KR102252756B1 - 텔로머라제 암호화 dna 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 텔로머라제 촉매 활성 및 핵인 국소화 시그널이 결여된 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT) 단백질를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 구조물을 제공한다. 본 구조물은 텔로머라제를 과발현하는 세포, 바람직하게는 이상형성 세포 또는 종양 세포에 대하여, 개체 내 면역 반응을 촉발시키는데 유용하다.
Description
본 발명은 항-종양 백신접종의 분야와 관련된다. 본 발명은 더욱 상세하게는 인간 텔로머라제 역전사효소 단백질의 불활성 효소 형태를 암호화하는 핵산 구조물을 제공한다.
능동 면역요법을 통한 종양-특이적 T-세포 반응의 자극(stimulation)은 암 치료의 다른 유형들과 비교하여 몇몇 이론적인 장점이 있다. T-세포-기초 면역요법의 임상적 이점을 획득하기 위해서는 종양 특이적 항원을 인식하는 CD8 및 CD4 종양-반응성 T 세포 반응 둘 모두를 자극하여야 한다. 따라서 증가된 관심이 다중의 종양 관련 항원(Tumor associated Antigen: TAAs)의 MHC class I 및 II 에피토프를 확인하는데 집중되었다 (Cheever, et al, 2009). 하지만, 상이한 유형의 암 중 특징화된 종양 항원 대부분의 이종 발현은 상기 항원을 표적 하는 암 백신의 광범위한 적용 가능성을 제한한다. 과거 수년간, 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT)가 첫번째의 일반적인 진짜의(bona fida) 종양 항원으로 부상되었고, 암 면역요법을 위한 보편적인 표적으로서 활발하게 연구되었다. 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT)는 염색체 말단에서 텔로머성 DNA를 합성하는, 텔로머라제 효소의 촉매성 서브유닛이다. hTERT는 인간 종양 대부분 (>85%) 및 사실상 모든 유형의 암에서 과발현된다. 또한, 텔로머라제 활성화는 세포 사멸의 텔로머-의존적 경로를 회피하기 위한 가장 중요한 종양 탈출 메커니즘 중 하나이다. 종양 성장과 관련되지 않은 항원을 표적 하는 치료적 전략이 임상적으로 진행성인 항원-상실 종양 돌연변이체의 선택을 야기할 수 있다는 점이 잘 알려졌다. 따라서, 텔로머라제 활성의 하향-조절 혹은 상실은 종양 세포의 성장 가능성에 크게 영향을 미친다. 더욱이, 정상 체세포는 대부분의 그들의 생애주기 동안 텔로머라제를 거의 생산하지 않거나 아예 생산하지 않고 종양 세포의 것보다 유전적으로 더 긴 텔로미어(telomere)를 가지기 때문에, 텔로머라제는 암세포에 상대적으로 특이적이다. 모든 상기의 발견들은 항암 면역요법에 hTERT를 임상적으로 적용하는 것을 정당화 한다.
몇몇 항암 백신 임상시험에서 널리 사용되는 펩티드 백신접종은 hTERT 항원과 관련된 가장 진전된 전략이다. 하지만, 몇몇 요소가 펩티드-기초 백신 전략의 최상의 성공에 영향을 미칠 수 있는데, 예를 들어, (1) 인간 백혈구 항원 (HLA) 제한, (2) 종양 세포 내 펩티드의 자연 프로세싱 (3) 종양 세포 상 항원 제공의 상실, (4) 항원-특이적 T 세포의 기능성(funtionality), 및 (5) 백신 접종 후 숙주 내 면역 반응의 장기간 잔존(persistence)이 그것이다.
펩티드 백신, 특히 짧은 펩티드에 의해 획득되는 기억 반응은, 매우 낮고 잔존적이지 않다. 본 차선의 결과는 CD4 T-세포의 도움의 부재에 의해 일부 설명될 수 있다. 또한, 제시 세포 상 MHC/펩티드 백신 복합체의 반감기는 단지 몇 시간이고, 이후 펩티드는 소멸한다. 수지상 세포는 이후 더이상 펩티드를 림프구로 제공하지 않고 및 따라서 관용적(tolerogenic)이 된다. 펩티드 제공에 대한 이러한 단점은 몇몇 경우에 있어서 유해하다(deleterious)(Rosenberg et al., 2004).
본 발명자들은 hTERT의 특정 에피토프 제한되는 펩티드(심지어 긴 펩티드) 백신 접종의 단점을 나타내지 않는, DNA 백신 전략을 개발해 왔다. 특히, DNA 백신접종은 고가의 및 복잡한 단백질 생산 및 정제 공정을 회피한다. 더욱이, hTERT 단백질을 암호화하는 DNA 백신은 환자 HLA- 제한(HLA-restriction)과는 독립적으로 CTL 및 CD4 헬퍼 T-세포 모두를 유도할 수 있고, 반면 안전하고 양적 및 질적으로 더 나은 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 텔로머라제 촉매 활성 및 핵인 국소화 시그널이 결여된 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT) 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 구조물을 제공한다.
바람직한 구현예에서, hTERT 단백질은 N-말단에서 hTERT 단백질의 프로테아좀으로의 어드레싱을 향상시키는 단백질, 예를 들어 유비퀴틴과 융합될 수 있다.
본 발명의 핵산 구조물은 텔로머라제를 과발현하는 세포, 바람직하게는 이상형성 세포 또는 종양 세포, 온코 바이러스에 감염된 세포에 대하여 개체 내 면역 반응, 바람직하게는 세포 면역 반응을 촉발(triggering)시키는데 유용하다.
본원에서는 핵산 구조물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자 내 종양을 예방 또는 치료하는 방법이 기술된다.
상기 치료는 능동 면역요법 또는 치료 백신접종으로 일컬어지고, 이는 종양에 대한 면역 반응, 특히 특이적 CD4 T-세포 반응과 함께 세포독성 CD8 T-세포 반응을 촉발시킨다.
CD4 및 CD8 T-세포 레퍼토리가 hTERT 상 입수가능 한 에피토프에 의해 자극되기 때문에 광범위한 세포 면역 반응이 획득된다. hTERT의 많은 에피토프에 대응하는 CD4 및 CD8 T-세포의 수는 펩티드 백신접종 내보다 더 많다. CD4 T-세포, 특히 Thl 사이토카인이 유도됨과 함께 인터류킨의 생산이 향상되고, 이는 항종양 세포의 전형적인 특징과 함께 CD8 T-세포의 최상의 성장 및 분화를 허용한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT)에서 유도되는 서열을 포함하는 핵산 구조물이 제공되고, 상기 서열은 하기의 hTERT로부터 유도된다:
i) hTERT의 모두 또는 실질적으로 모두를 암호화함, 임의의 순서로, 및
ii) 텔로머라제 촉매 활성 및 핵인 국소화 시그널이 결여된 단백질을 암호함.
실제로 본 발명자들은 상기 핵산 구조물(본원에서는 또한 "셔플된" 텔로머라제 구조물로 언급됨)이 또한 hTERT 특이적 in vivo 면역 반응, 특히 세포독성 CD8 T-세포 반응을 촉발시키는 것을 입증하였다.
도 1A INVAC -1 플라스미드 맵
벡터 특징
eRNAlla RIG-I 아고니스트: 7-532
trpA 원핵 터미네이터: 535-564
아데노바이러스 혈청형 5 VA RNAI (VA1): 568-761
Primosomal 어셈블리 사이트 (PAS-BH) 확장 오리진: 771-1055
pUC 복제 오리진: 1056-2070
슈크로오스 선택 마커 (RNA-OUT): 2087-2231
SV40 인핸서(enhancer): 2232-2451
CMV 인핸서: 2452-2897
CMV 프로모터: 2898-3017
비번역 리더 (엑손 1): 3018-3204
HTLV-1 R: 3089-3314
합성 래빗 β-글로빈-기초 3' 인트론: 3323-3429
엑손 2 (SR-단백질 결합 사이트-Kozak): 3430-3478
HindIII-XbaI 클로닝 사이트 포함 Ubi-hTERT 트랜스진- Invectys): 3479-6973
진핵 터미네이터: 6980-7114
도 IB INVAC -1에 대한 겔 밸리데이션
INVAC-1 발현 벡터가 제한 매핑에 의해 확인되었다. 패턴은 예상되는 제한 맵에 대응한다.
레인 1: 1 kb 래더(Ladder)
레인 2: 미처리된(Undigested) INVAC-1
레인 3: BglII/NotI로 처리된 INVAC- 1 (3496, 3262, 220, 142 bp 밴드)
레인 4: NcoI로 처리된 INVAC-1 (4084, 3036 bp 밴드)
레인 5: HindIII/XbaI로 처리된 INVAC-1 (3631, 3489 bp 밴드)
도 2A hTERT , INVAC -1 및 INVAC -1 유도체.
INVAC-1 및 INVAC-1 유도체에 의해 암호화된 야생형 hTERT 및 개질된 Ubi-hTERT 단백질 사이의 개략적 서열배열 (Schematic alignment):pUTDlONot (△lONot로 축약됨), pUTDlOCog (△lOCog로 축약됨) 및 pUTD23Tyn (△23로 축약됨).
서열 특징:
VDD: 촉매 사이트 내 아미노산 867-869의 결실
DGLLLRL (SEQ ID NO: 19): 아미노산 860-867의 추가 결실; 업스트림 VDD 결실
FLLVTPH (SEQ ID NO: 20): 아미노산 869-876의 추가 결실; 다운스트림 VDD 결실
IRR: 아미노산 857-859의 추가 결실; 업스트림 DGLLLRLVDD (SEQ ID NO: 21): 결실
LTH: 아미노산 877-879의 추가 결실; 다운스트림 VDDFLLVTPH (SEQ ID NO: 22): 결실
Ubi: 인간 유비퀴틴 서열 (1-76 아미노산)
V5: 용이한 단백질 검출을 위한 C-말단 V5 태그
도 2B INVAC -1 유도체를 위한 겔 밸리데이션
제한 매핑에 의해 pUTDlONot, pUTDlOCog 및 pUTD23Tyn 발현 벡터 (INVAC-1 유도체)가 확인되었다. 패턴은 예상된 제한 맵에 상응한다.
레인 M: 1 kb 래더
레인 1: pUTDlOCog (5348, 3585 bp 밴드)
레인 2: pUTDlONot (5348, 3585 bp 밴드)
레인 3: pUTD23Tyn (5348, 3546 bp 밴드)
도 3 웨스턴 블로팅에 의해 평가되는 상이한 세포주 내의 야생형 hTERT , INVAC-1 및 INVAC -1 유도체 in vitro 발현
야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT), 빈 벡터 (pNTC8685-eRNA41H, 외부 코딩 서열이 없는 INVAC-1 백본), INVAC-1 및 INVAC-1 유도체 구조물 (pUTDlONot/△10Not, pUTD10Cog/△10Cog 및 pUTD23Tyn/△23)이 HEK293T 세포 (A, C)로 형질감염되었다. 야생형 hTERT, pNTC8685-eRNA41H 빈 벡터 및 INVAC-1 구조물이 CrFK 세포(B)로 형질감염되었다.
단백질 발현이 형질감염 후 HEK293T 세포 (A, C)에 대해서 18-96h 동안 및 CrFK 세포 (B)에 대해서 24-72h 동안 모니터링 되었다.
세포 수확 시간이 각 레인의 상단에 표시된다. 세포 용해물의 총 단백질 15μg이 멤브레인 A, B, C (hTERT, INVAC-1)에 레인별로 로드되었고, 20 μg의 총 단백질 용해물이 멤브레인 C (△lONot, △lOCog, △23) 에 레인별로 로드되었다. hTERT는 항-hTERT 래빗 모노클로날 항체 (hTERT, INVAC-1) 또는 항-태그 V5 (△lONot, △lOCog, △23)로 검출되었다. β-액틴 단백질 검출이 로딩 컨트롤로 사용되었고, 항-β-액틴 마우스 모노클로날 항체로 검출되었다. CrFK 세포에서의 hTERT 단백질 검출(B) 및 HEK293T 세포에서의 INVAC-1 유도체 단백질 검출 (C)은 더 긴 노출 시간을 필요로했다.
도 4 면역형광법에 의해 평가되는 상이한 세포주 내로의 hTERT 및 INVAC -1 구조물의 세포내 국소화
야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT) , 빈 벡터 (pNTC8685-eRNA41H, 외부 코딩 서열 없는 INVAC-1 백본) 및 INVAC-1 구조물이 24시간 동안 HEK293T (A) 또는 CrFK 세포 (D)로, 및 24시간 및 48시간 동안 HeLa (B) 또는 QT6 (C) 세포로 형질감염 되었다.
세포는 항-hTERT 래빗 모노클로날 항체 및 염소 Alexa Fluor 488 항-래빗 2차 항체(녹색)로 면역 형광 염색이 수행되었다. 핵은 DAPI(청색)으로 염색되었다. 비처치된 세포는 DAPI 만으로 염색되었다. 세포는 형광 현미경 (x63)으로 분석되었다.
도 5 TRAP 에세이에 의해 평가되는 hTERT , INVAC -1 및 INVAC -1 유도체의 텔로머라제 활성
CrFK 세포가 야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT), INVAC-1 및 INVAC-1 유도체 구조물로 형질전환되었다. 24시간 후 세포가 수집되었고, 총 세포 단백질이 추출되었고 텔로머라제(역전사 효소) 활성이 텔로머성 반복 증폭 프로토콜(Telomeric Repeat Amplification 프로토콜: TRAP) 에세이에 의해 평가되었다. 야생형 hTERT 및 비처치된 CrFK 세포와 비교한 INVAC-1 (A, B) 및 INVAC-1 유도체 구조물 (C, D)의 흡광도측정(Absorbance mesurements)(OD450/690nm) 및 상대적인 텔로머라제 활성 (Relative Telomerase Activity: RTA; 샘플/양성 컨트롤 비율)이 표시된다 (2.1μg 총 단백질 농도 샘플에 대해 n = 3), **: p = 0.0016, ***: p < 0,0001, unpaired t-test.
INVAC-1 및 INVAC-1 유도체로 형질감염된 CrFK 세포에서 텔로머라제 활성은 검출되지 않았다.
도 6: INVAC -1의 ID 투여 후 인터페론-γ을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 유의한 레벨을 유도하는 전기천공법의 영향
7주-령 C57BL/6 암컷 마우스가 100 μg의 INVAC-1 또는 1X PBS로 ID 면역화되었다(그룹당 2 내지 8 마우스). 동물의 절반에 대해 면역화 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법이 수행되었다. 백신 접종 14일 후 모든 마우스의 비장이 수집되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 H2b MHC (p429, p660) 제한된 2개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 hTERT 특이적 CD8T 세포의 빈도의 중간값(median frequency) 이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석. *: p-value < 0.05. EP = 전기천공법.
도 7: 인터페론-γ을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포를 유도하기 위한 전기 천공법이 수반되는 INVAC-1 백신접종의 다양한 투여 경로의 평가.
7 내지 10주-령 형질전환된(transgenic) HLA-B7 마우스가 25μg의 INVAC-1 또는 1X PBS로 A) ID 또는 SC 경로 (그룹당 3-8 마우스) 및 B) ID 또는 IM 경로 (그룹 당 4-5 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들은 면역화 직후 각 백신접종 사이트에 전기천공법을 받았다. 백신 접종 14일 후, 모든 마우스의 비장 A) 또는 말초 혈액 B)이 수집되었다. 비장 세포 또는 PBMC는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 HLA-B7 MHC (p351, p1123 및 p277)로 제한된 3개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBMC를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T 세포의 빈도의 중간값 (median frequence) 이다. Mann Whitney 비모수적 테스트, *: p-value < 0.05. 컷-오프 역치로서 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 10 hTERT 특이적 CD8 T-세포에 교차 평행선(hatched line)이 자율적으로 설정되어, 반응하는 동물을 측정할 수 있다.
도 8: INVAC - 1를 사용한 단일 ID 면역화 및 전기천공법 후 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응에 미치는 백신 투여량의 영향
7주-령 C57BL/6 암컷 마우스가 A) 12.5, 25, 50 또는 100μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS (그룹당 4-6 마우스)로, 및 B) 100, 200, 400, 800 또는 1200μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS로 (그룹 당 3-5 마우스)로 ID 면역화되었다. 전기천공법이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 수행되었다. 백신 접종 14일 후 모든 마우스의 비장이 수득되었다.
비장 세포는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 H2b MHC (p429, p660) 제한된 2개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 를 분비하는 hTERT 특이적 CD8T 세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법.*: p-value < 0.05, **: p-value < 0.01. 교차 평행선이 10스팟/200,000 비장 세포에서 자율적으로 설정되어 반응하는 동물을 측정할 수 있다.
도 9: 인터페론-γ를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포에 대한 INVAC - 1를 이용한 프라임-부스트 백신접종 방법(regimen)의 영향
6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-B7 마우스가 25 μg 의 INVAC-1의 ID 경로 (그룹 당 5 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들은 면역 직후 각 백신 사이트에 전기천공법을 받았다. 21일 후 마우스는 동일한 방법을 사용하여 부스트 주사를 맞았다. 첫 번째 면역 전, 프라이밍 후 7일, 15일 및 21 일차 및 부스팅 후 9일, 16일 및 22일 차에 말초 혈액이 수집되었다. PBMC는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 HLA-B7 MHC(p351,p1123, 및 p277)로 제한된 3개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값 (median frequence) 이다. Mann-Whitney 비모수적 테스트, *: p-value < 0.05. 교차 평행선(hatched line)이 10 스팟/200,000 비장 세포에서 자율적으로 설정되어 반응하는 동물을 측정할 수 있다.
도 10: 인터페론-γ을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포를 유도하기 위한, INVAC-1, △ lONot , △ lOCog 또는 △ 23를 사용한 ID 백신접종 ( 단회 면역법 vs. 프 라임-부스트 방법) 및 이어지는 전기천공법의 평가.
A) 7주-령 C57BL/6 암컷 마우스가 100μg 의 INVAC-1, △lONot, △lOCog 또는 △23 또는 1X PBS로 ID 면역화되었다(그룹당 4 마우스). 전기천공법이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 수행되었다. 동물의 절반이 동일한 절차를 사용하여 일차 백신접종 20일 후에 부스트 주사되었다. 마우스 비장이 단일 또는 프라이밍 및 부스트 주사를 맞은 동물들에 대하여 마지막 면역 14일 또는 10일 후 각각 에서 수득 되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 H2b MHC (p429, p660)로 제한된 2개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 단회 주사 (PRIME, black dots) 또는 프라임 및 부스트 주사 (PB, white dots)를 투여받은 동물의 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 hTERT 특이적 CD8T 세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Mann Whitney 비모수적 테스트, *: p-value < 0.05. 컷오프가 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 10 hTERT 특이적 CD8 T 세포에서 자율적으로 설정되어 반응하는 동물을 측정할 수 있다 (교차 평행선). PB= 부스트-후.
B) 6 내지 10주-령 형질전환 된 HLA-B7 마우스가 100 μg 의 INVAC-1, △lONot, △lOCog 또는 △23 또는 1X PBS로 ID 경로 (그룹당 5마리 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 1차 백신접종 21일 후, 마우스는 동일한 방법으로 부스트 주사를 맞았다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 HLA-B7 MHC (p351, p1123 및 p277)로 제한된 3개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBL를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Mann Whitney 비모수적 테스트, *: p-value < 0.05. 컷오프(cut-off)가 10스팟/200,000 비장 세포에서 자율적으로 설정되어 반응하는 동물의 빈도를 측정할 수 있다 (교차 평행선).
도 11: 전기천공법이 뒤따르는 ID 면역법(들) 후 hTERT 특이적 T-세포 반응의 폭(breadth): INVAC -1, pNTC - hTERT 및 pNTC - hTERT -△ VDD 구조물와의 비교
7 내지 13주-령 형질전환된 HLA-B7 마우스가 5μg 의 INVAC-1, hTERT△VDD (pNTC-hTERT-△VDD), hTERT (pNTC-hTERT) 또는 빈 벡터 NTC (pNTC8685-eRNA41H)를 이용한 ID 경로(그룹당 6 마우스)를 통해 면역화되었다. 48마리의 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 동물의 절반이 동일한 절차를 사용하여 일차 백신접종 20일 후에 부스트 주사되었다. 마우스 비장이 단일 또는 프라이밍 및 부스트 주사를 맞은 동물들에 대하여 마지막 면역 14일 또는 10일 후 각각에서 수득되었다.
비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 밤사이 자극 (19시간)동안, 9-10개의 hTERT 오버래핑 펩티드(11개 아미노산에 의한 오버래핑 15mer 펩티드)의 27개 풀로 나누어진 hTERT의 269개의 정제된 펩티드 (순도 > 70%, GenScript)의 세트를 사용하여, 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다.
각 마우스당, 스팟의 중간 값이 3회당 및 자극 조건(배지 또는 펩티드 풀) 당 산출되었다. 이후, hTERT 특이적 T-세포의 빈도(F)가, 펩티드 풀 자극된 웰 내 스팟의 중간 값에서 배지 자극된 웰 내 스팟의 중간 값을 뺀 후에 산출되었다. 음성 값(negative value)이 이어지는 분석을 위해 0으로 세팅되었다.
(A 및 B) 상기 분석은 단일 (A) 또는 프라임-부스트 (B) 백신접종을 받은 동물들에 대해 수행되었다. 각각의 백신접종 그룹 (INVAC-1, hTERT△VDD, hTERT, NTC)에 대해, IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 텔로머라제 특이적 T-세포의 빈도 (F)의 중간값 (n=6)이 자극 조건당 산출되어 27개의 풀 각각에 대해 하나의 값이 획득되었다.
(C) INVAC-1, hTERT△VDD, hTERT 또는 NTC에 의한 백신접종 후 27개의 풀 (269개의 정제된 펩티드)에 대해 텔로머라제 특이적 T-세포의 빈도(F)의 중간 값의 총 합이 검출되었다. 통계적 분석이 Dunn's 보정을 이용한 비-모수(non-parametric) Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 Prism 5 소프트웨어와 함께 수행되었다. p-value < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로서 고려되었다.
도 12: 특이적 세포독성 CD8 T-세포 및 Thl -CD4 T-세포를 발생시키는 INVAC-1 ID 백신접종 및 전기천공법의 효력(potency)
A) 7 내지 10주-령 형질전환된 HLA-B7 마우스가 25 μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS를 이용한 ID 경로 (그룹당 5마리 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 접종 후 14일째 되는 날에, HLA-B7 MHC (p351 또는 p1123) 제한된 개별 hTERT 펩티드로 펄스된 또는 비펄스된 동계(syngeneic) 비장 세포가 상이한 농도[ 높은 = 1 μΜ (621), 중간의 = 0.5 μΜ (987) 및 낮은 = 0.1 μΜ (비펄스된)]에서, 카복시플루오레신-디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (carboxyfuorescein-diacetate succinimidyl ester: CFSE)로 라벨되었다. 동일한 수의 높은, 중간의 또는 낮은 CFSE 라벨된 세포가 백신된 마우스 내로 IV 전달되었다. 15-18 시간 후, 펩티드-펄스된 세포의 소멸이 유동 세포 분석법에 의해 비장 내에서 측정되었다. 특이적 용해의 비율(percentage)이 백신화된 마우스 대(versus) 컨트롤 마우스 내의, 비펄스된 세포에 대한 펄스된 세포의 비율을 비교함에 의해 산출되었다. 데이터는 INVAC-1을 ID 백신접종 후 비장 내 각개별 펩티드에 대한 각 마우스에서의 특이적 용해의 비율을 나타낸다. 수평 bar는 펩티드 당 및 면역 루트당 용해의 평균 비율 (average percentage)을 나타낸다. 표준 편차가 또한 플롯 되었다(n=10 개별 동물/ 그룹). 통계적 분석이 Dunn's 보정을 이용한 비-모수(non-parametric) Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 Prism 5 소프트웨어와 함께 수행되었고, p-value < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로서 고려되었다.
B 및 C) 6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스가 25 μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS로 ID 경로 (그룹당 7-10 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 백신접종 14일 후, 모든 마우스의 비장이 수득 되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 및 B) 19시간 동안 HLA-DRl MHC (pl029, p578 및 p904)로 제한된 3개의 hTERT 특이적 펩티드 풀로 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 3회 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 hTERT 특이적 CD4 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Mann Whitney 비모수적 테스트, ***: p-value < 0.001.
C) 비장 세포의 두 번째 절반이 24시간 동안 HLA-DRl MHC (pl029, p578 및 p904) 제한된 3개의 hTERT 특이적 펩티드의 풀로 자극되었다. 자극된 세포의 상청액이 회수되었고, CBA 에세이 내에서 시험되어 hTERT 특이적 CD4 T-세포에 의해 분비된 Thl/Th2 및 Thl7 사이토카인의 농도가 평가되었다. 결과는 pg/mL의 사이토카인 농도의 중간값이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법. *: p-value < 0.05.
도 13: 동계( syngeneic ) HLA -A2/DR1 형질전환된 마우스 종양 모델 내 전기천공법이 수반되는 INVAC -1 ID 백신접종의 치료적 또는 예방적 영향
A) 5 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스가 100 μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS로 ID 경로를 통해 (그룹당 5마리 마우스) 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 프라이밍 21일 후, 마우스는 동일한 방법에 따라 부스트 주사를 맞았다. 부스팅 1개월 후, 마우스에는 50,000 Sarc-2 종양 세포 (마우스 섬유육종)가 SC 경로를 통해 접종되었다. 각 백신된 그룹의 종양 볼륨의 중간값이 종양 세포 이식 후 일수에 따라 제시된다. 교차 평행선이 종양 성장 지연의 계산을 허용하기 위해 500mm3에 그어졌다.
B) 24주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스(그룹당 10 마우스)에 20,000 Sarc-2 종양 세포 (마우스 섬유육종)가 SC 경로를 통해서 접종되었다. 종양 세포 이식 4일 후, 동물에 25 μg 의 INVAC-1 또는 빈 플라스미드 (NTC, 항원 서열이 없는 INVAC-1 백본)가 ID 경로를 통해서 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 프라이밍 21일 및 35일 후, 마우스는 동일한 방법을 사용하여 부스트 주사가 투여되었다. 각 백신된 그룹의 종양 볼륨의 중간값이 이식 후 일수에 따라 제시된다. 교차 평행선이 종양 성장 지연의 계산을 허용하기 위해 500mm3에 그어졌다.
