CN111133109A - 用于免疫调节蛋白表达的多基因构建体和其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了对多种免疫调节蛋白进行编码的表达载体构建体，其中每种蛋白或其组分可以利用适当的启动子和/或转译修饰剂表达。可以添加含有共有肿瘤抗原的另外的免疫调节蛋白和基因佐剂，以进一步提高治疗潜力以及允许跟踪治疗性治疗。还提供了表达载体的使用方法。

Description

用于免疫调节蛋白表达的多基因构建体和其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年6月13日提交的美国申请第62/519,120号、于2017年11月7日提交的美国申请第62/582,917号和于2018年2月9日提交的美国申请第62/628,917号的权益，出于所有目的将所述美国申请通过整体引用并入本文。

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通过电子方式提交的序列表也通过引用整体并入本文(文件名：OM1702PCT SQ_ST25.txt；创建日期：2018年6月12日；文件大小：45KB)。

技术领域

描述了用于肿瘤内递送编码治疗活性多聚体和融合多肽的三种基因的重组表达载体。提供了编码由转译调节元件分离的多肽的核酸。还提供了递送的方法。

背景技术

长期以来，大肠杆菌质粒一直是研究人员和工业界使用的重组DNA分子的重要来源。如今，随着下一代生物技术产品(例如，基因药物和DNA疫苗)进入临床试验，并最终进入制药市场，质粒DNA变得越来越重要。表达质粒DNA可以作为将治疗性蛋白递送到患者需要治疗的部位(例如肿瘤)的载体。

这种“瘤内递送”通常涉及将免疫调节剂递送到肿瘤微环境。免疫疗法作为继外科手术、化学疗法和放射疗法之后用于治疗肿瘤的第四种方法最近引起了关注。由于免疫疗法利用人类固有的免疫力，因此据称免疫疗法与其它疗法相比减轻了患者的身体负担。称为免疫疗法的治疗方法包含：细胞转移疗法，其中将通过使用各种方法的扩增培养从例如外源诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或外周血淋巴细胞获得的细胞(如淋巴因子激活细胞、天然杀伤性T细胞或γδT细胞等)转移；树突状细胞转移疗法或肽疫苗疗法，期望通过这两种疗法在体内(in vivo)诱导抗原特异性CTL；Th1细胞疗法；以及免疫基因疗法，其中将预期具有多种效果的基因离体引入上述细胞以在体内对所述基因进行转移。在这些免疫疗法中，传统认为CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞起着关键作用。

体内电穿孔是一种基因递送技术，已成功用于将质粒DNA有效递送到许多不同组织。研究已经报道了将体内电穿孔施用于将质粒DNA递送到B16黑色素瘤和其它肿瘤组织。通过施用体内电穿孔可以获得质粒编码的基因或cDNA的全身和局部表达。体内电穿孔的使用增强了肿瘤组织中质粒DNA的摄取，实现了瘤内表达，并将质粒递送到肌肉组织，从而导致了全身细胞因子的表达。

已经表明电穿孔可以用于使用质粒DNA在体内转染细胞。最近的研究表明电穿孔能够增强质粒DNA作为抗肿瘤剂的递送。已在啮齿动物模型中通过电穿孔治疗肝细胞癌、腺癌、乳腺肿瘤、鳞状细胞癌和B16.F10黑色素瘤。B16.F10鼠黑色素瘤模型已广泛用于测试免疫调节分子(包含细胞因子)作为重组蛋白或通过基因治疗递送的潜在免疫治疗方案。

可以根据本领域已知的各种方案利用体内电穿孔递送编码免疫调节蛋白的质粒来治疗癌症。本领域已知的方案描述了利用低电压和长脉冲电流的体内电穿孔介导的基于细胞因子的基因治疗(包括瘤内基因治疗和肌肉内基因治疗)。

涉及癌症-免疫周期各个阶段的联合免疫疗法可以通过靶向多种机制来增强预防免疫逃逸的能力，从而避免免疫系统将肿瘤细胞消除，并且具有可能在更广泛的患者群体中提供更好的疗效的协同作用。这些组合治疗性免疫调节蛋白通常是涉及一个或多个同二聚体链或异二聚体链的复杂分子，例如IL-12、编码基因佐剂的融合蛋白以及肿瘤或病毒抗原。将多种蛋白质施用为治疗剂复杂且成本昂贵。使用表达质粒在肿瘤内递送多种编码蛋白更简单且更具成本效益。此外，使用合适的转译元件和优化的电穿孔参数可以改善包含异源二聚体免疫刺激细胞因子在内的多种蛋白质的表达，并且可以降低质粒治疗剂的治疗施用频率。然而，目前的表达质粒构建体不能满足充分产生每种免疫调节蛋白的需要。描述了化合物和使用这些化合物的方法，所述方法通过提供单独编码异二聚细胞因子IL-12的表达载体和提供与融合到具有适当放置的启动子和转译修饰剂的肿瘤抗原上的FLT3配体一起编码异二聚细胞因子IL-12的表达载体来满足这一需要。

发明内容

描述了包括多个由以下公式定义的表达盒的表达载体：P–A–T–A'–T–B，其中：a)P为人CMV启动子；b)A和A'分别为白细胞介素-12(IL-12)p35和p40；c)B为融合到至少一种抗原的FLT3L；以及d)T为转译调节元件，如P2A转译修饰元件。在某些实施例中，所述抗原选自由以下组成的组：NYESO-1、OVA、RNEU、MAGE-A1、MAGE-A2、Mage-A10、SSX-2、Melan-A、MART-1、Tyr、Gp100、LAGE-1、生存素、PRS pan-DR、CEA肽CAP-1、OVA、HCV-NS3、TERT、WT1、PSMA和HPV疫苗肽。在一些实施例中，所述表达载体为质粒。在一些实施例中，所述表达载体包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的核酸序列或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO 12的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，所述表达载体对包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽进行编码。

还描述了治疗受试者的肿瘤的方法，包括使用至少一种瘤内电穿孔脉冲将所述表达载体中的一种或多种递送到肿瘤中。在一些实施例中，所述瘤内电穿孔脉冲的场强度为约200V/cm到1500V/cm。在其它实施例中，所述受试者为人。在一些实施例中，所述肿瘤可以为(但不限于)黑色素瘤、三阴性乳腺癌、梅克尔细胞癌、CTCL和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。在另一个实施例中，所述电穿孔脉冲由能够产生电化学阻抗谱的发生器递送。

描述了用于治疗受试者的肿瘤的方法，所述方法包括至少一种低电压瘤内电穿孔(IT-EP)治疗，所述治疗递送编码含有至少一个P2A外显子跳跃基序的白细胞介素-12(IL-12)的所述表达载体中的任何一种。在一些实施例中，所述IT-EP处于200V/cm到500V/cm的场强度和约100μs(微秒)到约50ms(毫秒)的脉冲长度。在另外的实施例中，所述治疗包括场强度为至少400V/cm和脉冲长度为约10毫秒的至少一种IT-EP治疗。还考虑了含有P2A的IL-12编码的质粒的低压IT-EP治疗与含有IRES基序的IL-12编码质粒相比包括以下至少一项：a)IL-12的瘤内表达高至少3.6倍；b)经过治疗的肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；c)未经治疗的对侧肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；d)淋巴细胞流入到所述肿瘤中的量更大；e)循环肿瘤特异性CD8+T细胞增加；f)所述肿瘤中淋巴细胞和单核细胞表面标志物表达增加；以及g)INF-g相关基因(例如表23和24的一个或多个、或所有基因)的mRNA水平增加。

附图说明

图1示出了用于表达人IL-12和FLT3L-NYESO1融合蛋白的称为pOMI-PIIM(OncoSec医疗股份有限公司(OncoSec Medical Incorporated)-多顺反子IL-12免疫调节剂)的载体的质粒图谱。

图2展示了使用HEK Blue报道细胞测量的含有从pOMI-PIIM表达的分泌型IL-12p70异二聚体的组织培养细胞条件培养基的活性。对照物(添加中和抗IL12抗体；来自未转染细胞的条件培养基)用虚线示出。

图3展示了pOMI-PIIM瘤内电穿孔控制小鼠中原发性(经过治疗的)和对侧(未经治疗的)B16-F10肿瘤生长的能力(黑线)。示出了pUMVC3的瘤内电穿孔(空载体对照)以用于比较(虚线)。

图4示出了从pOMI-PIIM产生的Flt3L融合蛋白在体外(in vitro)使人树突细胞成熟的能力。与空载体(EV)和无活性突变Flt3L(H8R)对照物相比，Flt3L-NY-ESO-1显著增加了原代人未成熟树突状细胞上A.CD80和B.CD86的表达：*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001。

图5示出了未经过治疗的、经NY-ESO-1(157-165)治疗后的、经单独EV治疗后的、经Flt3L-NY-ESO-1治疗后的或经Flt3L-NY-ESO-1(H8R)治疗后的A.％TNF-α阳性细胞或B.％IFN-γ阳性细胞：*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001。

具体实施方式

如本文所用的，包含所附权利要求书在内，词语的单数形式如“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含对应的其复数指代物，除非上下文中清楚地另有指明。

本文引用的所有参考文献均通过引用并入，达到如同明确地且单独地指示每个单独的出版物、专利申请或专利通过引用并入的相同程度。

I.定义

分子的“活性”可以描述或指代分子与配体或受体的结合、催化活性、刺激基因表达的能力、抗原活性、对其它分子的活性的调节等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞间相互作用的活性(例如粘附)或保持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。“活性”还可以指比活性，例如\[催化活性]\/[mg蛋白质]或\[免疫活性]/\[mg蛋白质]等。

如本文所用的，“转译调节元件”或“转译修饰剂”是指新生多肽链中源自小核糖核酸病毒的序列阻止与下一个氨基酸的共价酰胺键连接的特定转译引发剂或核糖体跳跃调节剂。该序列的并入导致异二聚体蛋白质的每条链与等摩尔水平的转译的多肽的共表达。在一些实施例中，所述转译修饰剂为核糖体跳跃调节剂的2A家族。2A转译修饰剂可以为(但不限于)P2A、T2A、E2A和F2A，其均共用PG/P切割位点(参见表5)。在一些实施例中，所述转译修饰剂为内部核糖体进入位点(IRES)。

根据本发明，在本领域的技术范围内可以采用常规的分子生物学、微生物学、和重组DNA技术。文献中对这些技术进行了解释。参见例如Sambrook、Fritsch和Maniatis等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第二版(1989),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港,纽约(本文“Sambrook等人,1989”)；《DNA克隆：一种实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)(第I和II卷)》,(D.Glover编辑,1985)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,(1985))；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,(1984))；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,(1986))；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》(IRL出版社(1986))；B.Perbal，《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》(1994),约翰·威利父子出版公司(Wiley&Sons)。

本文可互换使用的术语“核酸”、“核苷酸序列”、和“多核苷酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其类似物或经过修饰的形式。所述核苷酸包含单链、双链和多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、和包括嘌呤碱基、嘧啶碱基或其它天然的、以化学方式修饰的、以生物化学方式修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是核酸中的一系列核苷酸，如DNA或RNA，并且是指两个或更多个核苷酸的任何链。

将核酸视为具有“5'端”和“3'端”，因为以使得一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸通过磷酸二酯键在一个方向上与其相邻的单核苷酸戊糖环的3'氧相连的方式使单核苷酸反应以形成寡核苷酸。如果寡核苷酸的5'磷酸不与单核苷酸戊糖环的3'氧相连，则将寡核苷酸的一端称为“5'端”。如果寡核苷酸的3'氧不与另一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸相连，则将寡核苷酸的一端称为“3'端”。即使核酸序列处于更大的寡核苷酸的内部，也可以视为该核酸序列具有5'端和3'端。在线性或环形DNA分子中，将不连续的元件称为“下游”或3'元件的“上游”或5'。

“编码序列”或“编码”表达产物(如RNA或肽(例如，免疫球蛋白链))的序列为在表达时使所述产物产生的核苷酸序列。

如本文所用的，术语“寡核苷酸”是指通常最多由约300个核苷酸(例如30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、150个、175个、200个、250个、或300个)构成的可以与基因组DNA分子、cDNA分子、或编码基因、mRNA、cDNA或其它关注的核酸的mRNA分子杂交的核酸。寡核苷酸通常为单链的，但也可以为双链的。寡核苷酸可以例如通过掺入32P-核苷酸、3H-核苷酸、14C-核苷酸、35S-核苷酸或已经将标记物(如生物素)共价缀合到的核苷酸来标记。在一个实施例中，可以将标记的寡核苷酸用作探针以检测核酸的存在。在另一个实施例中，可以将寡核苷酸(一个或两个都可以被标记)用作PCR引物，用于克隆基因的全长或片段，或用于检测核酸的存在。通常，寡核苷酸是通过合成方式制备的(例如在核酸合成仪上)。

“可操作的连接”或“可操作地连接”是指将两种或多种组分(例如启动子和另一种序列元件)并置使得两种组分正常发挥功能，并使得至少一种组分能够介导施加在至少一种其它组分上的功能。例如，如果启动子响应于存在或不存在一种或多种转录调节因子而控制编码序列的转录水平，则可将所述启动子可操作地连接到编码序列。可操作的连接可以包含这些彼此相邻或以反式作用的序列(例如，调节序列可在一定距离处起作用以控制编码序列的转录)。

术语“质粒”或“载体”包含任何已知的递送载体，包含细菌递送载体、病毒载体递送载体、肽免疫治疗递送载体、DNA免疫治疗递送载体、附加型质粒、整合质粒、或噬菌体载体。术语“载体”是指能够在宿主细胞中递送和(任选地)表达一种或多种融合多肽的构建体。在一些实施例中，多核苷酸为环状质粒pOMIP2A或pOMI-PIIM。

“蛋白质序列”、“肽序列”、或“多肽序列”、或“氨基酸序列”是指蛋白质、肽或多肽中的一系列两个或多个氨基酸序列。

本文可互换使用的术语“蛋白质”、“多肽”、和“肽”是指任何长度的聚合形式的氨基酸，包含编码氨基酸和非编码氨基酸以及以化学方式或生物化学方式修饰的氨基酸或以化学方式或生物化学方式衍生的氨基酸。这些术语包含已经修饰的聚合物，如具有经修饰的肽主链的多肽。

可将蛋白质视为具有“N端”和“C端”。术语“N端”是指蛋白质或多肽的起始端，其终止于具有游离胺基(-NH2)的氨基酸。术语“C端”是指氨基酸链(蛋白质或多肽)的末端，其终止于游离羧基(-COOH)。

术语“融合蛋白”是指包括通过肽键或其它化学键连接在一起的两个或更多个肽的蛋白。所述肽可以通过肽或其它化学键直接连接在一起。例如，可以通过重组方式将嵌合分子表达为单链融合蛋白。可替代地，所述肽可以通过“接头(如一个或多个氨基酸)”或所述两个或更多个肽之间的另一种合适的接头连接在一起。

术语“分离的多核苷酸”或“分离的多肽”分别包含多核苷酸(例如，RNA或DNA分子，或混合的聚合物)或多肽，其与通常存在于细胞中或重组DNA表达系统或任何其它污染物中的其它组分部分或完全分离。这些组分包含但不限于细胞膜、细胞壁、核糖体、聚合酶、血清组分和外来基因组序列。

