアプタマー媒介調節によって標的遺伝子発現を変調する遺伝子調節カセットと組み合わせて使用する。また、本発明は、参照により本明細書に組み込むPCT/US2017/016303及びPCT/US1207/016279において説明されているポリヌクレオチド構築物及び方法と組み合わせてもよい。

治療方法及び医薬組成物
本発明の一態様は、遺伝子療法によって送達される治療用タンパク質のレベルを調節する方法を提供する。この実施形態においては、「標的遺伝子」は、治療用タンパク質をコードし得る。「標的遺伝子」は、細胞にとって内因性又は外因性のタンパク質をコードし得る。

アプタマー駆動リボスイッチを伴う調節カセットを含有する治療用遺伝子配列は、in vitro又はex vivoで、例えばベクターによって標的細胞に送達される。「標的遺伝子」の細胞特異性は、ベクター内のプロモーター又は他のエレメントによって制御され得る。標的遺伝子及びポリヌクレオチドカセットを含有するベクター構築物の送達、並びに調節される標的遺伝子の安定なトランスフェクションをもたらす標的組織のトランスフェクションは、治療用タンパク質を生成することにおける第1の工程である。

しかしながら、標的遺伝子配列内の調節カセットの存在のために、標的遺伝子は顕著なレベルで発現されない、すなわち、それは、調節カセットリボスイッチ内に含有されるアプタマーに結合する特異的リガンドの非存在下では「オフ状態」である。アプタマー特異的リガンドが投与された(又は投与なしでも十分な量で存在する)場合のみ、標的遺伝子発現が活性化される。

標的遺伝子を含有するベクター構築物の送達、及び活性化リガンドの送達は一般的に、時間が離れている。活性化リガンドの送達は、標的遺伝子がいつ発現されるか、及びタンパク質発現レベルを制御する。リガンドは、非限定的に、経口、筋内(IM:intramuscular)、静脈内(IV:intravenous)、眼内又は局所を含むいくつかの経路によって送達され得る。

リガンドの送達のタイミングは、標的遺伝子の活性化についての要求に依存する。例えば、標的遺伝子によってコードされる治療用タンパク質が定常的に必要とされる場合、経口小分子リガンドを、毎日又は1日多数回送達して、標的遺伝子の連続的活性化、及びしたがって治療用タンパク質の連続的発現を確実にしてもよい。標的遺伝子が長期作用効果を有する場合、誘導リガンドは、より少ない頻度で投薬され得る。

本発明は、調節ポリヌクレオチドカセットのリボスイッチ内のアプタマーに特異的なリガンドの一時的投薬によって決定される様式で、治療用トランスジーンの発現が一時的に制御されることを可能にする。リガンド投与時のみの治療用トランスジーンの発現の増大は、標的遺伝子がリガンドの非存在下ではオフになることを可能にすることによって、遺伝子療法治療の安全性を増大する。

様々なリガンドが標的遺伝子を活性化することを可能にするために、様々なアプタマーを使用することができる。本発明のある特定の実施形態においては、調節カセットを含有する各治療用遺伝子は、カセット内に特定の小分子によって活性化される特異的アプタマーを有する。このことは、各治療用遺伝子は、その中に収容されているアプタマーに特異的なリガンドによってのみ活性化することができることを意味する。これらの実施形態においては、各リガンドは、1つの治療用遺伝子のみを活性化する。このことは、いくつかの異なる「標的遺伝子」を1つの個体に送達することができ、各々が各標的遺伝子内に収容されている調節カセット内に含有されるアプタマーに特異的なリガンドの送達に際して活性化される可能性が得られる。

本発明は、任意の治療用タンパク質(例えばエリスロポエチン(EPO)又は治療用抗体)が、その遺伝子が身体に送達され得ると、活性化リガンドが送達された場合に身体によって生成されることを可能にする。この治療用タンパク質送達方法は、体外でそのような治療用タンパク質、例えばがんにおいて使用されるか、又は炎症性疾患若しくは自己免疫疾患を遮断するための抗体を製造し、その後それを注射又は点滴することを置換し得る。調節される標的遺伝子を含有する身体は、遺伝子特異的リガンドが投与された場合にオンになる、生物製剤製造工場になる。

治療用タンパク質の投薬の投薬レベル及びタイミングは、治療効果にとって重要であり得る。例えば、がんのためのAVASTIN(抗VEGF抗体)の送達において。本発明は、治療用タンパク質レベル及び効果についてのモニタリングに応答して投薬の容易さを増大する。

一実施形態においては、標的遺伝子は、特定のDNA配列をターゲティングし、編集し得るヌクレアーゼをコードし得る。そのようなヌクレアーゼとして、Cas9、ヌクレアーゼを含有する亜鉛フィンガー又はTALENが挙げられる。これらのヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼタンパク質は、その標的内因性遺伝子を編集するのに十分な短期間の間のみ必要とされ得る。しかしながら、非調節ヌクレアーゼ遺伝子が身体に送達された場合、このタンパク質は、細胞の残りの寿命の間存在し得る。ヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼが存在するのが長ければ長いほど、オフターゲット編集のリスクが増大する。そのようなタンパク質の発現の調節は、顕著な安全性利益を有する。この場合、調節カセットを含有するヌクレアーゼ遺伝子を含有するベクターを、体内の適切な細胞に送達することができる。ヌクレアーゼ遺伝子は、カセット特異的リガンドの非存在下では「オフ」状態であり、そのため、ヌクレアーゼは生成しない。活性化リガンドが投与された場合のみ、ヌクレアーゼが生成する。十分な編集が起こることを可能にするのに十分な時間が経過したとき、リガンドを回収し、再び投与しない。このようにして、ヌクレアーゼ遺伝子は、その後「オフ」状態になり、更なるヌクレアーゼは生成せず、編集は停止する。このアプローチは、いくつかの遺伝性網膜症、例えばCEP290における変異によって引き起こされるLCA10、及びABCA4における変異によって引き起こされるシュタルガルト病を含む、遺伝子状態を修正するために使用され得る。