도 14: GM- CSF에 의한 INVAC -l-유도된 세포 면역 반응의 효력화(potentialization) 및 동계( syngeneic ) HLA -A2/DR1 형질전환된 마우스 종양 내 in vivo 효과(efficacy)
A) 7주-령 C57BL/6 암컷 마우스가 25 μg 의 INVAC-1, 25 μg 의 INVAC-1 및 0.5 μg mGM-CSF 또는 1X PBS로 ID (그룹당 5마리 마우스) 면역화되었다. 전기천공법이 각 백신접종 사이트에 INVAC-1 면역 직후에 수행되었다. 백신접종 14일 후, 모든 마우스에서 비장이 수득 되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 19시간 동안 H2b MHC (p429, p660)로 제한된 2 hTERT 특이적 펩티드의 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBL을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법. **: p-value < 0.01.
B) 6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스가 100 μg 의 INVAC-1, 100 μg 의 INVAC-1 및 5 μg mGM-CSF로 ID 경로 (그룹당 5마리 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들이 각 백신사이트에서 INVAC-1 면역 직후에 전기천공법을 받았다. 백신접종 14일 후, 모든 마우스에서 비장이 수득 되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 24시간 동안 HLA-DR1 MHC (pl029, p578 및 p904)로 제한된 3 hTERT 특이적 펩티드의 풀로 3회 자극되었다. 자극된 세포의 상청액이 회수되었고, CBA 에세이 내에서 시험 되어 hTERT 특이적 CD4 T-세포에서 분비된 Thl/Th2 및 Thl7 사이토카인의 농도가 평가되었다. 결과는 pg/mL의 사이토카인 농도의 중간값이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법. *: p-value < 0.05. **: p-value < 0.01.
C) 6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스 (그룹당 10 마우스)에 20,000 Sarc-2 종양 세포 (마우스 섬유육종)가 SC 경로를 통해 이식되었다. 종양 세포 이식 4일 후, 동물들이 25 μg INVAC-1 및 0.5 μg mGM-CSF, 빈 플라스미드 (NTC, 항원 서열이 없는 INVAC-1 백본) 및 0.5 μg mGM-CSF 또는 1X PBS 및 0.5 μg mGM-CSF을 ID 경로를 통해 면역화되었다. 모든 동물들은 INVAC-1 면역 직후에 각 백신 사이트에서 전기천공법을 받았다. 프라이밍 21 및 35일 후, 마우스는 동일한 프로토콜로 부스트 주사를 투여받았다. 각 백신 된 그룹 내 종양 볼륨의 중간값이 종양 세포 이식 후 일수에 따라 표시된다.
교차 평행선이 종양 성장 지연을 계산할 수 있도록 500mm3에 그어졌다.
도 15: INVAC -1 유도된 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응의 효력화(potentiate)에의 IL-12의 영향
6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스가 100 μg 의 INVAC-1, 100 μg 의 INVAC-1 및 1 ng IL-12, 1X PBS 또는 1X PBS 및 1 ng IL-12로 ID 경로 (그룹당 5마리 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들은 각 백신 사이트에서 INVAC-1 면역 직후에 전기천공법을 받았다. 백신 접종 14일 후, 모든 마우스의 비장이 수득되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 19시간 동안 HLA-A2 (UCP4.1 및 UCP2.1)로 제한된 2개의 hTERT 특이적 펩티드의 풀로 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 3회 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액으로 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBL를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. 반응 동물을 결정할 수 있도록 교차 평행선이 10 스팟/200,000 비장 세포에서 설정되었다.
도 16은 INVAC-1 플라스미드 발현 벡터의 전체 뉴클레오티드 서열(complete nucleotide sequence)을 보여준다 (7120 bp). 벡터 특징은 도 1A에 대한 설명부분(legend)에서 설명된다. INVAC-1-암호화된 hTERT 융합 단백질 (1158 AA)은 위치 3488 (M 아미노-산을 위한 ATG 코딩)에서 시작하여 6961 (D 아미노-산을 위한 GAC 코딩) 에서 종결된다. INVAC- 1/hTERT 단백질에서 47개의 첫 번째 아미노-산 (1-47 AA)이 결실되고, 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 촉매 사이트는 야생형 인간 텔로머라제(hTERT; Accession number NM_198253) 에 상응하는 AA 867-869에 대응되고 VDD (서열 내 *)를 코딩하는 9 bp 결실 (뉴클레오티드 6172-6173 사이)에 의해 불활성화되었다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이고; 두 번째 라인은 아미노-산 서열에 대응된다. 주석 (또한, 도 1A 참조)이 서열 위 또는 아래에 주어진다."□": 스탑 코돈.
도 17은 D10Not 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질 (Ubi-hTERT)을 암호화하는 인서트 서열을 나타낸다. hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 추가 결실이 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; Accession number NM_198253)의 AA 860-869에 상응하는 아미노산 912-913 (* 서열 참조) 사이에 삽입되었다. 상기 10개의 아미노산 결실은 인간 TERT 효소적 활성의 불활성화를 야기하는 3개의 AA 결실 (△VDD) 및 VDD 서열 업스트림의 추가적 7개 AA의 결실을 포함한다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개의 아미노산은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다; 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다. 주석이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
도 18은 D10Cog 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질 (Ubi-hTERT)을 암호화하는 인서트 서열을 나타낸다. hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 추가 결실이 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; Accession number NM_198253)의 AA 867-876에 상응하는 아미노산 919-920 (* 서열 참조)에 도입되었다. 상기 10개의 아미노산 결실은 인간 TERT 효소적 활성의 불활성화를 야기하는 3개의 AA 결실 (△VDD) 및 VDD 서열 다운스트림의 추가적 7개 AA의 결실을 포함한다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다; 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다. 주석이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
도 19는 D23Tyn 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질 (Ubi-hTERT)의 인서트 서열을 나타낸다. hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 추가 결실이 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; Accession number NM_198253)의 AA 857-879 에 상응하는 아미노산 909-910 (* 서열 참조) 사이에 도입되었다. 상기 23개의 아미노산 결실은 인간 TERT 효소적 활성의 불활성화를 야기하는 3개의 AA 결실 (△VDD) 및 VDD 서열의 업스트림 및 다운스트림의 추가적 10개의 AA의 결실을 포함한다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다; 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다. 주석이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
도 20 INVAC -1 셔플된 유도체 플라스미드 맵
도 20A pUTScram : 벡터 특징
도 20B pUTInv : 벡터 특징
도 21A pUTScram에 대한 겔 밸리데이션
pUTScram 발현 벡터가 제한 매핑에 의해 확인되었다. 패턴은 예상된 제한 맴에 상응한다.
레인 M: 1 kb 래더
레인 1 : HindIII/XbaI로 처리된 pUTScram (3576, 5342 bp 밴드)
도 21B pUTInv 에 대한 겔 밸리데이션
pUTInv 발현 벡터가 제한 매핑에 의해 확인되었다. 패턴이 예상된 제한 맵에 상응한다.
레인 M: 1 kb 래더
레인 1: HindIII/XbaI로 처리된 pUTInv (3576, 5342 bp 밴드)
도 22 hTERT , INVAC -1, pUTScram 및 pUTInv 구조물
야생형 hTERT 및 INVAC-1에 의해 암호화된 개질된 Ubi-hTERT 단백질 및 INVAC-1 셔플된 유도체: pUTScram (스크램블체) 및 pUTInv (역전체) 사이의 개략적 서열배열 (Schematic alignment).
개질된 hTERT 서열 (△VDD)이 10개의 면역원성 단편으로 나누어졌다: 단편 1 (258 bp; Leu24 - Glyl09), 단편 2 (201 bp; Phel l5 - Alal81), 단편 3 (120 bp; Trp203 - Ala242), 단편 4 (117 bp; Ser255 - Arg293), 단편 5 (303 bp; Pro320 -Thr420), 단편 6 (312 bp; Ala423 - Val526), 단편 7 (210 bp; Cys528 - Gln597), 단편 8 (477 bp; Arg599 - Lys757), 단편 9 (576 bp; Lys760 - Ile951), 단편 10 (516 bp; Asn958 - Aspll29).
서열 특징:
VDD : 촉매 사이트 내 아미노산 867-869의 결실
Ubi : 인간 유비퀴틴 서열 (1-76 아미노산)
F ( Phe ): hTERT의 페닐알라닌 잔기 (AA47)
G ( Gly ): 유비퀴틴의 C-말단 글리신 잔기 (AA76)
R ( Arg ): 아르기닌, INVAC-1 단백질의 첫 번째 아미노산 (AA 77)
N ( Asn ): 아스파라긴, pUTScram에 의해 암호화된 (스크램블된) hTERT 단백질의 첫 번째 아미노산 (AA 81)
C ( Cys ): 시스테인, pUTInv에 의해 암호화된 (역전된) 인조의 hTERT 단백질의 첫 번째 아미노산 (AA 81)
V5: 용이한 단백질 검출을 위한 C-말단 V5 태그
도 23 웨스턴 블로팅에 의해 평가되는 야생형 hTERT , INVAC -1 및 INVAC -1 셔 플된 유도체의 in vitro 발현
(A 및 C)야생형 hTERT, INVAC-1, pUTScram 및 pUTInv이 HEK293T 세포로 형질감염되었다. 단백질 발현은 형질감염 18-96h 후 모니터링되었다. 야생형 hTERT 및 INVAC-1 샘플이 18 h 및 72 h동안 15 μg의 총 단백질 농도로 로딩되었다. 상기 샘플은 단백질 발현의 양성 컨트롤로서 사용되었다. (A) 스크램블된 및 (C) 역전된 단백질이 레인당 20 μg 의 세포 용해물의 총 단백질로 로딩 되었다. hTERT가 항-hTERT 래빗 모노클로날 항체 (hTERT, INVAC-1) 또는 항-태그 V5 마우스 모노클로날 항체 (Srambled, Inverted)를 사용하여 검출되었다. 세포 수확의 시간이 각 레인의 상단(top)에 표시되었고, β-액틴 단백은 로딩 컨트롤로 사용되어 항-β-액틴 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 검출되었다. INVAC-1 셔플된 유도체 산물의 검출은 야생형 hTERT 및 INVAC-1 단백질보다 더 긴 노출 시간을 필요로 했다 (10 sec 내지 30 min 대(against) 1 sec 미만). 셔플된 단백질 시그널 강도가 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯 상에서 β-액틴 시그널에 대해 정상화되었다 (A 및 C). (B) 스크램블체. (D) 역전체. 로딩 컨트롤의 프로파일 및 단백질 밴드가 각 레인별로 발생되어 프로파일 곡선 하 면적에 상응하는 임의의 수가 획득되었다. 비율(상대적 농도)이 각 샘플에 대한 면적 값을 상응하는 로딩-컨트롤의 면적 값으로 나눔으로써 산출되었다.
도 24. hTERT , INVAC -1 및 INVAC -1 셔플된 유도체의 텔로머라제 활성이 TRAP 에세이에 의해서 평가되었다.
CrFK 세포가 야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT), pUTScram 및 pUTInv 구조물에 의해 형질감염되었다. 세포 수집 24시간 후, 총 세포 단백질이 추출되었고 및 텔로머라제(역전사효소) 활성이 텔로머성 반복 증폭 프로토콜 (TRAP) 에세이에 의해서 평가되었다. 흡광도 측정 (OD450/690 nm) 및 야생형 hTERT 및 비처치된 CrFK 세포과 비교하여 셔플된 구조물 (A 및 B 각각)의 상대적 텔로머라제 활성 (RTA; 샘플/양성 컨트롤 비율)이 기술되었고 (n = 3, 2.1 μg 의 총 단백질 농도 샘플), [unpaired t-test]가 수행되었다.
pUTScram 및 pUTInv 구조물로 형질감염된 CrFK 세포 내에서 텔로머라제 활성이 검출되지 않았다
도 25: INVAC -1, pUTScram 및 pUTInv를 사용한 ID 백신접종 및 전기천공법의 인터페론-γ을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포를 유도에 대한 평가.
9 내지 15주-령 형질감염 HLA-B7 마우스가 두 번의 면역 사이클 (프라임-부스트 방법) 상에서 100 μg 의 INVAC-1, pUTScram, pUTInv 또는 1X PBS로 ID 경로 (3-그룹당 5마리 마우스)를 통하여 면역되었다. 전기천공법이 각 백신접종 사이트에 각 면역 직후에 수행되었다. 마우스 비장이 이차 면역 10일 후에 수득 되었다.
비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 19시간 동안 HLA-B7 MHC (p277, p351 및 p1123)로 제한된 3개의 hTERT 특이적 펩티드의 풀 또는 자유 배지로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액으로 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBL를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Mann Whitney 비모수적 테스트가 수행되었다, *: p-value < 0.05. 반응 동물의 빈도를 결정하기 위하여 컷-오프가 10 스팟/200,000 비장 세포에서 자발적으로 설정되었다 (교차 평행선).
도 26: ID 백신접종 및 전기천공법 후 특이적 세포독성 CD8 T-세포 및 Thl-CD4 T-세포를 발생시키는 pUTScram 및 pUTInv의 효력(potency)
15주-령 형질전환된 HLA-B7 마우스가 100 μg 의 INVAC-1, pUTScram, pUTInv 또는 1X PBS로 ID 경로를 통해 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 접종 후 14일째 되는 날에, HLA-B7 MHC (p351 또는 p1123)로 제한된 개별 hTERT 펩티드로 펄스된 또는 비펄스된 동계 비장 세포가 상이한 농도[ 높은 = 5 μΜ (351), 중간의 = 2 μΜ (1123) 및 낮은 = 0.2 μΜ (비펄스된)]에서, 카복시플루오레신-디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (carboxyfuorescein-diacetate succinimidyl ester: CFSE) 로 라벨되었다. 각 농도로부터 동일한 수의 CFSE 라벨된 세포를 포함하는 혼합물이 안와정맥을 통해 백신된 마우스에 투여되었다 (IV). 15-18 시간 후, 펩티드-펄스된 세포의 소멸이 유동 세포 분석법에 의해 비장 내에서 측정되었다. 백신된 마우스 대 컨트롤 마우스 내에서 특이적 용해의 비율이 비펄스된 세포에 대한 펄스된 세포의 비율을 비교함에 의해서 산출되었다. 데이터는 ID 백신접종 후 비장 내 각 개별 펩티드에 대한 각 마우스의 특이적 용해 비율을 나타낸다. 평행 bar는 펩티드 당 용해 비율의 중간값을 나타낸다. 통계적 분석이 Dunn's 보정을 이용한 비-모수(non-parametric) Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 Prism 5 소프트웨어와 함께 수행되었고, p-value < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로서 고려되었다.
도 27은 INVAC-1 셔플된 유도체의 구성에 사용되는 Ubi-hTERT 코돈 최적화된 서열의 면역원성 세그먼트의 묘사(delineation)를 보여준다. 첫 번째 라인은 Ubi-hTERT의 최적화된 뉴클레오티드 서열의 코돈이고 (SEQ ID NO: 45) 및 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO: 46). Ubi-hTERT 서열은 면역원성 서열은 포함하는 10개의 단편으로 나누어졌다. 상기 단편들은 기호(< ... >)로 묘사된다. 면역원성 서열은 회색으로 강조되었다. pUTScram 및 pUTInv 구조물 내 포함되지 않은 비-면역원성 내(inter)-단편 hTERT 서열이 밑줄 되었다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 주석이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. (*)은 VDD 서열 결실을 나타낸다. "□": 스탑 코돈.
도 28은 pUTScram 인서트의 전체 뉴클레오티드 서열을 보여준다 (3555 bp). 벡터 특징이 도 20 레전드에 기술된다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트 (스크램블체, 1184 AA)는 위치 923 (M 아미노산을 위한 ATG 코딩)에서 시작하고 위치 4474 (T 아미노산을 위한 ACT 코딩)에서 종결되었다. hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 촉매 사이트는 VDD (* 서열 내)를 코딩하고 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; 특허 WO 2007/014740 및 hTERT isoform 1 Accession number NM_198253)의 AA 867-869에 상응하는 9 bp 결실에 의해 불활성화되었다. hTERT 서열이 10개의 면역원성 단편으로 나누어졌고, 다음의 특이적인 순서로 재조합되었다: 단편 7 (210 bp), 단편 2 (201 bp), 단편 6 (312 bp), 단편 4 (117 bp), 단편 9 (576 bp), 단편 3 (120 bp), 단편 1 (258 bp), 단편 8 (477 bp), 단편 10 (516 bp), 단편 5 (303 bp). 상기 10개의 단편이 6xGly 링커 (G 링커; 18 bp)로 연결된다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:47);두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO:48). 주석(또한, 도 20A 참조)이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
도 29는 pUTInv 인서트의 전체 뉴클레오티드 서열을 보여준다(3555 bp). 벡터 특징이 도 20 레전드에 기술된다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트 (역전체, 1184 AA)는 pUTInv의 위치 923 (M 아미노산을 위한 ATG 코딩)에서 시작하고, 위치 4474 (T-아미노산을 위한 ACT 코딩)에서 종결된다. hTERT 단백질에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 촉매사이트는 VDD (* 서열 내)를 코딩하고 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; 특허 WO 2007/014740; Accession number NM_198253)의 AA 867-869에 상응하는 9 bp 결실에 의해 불활성화되었다. hTERT 서열이 10개의 면역원성 단편으로 나누어졌고, 다음의 특이적인 순서로 재조합되었다: 단편 10 (516 bp), 단편 9 (576 bp), 단편 8 (477 bp), 단편 7 (210 bp), 단편 6 (312 bp), 단편 5 (303 bp), 단편 4 (117 bp), 단편 3 (120 bp), 단편 2 (201 bp), 단편 1 (258 bp). 상기 10개의 단편은 6xGly 링커 (G 링커; 18 bp)로 연결되었다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:49); 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO:50). 주석(또한, 도20B 참조)이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
벡터 특징
eRNAlla RIG-I 아고니스트: 7-532
trpA 원핵 터미네이터: 535-564
아데노바이러스 혈청형 5 VA RNAI (VA1): 568-761
Primosomal 어셈블리 사이트 (PAS-BH) 확장 오리진: 771-1055
pUC 복제 오리진: 1056-2070
슈크로오스 선택 마커 (RNA-OUT): 2087-2231
SV40 인핸서(enhancer): 2232-2451
CMV 인핸서: 2452-2897
CMV 프로모터: 2898-3017
비번역 리더 (엑손 1): 3018-3204
HTLV-1 R: 3089-3314
합성 래빗 β-글로빈-기초 3' 인트론: 3323-3429
엑손 2 (SR-단백질 결합 사이트-Kozak): 3430-3478
HindIII-XbaI 클로닝 사이트 포함 Ubi-hTERT 트랜스진- Invectys): 3479-6973
진핵 터미네이터: 6980-7114
도 IB INVAC -1에 대한 겔 밸리데이션
INVAC-1 발현 벡터가 제한 매핑에 의해 확인되었다. 패턴은 예상되는 제한 맵에 대응한다.
레인 1: 1 kb 래더(Ladder)
레인 2: 미처리된(Undigested) INVAC-1
레인 3: BglII/NotI로 처리된 INVAC- 1 (3496, 3262, 220, 142 bp 밴드)
레인 4: NcoI로 처리된 INVAC-1 (4084, 3036 bp 밴드)
레인 5: HindIII/XbaI로 처리된 INVAC-1 (3631, 3489 bp 밴드)
도 2A hTERT , INVAC -1 및 INVAC -1 유도체.
INVAC-1 및 INVAC-1 유도체에 의해 암호화된 야생형 hTERT 및 개질된 Ubi-hTERT 단백질 사이의 개략적 서열배열 (Schematic alignment):pUTDlONot (△lONot로 축약됨), pUTDlOCog (△lOCog로 축약됨) 및 pUTD23Tyn (△23로 축약됨).
서열 특징:
VDD: 촉매 사이트 내 아미노산 867-869의 결실
DGLLLRL (SEQ ID NO: 19): 아미노산 860-867의 추가 결실; 업스트림 VDD 결실
FLLVTPH (SEQ ID NO: 20): 아미노산 869-876의 추가 결실; 다운스트림 VDD 결실
IRR: 아미노산 857-859의 추가 결실; 업스트림 DGLLLRLVDD (SEQ ID NO: 21): 결실
LTH: 아미노산 877-879의 추가 결실; 다운스트림 VDDFLLVTPH (SEQ ID NO: 22): 결실
Ubi: 인간 유비퀴틴 서열 (1-76 아미노산)
V5: 용이한 단백질 검출을 위한 C-말단 V5 태그
도 2B INVAC -1 유도체를 위한 겔 밸리데이션
제한 매핑에 의해 pUTDlONot, pUTDlOCog 및 pUTD23Tyn 발현 벡터 (INVAC-1 유도체)가 확인되었다. 패턴은 예상된 제한 맵에 상응한다.
레인 M: 1 kb 래더
레인 1: pUTDlOCog (5348, 3585 bp 밴드)
레인 2: pUTDlONot (5348, 3585 bp 밴드)
레인 3: pUTD23Tyn (5348, 3546 bp 밴드)
도 3 웨스턴 블로팅에 의해 평가되는 상이한 세포주 내의 야생형 hTERT , INVAC-1 및 INVAC -1 유도체 in vitro 발현
야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT), 빈 벡터 (pNTC8685-eRNA41H, 외부 코딩 서열이 없는 INVAC-1 백본), INVAC-1 및 INVAC-1 유도체 구조물 (pUTDlONot/△10Not, pUTD10Cog/△10Cog 및 pUTD23Tyn/△23)이 HEK293T 세포 (A, C)로 형질감염되었다. 야생형 hTERT, pNTC8685-eRNA41H 빈 벡터 및 INVAC-1 구조물이 CrFK 세포(B)로 형질감염되었다.
단백질 발현이 형질감염 후 HEK293T 세포 (A, C)에 대해서 18-96h 동안 및 CrFK 세포 (B)에 대해서 24-72h 동안 모니터링 되었다.
세포 수확 시간이 각 레인의 상단에 표시된다. 세포 용해물의 총 단백질 15μg이 멤브레인 A, B, C (hTERT, INVAC-1)에 레인별로 로드되었고, 20 μg의 총 단백질 용해물이 멤브레인 C (△lONot, △lOCog, △23) 에 레인별로 로드되었다. hTERT는 항-hTERT 래빗 모노클로날 항체 (hTERT, INVAC-1) 또는 항-태그 V5 (△lONot, △lOCog, △23)로 검출되었다. β-액틴 단백질 검출이 로딩 컨트롤로 사용되었고, 항-β-액틴 마우스 모노클로날 항체로 검출되었다. CrFK 세포에서의 hTERT 단백질 검출(B) 및 HEK293T 세포에서의 INVAC-1 유도체 단백질 검출 (C)은 더 긴 노출 시간을 필요로했다.
도 4 면역형광법에 의해 평가되는 상이한 세포주 내로의 hTERT 및 INVAC -1 구조물의 세포내 국소화
야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT) , 빈 벡터 (pNTC8685-eRNA41H, 외부 코딩 서열 없는 INVAC-1 백본) 및 INVAC-1 구조물이 24시간 동안 HEK293T (A) 또는 CrFK 세포 (D)로, 및 24시간 및 48시간 동안 HeLa (B) 또는 QT6 (C) 세포로 형질감염 되었다.
세포는 항-hTERT 래빗 모노클로날 항체 및 염소 Alexa Fluor 488 항-래빗 2차 항체(녹색)로 면역 형광 염색이 수행되었다. 핵은 DAPI(청색)으로 염색되었다. 비처치된 세포는 DAPI 만으로 염색되었다. 세포는 형광 현미경 (x63)으로 분석되었다.
도 5 TRAP 에세이에 의해 평가되는 hTERT , INVAC -1 및 INVAC -1 유도체의 텔로머라제 활성
CrFK 세포가 야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT), INVAC-1 및 INVAC-1 유도체 구조물로 형질전환되었다. 24시간 후 세포가 수집되었고, 총 세포 단백질이 추출되었고 텔로머라제(역전사 효소) 활성이 텔로머성 반복 증폭 프로토콜(Telomeric Repeat Amplification 프로토콜: TRAP) 에세이에 의해 평가되었다. 야생형 hTERT 및 비처치된 CrFK 세포와 비교한 INVAC-1 (A, B) 및 INVAC-1 유도체 구조물 (C, D)의 흡광도측정(Absorbance mesurements)(OD450/690nm) 및 상대적인 텔로머라제 활성 (Relative Telomerase Activity: RTA; 샘플/양성 컨트롤 비율)이 표시된다 (2.1μg 총 단백질 농도 샘플에 대해 n = 3), **: p = 0.0016, ***: p < 0,0001, unpaired t-test.
INVAC-1 및 INVAC-1 유도체로 형질감염된 CrFK 세포에서 텔로머라제 활성은 검출되지 않았다.
도 6: INVAC -1의 ID 투여 후 인터페론-γ을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 유의한 레벨을 유도하는 전기천공법의 영향
7주-령 C57BL/6 암컷 마우스가 100 μg의 INVAC-1 또는 1X PBS로 ID 면역화되었다(그룹당 2 내지 8 마우스). 동물의 절반에 대해 면역화 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법이 수행되었다. 백신 접종 14일 후 모든 마우스의 비장이 수집되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 H2b MHC (p429, p660) 제한된 2개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 hTERT 특이적 CD8T 세포의 빈도의 중간값(median frequency) 이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석. *: p-value < 0.05. EP = 전기천공법.
도 7: 인터페론-γ을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포를 유도하기 위한 전기 천공법이 수반되는 INVAC-1 백신접종의 다양한 투여 경로의 평가.
7 내지 10주-령 형질전환된(transgenic) HLA-B7 마우스가 25μg의 INVAC-1 또는 1X PBS로 A) ID 또는 SC 경로 (그룹당 3-8 마우스) 및 B) ID 또는 IM 경로 (그룹 당 4-5 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들은 면역화 직후 각 백신접종 사이트에 전기천공법을 받았다. 백신 접종 14일 후, 모든 마우스의 비장 A) 또는 말초 혈액 B)이 수집되었다. 비장 세포 또는 PBMC는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 HLA-B7 MHC (p351, p1123 및 p277)로 제한된 3개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBMC를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T 세포의 빈도의 중간값 (median frequence) 이다. Mann Whitney 비모수적 테스트, *: p-value < 0.05. 컷-오프 역치로서 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 10 hTERT 특이적 CD8 T-세포에 교차 평행선(hatched line)이 자율적으로 설정되어, 반응하는 동물을 측정할 수 있다.
