IT202100021779A1 - Piastrine trasfettate con sirna e loro usi terapeutici - Google Patents
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- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
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-
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo: ?PIASTRINE TRASFETTATE CON SIRNA E LORO USI TERAPEUTICI?
La presente invenzione si riferisce a piastrine ingegnerizzate in modo da includere un siRNA progettato per bloccare l?mRNA di KRAS, un gene coinvolto nella cancerogenesi.
In particolare, l?invenzione rende disponibile una composizione terapeutica comprendente piastrine ematiche trasfettate con siRNA diretto contro una forma mutante dell?oncoproteina KRAS. Un ulteriore aspetto dell?invenzione riguarda l?uso della composizione terapeutica per il trattamento del tumore e in particolare dell?adenocarcinoma pancreatico.
Sfondo dell?invenzione
L'oncoproteina KRAS ? una GTPasi con funzione di mediatore essenziale delle vie di segnalazione intracellulari coinvolte nella crescita e sopravvivenza delle cellule tumorali. Nelle cellule normali, KRAS funziona come un interruttore molecolare, alternando uno stato inattivo legato al GDP e uno stato attivo legato al GTP. La transizione tra questi stati ? facilitata dall'idrolisi del GTP catalizzata dal fattore di scambio dei nucleotidi guanina (GEF), che carica il GTP e attiva KRAS, e dalla proteina attivante la GTPasi (GAP), che inattiva KRAS. Il legame di GTP a KRAS promuove il legame di effettori che attivano percorsi di segnalazione intracellulare tra cui RAF-MEK-ERK (MAPK). Le mutazioni del gene KRAS sono comuni nel cancro del pancreas, nell'adenocarcinoma polmonare, nel cancro del colon-retto, nel cancro della colecisti, nel cancro della tiroide e nel cancro del dotto biliare. Mutazioni di KRAS sono state osservate in circa il 94.1% dei tumori del pancreas e la mutazione di KRASG12D ? la pi? frequente con una incidenza del 41%. ? stato chiaramente dimostrato che le mutazioni nella GTPasi KRAS si trovano comunemente nei pazienti con adenocarcinoma duttale del pancreas (PDAC) e si pensa che queste mutazioni siano coinvolte nella fase iniziale di oncogenesi, nella progressione del tumore e nell?insorgenza delle metastasi. Le mutazioni di KRAS nei residui G12, G13 e Q61 sono le mutazioni pi? comuni riscontrate nelle neoplasie solide. Le mutazioni somatiche attivanti KRAS sono una caratteristica distintiva di alcuni tipi di cancro e interferiscono con l'associazione al GAP, stabilizzando cos? il legame con gli effettori e incrementando di conseguenza la via di segnalazione di KRAS. I pazienti con tumori che presentano mutazioni di KRAS hanno esiti e prognosi significativamente peggiori. Per altri tipi di tumore esistono inibitori di varie proteine della via intracellulare di segnalazione MAPK (ad es. MEK, BRAF, EGFR) approvati per l?uso clinico, ma ad oggi non esistono invece molecole selettive per i tumori KRAS mutati per l?uso clinico. Alcune terapie mirate alla via MAPK si sono mostrate clinicamente inefficaci nel trattamento dei tumori con mutazione di KRAS. Inoltre, una terapia non selettivamente indirizzata alle forme mutate delle proteine specifiche del tumore pu? causare tossicit? sistemica per via dell'inibizione del segnale indotto da MAPK nelle cellule normali.
Pertanto, esiste la necessit? di sviluppare terapie dirette selettivamente contro il tumore che riducano al minimo o escludano la distribuzione del farmaco nelle cellule sane.
La mutazione KRASG12D ? prevalente nell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), un tumore caratterizzato da una mortalit? elevata. I pazienti PDAC con tumori KRASG12D hanno prognosi particolarmente nefasta rispetto a quelli con altre mutazioni di KRAS. Pertanto, per migliorare la sopravvivenza dei pazienti con PDAC ? importante sviluppare una nuova strategia terapeutica diretta contro KRASG12D, che abbia maggiore efficacia e sicurezza.
I micro RNA, ed i loro corrispettivi sintetici siRNA, sono piccoli RNA a doppio filamento non codificanti che svolgono un importante ruolo di regolazione dell?espressione genica a livello post-trascrizionale mediante soppressione della traduzione o induzione della degradazione di specifici mRNA.
L?utilizzo di siRNA in terapia necessita di metodi efficienti per la loro veicolazione nel circolo sanguigno poich? altrimenti verrebbero rapidamente degradati e inattivati da enzimi plasmatici.