分离的多核苷酸(例如，pOMI-PIIM)或多肽将优选为基本上均质的分子组成，但是可以包含一些异质性。

术语“宿主细胞”包含为使细胞产生物质(例如使细胞表达或复制基因、多核苷酸(如环状质粒(例如pOMI-PIIM)或RNA或蛋白质))以任何方式选择、修饰、转染、转化、生长或以任何方式使用或操纵的任何生物体的任何细胞。例如，宿主细胞可以为哺乳动物细胞或细菌细胞(例如大肠杆菌)、或能够维持所述表达载体并促进表达载体编码的多肽的表达的任何分离的细胞。

可以根据本领域已知的许多技术中的任何一种将载体(如pOMI-PIIM)引入宿主细胞，例如葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质转染、将载体直接显微注射到胞核中或适用于给定宿主细胞类型的任何其它方式。

“盒”或“表达盒”是指编码可插入载体(例如在限定的限制位点)的表达产物(例如肽或RNA)的DNA编码序列或DNA片段。所述表达盒可包括可操作地连接到DNA编码序列的启动子和/或终止子和/或polyA信号。

通常，“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶(例如，直接或通过其它启动子结合的蛋白质或物质)并启动编码序列转录的DNA调节区。启动子序列通常在其3'端由转录起始位点界定，并向上游(5'方向)延伸，以包含在任何水平启动转录所需的最小数量的碱基或元件。在所述启动子序列中可以发现转录起始位点(方便地定义，例如通过用核酸酶S1作图)以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。所述启动子可以与其它表达控制序列(包含增强子序列和阻遏物序列)或待表达的核酸可操作地相关联或可操作地连接。如果表达控制序列调节来自所述启动子的表达，则所述表达控制序列与启动子可操作地关联或可操作地连接。

在pOMI-PIIM中用于基因表达的启动子为人CMV立即早期启动子(Boshart等人,《细胞(Cell)》,41:521-530(1985))；Foecking等人,《基因(Gene)》,45:101-105(1986)。所述hCMV启动子在多种哺乳动物细胞类型中提供高水平的表达。

当序列指导或调节编码序列的表达时，所述编码序列“处于细胞中转录和转译控制序列的控制下”、“在功能上与所述转录和转译控制序列相关联”、“可操作地连接到所述转录和转译控制序列”或“与所述转录和转译控制序列可操作地相关联”。例如，可操作地连接到基因的启动子将引导编码序列RNA聚合酶介导的转录为RNA(优选转录为mRNA)，然后可以将RNA剪切(如果所述RNA包含内含子)并且任选地将其转译成由所述编码序列编码的蛋白质。可操作地连接到基因的终止子/polyA信号将基因向RNA的转录终止，并引导polyA信号添加到RNA上。

术语“表达(express)”和“表达(expression)”是指允许或使得基因、RNA或DNA序列中的信息变得明显；例如，通过激活相应基因的转录和转译中涉及的细胞功能产生蛋白质。“表达(express)”和“表达(expression)”包含将DNA转录成RNA以及将RNA转录成蛋白质。DNA序列在细胞中表达(或由细胞表达)，以形成“表达产物”，如RNA(例如mRNA)或蛋白质。也可以将所述表达产物本身视为由细胞“表达”。

术语“转化”是指将核酸引入细胞。引入的基因或序列可以称为“克隆”。接受引入的DNA或RNA的宿主细胞已经“转化”，并且为“转化体”或“克隆”。引入宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源(包含与所述宿主细胞属于同一属或种的细胞)，或者来自不同属或种的细胞。本领域众所周知的转化方法的实例包含脂质体递送、电穿孔、CaPO4转化、DEAE-葡聚糖转化、显微注射和病毒感染。

本文公开了包括多核苷酸的表达载体。术语“载体”可以指可以将DNA或RNA序列引入宿主细胞以转化宿主并且任选地促进所引入序列的表达和/或复制的载体(例如质粒)。

所述多核苷酸可以在表达系统中表达。术语“表达系统”是指宿主细胞和相容的载体，所述载体在合适的条件下可以表达由载体携带并引入宿主细胞的蛋白质或核酸。常见的表达系统包含大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体、哺乳动物宿主细胞和如质粒、粘粒、BAC、YAC的载体和如腺病毒和腺病毒相关病毒(AAV)的病毒。

术语“免疫刺激细胞因子”或“免疫刺激细胞因子”是指参与免疫的具有刺激免疫应答的能力的细胞天然分泌的蛋白质。

在本文中，术语“抗原”用于指当与受试者或生物体接触时(例如当存在于受试者或生物体中或由受试者或生物体检测到时)使得受试者或生物体产生可检测免疫应答的物质。“抗原肽”是指当存在于受试者或生物体中或由受试者或生物体检测到时使得受试者或生物体中免疫应答增加的肽。例如，这种“抗原肽”可以涵盖装载并呈现在宿主细胞表面上的MHC I类和/或II类分子上的蛋白质，并且可以由宿主的免疫细胞识别或检测，从而使得针对所述蛋白质的免疫应答增加。这种免疫应答也可以延伸到宿主内的其它细胞，如表达相同蛋白质的患病细胞(例如，肿瘤或癌细胞)。

如本文所用的，短语“含有共有肿瘤抗原的基因佐剂”是指通过将Ag与如表1所述的结合细胞表面受体的分子以遗传方式融合来靶向DNA编码的Ag。表2中描述了基因佐剂另外的靶向组分。本文所述的基因佐剂当与特定抗原结合使用时可起到加速、延长、增强或修饰抗原特异性免疫应答的作用。

“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中是指当在指定的比较窗口上出于最大对应进行比对时两个序列中相同的残基。当提及蛋白质的序列同一性的百分比时，认识到不相同的残基位置通常因保守性氨基酸替代而不同，其中氨基酸残基用具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基替代，因此不改变分子的功能性质。当序列保守性替代不同时，可以将百分比序列同一性向上调整以校正替代的保守性质。将因这些保守性替代而不同的序列视为具有“序列相似性”或“相似性。”进行这种调整的方法众所周知。通常，这涉及将保守性取代计为部分错配而不是完全错配，从而增加百分比序列同一性。因此，例如，当相同氨基酸的所得评分为1，非保守性替代的所得评分为0时，保守替代的所得评分介于0与1之间。例如，通过在项目PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中的实施方式计算保守性替代的得分。

“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列确定的值(完全匹配残基的最大数量)，其中在比较窗口中的多核苷酸序列部分与参考序列(不包括添加物或缺失部分)相比可以包括添加物或缺失部分(即缺口)，以实现两个序列的最佳比对。通过确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数计算百分比来得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列一致性的百分比。除非另有说明(例如较短的序列包含连接的异源序列)，否则所述比较窗口为两个所比较序列中较短序列的全长。

除非另有说明，否则序列同一性/相似性值是指使用以下参数使用第10版GAP获得的值：使用GAP权重50、长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵的核苷酸序列的同一性百分比和相似性百分比；使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵的氨基酸序列的同一性百分比和相似性百分比；或其任何等效程序。“等效程序”包含任何当与第10版GAP产生的相应比对比较时产生所讨论的任何两个序列的具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对的序列比较程序。

术语“保守性氨基酸替代”是指用具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸对序列中正常存在的氨基酸的替代。保守性替代的实例包含用非极性(疏水性)残基(如异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸)替代另一种非极性残基。类似地，保守性替代的实例包含用一种极性(亲水性)残基替代另一种极性残基，如精氨酸与赖氨酸之间的极性残基、谷氨酰胺与天冬酰胺之间的极性残基或甘氨酸与丝氨酸之间的极性残基。此外，用碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)替代另一种残基或者用一种酸性残基(如天冬氨酸或谷氨酸)替代另一种酸性残基是保守性替代另外的实例。非保守性替代的实例包括用非极性(疏水性)氨基酸残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、或甲硫氨酸)替代极性(亲水性)残基(如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸)和/或用极性残基替代非极性残基。典型的氨基酸分类总结如下。

“同源”序列(例如，核酸序列)是指与已知参考序列相同或基本相似的序列，使得其例如与已知参考序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

术语“体外(in vitro)”是指人工环境以及在人工环境(例如试管)内发生的过程或反应。

术语“体内(in vivo)”是指自然环境(例如，细胞、生物体或身体)以及在自然环境内发生的过程或反应。

“包括”或“包含”一个或多个所列举的元件的组合物或方法可以包含其它未具体列举的元件。例如，“包括”或“包含”蛋白质的组合物可以单独含有蛋白质或与其它成分组合的蛋白质。

数值范围的指定包含所述范围内或定义所述范围的所有整数以及由所述范围内的整数定义的所有子范围。

除非从上下文中明显看出，术语“约”涵盖规定值的标准测量误差范围(例如，SEM)内的值或与指定值相差±0.5％、±1％、±5％或±10％的值。

除非上下文另外明确指明，否则本文中的单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数个提及物。例如，术语“抗原”或“至少一种抗原”可以包含多种抗原，包含其混合物。

II.总述

描述了在肿瘤微环境中转染体内细胞(特别是肿瘤细胞或其它细胞(例如免疫细胞))后使得多种蛋白充分表达的表达载体。

提供了含有本文所述的设计用于改善载体的功效和安全性的修饰物中的一些或全部的载体。对所述载体的优化包含结合编码合适肽的序列和调整位点以改善基因表达。应将肽理解为任何转译产物(无论其大小如何以及是否在转译后在糖基化和磷酸化中进行了修饰)。

描述了包括可操作地连接到待表达的基因序列的转译控制元件(例如P2A)的表达载体。在某些实施例中，所述表达载体包含至少两个待转译的核酸序列，并且所述转译控制元件可操作地连接到待转译的所述序列中的至少一个。载体是已知的或者可以由本领域技术人员构建，并且所述载体除了含有下文实例中所示的本文描述的序列之外，还含有实现所需序列转录所需的所有表达元件。所述载体含有根据用途用于原核宿主系统或真核宿主系统中的元件。本领域普通技术人员将知道哪个宿主系统与特定载体相容。

重组的基因表达取决于对合适的基因的转录和消息的有效转译。如果不能正确执行这些过程中的一个，则会导致给定基因无法表达。当需要从单个质粒表达一个以上的基因时，这将变得更加复杂。传统上，将内部核糖体进入位点(IRES)用于待表达基因之间。IRES由于其大小而具有局限性，并且第二个基因的转译效率远低于第一个基因的转译效率。最近的研究发现，小核糖核酸病毒多蛋白2A(“P2A”)肽的使用会导致以1比1化学计量比在P2A肽侧翼表达多种蛋白(参见例如Kim等人,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》(2011),6:318556)。

在一些实施例中，描述了用于表达多种免疫调节剂的表达载体，所述免疫调节剂包含例如异二聚体蛋白(如IL-12(GenBank参考号：NP_000873.2；NP_002178.2))和基因佐剂(例如含有共有肿瘤抗原(例如FLT3L-NYSO1融合蛋白)的FLT3L配体胞外结构域(FLT3L，GenBank号：XM_017026533.1))。在一些实施例中，通过体内电穿孔将所述表达载体递送到肿瘤(瘤内递送)。

表1：融合到共有肿瘤抗原或病毒抗原的基因佐剂(Flt3L蛋白融合物)

还考虑了另外的基因佐剂(表2)。

表2.基因佐剂

在一些实施例中，描述了表达载体，所述表达载体包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，表达载体包括与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有大于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施例中，将SEQ ID NO:8的核苷酸序列或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列可操作地连接到CMV启动子。

在一些实施例中，描述了表达载体，所述表达载体对包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽进行编码。在一些实施例中，表达载体对包括与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有大于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，所述表达载体对与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少80％、至少85％和至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同源性的多肽进行编码。

在一些实施例中，描述了表达载体，所述表达载体包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，表达载体包括与SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有大于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施例中，将SEQ ID NO:10的核苷酸序列或与SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列可操作地连接到CMV启动子。

在一些实施例中，描述了表达载体，所述表达载体对包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽进行编码或对与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽进行编码。在一些实施例中，表达载体对包括与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有大于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多肽进行编码。在一些实施例中，所述表达载体对与SEQID NO:11的氨基酸序列具有至少80％、至少85％和至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同源性的多肽进行编码。

在一些实施例中，描述了表达载体，所述表达载体包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列或与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，表达载体包括与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有大于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

在一些实施例中，描述了包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的表达载体。在一些实施例中，表达载体包括与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的同一性大于70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列，或基本由或由所述序列组成。

III.装置和用途

在一些实施例中，通过瘤内基因电转移递送所述表达载体。所述表达载体可用于产生浓度足够的若干种以重组方式表达的免疫调节分子，如多聚体细胞因子或多聚体细胞因子的组合、呈天然或工程形式的共刺激分子、包含共有肿瘤抗原的基因佐剂等。为了将所述表达载体转移到组织(如肿瘤)中，可以使用电穿孔装置。

本实施例的装置和方法用于通过向肿瘤连续地和/或以脉冲方式递送电治疗几分之一秒到几天、几周和/或几个月来治疗癌性肿瘤。在优选实施例中，电疗法为直流电疗法。

如本文所用的，术语“电穿孔”(即使得细胞膜可渗透)可以由在任何足以在细胞膜上开孔(例如使如药物、溶液、基因和其它试剂等的分子扩散到活细胞中)的时间段内递送给患者的任何量的库仑、电压和/或电流实现。

将电治疗递送到组织产生一系列生物反应和电化学反应。在足够高的电压下，电治疗的应用严重干扰细胞结构和细胞代谢。尽管癌细胞和非癌细胞都在特定水平的电治疗下受到破坏，但肿瘤细胞对其微环境的变化比非癌细胞更敏感。由于进行了电疗法，常量元素和微量元素的分布发生改变。电穿孔附近的细胞破坏被称为不可逆电穿孔。

还考虑了使用可逆电穿孔。可逆电穿孔发生于用电极施加的电流低于靶组织的电场阈值时。因为施加的电流低于细胞的阈值，因此细胞能够修复其磷脂双层并且继续维持其正常细胞功能。可逆电穿孔通常通过涉及使药品或基因(或细胞膜不可正常渗透的其它分子)进入细胞的治疗完成(Garcia等人,(2010),“非热不可逆电穿孔治疗颅内深部疾病(Non-thermal irreversible electroporation for deep intracranial disorders)”，《2010年国际医学和生物IEEE工程年度会议(2010Annual International Conference ofthe IEEE Engineering in Medicine and Biology)》:2743-6.)。

在单电极配置中，可以在引线电极与发电机外壳之间施加几秒到几小时的电压，以开始破坏癌组织。给定电压的施加可以采用一系列脉冲的方式，每个脉冲持续几分之一秒到几分钟。在某些实施例中，脉冲持续时间或宽度可以为约10微秒到约100毫秒。也可以施加持续几秒到几分钟的低电压，这样可以将白细胞吸引到肿瘤位点。以此方式，细胞介导的免疫系统可以将死亡的肿瘤细胞移除，并且可以产生针对肿瘤细胞的抗体。此外，受刺激的免疫系统可能攻击边缘肿瘤细胞和转移瘤。

根据宿主物种，可以使用各种佐剂来增加任何免疫应答，包含但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物盐(如氢氧化铝或磷酸铝等)、各种细胞因子、表面活性物质(如溶血卵磷脂等)、普朗尼克(pluronic)多元醇、多聚阴离子、肽、油乳剂以及潜在有用的人佐剂(如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌等)。可替代地，可以通过与分子(如钥孔戚血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、卵白蛋白、霍乱毒素或其片段)组合和/或偶联来增强免疫应答。

Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号描述了模块化电极系统及其用于促进将生物分子引入身体或植物中选定组织的细胞的用途。所述模块化电极系统包括：多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；和电源。操作者可以握住安装在支撑结构上的所述多个针电极并且将其牢固地插入身体或植物中选定的组织中。然后通过皮下注射针将生物分子递送到选定的组织中。将可编程恒流脉冲控制器激活并且将恒流电脉冲施加到所述多个针电极。施加的恒流电脉冲有助于将生物分子引入多个电极之间的细胞。美国专利第7,245,963号的全部内容通过引用并入本文。

美国专利公开2005/0052630描述了可以用于有效地促进将生物分子引入身体或植物中选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括电动装置(“EKD装置”)，其操作通过软件或固件来指定。所述EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输出在阵列中的电极之间产生一系列可编程恒流脉冲图案，并且使得能够存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包括具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中央注射通道以及可移除的引导盘(参见例如美国专利公开2005/0052630，其通过引用而并入本文中)。

美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法不仅适用于深度穿透如肌肉等的组织，而且适用于深度穿透其它组织或器官。由于电极阵列的配置，还将注射针(用于递送选中的生物分子)完全插入靶器官中，并且注射在电极预先描绘的区域中以垂直于靶组织的方式施用的。

还包括结合电化学阻抗谱(EIS)的电穿孔装置。这种装置提供体内的实时信息，特别是瘤内电穿孔效率，从而使得条件得到优化。可以在例如WO2016161201中找到结合EIS的电穿孔装置的实例，所述文献通过引用并入本文。

也考虑了其它替代性电穿孔技术。体内质粒递送也可以使用冷等离子体进行。等离子体是物质的四种基本状态之一，其它为固体、液体和气体。等离子体是由未结合的正负粒子构成的电中性介质(即等离子体的总电荷大致为零)。等离子体可以通过加热气体或将气体置于用激光发生器或微波发生器施加的强电磁场来产生。这减少或增加了电子的数量，产生了称为离子的带正电或负电的粒子，(Luo等人,(1998),《等离子体物理学(Phys.Plasma)》,5:2868-2870)，并伴有分子键(如果存在)的解离。

冷等离子体(即非热等离子体)通过将脉冲高压信号递送到合适的电极产生。冷等离子体装置可以采取气体喷射装置或介电阻挡放电(DBD)装置的形式。低温等离子体借助其在相对较低的气体温度下提供等离子体已经吸引了极大的热情和关注。在这样的温度下提供等离子体对于各种应用都是有意义的，包含伤口愈合、抗菌过程、各种其它医学疗法以及灭菌。如前所述，冷等离子体(即非热等离子体)通过将脉冲高压信号递送到合适的电极产生。冷等离子体装置可以采取气体喷射装置、介电阻挡放电(DBD)装置或多频富谐波电源的形式。

介电阻挡放电装置凭借不同的工艺来产生冷等离子体。介电阻挡放电(DBD)装置包含至少一个以介电层覆盖的导电电极。电返回路径由可以通过由接受冷等离子体治疗的靶底物提供的地形成或通过为电极提供内置地形成。介电阻挡放电装置的能量可以由高压电源如上文所提及的那个电源提供。介质阻挡放电装置的能量可以由高压电源提供，例如上述电源。更普遍地，以脉冲DC电压的形式将能量输入到介电阻挡放电装置，以形成等离子体放电。借助于介电层，放电与导电电极分离，并且电极蚀刻和气体加热减少。可以改变脉冲DC电压的振幅和频率，以实现不同的操作方案。任何结合这种冷等离子体产生原理的装置(例如DBD电极装置)都落在各个描述的实施例的范围内。

已经采用冷等离子体来转染具有外源核酸的细胞。具体地说，已经采用冷等离子体转染肿瘤细胞(参见例如Connolly等人(2012)《人类疫苗与免疫疗法(Human Vaccines&Immunotherapeutics)》8:1729-1733；和Connolly等人(2015)《生物电化学(Bioelectrochemistry)》103:15-21)。

考虑将所述装置用于患有癌症或其它非癌性(良性)生长物的患者。这些生长物可以表现为以下中的任何一种：损伤、息肉、瘤(例如乳头状尿路上皮瘤)、乳头状瘤、恶性肿瘤、肿瘤(例如Klatskin肿瘤、肝门区肿瘤、非浸润性乳头状尿路上皮瘤、生殖细胞瘤、尤文氏瘤、Askin瘤、原始神经外胚层肿瘤、莱迪希细胞瘤、维尔姆斯瘤、Sertoli细胞瘤)、肉瘤、癌(例如鳞状细胞癌、穴肛原癌、腺癌、腺鳞癌、胆管癌、肝细胞癌、浸润性乳头状尿路上皮癌、扁平尿路上皮癌)、肿块或任何其它类型的癌性或非癌性生长。用本实施例的装置和方法治疗的肿瘤可以为无创的、侵入性的、浅表的、乳头状的、扁平的、转移性的、局部的、单中心的、多中心的、低等级的或高等级的。

考虑将所述装置用于治疗多种类型的恶性肿瘤(如癌症)和良性肿瘤。例如，本文所述的装置和方法可用于以下疾病：肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌(例如癌周、胆道远端癌、肝内胆管癌)、膀胱癌、良性和癌性骨癌(例如骨瘤、骨样骨瘤、成骨细胞瘤、骨慢性瘤、血管瘤、软骨粘液纤维瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、脑和中枢神经系统癌(例如脑膜瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤、胶质瘤、髓母细胞瘤、神经节胶质瘤、神经鞘瘤、生殖细胞瘤、颅咽管瘤)、乳腺癌(例如原位导管癌、浸润导管癌、浸润小叶癌、原位小叶癌、男性乳房发育、三阴性乳腺癌(TNBC))、Castleman病(例如巨大淋巴结增生、血管滤泡性淋巴结增生)、子宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌(例如子宫内膜腺癌、腺癌、乳头状浆液腺癌、透明细胞)食管癌、胆囊癌(粘液腺癌、小细胞癌)、胃肠道类癌(例如绒毛膜癌、绒毛膜腺癌)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、卡波西肉瘤、肾癌(例如肾细胞癌)、肝癌(例如血管瘤、肝腺瘤、局灶性结节增生、肝细胞癌)、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、浆细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌(包含但不限于鼻腔和鼻旁窦癌(例如嗅神经母细胞瘤、中线肉芽肿)、唾液腺癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、喉癌和下咽癌、口腔癌和口咽癌)、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(例如胚胎横纹肌肉瘤、肺泡横纹肌肉瘤、多形性横纹肌肉瘤)、皮肤癌、黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌(包含Merkel细胞癌)、胃癌、睾丸癌(例如精原细胞瘤、非精原细胞癌)、胸腺癌、甲状腺癌(例如卵泡癌、间变性癌、低分化癌、甲状腺髓样癌、甲状腺淋巴瘤)、阴道癌、外阴癌和子宫癌(例如子宫平滑肌肉瘤)。

IV.瘤内电穿孔参数

通常，体内细胞电穿孔(特别是瘤内电穿孔(IT-EP))所需的电场在幅值上总体与体外细胞所需的电场相似。在一个实施例中，所述电场的幅值范围大致为10V/cm到约1500V/cm、约200V/cm到1500V/cm、约200V/cm到800V/cm、约200V/cm到500V/cm。在一个实施例中，场强为约200V/cm到约400V/cm，并且优选为约400V/cm。

脉冲长度或频率可以为10微秒到100毫秒、约100微秒到50毫秒、约500微秒到10毫秒。在一个实施例中，所述场强为约400V/cm，脉冲长度为约10毫秒。可以采用任何所需的脉冲数量，通常为每秒一个到100个脉冲。脉冲组之间的间隔可以为任何所需的时间，如一秒。波形、电场强度和脉冲持续时间也可能取决于细胞的类型和将通过电穿孔进入细胞中的分子的类型。

质粒编码的免疫刺激性细胞因子在每个周期或交替周期的至少一天、两天或三天通过电穿孔递送。在某些实施例中，细胞因子在每个周期的第1、5和8天递送。在优选实施例中，细胞因子在每个奇数周期的第1、3和8天递送。在某些实施例中，如果质粒含有P2A转译元件，则质粒编码的细胞因子仅在第1天作为单一治疗递送。

编码免疫刺激性细胞因子的含P2A的质粒以约1μg到100μg、约10μg到约50μg、约10μg到约25μg的剂量给药。在另一个实施例中，质粒的量通过计算靶肿瘤体积并施用这一体积的0.5mg/ml含P2A质粒溶液的1/4来确定。

IV.联合疗法

本公开包括治疗人类受试者的癌症的方法，所述方法包括施用受试者治疗有效量的一种或多种所述表达载体的步骤。在一些实施例中，所述表达载体与电穿孔结合施用。

在一些实施例中，所述疗法中的任何一种与一种或多种另外的(即第二)治疗剂或疗法相结合。表达载体和另外的治疗剂可以以单一组合物施用，也可以单独施用。另外的治疗剂的非限制性实例包含但不限于抗癌药物、抗癌生物制剂、抗体、抗PD-1抑制剂、抗CTLA4拮抗剂Ab、肿瘤疫苗或本领域已知的其它治疗剂。

考虑对编码免疫调节蛋白的DNA的瘤内电穿孔(IT-EP)可以与其它治疗实体一起施用。表3提供了可能的组合。联合疗法的施用可以通过单独的电穿孔或电穿孔和全身递送的组合来实现。

表3：联合疗法

可将所述表达载体和/或组成用在治疗癌症的方法中。所述癌症可以为但不限于：黑色素瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、梅克尔(Merkel)细胞癌、CTCL、头颈部鳞状细胞癌或如上所述的其它癌症。此类方法包括通过电穿孔施用表达载体。

在一些实施例中，所述表达载体中的至少一种用于制备用于治疗受试者的将有益于IL12和FLT3L-NY-ESO在肿瘤中的表达药物组合物(即药剂)。在一些实施例中，所述药物组成用于治疗受试者的癌症。

如本文所用的，药物组合物或药剂包括药理学有效量的所述表达载体中的至少一种。在一些实施例中，药物组合物或药剂进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂(赋形剂)是指除活性药物成分(API、治疗性产品，如表达载体)之外的已经过适当的安全性评估并特意纳入药物递送系统的其它物质。赋形剂不在预期剂量下发挥治疗作用(或未将其设计成在预期剂量下发挥治疗作用)。赋形剂可起到以下作用：(a)在制造过程中协助药物递送系统的处理；(b)保护、支持或增强API的稳定性、生物有效性或患者可接受性；(c)协助产品识别；和/或(d)增强在存储或使用过程中API递送的整体安全性和有效性之外的任何其它属性。药学上可接受的赋形剂可以为惰性物质，也可以不为惰性物质。

赋形剂包含但不限于：吸收促进剂、抗粘结剂、抗发泡剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、载体、涂布剂、着色剂、递送促进剂、右旋糖酐、右旋糖、稀释剂、崩解剂、乳化剂、延长剂、填充剂、调味剂、助流剂、保湿剂、润滑剂、油、聚合物、防腐剂、盐水、盐、溶剂、糖、悬浮剂、缓释基质、甜味剂、增稠剂、强力剂、媒介物、防水剂和润湿剂。

药物组合物可以含有药物组合物中常见的其它另外的组分。此类另外的组分包括但不限于：止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂(如抗组胺药、苯海拉明等)。还设想表达或包括本文所述表达载体的细胞可用作“药物组合物”。如本文所用的，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简言之的“有效量”指用于产生预期的药理学、治疗或预防结果的表达载体的量。

在一些实施例中，描述的表达载体可以用于：降低经过治疗的肿瘤病变的平均肿瘤体积，降低未经治疗的对侧肿瘤病变的平均肿瘤体积，诱导淋巴细胞流入肿瘤，诱导循环肿瘤特异性CD8+T细胞的增加，增加肿瘤中淋巴细胞和单核细胞表面标志物的表达和/或增加表23和24的INF-γ相关基因中的任何一种的mRNA水平。

在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，IL-12的肿瘤内表达增加了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，IL-12的肿瘤内表达增加了至少1×、至少2×、至少3×、至少3.6×、至少4×或至少5×。

在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，经过治疗的肿瘤病变的平均肿瘤体积减少了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。

在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，未经治疗的对侧肿瘤病变的平均肿瘤体积减少了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。

在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，淋巴细胞流入肿瘤的量增加了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，淋巴细胞流入肿瘤的量增加了至少1×、至少2×、至少3×、至少4×或至少5×。

在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，受试者体内循环的肿瘤特异性CD8+T细胞增加了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，受试者体内循环的肿瘤特异性CD8+T细胞增加了至少1×、至少2×、至少3×、至少4×或至少5×。

在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，肿瘤中的淋巴细胞和单核细胞表面标志物表达增加了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，肿瘤中的淋巴细胞和单核细胞表面标志物表达增加了至少1×、至少2×、至少3×、至少4×或至少5×。

在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，肿瘤中表23和24的任何与INF-γ相关基因的mRNA水平增加了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。在一些实施例中，相对于施用所述表达载体之前的受试者或未接受所述表达载体的受试者，肿瘤中表23和24的INF-γ相关基因中的任一种的mRNA水平增加了至少1×、至少2×、至少2×、至少3×或至少5×。

在一些实施例中，可以通过电穿孔将所述表达载体或含有所述表达载体的组合物递送到肿瘤或肿瘤病变部位。一般而言，本领域公认的用于递送核酸分子(体外或体内)的任何合适的电穿孔方法均可适于与所述表达载体结合使用。

可将所述表达载体和包括本文所公开的表达载体的药物组合物包装或包含在试剂盒、容器、包装或分配器中。可以将所述表达载体和包括所述表达载体的药物组合物包装在预填充的注射器或小瓶中。试剂盒可以包括用于执行本文公开的方法的试剂。试剂盒也可以包括本文所公开的组合物、工具或仪器。例如，此类试剂盒可以包括所描述的表达载体中的任何一种。在一些实施例中，所述试剂盒包括一种或多种所描述的表达载体和电穿孔装置。在一些实施例中，所述试剂盒包括一种或多种所描述的表达载体和一个或多个电极盘、针电极和注射针。尽管下文描述了模型试剂盒，但根据本公开，其它有用试剂盒的内容物是显而易见的。

出于所有目的，以上或以下引用的所有专利申请、网站、其它出版物、登录号等都通过引用整体并入，达到具体地和单独地指出每个单独的项通过引用并入本文的程度。如果序列的不同版本与不同时间的登录号相关联，则意指在本申请的有效提交日期与该登录号相关联的版本。有效提交日期是指实际提交日期或提及登记号的优先权申请的提交日期(在适用情况下)中较早的日期。同样，如果出版物、网站等的不同版本在不同时间发布，除非另有说明，否则指在申请的有效提交日期最近发布的版本。如本文所述的任何特征、步骤、元件、实施例或方面都可以与任何其它特征、步骤、元件、实施例或方面结合使用，除非另有具体说明。尽管为了清楚和理解起见，已通过图解和示例方式详细地对实施例进行了描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。

实施例清单

本文所公开的主题包含但不限于以下实施例。

1.一种表达载体，其包括SEQ ID NO:1的核酸序列。

2.一种表达载体，其包括对多肽进行编码的核酸，所述多肽包括与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸。