도 8: INVAC - 1를 사용한 단일 ID 면역화 및 전기천공법 후 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응에 미치는 백신 투여량의 영향
7주-령 C57BL/6 암컷 마우스가 A) 12.5, 25, 50 또는 100μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS (그룹당 4-6 마우스)로, 및 B) 100, 200, 400, 800 또는 1200μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS로 (그룹 당 3-5 마우스)로 ID 면역화되었다. 전기천공법이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 수행되었다. 백신 접종 14일 후 모든 마우스의 비장이 수득되었다.
비장 세포는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 H2b MHC (p429, p660) 제한된 2개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 를 분비하는 hTERT 특이적 CD8T 세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법.*: p-value < 0.05, **: p-value < 0.01. 교차 평행선이 10스팟/200,000 비장 세포에서 자율적으로 설정되어 반응하는 동물을 측정할 수 있다.
도 9: 인터페론-γ를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포에 대한 INVAC - 1를 이용한 프라임-부스트 백신접종 방법(regimen)의 영향
6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-B7 마우스가 25 μg 의 INVAC-1의 ID 경로 (그룹 당 5 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들은 면역 직후 각 백신 사이트에 전기천공법을 받았다. 21일 후 마우스는 동일한 방법을 사용하여 부스트 주사를 맞았다. 첫 번째 면역 전, 프라이밍 후 7일, 15일 및 21 일차 및 부스팅 후 9일, 16일 및 22일 차에 말초 혈액이 수집되었다. PBMC는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 HLA-B7 MHC(p351,p1123, 및 p277)로 제한된 3개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값 (median frequence) 이다. Mann-Whitney 비모수적 테스트, *: p-value < 0.05. 교차 평행선(hatched line)이 10 스팟/200,000 비장 세포에서 자율적으로 설정되어 반응하는 동물을 측정할 수 있다.
도 10: 인터페론-γ을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포를 유도하기 위한, INVAC-1, △ lONot , △ lOCog 또는 △ 23를 사용한 ID 백신접종 ( 단회 면역법 vs. 프 라임-부스트 방법) 및 이어지는 전기천공법의 평가.
A) 7주-령 C57BL/6 암컷 마우스가 100μg 의 INVAC-1, △lONot, △lOCog 또는 △23 또는 1X PBS로 ID 면역화되었다(그룹당 4 마우스). 전기천공법이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 수행되었다. 동물의 절반이 동일한 절차를 사용하여 일차 백신접종 20일 후에 부스트 주사되었다. 마우스 비장이 단일 또는 프라이밍 및 부스트 주사를 맞은 동물들에 대하여 마지막 면역 14일 또는 10일 후 각각 에서 수득 되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 H2b MHC (p429, p660)로 제한된 2개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 단회 주사 (PRIME, black dots) 또는 프라임 및 부스트 주사 (PB, white dots)를 투여받은 동물의 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 hTERT 특이적 CD8T 세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Mann Whitney 비모수적 테스트, *: p-value < 0.05. 컷오프가 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 10 hTERT 특이적 CD8 T 세포에서 자율적으로 설정되어 반응하는 동물을 측정할 수 있다 (교차 평행선). PB= 부스트-후.
B) 6 내지 10주-령 형질전환 된 HLA-B7 마우스가 100 μg 의 INVAC-1, △lONot, △lOCog 또는 △23 또는 1X PBS로 ID 경로 (그룹당 5마리 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 1차 백신접종 21일 후, 마우스는 동일한 방법으로 부스트 주사를 맞았다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고 19시간 동안 HLA-B7 MHC (p351, p1123 및 p277)로 제한된 3개의 hTERT 펩티드 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBL를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Mann Whitney 비모수적 테스트, *: p-value < 0.05. 컷오프(cut-off)가 10스팟/200,000 비장 세포에서 자율적으로 설정되어 반응하는 동물의 빈도를 측정할 수 있다 (교차 평행선).
도 11: 전기천공법이 뒤따르는 ID 면역법(들) 후 hTERT 특이적 T-세포 반응의 폭(breadth): INVAC -1, pNTC - hTERT 및 pNTC - hTERT -△ VDD 구조물와의 비교
7 내지 13주-령 형질전환된 HLA-B7 마우스가 5μg 의 INVAC-1, hTERT△VDD (pNTC-hTERT-△VDD), hTERT (pNTC-hTERT) 또는 빈 벡터 NTC (pNTC8685-eRNA41H)를 이용한 ID 경로(그룹당 6 마우스)를 통해 면역화되었다. 48마리의 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 동물의 절반이 동일한 절차를 사용하여 일차 백신접종 20일 후에 부스트 주사되었다. 마우스 비장이 단일 또는 프라이밍 및 부스트 주사를 맞은 동물들에 대하여 마지막 면역 14일 또는 10일 후 각각에서 수득되었다.
비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 밤사이 자극 (19시간)동안, 9-10개의 hTERT 오버래핑 펩티드(11개 아미노산에 의한 오버래핑 15mer 펩티드)의 27개 풀로 나누어진 hTERT의 269개의 정제된 펩티드 (순도 > 70%, GenScript)의 세트를 사용하여, 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다.
각 마우스당, 스팟의 중간 값이 3회당 및 자극 조건(배지 또는 펩티드 풀) 당 산출되었다. 이후, hTERT 특이적 T-세포의 빈도(F)가, 펩티드 풀 자극된 웰 내 스팟의 중간 값에서 배지 자극된 웰 내 스팟의 중간 값을 뺀 후에 산출되었다. 음성 값(negative value)이 이어지는 분석을 위해 0으로 세팅되었다.
(A 및 B) 상기 분석은 단일 (A) 또는 프라임-부스트 (B) 백신접종을 받은 동물들에 대해 수행되었다. 각각의 백신접종 그룹 (INVAC-1, hTERT△VDD, hTERT, NTC)에 대해, IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 텔로머라제 특이적 T-세포의 빈도 (F)의 중간값 (n=6)이 자극 조건당 산출되어 27개의 풀 각각에 대해 하나의 값이 획득되었다.
(C) INVAC-1, hTERT△VDD, hTERT 또는 NTC에 의한 백신접종 후 27개의 풀 (269개의 정제된 펩티드)에 대해 텔로머라제 특이적 T-세포의 빈도(F)의 중간 값의 총 합이 검출되었다. 통계적 분석이 Dunn's 보정을 이용한 비-모수(non-parametric) Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 Prism 5 소프트웨어와 함께 수행되었다. p-value < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로서 고려되었다.
도 12: 특이적 세포독성 CD8 T-세포 및 Thl -CD4 T-세포를 발생시키는 INVAC-1 ID 백신접종 및 전기천공법의 효력(potency)
A) 7 내지 10주-령 형질전환된 HLA-B7 마우스가 25 μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS를 이용한 ID 경로 (그룹당 5마리 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 접종 후 14일째 되는 날에, HLA-B7 MHC (p351 또는 p1123) 제한된 개별 hTERT 펩티드로 펄스된 또는 비펄스된 동계(syngeneic) 비장 세포가 상이한 농도[ 높은 = 1 μΜ (621), 중간의 = 0.5 μΜ (987) 및 낮은 = 0.1 μΜ (비펄스된)]에서, 카복시플루오레신-디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (carboxyfuorescein-diacetate succinimidyl ester: CFSE)로 라벨되었다. 동일한 수의 높은, 중간의 또는 낮은 CFSE 라벨된 세포가 백신된 마우스 내로 IV 전달되었다. 15-18 시간 후, 펩티드-펄스된 세포의 소멸이 유동 세포 분석법에 의해 비장 내에서 측정되었다. 특이적 용해의 비율(percentage)이 백신화된 마우스 대(versus) 컨트롤 마우스 내의, 비펄스된 세포에 대한 펄스된 세포의 비율을 비교함에 의해 산출되었다. 데이터는 INVAC-1을 ID 백신접종 후 비장 내 각개별 펩티드에 대한 각 마우스에서의 특이적 용해의 비율을 나타낸다. 수평 bar는 펩티드 당 및 면역 루트당 용해의 평균 비율 (average percentage)을 나타낸다. 표준 편차가 또한 플롯 되었다(n=10 개별 동물/ 그룹). 통계적 분석이 Dunn's 보정을 이용한 비-모수(non-parametric) Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 Prism 5 소프트웨어와 함께 수행되었고, p-value < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로서 고려되었다.
B 및 C) 6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스가 25 μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS로 ID 경로 (그룹당 7-10 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 백신접종 14일 후, 모든 마우스의 비장이 수득 되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 및 B) 19시간 동안 HLA-DRl MHC (pl029, p578 및 p904)로 제한된 3개의 hTERT 특이적 펩티드 풀로 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 3회 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포를 분비하는 hTERT 특이적 CD4 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Mann Whitney 비모수적 테스트, ***: p-value < 0.001.
C) 비장 세포의 두 번째 절반이 24시간 동안 HLA-DRl MHC (pl029, p578 및 p904) 제한된 3개의 hTERT 특이적 펩티드의 풀로 자극되었다. 자극된 세포의 상청액이 회수되었고, CBA 에세이 내에서 시험되어 hTERT 특이적 CD4 T-세포에 의해 분비된 Thl/Th2 및 Thl7 사이토카인의 농도가 평가되었다. 결과는 pg/mL의 사이토카인 농도의 중간값이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법. *: p-value < 0.05.
도 13: 동계( syngeneic ) HLA -A2/DR1 형질전환된 마우스 종양 모델 내 전기천공법이 수반되는 INVAC -1 ID 백신접종의 치료적 또는 예방적 영향
A) 5 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스가 100 μg 의 INVAC-1 또는 1X PBS로 ID 경로를 통해 (그룹당 5마리 마우스) 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 프라이밍 21일 후, 마우스는 동일한 방법에 따라 부스트 주사를 맞았다. 부스팅 1개월 후, 마우스에는 50,000 Sarc-2 종양 세포 (마우스 섬유육종)가 SC 경로를 통해 접종되었다. 각 백신된 그룹의 종양 볼륨의 중간값이 종양 세포 이식 후 일수에 따라 제시된다. 교차 평행선이 종양 성장 지연의 계산을 허용하기 위해 500mm3에 그어졌다.
B) 24주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스(그룹당 10 마우스)에 20,000 Sarc-2 종양 세포 (마우스 섬유육종)가 SC 경로를 통해서 접종되었다. 종양 세포 이식 4일 후, 동물에 25 μg 의 INVAC-1 또는 빈 플라스미드 (NTC, 항원 서열이 없는 INVAC-1 백본)가 ID 경로를 통해서 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 프라이밍 21일 및 35일 후, 마우스는 동일한 방법을 사용하여 부스트 주사가 투여되었다. 각 백신된 그룹의 종양 볼륨의 중간값이 이식 후 일수에 따라 제시된다. 교차 평행선이 종양 성장 지연의 계산을 허용하기 위해 500mm3에 그어졌다.
도 14: GM- CSF에 의한 INVAC -l-유도된 세포 면역 반응의 효력화(potentialization) 및 동계( syngeneic ) HLA -A2/DR1 형질전환된 마우스 종양 내 in vivo 효과(efficacy)
A) 7주-령 C57BL/6 암컷 마우스가 25 μg 의 INVAC-1, 25 μg 의 INVAC-1 및 0.5 μg mGM-CSF 또는 1X PBS로 ID (그룹당 5마리 마우스) 면역화되었다. 전기천공법이 각 백신접종 사이트에 INVAC-1 면역 직후에 수행되었다. 백신접종 14일 후, 모든 마우스에서 비장이 수득 되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 19시간 동안 H2b MHC (p429, p660)로 제한된 2 hTERT 특이적 펩티드의 풀로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBL을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법. **: p-value < 0.01.
B) 6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스가 100 μg 의 INVAC-1, 100 μg 의 INVAC-1 및 5 μg mGM-CSF로 ID 경로 (그룹당 5마리 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들이 각 백신사이트에서 INVAC-1 면역 직후에 전기천공법을 받았다. 백신접종 14일 후, 모든 마우스에서 비장이 수득 되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 24시간 동안 HLA-DR1 MHC (pl029, p578 및 p904)로 제한된 3 hTERT 특이적 펩티드의 풀로 3회 자극되었다. 자극된 세포의 상청액이 회수되었고, CBA 에세이 내에서 시험 되어 hTERT 특이적 CD4 T-세포에서 분비된 Thl/Th2 및 Thl7 사이토카인의 농도가 평가되었다. 결과는 pg/mL의 사이토카인 농도의 중간값이다. Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법. *: p-value < 0.05. **: p-value < 0.01.
C) 6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스 (그룹당 10 마우스)에 20,000 Sarc-2 종양 세포 (마우스 섬유육종)가 SC 경로를 통해 이식되었다. 종양 세포 이식 4일 후, 동물들이 25 μg INVAC-1 및 0.5 μg mGM-CSF, 빈 플라스미드 (NTC, 항원 서열이 없는 INVAC-1 백본) 및 0.5 μg mGM-CSF 또는 1X PBS 및 0.5 μg mGM-CSF을 ID 경로를 통해 면역화되었다. 모든 동물들은 INVAC-1 면역 직후에 각 백신 사이트에서 전기천공법을 받았다. 프라이밍 21 및 35일 후, 마우스는 동일한 프로토콜로 부스트 주사를 투여받았다. 각 백신 된 그룹 내 종양 볼륨의 중간값이 종양 세포 이식 후 일수에 따라 표시된다.
교차 평행선이 종양 성장 지연을 계산할 수 있도록 500mm3에 그어졌다.
도 15: INVAC -1 유도된 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응의 효력화(potentiate)에의 IL-12의 영향
6 내지 10주-령 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스가 100 μg 의 INVAC-1, 100 μg 의 INVAC-1 및 1 ng IL-12, 1X PBS 또는 1X PBS 및 1 ng IL-12로 ID 경로 (그룹당 5마리 마우스)를 통해 면역화되었다. 모든 동물들은 각 백신 사이트에서 INVAC-1 면역 직후에 전기천공법을 받았다. 백신 접종 14일 후, 모든 마우스의 비장이 수득되었다. 비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 19시간 동안 HLA-A2 (UCP4.1 및 UCP2.1)로 제한된 2개의 hTERT 특이적 펩티드의 풀로 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 3회 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액으로 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBL를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. 반응 동물을 결정할 수 있도록 교차 평행선이 10 스팟/200,000 비장 세포에서 설정되었다.
도 16은 INVAC-1 플라스미드 발현 벡터의 전체 뉴클레오티드 서열(complete nucleotide sequence)을 보여준다 (7120 bp). 벡터 특징은 도 1A에 대한 설명부분(legend)에서 설명된다. INVAC-1-암호화된 hTERT 융합 단백질 (1158 AA)은 위치 3488 (M 아미노-산을 위한 ATG 코딩)에서 시작하여 6961 (D 아미노-산을 위한 GAC 코딩) 에서 종결된다. INVAC- 1/hTERT 단백질에서 47개의 첫 번째 아미노-산 (1-47 AA)이 결실되고, 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 촉매 사이트는 야생형 인간 텔로머라제(hTERT; Accession number NM_198253) 에 상응하는 AA 867-869에 대응되고 VDD (서열 내 *)를 코딩하는 9 bp 결실 (뉴클레오티드 6172-6173 사이)에 의해 불활성화되었다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이고; 두 번째 라인은 아미노-산 서열에 대응된다. 주석 (또한, 도 1A 참조)이 서열 위 또는 아래에 주어진다."□": 스탑 코돈.
도 17은 D10Not 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질 (Ubi-hTERT)을 암호화하는 인서트 서열을 나타낸다. hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 추가 결실이 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; Accession number NM_198253)의 AA 860-869에 상응하는 아미노산 912-913 (* 서열 참조) 사이에 삽입되었다. 상기 10개의 아미노산 결실은 인간 TERT 효소적 활성의 불활성화를 야기하는 3개의 AA 결실 (△VDD) 및 VDD 서열 업스트림의 추가적 7개 AA의 결실을 포함한다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개의 아미노산은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다; 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다. 주석이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
도 18은 D10Cog 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질 (Ubi-hTERT)을 암호화하는 인서트 서열을 나타낸다. hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 추가 결실이 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; Accession number NM_198253)의 AA 867-876에 상응하는 아미노산 919-920 (* 서열 참조)에 도입되었다. 상기 10개의 아미노산 결실은 인간 TERT 효소적 활성의 불활성화를 야기하는 3개의 AA 결실 (△VDD) 및 VDD 서열 다운스트림의 추가적 7개 AA의 결실을 포함한다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다; 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다. 주석이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
도 19는 D23Tyn 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질 (Ubi-hTERT)의 인서트 서열을 나타낸다. hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 추가 결실이 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; Accession number NM_198253)의 AA 857-879 에 상응하는 아미노산 909-910 (* 서열 참조) 사이에 도입되었다. 상기 23개의 아미노산 결실은 인간 TERT 효소적 활성의 불활성화를 야기하는 3개의 AA 결실 (△VDD) 및 VDD 서열의 업스트림 및 다운스트림의 추가적 10개의 AA의 결실을 포함한다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다; 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다. 주석이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
도 20 INVAC -1 셔플된 유도체 플라스미드 맵
도 20A pUTScram : 벡터 특징
도 20B pUTInv : 벡터 특징
도 21A pUTScram에 대한 겔 밸리데이션
pUTScram 발현 벡터가 제한 매핑에 의해 확인되었다. 패턴은 예상된 제한 맴에 상응한다.
레인 M: 1 kb 래더
레인 1 : HindIII/XbaI로 처리된 pUTScram (3576, 5342 bp 밴드)
도 21B pUTInv 에 대한 겔 밸리데이션
pUTInv 발현 벡터가 제한 매핑에 의해 확인되었다. 패턴이 예상된 제한 맵에 상응한다.
레인 M: 1 kb 래더
레인 1: HindIII/XbaI로 처리된 pUTInv (3576, 5342 bp 밴드)
도 22 hTERT , INVAC -1, pUTScram 및 pUTInv 구조물
야생형 hTERT 및 INVAC-1에 의해 암호화된 개질된 Ubi-hTERT 단백질 및 INVAC-1 셔플된 유도체: pUTScram (스크램블체) 및 pUTInv (역전체) 사이의 개략적 서열배열 (Schematic alignment).
개질된 hTERT 서열 (△VDD)이 10개의 면역원성 단편으로 나누어졌다: 단편 1 (258 bp; Leu24 - Glyl09), 단편 2 (201 bp; Phel l5 - Alal81), 단편 3 (120 bp; Trp203 - Ala242), 단편 4 (117 bp; Ser255 - Arg293), 단편 5 (303 bp; Pro320 -Thr420), 단편 6 (312 bp; Ala423 - Val526), 단편 7 (210 bp; Cys528 - Gln597), 단편 8 (477 bp; Arg599 - Lys757), 단편 9 (576 bp; Lys760 - Ile951), 단편 10 (516 bp; Asn958 - Aspll29).
서열 특징:
VDD : 촉매 사이트 내 아미노산 867-869의 결실
Ubi : 인간 유비퀴틴 서열 (1-76 아미노산)
F ( Phe ): hTERT의 페닐알라닌 잔기 (AA47)
G ( Gly ): 유비퀴틴의 C-말단 글리신 잔기 (AA76)
R ( Arg ): 아르기닌, INVAC-1 단백질의 첫 번째 아미노산 (AA 77)
N ( Asn ): 아스파라긴, pUTScram에 의해 암호화된 (스크램블된) hTERT 단백질의 첫 번째 아미노산 (AA 81)
C ( Cys ): 시스테인, pUTInv에 의해 암호화된 (역전된) 인조의 hTERT 단백질의 첫 번째 아미노산 (AA 81)
V5: 용이한 단백질 검출을 위한 C-말단 V5 태그
도 23 웨스턴 블로팅에 의해 평가되는 야생형 hTERT , INVAC -1 및 INVAC -1 셔 플된 유도체의 in vitro 발현
(A 및 C)야생형 hTERT, INVAC-1, pUTScram 및 pUTInv이 HEK293T 세포로 형질감염되었다. 단백질 발현은 형질감염 18-96h 후 모니터링되었다. 야생형 hTERT 및 INVAC-1 샘플이 18 h 및 72 h동안 15 μg의 총 단백질 농도로 로딩되었다. 상기 샘플은 단백질 발현의 양성 컨트롤로서 사용되었다. (A) 스크램블된 및 (C) 역전된 단백질이 레인당 20 μg 의 세포 용해물의 총 단백질로 로딩 되었다. hTERT가 항-hTERT 래빗 모노클로날 항체 (hTERT, INVAC-1) 또는 항-태그 V5 마우스 모노클로날 항체 (Srambled, Inverted)를 사용하여 검출되었다. 세포 수확의 시간이 각 레인의 상단(top)에 표시되었고, β-액틴 단백은 로딩 컨트롤로 사용되어 항-β-액틴 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 검출되었다. INVAC-1 셔플된 유도체 산물의 검출은 야생형 hTERT 및 INVAC-1 단백질보다 더 긴 노출 시간을 필요로 했다 (10 sec 내지 30 min 대(against) 1 sec 미만). 셔플된 단백질 시그널 강도가 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 웨스턴 블롯 상에서 β-액틴 시그널에 대해 정상화되었다 (A 및 C). (B) 스크램블체. (D) 역전체. 로딩 컨트롤의 프로파일 및 단백질 밴드가 각 레인별로 발생되어 프로파일 곡선 하 면적에 상응하는 임의의 수가 획득되었다. 비율(상대적 농도)이 각 샘플에 대한 면적 값을 상응하는 로딩-컨트롤의 면적 값으로 나눔으로써 산출되었다.
도 24. hTERT , INVAC -1 및 INVAC -1 셔플된 유도체의 텔로머라제 활성이 TRAP 에세이에 의해서 평가되었다.
CrFK 세포가 야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT), pUTScram 및 pUTInv 구조물에 의해 형질감염되었다. 세포 수집 24시간 후, 총 세포 단백질이 추출되었고 및 텔로머라제(역전사효소) 활성이 텔로머성 반복 증폭 프로토콜 (TRAP) 에세이에 의해서 평가되었다. 흡광도 측정 (OD450/690 nm) 및 야생형 hTERT 및 비처치된 CrFK 세포과 비교하여 셔플된 구조물 (A 및 B 각각)의 상대적 텔로머라제 활성 (RTA; 샘플/양성 컨트롤 비율)이 기술되었고 (n = 3, 2.1 μg 의 총 단백질 농도 샘플), [unpaired t-test]가 수행되었다.
pUTScram 및 pUTInv 구조물로 형질감염된 CrFK 세포 내에서 텔로머라제 활성이 검출되지 않았다
도 25: INVAC -1, pUTScram 및 pUTInv를 사용한 ID 백신접종 및 전기천공법의 인터페론-γ을 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포를 유도에 대한 평가.
9 내지 15주-령 형질감염 HLA-B7 마우스가 두 번의 면역 사이클 (프라임-부스트 방법) 상에서 100 μg 의 INVAC-1, pUTScram, pUTInv 또는 1X PBS로 ID 경로 (3-그룹당 5마리 마우스)를 통하여 면역되었다. 전기천공법이 각 백신접종 사이트에 각 면역 직후에 수행되었다. 마우스 비장이 이차 면역 10일 후에 수득 되었다.
비장 세포는 Ficoll 정제되었고, 19시간 동안 HLA-B7 MHC (p277, p351 및 p1123)로 제한된 3개의 hTERT 특이적 펩티드의 풀 또는 자유 배지로 3회 IFN-γ ELIspot 에세이 내에서 자극되었다. 비오틴-접합된 검출 항체 및 뒤따르는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액으로 스팟이 나타났다. 결과는 IFNγ/200,000 비장 세포 또는 PBL를 분비하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값(median frequency)이다. Mann Whitney 비모수적 테스트가 수행되었다, *: p-value < 0.05. 반응 동물의 빈도를 결정하기 위하여 컷-오프가 10 스팟/200,000 비장 세포에서 자발적으로 설정되었다 (교차 평행선).
도 26: ID 백신접종 및 전기천공법 후 특이적 세포독성 CD8 T-세포 및 Thl-CD4 T-세포를 발생시키는 pUTScram 및 pUTInv의 효력(potency)
15주-령 형질전환된 HLA-B7 마우스가 100 μg 의 INVAC-1, pUTScram, pUTInv 또는 1X PBS로 ID 경로를 통해 면역화되었다. 모든 동물이 면역 직후 각 백신접종 사이트에서 전기천공법을 받았다. 접종 후 14일째 되는 날에, HLA-B7 MHC (p351 또는 p1123)로 제한된 개별 hTERT 펩티드로 펄스된 또는 비펄스된 동계 비장 세포가 상이한 농도[ 높은 = 5 μΜ (351), 중간의 = 2 μΜ (1123) 및 낮은 = 0.2 μΜ (비펄스된)]에서, 카복시플루오레신-디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (carboxyfuorescein-diacetate succinimidyl ester: CFSE) 로 라벨되었다. 각 농도로부터 동일한 수의 CFSE 라벨된 세포를 포함하는 혼합물이 안와정맥을 통해 백신된 마우스에 투여되었다 (IV). 15-18 시간 후, 펩티드-펄스된 세포의 소멸이 유동 세포 분석법에 의해 비장 내에서 측정되었다. 백신된 마우스 대 컨트롤 마우스 내에서 특이적 용해의 비율이 비펄스된 세포에 대한 펄스된 세포의 비율을 비교함에 의해서 산출되었다. 데이터는 ID 백신접종 후 비장 내 각 개별 펩티드에 대한 각 마우스의 특이적 용해 비율을 나타낸다. 평행 bar는 펩티드 당 용해 비율의 중간값을 나타낸다. 통계적 분석이 Dunn's 보정을 이용한 비-모수(non-parametric) Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 Prism 5 소프트웨어와 함께 수행되었고, p-value < 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로서 고려되었다.