A questo scopo sono stati sviluppati metodi che utilizzano come veicolo batteri, virus, vescicole sintetiche artificiali (micelle, microsomi, ecc) e cellule umane (eritrociti, macrofagi, linfociti e cellule staminali).
Il trasporto efficace di RNAi agli organi parenchimali non epatici, in particolare al pancreas, rimane una sfida. Sebbene liposomi e nanoparticelle possano offrire vantaggi per il rilascio di RNAi rispetto ai sistemi virali, essi mostrano una bassa efficienza e una rapida eliminazione dalla circolazione.
Gli approcci basati sull'interferenza dell'RNA (RNAi) per colpire KRAS wild-type, o effettori a valle dell?enzima, e che utilizzano nanoparticelle come vettori hanno mostrato un chiaro effetto per il trattamento del tumore del polmone e in alcuni modelli di cancro del colon-retto.
Il targeting di KRAS per il trattamento dell?adenocarcinoma del pancreas ? stato invece finora limitato alla somministrazione di inibitori tramite elettroporazione diretta o impianti biopolimerici in modelli di xenotrapianto di cancro al pancreas.
Stato dell?arte
L?utilizzo delle piastrine umane per il rilascio di siRNA ? descritto nella domanda internazionale WO2014/118817, a nome dello stesso richiedente. In essa sono riportate alcune sequenze di siRNA dirette contro mutazioni dell?oncogene KRAS, ma non contro la mutazione G12D. In particolare non ? descritto n? suggerito l?uso di piastrine caricate con siRNA contro KRASG12D per il trattamento dell?adenocarcinoma pancreatico.
Le pubblicazioni brevettuali WO2017/127473 e US2015/0307885 descrivono l?inibizione dell?espressione di mutanti di KRAS attraverso l?interferenza di RNA e sequenze di dsRNA utili allo scopo.
WO2010/001325 descrive un sistema polimerico idoneo a veicolare agenti terapeutici, inclusi siRNA.
Descrizione dell?invenzione
Si ? ora trovato che piastrine ematiche trasfettate con un siRNA specifico per il mutante KRAS G12D, o microparticelle da esse derivate, sono in grado di inibire efficacemente la crescita tumorale di cancro del pancreas in vivo in un modello murino.
Pertanto, un primo aspetto dell?invenzione riguarda una composizione terapeutica comprendente piastrine trasfettate con un siRNA in grado di inibire l?mRNA di KRAS recante la mutazione G12D (KRASG12D), o microparticelle piastriniche da esse derivate.
In una realizzazione preferita, la sequenza del filamento antisenso di siRNA ? complementare a una sequenza di mRNA di KRASG12D contenente il codone mutato.
La molecola di siRNA pu? contenere da 15 a 30, preferibilmente 21 paia di basi.
In una realizzazione particolarmente preferita, la molecola di siRNA comprende un filamento senso e un filamento antisenso, dove:
(i) il filamento senso comprende o consiste della sequenza 5?-GUUGGAGCUGAUGGCGUAGTT-3? (SEQ ID NO:1), e
(ii) il filamento antisenso comprende o consiste della sequenza
5?-CUACGCCAUCAGCUCCAACTT-3? (SEQ ID NO:2).
La sequenza del siRNA trasfettato nelle piastrine riconosce la sostituzione nucleotidica G?A nella sequenza del gene KRAS mutato (KRASG12D) e include la sporgenza (?overhang?) TT al 3? per promuovere l'efficienza del silenziamento. La posizione centrale del nucleotide mutato aumenta la specificit? del siRNA, prevenendo cos? il silenziamento del gene wild-type KRAS e dei geni recanti altri tipi di mutazione quali KRAS G12C, KRAS G12N e KRAS G12V.
La trasfezione delle piastrine con siRNA viene effettuata secondo il metodo descritto in EP2951292 (WO2014/118817), a nome dello stesso richiedente. In breve, le piastrine isolate da sangue periferico sono poste in contatto con siRNA in un mezzo contenente alcol etilico e una poliammina scelta tra polietilenimmina e polilisina. Per ottenere le microparticelle, dopo trasfezione le piastrine vengono attivate con opportuni agenti stimolanti, per esempio mediante aggiunta di trombina in presenza di sali di calcio, come descritto in EP2951292.
Le piastrine ingegnerizzate con siRNA diretto contro KRASG12D preparate secondo la presente invenzione si sono dimostrate capaci di ridurre la massa tumorale in modelli animali di tumore esprimente KRASG12D.