3.根据实施例2所述的表达载体，其中所述多肽包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

4.根据实施例2或3所述的表达载体，其中所述核酸包括与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

5.根据实施例4所述的表达载体，其中所述核酸包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列。

6.根据实施例4或5所述的表达载体，其中所述核酸可操作地连接到编码P2A转译修饰元件的核酸和编码融合到至少一种抗原的FLT-3L肽的核酸。

7.根据实施例6所述的表达载体，其中所述抗原选自由以下组成的组：NYESO-1、OVA、RNEU、MAGE-A1、MAGE-A2、Mage-A10、SSX-2、Melan-A、MART-1、Tyr、Gp100、LAGE-1、生存素、PRS pan-DR、CEA肽CAP-1、OVA、HCV-NS3、TERT、WT1、PSMA和HPV疫苗肽。

8.根据实施例7所述的表达载体，其中所述抗原为NYESO-1。

9.根据实施例2到8中任一项所述的表达载体，其中所述核酸可操作地连接到CMV启动子。

10.根据实施例2到9中任一项所述的表达载体，其中所述多肽包括与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

11.根据实施例10所述的表达载体，其中所述多肽包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

12.根据实施例10或11所述的表达载体，其中所述核酸包括与SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

13.根据实施例12所述的表达载体，其中所述核酸包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列。

14.根据实施例12或13所述的表达载体，其中所述核酸可操作地连接到CMV启动子。

15.根据实施例14所述的表达载体，其中所述表达载体包括与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

16.根据实施例15所述的表达载体，其中所述表达载体包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列。

17.一种治疗受试者的肿瘤的方法，其包括使用至少一种瘤内电穿孔脉冲将实施例1到16中任一项所述的表达载体递送到肿瘤中。

18.根据实施例17所述的方法，其中所述瘤内电穿孔脉冲的场强为约200V/cm到约1500V/cm。

19.根据实施例17或18所述的方法，其中所述受试者为人。

20.根据实施例17到19中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：黑色素瘤、三阴性乳腺癌、梅克尔细胞癌、CTCL和头颈部鳞状细胞癌。

21.根据实施例17到20中任一项所述的方法，其中所述电穿孔脉冲通过具有电化学阻抗谱功能的发生器递送。

22.一种治疗受试者的肿瘤的方法，其包括施用递送包括以下的表达载体的至少一种低电压瘤内电穿孔(IT-EP)治疗：

a.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的核苷酸序列；

b.与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列；

c.对包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽进行编码的核苷酸序列；或

d.对与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽进行编码的核苷酸序列。

23.根据实施例22所述的方法，其中所述IT-EP治疗包括约200V/cm到约500V/cm的场强和约100微秒到约50微秒的脉冲长度。

24.根据实施例23所述的方法，其中所述治疗为一种IT-EP治疗并且包括约350-450V/cm的场强和约10微秒的脉冲长度。

25.根据实施例24所述的方法，其中所述治疗为一种IT-EP治疗并且包括约400V/cm的场强和约10微秒的脉冲长度。

26.根据实施例17至25中任一项所述的方法，其中所述治疗包括1到10个10微秒电穿孔脉冲。

27.根据实施例26所述的方法，其中所述治疗包括5到10个10微秒电穿孔脉冲。

28.根据实施例27所述的方法，其中所述治疗包括8个10微秒电穿孔脉冲。

29.根据实施例22到28中任一项所述的方法，其中与使用编码含有IRES基序的质粒的IL-12进行低电压IT-EP治疗相比，所述治疗产生以下结果中的一项或多项或全部：

a.IL-12的瘤内表达高至少3.6倍；

b.经过治疗的肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；

c.未经治疗的对侧肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；

d.淋巴细胞流入到所述肿瘤中的量更大；

e.循环肿瘤特异性CD8+T细胞增加；

f.所述肿瘤中淋巴细胞和单核细胞表面标志物表达增加；以及

g.表23和24中INF-g相关基因的mRNA水平升高。

30.根据实施例1到16中任一项所述的用于治疗受试者的肿瘤的表达载体，其中治疗包括使用至少一种瘤内电穿孔脉冲将所述表达载体递送到所述肿瘤中。

31.根据实施例30所述的表达载体，其中所述瘤内电穿孔脉冲包括至少一种低电压瘤内电穿孔(IT-EP)治疗。

32.根据实施例31所述的表达载体，其中所述IT-EP治疗包括200V/cm到500V/cm的场强和约100微秒到约50毫秒的脉冲长度。

33.根据实施例32所述的表达载体，其中所述治疗为一种IT-EP治疗并且包括350到450V/cm的场强和约10毫秒的脉冲长度。

34.根据实施例33所述的表达载体，其中所述治疗为一种IT-EP治疗并且包括约400V/cm的场强和约10毫秒的脉冲长度。

35.根据实施例30到34中任一项所述的表达载体，其中所述治疗包括1到10个10毫秒电穿孔脉冲。

36.根据实施例35所述的表达载体，其中所述治疗包括5到10个10毫秒电穿孔脉冲。

37.根据实施例36所述的表达载体，其中所述治疗包括8个10毫秒电穿孔脉冲。

38.一种表达质粒，其包括多个由以下公式定义的表达盒：

P–A–T–A'–T–B

其中：

a)P为人CMV启动子；

b)A和A'分别为白细胞介素-12(IL-12)p35和p40；

c)B为融合到表1中至少一种抗原的FLT-3L；以及

d)T为P2A转译修饰元件。

39.根据实施例38所述的表达载体，其中所述抗原选自由以下组成的组：NYESO-1、OVA、RNEU、MAGE-A1、MAGE-A2、Mage-A10、SSX-2、Melan-A、MART-1、Tyr、Gp100、LAGE-1、存活素、PRS pan-DR、CEA肽CAP-1、OVA、HCV-NS3、TERT、WT1、PSMA和HPV疫苗肽。

40.根据实施例39所述的表达载体，其中所述抗原为NYESO-1。

41.根据实施例38所述的表达载体，其包括SEQ ID NO:1的核酸序列。

42.一种治疗受试者的肿瘤的方法，其包括使用至少一种瘤内电穿孔脉冲将实施例38到41中任一项所述的表达质粒递送到肿瘤中。

43.根据实施例42所述的方法，其中所述瘤内电穿孔脉冲的场强为约200V/cm到1500V/cm。

44.根据实施例42或43所述的方法，其中所述受试者为人。

45.根据实施例42到44中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：黑色素瘤、三阴性乳腺癌、梅克尔细胞癌、CTCL和头颈部鳞状细胞癌。

46.根据实施例42到45中任一项所述的方法，其中所述电穿孔脉冲通过具有电化学阻抗谱功能的发生器递送。

47.一种在受试者体内治疗肿瘤的方法，其包括至少一种低电压瘤内电穿孔(IT-EP)治疗，该治疗递送编码白细胞介素12(IL-12)的表达质粒，其中该质粒包含P2A外显子跳跃基序。

48.根据实施例47所述的方法，其中所述IT-EP治疗包括200V/cm到500V/cm的场强和约100微秒到约50毫秒的脉冲长度。

49.根据实施例48所述的方法，其中所述治疗为一种IT-EP治疗并且包括至少400V/cm的场强和约10毫秒的脉冲长度。

50.根据实施例47到49中任一项所述的方法，其中含有P2A的IL-12编码质粒的所述低压IT-EP治疗与包含IRES基序的IL-12编码质粒的低压IT-EP治疗相比包括以下中的至少一项：

a)IL-12的肿瘤内表达至少高3.6倍；

b)经过治疗的肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；

c)未经治疗的对侧肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；

d)淋巴细胞流入肿瘤的量更大；

e)循环肿瘤特异性CD8+T细胞增加；

f)所述肿瘤中淋巴细胞和单核细胞表面标志物表达增加；以及

g)表23和24中INF-g相关基因的mRNA水平升高。

序列标识符

表31.序列标识符表

以上提供的实施例和项现用以下非限制性实例进行说明。

实例

I.通用方法

描述了分子生物学中的标准方法。Maniatis等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)》(1982),冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州；Sambrook和Russell，《分子克隆(Molecular Cloning)》(2001),第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州；Wu，《重组DNA(Recombinant DNA)》(1993),第217卷,学术出版社(Academic Press),圣地亚哥,加利福尼亚。以下文献还描述了标准方法：Ausbel等人,《分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(2001),第1到4卷,约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons,Inc.),纽约,纽约州，所述文献描述了细菌细胞和DNA诱变的克隆(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。

描述了用于蛋白质纯化的方法，包含免疫沉淀法、色谱法、电泳法、离心法和结晶法。Coligan等人,《蛋白质科学实验室指南(Current Protocols in Protein Science)》(2000),第1卷,约翰·威利父子出版公司,纽约。描述了化学分析、化学修饰、转译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化。参见例如Coligan等人(2000)《蛋白质科学实验室指南》,第2卷,约翰·威利父子出版公司,纽约；Ausubel等人,《分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(2001),第3卷,约翰·威利父子出版公司,纽约,纽约州,第16.0.5-16.22.17页；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Co.)，《生命科学研究用产品(Products for Life Science Research)》(2001),圣路易斯,马萨诸塞州；第45-89页；安玛西亚法玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)，《生物目录(BioDirectory)》(2001),皮斯卡塔韦,新泽西州,第384-391页。描述了多克隆抗体和单克隆抗体的生产、纯化和裂解。Coligan等人,《免疫学实验室指南(Current Protocols inImmunology)》(2001),第1卷,约翰·威利父子出版公司,纽约；Harlow和Lane，《使用抗体(Using Antibodies)》(1999),冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约；Harlow和Lane,同上。可利用用于表征配体/受体相互作用的标准技术。参见例如Coligan等人,《免疫学实验室指南》(2001),第4卷,约翰·威利父子出版公司,纽约。

可利用包含荧光活化细胞分选检测系统

在内的用于流式细胞术的方法。参见例如Owens等人,《临床实验室实践用流式细胞术原理(Flow CytometryPrinciples for Clinical Laboratory Practice)》(1994),约翰·威利父子出版公司,霍博肯,新泽西州；Givan，《流式细胞术(Flow Cytometry)》(2001),第2版；威利-里斯公司(Wiley-Liss),霍博肯,新泽西州；Shapiro，《实用流式细胞术(Practical FlowCytometry)》(2003),约翰·威利父子出版公司,霍博肯,新泽西州。可利用适用于修饰核酸以例如用作诊断试剂的荧光试剂(包含核酸引物和探针、多肽和抗体)。《分子探针公司目录(2003)(Molecular Probes(2003)Catalogue)》,分子探针公司(Molecular Probes,Inc.),尤金,俄勒冈州；西格玛奥德里奇公司，《目录(Catalogue)》(2003),圣路易斯,密苏里州。

描述了免疫系统的组织学标准方法。参见例如Muller-Harmelink(编辑)，《人体胸腺：组织病理学和病理学(Human Thymus:Histopathology and Pathology)》(1986),斯普林格·维拉,纽约,纽约州；Hiatt等人,《组织学颜色图集(Color Atlas of Histology)》(2000),利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams,and Wilkins),费城,宾夕法尼亚州；路易斯等人,《基本组织学：文本和图集(Basic Histology:Text andAtlas)》(2002),麦格劳-希尔出版公司(McGraw-Hill),纽约,纽约州。

可利用用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库。参见例如GenBank,Vector

Suite(Informax公司，贝塞斯达,马里兰州)；GCG Wisconsin Package(Accelrys公司,圣地亚哥,加利福尼亚州)；

(TimeLogic公司,水晶湾,内华达州)；Menne等人,《生物信息学(Bioinformatics)》(2000),16:741-742；Menne等人,《生物信息学应用笔记(Bioinformatics Applications Note)》(2000),16:741-742；Wren等人,(2002)《生物医学的计算机方法与程序(Comput.ethods Programs Biomed.)》,68:177-181；von Heijne,(1983)《欧洲生物化学杂志(Eur..Biochem.)》,133:17-21；von Heijne，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》(1986),14:4683-4690。

II.将人IL-12p35和p40亚基亚克隆成pOMIP2A

pUMVC3主链购自Aldevron公司(法戈，北达科他州)。编码与hIL12p40(P2A-hIL12p40)框内连接的转译调节元件P2A的1071bp DNA片段(基因块)购自IDT(克拉尔维尔，爱荷华州)。使用Phusion聚合酶(新英格兰生物实验室(NEB)，伊普斯维奇，马萨诸塞州，目录号M0530S)对p40基因块进行PCR扩增，并使用标准限制内切酶配对和T4DNA连接酶(生命科技公司(Life Technologies)，格兰德岛，纽约州，目录号15224-017)将其连接到CMV启动子/增强子下游的pUMVC3。P2A-hIL12p40/pOMIP2A阳性克隆通过限制内切酶消化鉴定，并利用DNA测序验证。

从IDT(科拉尔维尔，爱荷华州)购买了人p35的789bp基因块，其中去除了内部BamH1、BglII和Xba1位点，以便于克隆。如上所述对p35基因块进行PCR扩增，并将其连接到P2A-hIL12p40/pOMIP2A中的p40基因块的上游。hIL12p35-P2A-p40/pOMIP2A阳性克隆通过限制内切酶消化鉴定，并利用DNA测序验证。

制备了含有报道基因的类似构建体，用于体内成像和离体流式细胞术。为了产生pOMI-Luc2p-P2A-mCherry，从pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro](普洛麦格公司(Promega))中PCR扩增了Luc2P，并从基因块片段(IDT)中扩增了mCherry。将经扩增的DNA片段纯化、酶切并连接到pUMVC3中。阳性克隆通过限制内切酶消化鉴定，并利用DNA测序验证。

III.FLT3L-抗原融合蛋白构建体的产生

已证明FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)可将抗原引导到抗原呈递细胞(APC)，以便优先呈递到T细胞(Kim等人,《自然通讯(Nat Comm.)》,2014；Kreiter等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,2011,71:6132)。可溶性分泌型FLT3L融合到多种蛋白或肽抗原(表1；Kim等人,《自然通讯(Nat Comm.)》,2014)。

给出了用于产生FLT3L-NY-ESO-1融合蛋白构建体的示例方案。从IDT获得三个基因块，每个基因块含有IgK信号肽序列，然后是FLT3L的ECD、一个短铰链区以及NY-ESO-1抗原的三个不同片段。使用PCR添加侧翼限制位点，并将这三种融合蛋白构建体引入pUMVC3。还将FLT3L融合到含有来自卵白蛋白基因的SIINFEKL肽抗原的3个肽的串联体，用于小鼠的临床前研究。将这些融合构建体从pUMVC3引入pOMIP2A(如下所述)。

使用相同的方法构建使用其它共有的肿瘤或病毒抗原的替代性融合蛋白(表1)。

除了能够鉴定出的共有肿瘤抗原外，还可以鉴定患者特异性新抗原，并且可以将针对该患者的免疫原性肽抗原融合到FLT3L，以通过瘤内电穿孔进行个人化的治疗(参见例如Beckhove等人,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》,2010,120:2230)。

所有免疫调节蛋白的形式都是使用小鼠同源序列平行构建的，并用于临床前研究。

IV.产生pOMI-2xP2A以用于从单个转录物表达三种蛋白质

针对IL-12异二聚体细胞因子和FLT3L-NY-ESO-1给出了示例亚克隆方案。用上游P2A位点和侧翼限制位点对编码FLT3L-NYSO-1的DNA基因块(IDT)进行PCR扩增，并将所述基因块连接在hIL-12p40的下游。进行Quikchange突变(安捷伦(Agilent)，圣克拉拉，美国)，以删除p40的终止位点3'。阳性克隆通过限制内切酶消化鉴定，并利用DNA测序验证。