도 27은 INVAC-1 셔플된 유도체의 구성에 사용되는 Ubi-hTERT 코돈 최적화된 서열의 면역원성 세그먼트의 묘사(delineation)를 보여준다. 첫 번째 라인은 Ubi-hTERT의 최적화된 뉴클레오티드 서열의 코돈이고 (SEQ ID NO: 45) 및 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO: 46). Ubi-hTERT 서열은 면역원성 서열은 포함하는 10개의 단편으로 나누어졌다. 상기 단편들은 기호(< ... >)로 묘사된다. 면역원성 서열은 회색으로 강조되었다. pUTScram 및 pUTInv 구조물 내 포함되지 않은 비-면역원성 내(inter)-단편 hTERT 서열이 밑줄 되었다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 주석이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. (*)은 VDD 서열 결실을 나타낸다. "□": 스탑 코돈.
도 28은 pUTScram 인서트의 전체 뉴클레오티드 서열을 보여준다 (3555 bp). 벡터 특징이 도 20 레전드에 기술된다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트 (스크램블체, 1184 AA)는 위치 923 (M 아미노산을 위한 ATG 코딩)에서 시작하고 위치 4474 (T 아미노산을 위한 ACT 코딩)에서 종결되었다. hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 촉매 사이트는 VDD (* 서열 내)를 코딩하고 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; 특허 WO 2007/014740 및 hTERT isoform 1 Accession number NM_198253)의 AA 867-869에 상응하는 9 bp 결실에 의해 불활성화되었다. hTERT 서열이 10개의 면역원성 단편으로 나누어졌고, 다음의 특이적인 순서로 재조합되었다: 단편 7 (210 bp), 단편 2 (201 bp), 단편 6 (312 bp), 단편 4 (117 bp), 단편 9 (576 bp), 단편 3 (120 bp), 단편 1 (258 bp), 단편 8 (477 bp), 단편 10 (516 bp), 단편 5 (303 bp). 상기 10개의 단편이 6xGly 링커 (G 링커; 18 bp)로 연결된다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:47);두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO:48). 주석(또한, 도 20A 참조)이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
도 29는 pUTInv 인서트의 전체 뉴클레오티드 서열을 보여준다(3555 bp). 벡터 특징이 도 20 레전드에 기술된다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트 (역전체, 1184 AA)는 pUTInv의 위치 923 (M 아미노산을 위한 ATG 코딩)에서 시작하고, 위치 4474 (T-아미노산을 위한 ACT 코딩)에서 종결된다. hTERT 단백질에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 촉매사이트는 VDD (* 서열 내)를 코딩하고 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; 특허 WO 2007/014740; Accession number NM_198253)의 AA 867-869에 상응하는 9 bp 결실에 의해 불활성화되었다. hTERT 서열이 10개의 면역원성 단편으로 나누어졌고, 다음의 특이적인 순서로 재조합되었다: 단편 10 (516 bp), 단편 9 (576 bp), 단편 8 (477 bp), 단편 7 (210 bp), 단편 6 (312 bp), 단편 5 (303 bp), 단편 4 (117 bp), 단편 3 (120 bp), 단편 2 (201 bp), 단편 1 (258 bp). 상기 10개의 단편은 6xGly 링커 (G 링커; 18 bp)로 연결되었다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다. 첫 번째 라인은 뉴클레오티드 서열이다 (SEQ ID NO:49); 두 번째 라인은 대응하는 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO:50). 주석(또한, 도20B 참조)이 서열의 위 또는 아래에 주어진다. "□": 스탑 코돈.
정의
텔로머라제 복합체는 RNA 주형 및 텔로머라제 활성의 주요 결정 요인인 " 텔로머라제 역전사효소" (TERT)로 언급되는 역전사 효소를 포함하는 단백질 성분으로 구성된다. 다르게 특정되지 않는 한, 본원에서, 용어 "텔로머라제"는 야생형 인간 텔로머라제를 포함하는 TERT 또는 이의 변이체를 의미한다. 야생-형 인간 텔로머라제 (또는 hTERT)는 공지되어 있고 (GeneBank Accession number NM_198253), 및 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 (cDNA는 SEQ ID NO: 1로 지정됨)를 가진다.
" 텔로머라제 촉매 활성"은 텔로머라제 역전사효소로서 TERT의 활성을 의미한다. 용어 "텔로머라제 촉매 활성이 결여된"은 핵산 서열이 불활성인 돌연변이체 TERT를 암호화하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 용어 " 변이체" 는 참조의 hTERT 서열과 상동인, 대립형질 변이체, 스플라이싱 변이체, 천연 또는 인조 돌연변이체를 의미한다.
하나 이상의 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 잔기로 대체되거나, 또는 80% 초과의 아미노산 아미노산이 동일하거나 또는 약 90% 초과, 바람직하게는 약 95% 초과가 유사 (기능적으로 동일)한 경우, 두 개의 아미노산 서열은 "상동", "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 바람직하게는, 유사한 또는 상동의 서열은 예를 들어 GCG (Genetics Computer Group, GCG 패키지를 위한 프로그램 매뉴얼, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램, 또는 공지된 임의의 프로그램 (BLAST, FASTA, 등)을 사용하는 서열배열에 의해 확인된다.
"치환" 또는 "개질"에 의해, 본 발명은 천연에서 발생한 아미노산에서 대체된 또는 개질되어온 상기 아미노산을 포함한다.
변이체는 하나 또는 복수의 돌연변이 (즉 치환, 결실, 삽입), 여전히 바람직하게는 하나 또는 복수의 싱글 포인트 치환에 의해 야생형 hTERT 단백질과는 상이한 서열을 가지는 단백질을 포함한다. 변이체는 보존 치환을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "보존 치환"은 펩티드의 전체적인 형태와 기능에 변화를 주지 않으면서 한 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미하며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 한 아미노산의 유사한 특성(예, 극성, 수소결합 포텐셜, 산성, 염기성, 형상, 소수성, 방향족성 등)을 갖는 아미노산으로의 치환을 포함한다. 유사한 특성이 갖는 아미노산들은 본 분야에 잘 알려졌다. 예를 들어, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신은 친수성-염기성 아미노산이고 상호치환가능하다. 유사하게, 소수성 아미노산인 이소류신은 류신, 메티오닌 또는 발린으로 치환될 수 있다. 서로 치환될 수 있는 중성 친수성 아미노산으로는 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌이 포함된다.
용어 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드가 자연적으로 발생한 환경에서 제거된 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 예를 들어, 살아있는 박테리아의 게놈 내 또는 유전자 bank의 일부분으로서 존재하는 자연적으로-발생한 DNA 분자는 분리되지 않은 것이지만, 예를 들어 클로닝 활동(증폭)에 의해 박테리아의 게놈의 나머지 부분과 분리된 동일한 분자는 분리된 것이다. 일반적으로, 분리된 DNA 분자는 자연적으로 발생하는 게놈 내에서, 5' 또는 3' 말단에 즉시 인접한 DNA 영역 (예컨대, 코딩 영역)으로부터 자유롭다. 상기의 분리된 폴리뉴클레오티드는 벡터 또는 조성물의 일부가 될 수 있고, 상기 벡터 또는 조성물이 상기 폴리뉴클레오티드의 천연의 환경의 부분이 아니라는 점에서 여전히 분리된 것으로 정의된다.
용어 "면역원성"은 투여에 의해서 면역 반응을 유도할 수 있는 조성물 또는 구조물을 의미한다. 개체 내 "면역 반응"은 항원에 대한 체액성 면역 반응, 세포 면역 반응, 또는 체액성 및 세포 면역 반응을 포함하는, 선천적 및 후천적 면역 반응의 발달을 의미한다. "체액성 면역 반응"은 항체에 의해 매개 되는 것을 의미한다. "세포 면역 반응"은 T-림프구에 의해 매개 되는 것이다. 이는 활성화된 T-세포, 백혈구, 또는 이들 둘 모두에 의해 생산되는 사이토카인, 케모카인 및 유사 분자의 생산을 포함한다. 면역 반응은 당해 분야에 공지된, 체액성 면역 반응의 검출을 위한 표준 면역에세이 및 중화 에세이를 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 면역 반응은 바람직하게는 세포독성적 CD8 T-세포 및/또는 CD4 T-세포의 자극 또는 증식을 포함하고, ELIspot 에세이, in vivo 세포독성 에세이 또는 사이토카인 분비 결합 에세이와 같은 면역에세이를 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "요법" 또는 "면역요법"은 증상의 완화, 호전 및/또는 완치, 경감 및/또는 안정화 (예컨대, 더 발전된 단계로 진행하는 것의 실패), 그뿐만 아니라, 종양 또는 이상형성 또는 이들의 증상의 진행의 지연 중 어느 하나를 의미한다. 용어는 따라서 암 환자에게서 관찰되는 효과적 항 종양 면역 반응의 달성을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "예방" 또는 "예방하는"은 특이적 증상의 발현 전 질병의 시작을 의미하는 것일지도 모르는 전구증상, 즉 임의의 변경 또는 전조 증상 (또는 증상 세트)의 완화, 호전 및/또는 완치, 경감 및/또는 안정화 (예컨대, 더 발전된 단계로 진행하는 것의 실패)를 의미한다.
"텔로머라제를 과발현"하는 세포는, 일반적으로는 발현하지 않지만, 정상 상태에서 돌연변이 또는 감염, 특히 온코바이러스에 의한 감염에 의해 텔로머라제를 발현하는 개체 내 세포, 또는 정상 상태와 비교할 때 (예를 들어 돌연변이 또는 감염에 의해) 높은 레벨의 텔로머라제를 발현하는 개체 내 세포를 의미한다. 바람직하게는 텔로머라제를 과발현하는 세포는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 그 이상의 발현의 증가를 보여준다.
"환자" 또는 "개체"는 임의의 연령, 성별 또는 질환의 심각도를 가지는 일반적으로 포유류 개체, 바람직하게는 인간 개체이다.
핵산 구조물
본원에서는 환자에게 백신 접종이 가능하도록 디자인된 핵산 구조물이 제공된다. 핵산 구조물은 (이의 불멸화(immortalizing) 활성을 제거하는) 텔로머라제 촉매 활성이 없고 및 (핵인으로의 전달을 억제하는) 핵인 국소화 시그널이 없는 텔로머라제를 암호화한다.
본 발명의 핵산 구조물은 분리된 형태로 존재한다.
핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 바람직하게는 DNA, 여전히 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
핵산 구조물은 자연적으로-발생한 게놈의 핵산이 아니고, 특히 이는 인트론을 포함하지 않는다.
제1 안전장치로서, hTERT 서열은 텔로머라제 촉매 활성이 없다. 바람직한 구현예에서, hTERT를 암호화하는 서열은 hTERT 단백질의 촉매 활성의 불활성화를 제공하는 돌연변이를 포함한다. 용어 "돌연변이" 에는 하나 또는 복수의 아미노산의 치환, 하나 또는 복수의 아미노산의 결실, 및/또는 하나 또는 복수의 아미노산의 삽입이 포함된다. 특정의 구현예에서, hTERT 단백질은 적어도 하나의 아미노산의 결실에 의해 텔로머라제의 촉매 활성이 없다.
도 2A에서 보이는 바와 같이, 바람직하게는 서열은 결실, 바람직하게는 아미노산 VDD 결실을 보인다. 바람직하게는 hTERT 단백질은 아미노산 867-869 (VDD) 결실 단독에 의해 텔로머라제 촉매 활성이 결여된다. 또 다른 특정의 구현예에서 hTERT 단백질은 아미노산 867-869 (VDD) 업스트림 및/또는 다운스트림의 1 내지 10, 11 또는 12개의 아미노산의 추가의 결실에 의해 텔로머라제 촉매 활성이 결여된다.
제2의 안전장치로서, hTERT를 암호화하는 서열은 핵인 국소화 시그널이 추가로 결여된다. 상기 핵인 국소화 시그널은 hTERT의 준세포(subcellular) 국소화 및 따라서 이의 효소적 활성과 상호 관련된다. 바람직하게는 hTERT 단백질은 적어도 아미노산 1-23의 결실, 여전히 바람직하게는 아미노산 1-47의 결실에 의해 핵인 국소화 시그널이 결여된다.
제1 및 제2 안전장치를 제공하는 변형에 더하여, 본 발명의 핵산 구조물에 의해 암호화되는 hTERT 단백질은 야생형 hTERT 서열 또는 변이체 서열일 수 있다.
서열목록에서,
SEQ ID NO: 1 는 야생형 hTERT의 cDNA이다;
SEQ ID NO: 2 는 대응하는 아미노산 서열이다;
SEQ ID NO: 3 은 INVAC-1 벡터 내에서 사용되는 hTERT의 cDNA이다;
SEQ ID NO: 4 는 대응하는 아미노산 서열이다;
SEQ ID NO: 5 는 pUTDlONot 벡터에서 사용되는 hTERT의 cDNA이다;
SEQ ID NO: 6 은 대응하는 아미노산 서열이다;
SEQ ID NO: 7 은 pUTDlOCog 벡터에서 사용되는 hTERT의 cDNA이다 ;
SEQ ID NO: 8 은 대응하는 아미노산 서열이다;
SEQ ID NO: 9 는 pUTD23Tyn 벡터에서 사용되는 hTERT의 cDNA이다;
SEQ ID NO: 10 은 대응하는 아미노산 서열이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 4의 단백질을 암호화하는 핵산을 사용한다.
상기 핵산은 서열 SEQ ID NO: 3을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 핵산 구조물은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 6, 8 또는 10을 암호화하고, 바람직하게는 SEQ ID NO: 5, 7 또는 9을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 핵산은 hTERT 단백질의 프로테아좀으로의 어드레싱을 향상(유도된 펩티드의 class I 제공(presentation)을 증가)시키는 단백질을 추가로 암호화할 수 있다. 더욱 상세하게는, hTERT 단백질은 N-말단에서 hTERT 단백질의 프로테아좀으로의 어드레싱을 향상시키는 단백질과 융합될 수 있다. 상기 단백질은 바람직하게는 유비퀴틴일 수 있고, 또는 임의의 샤프롱 단백질, 예를 들어 칼레티쿨린일 수 있다.
서열목록에서,
SEQ ID NO: 11은 INVAC-1에 의해 암호화된 Ubi-hTERT의 cDNA 를 포함하는 INVAC-1 플라스미드의 전체-길이 서열이다;
SEQ ID NO: 12는 INVAC-1에 의해 암호화된 Ubi-hTERT의 대응하는 아미노산 서열이다;
SEQ ID NO: 13은 pUTDlONot 인서트의 cDNA이다;
SEQ ID NO: 14는 대응하는 아미노산 서열이다;
SEQ ID NO: 15는 pUTDlOCog 인서트의 cDNA이다;
SEQ ID NO: 16은 대응하는 아미노산 서열이다;
SEQ ID NO: 17은 pUTD23Tyn 인서트의 cDNA이다;
SEQ ID NO: 18은 대응하는 아미노산 서열이다.
특정의 구현예에서, 핵산 구조물은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 12를 암호화한다.
더욱 상세하게는, 핵산 구조물은 SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 3488 내지 6961를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 핵산 구조물은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 14, 16, 또는 18를 암호화하고, 바람직하게는 SEQ ID NO: 13, 15, 또는 17을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT)에서 유래된 서열을 포함하는 핵산 구조물이 제공되고, 상기의 hTERT에서 유래된 서열은:
i) hTERT의 모든 또는 실질적으로 모든 에피토프를 암호화하고, 임의의 순서로, 및
ii) 텔로머라제 촉매 활성 및 핵인 국소화 시그널이 결여된 단백질을 암호화한다.
본 발명의 핵산 구조물은 분리된 형태로 존재한다.
핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 바람직하게는 DNA, 여전히 바람직하게는 이중 가닥 DNA다. 핵산 구조물은 자연적으로-발생한 게놈의 핵산이 아니고, 특히 이는 인트론을 포함하지 않는다.
상기 구조물은 본원 명세서상에서 "셔플된 구조물" 또는 "폴리에피토프 구조물"로 지칭된다.
용어 "hTERT의 에피토프"는 항원성 결정요인, 즉 면역 시스템의 세포에 의해 인식되고, 면역원성, 즉 면역 반응을 이끌어내는 hTERT의 임의의 아미노산 단편을 의미한다. 바람직하게는, 이는 항-hTERT T-세포에 의해 특이적으로 인식될 수 있다. hTERT의 수개의 면역원성 에피토프 서열이 되었다. MHC class I 제한된 hTERT 에피토프에 대한 국제 특허 출원 WO07014740이 참조된다. 다른 것들이 본원에서 기술된다 (도 27 및 하기 표 2 참조)
상기 "셔플된 구조물"은 hTERT에 대한 특이적 반응을 이끌어낼 수 있는데 즉, 세포독성 T 림프구(CTL)가 야생형 에피토프를 인식한다.
어떠한 "셔플된 구조물"도 전체 길이 hTERT의 코딩 서열과 일치하지 않는다.
용어 "실질적으로 모든 에피토프"는 적어도 80%, 여전히 바람직하게는 적어도 85%, 여전히 바람직하게는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 의 야생-형 hTERT의 에피토프를 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 구조물을 의미한다.
다중 에피토프를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 유닛(등)은 임의의 순서로, 연속하여 재배열, 즉, 3' 말단의 제1 폴리뉴클레오티드 유닛이 제2 폴리뉴클레오티드 유닛의 5'단ㄷk과 직접 연결되고 (기타 등등) 따라서 연이은 에피토프만으로 구성된 펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 이어질 수 있다. 다중 에피토프는 그 대신 하나의-아미노산 스페이서 또는 펩티드 스페이서에 의해 분리될 수 있는데, 즉 이는 상이한 폴리뉴클레오티드 유닛이 하나 또는 복수의 아미노산(들) 각각을 암호화하는 하나 또는 복수의 코돈(들)에 의해 분리된다는 것을 의미한다. 일반적으로, 면역원성 hTERT 단편은 약 4개 내지 6개의 Gly 아미노산에 의해 분리될 수 있다.
에피토프가 재배열되는 순서는 하기의 기준에 따라, 당업자가 결정할 수 있다: 몇몇 순서는 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 가능하게 하고 특히 삼차원적 형태가 특성에 영향을 기치는 경우, 결과로서 발현된 폴리에피토프를 소포체 (ER) 내로 이동시키는 것을 가능하게 할 수 있고, 복수의 에피토프 또는 아날로그 내 폴리에피토프의 프로세싱을 가능하게 하며, 에피토프의 오버래핑 프로세싱을 회피하게 할 수 있다.
바람직한 구현예에서, hTERT 아미노산 24 내지 아미노산 1132의 모든 또는 실질적으로 모든 면역원성 에피토프는 비록 임의의 순서로, 핵산 구조물에 의해 암호화된다.
하기 표는 "셔플" 구조물 내에서 재배열될 수 있는 면역원성 서열을 보여준다.
따라서, 본 발명은 임의의 순서로 SEQ ID NO: 61 내지 97로 표시되는 면역원성 서열 모두 또는 실질적으로 모두를 포함하는 폴리에피토프 성 핵산 구조물을 제공한다.
본 서열은 텔로머라제 촉매 활성이 결여된다. 바람직한 구현예에서, hTERT 촉매 활성을 나르는 단편은, 촉매 활성의 불활성화를 유발하는 돌연변이를 포함한다. 용어 "돌연변이"는 하나 또는 복수의 아미노산의 치환, 하나 또는 복수의 아미노산의 결실, 및/또는 하나 또는 복수의 아미노산의 삽입을 포함한다. 특정의 구현예에서, 단백질은 적어도 하나의 아미노산의 결실에 의해 텔로머라제 촉매 활성이 결여된다.
바람직하게는 본 서열은 도 22에서 나타나는 바와 같이 결실, 바람직하게는 아미노산 VDD의 결실을 나타낸다. 바람직하게는 hTERT 단백질은 아미노산 867-869 (VDD)의 결실 만에 의해 텔로머라제 촉매 활성이 결여된다. 또 다른 측정 구현예에서 단백질은 hTERT의 아미노산 867-869 (VDD)의 업스트림 및/또는 다운스트림의 1 내지 10, 11 또는 12개의 아미노산의 추가의 결실에 의해 텔로머라제 촉매 활성이 결여된다.
본 서열은 추가로 핵인 국소화 시그널이 결여된다. 상기 핵인 국소와 시그널은 hTERT의 준세포 국소화 및 따라서 이의 효소적 활성과 상호 관련된다. 바람직하게는 본 단백질은 hTERT의 적어도 아미노산 1-23의 결실, 여전히 바람직하게는 아미노산 1-47의 결실에 의해 핵인 국소화 시그널이 결여된다.
바람직한 구현예에서, 핵산은 상기 단백질의 프로테아좀으로의 어드레싱을 향상(유도된 펩티드의 class I 제공(presentation)을 증가)시키는 단백질을 추가로 암호화할 수 있다. 더욱 상세하게는, 단백질은 N-말단에서 단백질의 프로테아좀으로의 어드레싱을 향상시키는 단백질과 융합될 수 있다. 상기 단백질은 바람직하게는 유비퀴틴일 수 있고, 또는 임의의 샤프롱 단백질, 예를 들어 칼레티쿨린일 수 있다.
△hTERT는 VDD 867-869 아미노산이 결실된 hTERT를 의미한다.
특정의 핵산 구조물은, 임의의 순서로, △hTERT의 Leu24 내지 Glyl09를 암호화하는 단편 1(SEQ ID NO:51), △hTERT의 Phell5 내지 Alal81를 암호화하는 단편 2(SEQ ID NO:52), △hTERT의 Trp203 내지 Ala242를 암호화하는 단편 3 (SEQ ID NO:53), △hTERT의 Ser255 내지 Arg293를 암호화하는 단편 4 (SEQ ID NO:54), △hTERT 의 Pro320 내지 Thr420를 암호화하는 단편 5(SEQ ID NO:55), △hTERT의 Ala423 내지 Val526를 암호화하는 단편 6 (SEQ ID NO: 56), △hTERT의 Cys528 내지 Gln597를 암호화하는 단편 7, △hTERT의 Arg599 내지 Lys757를 암호화하는 단편 8 (SEQ ID NO:58), △hTERT의 Lys760 내지 Ile951를 암호화하는 단편 9 (SEQ ID NO:59), △hTERT의 Asn958 내지 Aspl 129를 암호화하는 단편 10(SEQ ID NO:60)을 포함한다.
바람직한 구조물은 SEQ ID NO:48 (또한, 본원에서는 "스크램블체"로 언급됨)을 암호화하고, 이는 도 28에서 개시된다.
또 다른 바람직한 구조물은 SEQ ID NO:50 (또한, 본원에서는 "역전체 (Inverted)로 언급됨)을 암호화하고, 이는 도 29에서 개시된다.
유전성 구조물, 면역원성 조성물 및 투여
바람직하게는, 본 핵산은 본원에서 정의된 폴리뉴클레오티드 서열 및 숙주 세포 또는 숙주 유기체 내 단백질 산물의 발현(예를 들어 전사 및 번역)을 허용하는 조절 서열(예를 들어 적절한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들), 등)을 포함한다.
본 발명의 유전성 구조물은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 이중-가닥 DNA 이다. 본 발명의 유전성 구조물은 또한 의도되는 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 형질전환에 적합한 형태, 의도된 숙주 세포의 게놈성 DNA로의 인테그레이션 에 적합한 형태, 의도되는 숙주 내의 독립적 복제, 유지 및/또는 유전에 적합한 형태일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유전성 구조물은 예를 들어 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스 백터 또는 트랜스포존과 같은 백터의 형태일 수 있다. 특히, 백터는 발현 벡터, 즉 (예컨대 적절한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템 내에서) in vitro 및/또는 in vivo 발현을 제공할 수 있는 벡터일 수 있다.
비제한적인 바람직한 양상에서, 본 발명의 유전성 구조물은 i) 본 발명의 적어도 하나의 핵산; 상기 핵산과 사용 가능하도록 연결된 ii) 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어 프로모터 및 임의로 적절한 터미네이터; 및 임의로 iii) 하나 이상의 유전성 구조물의 추가 요소 예를 들어 3'- 또는 5'-UTR 서열, 리더 서열, 선택 마커, 발현 마커/리포터 유전자, 및/또는 형질전환 또는 인테그레이션(의 효율)을 가능하게하거나 또는 증가시킬 수 있는 요소를 포함한다.
특정의 구현예에서, 유전성 구조물은 핵산 폴리머가 제한 엔도뉴클레아제로 절단되고 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 또는 Rous 육종 바이러스 (RSV) 프로모터와 같은 프로모터를 함유하는 플라스미드 내로의 클로닝에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 구현예에서, TERT 핵산 서열은 NTC8685-eRNA41H 발현 플라스미드 내로 삽입된다 (도 1A 참조).
다른 벡터로는 레트로바이러스 백터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 우두바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터, 홍역 바이러스 벡터 및 아데노바이러스-관련 벡터가 포함된다.
상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물이 제조될 수 있다. 본 조성물은 면역원성이다. 이들은 인간 또는 포유류의 투여에 적절한(즉, 비-독성이고, 필요 시 멸균된) 첨가물 또는 캐리어를 포함할 수 있다. 상기 첨가물로는 약학적 비히클로서 제공하는 액체, 반고체, 또는 고체 희석제, 등장성 제제, 안정화제, 또는 임의의 보조제가 포함된다. 희석제로 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤, 등이 포함될 수 있다. 등장성 제제로는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토오스 등이 포함될 수 있다. 안정화제로는 알부민 등이 포함될 수 있다. 당해 분야에 알려진 임의의 보조제가 백신 조성물 내 사용될 수 있는데, 여기에는 오일-기초 보조제 예를 들어 Freund's Complete 보조제 및 Freund's Incomplete 보조제, mycolate-기초 보조제, 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS), 펩티도글리칸s, 프로테오글리칸, 수산화 알루미늄, 사포닌, DEAE-덱스트란, 중성 오일 (예컨대, 미글리올), 식물성 기름 (예컨대, 땅콩기름), Pluronic® 폴리올이 포함된다.