特異的リガンド投与に際してのみ活性化される治療用タンパク質をコードする調節される標的遺伝子の投与は、治療用遺伝子を調節して、多くの様々な種類の疾患を治療するために使用してもよく、例えば治療用抗体でのがん、免疫調節タンパク質若しくは抗体での免疫障害、調節される遺伝子としての抗C5抗体若しくは抗体断片での代謝疾患、PNH等の奇病、又は治療用抗体での眼球血管新生、及び免疫調節タンパク質での乾燥AMDがある。

多種多様な特異的疾患及び状態の治療を可能にする、多種多様な特異的標的遺伝子は、本発明における使用のために好適である。例えば、インスリン又はインスリンアナログ(好ましくはヒトインスリン又はヒトインスリンのアナログ)は、I型糖尿病、II型糖尿病又は代謝症候群を治療するための標的遺伝子として使用してもよく;ヒト成長ホルモンは、成長障害を有する小児又は成長ホルモンが不足している成人を治療するための標的遺伝子として使用してもよく;エリスロポエチン(好ましくはヒトエリスロポエチン)は、慢性腎疾患のための貧血、骨髄形成異常症のための貧血又はがん化学療法のための貧血を治療するための標的遺伝子として使用してもよい。

本発明は、単一の遺伝子欠損によって引き起こされる疾患、例えば嚢胞性線維症、血友病、筋ジストロフィー、地中海貧血症又は鎌状赤血球貧血症を治療するためにとりわけ好適であり得る。したがって、ヒトβ-、γ-、δ-又はζ-グロブリンは、β-地中海貧血症又は鎌状赤血球貧血症を治療するための標的遺伝子として使用してもよく;ヒト第VIII因子又は第IX因子は、血友病A又は血友病Bを治療するための標的遺伝子として使用してもよい。

本発明において使用されるリガンドは一般的に、1つ又は複数の薬学的に許容される担体と組み合わせて、患者への投与に好適な医薬組成物を形成する。薬学的に許容される担体として、医薬分野で一般的に使用される溶媒、結合剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等が挙げられる。医薬組成物は、錠剤、ピル、カプセル、トローチ等の形態であってもよく、それらの意図される投与経路と適合するように配合される。投与経路の例として、非経口、例えば静脈内、皮内、鼻内、皮下、経口、吸入、経皮(局所)、経粘膜及び直腸が挙げられる。

リガンドを含む医薬組成物は、標的遺伝子を望ましく調節するのに十分なリガンドの量が患者に送達されるような投薬スケジュールで患者に投与される。リガンドが小分子であり、投与形態が錠剤、カプセル等である場合、好ましくは、医薬組成物は、0.1mg～10gのリガンド;0.5mg～5gのリガンド;1mg～1gのリガンド;2mg～750mgのリガンド;5mg～500mgのリガンド;又は10mg～250mgのリガンドを含む。

医薬組成物は、1日当たり1回又は1日当たり多数回(例えば1日当たり2、3、4、5回又はそれよりも多く)投薬してもよい。或いは、医薬組成物は、1日当たり1回よりも少ない頻度で、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13若しくは14日毎に1回、又は1カ月に1回若しくは数カ月毎に1回投薬してもよい。本発明の一部の実施形態においては、医薬組成物は、少数回のみ、例えば1、2、3回等、患者に投与してもよい。

本発明は、標的遺伝子によってコードされる治療用タンパク質の発現の増大の必要のある患者を治療する方法であって、アプタマーのためのリガンドを含む医薬組成物を患者に投与する工程であって、患者が、以前に標的遺伝子を含む組換えDNAを投与されており、標的遺伝子が、(アプタマーを含有する)リボスイッチがアプタマーリガンドに応答してRNase P基質のRNase P切断を変調する本発明の遺伝子調節カセットを含有する、工程を含む方法を提供する。

製造物品及びキット
また、本明細書において説明する方法における使用のためのキット又は製造物品が提供される。態様においては、キットは、好適な包装中に(例えば遺伝子調節カセットを含有する標的遺伝子を含むベクターの送達のための組成物について)本明細書において説明する組成物を含む。本明細書において説明する(眼科注射用組成物等の)組成物に好適な包装は、本分野において公知であり、例えばバイアル(例えば密閉バイアル)、容器、アンプル、瓶、ジャー、フレキシブルな包装(例えば密閉マイラ又はプラスチック袋)等を含む。これらの製造物品は、更に滅菌及び/又は密閉してもよい。