可以使用相同的方法在多顺反子信息中已经存在的三个基因的上游或下游添加第四个基因。

V.pOMI-PIIM的产生

图1中示出了pOMI-PIIM质粒的示意图。OMI-PIIM代表OncoSec医疗股份有限公司—多顺反子IL-12免疫调节剂。所有三个基因均从同一个启动子表达，并带有中间的外显子跳跃基序，使得所有三种蛋白质都能从单个多顺反子信息中产生。

通过Kpn1限制内切酶消化将载体pUMVC3线性化。通过PCR从Aldevron公司(法戈，北达科他州)的临床hIL 12-IRES/pUMVC3质粒中扩增hIL12p35，其具有24bp重叠，所述重叠与线性化的pUMVC3的5'序列和3'部分P2A序列匹配。通过PCR从hIL12-2A/pUMVC3质粒(上文进行了描述)扩增hIL12p40，其具有5'P2A序列并且与线性化的pUMVC3重叠3'24bp。p35-P2A(部分)和P2A-p40PCR产物之间的序列重叠为14bp。按照制造商的建议(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)E2611S/L)对三个片段进行Gibson组装，并通过限制内切酶消化筛选hIL12-2A-seamless/pUMVC3的阳性克隆，并通过DNA测序进行验证。

随后，用Not1将该构建体酶切，使其在hIL12p40终止位点3'处线性化。使用hIL12～hFLT3L-NYESO1作为模板(上文进行了描述)，通过PCR扩增P2A-FLT3L-NYESO(80-180aa)，其与hIL12p40的末端重叠5'28bp(删除终止位点)，并与线性化pUMVC3重叠3'28bp。按照制造商的建议进行Gibson组装(新英格兰生物实验室E2611S/L)，并通过限制内切酶消化筛选hIL12～hFLT3L-NYESO(80-180aa)-无缝/pUMVC3的阳性克隆，并通过DNA测序进行验证(pOMI-PIIM，序列ID#1)。

产生了无法结合FLT3受体的突变形式的FLT3L，作为功能研究的对照物(Graddis等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem)》(1998),273:17626)。如Graddis所述(同上)，使用Quikchange突变(安捷伦，圣克拉拉，美国)产生点突变，并以pOMI-PIIM作为模板。

同时，用小鼠IL-12构建了pOMI-PIIM的一个形式，用于临床前研究。

VI.ELISA

根据制造商的建议，使用TransIT LT-1(Mirus公司，麦迪逊，威斯康星州，目录号MIR 2300)将pUMVC3-IL12(Aldevron公司，法戈，北达科他州)和pOMI-IL12P2A转染到HEK293细胞中。两天后，收集上清液并以3000rpm的转速旋转5分钟，以除去细胞碎片。将澄清的上清液等分并在-86℃下冷冻。使用特异性检测复合物的ELISA(研发系统公司(R&DSystems)，明尼阿波利斯，明尼苏达州，目录号DY1270)对条件培养基中的hIL-12p70异二聚体蛋白的水平进行定量。

表4：转染pOMI-IL12P2A和pUMVC3-IL12的细胞培养上清液中hIL-12p70蛋白的相对表达

质粒	hIL-12p70(ng/ml)平均值+/-SEM n＝2
		无转染对照物	2.0+/-2.0
pUMVC3-hIL12	442.4+/-181.6
		pOMI-IL12P2A	1603.4+/-77.4

对于给定数量的经转染质粒，pOMI-IL12P2A产生的人IL12p70分泌蛋白比培养上清液中的pUMVC3-IL12多3.6倍。

根据制造商的建议，使用TransIT LT-1(Mirus公司，麦迪逊，威斯康星州，目录MIR2300)将pOMI-PIIM的克隆转染到HEK293细胞中。两天后，收集上清液并以3000rpm的转速旋转5分钟，以除去细胞碎片。将澄清的上清液转移到新试管中，等分并在-86℃下冷冻。使用特异性检测复合物的ELISA(研发系统公司(R&D Systems)，明尼阿波利斯，明尼苏达州，目录号DY1270)对条件培养基中的hIL-12p70异二聚体蛋白的水平进行定量。使用抗FLT3L抗体(研发系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州，目录号DY308)通过ELISA对FLT3L-NYESO-1融合蛋白的水平进行定量。

从转染pOMI-PIIM的细胞中产生了大量的p70IL-12和FLT3L融合蛋白(表5)。

表5：通过ELISA测定了转染pOMI-PIIM的细胞中IL-12p70和FLT3L-NYESO1融合蛋白的表达和分泌，并将其示出。

分泌蛋白	ng/ml；平均值+/-SEM
		IL-12p70	1364+/-5.5
FLT3L-NY-ESO-1融合蛋白	25.1+/-3.1

VII.体外功能测定

使用HEK-Blue细胞测试来自表达pOMI-IL12P2A和pOMI-PIIM的细胞的组织培养上清液的功能性IL-12p70的表达。将这些细胞改造用于表达人IL-12受体和STAT4驱动的分泌型碱性磷酸酶。

该报道基因测定按照制造商方案(HEK-Blue IL-12细胞，InvivoGen公司，目录号hkb-il12)进行。根据制造商的方案(Quanti-Blue，InvivoGen公司，目录号rep-qbl)测量分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达。

在该测定中，比较了来自转染相同量的人pOMI-IL12P2A或pUMVC3-IL12(Aldevron公司)的HEK293细胞的培养上清液的不同稀释度。pOMI-IL12P2A样品的平均EC50降低了2倍以上(n＝3，曼-惠特尼(Mann-Whitney)；**p<0.01)。这些数据表明，对于给定剂量的质粒，pOMI-IL12P2A与pUMVC3-IL12相比，可产生更多功能性人IL-12p70蛋白。

从pOMI-PIIM多顺反子载体表达和分泌的IL-12p70蛋白在诱导SEAP蛋白中也表现出较强的活性(图2)。这种活性与rhIL-12蛋白对照物相当，并被中和的IL-12抗体(研发系统公司；AB-219-NA)阻断(图2)。

测试从pOMIP2A载体表达并分泌到HEK 293细胞培养基中的人FLT3L和FLT3L-NYESO1融合蛋白,以与在THP-1单核细胞表面表达的FLT3受体结合。

使用Mirus公司TransIT LT-1用pOMIP2A-hFLT3L或pOMIP2A-hFLT3L-NYESO1(80-180aa)转染HEK细胞。72小时后收集上清液。使用hFLT3L ELISA(研发系统公司，目录号DY308)对分泌的FLT3L蛋白的量进行定量。

将THP-1单核细胞系在RPMI+10％FBS+1％P/S(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，目录号TIB-202)中培养。在每个实验中，将750,000个THP-1细胞在Fc缓冲液(PBS+5％经过滤FBS+0.1％NaN3)中洗涤，用人Fc阻断剂(TruStain FcX公司，Biolegend 422301)将这些细胞预孵育10分钟，然后用150ng重组hFLT3L-Fc(研发系统公司，目录号AAA17999.1)或用含有150ng hFLT3L或hFLT3L-NYESO1蛋白的HEK 293条件培养基孵育，并且在4℃下孵育1小时。然后在Fc缓冲液中洗涤细胞，并用生物素化的抗hFLT3L抗体(研发系统公司，目录号BAF308)将这些细胞孵育1小时。然后在Fc缓冲液中洗涤细胞，并用链菌素-AlexaFluor-6472Ab(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher)，编号S32357)将这些细胞孵育1小时。再次洗涤细胞，并在Red-R通道上使用Guava 12HT细胞仪(密理博公司(Millipore))通过流式细胞术对这些细胞进行分析。还测试了不表达FLT3受体的HEK 293细胞，作为阴性对照物。

表6：分泌型重组FLT3配体蛋白与THP-1单核细胞表面的FLT3受体结合

超过90％的THP-1细胞显示出平均荧光强度增加，其中hFLT3L和hFLT3L-NYESO1融合蛋白均由pOMIP2A载体表达，表明这些重组蛋白与细胞表面的FLT3受体有效结合(表6)。

为了进一步测试重组FLT3L蛋白的功能，使用HEK 293条件培养基测试小鼠脾细胞中树突状细胞成熟的诱导。

将荷B16-F10肿瘤的C58/BL6小鼠的脾脏切除。在无菌条件下，将脾脏在DMEM培养基中置入70微米细胞过滤器(美天旎生物技术有限公司(Miltenyi))中，并使用3ml注射器中的柱塞橡胶尖端进行机械分离。一旦脾脏完全分离，使用10ml含10％FBS(PFB)的HBSS和冲洗过滤器。将流过液(flow-though)在离心机中以300xg旋转10分钟，以沉淀细胞。用PFB将细胞洗涤一次。根据制造商的说明(赛默飞世尔科技公司，A1049201)，用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。通过40微米的细胞过滤器将细胞过滤到15ml锥形管中，并在离心机中以300xg的速度旋转。将脾脏单细胞悬液重新悬浮在完整的RPMI-10培养基中。将150万个脾细胞接种在12孔板中，并使其粘附在板上约3小时。除去非贴壁细胞，加入2ml含小鼠GMCSF(100ng/ml)和小鼠IL-4(50ng/ml)的RPMI-10完全培养基。培养基在一周内每2天更换一次。用1mlHEK 293调节的上清液(含有100ng/ml Flt3L-NYESO1融合蛋白)在将贴壁的树突细胞在三孔中处理7天。将100ng人FLT3配体重组蛋白作为阳性对照物进行比较(研发系统公司，AAA17999.1)。轻轻地从板上将细胞刮下，并通过流式细胞术分析确定CD11c⁺细胞的数目。

当将CD3(-)CD11c(+)树突状细胞的数量列表时，来自转染pOMI-FLT3L-NYESO1质粒的细胞的条件培养基与用来自未转染细胞的条件培养基孵育的脾细胞相比这些细胞的数量显著增加。

这一结果表明FLT3L-NYESO1融合蛋白可以在小鼠脾细胞体外刺激FLT3受体介导的树突状细胞成熟。

VIII.肿瘤和小鼠

从杰克逊实验室(Jackson Laboratories)获得6到8周龄的雌性C57Bl/6J或Balb/c小鼠并且根据AALAM指南进行饲养。

用McCoy的5A培养基(2mM左旋谷酰胺)(添加10％FBS和50μg/ml庆大霉素)来培养B16-F10细胞。用0.25％的胰蛋白酶收获细胞，并将其重新悬浮在汉克氏(Hank's)平衡盐溶液(HBSS)中。将1百万个细胞(总体积为0.1ml)皮下注射到已麻醉的小鼠中的每个小鼠的右胁腹。将25万个细胞(总体积为0.1ml)皮下注射到每个小鼠的左胁腹。

从第8天开始，通过数字卡尺测量结果监测肿瘤生长，直到平均肿瘤体积达到约100mm³。一旦肿瘤发展到所需的体积，就将肿瘤非常大或非常小的小鼠处死。将剩余的小鼠分为每10个小鼠一组，按照植入右胁腹的肿瘤体积随机分组。

对另外的肿瘤细胞类型进行了测试，包括C57Bl/6J小鼠中的B16OVA以及Balb/c小鼠中的CT26和4T1。

将这个方案用作用于同时测试对经过治疗的肿瘤(原发性)的影响和未经治疗的肿瘤(对侧的)的影响的标准模型。在携带4T1肿瘤的Balb/c小鼠中也对肺转移瘤进行了定量。

IX.瘤内治疗

用异氟烷将小鼠麻醉以进行治疗。在0.9％无菌盐水中将环状质粒DNA稀释到1μg/μl。使用具有26Ga针头的1ml注射器将50μl的质粒DNA集中注射到原发性肿瘤中。注射后立即进行电穿孔。使用脉冲发生器(Medpulser)以临床电穿孔参数1500V/cm、100微秒脉冲、0.5cm、6针电极来实现DNA电穿孔。使用BTX发生器或结合阻抗谱的发生器使用的替代性参数是400V/cm、10毫秒脉冲，如上文所述。肿瘤体积每周测量两次。当原发性肿瘤和对侧肿瘤的总肿瘤负荷达到2000mm³时，对小鼠实施安乐死。

X.瘤内表达

体内成像。使用光学成像系统(Lago，Spectral Instruments公司)来量化预先使用pOMI-Luc2p-P2A-mCherry质粒治疗的肿瘤的发光(luminescence)。在不同的时间点对小鼠进行成像。用含2％异氟醚的500ml/min的氧气将动物麻醉以进行成像。一旦将小鼠麻醉，用27号注射器通过腹膜内注射施用200μl在无菌D-PBS中制备的15mg/ml D-萤光素(GoldBio)溶液。然后将动物转移到加热到37℃的麻醉歧管中，在歧管中小鼠继续接受含2％异氟烷的500ml/min的氧气。注射后20分钟，在冷却至-90℃的条件下通过用CCD相机拍摄5秒来获得发光图像。通过使用半径为0.5cm的关注区域(AmiView，Spectral Instruments公司)进行后处理来确定从每个肿瘤发射的总光子数。

表7：在1500V/cm、6个0.1毫秒脉冲与400V/cm、8个10毫秒脉冲下电穿孔48小时后肿瘤中荧光素酶的相对表达

如利用体内成像所见，在低压条件下引入具有EP的pOMI-Luc2p-P2A-mCherry质粒使得电穿孔肿瘤中萤光素酶的活性水平提高近10倍(表7)。

将肿瘤分离以进行流式细胞术分析从B16-F10肿瘤制备单细胞悬液。用CO₂将小鼠处死，小心地将肿瘤切下，留下皮肤和非肿瘤组织。将切除的肿瘤保存在冰冷的HBSS(Gibco公司)中以进行进一步处理。将肿瘤切碎，并在37℃温和搅拌下将肿瘤在5ml含有1.25mg/ml胶原酶IV、0.125mg/ml透明质酸酶和25U/ml DNase IV的HBSS中孵育20-30分钟。酶解后，使悬浮液通过40μm尼龙细胞过滤器(康宁公司(Corning))，并用ACK裂解缓冲液(质量生物公司(Quality Biological))将红细胞除去。将单细胞用离心沉淀的PBS流动缓冲液(PFB：含2％FCS和1mM EDTA的PBS(不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺))洗涤，并在PFB中重新悬浮，以立即进行流式细胞分析。

表8：用流式细胞术观察到的在IT-EP48小时后表达RFP(mCherry)蛋白的分离的肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的相对百分比

瘤内治疗	所有活细胞的RFP<sup>+</sup>细胞百分比
		未经治疗对照物	0.00+/-0.00
OMI-Luc2p-P2A-mCherry/无EP	0.24+/-0.03
		OMI-Luc2p-P2A-mCherry/EP 1500V/cm 0.1ms	2.04+/-0.53
OMI-Luc2p-P2A-mCherry/EP 400V/cm 10ms	8.16+/-0.92

如使用RFP报道基因所观察到的，高电压条件使得约2％的肿瘤细胞表达该蛋白，而低电压、较长脉冲条件使得大于8％的细胞表达所述蛋白。低电压条件下的百分比接近病毒载体的转导效率(Currier,M.A.等人,《癌症基因治疗(Cancer Gene Ther)》,12,407-416,doi:10.1038/sj.cgt.7700799(2005)。