핵산 또는 조성물은 직접 투여될 수 있고, 투여 전 리포좀에 패키징되거나 또는 콜로이드성금입자상에 코팅될 수 있다. DNA 백신의 리포좀 내로의 패키징 기술은 당해 분야 예를 들어 Murray, 1991에 공지되어 있다. 유사하게, 노출(naked) DNA를 금 입자 상에 코팅하는 기술은 Yang, 1992에 개시되고, 바이러스 백터를 사용하여 단백질을 발현하는 기술은 Adolph, 1996에서 확인된다.
유전성 면역법을 위해, 백신 조성물은 바람직하게는 주사 또는 가스 주입된 입자 투사장치 (gas driven particle bombardment)에 의해 임의의 유형의 림프계 기관 내로 또는 종양 내로 피내, 피하, 근육내 투여되고, 및 숙주 유기체 내 면역 반응을 자극하기에 유효한 양으로 운반된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 투여는 주사 단계에 더하여 "전기이동"으로도 지칭되는 전기천공법(전기천공법) 단계를 포함한다 (Mir 2008, Sardesai And Weiner 2011 참조).
본 조성물은 또한 리포조말 형질감염, 입자 투사장치 또는 (공-배양 기술을 포함하는) 바이러스 형질도입을 사용하여 ex vivo로 림프구성 또는 골수성 세포로 투여될 수 있다. 처치된 세포는 이후 다시 면역화될 개체 내로 재삽입된다.
비록 필요한 물질의 양은 각 개별 구조물의 면역원성에 따라 변화되고 우선적으로 예측될 수는 없지만, 임의의 주어진 구조물의 적합한 용량을 결정하는 과정은 복잡하지 않다. 특히, 예를 들어 약 5 내지 30 μg, 또는 바람직하게는 20-25 μg에서 시작하여 약 500μg 내지 약 5mg, 바람직하게는 500-1500 μg, 500-1200 μg, 또는 500-1000 μg 까지의, 증가하는 크기의 일련의 용량이, 상응하는 종(species)으로 투여되고, 및 이에 따른 면역 반응이 예를 들어 IFNγ Elispot 에세이 (실험 섹션에서 기술됨)에 의한 세포 면역 반응을 검출함에 의해, in vivo 용해 에세이 또는 크롬 유리 에세이를 이용한 CTL 반응을 검출함에 의해, 또는 사이토카인 유리 에세이를 사용하여 Th (헬퍼 T-세포) 반응을 검출함에 의해 관찰된다.
바람직한 구현예에서, 백신접종 방법(regimen)은 바람직하게는 3 내지 4주 후 반복되는 1회 내지 3회의 주사를 포함한다.
특정의 구현예에서, 백신접종 스케줄은 1 또는 2회의 주사 및 이어서 3주 또는 4주 후 3 내지 5회 주사의 적어도 하나의 사이클로 구성될 수 있다. 또 다른 구현예에서 프라이머 용량은 1 내지 3회의 주사, 및 이어서 예를 들어 매년 또는 매 2년 부스터 용량으로 구성된다.
이들은 예시에 불과하고, 임의의 다른 백신 접종 방법(regimen)이 본원에 포함된다.
종양의 예방 또는 치료
전술된 핵산 또는 면역원성 조성물은 환자의 종양을 예방 또는 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 환자의 종양을 예방 또는 치료하는 방법이 기술되는데, 상기 방법은 유효한 용량의 상기 핵산 또는 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 핵산 또는 면역원성 조성물은 환자 내 면역 반응을 유도하기 충분한 용량으로 투여된다.
종양은 원치않는 세포의 증식, 특히 양성 종양 또는 악성 종양, 특히 암일 수 있다.
암은 전이 단계를 포함하여 임의의 발전 단계일 수 있다. 암은 만성 또는 비-만성 (급성)일 수 있다.
특정의 구현예에서, 종양은 고형암 또는 상피성암이다. 예로서 흑색종, 교아종, 신경아세포종 및 성상세포종과 같은 뇌종양 및 방광암, 유방, 자궁경부, 대장, 폐, 특히 비소세포 폐암 (NSCLC), 췌장, 전립선, 머리 및 목 암, 또는 위암이 포함된다.
또 다른 구현예에서, 종양은 액체 종양, 예컨대 조혈성 종양 또는 백혈병, 예컨대 만성 또는 급성 림프구성 백혈병, 만성 또는 급성 골수성 백혈병, Hodgkin's 병을 포함한 림프종, 다발성 골수종, 악성 골수종을 포함할 수 있다. 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 치료는 화학요법, 방사선요법 또는 수술을 포함하는 통상의 요법과 조합될 수 있다. 보조제 면역제어 분자 예를 들어 GM-CSF 또는 사이토카인 유사 IL-2 또는 IL-12와의 조합이 유용할 수 있다.
도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 예시한다.
실시예
I
약어:
AA: 아미노산, APC: 항원 표출 세포, bp: 염기-쌍, CTL: 세포독성 T-림프구, CMV: 사이토메갈로바이러스, DNA: 데옥시리보핵산, EP: 전기천공법, HTLV -1: 인간 T-세포림프친화 바이러스 Type I, hTERT: 인간 텔로머라제 역전사효소, ID: 피내투여, IM: 근육내투여, IV: 정맥투여, LTRs: 긴 말단 반복, NoLS: 핵인 국소화 서열, PBMC: 말초 혈액 단핵 세포, RIG-I: 레티노산-유도가능 유전자 1, RNA: 리보뉴클레익산, RT: 상온, RTA: 상대적 텔로머라제 활성, SC: 피하투여, TRAP: 텔로머성 반복 증폭 프로토콜, TERT: 텔로머라제 역전사효소, Ubi: 유비퀴틴, VDD: 발린- 아스파르트산-아스파르트산
재료 및 방법 (MATERIALS AND METHODS )
플라스미드 DNA 벡터
INVAC
-1
INVAC-1은 대략 127.4 kDa의 단백질에 상응하는 1158 AA의 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 구조물 (Ubi-hTERT)을 암호화하는 7120 bp 플라스미드 발현 벡터이다(도 1A 및 16). INVAC-1이 인간 내에서 사용되고자 하는 경우, 안전상의 이유로 텔로머라제 역전사효소 효소적 활성은 불활성화된다. 실제로, INVAC-1에 의해 암호화되는 인간 TERT 서열은 한 단어 코드에서 VDD 로 약칭되는 3개의 아미노산 발린-아스파르트산-아스파르트산 (867-869 AA)을 코딩하는 9 bp 결실에 의해 촉매 사이트 내에서 개질 되었다 (도 2A). 또한, 텔로머라제 준세포 국소화에 필요한 핵인 국소화 서열 (NoLS)을 포함하는, 단백질의 N-말단 부분의 47 AA (Yang, 2002)가 유비퀴틴 (Ubi) 코딩 서열 (1-76 AA)에 의해 대체되었다.
Ubi-hTERT 트랜스진은, 고 수율의 박테리아 생산, 포유류 세포 내 증가 되는 발현 및 그 결과 효율적인 면역 반응을 위해 조심스럽게 디자인된 합성유전자와 함께 NTC 유효화된 벡터 백본 내로 삽입된다 (Nature Technology Corporation, LiNcoIn, Nebraska).
표적 유전자 발현은 CMV 프로모터 및 엑손 1에서 시작하여, 5' 스플라이스 수용체 사이트를 포함하는 HTLV-I R 서열, 래빗 β-글로빈 인트론 기초 합성 3' 수용체 사이트, RNA 이동(export)을 향상시키기 위한 세린-아르기닌 풍부(SR) 단백질 결합 사이트를 포함하는 엑손 2 스플라이싱 인핸서 (Lavigueur et al., 1993) 및 관심의 유전자 시작 코돈 업스트림의 엑손 2 Kozak 서열로 구성되는, 최적화된 키메라 프로모터-인트론 (SV40-CMV-HTLV-1 R 합성 인트론)으로부터 구동된다. 스탑 코돈 및 터미네이터 사이의 DNA는 크립틱 펩티드 발현 또는 비의도된 마이크로RNA-매개 발현 변경의 가능성을 낮추기 위해서 제한된다.
세포 면역 반응을 향상시키기 위해 벡터는 레티노산 유도 유전자 -1(retinoic acid inducible gene-1: RIG-I) 선천적 면역 반응 활성화제의 RNA 폴리머라제 III 전사된 이중 가닥 RNA 아고니스트를 암호화한다.
본 벡터와 연관된 알려진 독성 특징은 없다. 플라스미드는 진핵 표적 세포 내에서 복제하지 않는다. 백터 백본 그 자체는 단백질 코딩 서열을 포함하지 않고 백터 백본 내에서 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 대체 단백질도 확인되지 않아서, 항생제 저항성 유전자가 존재하지 않는다. 플라스미드 선별이 무-항생제 슈크로오스 선택가능한 마커(RNA-OUT)에 의해 수행된다.
유전자 합성 및
클로닝
Ubi-hTERT 유전자가 오버래핑 40-mer 올리고뉴클레오티드 어셈블리 프로세스 (GeneCust, Luxembourg)를 통해서 de novo 합성되었다. 몇몇 보존적 염기 변화가 제한 사이트를 제거하고 GC 풍부 서열을 약화시키기 위해서 수행되었다. 인서트가 HindIII-XbaI 클로닝 사이트를 사용하여 발현 벡터 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, USA) 내로 클로닝되고, 시퀀싱에 의해 확인되었다.
Ubi
-
hTERT
인서트의
클로닝
벡터
NTC8685
-
eRNA41H
-
HindIII
-
XbaI
로의
서브클로닝
유비퀴틴-텔로머라제 인서트가 NTC에 의해 디자인된 NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI 발현 벡터 내로 클로닝 되었다. 하지만, 이들의 가장 적합한 벡터인 NTC8685-eRNA41H (ref. NTC-DV8685-41HLV)는 Ubi-hTERT와 호환되는 제한 사이트를 가지고 있지 않았다. 따라서 상기 벡터는 [SalI 및 BglII]로 처리되었고, Ubi-hTERT를 서브클로닝하는데 적합한 제한사이트, 즉 HindIII-XbaI:
SalI HindIII SmaI XbaI BglII
GTCGACAAGCTTCCCGGGTCTAGAAGATCT (SEQ ID NO: 23)
을 포함하는 합성 이중 가닥 올리고뉴클레오티드에 결찰 (ligated) 되었다.
이제, 전술된 폴리링커를 포함하는 상기 신규 벡터 (NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI)는 제한효소 처리(restriction digestion) 및 폴리링커 사이트 업스트림 및 다운스트림 서열 각각을 어닐링하는 pVAC5' (GCTTTTCTGCCAGGTGCTGA SEQ ID NO: 24) 및 pVAC3' (GCCAGAAGTCAGATGCTCAA SEQ ID NO: 25) 프라이머를 사용한 시퀀싱에 의해 확인되었다.
소비자-제작 NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI 벡터가 HindIII 및 XbaI로 처리되었고, 3631 bp 벡터가 12 bp 링커로부터 겔 정제되었다. pcDNA3.1-Ubi-hTERT 구조물이 HindIII 및 XbaI로 처리되었고, 3489 bp Ubi-hTERT 인서트가 결찰(ligating)에 의해 NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI 수용체 내로 이동되어 NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI-Ubi-hTERT (INVAC-1) (도 1A)를 제작하였다. 결찰 산물(ligation product)은 무항생제 선택 숙주 NTC4862 (DH5α attλ::P5/6 6/6-RNA-IN-SacB, catR) (ref. NTC-DVU-CC1) 내로 형질전환 되었다. 생성된 벡터는 제한효소 처리에 의해 확인되었고 (도 IB): BglII/NotI = 3496, 3262, 220, 142 bp 밴드; NcoI = 4084, 3036 bp 밴드; HindIII/XbaI = 3631, 3489 bp 밴드, 및 Ubi-hTERT 인서트 말단 (termini)은 pVAC5' 및 pVAC3' 프라이머를 사용한 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.
플라스미드 생산
INVAC-1이 연구 급 품질 조건(research grade quality condition) 하에서 NTC에 의해 첫 번째 생산되었다. 플라스미드 DNA가 전기천공법을 사용하여 NTC4862 E. coli 세포 내로 형질전환되었다. 세포가 제조사(NTC Instruction Manual, June 2011)가 권유한 바와 같이 6% 슈크로오스 배지 상에서 이식 및 증식되었다. 추출 후, 플라스미드 DNA는 2mg/ml의 최종 농도로 무-엔도톡신 1X PBS 내에서 재분산되었다.
INVAC-1는 이후 Eurogentec (Belgium)에 의해 GLP 및 GMP 스케일-업, 및 GMP 생산을 위해 제조되었다. INVAC-1 플라스미드의 전체-길이 시퀀싱이 본 시점에서 수행되었다.
INVAC
-1 유도체
모든 INVAC-1 유도체 구조물은 효소적으로 불활성인 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질를 암호화하는 대략 8.9 kb의 이중 가닥 DNA 플라스미드이다(도 2A). Ubi-hTERT 트랜스진이 포유류 세포 내 고-강도의 안정성 및 일시적 발현을 위해 디자인된 pcDNA3.0에서 유래된 Invitrogen pcDNA3.1(+) 벡터 (5.4 kb) 내로 삽입되었다. 상기 벡터는 인간 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 (CMV-IE) 프로모터 및 터미네이션 서열로서 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 (BHG-polyA) 시그널을 포함한다.
pUTDlONot
(△
lONot로
약칭됨)
hTERT 코딩 서열은 pcDNA3.1 플라스미드 백본의 뉴클레오티드 923 내지 4492 bp에 위치된다. pUTDlONot는 대략 130.8 kDa의 분자량에 상응하는 1189 AA 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질 (△lONot)을 암호화한다 (도 2A). hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되고, 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체된다. 촉매 사이트의 도메인 내에서, 야생형 hTERT (Accession number NM_198253)의 AA 860-869 (DGLLLRLVDD_ SEQ ID NO: 21)에 상응하는, 추가 결실이 아미노산 912-913 (* mark; 도 17) 사이에 도입되었다. 상기 10개 아미노산 결실은 hTERT 효소적 활성의 불활성화를 야기하는 3개 AA 결실 (△VDD) 및 VDD 서열 업스트림의 추가적 7개 AA의 결실을 포함한다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개 아미노산은 V5 에피토프 태그를 코딩한다 (도 2A).
pUTDlOCog
(△
lOCog로
약칭됨)
hTERT 코딩 서열은 pcDNA3.1 플라스미드 백본의 뉴클레오티드 923 내지 4492 bp에 위치된다. pUTDlOCog는 대략 130.8 kDa의 분자량에 상응하는 1189 AA 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질 (△lOCog)을 암호화한다 (도 2A). hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되고, 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체된다. 촉매 사이트의 도메인 내에서, 야생형 hTERT (Accession number NM_198253)의 AA 867-876 (VDDFLLVTPH_ SEQ ID NO: 22)에 상응하는, 추가 결실이 아미노산 919-920 (* mark; 도 18) 사이에 도입되었다. 상기 10개 아미노산 결실은 hTERT 효소적 활성의 불활성화를 야기하는 3개 AA 결실 (△VDD) 및 VDD 서열 다운스트림의 추가적 7개 AA의 결실을 포함한다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개 아미노산은 V5 에피토프 태그를 코딩한다 (도 2A).
pUTD23Tyn
(△
23로
약칭됨)
hTERT 코딩 서열은 pcDNA3.1 플라스미드 백본의 뉴클레오티드 923 내지 4492 bp에 위치된다. pUTD23Tyn는 대략 129.4 kDa의 분자량에 상응하는 1176 AA 인간 유비퀴틴-텔로머라제 융합 단백질 (△23)을 암호화한다 (도 2A). hTERT에서 23개의 첫 번째 아미노산 (1-23 AA)이 결실되고, 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체된다. 촉매 사이트의 도메인 내에서, 야생형 hTERT (Accession number NM_198253)의 AA 857-879 (IRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTH_ SEQ ID NO: 26)에 상응하는, 추가 결실이 아미노산 909-190 (* mark; 도 19) 사이에 도입되었다. 상기 23개 아미노산 결실은 hTERT 효소적 활성의 불활성화를 야기하는 3개 AA 결실 (△VDD) 및 추가적인 VDD 서열 업스트림의 10개 AA 및 다운스트림의 10개 AA 결실을 포함한다. Ubi-hTERT의 C-말단 서열의 14개 아미노산은 V5 에피토프 태그를 코딩한다 (도 2A).
유전자 합성 및
클로닝
유비퀴틴-텔로머라제 융합 구조물로서 유전자가 오버래핑 40-mer 올리고뉴클레오티드 어셈블리 프로세스 (GeneCust, Luxembourg)를 통해 de novo 합성되었다. 유전자 합성은 원하는 발현 시스템 내로 유전자를 서브클로닝 할 수 있도록 독특한 플랭킹(flanking) 제한 사이트 HindIII/XbaI 를 포함하였다. 합성된 유전자는 pcDNA3.1(+) 발현 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, USA)의 HindIII 내지 XbaI 제한 사이트 사이에 클론되었다. 플라스미드의 서열은 PEGFP-N5' CGGTGGGAGGTCTATATAAG (SEQ ID NO: 27) 및 BGH CAGGGTCAAGGAAGGCAC (SEQ ID NO: 28) 프라이머를 사용한 시퀀싱에 의해 확인되었다.
플라스미드 생산
INVAC-1 유도체가 RD Biotech (Besancon, France)에 의한 E. coli 5-알파 세포 (fhuA2△(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 △(lacZ)M15 gyrA96 recAl relAl endAl thi-1 hsdR17) (Lucigen Corporation, Middleton, USA, ref. 60602-2) 내에서 형질전환 및 생산되었다. IX 멸균 PBS 내에서 재분산된 농축된 무-엔도톡신 기가프렙 플라스미드 스톡(gigaprep plasmid stocks)(2 mg/mL)이 제조되었다. 벡터는 제한 매핑 (HindIII-XbaI; 도 2B)에 의해 확인되었다.
pTRIP
-
CMV
-
hTERT
pTRIP-CMV-hTERT는 촉매 활성을 가지는 1132 AA (대략 124.5 kDa에 상응함) 야생형 인간 TERT (hTERT) 단백질을 암호화한다. 상기 플라스미드는 in vitro 에세이의 양성 컨트롤로서 사용된다. 상기 구조물은 특허 출원 WO 2007/014740에서 첫 번째 기술되었다. pTRIP-CMV-hTERT는 pBABE-hygro-hTERT 플라스미드 (Dr. Robert Weinberg에 의해 제공됨)에서 유래된 EcoRI-SalI hTERT 인서트를 pSP73 벡터 (Promega Life Science, Wisconsin, USA) 내로 첫 번째 서브클로닝하여 pSPhTERT 구조물를 생산시킴으로써 구성되었다. 이후, BglII-SalI 단편이 BamHI 및 XhoI로 절단된 pTRIP-CMV 레트로바이러스-유래 벡터 내로 삽입되어 pTRIP-CMV-hTERT가 제작되었다. hTERT 발현은 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터에 의해 유리된다.
pTRIP-CMV-hTERT 플라스미드가 RD Biotech (Besancon, France)에 의한 E. coli 5-알파 세포 (fhuA2△(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 △(lacZ)M15 gyrA96 recAl relAl endAl thi-1 hsdR17) (Lucigen Corporation, Middleton, USA, ref. 60602-2) 내에서 형질전환 및 생산되었다.
IX 멸균 PBS 내 재분산된 2 mg/ml의 농축된 무-엔도톡신 기가프렙 플라스미드 스톡(gigaprep plasmid stock)이 생산되었다. 제조된 벡터는 제한 효소 처리 (EcoRI+BamHI = 10286 + 2720 + 886 bp 밴드)에 의해 확인되었다.
pNTC
-
hTERT
pNTC-hTERT는 촉매 활성을 가지는 1132 AA 야생-형 인간 TERT (hTERT) 단백질을 암호화한다 (SEQ. ID NO: 2). 상기 플라스미드는 INVAC-1 구조물와 비교하여 hTERT 특이적 T-세포 in vivo 반응의 폭(breadth)을 검토하는데 사용되었다.
야생형 hTERT 인서트가 오버래핑 올리고뉴클레오티드 어셈블리 프로세스 (GenScript, USA)를 통해 HindIII-XbaI 클로닝 사이트를 사용하여 de novo 합성되었다. 합성 구조물 (3417 bp)은 HindIII 및 XbaI 사이트에 의해 pUC57 (2710 bp) 내 클로닝되었고, 이후 M13/pUC (-20) 및 M13/pUC (-26) 프라이머를 사용한 시퀀싱 및 제한 매핑 (HindIII/XbaI)에 의해 확인되었다. 따라서, hTERT 인서트가 NTC에 의해 전술된(INVAC-1 구조물 참조) 클로닝 벡터 NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI 내로 서브클로닝되었다. 생산된 벡터 pNTC -hTERT는 제한효소 처리 (Xmal = 4375, 2041, 506, 120 bp 밴드; BamHI/XmnI = 6887, 155 bp 밴드; HindIII/XbaI = 3631, 3411 bp 밴드) 및 pVAC5', pVAC3' 및 hTERTseq (5' GGCAAGTCCTACGTCCAGTG 3', SEQ ID NO: 44) 프라이머를 사용한 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.
pNTC-hTERT 플라스미드는 NTC에 의해 INVAC-1 플라스미드에 대해 전술된 것과 같은 연구 급 품질 조건(research grade quality condition) 하에서 제조되었다.
pNTC
-
hTERT
-△
VDD
pNTC-hTERT-△VDD는 발린 - 아스파르트산 - 아스파르트산 (△VDD; 867-869 AA)을 코딩하는 9 bp의 결실에 의해 촉매 사이트가 개질된, 1129 AA 인간 TERT (hTERT) 서열을 암호화한다. 상기 플리스미드는 INVAC-1 구조물와 비교하여 hTERT 특이적 T-세포 in vivo 반응의 폭(breadth)을 검토하는데 사용되었다.
hTERT-△VDD DNA 서열은 3개의 아미노산 결실 (△VDD)을 제외하고는 야생형 hTERT와 동일하다. hTERT의 152 bp BamHI/XmnI 단편을 포함하지만 △VDD 결실 및 추가적인 EcoRV 제한 사이트를 가지는 167 bp DNA 인서트가 Genscript에 의해 de novo 합성되었다. 상기 합성 단편은 EcoRV 클로닝 사이트를 사용하여 pUC57 벡터 (2710 bp) 내에서 클로닝되었다. 합성된 유전자는 M13/pUC (-20) 및 M13/pUC (-26) 프라이머를 사용한 시퀀싱 및 제한 처리(BamHI/NdeI)에 의해 확인되었다. 이후, 상기 벡터는 BamHI/XmnI 사이트를 이용하여 처리되었고, 및 △VDD-BamHI/XmnI 단편이 pNTC -hTERT 벡터의 BamHI/XmnI 전처리된 hTERT 영역(6887, 155 bp 밴드) 내에서 클로닝되었다. 생산된 벡터 pNTC-hTERT-△VDD는 제한효소 처리 (Xmal = 4375, 2032, 506, 120 bp 밴드; BamHI/XmnI = 6887, 146 bp 밴드; HindIII/XbaI = 3631, 3402 bp 밴드) 및 pVAC5', pVAC3' 및 hTERTseq (5' GGCAAGTCCTACGTCCAGTG 3' SEQ ID NO: 44) 프라이머를 사용한 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.
INVAC-1 및 pNTC-hTERT 구조물과 관련하여 전술된 바와 같이 pNTC -hTERT-△VDD는 NTC에 의해 제조되었다.
웨스턴
블롯
및 TRAP 에세이를 위한 세포 배양 및 일시적 형질 감염
CrFK (CraNdell Rees feline kidney), HEK293T (인간 배아 신장) 및 HeLa (Henrietta Lacks' - Human cervical adenocarcinoma) 세포주가 10% 가열-불활성화된 태아 소 혈청 (fetal calf serum)(PAA, Velizy-Villacoublay, France) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Life Technologies, Saint- Aubin, France)이 보충된 [Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM)] 내에서 배양되었다.
QT6 (Quail Japanese 섬유육종) 세포주가 10% 가열-불활성화된 태아 소 혈청(PAA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Life Technologies), 1% 닭 혈청(PAA), 10 mM L-글루타민 (Sigma- Aldrich, St. Louis, USA), 0.5% 트립토오스 브로쓰 (Sigma- Aldrich, St. Louis, USA)이 보충된 Ham's F10 (Eurobio, Courtaboeuf, France) 내에서 배양되었다.
세포는 5% C02를 함유하는 가습 된 대기 내 37℃ 75 cm 플라스크 내에서 단층으로 성장되었다. 세포는 형질감염일의 70-80% 컨플루언스까지 성장되었다. 웨스턴 블롯 에세이를 위해, 5xl05 세포가 6-웰 조직 배양 플레이트 내 시딩되고 24시간 동안 인큐베이트되었다. TRAP 에세이를 위해 7xl05 세포가 6-웰 조직 배양 플레이트 내 시딩되었고 24시간 동안 인큐베이트되었다.
INVAC-1 및 INVAC-1 유도체 구조물은 제조자의 인스트럭션 ((Polyplus-transfection Inc., France)에 따라 jetPrime 양이온성 형질감염 시약을 사용하여 표적 세포 내로 형질감염되었다. pTRIP-CMV-hTERT 플라스미드로 형질감염된 세포는 양성 컨트롤로, 비-형질감염된 세포 또는 pNTC8685-eRNA41H 빈 플라스미드 형질감염된 세포는 음성 컨트롤로서 사용되었다. 형질감염 배지는 4시간 후 제거되었고 2 mL의 DMEM의 배양 배지로 대체되었다. 적절한 시간의 형질감염 (웨스턴 블롯 에세이의 경우 18-96시간 및 TRAP 에세이의 경우 24시간)후, 세포는 수득되었고 텔로머라제 발현 및 활성이 분석되었다.