また、本発明は、本明細書において説明する組成物を含むキットを提供し、本明細書において説明する使用等の組成物を使用する方法についての教示を更に含み得る。本明細書において説明するキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び例えば本明細書において説明する任意の方法を含む投与を行うための教示を有する包装インサートを含む、商業的観点及びユーザーの立場から望ましい他の材料を更に含んでもよい。例えば、一部の実施形態においては、キットは、本発明の遺伝子調節カセットを含む標的遺伝子の発現のためのrAAV、注射に好適な薬学的に許容される担体、並びに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び注射を行うための教示を有する包装インサートのうちの1つ又は複数を含む。一部の実施形態においては、キットは、眼内注射、筋内注射、静脈内注射等に好適である。

「ホモロジー」及び「相同の」は、本明細書において使用するとき、2つのポリヌクレオチド配列間又は2つのポリペプチド配列間の同一性の百分率を指す。1つの配列の別の配列に対する対応は、本分野において公知の技術によって決定することができる。例えば、ホモロジーは、配列情報を整列し、容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することによる、2つのポリペプチド分子の直接比較によって決定することができる。2つのポリヌクレオチド又は2つのポリペプチド配列は、適切な挿入又は欠失を伴って最適に整列した後、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%のヌクレオチド又はアミノ酸がそれぞれ、上記の方法を使用して決定される通り、定義された分子の長さにわたり適合する場合、互いに「実質的に相同」である。

参照ポリペプチド又は核酸配列についての「配列同一性パーセント」は、配列を整列し、必要に応じてギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド又は核酸配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一の、候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドの割合として定義される。アミノ酸又は核酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当業者に公知の方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR社)ソフトウェアを含む公に入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して達成することができる。

「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、本明細書において使用するとき、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖若しくは多数鎖DNA若しくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、若しくはプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、又は他の天然ヌクレオチド塩基、化学若しくは生化学修飾ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基若しくは誘導ヌクレオチド塩基を含むが、これらに限定されない。

「異種の」又は「外因性の」は、あるものが比較されるか、又はそれが導入されるか、若しくは組み込まれる実体の残りのそれとは遺伝子型として別個の実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞種に導入されたポリヌクレオチドは、異種のポリヌクレオチドである(そして、発現すると、異種のポリペプチドをコードし得る)。同様に、ウイルスベクターに組み込まれた細胞配列(例えば遺伝子又はその部分)は、ベクターについて異種のヌクレオチド配列である。

本明細書において開示する本発明の原理における変形は、当業者によって行うことができると理解及び予測されるべきであり、そのような改変は本発明の範囲内に含まれるべきであると意図される。以下の実施例は、本発明を更に例示するが、いかなるようにも本発明の範囲を限定するとは解釈されるべきではない。本明細書において引用するすべての参考文献は、それら全体を参照により本明細書に組み込む。

(実施例1)
3'UTR又は5'UTRにおけるtRNA様構造(mascRNA)の挿入はmRNAの切断及びタンパク質発現の低減をもたらす。
実験手技:
プラスミド構築物:マウスmascRNA配列及び各末端に制限酵素部位を含有するDNA断片を合成し(IDT社)、消化し、CMVエンハンサー/プロモーター及びヒトベータ-グロブリンポリアデニル化配列を含有するプラスミド骨格Con8にクローニングした。すべての構築物を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。

ノザンブロット分析:ヒト及びマウスmascRNAの両方を検出する配列tggaaaccaggagtgcca(配列番号19)を含有するロックド核酸(LNA:Locked Nucleic Acid)-修飾オリゴヌクレオチドを設計し、Exiqon社によって合成し、DIG Oligonucleotide Tailing Kit(Roche社)を使用してジゴキシゲニンで標識した。公開されているプロトコール(Kim, S. W.ら A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38、e98(2010))に従って、非放射性ノザンブロットを行った。

フローサイトメトリー分析:1.5×10⁵個のHeLa細胞を、トランスフェクション前日に24ウェルプレートに播種した。Lipofectamine 2000を使用して製造業者の教示に従って、細胞に0.2μgのプラスミドDNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞をトリプシン処理し、細胞懸濁液を、Guava EasyCyte 8HT機を使用するGFP蛍光強度についてのフローサイトメトリー分析に供した。得たデータを、GuavaSoft2.2.2を使用して分析した。

培養細胞のホタルルシフェラーゼアッセイ:3.5×10⁴個のHEK293細胞を、トランスフェクション前日に96ウェル平底プレートに播種した。プラスミドDNA(500ng)を、管又は96ウェルU底プレートに添加した。別々に、TransIT-293試薬(Mirus社;1.4μL)を50μLのopti-mem I培地(Life Technologies社)に添加し、室温(「RT(room temperature)」)で5分間静置した。その後、50μLのこの希釈したトランスフェクション試薬をDNAに添加し、混合し、RTで20分間インキュベートした。最後に、7μLのこの溶液を、96ウェルプレート中の細胞のウェルに添加した。トランスフェクションの4時間後、トランスフェクション溶液を含有する培地を、新しい培地で置換した。培地交換の24時間後、プレートをインキュベーターから除去し、ラボの作業台上でRTまで数分間平衡化し、その後吸引した。Glo-溶解緩衝液(Promega社、100μL、RT)を添加し、プレートをRTで少なくとも5分間置いた。その後、ウェル内容物を50μLの摩砕剤によって混合し、20μLの各試料を、glo-溶解緩衝液中で10%に希釈した20μLのbright-glo試薬(Promega社)と混合した。96ウェルを、不透明白色384ウェルプレート上に間隔をあけて配置した。RTでの5分のインキュベーション後、Tecan機を使用して500ミリ秒の読取り時間により発光を測定した。ルシフェラーゼ活性を、任意の光ユニット(ALU:arbitrary light unit)平均値±S.D.として表した。