Un ulteriore aspetto dell?invenzione riguarda pertanto l?uso delle piastrine trasfettate con un siRNA inibente l?mRNA di KRASG12D, o di microparticelle da esse derivate, nel trattamento di tumori esprimenti il mutante KRASG12D.
Preferibilmente, le piastrine trasfettate con siRNA sono utilizzate per il trattamento dell?adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), verso il quale si sono dimostrate particolarmente efficaci nei test condotti nel modello animale.
La pratica, utilizzata in medicina trasfusionale, di separare da un donatore le piastrine e il plasma reinfondendo nel donatore la restante parte del sangue separato (parte corpuscolata) direttamente nello stesso ciclo di trasfusione (piastrino-plasmaferesi), permette di prelevare le piastrine, trasfettarle, rispospenderle nel plasma e reinfonderle. Inolte, i tempi brevi necessari per la trasfezione delle piastrine permettono di reinfondere per via endovenosa le piastrine trasfettate nello stesso soggetto da cui sono state prelevate nel corso di un'unica seduta, eliminando cos? il rischio di alloimmunizzazione e di rigetto delle piastrine trasfettate.
Pertanto, in una modalit? di realizzazione preferita, il trattamento terapeutico secondo la presente invenzione prevede il prelievo delle piastrine dal paziente affetto da tumore o da un donatore sano, la loro trasfezione con siRNA ed eventuale attivazione, e la reintroduzione nel paziente delle piastrine trasfettate o delle microparticelle da esse derivate.
Usando un modello animale di PDAC sono stati determinati il dosaggio, la via e la frequenza di somministrazione delle piastrine trasfettate con siRNA KRASG12D in grado di ridurre la crescita del tumore.
Oltre alla via di somministrazione endovenosa, utilizzata nelle prove sperimentali in vivo, per l?uso clinico nell?uomo si possono utilizzare la via intramuscolare, intradermica, sottocutanea e/o la somministrazione in situ.
Nelle prove in vivo la frequenza di somministrazione era di 6 somministrazioni complessive nell?arco di 14 giorni ma per le applicazioni cliniche si possono prevedere da una fino a sei somministrazioni.
Il dosaggio utilizzato nel modello animale era di circa 45.000.000 di piastrine per somministrazione. Il dosaggio nell?uomo pu? essere aumentato fino a 5x10<11 >piastrine, pertanto l?intervallo di dosaggio per le applicazioni cliniche ? preferibilmente compreso tra 45x10<6 >e 5x10<11 >piastrine trasfettate.
L?invenzione ? ulteriormente illustrata negli esempi seguenti e nelle figure allegate.
Descrizione delle Figure
Figura 1 ? efficienza di inibizione di KRAS G12D da parte di piastrine trasfettate con siRNA diretto contro KRAS G12D in cellule PANC-1.
Piastrine trasfettate con siRNA KRASG12D co-incubate in vitro con linea cellulare di adenocarcinoma del pancreas PANC-1 per 24 ore e per 48 ore riducono specificamente l'espressione di mRNA KRASG12D nella cellula. I dati sono riportati come livelli di riduzione di KRASG12D nelle cellule PANC-1 rispetto alla cellula PANC-1 non trattate; n = 3 esperimenti indipendenti.
Plts-NC: piastrine trasfettate con siRNA Scrambled Negative Control DsiRNA (IDT, Inc.). Plts-KRAS: piastrine trasfettate con siRNA KRASG12D.
Figura 2 - massa tumorale in vivo - trattamento precoce.
Analisi effettuate dopo il sacrificio animale; n = 6 topi per gruppo. Gruppo di controllo: piastrine umane trasfettate con siRNA siRNA Scrambled Negative Control DsiRNA (IDT, Inc.). Gruppo K-ras: piastrine umane trasfettate con siRNA KRASG12D. A. Immagini di ciascun tumore espiantato. B. Volume del tumore C. Peso del tumore.
Figura 3 - farmacodinamica
A. Percentuale di piastrine umane nella popolazione piastrinica totale durante il trattamento; n=6 topi per gruppo. B. Variazione della percentuale del peso corporeo del topo durante il trattamento (end point); n=6 topi per gruppo.
Parte sperimentale
Materiali e metodi
Preparazione delle piastrine umane con siRNA KRASG12D
Sangue periferico venoso viene prelevato e raccolto in provette contenenti un anticoagulante.