将肿瘤裂解以提取蛋白质在IT-EP(400v/cm，8个10ms脉冲)后的1天、2天或7天，从处死的小鼠中分离肿瘤组织以确定转基因的表达。从小鼠体内解剖肿瘤，然后转移到处于液氮中的冷冻管中。将冷冻的肿瘤转移到含有300μL肿瘤裂解缓冲液(50mM TRIS pH 7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5％的曲通(Triton)X-100、蛋白酶抑制剂混合物)的4ml的试管中，将该试管置于冰上并均质化30秒(LabGen 710均质器)。将裂解液转移到1.5ml离心管中，在4℃下以10,000x g转速旋转10分钟。将上清液转移到新试管中。将旋转和转移步骤重复三遍。立即根据制造商的说明(小鼠细胞因子/趋化因子磁珠面板MCYTOMAG-70K，千孔虫)分析肿瘤提取物，或将其于-80℃下冷冻。通过标准ELISA方案(研发系统公司)使用用于捕获的抗FLT3L抗体(研发系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州，目录号DY308)和用于检测的卵清蛋白抗体(赛默飞世尔科技公司，目录号PA1-196)检测重组Flt3L-OVA蛋白。

表9：在低压条件下电穿孔编码hIL-12的pOMI多顺反子质粒后hIL-12细胞因子的瘤内表达

为了测试FLT3L追踪抗原融合蛋白的表达和功能，构建了FLT3L(胞外域)和来自卵白蛋白基因的肽在OMIP2A载体中的融合体，并如上所述进行了肿瘤内电穿孔。

表10：通过ELISA分析(n＝8)的在低电压条件下电穿孔2天后FLT3L-OVA融合蛋白(具有共有肿瘤抗原的基因佐剂)的瘤内表达

在对含有免疫调节蛋白的小鼠同源物的pOMIP2A载体进行瘤内电穿孔后，通过ELISA可以在肿瘤匀浆中检测到大量的IL-12p70(表9)和FLT3L-OVA重组蛋白(表10)。

XI.肿瘤消退

并行产生包含小鼠Il-12的OMIP2A质粒，并用于在临床前小鼠模型中根据肿瘤消退和宿主免疫系统的变化测试体内生物活性。

将上述用于在相对的胁腹上创建具有两个肿瘤的小鼠的方案用作用于同时测试对经过治疗的肿瘤(原发性)的影响和未经治疗的肿瘤(对侧的)的影响的标准模型。在携带4T1肿瘤的Balb/c小鼠中也对肺转移瘤进行了定量。

表11：在肿瘤细胞接种后第8天、第12天和第15天注射50μg pOMI-IL12P2A、注射50μg pUMVC3-IL12(Aldevron公司)与注射50μg pUMVC3对照质粒并以1500伏/厘米、6个0.1毫秒脉冲进行IT-EP后原发性(经过治疗)和对侧(远侧未经治疗)肿瘤的B16-F10肿瘤消退的比较。

表11中的数据表明，与在高电压下使用内部核糖体进入位点(IRES)相比，使用新的质粒设计的表达带有P2A外显子跳跃基序的IL12亚基的IT-EP正如预期的以更有效的表达更好地控制了肿瘤生长(经过治疗的原发性肿瘤和远侧未经治疗的肿瘤)(表4)。

表12：在肿瘤细胞接种后第8天、第12天和第15天以1500伏/厘米、6个0.1毫秒脉冲与以400伏/厘米、8个10毫秒脉冲进行IT-EP后原发性肿瘤和远侧肿瘤的B16-F10肿瘤消退的比较

表12中的数据表明，当在较低的电压、较长的脉冲条件下进行电穿孔时，在经电穿孔的肿瘤病变和远侧未经治疗的病变中观察到对肿瘤生长的更好的抑制(尤其是在远侧未经治疗的肿瘤中)。这些数据表明，与更高的电压、更短的脉冲条件相比，产生了更好的全身性肿瘤免疫力。

使用新的质粒设计和较低电压的EP参数，在肿瘤细胞接种后第10天仅施用一剂后测试了不同剂量的pOMI-IL12P2A质粒。

表13：使用不同剂量的OMI-mIL12P2A进行IT-EP后原发性肿瘤和远侧肿瘤的B16-F10肿瘤消退。植入后10天，使用针灸针以400V/cm、8个10毫秒脉冲的参数进行一次电穿孔。

随着渐增剂量的pOMI-mIL12P2A质粒的电穿孔，原发性已经治疗的肿瘤和远侧未经治疗的肿瘤的消退更加显著。使用pOMI-IL12P2A，10μg质粒足以达到最大作效果，并且采用新的质粒设计和较低电压电穿孔条件进行单剂量治疗即可显著控制肿瘤生长。

表14：在对侧肿瘤回归模型中10μg pOMI-mIL12P2A/低压EP与10μg pUMVC3-IL12/高压EP的直接比较。肿瘤细胞接种后第10天对肿瘤进行一次治疗。

pIL12-P2A+低电压治疗的小鼠的原发性(经过治疗的)和对侧(未经治疗)肿瘤均显示出对肿瘤生长的抑制增强。具有统计学上显著的存活优势也反映了使用EP低电压的pOMI-IL12P2A的瘤内电穿孔的治疗效果的改善(直到研究结束使用pOMI-IL12P2A/低V 5/6只小鼠存活，而使用pUMVC3-IL12/高V1/6只小鼠存活)。

表14中的数据表明，在采用新的质粒设计以及优化的电穿孔参数的情况下，通过单次EP治疗就实现了显著的肿瘤生长控制以及全身肿瘤免疫(通过对对侧未经治疗肿瘤的影响测量)。

还测试了pOMI-mIL12P2A的IT-EP影响Balb/c小鼠的4T1原发性肿瘤生长和肺转移瘤的能力。

将一百万个4T1细胞皮下注射到小鼠的右胁腹中，并将25万个4T1细胞注射到左胁腹中。用空载体(pUMVC3，Aldevron公司)或pOMI-mIL12P2A对右胁较大的肿瘤进行IT-EP。每两天测量一次肿瘤体积，在第19天将小鼠处死，将肺切下并称重。

表15：在植入后第8天和第15天用针炙针以400V/cm、8个10毫秒脉冲电穿孔的小鼠的肺的原发性肿瘤生长和死后重量。在第17天测量原发性肿瘤体积，在第18天测量肺重量。

据报道全身IL-12治疗可以减少荷4T1肿瘤的小鼠的肺转移瘤(Shi等人,《免疫学杂志(J Immunol.)》,2004,172:4111)。研究结果表明，在该模型中，对肿瘤进行局部IT-EP治疗还减少了这些肿瘤细胞向肺的转移(表15)。

除了使B16F10肿瘤消退外，pOMI-mIL12P2A电穿孔还使得原发性(经过治疗的)和对侧(未经治疗的)B16OVA和CT26肿瘤消退。在4T1肿瘤模型中，原发性肿瘤在EP/pOMI-mIL12P2A后消退，并且小鼠的肺重量显著降低，表明肺转移瘤减少。表明OMI-mIL12P2A的IT-EP可以减少两种不同品系的小鼠在4种不同肿瘤模型中的肿瘤负担。

表16：在肿瘤细胞接种后的第7天和第14天以400V/cm和8个10毫秒脉冲瘤内电穿孔含有编码mIL-12和FLT3L-OVA基因的pOMIP2A质粒后经过治疗的和未经治疗的肿瘤的B16-F10肿瘤消退；显示了从第16天开始的肿瘤的测量值。

表17：在肿瘤细胞接种后的第7天以400V/cm和8个10毫秒脉冲进行pOMI-PIIM(含小鼠IL-12的形式)IT-EP后经过治疗的和未经治疗的肿瘤的B16-F10肿瘤消退；显示了从第15天开始的肿瘤的测量值。

表达小鼠IL-12p70和人FLT3L-NY-ESO-1融合蛋白的pOMI-PIIM的电穿孔仅用单次治疗就使原发性经过治疗肿瘤和远侧未经治疗肿瘤的生长显著降低(表17和图3)。

与电穿孔空载体对照物相比，通过电穿孔引入免疫调节基因的小鼠的原发和对侧肿瘤的体积均明显减少，这不仅表明在经过治疗的肿瘤微环境中具有局部作用，而且还提高了全身免疫力。

XII.流式细胞术

在IT-pIL12-EP治疗后的不同时间点将小鼠处死，并通过手术切除肿瘤和脾组织。

通过将脾按压通过70微米过滤器将脾细胞分离，然后进行红细胞裂解(RBC裂解缓冲液，VWR，420301OBL)和Lymphocyte(Cedarlane公司CL5035)分馏。用SIINFEKL-四聚体(MBL国际公司(MBL International)T03002)将淋巴细胞染色，之后用含有以下物质的抗体混合物对其进行染色：抗CD3(Biolegend公司100225)、抗CD4(Biolegend公司100451)、抗CD8a(Biolegend公司100742)、抗CD19(Biolegend公司115546)和活体染色剂(活-死水(live-dead Aqua)；赛默飞世尔科技公司L-34966)。将细胞固定并在LSR II流式细胞仪(贝克曼公司(Beckman))上进行分析。

使用用于肿瘤的Gentle-MACS(美天旎(Miltenyi)肿瘤分离试剂盒130-096-730，C试管，130-093-237)将肿瘤分离，并使用带加热器的Miltenyi gentleMACS^TM Octo分离器(130-096-427)将肿瘤均质化。将细胞在4℃下以800x g沉淀5分钟、重新悬浮于5mL PBS+2％FBS+1mM EDTA(PFB)中并且覆盖到5mL Lympholyte-M(Cedarlane公司)上。在室温下将Lymphocyte柱在离心机中在无制动的情况下以1500x g旋转20分钟。用PBF洗涤Lymphocyte层。用将细胞沉淀物轻轻地重新悬浮在500μL具有Fc阻断剂(BD生物科学公司(BDBiosciences)553142)的PFB中。在96孔板中，根据制造商的说明将细胞与代表B16OVA肿瘤中免疫优势抗原的SIINFEKL四聚体(MBL公司)溶液混合，并在室温下孵育10分钟。加入含有以下物质的抗体染色混合物并在室温下孵育30分钟：抗CD45-AF488(Biolegend公司100723)、抗CD3-BV785(Biolegend公司100232)、抗CD4-PE(eBioscience公司l2-0041)、抗CD8a-APC(eBioscience公司17-0081)、抗CD44-APC-Cy7(Biolegend公司103028)、抗CD19-BV711(Biolegend公司11555)、抗CD127(135010)、抗KLRG1(138419)。用PFB将细胞洗涤3次。在冰上将细胞固定在含有1％多聚甲醛的PFB中1分钟。用PFB将细胞洗涤两次并在黑暗中在4℃下保存。在LSR II流式细胞仪(贝克曼公司)上分析样品。

表18：与在高压条件下瘤内电穿孔pUMVC3-IL12相比在低压条件下瘤内电穿孔OMI-mIL12P2A后淋巴细胞流入原发性肿瘤的相对量(每组n＝5)。

除了减少肿瘤生长之外，pOMI-mIL12P2A/EP低V与pUMVC3-mIL12/EP高V相比还增加了淋巴细胞流入原发性经过治疗肿瘤的量，并降低了TIL人群中CD4+/CD8+的比率。

进一步在脾脏和远侧未经治疗的肿瘤中评估了pOMI-IL12P2A/EP低V治疗后的全身肿瘤免疫

表19：IT-pOMIP2A-mIL12-EP增加了经过治疗的荷B16OVA瘤小鼠的脾中的SIINFEKL-四聚体结合CD8+T细胞。在肿瘤细胞接种后的第10天，用0.5cm的针灸针以400V/cm、10毫秒脉冲、300毫秒脉冲频率对小鼠进行一次肿瘤内电穿孔(IT-EP)。

IT-pOMI-mIL12P2A-EP诱导针对来自B16OVA肿瘤中的主要抗原—卵白蛋白的SIINFEKL肽的循环CD8⁺T细胞增加。这些数据表明局部IL-12治疗可使小鼠产生全身性肿瘤免疫。

表20：OMI-mIL12P2A的瘤内电穿孔改变B16OVA远侧未经治疗的肿瘤的免疫环境。在细胞植入后第10天，用0.5cm针灸针以400V/cm、10微秒脉冲、300微秒脉冲频率对小鼠进行一次瘤内电穿孔(IT-EP)。示出了在治疗后18天测量的未经治疗的肿瘤中浸润性淋巴细胞(TIL)的组成。

将OMI-mIL12P2A电穿孔到原发性肿瘤中可以显著改变未经治疗的对侧肿瘤内的TIL的组成(表20)。这些结果表明，用OMI-mIL12P2A进行瘤内治疗可影响未经治疗肿瘤的免疫环境，表明局部治疗可以产生全身性抗肿瘤免疫响应。脾脏中肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞检测的增加(表19)、对侧肿瘤消退(表11、12、13、14)和肺转移瘤的减少(表15)证实了这一结论。

XIII.小鼠基因表达分析

用于分析通过pOMI-mIL12P2A质粒、pOMI-PIIM(小鼠IL-12版本)质粒和pOMI-FLT3L-NYESO1质粒的IT-EP诱导的原发性经过治疗的和远侧未经治疗的肿瘤中基因表达的变化。使用解剖刀小心地从小鼠收集肿瘤组织，并将其快速冷冻在液氮中。天平(梅特勒-托利多公司(Mettler Toledo)，型号ML54)将组织称重。将1ml Trizol(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)加入组织中，并使用探针均质器在冰上将其均质化。按照制造商的说明从Trizol中提取RNA。通过DNase(赛默飞世尔科技公司，目录号：EN0525)处理将污染的DNA除去。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)确定总RNA浓度。使用

技术进行基因表达图谱分析。简单来说，将50ng总RNA与

(小鼠免疫‘v1’表达Panel，

技术有限公司(

Technologies))在96℃下杂交过夜。此Panel通过图谱分析了561种免疫相关小鼠基因以及两种内置对照物：阳性对照物(在不同浓度下的加标RNA以评估总体测定性能)和15个阴性对照物(以将总RNA输入的差异归一化)。然后使用nCounter SPRINT^TM断面仪对杂交样品进行数字分析，以确定每种RNA的频率。使用nSolver^TM分析软件2.5包分析原始mRNA丰度频率。在这个过程中，使用了从管家基因的几何平均值、阴性对照物的平均值以及阳性对照物的几何平均值导出的归一化因子。

表21：pOMI-mIL12P2A的IT-EP使原发性肿瘤和远侧肿瘤两者中淋巴细胞表面标志物和单核细胞的细胞表面标志物的瘤内水平增加。治疗后7天获得的测量结果显示了经过治疗和未经治疗的小鼠数值的倍数变化。

表22：pOMI-mIL12P2A的IT-EP使原发性肿瘤和远侧肿瘤两者中INF-γ调节的基因的瘤内水平增加。示出了经过治疗的小鼠与未经治疗的小鼠的数值的倍数变化。