結果:
RNase Pは、tRNA前駆体(pre-tRNA)又はtRNA様分子を三次構造により認識し、加水分解反応を触媒して、pre-tRNA中のリーダー配列を切断する(Kirsebom, L. A. RNase P RNA mediated cleavage: substrate recognition and catalysis. Biochimie 89、1183～1194頁(2007))。mRNAにおけるRNase P基質の挿入がmRNA切断及びタンパク質発現の低減をもたらすかどうかを試験するために、マウスmascRNA配列をGFPレポーター遺伝子の3'UTRに導入した。mascRNA(MALAT1-associated small cytoplasmic RNA)は、tRNA様構造であり、長い非コードRNA MALAT1から、mascRNAの5'末端を形成するRNase P切断及び3'末端を形成するRNase Zによる後続の切断によって生成する(Wilusz, J. E.ら、3' end processing of a long nuclear-retained noncoding RNA yields a tRNA-like cytoplasmic RNA. Cell 135、919～932頁(2008))。このtRNA様構造だけでも、12-nt非関連リーダー配列を伴うと、RNase Pを動員してmascRNA産生するのに十分である。

3'UTR中にmascRNAを伴うGFPの切断を、ノザンブロットによってヒト及びマウスmascRNAの両方を検出し得るプローブを使用してモニターした。GFP-mascRNA(センス)をトランスフェクトした細胞から産生した61ntのmascRNAを、ノザンブロットによって特定した。61ntのmascRNAは、逆向きのmascRNA配列を有するGFP-mascRNA(アンチセンス)をトランスフェクトした細胞においては検出されなかった(図2a)。

タンパク質レベルでは、GFP-mascRNA構築物をトランスフェクトした細胞は、GFP対照構築物を有する細胞と比較して、より低い割合のGFP陽性集団を示しただけではなく、GFP発現における平均蛍光強度(MFI)を減少した(図2b、第1及び第2のグラフ)。また、mascRNAをGFPレポーター遺伝子構築物の5'UTRに、並びに5'UTR及び3'UTRの両方に挿入した。GFP対照構築物をトランスフェクトした細胞と比較して、GFPの5'UTRに挿入したmascRNAをトランスフェクトした細胞において、GFP発現は減少した(図2b、第3のグラフ)。mascRNAをGFPレポーター構築物の5'UTR及び3'UTR領域の両方に挿入した場合、GFP発現は更に低減した(図2b、第4のグラフ)。

また、mascRNA配列を、ホタルルシフェラーゼ構築物の3'UTRに挿入した。mascRNAのT-ループにおける3個のヌクレオチドを(UUCからAAGに)変異させることによって、陰性対照(Luci-masc-mlp)を産生した(図2c、左パネルを参照のこと)。それらの3個のヌクレオチドは、tRNA構造のT-ループにおいて高度に保存されており、RNase Pによる効率的な切断に必要である(参照により本明細書に組み込むYuan, Y.及びAltman, S. Substrate recognition by human RNase P: identification of small, model substrates for the enzyme. EMBO J. 14、159～168頁(1995))。図2c(右パネル)において示す通り、3'UTR領域におけるmascRNA配列の挿入(Luci-masc)は、mascRNAを有しないルシフェラーゼ構築物(Luci)と比較して、ルシフェラーゼの発現を81%減少し、3'UTRにおけるmascRNAの挿入がmRNAの切断及びタンパク質発現の低減をもたらしたことを示した。しかしながら、T-ループにおける3つの変異を含有するmascRNAを有するルシフェラーゼ構築物(Luci-mascRNA-mlp)を有する細胞は、Luci対照と比較して、ルシフェラーゼ発現の20%のみの低減を示し、mascRNAのT-ループにおける変異は、RNase P媒介切断を損なうことを示した。

これらの結果は、3'UTR又は5'UTRのいずれかにおけるtRNA様構造、mascRNAの挿入は、標的mRNAのRNase P媒介切断及び後続のタンパク質発現の低減をもたらすことを示す。

(実施例2)
mRNAのmascRNA-RNase P媒介切断を変調することを通して標的遺伝子発現を調節するためのxpt-グアニンアプタマーの使用
実験手技:
プラスミド構築物:mascRNA及びグアニンアプタマー配列(参照により本明細書に組み込むMandal, Mら、Cell 113、577～586頁(2003))を含有するオリゴヌクレオチド断片を合成し(IDT社)、ルシフェラーゼ(Luci)発現構築物(Con8)の3'UTR領域に、互換性のある制限酵素部位BamHI及びXhoIを使用してクローニングした。すべての構築物を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。

培養細胞のホタルルシフェラーゼアッセイ:実施例1において説明する通り、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの4時間後、トランスフェクション溶液を含有する培地を、溶媒対照としての0.5%のDMSO又はアプタマーリガンドとしての500μMのグアノシン(Sigma社)のいずれかを有する培地により置換した。処理の22～24時間後、実施例1において説明する通り、ルシフェラーゼアッセイを行った。