1. Il prelievo viene centrifugato a 120 g per 10 minuti per ottenere PRP (Plasma Ricco di Piastrine).
2. Si procede all'isolamento delle piastrine del plasma tramite metodi comuni (lavaggio piastrinico o gel-filtrazione).
3. Le piastrine, cos? isolate, vengono risospese in RPMI 1640 addizionato con antibiotici (100 U di Penicillina e 100 U di Streptomicina) oppure nel plasma stesso del donatore ad una concentrazione compresa tra le 2x10<5 >e 1x10<6 >per microlitro, senza superare il limite inferiore di concentrazione di 130.000 piastrine/microlitro e aliquote da un millilitro vengono trasferite nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e messe in incubazione a 37?C in atmosfera controllata di CO2 al 5%.
4. Di seguito viene preparato il medium di trasfezione, inserendo in una provetta 32,4 microlitri di alcool etilico assoluto, 32 microlitri di una poliammina a scelta tra polilisina e polietilenimmina e 168 microlitri di RPMI 1640 cos? da raggiungere, in entrambi i casi, la quantit? totale di 200 microlitri.
5. Dopo 5 minuti di attesa viene aggiunto alla suddetta miscela il siRNA KRASG12D alla concentrazione di 200 nM e dopo 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente la soluzione viene trasferita nel pozzetto dove precedentemente era stato posto 1 ml di sospensione piastrinica.
6. Dopo 5 minuti di incubazione a 37?C, viene interrotta la trasfezione per centrifugazione delle piastrine (a 3000 g per 10 minuti in presenza di PGI2 0,2 microM e, di seguito, risospendendole in 3 ml di terreno di coltura RPMI 1640).
RealTime PCR
Le cellule sono state incubate con piastrine umane per diversi tempi, dopodich? l'RNA ? stato retrotrascritto con iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR (Bio-rad Laboratories) dopo purificazione totale dell'RNA con Trizol (Invitrogen), secondo le indicazioni del produttore. Le analisi Quantitative PCR (qPCR) sono state eseguite con lo strumento AriaDX Real Time PCR System (Agilent) utilizzando SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). I trascritti di interesse sono stati normalizzati ai livelli di trascrizione del RNA 18S. Ogni reazione includeva tre repliche tecniche, di cui ? stata calcolata la media per definire una replica biologica. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte in giorni distinti e ogni esperimento ha definito una replica biologica. Sono state eseguite analisi statistiche su ?Ct di replicati biologici e i risultati sono stati espressi come variazione di incremento relativo. Le sequenze dei primer erano le seguenti:
KRASG12D umano: forward 5' -ACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA-3' (SEQ ID NO:3), reverse 5' -TTGGATCATATTCGTCCACAA-3' (SEQ ID NO:4).
18S: forward 5? -GCTTAATTTGACTCAACACGGGA-3? (SEQ ID NO:5), reverse 5? -AGCTATCAATCTGTCAATCCTGT-3? (SEQ ID NO:6).
Modello animale di adenocarcinoma del pancreas
Topi maschi NSG Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ (Charles Rivers) tra le 4 e le 6 settimane di et? sono stati alloggiati in gabbie ventilate con un ciclo di 12 ore di luce: 12 ore di buio a 21-23?C e 40-60% di umidit?. I topi hanno avuto libero accesso a una dieta e ad acqua sterilizzata. In anestesia generale, PANC-1 (10<6 >cellule in 10 ?l di PBS) sono state iniettate per via sottocutanea usando una siringa da 27 gauge.
Per le analisi della massa tumorale, ? stata utilizzata la versione 4.4 di Living Image (Caliper Life Sciences) per quantificare il volume di tutti i tumori. Le condizioni di esposizione (tempo, apertura, posizione del palco e binning) sono state mantenute identiche per tutte le misurazioni all'interno di ciascun esperimento. La massa tumorale ? stata misurata con una bilancia elettronica (BL 224 Touch).
Il sangue dei topi ? stato isolato usando eparina con prelievo caudale. Il sangue (10 ?l per topo) ? stato quindi diluito in 100 ?l di PBS. Successivamente, i campioni sono stati incubati con anticorpi Human CD41-FITC (BD Biosciences) e relativi controlli e analizzati mediante analisi con citofluorimetro Cytoflex (Beckman Coulter). Tutti i campioni di controllo sono stati analizzati insieme ai campioni sperimentali.
Risultati
Le piastrine caricate con siRNA diretto contro KRAS G12D sono state mantenute in contatto con cellule PANC-1 per 24 e 48 ore e sono stati valutati i livelli di espressione dell'mRNA di KRASG12D nelle cellule PANC-1 umane tramite qPCR (Figura 1).
E? stata poi effettuata una prima serie di analisi di esperimenti riguardanti i dati di efficacia in vivo su un modello murino di crescita del tumore del cancro del pancreas con KRAS mutato.