웨스턴
블롯
웨스턴 블롯 분석을 위해, 형질감염된 CrFK 및 HEK293T 세포가 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche Diagnostic, Indianapolis, USA)이 보충된 RIPA 버퍼 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 내에서 10 내지 20분간 얼음 상에서 용해되었다. 용해물은 4℃에서 15분간 14,000 rpm으로 원심분리에 의해 제거되었다. 상청액이 수득되었고, 단백질 농도가 Bradford 비색 분석법을 사용하여 측정되었다. 단백질 샘플은 95℃에서 5분간 변성되었고, u-PAGE® Novex 4-12% Bis-Tris gels (Invitrogen, Carlsbad, USA) 상에서 분리되었으며 iBlot® 장치 (Invitrogen, Carlsbad, USA)를 사용하여 PVDF 멤브레인 (iBlot® transfer stack, Invitrogen, Carlsbad, USA) 상에서 전기블롯(electroblot) 되었다. Novex® Sharp Prestained Protein Ladder (Invitrogen, Carlsbad, USA)가 분자량을 측정하는데 사용되었다. 멤브레인은 대략 60 kDa에서 절단되었고, 1X PBS, 0.05% Tween®20, 3% 우유로 블로킹되었다. 멤브레인의 상부는 블로킹 버퍼 내 1/2000로 희석된 항-hTERT 래빗 모노클로날 항체 (Abeam, Cambridge, UK) 또는 1/5000로 희석된 항-V5 마우스 모노클로날 항체 (Invitrogen, Carlsbad, USA)로 검출되었다. 멤브레인의 하부는 1/5000로 희석된 항-β-액틴 마우스 모노클로날 항체 (Sigma Aldrich SARL, Saint-Quentin Fallavier, France)로 검출되었다.
끝으로, 관련된 단백질은 상온에서 1시간 동안의 적절한 이차 서양고추냉이 과산화수소(horseradish peroxidase: HRP) 접합된 항체-1/5000로 희석된 항-마우스 HRP 연결된 항체 (GE Healthcare, Velizy, France) 또는 블로킹 버퍼 내 1/1000으로 희석된 항-래빗 HRP 연결된 항체 (Cell Signaling, Danvers, USA)로 염색함으로써 시각화되었다. 면역 블롯 신호가 ECL HRP 화학발광 기질 시약 키트를 사용한 강화된 화학발광 에세이에 의해 검출되었다. 필름 및 대응되는 카세트는 GE Healthcare(Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다.
TRAP 에세이
텔로머라제 활성이 제조자의 인스트럭션에 따라 TeloTAGGG 텔로머라제 PCR ELISAPLUS 키트 (Roche Diagnostic GmbH Mannheim, Germany)를 사용하여 텔로머성 반복 증폭 프로토콜 (Telomeric Repeat Amplification Protocol: TRAP) 접근법(Kim et al. 1994) 을 통해서 평가되었다. 전술된 형질감염 24시간 후, CrFK 세포가 수득 되었다. 세포는 1X PBS로 세척되었고, 이어서 1,600 rpm에서 5 minute 동안 4℃에서 원심분리되었다. 세포는 0.2 ml의 용해 버퍼 내 재분산되었고 30분간 얼음상에서 인큐베이트되었다. 용해물은 14,000 rpm, 20 min, 4-8℃에서의 원심분리에의해 제거되었다. 상청액이 수득되었고, 단백질 농도가 Bradford 비색 분석법을 사용하여 측정되었다. 상청액은 텔로머성 서열의 텔로머라제-매개 신장에 사용되었고, 산물은 비오틴화된 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭되었다. 세포의 각 상청액은 에세이를 수행하기 전 두 개의 부분표본으로 사전에 분리되었다: 하나는 10 min.동안 85℃에서의 텔로머라제의 가열 불활성화에 의한 음성 컨트롤을 제조하는데 사용되었고, 다른 하나는 텔로머성 서열의 텔로머라제-매개 신장을 평가하기 위해 사용되었다. 또한, 반응 혼합물 내 존재하는 216 bp 길이 내부 표준(internal standard)이 용해물 내 존재할 수 있는 Taq DNA-폴리머라제 억제제에 의한 허위 음성 결과를 배제하기 위해 동시에 증폭되었다. 용해 버퍼가 음성 컨트롤로서 사용되었다. 모든 반응 혼합물은 20 분, 25℃ 및 이후 5 분, 94℃에서 인큐베이트되었다. 텔로머라제 산물은 30 PCR 사이클 내에서 증폭되었다: 94℃ 30초; 50℃, 30초; 72℃ 90초; 72℃, 10분에서 1사이클 종료 및 4℃ 유지됨.
2.5 μL의 PCR 증폭 산물은 키트에서 제공되는 변성 시약과 함께 RT에서 10분 동안 인큐베이트되었다. 인큐베이션 후, 100 μL의 하이브리드화 버퍼가 웰 당 첨가되었다. 각 용액이 혼합되었고 100 μL이 스트렙타비딘 전-코트된 마이크로플레이트로 옮겨졌고, 온화한 교반(300 rpm) 하 2시간 동안 37℃에서 인큐베이트되었다. 이후, 웰은 세척 버퍼로 세척되었고, 항-디곡시제닌 서양고추냉이 과산화제(HRP) 연결된 항체(1/50)와 함께 30분 동안 RT에서 인큐베이트되었다. HRP 기질 (TMB)이 비색분석법을 위해 RT에서 15분 동안 첨가되었다. 반응이 ELISA 정지 시약을 사용하여 정지되었다.
각 샘플 내 텔로머라제 활성의 레벨이 샘플의 신호와 알려진 양의 양성 컨트롤 주형 (8개의 텔로머성 반복(repeats)을 가지는 텔로머라제 산물과 동일한 서열을 가지는 주형 DNA)을 사용하여 획득된 신호와 비교함으로써 측정되었다. 흡광도 값은 블랭크(참조 파장 A680 nm)에 대한 A450 리딩에 의해 보고되었다. 상대적 텔로머라제 활성(Relative telomerase activity: RTA)이 하기의 식을 사용하여 획득되었다:
RTA= [(AS-ASO)]/AS,IS]/[(ATS8-ATS8,O)/ATS8,IS] X 100
상기에서:
AS, 샘플의 흡광도,
ASO, 가열-처치된 샘플의 흡광도,
AS,IS, 샘플의 내부 표준(IS)의 흡광도,
ATS8, 컨트롤 주형(TS8)의 흡광도,
ATS8,O, 용해 버퍼의 흡광도,
ATS8,IS, 컨트롤 주형(TS8)의 내부 표준(IS)의 흡광도임.
면역형광법
CrFK, HEK293T, HeLa 및 QT6 세포가 200μL의 배양 배지 내 2xl04 세포/웰로 8-웰 Lab-Tek® 챔버 슬라이드 (Sigma- Aldrich, St. Louis, USA)에 시딩되고 및 37℃, 5% C02에서 밤사이동안 인큐베이트되었다. 그 다음 날, 배양 배지는 버려졌고 200 μL의 신선한 배지가 첨가되었다. 0.2 μg 의 INVAC-1, pTRIP-CMV-hTERT 또는 컨트롤 빈 플라스미드 pNTC8685-eRNA41H 및 OptiMEM (Life Technologies, Saint- Aubin, France) 내 0.5 μL의 Fugene HD (Promega France, Charbonnieres-les-bains, France)를 포함하는 10μL의 혼합 용액이 대응하는 챔버에 첨가되었다. 챔버 당 2xl04 비처치된 세포가 음성 컨트롤로서 사용되었다. 챔버 슬라이드는 24 및 48시간 동안 37℃, 5% C02에서 인큐베이트되었다. 형질감염된 세포는 1X PBS로 조심스럽게 세척되었고, 200μL의 2% PFA가 각 웰에 10분 동안 4℃에서 세포를 고정 및 투과가능하도록 하기 위해 첨가되었다. 이후, 웰은 1X PBS 0.05% Tween®20로 2회 세척되었고, 200μL의 블로킹 용액 (0.5% Triton X100; Sigma-Aldrich, 3% BSA; Sigma-Aldrich, 10% 염소 혈청; Invitrogen, 1X PBS 0.05% Tween®20 내)과 함께 상온에서 30분간 인큐베이트되었다. 블로킹 버퍼 내 1/100로 희석된 일차 항-hTERT 래빗 모노클로날 항체 (Abeam, Cambridge, UK)가 교반하 상온에서 1.5시간 동안 세포 상에 적용되었다. 1X PBS 0.05% Tween®20로의 3번의 세척 후 블로킹 용액 내 희석된 (1/500) 이차 염소 항-래빗-Alexa Fluor 488® 항체 (Life Technologies, Saint- Aubin, France)가 교반 하 상온에서 45분 동안 적용되었다. 웰이 1X PBS 0.05% Tween®20으로 3회 세척되었고 DAPI를 함유하는 VECTASHIELD® 마운팅 배지 (Vector laboratories, Cambridgeshire, UK) 내에 마운팅(mounted) 되었다. 커버 슬립이 이미지 프로세싱 및 분석 시스템 (Axiovision, Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany)이 설치된 형광 현미경 (Axio observer Zl, Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) 하에서 분석되었다.
마우스 (mice)
암컷 C57BL/6 마우스 (6-8 주령)를 Janvier laboratories (Saint-Berthevin, France)에서 구매하였다.
두 형질전환된 마우스 스트레인이 사용되었다: HLA-B*0702 및 HLA-A2/DR1.
HLA-B*0702 형질전환된 마우스는 인간 HLA-B*0702 α1-α2 도메인 분자 및 뮤린 α3 도메인 H2D 분자를 발현한다. 상기 마우스는 H2-Db 및 H2-Kb 분자는 발현하지 않는다 (Rohrlich et al., 2003).
HLA-A2/DR1 형질전환된 마우스는 인간 HLA-A*0201 αl-α2 도메인, 뮤린 α3 도메인의 H2D 분자 및 인간 β2-마이크로튜블린을 발현한다. 또한, 상기 형질전환된 마우스는 인간 HLA-DRB1*0101 및 HLA-DRA*0101 분자를 발현한다. 이들은 뮤린 H2-Db, H2-Kb 및 IAb 유전자에 대해 넉-아웃된다 (Pajot et al., 2004).
두 형질전환된 마우스 스트레인 모두는 6 내지 10주령 사이에서 사용되었고, [Pasteur Institute of Paris]에 의해 제공되었다. 동물은 Pasteur Institute의 [Specific Pathogen Free animal facility](Animal Facilities Lwoff n°22, agreement number B 75 15-07) 에서 사육되었다(housed). 피내(ID), 근육내(IM) 또는 피하(SC) 면역 또는 정맥 (IV) 주사 전, 마우스는 개별 동물 체중 및 마취 기간에 따라 복강 내 경로 (IP)를 통해 IX 포스페이트 버퍼 식염수 (1X PBS, Life Technologies, Saint-Aubin, France) 내 2% 자일라진 (Rompun, Bayer Sante, Loos, France) 및 8% 케타민 (Imalgen 1000, Merial, Lyon, France) 혼합 용액으로 마취되었다. 모든 동물들은 [good animal practice and complied with local animal experimentation (Directive 2010/63/UE)]를 엄격하게 준수하면서 다루어졌다.
hTERT
펩티드
HLA-B*0702, HLA-A*0201 또는 HLA-DR 제한된 hTERT 펩티드가 전술되었다 (표 1 참조). H2-Db 및 H2-Kb 제한된 hTERT 펩티드가 온라인상 접근가능한 4개의 알고리즘: Syfpeithi (http://www.syfpeithi.de/), Bimas(http://www-bimas.cit.nih.gov/), NetMHCpan 및 SMM (http://tools.immuneepitope.org/main/)을 사용하여 마우스 MHC Class I 분자를 결합하기위한 인-실리코 에피토프 예측(in-silico epitope prediction)에 의해 측정되었다. 모든 합성 펩티드는 Proimmune (Oxford, united Kingdom)에서 동결건조되어(>90 순도) 구매되었다. 동결건조된 펩티드가 2 mg/mL로 멸균수 내 용해되었고 사용 전 -20℃로 저장되었다. 펩티드 서열 및 MHC 제한의 세부사항은 하기 표 1에서 나타낸다.
[표 1]
hTERT
펩티드 및
MHC
제한
hTERT
펩티드 라이브러리
동결건조된 hTERT 펩티드 (순도 > 70%)가 GenScript (USA)에서 구매되었다. 본 세트는 11 AA를 오버래핑하고 INVAC-1 hTERT의 전체 단백질 서열을 회복하는 15AA의 269 펩티드로 구성된다. 각 펩티드는 희석된 물에서 2 mg/mL로 사용 전에 제조자의 권고에 따라 재분산되고 및 사용 전 -20℃로 동결 유지되었다. 9-10 hTERT 오버래핑 펩티드의 27개의 풀 (표 2)이 IFNγ ELISPOT 에세이 내 hTERT 특이적 T-세포 반응의 폭을 스크린하는데 사용되었다.
[표 2]
hTERT
오버래핑 펩티드의 풀(Pool)
종양 세포주
INVAC-1에 의해 매개되는 항-종양 효과를 평가하는데 사용되는 Sarc-2 종양 세포주는 HLA-A2/DR3 마우스의 자발적 섬유육종에서 획득되었다. 종양 덩어리가 멸균 조건하에서 분리되었고, 일차 세포 서스펜션이 생성되었다. 세포주는 HLA-A*0201 분자를 발현하는 것으로 나타났다. 세포는 10% FBS (Life Technologies) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 글루타맥스 배지 (Life Technologies) 내에서 배양되었다.
마우스 면역법 및
in
vivo
전기천공법 절차
피내(intradermal: ID) 면역이 마우스 옆구리 하부에서 인슐린 시린지 및 특수 니들(U-100, 29GXl/2"-0.33x12 mm, Terumo, Belgium)을 사용하여 면도 후에 수행되었다. 면도 후, 면역 절차 도중 및 후에도 홍반(erythema)은 관찰되지 않았다. 근육 내 (Intramuscular: IM) 면역이 앞정강근(anterior tibialis cranialis muscle)에 대해, 이 또한 인슐린 시린지 및 특수 니들 U-100을 사용하여 수행되었다. 피하(subcutaneous: SC) 면역은 꼬리를 기초로, 이 또한 인슐린 시린지 및 특수 니들 U-100을 사용하여 수행되었다. 동물 각각은 실험에 따라서 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800 또는 1200 μg 의 DNA 또는 1X PBS에 상응하는 플라스미드 (INVAC-1, NTC, pUTDlONot, pUTDlOCog 또는 pUTD23Tyn)의 프라이밍 IM, ID 또는 SC 주사를 투여받았다. 백신 방법에 따라, 마우스는 유사한 2차 또는 3차 DNA 또는 1X PBS 주사를 투여받을 수 있었다.
In vivo DNA 전기천공법이 플레이트 전극(P-30-8G, IGEA)이 설치된 CLINIPORATOR® 2 전기천공법 시스템 및 소프트웨어 (IGEA, Italy)를 사용하여 수행되었다. ID 또는 SC 백신접종 직후, 피부 주름(skin fold)이 주사 사이트에 만들어져, 전체적으로 전도성 겔 (Labo FH, blue contact gel, NM Medical, France)로 덮여지고 및 플레이트 전극 사이에 놓였다. 상이한 전압의 두개의 펄스가 적용되었다 (HV-LV): HV: 1250 V/cm, 1 Hz, 100 μs; 1 펄스, 1000 ms 브레이크; LV: 180 V/cm, 1Hz, 400 ms, 1 펄스. IM 주사 직후, 각 근육은 전체적으로 전도성 겔로 덮여졌고, 플레이트 전극 사이에 놓였다. 상이한 전압의 두개의 펄스가 적용되었다 (HV-LV): HV: 750 V/cm, 1 Hz, 100 μ8; 1 펄스, 1000 ms 브레이크; LV: 100 V/cm, 1 Hz, 400 ms, 1 펄스.
특정 실험에서는, DNA 백신접종 18시간 전 또는 INVAC-1 투여에 부수적으로, 마우스는 25 μl/플랭크의 최종 볼륨 내 0.5 μg 의 뮤린 GM-CSF 또는 1 ng의 뮤린 IL-12을 ID 주사받았다. 두 사이토카인 모두는 Miltenyi (Germany)에서 구매되었다.
ELispot
에세이
면역화된 마우스의 비장이 취해져서 으깨졌고, 세포 서스펜션이 70 mm 나일론 메쉐 (Cell Strainer, BD Biosciences, France)를 통과하여 여과되어 비장 세포를 분리하였다. 면역화된 마우스의 혈액이 마취 후 안-와 천자(retro-orbital puncture)를 통해 수집되어 말초 단핵 혈액 세포(peripheral mononuclear blood cells:PBMC)를 분리하였다. 비장 세포 또는 PBMC가 Ficoll(lymphocyte Separation Medium, Eurobio, France)를 사용하여 정제되었다. 혈액 또는 비장의 Ficoll-정제된 림프구는 Cellometer® Auto T4 Plus 카운터 (Ozyme, France)를 사용하여 계산되었다.
ELispot PVDF 마이크로플레이트 (IFNγ Elispot kit, Diaclone, Abcyss, France, ref. 862.031.010P)가 포획 항체 (항-마우스 IFN-γ)로 하룻밤 동안 코팅되었고 1X PBS-2% 우유로 블로킹되었다. 세포 서스펜션이 2xl05 세포/웰로 3회 플레이트에 첨가되었고, 무-혈청 배양 배지 또는 PMA-이오노마이신 (각각 0.1 μΜ 및 1 μΜ)과 함께 5 μg/ml 의 HLA 또는 H2 제한된 hTERT 유래 펩티드로 자극되었다. 19시간 후, 스팟이 비오틴-접합된 검출 항체 및 이어지는 스트렙타비딘-AP 및 BCIP/NBT 기질 용액에 의해 나타났다. 스팟은 Immunospot ELispot 카운터 및 소프트웨어 (CTL, Germany)에 의해 카운팅되었다. ELispot 데이터의 분석 시, hTERT 특이적 CD8 또는 CD4 T-세포에 대응하는 스팟의 빈도가 10 스팟의 컷-오프 값보다 더 놓은 경우 백신된 동물이 반응자(responder)로 고려되었다.
In
vivo
세포독성 에세이
표적 세포 제조를 위해, 나이브(naive) HLA-B7 마우스의 비장 세포가 높은 (5 μΜ), 중간의(1 μΜ) 또는 낮은 (0.2 μΜ) 농도의 CFSE (Vybrant CFDA-SE cell-tracer 키트; Life Technologies, Saint-Aubin, France)를 함유하는 1X PBS 용액에 의해 라벨링되었다. 5 및 1 μΜ CFSE로 라벨된 나이브 비장 세포는 각각 2개의 상이한 HLA-B7 펩티드, 1123 및 351의 5 μg/mL와 함께 1.5 hour동안 상온에서 펄스되었다. 낮은 CFSE 라벨된 비장 세포는 비펄스되어 남겨졌다. 이전에 INVAC-1 또는 1X PBS로 백신된 마우스 각각이 프라임-14일 후 또는 부스트 주사-10일 후에, 안와 정맥을 통해, 각 분획의 동일한 세포의 수를 함유하는 혼합의 10 CFSE-라벨된 세포가 주사되었다. 15-18 시간 후, 비장의 단일-세포 서스펜션이 MACSQUANT® 유세포 분석기 (Miltenyi, Germany)를 사용한 유동 세포분석법에 의해 분석되었다.
펩티드-펄스된 세포의 소멸을, INVAC-1 면역회된 마우스 대(versus) 컨트롤 (1X PBS) 마우스 내에서의 비펄스된 (낮은 CFSE 형광 강도) 집단에 대한 펄스된 (높은/중간의 CFSE 형광 강도) 집단의 비율을 비교함으로써 측정되었다. 테스트 동물 당 특이적 사멸(specific killing)의 비율이 하기의 식에 따라서 정립되었다:
[1 - [평균 (CFSElowPBS/CFSEhigh / mediumPBS)/(CFSElowpDNA/CFSEhigh / mediumpDNA)]] x 100.
사이토카인 결합 에세이(
Cytokine
Binding Assay:
CBA
)
백신된 HLA-A2/DR1 마우스의 비장 세포 (6xl05 세포)가 5 μg/mL의 HLA-DR-제한된 hTERT 유래 펩티드 (578, 904, 및 1029)와 함께 24 h, 37 ℃에서 배양되었다. 사이토카인 배양 상청액이 회수되었고, 시험 때까지 -20℃에서 동결되었다. 상업적으로 입수 가능한 키트인, 마우스 Thl/Th2/Thl7 Cytometric Beads Array (CBA, BD biosciences) 키트가 IL-2, IFNγ, TNFα, IL-4, IL-6, IL-17a 및 IL-10 각각의 농도를 정량하는데 사용되었다. CBA 면역에세이가 제조자의 인스트럭션에 의거하여 수행되었다. 유동 세포 분석 획득이 FACScan LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 수행되었다; 분석은 FCAP Array TM 소프트웨어 버젼 3.0 (BD Biosciences)을 사용하여 수행되었다.
In
vivo
항-종양 효과
치료 백신접종 실험을 위해, 24주-령 HLA-A2/DR1 마우스의 우측 복부 옆구리 상에 2.104 Sarc-2 세포가 피하적으로 이식되었다. 동물은 이식 후 4, 21 및 35일째에 ID 경로를 통한 DNA 백신으로 면역화되었고, 이어서 전술된 전기천공법이 수행되었다. 매 2 내지 3일마다, 종양 성장이 칼리퍼를 사용하여 모니터링되었다. 마우스 중량 또한 매 2 내지 3일마다 모니터링되었다. 마우스는 종양이 2000mm3에 도달하는 경우 안락사 되었다. 암 연구에 대한 [guidelines for the welfare and use of animals]의 가이드라인이 특히, 즉시 간섭을 필요하게 하는 임상적인 징후의 모니터링에 대하여 준수되었다 (Workman et al. 2010, BJC). 종양 볼륨이 하기의 식을 사용하여 산출되었다:
(L*l2)/2. (L= 길이; 1= 넓이)
결과는 mm3 로 표시되었다.
예방적 백신 접종을 위해, 5-10 주-령 HLA-A2/DR1 마우스가 전술된 바와 같이 2회 백신되었다 (0일 및 21일). 마지막 면역 32일 후, 동물들은 5.104 Sarc-2 세포를 피하적으로 이식받았다. 마우스 중량 및 종양 성장이 매 2 내지 3일마다 전술된 바와 같이 모니터링되었다.마우스는 종양이 2000 mm3에 도달되는 경우, 안락사되었다.
종양 성장 지연 (Tumor growth delay: TGD) 기준이 백신 효능을 평가하는데 t용되었다. 이는 컨트롤 및 처치된 그룹 내에서 규정된 종양 볼륨 (500 mm3)에 도달하는 시간을 비교하였다.
통계적 분석 및 데이터 처리
Prism-5 소프트웨어가 데이터 처리, 분석, 그래프 표현(representation)에 사용되었다. 데이터는 평균±표준편차 또는 중간값으로 표현되었다. ELISpot 에세이의 통계적 분석이 Mann Whitney 비 모수성(non parametric) 및/또는 Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법을 사용하여 수행되었다. 유의성은 p-value < 0.05에서 설정되었다.
결과(RESULT)
INVAC
-1 플라스미드 DNA의
특징화
및 서열 분석
다양한 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 제한 매핑에 의해 확인된 바와 같이 Ubi-hTERT 트랜스진이 pNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI 내로 성공적으로 삽입되었다 (도 1A & 1B). 생성된 pNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI-Ubi-hTERT (INVAC-1) 벡터는 또한 부분적으로 접합점(junction)에서 pVAC5' 및 pVAC3' 프라이머를 사용하여 시퀀싱되었다. 서열은 클로닝 공정이 성공적으로 수행되었음을 확인하였다.
INVAC-1 플라스미드의 전체-길이 시퀀싱이 Master Cell Bank 플라스미드 재료 (SEQ ID NO: 11 & 도 16) 상에서 수행되었다 (SEQ ID NO: 11 & 도 16). 결과는 한 개의 염기를 제외하고는 예상된 서열과 일치하였다. 실제로, 본 전체 시퀀싱은 데이터베이스에 제출된 인간 텔로머라제 유전자 (Accession number NM_198253)와 비교하였을 때, 침묵 돌연변이 (G6064C; GGG 글리신이 GGC 글리신으로)를 확인하였다. 상기 염기 변화는 야생형 텔로머라제 유전자 내 존재하는 독특한 BamHI 사이트 (GGATCC 내지 GCATCC)를 파괴하기 때문에 상기 침묵 돌연변이는 INVAC-1의 추가적 특징(signature)으로서 고려되었다.
NVAC
-1 유도체 구조물의
특징화
및 서열 분석
상이한 Ubi-hTERT 융합 단백질을 발현하는 3개의 INVAC-1 유도체 DNA 플라스미드가 합성되었고 클로닝되었다(도 2A). 모든 Ubi-hTERT 트랜스진이 HindIII 및 XbaI 처리 및 전기영동에 의해 확인되는 바와 같이, pcDNA3.1(+) Invitrogen 발현 벡터 내로 성공적으로 결찰되었다 (도 2B). 인서트 및 접합점이 DNA 인서트를 플랭킹하는 벡터 서열을 매칭하는 PEGFP-N5'및 BGH 프라이머를 사용하여 시퀀싱되었다. 시퀀싱 결과는 트랜스진이 정확하게 클로닝되었다는 것을 확인하였다 (SEQ ID NO: 13, 15, 17 & 도 17 내지 19).
INVAC
-1 및
INVAC
-1 유도체 단백질이 맞게 in vitro 발현되었고,
프로테아좀
경로에 의해 분해되었다.
웨스턴 블롯 에세이가 수행되어 HEK293T 및 CrFK 세포주 내로의 일시적 in vitro 형질감염 18 h 내지 96 h 후의 야생형 hTERT, INVAC-1 및 INVAC-1 유도체 단백질의 전체적인 발현에 대한 정보를 제공하였다. 야생-형 hTERT 단백질의 밴드는 124.5 kDa 에서의 비개질된 hTERT의 크기에 대응한다 (도 3A 및 3B, 상기 도면의 왼쪽 부분). 야생-형 hTERT 단백질 발현은 시간이 경과 되는 동안, 특히 HEK293T 세포 내에서 안정한 것으로 확인되었다. 반면, INVAC-1 (도 3A 및 3B의 우측 부분, 및 도 3C의 상단부분) 및 INVAC-1 유도체 단백질 (도 3C의 하단부)은 시간이 경과됨에 따라 빠르게 분해되었다.