結果:
mRNAのRNase P媒介切断を調節し、それによって標的遺伝子発現を調節するために、アプタマーリガンドの非存在下ではRNase P切断は影響を受けず、それゆえmRNAは切断され、タンパク質は発現されないという仮定に基づいて、mascRNA配列に連結したアプタマー配列を、ルシフェラーゼ発現構築物の3'UTRに挿入した。アプタマーリガンドが使用可能なとき、アプタマー/リガンド結合は、RNA構造のコンフォメーション変化を誘発し、それは次にRNase P切断を損ない、それゆえmRNAはインタクトなままである。

構築物MG1(配列番号1)(図3a)においては、グアニンアプタマーを、mascRNA配列のすぐ下流に挿入し、グアニンアプタマー配列のすぐ後続の7ヌクレオチド配列は、mascRNAの最後の7個のヌクレオチドに相補的である。この配置においては、アプタマー/リガンド結合に際して、mascRNAの最後の7個のヌクレオチドとその相補配列とが一緒になってリボスイッチのエフェクター領域ステムを形成し得ると考えられた。それゆえ、tRNA様構造形成に必要なmascRNAのこの7ヌクレオチド配列は、新しく形成したアプタマー/リガンド構造中に埋め込まれてしまい、したがってRNase P結合及び切断は損なわれ得る。実際に、図3cにおいて示す通り、グアノシンの非存在下では、mascRNAの下流のxpt-Gアプタマーの挿入(MG1)は、Luci対照構築物からのルシフェラーゼ活性の約68%であるルシフェラーゼ活性をもたらした(Luci対照構築物と比較して、ルシフェラーゼ活性の32%低減)。しかしながら、グアノシンの存在下では、ルシフェラーゼ活性は、Luci対照構築物の100%まで回復し、グアノシン処理細胞と溶媒対照処理細胞とを比較した場合、2.1倍のルシフェラーゼ遺伝子発現誘導を生じた。アプタマーリガンドの非存在下での高レベルのルシフェラーゼ活性は、RNase P媒介切断の低い効率を示す。

別の3つの構築物、GM1(配列番号2)、GM2(配列番号3)及びGM3(配列番号4)においては、グアニンアプタマーを、mascRNA配列の上流に挿入した(図3b)。GM1及びGM2構築物において、7ヌクレオチド配列(GM1)又は6ヌクレオチド配列(GM2)及びmascRNAの第1のヌクレオチド(G)並びにそれらの相補配列を、それぞれ、グアニンアプタマー配列の5'及び3'末端に挿入し、リガンド結合に際してアプタマー構造のエフェクター領域ステムを形成する。アプタマーリガンドの非存在下でエフェクター領域ステムが形成されない場合、グアニンアプタマーの3'末端の7又は6ヌクレオチド配列は、一本鎖であり、RNase P切断のためのmascRNAのリーダー配列として働く。アプタマー/リガンド結合に際しては、リーダー配列及びmascRNAのアクセプターステムの第1のヌクレオチドは、アプタマー構造のステムにおいて隔離され、それゆえ一本鎖RNAは、RNase P結合及び後続の切断のために使用可能ではない。図3cにおいて示す通り、グアノシンの非存在下では、GM1構築物をトランスフェクトした細胞は、Con8対照と比較してルシフェラーゼ活性の52%低減を示した。一方で、グアノシン処理の存在下では、細胞は、対照構築物のほぼ100%のルシフェラーゼ活性を産出し、グアノシン処理なしの細胞と比較して、2.9倍の誘導を生じた。構築物GM2をトランスフェクトした細胞は、MG1と同様の基礎レベルのルシフェラーゼ活性を有し、グアノシンの非存在下ではルシフェラーゼ活性の40%低減を生じ、mRNAのRNase P媒介切断の同様の効率を示唆した。しかしながら、誘導されたルシフェラーゼ活性は、MG1より低く、グアノシン処理に際して1.9倍のルシフェラーゼ活性誘導を生じた。対照的に、構築物GM3においては、エフェクター領域ステムとmascRNAのアクセプターステムとの間に5nt配列がある。図3cにおいて示す通り、グアノシン処理に際してルシフェラーゼ発現の増大はなく、RNase P切断は、リガンド結合アプタマー構造によって影響を受けなかったことを示唆する。

これらの結果は、アプタマーリガンドに応答してmRNAのRNase P切断を変調することを通して標的遺伝子発現を調節する、アプタマーに基づくリボスイッチが産生されたことを示す。

(実施例3)
アプタマーステム周辺の局所配列及びアプタマーとtRNA様構造との間の距離はリボスイッチ活性に影響を及ぼす。
結果:
リガンド非結合アプタマー構造は、tRNA様構造に近接して入れた場合、RNase P結合及び切断を妨害し得るかどうかを調べるために実験を行った。アプタマー配列の下流又は上流のいずれかの配列は、エフェクター領域ステム形成を促進し得る。構築物GM1において、4個のヌクレオチド、つまりエフェクター領域の上流にあり、エフェクター領域の下流の配列と塩基対形成する可能性を有し得るCGGCを、AAGAに変異させ、構築物GM4(配列番号5)を産生した。図4aにおいて示す通り、GM4は、GM1より低レベルのルシフェラーゼ活性を発現し、アプタマーリガンドグアニンの非存在下でmRNAのより効率的な切断を示した。GM4の2つのコピーを3'UTRにタンデムに挿入した場合(GM4_2C、配列番号6)、基礎レベル発現は、対照構築物Con8の18%まで更に低減した。グアニン処理の存在下では、ルシフェラーゼ発現は、Con8のルシフェラーゼの51%まで誘導され、グアニン処理なしの試料と比較した場合、3.95倍誘導を生じた。