Le piastrine trasfettate con siRNA KRAS G12D rispetto alle piastrine trasfettate con un siRNA disegnato per non riconoscere nessun target (siRNA NC) hanno inibito la crescita del tumore in vivo.
Sono stati trattati topi NSG (NOD scid gamma mouse) con piastrine umane il giorno 7 (inizio del trattamento precoce) dopo l'iniezione sottocutanea di 1x10<6 >cellule umane PANC-1 (linea cellulare di PDAC).
45x10<6 >piastrine umane sono state iniettate per via endovenosa e sono state somministrate un totale di 6 iniezioni a partire dal giorno 7 al giorno 21 in ciascun topo ogni 2-3 giorni. Le piastrine umane sono state isolate da 6 diversi donatori sani.
La massa tumorale ? stata quantificata in seguito al sacrificio di animali al termine dello studio. Durante l'esperimento sono stati costantemente monitorati la conta piastrinica umana nel sangue di topo e il peso dell'animale.
Si ? osservata una riduzione della massa tumorale nei topi infusi con piastrine trasfettate con un siRNA contro KRAS G12D rispetto alle piastrine trasfettate con un siRNA NC, come mostrato dalla diminuzione statisticamente significativa del volume e della massa tumorale illustrati in Figura 2.
Inoltre, non sono state osservate variazioni significative nel numero delle piastrine umane circolanti nel sangue dei topi (misurate come percentuale di piastrine umane/numero totale di piastrine nel sangue di topo), suggerendo che le piastrine trasfettate circolano in modo efficiente nell'ospite senza differenze nei due gruppi sperimentali (Figura 3A).
Infine, non si sono osservate differenze significative tra due gruppi sperimentali per quanto riguarda la variazione del peso dei topi dopo il trattamento, a riprova del fatto che il trattamento ? sicuro e non causa effetti collaterali indesiderati (Figura 3B).
LISTA DELLE SEQUENZE
<110> PLASFER s.r.l.
<120> Piastrine trasfettate con siRNA e loro usi terapeutici
<130> 11884M
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_RNA
<222> (20)..(20)
<223> thymine base
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is a, c, g, or u
<220>
<221> misc_RNA
<222> (21)..(21)
<223> thymine base
<400> 1
guuggagcug auggcguagn n 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_RNA
<222> (20)..(20)
<223> thymine base
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n is a, c, g, or u
<220>
<221> misc_RNA
<222> (21)..(21)
<223> thymine base
cuacgccauc agcuccaacn n 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
acttgtggta gttggagcag a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ttggatcata ttcgtccaca a 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gcttaatttg actcaacacg gga 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
agctatcaat ctgtcaatcc tgt 23
Claims (9)
1. Composizione terapeutica comprendente piastrine trasfettate con un siRNA in grado di inibire l?espressione dell?mRNA che codifica la proteina KRAS recante la mutazione G12D (KRASG12D), o microparticelle piastriniche da esse derivate.
2. Composizione secondo la rivendicazione 1, in cui detto siRNA ? diretto contro una sequenza dell?mRNA di KRASG12D contenente il codone mutato.
3. Composizione secondo le rivendicazioni 1-2, in cui detto siRNA contiene da 15 a 30 paia di basi.
4. Composizione secondo le rivendicazioni 1-3, in cui detto siRNA comprende un filamento senso e un filamento antisenso, dove:
(i) il filamento senso comprende o consiste della sequenza 5? -GUUGGAGCUGAUGGCGUAGTT-3? (SEQ ID NO:1), e
(ii) il filamento antisenso comprende o consiste della sequenza 5? -CUACGCCAUCAGCUCCAACTT-3? (SEQ ID NO:2).
5. Composizione secondo le rivendicazioni 1-4, in cui dette piastrine sono ottenute attraverso un metodo di trasfezione che comprende il porre in contatto le piastrine isolate da sangue periferico con siRNA in un mezzo di trasfezione contenente alcol etilico e una poliammina scelta tra polietilenimmina e polilisina.
6. Composizione secondo la rivendicazione 5, in cui dette piastrine sono attivate in modo da produrre microparticelle.
7. Composizione secondo le rivendicazioni 1-6, per uso nel trattamento di un tumore esprimente KRASG12D.
8. Composizione per uso secondo la rivendicazione 7, in cui detto tumore ? adenocarcinoma pancreatico.
9. Composizione per uso secondo le rivendicazioni 7-8, in cui il trattamento del tumore prevede (i) il prelievo delle piastrine dal paziente tumorale o da donatore, (ii) la trasfezione delle piastrine con siRNA e (iii) la loro (re)introduzione nel paziente.
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