야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT)와는 반대로, INVAC-1 구조물은 두 개의 상이한 밴드를 생성한다: Ubi-hTERT 융합 단백질에 상응하는 127.4 kDa의 예상되는 크기를 가지는 약한 상부 밴드 및 유비퀴틴 폴리펩티드가 결여된 INVAC-1-암호화 hTERT 단백질에 상응하는 하부 밴드 (119 kDa). 상기 INVAC-1-암호화 hTERT 단백질의 두 유형은 세포주 HEK293T 및 CrFK 둘 다에서 검출되었다 (도 3A 및 3B). 동일한 패턴이 INVAC-1 유도체 구조물인, △lONot, △lOCog 및 △23에서도 관찰되었다. (도 3C). 종합하면, 야생형 hTERT와 비교하여 INVAC-1 및 INVAC-1 유도체 단백질의 약한 발현, 이들의 발현 패턴 및 이들의 시간에 따른 소멸 동력학은 상기 단백질들이 유비퀴틴 융합 단백질의 분해와 관련된 제안된 모델인 유비퀴틴-의존 프로테아좀 경로(Bachmair, 1986)에 의해 빠르게 분해된다는 것을 제안한다. 119 kDa 의 INVAC-1 밴드의 빠른 출현은 Ubi-hTERT 접합점에서의 유비퀴틴- 특이적 프로세싱에 의해 단백질의 대다수가 공번역적으로 절단되거나 거의 그렇게 되었다는 것을 의미한다. 따라서, 단백질은 단백질 분해에 대한 소위 N-말단 룰에 따른 빠른 프로테아좀-의존 분해 경로 내로 들어가게 되었다 (Tasaki, 2012; Varshavsky, 1996).
상기 결과는 in vitro 발현 패턴 및 INVAC-1 및 INVAC-1 유도체에 의해 암호화되는 Ubi-hTERT 융합 단백질의 존재를 입증한다. hTERT-유래 단백질로 융합된 유비퀴틴 폴리펩티드는 N-말단 룰에 따라 단백질의 분해를 향상시킴에 의해 이의 역할을 수행하였다. 상기 N-말단 룰에 따라, hTERT는 주요 조직접합성 복합체 (MHC) class I 분자에 의한 항원 제공을 위한 펩티드의 생산과 관련된 프로테아좀 시스템에 의해 빠르게 분해되는 불안정한 단백질이 된다(Cadima-Couto, 2009; Michalek et al, 1993). 따라서, 상기 데이터는 포유류 조직 배양 세포 내 향상된 분해를 경험하는 Ubi-hTERT 융합 구조물이 또한 in vivo 상에서 빠르게 분회될 수 있고, 야생형 hTERT 보다 더 높은 CD8+ T-세포 반응을 효율적으로 유도한다는 젓을 의미한다.
INVAC
-1 단백질은 두드러진 세포질 분포 및 핵인 배재 패턴을 가진다.
INVAC-1-유래 hTERT 단백질의 분해를 촉진하기 위해 이의 탈국소화하기 위한 아이디어로, 핵인 국소화 시그널 (hTERT의 N-말단 부분)이 제거되었다. 따라서, INVAC-1에 의해 암호화된 hTERT의 세포 국소화가 CrFK, HEK293, HeLa, QT6 세포주 내로의 형질 감염 후 면역형광 분석법에 의해 평가되었다 (도 4).
야생형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT)는 24시간에 형질감염된 HEK293T 세포 내 핵 및 핵소체 내로 두드러지게 국소화되는 것이 확인되었다 (도 4A). 대조적으로, INVAC-1 단백질은 먼저 명백한 핵인 배재 패턴을 가지고 핵과 세포질 사이에 분포되었다 (도 4A). 야생-형 hTERT (pTRIP-CMV-hTERT) 및 INVAC- 1 플라스미드의 HeLa 세포내로의 일시적 형질감염은 두 단백질 모두에 대해 형질감염 후 24시간 및 48시간에 유사한 국소화 패턴을 보였다 (도 4B).
약한 항-hTERT 형광 신호가 pNTC8685-eRNA41H 빈 백본 벡터의 형질감염 후 HEK293T 및 HeLa 세포 내에서는 관찰되지 않을 수 있다는 것은 아마도 내생적 hTERT와의 교차 반응성 때문일 것이다.
내생적 hTERT 단백질 발현에 의한 비-특이적 형광 백그라운드를 극복하기 위해서, 비-인간 세포주인, QT6 quail 섬유육종 및 CrFK 고양이 신장 세포가 면역염색에 사용되었다. 어떤 백그라운드 신호도 pNTC8685-eRNA41H 빈 백본 벡터로 일시적 형질감염 후 상기 두 세포 모두에서 관찰되지 않았다 (도 4C & D). 예상대로, 외생성 야생형 hTERT 단백질(pTRIP-CMV-hTERT)이 두 세포주의 핵 및 핵소체 내에서 주로 검출되었다 (도 4C & D). HEK293T 및 HeLa 세포 내에서 기존 관찰된바와 같이, INVAC-1 단백질은 24h에 CrFK 세포 내 핵 및 세포질성 분포를 가졌다 (도 4D). 흥미롭게도, 24h 및 48h에서의 QT6 세포 내 INVAC-1의 발현이 세포질에서만 이라는 것은 핵인 국소화 시그널의 결실이 상기 세포주 내 단백질의 분포를 완전히 변경한다는 점을 나타낸다.
종합하면, 상기 결과는 INVAC-1-유도된 hTERT 단백질이 상이한 세포주 내 야생형 hTERT와 비교하여 개질된 준세포 분포를 가진다는 것을 보여준다. 상기 변경은 MHC class I을 위한 단백질의 펩티드로의 프로테오좀형 분해를 촉진시켜 특이적 세포 면역 반응을 발생시키는데 유리할 수 있다(Andersson 및 Barry, 2004).
(비특이적 hTERT 백그라운드 없이) INVAC-1 유도체 (pUTDlONot, pUTDlOCog 및 pUTD23Tyn)를 사용한 QT6 및 CrFK 세포의 형질감염은 상기 hTERT-유래된 단백질의 핵인 배재 패턴을 확인한다 (데이터 미제시). 이들의 준세포 분포는 야생형 hTERT와 비교하여 대부분 세포질성이었다.
INVAC
-1 및
INVAC
-1 유도체는
효소적
활성을 갖지 않는다.
인간 텔로머라제는 종양 세포의 불멸화에 참여하고 노화를 억제함으로써 종양 성장에 큰 영향을 미친다. 따라서, 백신 제품으로서 야생형 텔로머라제를 사용하는 것은 안전성의 문제를 야기시킬 수 있다.
텔로머라제 음성 CrFK 세포주 내 Ubi-hTERT 구조물의 텔로머라제 활성을 평가하기 위해서 TRAP 에세이가 수행되었다. pTRIP-CMV-hTERT 플라스미드를 사용한 야생형 hTERT로 형질감염된 CrFK 세포에서만 텔로머라제 활성이 검출되었다. INVAC-1 또는 INVAC-1 유도체로 형질감염된 CrFK 세포에서는 텔로머라제 활성이 검출되지 않았다 (도 5).
도 5A 및 5C에서 나타낸 바와 같이, 원(raw) 흡광도 데이터는 INVAC-1 및 INVAC-1 유도체의 텔로머라제 활성 레벨이 비처치된 세포의 레벨과 유사한 것을 보여준다.
가열-비활성화된 샘플을 포함하는 다양한 음성 컨트롤을 사용함으로써 에세이의 특이성을 고려하여 충분히 분석한 결과인, 상대적 텔로머라제 활성(RTA) 데이터 (도 5B 및 5D)에 따르면, INVAC-1 및 INVAC-1 유도체에 텔로머라제 활성이 완전하게 결여되었다는 것을 보여준다.
내부 증폭 표준 (IS) 컨트롤로 처치된 모든 샘플은 CrFK 용해물 샘플 내 Taq DNA 폴리머라제 억제제의 부재를 확인하는데 매우 긍정적이었고 따라서 에세이의 특이성(specificity)이 재차 강조되었다.
따라서, 상기 결과는 INVAC-1 및 INVAC-1 유도체가 효소적 활성을 가지지 않는 다는 것을 의미한다. 따라서, 텔로머라제 활성과 관련하여, 인간에 INVAC-1을 사용하는 데에 대한 안전성의 우려는 존재하지 않는다.
전기천공법은
INVAC
-1의 ID 투여 후 인터페론-γ를 분비하는
hTERT
특이적 CD8 T-세포의 유의한 레벨을 유도하는데 유리하다.
hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응의 강도가 피부 전기천공법이 뒤따르는 혹은 뒤따르지 않는 피내(intradermal) 경로를 통해 INVAC-1로 사전 면역화된 C57BL/6 마우스에서 평가되었다 (도 6). 투여 14일 후, 마우스 비장이 수득 되었고 및 유도된 면역반응이 H2 제한된 hTERT 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통하여 모니터되었다. IFNγ+ CD8 T-세포에 대해 빈도의 유의한 차이가 INVAC-1 의 ID 주사 후 전기천공법을 받은 마우스 그룹 및 그렇지 않은 그룹 간에 관찰되었다 (p< 0.05). 따라서, 결과는 전기 천공법이 INVAC- 1로 ID 백신접종 후 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응의 유의한 레벨을 유도하는데 유리하다는 것을 보여준다.
상이한 투여 경로를 통한
INVAC
-1 백신접종과 이어지는 전기천공법은 인터페론-γ을 분비하는
hTERT
특이적 CD8 T-세포를 유도한다. ID 백신접종 경로는 가장 좋은 경로인 것으로 나타났다.
통상의 백신은 일반적으로 SC 또는 IM 루트를 통해서 투여된다. 하지만, 면역의 피내 경로는 현재 백신접종 분야에서 다시 관심을 받고 있다 (Combadiere 및 Liard, 2011). 따라서, 통상의 SC 및 IM 루트와 비교하여 INVAC-1의 투여를 위한 ID경로가 시험 되었다.
시험의 제1 세트에서, 형질전환된 HLA-B7 마우스의 상이한 그룹이 ID 또는 SC 경로를 통해 INVAC-1으로 면역화되고, 이후 즉시 전기천공법이 수행되었다 (도 7A). 백신접종/전기천공법 14일 후, 마우스 비장이 수득 되었고 및 유도된 면역 반응이 비장 내에서 HLA-B7 제한된 hTERT 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통해서 모니터되었다. 시험의 제2 세트에서, 형질전환된 HLA-B7 마우스의 하나의 그룹이 ID 경로를 통한 INVAC-1로 면역화되었고, 다른 그룹은 IM 경로를 통해 면역화되었으며, 이후 즉시 전기천공법이 수행되었다 (도 7B). hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도가 HLA-B7 제한된 hTERT 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통해 PBMC 내에서 모니터되었다. INVAC-1를 사용한 백신 접종 및 이어지는 전기천공법이 사용되는 백신접종의 경로가 무엇이던 간에 HLA-B7 마우스 내 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응을 유도할 수 있다는 것이 확인되었다 (도 7A 및 7B).
또한, 도 7A에서 보이는 바와 같이, 반응하는 동물의 수가 각각 8마리 중 6마리 vs 8마리 중 3마리의 반응자로, SC 루트를 통해 백신된 그룹과 비교하여 IC 경로를 통해 백신된 마우스의 그룹에서 더 높았다. IM 백신된 동물과 ID 백신된 마우스의 그룹 사이에서 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 유의한 차이가 관찰되었다 (p<0.05) (도 7B).
상기 두 실험은 백신접종의 ID 경로가 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 INVAC-1-매개된 유도에 대해 IM 및 SC 루트보다 더 효율적이라는 것을 보여준다. 유사한 데이터가 다른 마우스 모델, 즉 HLA-A2-DR1 마우스를 사용하여 획득되었다 (데이터 미제시). 따라서, 이후의 모든 INVAC-1과 함께 수행되는 면역원성 연구는 전기천공법이 뒤따르는 백신의 ID 투여로 디자인되었다.
INVAC
-
1를
사용한 단일 ID 면역화 및 전기천공법 후
hTERT
특이적 CD8 T-세포 반응에 대한 백신 투여량의 영향
시험 되는 또 다른 중요한 파라메터는 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응에 대한 백신 투여량의 영향이다. C57BL/6 마우스가 INVAC-1의 증가되는 용량으로 두 하부 옆구리에 전기 천공법이 뒤따르는 ID 경로를 통해 면역화되었다. 백신 볼륨은 50 μΕ/사이트로 일정하게 유지되었다. 동물들은 투여받은 최종 백신 투여량에 따라 2 또는 4개의 사이트에 백신투여 되었다. 백신접종/전기천공법 14일 후, 마우스 비장이 수득 되었고 및 H2 제한된 hTERT 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통해서 모니터되었다.
첫 번째 실험에서, C57BL/6 마우스는 12.5 μg 내지 100 μg 범위의 용량으로 INVAC-1의 단일 ID 주사/전기천공법을 받았다 (도 8A). hTERT 특이적 CD8 T-세포의 유의한 차이가 100 μg 의 INVAC-1로 백신 된 동물 그룹과 PBS로 백신 된 컨트롤 동물 간에 관찰되었다(p<0.01) (도 8A). 또한, hTERT 특이적 CD8 T-세포의 수의 중간 값이 투여받은 백신의 용량 (12.5 μg 내지 100)에 비례하여 증가하였다. 반응하는 동물의 수는 또한 백신 투여용량에 따라 증가하였는데, 12.5 μg 투여량에 대해 6마리 중 4마리의 반응자, 25 μg 투여량에 대해 5마리 중 5마리의 반응자 및 100 μg 투여량에 대해 6마리 중 6마리의 반응자를 보였다.
실험의 두 번째 시리즈에서, C57BL/6 마우스는 100 μg 내지 1200 μg 범위로 INVAC-1의 단일 ID 주사/전기천공법을 받았다 (도 8B). hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도에 대해 유의한 차이가 PBS로 백신 된 컨트롤 동물과 비교하여 4 mg/mL 투여되는 800 μg 의 INVAC-1로 백신 된 동물의 그룹에서 관찰되었다(p<0.05) (도 8B). 이는 hTERT 특이적 CD8 T-세포 수의 중간 값이 100 μg 내지 800 μg의 투여받은 백신 용량에 비례하여 증가한다는 점 및 이의 중간 값이 1200 μg를 주사하는 경우 감소한다는 점을 보여준다. 반응하는 동물의 수는 백신의 투여량에 따라 증가되었는데, 각각 100 μg 투여량에서 5마리 중 4마리의 반응자, 200 μg 초과의 투여량에 대하여 5마리 중 5마리 또는 4마리 중 4마리의 반응자를 보였다. 1200 μg 투여량에 대하여, 심지어 모든 동물들이 반응자인 경우, 5마리 중 2마리는 여전히 컷-오프 값에 가까운 특이적 반응의 레벨을 나타내었다.
따라서, C57BL/6 마우스 내 백신 특이적 CD8 T-세포의 기준(criterion)과 관련하여, 투여량 반응이 INVAC-1의 상이한 양의 투여에 따라 관찰되었다. 흥미롭게도 컨트롤 마우스와 비교하여 가장 높은 용량의 백신(800 및 1200 μg)을 주사 받은 동물에 대해서도 백신 독성의 징후가 발견되지 않았다 (체중의 모니터링 및 희생된 시점에서의 현미경 부검). 유사한 데이터가 형질전환된 HLA-B7 마우스에서 획득되었다 (데이터 미제시)
프라임
-
부스트
방법이
hTERT
특이적 CD8 T-세포 반응의 레벨을 증가시키기 위해
INVAC
-1 백신접종에 대해 권장된다.
백신 특이적 면역 반응의 빈도를 향상시키기 위해서, 프라임 부스트 방법을 포함하는 대부분의 백신접종 프로토콜이 통상의 백신(BCG, 홍역, 인플루엔자...)에서 권장된다. 따라서, hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응의 발생에 대한 프라임-부스트 방법의 영향이 INVAC- 1 ID 백신접종 및 전기천공법에 대하여 시험 되었다. 상기의 목적을 위해, 형질전환된 HLA-B7 마우스가 INVAC-1로 ID를 통해 면역화되었고, 피부 백신접종 사이트가 백신 투여직 후 전기천공되었다. 1차 면역 21일 후, 마우스는 동일한 백신접종 절차를 사용하여 INVAC-1로 2차 주사되었다. 프라임 및 부스트 면역 후 상이한 시간 지점(point)에서, 말초 혈액이 수집되어 HLA-B7 제한된 hTERT 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통해 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응이 모니터 되었다 (도 9). hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응의 피크가 프라이밍 후 14일째에 관찰되었다. 하지만, 백신화된 동물 그룹 내 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값는 상대적으로 낮았고 (11.3 스팟/200,000 PBMCs), 5마리 중 5마리의 동물에서 백신에 반응하지 않았다. 부스팅 후, hTERT 특이적 CD8 T-세포의 피크는 주사 후 10일째 되는 날에 관찰되었다. 본 시간 지점(프라임 후 D31, 부스트-후 D10)에서 백신화된 동물의 그룹 내 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값는 면역-전 샘플의 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 중간값와 유의하게 상의하였다 (p<0.05). 부스팅 후 5마리 중 4마리가 반응자였다.
결론적으로, 프라임-부스트 백신접종 방법(regimen)은 INVAC-1 ID 백신접종/전기천공법에 대해 권장되는데, 그 이유는, 첫째 이는 혈액 내 순환하는 hTERT 특이적 CD8 T-세포 (이펙터 T-세포)의 빈도를 증가시킬 수 있고, 및 둘째 이는 항-암 백신접종에서 중요한 파라메터인 특이적 세포 면역 반응의 피크에 도달하는데 필요한 시간을 단축시키기 때문이다.
INVAC
-1, △
lONot
, △
lOCog
또는 △
23를
사용한 ID 백신접종 및 이어지는 전기천공법은
또한 hTERT
특이적 CD8 T-세포
반응를
유도한다.
프라임
-
부스트
백신접
종 방법이 백신 특이적 CD8 T-세포의 빈도를 증가시키기 위해 권장된다.
INVAC-1의 개발과 함께 3개의 다른 DNA 플라스미드 구조물 (INVAC-1 유도체)이 디자인되었다: △lONot (pUTDlONot), △lOCog (pUTDlOCog) 또는 △23 (pUTD23Tyn). 3개의 결실이 hTERT 효소의 촉매 사이트 내에서 조작되었다. 이들은 10 내지 23개의 아미노산 잔기로 범위되고, 및 발린-아스파르트산-아스파르트산 잔기 (Val-Asp-Asp, 또는 한 단어 코드로 VDD)의 핵심 트리오를 포괄(span)하였다 (도 2A). 상기 구조물은 효소의 활성을 감소시키는 임의의 결실도 면역원성을 유지할 수 있다는 것을 보여주기 위해 디자인되었다.
상기의 가정을 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스가 INVAC-1, △lONot, △lOCog, △23 또는 PBS를 사용하여 전기천공법이 뒤따르는 ID 경로를 통해 면역화되었다 (도 10A). 동물의 절반이 동일한 절차를 사용하여 일차 면역 21일 후에 DNA 또는 PBS의 이차 주사를 맞았다. 동물들은 최종 백신접종/전기천공법 14일 (단회 주사를 투여받은 마우스의 그룹) 또는 10일 (2회의 주사를 투여받은 마우스의 그룹) 후에 희생되었다. 마우스 비장이 수득 되었고 및 H2 제한된 hTERT 펩티드(4 펩티드의 풀)를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통하여 유도된 CD8 T-세포 반응이 모니터되었다.
단회 DNA 주사를 투여받은 동물에 대하여, PBS로 백신화된 컨트롤 동물과 비교하여, hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도에 대해 유의한 차이는 100 μg의 INVAC-1로 백신화 된 마우스의 그룹에서만 관찰되었다 (p<0.05) (도 10A, dark dots). 반응자의 빈도 분석에서, INVAC-1 및 △lOCog로 백신화된 마우스의 그룹에서 4마리 중 3마리의 반응자가 있었다. 하지만, △lOCog에 대해서는, 동물들은 50/200,000 비장 세포보다 더 낮은 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응을 가지는, 낮은 반응자였다. △23로 백신화된 동물 그룹에서는 4마리 중 1마리만이 반응자였고, △lONot에 의해 처치된 동물은 반응자가 없었다. 2회의 백신접종을 받은 동물들의 경우(도 10A, white dots), PBS를 투여받은 컨트롤 마우스와 비교하여, hTERT 특이적 IFN-γ를 분비하는 CD8 T-세포의 유의한 빈도의 중간값이 INVAC-1, △lONot, 및 △lOCog로 면역화된 마우스의 비장에서 관찰되었다(p<0.001). △23로 백신화된 마우스 그룹에서는 4마리 중 2마리만이 반응 동물이었고, 이는 통계적으로 유의하지 않았다. 결과적으로, 1회 또는 2회의 백신접종 후, INVAC-1 및 INVAC-1 유도체 구조물은 hTERT 특이적 CD8 T-세포를 유도할 수 있었고, INVAC-1는 C57BL/6 마우스 내에서 더 많은 면역원성이었다.
두번째 세트의 실험에서, 형질전환된 HLA-B7 마우스가 전기천공법으로 이어지는 INVAC-1, △lONot, △lOCog, △23 또는 PBS를 사용한 ID를 통해 백신화되었고 (도 10B), 동일한 절차를 사용하여 첫 번째 투여 21일 후 2차 주사되었다. 비장이 마지막 주사 10일 후 수집되었고, 유도된 CD8 T-세포 반응이 B7 제한된 hTERT 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통해 모니터되었다. 도 10B가 나타내는 바와 같이, PBS로 투여된 컨트롤 마우스와 비교하여, hTERT 특이적 IFN-γ 분비하는 CD8 T-세포의 유의한 빈도의 중간값이 INVAC-1, △lONot, △lOCog 및 △23로 면역화된 마우스의 비장에서 관찰되었다 (p<0.001).
INVAC-1에 대해 나타난 바와 같이, 3개의 INVAC-1 유도체 △lONot, △lOCog 및 △23도 또한 두 상이한 마우스 스트레인 내에서 ID 백신접종 및 전기천공법 후 hTERT 특이적 CD8 T-세포를 in vivo 유도할 수 있었다. 또한, 프라임-부스트 백신접종 방법이 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응의 유의한 레벨에 도달하기 위하여 INVAC-1 유도체에 대하여 권장되었다. 종합하면, 상기의 결과들은 INVAC-1이 가장 좋은 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응을 유도할 수 있는 구조물이라는 것을 보여준다. 이는 아마도 웨스턴 블로팅에 의해 보여지는 플라스미드 형질감염 후 △hTERT 단백질 발현 내에서 관찰되는 차이 때문일 것이다 (도 3).
전기천공법이 뒤따르는 ID 면역(들) 이후의
hTERT
특이적 T-세포 반응의 폭(breadth)은 백신접종에 사용되는
hTERT
플라스미드 구조물(
INVAC
-1,
pNTC
-
hTERT
및 pNTC-hTERT-△VDD)에 따라 상이하다.
hTERT와 비교하여, INVAC-1 구조물 내에서 조작된 hTERT 서열 변형, 즉 (1) 핵인 국소화 시그널의 결실, (2) 유비퀴틴 서열의 부가 및 (3) 촉매 사이트 내 결실,의 T-세포 면역 반응의 레퍼토리에 대한 영향(impact)이 평가되었다. INVAC-1 hTERT 특이적 세포 면역 반응이 INVAC-1을 이용한 ID 면역(들)/전기천공법(들) 후에 스크린되었고, 인간 TERT (pNTC -hTERT)의 천연형/야생형 서열을 암호화하는 NDA 및 VDD 영역만이 결실된 hTERT 서열을 암호화하는 DNA (pNTC -hTERT- △VDD)에 의해 유도된 반응과 비교하였다. 컨트롤 동물은 25 μg 의 pNTC 빈 벡터의 ID 주사 및 전기천공법을 받았다.
첫 번째 시리즈의 HLA-B7 형질전환된 마우스가 전술된 백신접종 프로토콜을 사용하여 4개의 구조물 중 하나의 단회 주사를 투여받았다 (25 μg/마우스). 두 번째 시리즈의 동물은 전술된 백신접종 프로토콜을 사용하여 4개의 구조물 중 하나로 제1 백신접종 21 후 프라임 주사 및 부스트를 투여받았다 (25 μg/마우스).
단회 주사 또는 부스트 10일 후, 백신화된 마우스 및 컨트롤 마우스의 비장 세포가 11 AA를 오버래핑하고 hTERT의 전체 단백질 서열을 회복하는 15AA의 269 펩티드 (10개의 펩티드 각각으로 구성된 27개의 풀)를 사용하여 IFNγ ELIspot 에세이 내에서 시험되었다.
INVAC-1를 사용한 면역은 많은 hTERT 에피토프에 대한 T-세포의 큰 레퍼토리를 유도하는데 왜냐하면 프라이밍 후, 약 12개의 풀의 펩티드가 인식되었기 때문이다(도 11A). 상기의 데이터는 최소 HLA-B7 제한된 12개의 에피토프가 강한 T-세포 반응을 유도할 수 있는 MHC 펩티드 복합제의 농도로 수지상 세포의 표면에 프로세싱 후 발현된다는 것을 의미한다. 상기의 중요한 결과는 APC의 표면상에 많은 hTERT 펩티드를 프로세싱 및 발현하는 INVAC-1의 능력을 보여준다. 다른 구조물(hTERT 및 hTERT△VDD)을 사용하여 획득된 차이는, hTERT에 대하여 T-세포 레퍼토리(repertoire)의 폭의 증가를 야기하는 INVAC-1에서 만들어지는 최적화 특징을 입증한다. 또한, 상기 결과는 펩티드 면역법과 비교하여 DNA 백신접종의 장점을 강조한다.
형질전환 마우스 내 INVAC-1을 사용한 두 번째 사이클의 면역법 (프라임-부스트)에 대한 장점이 본 연구에서 확인되었다. In vivo T-세포 레퍼토리는 적어도 5개의 신규 에피토프가 나타도록 개선되었다 (도 11B). 부스트 이후 총 적어도 17개의 에피토프가 인식되었다. 상기 데이터는 환자 내 복수의 주사가 더 나은 항-종양 반응을 유발하는데 더 유리할 것이라는 것을 보여준다.