また、アプタマー構造とtRNA様構造との間の配列距離を改変した。図3cにおいて示す通り、xpt-グアニンアプタマーリボスイッチのエフェクターステムとmascRNAのアクセプターステムとの間に5個のヌクレオチドがある構築物GM3は、グアノシン処理に応答してルシフェラーゼ遺伝子発現を調節せず、リガンドに応答したアプタマー構造のコンフォメーション変化は、tRNA様構造から離れて5個のヌクレオチドを入れた場合、RNase P活性を妨害しないことを示す。エフェクター領域ステムの3'末端とmascRNAのアクセプターステムとの間の間のヌクレオチドの数を、GM4構築物(mascRNAのアクセプターステムの第1のヌクレオチドがリボスイッチのエフェクター領域ステム形成に関わる)から開始して改変した。0、1、2又は3個のヌクレオチドを挿入して、それぞれ、構築物GM5～GM8(配列番号7～10)を産生した。図4bにおいて示す通り、構築物GM5は、グアニンの非存在下でより低レベルのルシフェラーゼ活性を発現し、RNase Pによるより効率的な切断を示す。しかしながら、2つの構造を更に分離しても、RNase P切断は改善しなかった。間に5個のヌクレオチドを有し、調節を有しないGM3とは異なり、GM6、7及び8は、グアニン処理に応答してルシフェラーゼ発現をアップレギュレートする。

同様に、MG1構築物中のアプタマーとRNase P基質との間の距離を、mascRNAのアクセプターステムとエフェクター領域ステムとの間で択一的に共有される(alternatively shared)ヌクレオチドの数をMG1における6個のヌクレオチドから5、4又は3個のヌクレオチドに低減することによって改変し、それぞれ、MG2、3及び4(それぞれ、配列番号11～13)構築物を産生した(一方で、全部で8塩基対のエフェクター領域ステムは保持した)。図4cにおいて示す通り、2つの構造を分離すると、択一的に共有されるヌクレオチドを4個のヌクレオチド(構築物MG3)又は3個のヌクレオチド(構築物MG4)に低減した場合、グアニン処理の非存在下で基礎レベルのルシフェラーゼ発現は中程度減少し、わずかにより効率的なRNase P媒介mRNA切断を示す。グアニン処理の存在下では、ルシフェラーゼ発現は、MG1に匹敵するレベルまで誘導され、構築物MG3及びMG4について約2倍の誘導を生じた。択一的に共有されるヌクレオチドは、2個のヌクレオチド又はそれ未満まで更に低減して、RNase P基質構造とアプタマー構造とを更に分離し、リボスイッチの調節可能性を改善してもよい。

(実施例4)
mRNAのpre-tRNA^Arg-RNase P媒介切断を変調することを通して標的遺伝子発現を調節するためのxpt-グアニンアプタマーの使用。
実験手技:
プラスミド構築:グアニンアプタマーxpt-G及びヒトアルギニンpre-tRNA(Nashimoto M.N.ら Long 5' leaders inhibit removal of a 3' trailer from a precursor tRNA by mammalian tRNA 3' processing endoribonuclease. Nucleic Acids Research, 1999;27(13):2770～2776頁)の配列を含有するDNA断片を合成した(IDT社)。合成したDNA断片を、BamHI及びXhoI制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したCon8構築物にクローニングした。構築物の配列を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。

結果:
遺伝子発現を調節することにおけるアプタマー媒介RNase P切断の適用可能性を更に示すために、ヒトアルギニンtRNA配列(tRNA^Arg)をxpt-グアニンアプタマーに連結した。構築物GM1において、mascRNA配列をヒトアルギニンtRNA配列で置換した。5'エフェクター領域ステム配列を、tRNA^Argリーダー配列の7個のヌクレオチド及びtRNA^Argアクセプターステムの第1のヌクレオチドに相補的になるように設計し、構築物GArg(配列番号14)を産生した。図5において示す通り、グアニンの非存在下で、GArgは、同様のレベルのルシフェラーゼ活性である対照構築物Con8の約50%を発現し、RNase P媒介切断を動員することにおけるmascRNAと同様のtRNA^Argの能力を示す。グアニン処理は、非処理試料と比較した場合、1.6倍のルシフェラーゼ誘導を誘導し、グアニンに応答してGM1構築物よりわずかに効率が下がる。