在pOMI-mIL12P2A电穿孔后，对4T1和MC-38肿瘤模型中原发性经过治疗的和未经治疗的肿瘤的提取物进行的另外的

基因表达分析显示，淋巴细胞和单核细胞表面标志物以及INF-γ调节的基因均相似地远侧上调，表明IL-12对肿瘤微环境的这些作用可推广到多种小鼠肿瘤模型。

流式细胞分析显示在进行pOMIP2A-mIL12的IT-EP的情况下肿瘤TIL稳健增加，对来自原发性、已治疗和远侧未经治疗肿瘤的组织的基因表达分析证实了这一点。另外，干扰素γ调节的基因的增加表明在肿瘤内诱导了免疫刺激环境。检查点蛋白表达的显著增加表明，IT-pOMI-mIL12P2A-EP可以将底物增加，以实现结合使用的检查点抑制剂的作用。

用pOMI-PIIM以400V/cm和8个10毫秒脉冲对B16-F10肿瘤进行瘤内电穿孔后7天，通过手术切除肿瘤并提取RNA，以用于分析由IL-12和FLT3L-NYESO1瘤内表达联合介导的基因表达变化。

表23：pOMI-PIIM的IT-EP使得原发性(经过治疗)肿瘤的淋巴细胞表面标志物和单核细胞表面标志物、INF-γ调节基因和抗原呈递机制的瘤内水平增加。治疗后7天获得的测量结果显示了经过治疗和未经治疗的小鼠数值的倍数变化。

在将用于表达多个基因的质粒电穿孔后，IL-12蛋白的瘤内表达仍然诱导与强适应性免疫应答相关的基因表达产生了显著变化。FLT3L-NYESO1融合蛋白瘤内表达的增加诱导了经过治疗的肿瘤中与抗原呈递相关的基因表达的显著增加。

表24：pOMI-PIIM的IT-EP使得远侧(未经治疗)肿瘤中的淋巴细胞表面标志物和单核细胞表面标志物、INF-γ调节基因的瘤内水平增加。示出了经过治疗的小鼠与未经治疗的小鼠的数值的倍数变化。

编码mIL-12和FLT3L-NYESO1两者的质粒的瘤内电穿孔显示瘤内基因表达发生显著变化，并且局部和全身抗肿瘤免疫力增强，并证实了该疗法对控制该小鼠模型内原发性经过治疗的和远侧未经治疗的肿瘤的生长具有较强效果(表17和图3)。

单独编码人FLT3L-NYESO1融合蛋白的OMI质粒的瘤内电穿孔对肿瘤消退和肿瘤TIL免疫表型的改变也有影响。

表25：pOMI-FLT3L-NYESO1质粒的IT-EP降低了肿瘤的生长质粒注射后，用针灸针以400V/cm、8个10毫秒脉冲对皮下B16-F10肿瘤进行一次电穿孔。显示了治疗后第6天的肿瘤测量值。

表26：在pOMI-FLT3L-NYESO1的IT-EP后通过肿瘤提取物中的

测量的经过治疗的肿瘤中INF-γ相关基因表达的变化。示出了经过治疗的小鼠与未经治疗的小鼠的数值的倍数变化。

表27：在pOMI-FLT3L-NYESO1的IT-EP后在经过治疗的肿瘤中检测(通过肿瘤提取物中的

测量)抗原呈递机制(APM)基因表达的变化。示出了经过治疗的小鼠与未经治疗的小鼠的数值的倍数变化。

表28：在pOMI-FLT3L-NYESO1的IT-EP后通过肿瘤提取物中的NanoString测量的经过治疗的肿瘤中共刺激基因表达的变化。示出了经过治疗的小鼠与未经治疗的小鼠的数值的倍数变化。

表29：在pOMI-FLT3L-NYESO1的IT-EP后通过肿瘤提取物中的

测量的经过治疗的肿瘤中T细胞相关基因表达和自然杀伤(NK)细胞相关基因表达的变化。示出了经过治疗的小鼠与未经治疗的小鼠的数值的倍数变化。

表达Flt3L-NYESO1融合蛋白的质粒的瘤内电穿孔显示了在没有IL-12共表达的情况下对免疫细胞和APM相关基因表达的可测量的影响，表明当通过IT-EP将Flt3L-NYESO1引入时Flt3L-NYSO1对瘤内免疫调节具有独立的影响(表26、27、28、29)。

XIV.通过流式细胞术检测宿主对追踪抗原的反应

为了测试宿主对编码融合到Flt3L的追踪抗原的质粒的电穿孔的反应，用pOMI-mIL12P2A-FLT3L-OVA对B16-F10肿瘤进行电穿孔，并测量宿主对OVA抗原的反应。在小鼠右胁腹注射了一百万个B16-F10细胞。七天后，用pOMI-mIL12P2A-FLT3L-OVA、空载体对肿瘤进行电穿孔或不对其进行治疗。使用具有电化学阻抗感测(EIS)(参见例如WO 2016161201)的发生器以400V/cm、8个10微秒脉冲进行电穿孔。与使用含有小鼠IL-12的pOMI-PIIM一样(表17)，在本实验中使用pOMI-mIL12P2A-FLT3L-OVA也观察到了肿瘤消退。

在将编码mIL12和FLT3L-OVA融合蛋白的质粒IT-EP入肿瘤后7天，在腹股沟淋巴结中检验小鼠中进行了抗原特异性CD8+T细胞的检测。

将小鼠处死；将腹股沟淋巴结切下，在PBS+2％FBS+1mM EDTA(PFB)中捣碎，然后通过70微米滤器将其过滤。在4℃下将细胞在离心机中以300x g沉淀，并在PFB中洗涤，并在Cellometer(Nexcelom公司)上计数。

将淋巴结细胞沉淀物轻轻地重新悬浮在具有Fc阻断剂(BD生物科学公司(BDBiosciences)553142)的PFB中。然后根据制造商的说明将细胞与SIINFEKL四聚体(MBL公司)溶液混合，并在室温下孵育10分钟。加入含有以下物质的抗体染色混合物并在室温下孵育30分钟：活/死水(Live/Dead Aqua)(赛默飞世尔科技公司L34966)、抗CD3(Biolegend公司100228)、抗CD19(Biolegend公司115555)、抗CD127(Biolegend公司)、抗CD8a(MBL公司D271-4)、抗CD44(Biolegend公司103028)、抗PD-1(Biolegend公司109110)、抗CD4(Biolegend公司100547)、抗KLRG1(138419)、抗CD62L(Biolegend公司104448)。用PFB洗涤细胞。用1％的多聚甲醛将细胞于冰上在PFB中固定1分钟。用PFB洗涤细胞3次，并通过流式细胞术(LSR Fortessa公司X-20)对其进行分析。

表30.pOMI-mIL12P2A-FLT3L-OVA(与进入B16-F10皮下肿瘤的pUMVC3空载体相比)的IT-EP后对卵清蛋白追踪抗原有反应的宿主T细胞的检测。

使用OVA作为小鼠中的替代追踪抗原证明了可以轻松检测到针对电穿孔入肿瘤作为FLT3L融合蛋白的所述追踪抗原的循环T细胞表30)。

XV.通过流体动力注射将质粒引入小鼠尾静脉

通过向C57Bl/6J小鼠的尾静脉内流体动力注射5μg质粒，测试了从OMI质粒表达的FLT3L融合蛋白的体内活性。七天后，将小鼠处死；将脾脏切下、称重并分离以通过流式细胞术分析细胞组成的变化。

将脾细胞如上所述分离，用PFB洗涤，重新悬浮在具有Fc阻断剂(BD生物科学公司(BD Biosciences)553142)的PFB中，并在室温下孵育10分钟。添加了包含以下物质的抗体混合物：抗NK1.1(Biolegend公司108731)、活/死水(赛默飞世尔科技公司L34966)、抗CD4(Biolegend公司100547)、抗F4/80(Biolegend公司123149)、抗CD19(Biolegend公司115555)、抗I-A/I-E(Biolegend公司107645)、抗CD8(MBL国际公司D271-4)、抗CD80(Biolegend公司104722)、抗CD3(Biolegend公司117308)、抗CD40(Biolegend公司124630)、抗GR-1(Biolegend公司108424)、抗CD11c(Biolegend公司117324)、抗CD86(Biolegend公司105024、抗CD11b(Biolegend公司101212)。在37℃下孵育。用PFB洗涤细胞3次，并通过流式细胞术(LSR Fortessa公司X-20)对其进行分析。

表31.全身暴露于通过尾静脉注射引入的pOMIP2A-FLT3L和pOMIP2A-FLT3L-NYESO1质粒的影响。

编码人FLT3L或融合到NY-ESO-1蛋白(80-180aa)的一部分的人FLT3L的质粒的引入使得脾脏CD11c⁺树突状细胞(DC)的增加(表31)。此外，这些DC中的大多数DC显示出高水平的II类MHC，表明这些DC是成熟的DC。此外，这些DC的一部分表现出较高水平的细胞表面CD86表达，表明这些DC已经激活。

这些数据与暴露于从这些质粒表达的活性FLT3配体并导致体内DC成熟和激活(Maraskovsky等人,(2000)《血液(Blood)》,96:878)相一致。

XVI.Flt3L融合蛋白在体外使人树突状细胞成熟

测试了从pOMI-PIIM表达的人Flt3L-NY-ESO1融合蛋白使离体培养的未成熟人DC成熟的能力。为了实现测试，使用标准方案(Pollack SM JR等人,(2013)《四聚体引导细胞分选仪辅助生产用于治疗滑膜肉瘤和粘液样圆形细胞脂肪肉瘤的NY-ESO-1特异性细胞(Tetramer Guided Cell Sorter Assisted Production of NY-ESO-1 Specific Cellsfor the Treatment of Synovial Sarcoma and Myxoid Round Cell Liposarcoma)》,结缔组织肿瘤学会会议(Connective Tissue Oncology Society Meeting))培养DC，首先从健康供体外周血单核细胞(PBMC)分离单核细胞，然后在治疗前将这些单核细胞在无血清培养基中用GM-CSF和IL-4培养5到7天。然后不对这些未成熟的DC进行处理，或用预先转染pOMI-PIIM、空阴性对照载体(EV)或具有用于表达Flt3L-NYESO1融合蛋白(其不能与Flt3结合，因此应该是无活性的(Flt3L-NY-ESO-1(H8R))的突变基因的载体以及用作阳性对照物的重组纯化的FLT3L的HEK 293细胞调节的培养基处理48小时。

将通过流式细胞术测量的CD80和CD86细胞表面标志物用作所有CD11c⁺DC-SIGN⁺细胞上FLT3L介导的DC活性的主要指标。与来自具有空载体或编码Flt3L(H8R)无活性突变体的载体的细胞的培养基相比，来自转染pOMI-PIIM的细胞的条件培养基诱导了明显更多的CD80和CD86(图4)。与用作阳性对照物的重组Flt3L蛋白相比，用pOMI-PIIM质粒转染的细胞的培养上清液具有相似的活性。重复这些研究以确保其具有再现性。与未处理的上清液相比，通过添加对照上清液(不含任何质粒衍生的蛋白)观察到了一些对CD80/CD86表达的非特异性诱导。

通过与Flt3L-NYESO转导的DC共培养来刺激NY-ESO-1特异性T细胞。使用转导的DC刺激预先建立的NY-ESO-1特异性CTL系(在第XVI节中进行了描述)，然后通过流式细胞术染色对细胞内细胞因子、TNFα和INF-γ进行了分析。这些数据表明，用质粒衍生的Flt3L-NY-ESO-1脉冲而不是用无活性突变体(Flt3L-NY-ESO-1(H8R))脉冲的DC能够激活NY-ESO-1特异性CTL系(图5)。

这些数据表明，从pOMI-PIIM表达的人Flt3L-NY-ESO1融合蛋白可以诱导原代未成熟人树突状细胞的成熟。

序列表

<110> 昂科赛克医疗公司

<120> 用于免疫调节蛋白表达的多基因构建体和其使用方法

<130> OM1702WO1 066914/516052

<150> 62/519,120

<151> 2017-06-13

<150> 62/582,917

<151> 2017-11-07

<150> 62/628,917

<151> 2018-02-09

<160> 4

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 6752

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 内含重组人基因序列的质粒序列

<400> 1

tggccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca 60

acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 120

tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 180

cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240

gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300

cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360

ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420

cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc 480

aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 540

aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc 600

gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct 660

cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 720

agacaccggg accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc 780

cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt 840

atgcatgcta tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg 900

tgatggtata gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctccaacggt 960

ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt tgctgccgcg cgcgccacca gacataatag 1020

ctgacagact aacagactgt tcctttccat gggtcttttc tgcagtcacc gtcgtcgacg 1080

gtatcgataa gcttgatatc gaattcacgt gggcccggta ccaccatgtg gccccctggg 1140

tcagcctccc agccaccgcc ctcacctgcc gcggccacag gtctgcatcc agcggctcgc 1200

cctgtgtccc tgcagtgccg gctcagcatg tgtccagcgc gcagcctcct ccttgtggct 1260

accctggtcc tcctggacca cctcagtttg gccagaaacc tccccgtggc cactccagac 1320

ccaggaatgt tcccatgcct tcaccactcc caaaacctgc tgagggccgt cagcaacatg 1380

ctccagaagg ccagacaaac tctagaattt tacccttgca cttctgaaga gattgatcat 1440

gaagatatca caaaagataa aaccagcaca gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc 1500

aagaatgaga gttgcctaaa ttccagagag acctctttca taactaatgg gagttgcctg 1560

gcctccagaa agacctcttt tatgatggcc ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg 1620

aagatgtacc aggtggagtt caagaccatg aatgcaaagc ttctgatgga tcctaagagg 1680

cagatctttc tagatcaaaa catgctggca gttattgatg agctgatgca ggccctgaat 1740

ttcaacagtg agactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact 1800

aaaatcaagc tctgcatact tcttcatgct ttcagaattc gggcagtgac tattgataga 1860

gtgatgagct atctgaatgc ttccggatct ggggccacca acttttcatt gctcaagcag 1920

gcgggcgatg tggaggaaaa ccctggcccc tgtcaccagc agttggtcat ctcttggttt 1980

tccctggttt ttctggcatc tcccctcgtg gccatatggg aactgaagaa agatgtttat 2040

gtcgtagaat tggattggta tccggatgcc cctggagaaa tggtggtcct cacctgtgac 2100

acccctgaag aagatggtat cacctggacc ttggaccaga gcagtgaggt cttaggctct 2160

ggcaaaaccc tgaccatcca agtcaaagag tttggagatg ctggccagta cacctgtcac 2220

aaaggaggcg aggttctaag ccattcgctc ctgctgcttc acaaaaagga agatggaatt 2280

tggtccactg atattttaaa ggaccagaaa gaacccaaaa ataagacctt tctaagatgc 2340

gaggccaaga attattctgg acgtttcacc tgctggtggc tgacgacaat cagtactgat 2400

ttgacattca gtgtcaaaag cagcagaggc tcttctgacc cccaaggggt gacgtgcgga 2460

gctgctacac tctctgcaga gagagtcaga ggggacaaca aggagtatga gtactcagtg 2520

gagtgccagg aggacagtgc ctgcccagct gctgaggaga gtctgcccat tgaggtcatg 2580

gtggatgccg ttcacaagct caagtatgaa aactacacca gcagcttctt catcagggac 2640

atcatcaaac ctgacccacc caagaacttg cagctgaagc cattaaagaa ttctcggcag 2700

gtggaggtca gctgggagta ccctgacacc tggagtactc cacattccta cttctccctg 2760

acattctgcg ttcaggtcca gggcaagagc aagagagaaa agaaagatag agtcttcacg 2820

gacaagacct cagccacggt catctgccgc aaaaatgcca gcattagcgt gcgggcccag 2880

gaccgctact atagctcatc ttggagcgaa tgggcatctg tgccctgcag tggatctggg 2940

gccaccaact tttcattgct caagcaggcg ggcgatgtgg aggaaaaccc tggccccgag 3000

acagacacac tcctgctatg ggtactgctg ctctgggttc caggttccac tggtgacact 3060

caggattgca gcttccagca ttcacccata tcatcagatt ttgcagtaaa gatcagggaa 3120

ctctccgatt atctccttca agactacccc gtaacagtgg cctccaattt gcaagacgaa 3180

gagctttgtg gtgccctctg gcggctcgtt ttggcccaaa ggtggatgga acggcttaag 3240

acagtcgctg gcagcaagat gcaagggttg ctcgaacgag tcaatacaga gatccatttt 3300

gtaaccaagt gtgcatttca accgccgcca agctgccttc gctttgttca gacgaatata 3360

agtagactgt tgcaggaaac ctccgagcaa ctcgtagccc tgaagccctg gattacacgg 3420

caaaatttca gtcggtgcct tgagcttcag tgtcagcctg atagtagtac cttgcctccg 3480

ccatggtccc ccaggcctct tgaagctaca gctccgacag cccctcagcc gggcagtagt 3540

ggtagttctg gagccagggg gccggagagc cgcctgcttg agttctacct cgccatgcct 3600

ttcgcgacac ccatggaagc agagctggcc cgcaggagcc tggcccagga tgccccaccg 3660

cttcccgtgc caggggtgct tctgaaggag ttcactgtgt ccggcaacat actgactatc 3720

cgactgactg ctgcagacca ccgccaactg cagctctcca tcagctcctg tctccagcag 3780

ctttccctgt tgatgtggat cacgcagtgc tttctgcccg tgtttttggc tcagcctccc 3840

tcagggcaga ggcgctaagg ccgcggatcc agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg 3900

ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat 3960

tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa 4020

tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg cccattcttc 4080

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 4140

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 4200

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 4260

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 4320

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 4380

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 4440

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 4500

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 4560

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 4620

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 4680

ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 4740

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 4800

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 4860

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 4920

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 4980

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 5040

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcg gggggggggg 5100

gcgctgaggt ctgcctcgtg aagaaggtgt tgctgactca taccaggcct gaatcgcccc 5160

atcatccagc cagaaagtga gggagccacg gttgatgaga gctttgttgt aggtggacca 5220

gttggtgatt ttgaactttt gctttgccac ggaacggtct gcgttgtcgg gaagatgcgt 5280

gatctgatcc ttcaactcag caaaagttcg atttattcaa caaagccgcc gtcccgtcaa 5340

gtcagcgtaa tgctctgcca gtgttacaac caattaacca attctgatta gaaaaactca 5400

tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga 5460

aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga 5520

tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc 5580

tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag 5640

aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg 5700

tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga 5760

cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc 5820

aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc 5880

tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg 5940

ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc 6000

tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca 6060

tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc 6120

catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac 6180

gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc cttgtattac tgtttatgta agcagacagt 6240

tttattgttc atgatgatat atttttatct tgtgcaatgt aacatcagag attttgagac 6300

acaacgtggc tttccccccc cccccattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 6360

agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 6420

ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 6480

aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 6540

tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 6600

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg 6660

gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc 6720

gtaaggagaa aataccgcat cagattggct at 6752

<210> 2

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人重组蛋白

<400> 2

Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala

1 5 10 15

Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg

20 25 30

Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val

35 40 45

Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro

50 55 60

Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg

65 70 75 80

Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr

85 90 95

Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys

100 105 110

Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu

115 120 125

Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys

130 135 140

Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser

145 150 155 160

Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn

165 170 175

Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn

180 185 190

Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser

195 200 205

Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys

210 215 220

Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala

225 230 235 240

Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Gly Ser Gly

245 250 255

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

260 265 270

Pro Gly

<210> 3

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 重组人蛋白

<400> 3

Pro Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu

1 5 10 15

Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val

20 25 30

Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu

35 40 45

Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln

50 55 60

Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys

65 70 75 80

Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val

85 90 95

Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp

100 105 110

Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe

115 120 125

Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp

130 135 140

Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser

165 170 175

Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu

180 185 190

Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile

195 200 205

Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr

210 215 220

Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn

225 230 235 240

Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp

245 250 255

Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr

260 265 270

Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg

275 280 285

Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala

290 295 300

Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser

305 310 315 320

Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser

325 330 335

Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

340 345

<210> 4

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 重组人蛋白

<400> 4

Pro Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile

20 25 30

Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu

35 40 45

Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu

50 55 60

Cys Gly Ala Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg

65 70 75 80

Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val

85 90 95

Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro

100 105 110

Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu

115 120 125

Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn

130 135 140

Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu

145 150 155 160

Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala

165 170 175

Pro Gln Pro Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser

180 185 190

Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu

195 200 205

Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro

210 215 220

Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu

225 230 235 240

Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile

245 250 255

Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys

260 265 270

Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg

275 280 285

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种表达载体，其包括SEQ ID NO:1的核酸序列。

2.一种表达载体，其包括与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，其中所述载体编码人IL12p35、人IL12 p40、FLT3L-NY-ESO以及至少一个P2A转译修饰元件。

3.一种表达载体，其包括由下式定义的表达盒：

P-A-T-A'-T–B

其中：

a)P是人CMV启动子；

b)A和A'分别是白细胞介素-12(IL-12)p35和p40；

c)B是融合到来自表1的至少一种抗原的FLT-3L、OVA、RNEU、Melan-A、LAGE-1、CEA肽CAP-1、TERT或HPV疫苗肽；以及

d)T是P2A转译修饰元件。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其中所述表达载体对包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽和包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽进行编码。

5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其中所述表达载体对包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽进行编码。

6.根据权利要求3到5中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少70％、72％、75％、78％、80％、82％、83％、85％、87％、88％、90％、92％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

7.根据权利要求3到4和6中任一项所述的表达载体，其中所述抗原选自由以下组成的组：NYESO-1、NY-ESO-1的氨基酸80-180、Ny-ESO-1的氨基酸157-165、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A10、SSX-2、MART-1、酪氨酸酶、Gp100、生存素、TERT、hTERT、WT1、PSMA、PRSpan-DR、B7-H6、HPV E7、HPV16 E6/E7、HPV11 E6、HPV6b/11E7、HCV-NS3、流感HA、流感NA、多瘤病毒MCPyV LTA、多瘤病毒VP1、多瘤病毒LTA、多瘤病毒STA、OVA、RNEU、Melan-A、LAGE-1、CEA肽CAP-1以及HPV疫苗肽，或其抗原肽。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其中所述抗原包含NYESO-1。

9.一种表达载体，其包括对可操作地连接到CMV启动子的异二聚体细胞因子IL-12进行编码的编码序列，其中所述表达载体对SEQ ID NO:2的氨基酸序列进行编码。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其中所述表达载体进一步编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

11.根据权利要求9或10所述的表达载体，其中所述表达载体进一步编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

12.根据权利要求1到11中任一项所述的表达载体，其用于治疗患有癌性肿瘤的受试者的方法中，所述方法包括使用至少一种瘤内电穿孔(IT-EP)治疗将所述表达载体递送至肿瘤中。

13.根据权利要求12所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述IT-EP治疗的场强为约200V/cm到约1500V/cm。

14.根据权利要求13所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述IT-EP治疗包括至少一种低电压IT-EP治疗。

15.根据权利要求14所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述IT-EP治疗包括200V/cm到500V/cm的场强和约100μs到约50ms的脉冲强度。

16.根据权利要求15所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述IT-EP治疗是一种IT-EP治疗并且包括350V/cm到450V/cm的场强和约10ms的脉冲强度。

17.根据权利要求16所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述IT-EP治疗是一种IT-EP治疗并且包括约400V/cm的场强和约10ms的脉冲强度。

18.根据权利要求12到17中任一项所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述治疗包括1到10个10ms电穿孔脉冲。

19.根据权利要求18所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述治疗包括5到10个10ms电穿孔脉冲。

20.根据权利要求19所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述治疗包括8个10ms电穿孔脉冲。

21.根据权利要求12到20中任一项所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述个体是人。

22.根据权利要求12到21中任一项所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：黑色素瘤、三阴性乳腺癌、梅克尔细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和头颈部鳞状细胞癌。

23.根据权利要求12到22中任一项所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述电穿孔脉冲通过能够产生电化学阻抗谱的发生器递送。

24.根据权利要求11到22中任一项所述的用于所述方法中的表达载体，其中与使用对含IRES基序的质粒进行编码的IL-12进行低电压瘤内电穿孔相比，所述治疗产生以下中的一种或多种或全部：

a.IL-12的瘤内表达高至少3.6倍；

b.经过治疗的肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；

c.未经治疗的对侧肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；

d.淋巴细胞流入到所述肿瘤中的量更大；

e.循环肿瘤特异性CD8+T细胞增加；

f.所述肿瘤中淋巴细胞和单核细胞表面标志物表达增加；以及

g.表23和24中INF-γ相关基因的mRNA水平增加。

25.根据权利要求11到24中任一项所述的用于所述方法中的表达载体，其中所述治疗进一步包含一种或多种另外的治疗剂，所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：抗癌药物、抗癌生物制剂、抗体、抗PD-1抑制剂、抗CTLA4拮抗剂Ab、肿瘤疫苗、抗PD1拮抗剂Ab、抗PDL1拮抗剂Ab、CTLA4激动剂抗体、CTLA4激动剂配体、肿瘤疫苗、治疗剂、博来霉素、5-氟-尿嘧啶、小分子抑制剂、伊马替尼、威罗菲尼、曲妥珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、雷帕霉素、硼替佐米、PI3K-AKT抑制剂、IAP抑制剂、放射。

26.一种治疗受试者的肿瘤的方法，其包括使用至少一种瘤内电穿孔脉冲将根据权利要求1到11中任一项所述的表达载体递送到所述肿瘤中。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述瘤内电穿孔脉冲的场强为约200V/cm到约1500V/cm。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述瘤内电穿孔脉冲的场强为约200V/cm到约500V/cm。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述受试者是人。

30.根据权利要求27到29中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自以下的组：黑色素瘤、三阴性乳腺癌、梅克尔细胞癌、CTCL和头颈部鳞状细胞癌。

31.根据权利要求17到20中任一项所述的方法，其中所述电穿孔脉冲通过能够产生电化学阻抗谱的发生器递送。

Claims (37)

1.一种表达载体，其包括SEQ ID NO:1的核酸序列。

2.一种表达载体，其包括对多肽进行编码的核酸，所述多肽包括与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其中所述多肽包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

4.根据权利要求2或3所述的表达载体，其中所述核酸包括与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其中所述核酸包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列。

6.根据权利要求4或5所述的表达载体，其中所述核酸可操作地连接到对P2A转译修饰元件进行编码的核酸和对融合到至少一种抗原的FLT-3L肽进行编码的核酸。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其中所述抗原选自由以下组成的组：NYESO-1、OVA、RNEU、MAGE-A1、MAGE-A2、Mage-A10、SSX-2、Melan-A、MART-1、Tyr、Gp100、LAGE-1、生存素、PRS pan-DR、CEA肽CAP-1、OVA、HCV-NS3、TERT、WT1、PSMA和HPV疫苗肽。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其中所述抗原为NYESO-1。

9.根据权利要求2到8中任一项所述的表达载体，其中所述核酸可操作地连接到CMV启动子。

10.根据权利要求2到9中任一项所述的表达载体，其中所述多肽包括与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

11.根据权利要求10所述的表达载体，其中所述多肽包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

12.根据权利要求10或11所述的表达载体，其中所述核酸包括与SEQ ID NO:10的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

13.根据权利要求12所述的表达载体，其中所述核酸包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列。

14.根据权利要求12或13所述的表达载体，其中所述核酸可操作地连接到CMV启动子。

15.根据权利要求14所述的表达载体，其中所述表达载体包括与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

16.根据权利要求15所述的表达载体，其中所述表达载体包括SEQ ID NO:12的核苷酸序列。

17.一种治疗受试者的肿瘤的方法，其包括使用至少一种瘤内电穿孔脉冲将根据权利要求1到16中任一项所述的表达载体递送到所述肿瘤中。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述瘤内电穿孔脉冲的场强为约200V/cm到约1500V/cm。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述受试者为人。

20.根据权利要求17到19中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：黑色素瘤、三阴性乳腺癌、梅克尔细胞癌、CTCL和头颈部鳞状细胞癌。

21.根据权利要求17到20中任一项所述的方法，其中所述电穿孔脉冲通过能够产生电化学阻抗谱的发生器递送。

22.一种治疗受试者的肿瘤的方法，其包括施用递送包括以下的表达载体的至少一种低电压瘤内电穿孔(IT-EP)治疗：

a.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的核苷酸序列；

b.与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列；

c.对包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的多肽进行编码的核苷酸序列；或

d.对与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽进行编码的核苷酸序列。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述IT-EP治疗包括约200V/cm到约500V/cm的场强和约100微秒到约50微秒的脉冲长度。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述治疗为一种IT-EP治疗并且包括约350-450V/cm的场强和约10微秒的脉冲长度。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述治疗为一种IT-EP治疗并且包括约400V/cm的场强和约10微秒的脉冲长度。

26.根据权利要求17到25中任一项所述的方法，其中所述治疗包括1到10个10毫秒电穿孔脉冲。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述治疗包括5到10个10毫秒电穿孔脉冲。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述治疗包括8个10毫秒电穿孔脉冲。

29.根据权利要求22到28中任一项所述的方法，其中与使用对含IRES基序的质粒进行编码的IL-12进行低电压IT-EP治疗相比，所述治疗产生以下中的一种或多种或全部：

a.IL-12的瘤内表达高至少3.6倍；

b.经过治疗的肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；

c.未经治疗的对侧肿瘤病变的平均肿瘤体积更低；

d.淋巴细胞流入到所述肿瘤中的量更大；

e.循环肿瘤特异性CD8+T细胞增加；

f.所述肿瘤中淋巴细胞和单核细胞表面标志物表达增加；以及

g.表23和24中INF-γ相关基因的mRNA水平增加。

30.根据权利要求1到16中任一项所述的用于治疗受试者的肿瘤的表达载体，其中治疗包括使用至少一种瘤内电穿孔脉冲将所述表达载体递送到所述肿瘤中。

31.根据权利要求30所述的表达载体，其中所述瘤内电穿孔脉冲包括至少一种低电压瘤内电穿孔(IT-EP)治疗。

32.根据权利要求31所述的表达载体，其中所述IT-EP治疗包括200V/cm到500V/cm的场强和约100微秒到约50毫秒的脉冲长度。

33.根据权利要求32所述的表达载体，其中所述治疗为一种IT-EP治疗并且包括350-450V/cm的场强和约10毫秒的脉冲长度。

34.根据权利要求33所述的表达载体，其中所述治疗为一种IT-EP治疗并且包括约400V/cm的场强和约10毫秒的脉冲长度。

35.根据权利要求30到34中任一项所述的表达载体，其中所述治疗包括1到10个10毫秒电穿孔脉冲。

36.根据权利要求35所述的表达载体，其中所述治疗包括5到10个10毫秒电穿孔脉冲。

37.根据权利要求36所述的表达载体，其中所述治疗包括8个10毫秒电穿孔脉冲。

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