(実施例5)
mRNAのmascRNA-RNase P媒介切断を変調することを通して標的遺伝子発現を調節するためのテオフィリンアプタマー及びアデニンアプタマーの使用。
実験手技:
プラスミド構築:アデニンアプタマーydhl-A(参照により本明細書に組み込むM. Mandal及びR.R. Breaker、Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator. Nature Structural & Molecular Biology. 2004;11:29～35頁)又はテオフィリンアプタマー(参照により本明細書に組み込むG.R. Zimmermanら Interlocking structural motifs mediate molecular discrimination by a theophylline-binding RNA. Nature Structural Biology. 1997;4:644～649頁)の配列及びmascRNA配列を含有するDNA断片を合成した(IDT社)。合成したDNA断片を、BamHI及びXhoI制限酵素で消化し、同じ制限酵素で消化したCon8にクローニングした。構築物の配列を、DNAシークエンシング(Genewiz社)によって評価した。

培養細胞のトランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ:実施例1において説明する通り。

トランスフェクションの4時間後、培地を吸引し、溶媒としてNaOH(1mM)又は1mMアデニン(Calbiochem社)若しくは3mMテオフィリン(Sigma社)を含む新しい培地を添加した。誘導倍率を、アプタマーリガンドの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、アプタマーリガンドの非存在下で得た値で割った商として表した。

結果:
標的遺伝子発現を制御するための追加のアプタマー/リガンド対の使用を研究した。構築物GM1についての実施例2と同じ戦略を使用して、xpt-グアニンアプタマーを、テオフィリンアプタマー又はydhl-Aアデニンアプタマーのいずれかで置換し、それぞれ、TheoM(配列番号16)及びYM(配列番号15)構築物を産生した。図6aにおいて示す通り、テオフィリン処理の非存在下では、TheoM構築物は、低減したレベルのルシフェラーゼである、対照Con8構築物の約43.4%を発現し、mRNAのRNase P媒介切断を示した。テオフィリン処理の存在下では、対照構築物が、アプタマー非関連機構を通して、ルシフェラーゼ活性の2倍の増大を発現した。しかしながら、TheoM構築物は、ルシフェラーゼ発現の4.1倍増大を生じ、テオフィリン/アプタマー特異的効果を示した。同様に、構築物YMについて、図6bにおいて示す通り、アデニン処理は、対照構築物において、アプタマー非関連機構を通して、ルシフェラーゼ活性を2.2倍増大した。しかしながら、YM構築物は、ルシフェラーゼ発現の3.3倍増大を生じ、アデニン/アプタマー特異的効果を示した。

(実施例6)
標的遺伝子発現のより厳格な調節を得るためのRNase P切断ベースのリボスイッチと第2のリボスイッチとの組合せ使用。
実験手技:
G15若しくはG17リボスイッチカセット又はアプタマーを有しない対照カセットを、以前に開発した(参照により本明細書に組み込むWO2016/126747の実施例5及び8並びに配列番号46及び15を参照のこと)。構築物GM1-G15又はGM1-G17を産生するために、グアニンアプタマー及びmascRNA配列を含有する断片を、GM1構築物からBamHI及びXhoI消化によって放出し、同じ制限酵素で消化したG15又はG17構築物にクローニングした。調節カセットG17_2IR3(参照により本明細書に組み込むWO2016/126747の配列番号31を参照のこと)を、Golden Gateクローニング法を使用してマウスエリスロポエチンcDNAの308位にクローニングして、Epo-G17_2IR3を産生した。グアニンアプタマー及びmascRNA配列を含有する断片を、GM1構築物からBamHI及びXhoI消化によって放出し、同じ制限酵素で消化したEpo-G17_2IR3にクローニングして、構築物Epo-GM1-G17_2IR3を産生した。

マウスエリスロポエチンのELISA:トランスフェクションは、実施例1において説明する通りであった。トランスフェクトしたHEK293細胞を、500μMのグアニンあり又はなしで処理した。トランスフェクトした細胞からの上清を、リガンド処理の20時間後に収集し、ELISAに供した。ELISAを、製造業者の教示(R&D社)に従って行った。

結果:
GM1～8リボスイッチを含有する発現構築物は、実質的なレベルの標的遺伝子の基礎発現を有する。更に、また、以前に開発した選択的スプライシングベースのリボスイッチは、ある程度の基礎発現を有する。これらのスイッチのタンデムの組合せ使用は、基礎発現を制限する可能性があり、それゆえ、標的遺伝子発現のより厳格な調節を生じ得る。

このことを示すために、G15リボスイッチを、tRNA-RNase Pベースのリボスイッチと組み合わせた。G15リボスイッチは、xpt-グアニンアプタマー変調選択的スプライシング機構に基づき、ある程度の基礎レベル発現を有し、それはアプタマーリガンドグアニン処理に応答した誘導倍率を低減する。G15構築物からの基礎レベル発現を低減するために、3'UTRをGM1構築物からの3'UTRで置換し、2つのリボスイッチを含有する構築物GM1-G15を産生した。図7aにおいて示す通り、アプタマーリガンド(グアニン)の非存在下では、GM1-G15のルシフェラーゼの基礎レベル発現は、G15からのルシフェラーゼ活性の約45%まで実質的に低減する。グアニン処理の存在下では、GM1-G15からのルシフェラーゼ活性の誘導されるレベルは、G15の96%であるが、基礎レベル発現の低減のために、誘導倍率はG15より高い(215倍対100倍)。G17が、G15よりもっと低い基礎レベル発現を有する、構築物GM1-G17を産生するために同様の戦略を使用した。図7bにおいて示す通り、G17をGM1と組み合わせると、基礎レベル標的遺伝子発現は更に低減し、グアニン処理に応答して標的遺伝子発現のより高い誘導倍率を生じた。図7cにおいて示す通り、マウスエリスロポエチンタンパク質の発現を調節するためにGM1スイッチをG17_2IR3と組み合わせた場合、同様の結果を得た。

これらの結果は、基礎レベル発現を有する2つのスイッチをタンデムに組み合わせることによって、より厳格なスイッチが産生され得ることを示す。この二重スイッチにおけるアプタマーは、本明細書において示す通り、同じ若しくは異なるリガンドに結合する同じ若しくは異なるアプタマー、又は様々なリガンドに応答するアプタマーであり得る。

Claims

標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチドカセットであって、前記ポリヌクレオチドカセットが、RNase P基質配列をコードし、前記RNase P基質配列が、リボスイッチに連結した、リーダー配列及びアクセプターステムを含むtRNA様構造を有し、前記リボスイッチが、アプタマー配列に連結したエフェクター領域を含み、前記エフェクター領域が、前記RNase P基質配列の一部に相補的な配列を含み、前記アプタマーがそのリガンドに結合していない場合、前記エフェクター領域は、ステムを形成せず、前記RNase P基質配列へのアクセスを提供し、それによって、RNase Pによる切断をもたらし；前記アプタマーがそのリガンドに結合した場合、前記エフェクター領域は、前記RNase P基質配列の一部を含むステムを形成し、それによって、RNase Pによる前記基質配列の切断を防止する、ポリヌクレオチドカセット。
前記アプタマーが、小分子リガンドに結合する、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
前記RNase P基質配列が、RNase P切断を開始し得るtRNA、mascRNA、MENベータtRNA様構造、ウイルスtRNA様構造、RNase Pモデル基質をコードする配列及び相同配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
エフェクター領域ステムが、6～12個の塩基対である、請求項1に記載のポリヌクレオチドカセット。
前記アプタマー配列が、前記RNase P基質配列に対して5'に位置し、前記エフェクター領域が、前記RNase P基質のリーダー配列に相補的な配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
前記RNase P基質のアクセプターステムとリボスイッチエフェクター領域とが、0、1、2、3又は4個のヌクレオチドによって隔てられている、請求項5に記載のポリヌクレオチドカセット。
前記エフェクター領域が、前記RNase P基質のアクセプターステム配列に相補的な配列を更に含む、請求項5に記載のポリヌクレオチドカセット。
前記アプタマー配列が、前記RNase P基質配列に対して3'に位置し、前記エフェクター領域が、前記RNase P基質配列の3'アクセプターステムに相補的な配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
前記RNase P基質の3'アクセプターステムに相補的なエフェクター領域配列が、1～7個のヌクレオチドである、請求項8に記載のポリヌクレオチドカセット。
標的遺伝子の発現を変調する方法であって、
a.請求項1から4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットを、前記標的遺伝子の非翻訳領域(UTR)に挿入する工程と、
b.前記ポリヌクレオチドカセットを含む前記標的遺伝子を、ex vivo又はin vitroで細胞に導入する工程と、
c.前記細胞を、前記標的遺伝子の発現を増大するのに有効な量の前記アプタマーに特異的に結合する小分子リガンドに曝露する工程と
を含む、方法。
前記ポリヌクレオチドカセットのアプタマー配列が、前記RNase P基質配列に対して5'に位置し、前記エフェクター領域が、前記RNase P基質のリーダー配列に相補的な配列を含む、請求項10に記載の方法。
前記RNase P基質のアクセプターステムとリボスイッチエフェクター領域とが、0、1、2、3又は4個のヌクレオチドによって隔てられている、請求項11に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドカセットのアプタマー配列が、前記RNase P基質配列に対して3'に位置し、前記エフェクター領域が、前記RNase P基質配列の3'アクセプターステムに相補的な配列を含む、請求項10に記載の方法。
前記RNase P基質の3'アクセプターステムに相補的なエフェクター領域配列が、1～7個のヌクレオチドである、請求項13に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドカセットが、前記標的遺伝子の5'非翻訳領域に挿入される、請求項10に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドカセットが、前記標的遺伝子の3'非翻訳領域に挿入される、請求項10に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドカセットのうちの2つ又はそれよりも多くが、前記標的遺伝子に挿入される、請求項10に記載の方法。
前記2つ又はそれよりも多いポリヌクレオチドカセットが、異なる小分子リガンドに特異的に結合する異なるアプタマーを含む、請求項17に記載の方法。
前記2つ又はそれよりも多いポリヌクレオチドカセットが、同じアプタマーを含む、請求項17に記載の方法。
前記標的遺伝子が、選択的スプライシングのアプタマー媒介調節によって標的遺伝子発現を変調する遺伝子調節カセットを更に含む、請求項10に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドカセットを含む前記標的遺伝子が、前記標的遺伝子の発現のためのベクターに組み込まれる、請求項10に記載の方法。
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項21に記載の方法。
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
請求項1から9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットを含有する標的遺伝子を含むベクター。
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項24に記載のベクター。
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項25に記載のベクター。
前記標的遺伝子が、選択的スプライシングのアプタマー媒介調節によって標的遺伝子発現を変調する遺伝子調節カセットを更に含む、請求項24に記載のベクター。