27개 풀의 펩티드에 대해 검출된 특이적 T-세포의 빈도의 총 중간값을 합함에 의해 상기 데이터를 분석함에 있어서, 3개의 hTERT 구조물 사이에서는, 어떠한 주요한 차이도 하나의(프라임) 또는 두개의(프라임-부스트) 사이클의 면역 후에 관찰되지 않았다(도 11C). 이는, 비록 유의하게 더 높은 T-세포 매개 면역반응이 INVAC-1로의 부스트 후에 관찰되었지만, INVAC-1 hTERT 내 만들어진 변형이 면역 반응의 폭에는 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
결론적으로, INVAC- 1 백신접종은 T-세포에 의해 인식되는 펩티드/에피토프에 대하여 야생형 hTERT 및 hTERT△VDD 구조물과는 상이하게 많은 hTERT 에피토프에 대한 T-세포 면역 반응의 큰 레퍼토리를 매개하였다.
전기천공법이 수반되는
INVAC
-1 ID 백신접종은 항-암 면역반응의 전형적인 특징인 세포독성 CD8 T-세포 및
Thl
CD4 T-세포와 함께
hTERT
특이적 T-세포 반응을 유도한다.
항종양 면역 반응과 관련된 면역 세포들 중에서, 세포독성 CD8 T 림프구 (CTL) 및 Thl CD4 T-세포는 가장 파워풀한 이펙터 세포로서 알려졌다(Vesely et al., 2011) (Braumuller et al., 2013).
첫 번째 단계에서, hTERT 특이적 CD8 T-세포의 세포독성 활성이 INVAC-1에 의한 ID 백신접종/전기천공법 후에 in vivo 연구되었다. 실제로, 상기 활성은 종양 세포를 죽이는데 필수적이다. INVAC-1 면역법에 의해 유발되는 hTERT 특이적 CD8+ T-세포 반응의 세포분해 강도를 in vivo 측정하기 위해서, in vivo 세포독성 에세이가 표적 세포로서 카복시플루오레신-디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)-라벨된, 펩티드-펄스된 비장 세포를 사용하여 수행되었다. 전술된 바와 같이 ID 경로를 통해 INVAC-1 (또는 컨트롤로서 PBS)으로 프라임 또는 프라임-부스트 백신접종을 받은 HLA-B7 형질전환된 마우스에 7.106 표적 세포가 정맥주사 되었다. 표적 세포는, 독립적으로 3개의 상이한 농도의 CFSE로 라벨되었고, HLA-B7 제한된 hTERT 펩티드(p351, 면역-우성 펩티드 또는 p1123, 준-우성 펩티드)로 펄스되거나 또는 내부 컨트롤로서 비펄스된, 나이브 유사(congenic) 마우스의 비장 세포이었다. 15-18 시간 후, 비장 세포가 수득 되었고, 면역화된 마우스 대(vs) 컨트롤 마우스 내 펩티드-펄스된 세포의 소멸이 유동 세포분석법에 의해 정량화되었다.
결과는 모든 마우스가 35%의 중간 특이적 용해와 함께, 단회 주사 후 면역-우성 펩티드 p351에 대하여 특이적 CTL을 발달시켰다 (도 12A, white dots). 3분의 1의 동물들이 준-우성 펩티드 p1123에 대하여 특이적 CTL을 발달시켰다 (도 12A, black dots). 다중 주사 사이클이 준-우성 펩티드 1123에 대응하여 특이적 용해를 발달시키는 동물의 수를 증가시킬 수 있을 것이라는 점을 예상할 수 있다.
hTERT 특이적 CD4 T-세포 반응이 NSCLC 환자에 대한 화학요법의 더 좋은 반응과 관련될 수 있다는 것이 최근 기술되었다(Godet et al., 2012). 따라서, INVAC-1 ID 주사 후 hTERT 특이적 CD4 T-세포 반응의 존재가 연구되었다. 상기 목적을 위해서, HLA-A2/DR1 형질전환된 마우스가 전기천공법이 수반되는 INVAC-1 ID 면역화되었고, hTERT 특이적 CD4 T-세포 반응이 비장 내에서 백신 접종 14일 후 DR1 제한 hTERT 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통해서 모니터링 되었다. 도 12B에서 나타내는 바와 같이, hTERT 특이적 IFN-γ 분비하는 CD4 T-세포 빈도의 유의한 중간값이 ID 백신된 마우스의 비장에서 PBS를 투여받은 컨트롤 마우스와 비교하여 관찰되었다 (p<0.001).
Thl 면역력은 in vivo 에서 암세포 완치에 상당히 긍정적인 영향을 미친다는 것이 강조되어왔다(Braumuller et al., 2013). 실제로, CD4+Thl 세포는 종앙에 대한 세포-매개된 면역력을 유도하는데 필수적인 몇몇 사이토카인(예를 들어 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2)을 생산한다. 따라서, INVAC-1 ID 백신접종 후, hTERT 특이적 CD4 T-세포에 의해 분비되는 상이한 사이토카인에 대해서 연구되었다. 이를 위해, NVAC-1 -백신된 HLA-A2/DR1 형질전환된 마우스의 비장 세포가 hTERT 펩티드의 풀로 24시간동안 in vitro 자극되거나 비 자극되었다. 상청액이 회수되었고, 사이토카인 결합 에세이 (CBA)에서 검사되어 hTERT 특이적 CD4 T-세포에 의해 분비되는 Thl, Th2 및 Thl7 사이토카인의 농도가 평가되었다. 도 12C에서 나타내는 바와 같이, 컨트롤 마우스의 상청액과 비교하여 INVAC-1로 백신된 마우스에서 회수된 비장 세포의 상청액에서 Thl 사이토카인 IL-2, TNFα 및 IFNγ의 유의한 농도가 검출되었다(p<0.05).
따라서, INVAC-1의 ID 백신접종/전기천공법은 Th1 프로파일을 가지는 특이적 CD4 T-세포와 함께 in vivo 세포 독성 활성을 보이는 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 확장을 촉진할 수 있다. 두 타입의 반응은 바람직한 항암 면역 반응의 전형적인 특징이다.
치료적 및 예방적
INVAC의
ID 백신접종 및 이어지는 전기천공법은 HLA-A2/DR1 형질전환된 마우스 내 동계(
syngeneic
) 종양 후 종양 성장을 지연시킨다.
지금까지는, INVAC-1의 ID 주사 및 이어지는 전기천공법이 마우스 내 세포독성 CD8 T-세포 및 Thl CD4 T-세포를 유도할 수 있는 결과가 제시되었다. 이후 단계에서는 Sarc-2 (섬유육종) 종양 세포 이식 후 INVAC-1 ID 백신접종 및 전기천공법에 의해 부여되는 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스의 보호 여부를 평가하였다. 첫번째 시도로서, 형질전환된 HLA-A2/DR1 마우스에 프라임-부스트 전략으로 전기천공법이 뒤따르는 INVAC-1이 ID 백신화되거나 또는 PBS가 목(mock) 백신화되었다. 예방적 백신접종 1개월 후, 마우스에는 50,000 Sarc-2 세포가 SC 경로를 통해서 접종되었다. 종양 볼륨이 매 2-3일마다 측정되었다. 도 13A는 마우스 치료에 따른 접종 후 종양 볼륨의 중간 값의 동력학을 보여준다. 500mm3 에서의 종양 성장 지연(TGD)이 이후 산출되었다. 본 기준은 컨트롤 및 처치된 그룹에서 규정된 종양 볼륨에 도달하는데의 시간을 비교함으로써 종양 성장에 미치는 백신 치료의 효과를 측정할 수 있게 한다. 11-일 종양 성장 지연이 INVAC-1로 백신된 마우스의 그룹과 PBS를 투여받은 동물 그룹 간에 관찰되었다. 따라서, INVAC-1의 예방적 백신 접종이 종양 성장을 늦추는데 효과가 있었다. 왜냐하면, 종양 이식이 마지막 백신접종 1달 후에 수행되었기 때문에, 항-종양 효과는 hTERT 특이적 메모리 T-세포의 존재에 어느 정도 기여될 수 있기 때문이다.
두 번째 시리즈의 실험에서, 형질전환된 마우스는 20,000 Sarc-2 세포로 이식되었고, 세포 이식 4일 후 INVAC-1로 ID 백신화되었고 전기천공법이 수행되었다 (도 13B). 컨트롤 동물은 INVAC-1과 동일한 백본을 가지지만 어느 종양 항원도 암호화하지 않는 "빈" 플라스미드 (NTC)의 ID 주사를 투여받았다. 2회의 부스트 백신 접종이 동일한 방법으로 종양 이식 21 및 35일 후에 수행되었다. 500mm3 에서의 종양 성장 지연이 산출되었다. 4-일 종양 성장 지연이 INVAC-1로 백신화된 마우스의 그룹과 NTC 빈 플라스미드를 투여받은 동물의 그룹 사이에서 관찰되었다. 따라서, INVAC-1 치료 백신접종은 상대적으로 약하지만 그럼에도 불구하고 반복적으로 관찰되는 종양 성장의 완화를 허용하였다.
INVAC
-1 ID 백신접종/전기천공법과 함께
뮤린
GM-
CSF의
투여는
hTERT
특이적 세포 면역 반응의 강도 및 질을
개선시키고
HLA
-A2/DR1 형질전환된 마우스 내 동계 종양 이식 후 종양 성장을 지연시킨다.
동물 모델 및 인간에서의 항-암 백신접종 연구에 있어서 항원 인식 및 T-세포 확장을 가능하도록 하기 위해 상이한 사이토카인이 면역조절제로서 지금까지 사용되어져 왔다. 가장 빈번하게 사용되어온 사이토카인 중 하나는 GM-CSF (Granulocyte macrophage Colony Stimulating Factor)이다. 상기 사이토카인은 항원 표출 세포의 성숙을 돕고 Thl 세포 면역 반응을 돕든다는 것이 알려져있다(Parmiani et al., 2007). 항-종양 백신 분야에서 GM-CSF이 수행하는 주요 역할과 관련하여, INVAC-1 ID 백신접종 및 전기천공법 후 hTERT 특이적 T-세포 반응에 대해서 뮤린 GM-CSF (mGM-CSF)의 첨가가 미치는 영향이 시험 되었다. 이를 위해서, C57BL/6 마우스는 ID 경로를 통한 INVAC-1 백신 및 이어지는 전기천공법 수행 18시간 전에 mGM-CSF의 ID 주사를 투여받았다(도 14A). 또 다른 그룹의 마우스는 mGM-CSF 투여 없이 INVAC-l로 ID 백신화/전기천공법을 받았다. 컨트롤 동물은 PBS으로 목(mock) 백신화 되었고 전기천공법을 받았다. 투여 14일 후, 마우스 비장이 수득 되었고 및 유도된 면역 반응이 H2 제한된 hTERT 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통해서 모니터링되었다. INVAC-1의 ID 주사 전에 mGM-CSF를 투여받은 마우스 그룹과 그렇지 않은 그룹간의 IFNγ+ CD8 T-세포의 빈도에 대한 유의한 차이가 관찰되었다 (p< 0.001). 따라서 mGM- CSF의 첨가가 hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도의 큰 증가를 허용하였다. 두 번째 단계는 상기 면역조절제가 hTERT 특이적 CD4 T-세포의 질, 및 특히 Thl 특이적 T-세포의 발생에 미치는 영향을 연구하는 것으로 구성되었다. 상기 목표를 위해, INVAC-1 또는 INVAC-l/mGM-CSF 백신된 HLA-A2/DR1 형질전환된 마우스의 비장 세포가 24시간 동안 DRl 제한된 hTERT 펩티드의 풀로 in vitro 자극되거나 또는 자극되지 않았다. 상청액이 회수되었고 사이토카인 결합 에세이 (CBA) 내에서 분석되어 hTERT 특이적 CD4 T-세포에서 분비된 ㅆhl, Th2 및 Thl7 사이토카인의 농도가 평가되었다. 도 14B에 나타난 바와 같이, INVAC-1만으로 백신화된 마우스의 상청액과 비교하여 INVAC-l/mGM-CSF 으로 백신된 마우스에서 회수된 배장세포의 상청액에서 유의한 농도의 Thl 사이토카인 IL-2, TNFα 및 IFNγ가 검출되었다. mGM-CSF를 첨가하는 경우, 항-종양성 사이토카인인 TNFα (p< 0.01), IFNγ (p< 0.05) 및 IL-2 (p< 0.05)의 농도의 큰 증가가 관찰되었다
따라서, mGM-CSF이 항-종양 효과를 강화시키는지 여부를 평가하기 위해서 mGM-CSF/INVAC- 1 조합이 Sarc-2 동물 종양 모델 내에서 연구되었다.
이를 위해, HLA-A2/DR1 형질전환된 마우스에 세포 이식 4일 후 INVAC-1 및 mGM-CSF이 ID 백신되었고 전기천공법이 수행되었다 (도 14C). 컨트롤 동물에는 빈 플라스미드 (NTC) 및 mGM-CSF 또는 PBS 및 mGM-CSF가 ID 주사되었다. 2회의 부스트 백신접종이 동일한 절차로 종양 이식 후 21일 및 35일째에 수행되었다. 500mm3에서의 종양 성장 지연 (TGD)이 산출 되었다. 14-일 TGD가 INVAC-l/mGM-CSF로 백신된 마우스 그룹 및 NTC/mGM-CSF를 투여받은 동물 그룹 사이에서 관찰되었다; 10-일 TGD가 INVAC-l/mGM-CSF 및 PBS/mGM-CSF 사이에서 관찰되었다. 상기 결과는 mGM-CSF와 조합된 INVAC-1의 치료 백신접종이 종양 성장의 완화(slow-down)를 허용한다는 것을 보여준다.
INVAC
-1 ID 백신접종/전기천공법과 함께
뮤린
IL-12의 투여는
hTERT
특이적 CD8 T-세포 반응의 강도를 향상시킨다
INVAC-1 ID 백신접종 및 전기천공법 후 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응에 대한 IL-12 사이토카인이 미치는 영향이 또한 연구되었다. 이를 위해서, HLA-A2/DR1 마우스는 INVAC-1의 ID 투여 및 이어지는 전기천공법과 함께 IL-12의 ID 주사를 투여받았다 (도 15). 마우스의 또다른 그룹은 IL-12의 투여 없이 INVAC-1/전기천공법 으로 ID 백신되었다. 컨트롤 동물은 PBS 및 IL-12 또는 PBS 단독으로 목(mock) 백신되었고, 이어서 전기천공법이 수행되었다. 주사 14일 후, 마우스 비장이 수득 되었고 및 유도된 면역반응이 A2 제한된 hTERT 펩티드를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통해서 모니터링되었다. 반응 마우스의 빈도는 IL-12를 첨가할 때 증가되었다. 실제로, INVAC-1 백신화 그룹 및 the INVAC-l/IL-12 백신화 그룹 각각에서 5마리 중 2마리, 5마리 중 4마리의 반응 동물이 관찰되었다.
실시예
II
약어:
AA: 아미노산, bp: 염기-쌍, CTL: 세포독성 T-림프구, CMV: 사이토메갈로바이러스, DNA: 데옥시리보핵산, EP: 전기천공법, ID: 피내투여, NoLS: 핵인 국소화 서열, RNA: 리보뉴클레익산, RTA: 상대적 텔로머라제 활성, TRAP: 텔로머성 반복 증폭 프로토콜, TERT: 텔로머라제 역전사효소, Ubi: 유비퀴틴, VDD: 발린- 아스파르트산-아스파르트산
물질 및 방법
플라스미드 DNA 벡터
INVAC
-1
INVAC- 1 구조물은 실시예 I에서 언급되었다.
INVAC
-1
셔플된
유도체
pUTScram 및 pUTInv 구조물은 효소적으로 불활성인 인간 유비퀴틴-텔로머라제-기초 융합 단백질을 암호화하는 대략 8.9 kb의 이중 가닥 DNA 플라스미드이다. 스크램블된 및 역전된 트랜스진이 포유류 세포 내 고-강도의 안정하고 일시적 발현을 위해 디자인된 pcDNA3.0에서 유래된 Invitrogen pcDNA3.1(+) 벡터 (5.4 kb) 내로 삽입되었다.
트랜스진 발현은 인간 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 (CMV) 프로모터에서 유래되어 넓은 범위의 포유류 세포 내에서 효율적인 고-강도의 발현을 허용한다. 벡터는 다중 클로닝 사이트 (MCS)를 포함하여 클로닝이 가능하도록 한다. 효율적인 전사 터미네이션은 소 성장 호르면 (BGH) 폴리아데닐레이션 시그널에 의해 유도된다.
pUTScram
(
스크램블체로
명명됨)
Ubi-스크램블된 hTERT 인서트 (스크램블체, 1184 AA)가 pUTScram 플라스미드의 위치 923에서 시작되어 위치 4474에서 종결된다 (도 20 A). pUTScram은 대략 130.2 kDa의 단백질에 상응하는 1184개 AA의 인간 유비퀴틴-텔로머라제-기초 융합 구조물 (스크램블체)을 암호화한다. hTERT 단백질에서 23개의 첫 번째 아미노-산 (1-23 AA)이 결실되고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 촉매 사이트는 VDD(* mark; 도 28)를 코딩하고 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; 특허 WO 2007/014740 및 hTERT isoform 1 Accession number NM_198253)의 AA 867-869에 상응하는 9 bp 결실에 의해 불활성화되었다. hTERT 서열이 10개의 면역원성 단편으로 나누어졌고 다음의 특이적인 순서로 재조합(reassemble)되었다: 단편 7 (210 bp), 단편 2 (201 bp), 단편 6 (312 bp), 단편 4 (117 bp), 단편 9 (576 bp), 단편 3 (120 bp), 단편 1 (258 bp), 단편 8 (477 bp), 단편 10 (516 bp), 단편 5 (303 bp). 상기 10개의 단편은 6xGly 링커 (G 링커; 18 bp)로 연결되었다. 따라서, 76개의 비-면역원성 AA (228 bp)가 hTERT 서열에서 결실되었다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트의 C-말단 서열의 14개의 아미노산은 V5 에피토프 태그를 코딩한다 (도 22).
pUTInv
(
역전체(inverted)로
명명됨)
Ubi-역전된 hTERT 인서트 (역전체, 1184 AA)는 pUTInv 플라스미드의 위치 923에서 시작하여 위치 4474에서 종결된다(도 20B). pUTInv는 대략 130.2 kDa의 단백질에 상응하는 1184개의 AA의 인간 유비퀴틴-텔로머라제-기초 융합 구조물(역전체)를 암호화한다. hTERT 단백질에서 23개의 첫 번째 아미노-산 (1-23 AA)이 결실되었고 이는 유비퀴틴 폴리펩티드 (76 AA)로 대체되었다. 촉매 사이트는 VDD (* mark; 도 29)를 코딩하고 야생형 인간 텔로머라제 (hTERT; 특허 WO 2007/014740; Accession number NM_198253)의 AA 867-869에 상응하는 9 bp 결실에 의해 불활성화되었다. hTERT 서열이 10개의 면역원성 단편으로 나누어졌고, 다음의 특이적인 순서로 재조합되었다: 단편 10 (516 bp), 단편 9 (576 bp), 단편 8 (477 bp), 단편 7 (210 bp), 단편 6 (312 bp), 단편 5 (303 bp), 단편 4 (117 bp), 단편 3 (120 bp), 단편 2 (201 bp), 단편 1 (258 bp). 상기 10개의 단편은 6xGly 링커 (G 링커; 18 bp)로 연결되었다. 따라서 76개의 비-면역원성 AA (228 bp)가 hTERT 서열에서 결실되었다. Ubi-hTERT 셔플된 인서트의 C-말단 서열의 14개의 아미노산 서열은 V5 에피토프 태그를 코딩한다 (도 22).
유전자 합성 및
클로닝
유전자가 유비퀴틴-텔로머라제-기초 융합 구조물로서 오버래핑 40-mer 올리고뉴클레오티드 어셈블리 프로세스 (GeneCust, Luxembourg)을 통하여 de novo 합성되었다. 몇몇 보존적 염기 변화가 제한 사이트를 제거하고 GC 풍부 서열을 약화시키기 위해서 수행되었다. 유전자 합성은 유전자를 원하는 발현 시스템 내로 서브클로닝하기 위해 독특한 플랭킹(flanking) 제한 사이트 HindIII/XbaI를 포함하였다. 합성된 유전자는 pcDNA3.1(+) 발현 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, USA)의 HindIII 및 XbaI 제한 사이트 사이에서 클로닝되었다. 플라스미드의 서열은 PEGFP-N5' CGGTGGGAGGTCTATATAAG (SEQ ID NO: 27) 및 BGH CAGGGTCAAGGAAGGCAC (SEQ ID NO: 28) 프라이머를 사용하는 시퀀싱에 의하여 확인되었다.
플라스미드 생산
본 INVAC-1 셔플된 유도체가 RD Biotech (Besancon, France)에 의한 E. coli 5-알파 세포 (fhuA2△(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 △(lacZ)M15 gyrA96 recAl relAl endAl thi-1 hsdR17) (Lucigen Corporation, Middleton, USA, ref. 60602-2) 내에서 혈질전환 및 생산되었다. 세포가 암피실린을 함유하는 Lenox Broth 배지(#EU04000D, Euromedex) 상에서 이식 및 증식되었다. 추출 및 정제 후, IX 멸균 PBS 내에서 재분산된 농축된 무-엔도톡신 기가프렙 플라스미드 스톡(gigaprep plasmid stocks)(2 mg/mL)이 제조되었다. 벡터는 제한 매핑 (HindIII-XbaI; 도 21)에 의해 확인되었다.
pTRIP
-
CMV
-
hTERT
본 DNA 플라스미드는 실시예 I에서 이미 기술되었다.
웨스턴
블롯
및 TRAP 에세이를 위한 세포 배양 및 일시적 형질 감염
CrFK (CraNdell Rees feline kidney), HEK293T (인간 배아 신장) 세포주가 10% 가열-불활성화된 태아 소 혈청(PAA, Velizy-Villacoublay, France) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Life Technologies, Saint- Aubin, France)이 보충된 [Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM)] 내에서 배양되었다.
세포는 5% C02를 함유하는 가습 된 대기 내 37℃ 75cm 플라스크 내에서 단층으로 성장되었다. 세포는 형질감염일의 70-80% 컨플루언스까지 성장되었다. 웨스턴 블롯 에세이를 위해, 5xl05 세포가 6-웰 조직 배양 플레이트 내 시딩 되었고 24시간 동안 인큐베이트되었다. TRAP 에세이를 위해 7xl05 세포가 6-웰 조직 배양 플레이트 내 시딩되었고 24시간 동안 인큐베이트되었다.
INVAC-1 및 pUTScram 및 pUTInv 구조물이 제조자의 인스트럭션 (Polyplus-transfection Inc., France)에 따라 jetPrime 양이온성 형질감염 시약을 사용하여 표적 세포 내로 형질감염되었다. pTRIP-CMV-hTERT 플라스미드로 형질감염된 세포는 양성 컨트롤로, 비-형질감염된 세포는 음성 컨트롤로서 사용되었다. 형질감염 배지는 4시간 후 제거되었고 2 mL의 DMEM의 배양 배지로 대체되었다. 적절한 시간의 형질감염-웨스턴 블롯 에세이의 경우 18-96시간 및 TRAP 에세이의 경우 24시간-후, 세포는 수득되었고 텔로머라제 발현 및 활성이 분석되었다.
웨스턴
블롯
웨스턴 블롯 분석이 형질감염된 HEK293T 세포를 사용하여 수행되었다. 웨스턴 블롯 절차는 실시예 I에서 기술된 것과 동일하다..
TRAP 에세이
본 절차는 실시예 I에 기술된다.
마우스
HLA-B*0702 형질전환된 마우스 스트레인이 본 실험에서 사용되었다.
HLA-B*0702 형질전환된 마우스는 인간 HLA-B*0702 α1-α2 도메인 분자 및 뮤린 α3 도메인 H2D 분자를 발현한다. 상기 마우스는 H2-Db 및 H2-Kb 분자는 발현하지 않는다 (Rohrlich et al., 2003).
마우스는 9 내지 15주령 사이에서 사용되었고, [Pasteur Institute of Paris]에 의해 제공되었다. 동물은 Pasteur Institute의 [Specific Pathogen Free animal facility](Animal Facilities Lwoff n°22, agreement number B 75 15-07)에서 사육되었다(housed). 피내(ID) 또는 정맥 (IV) 주사 전, 마우스는 개별 동물 체중 및 마취 기간에 따라 복강내의 경로 (IP)를 통해 IX 포스페이트 버퍼 식염수 (1X PBS, Life Technologies, Saint-Aubin, France) 내 2% 자일라진 (Rompun, Bayer Sante, Loos, France) 및 8% 케타민 (Imalgen 1000, Merial, Lyon, France) 의 혼합 용액으로 마취되었다. 모든 동물들은 [good animal practice and complied with local animal experimentation (Directive 2010/63/UE)]를 엄격하게 준수하면서 다루어졌다.
hTERT
펩티드
HLA-B*0702 제한된 hTERT 펩티드가 실시예 I에서 전술되었다. 동결건조된 펩티드는 2 mg/mL으로 멸균 수에 용해되었고 사용 전 -20℃에서 저장되었다.
마우스 면역법 및
in
vivo
전기천공법 절차
피내(ID) 면역이 마우스 옆구리 하부에서 인슐린 시린지 및 특수 니들(U-100, 29GXl/2"-0.33x12 mm, Terumo, Belgium)를 사용하여 면도 후에 수행되었다. 면도 후, 면역 절차 도중 및 후에도 홍반(erythema)은 관찰되지 않았다. 각 동물은 100 μg 의 DNA 또는 1X PBS와 함께 플라스미드 (INVAC-1, pUTScram 또는 pUTInv)의 프라이밍 ID 주사를 투여받았다. 백신 방법에 따라, 마우스는 유사한 2차 또는 3차 DNA 또는 1X PBS 주사를 투여받을 수 있었다.
In vivo DNA 전기천공법이 플레이트 전극(P-30-8G, IGEA)이 설치된 CLINIPORATOR® 2 전기천공법 시스템 및 소프트웨어 (IGEA, Italy)를 사용하여 수행되었다. ID 백신접종 직후, 피부 주름(skin fold)이 주사 사이트에 만들어져, 전체적으로 전도성 겔 (Labo FH, blue contact gel, NM Medical, France)로 덮여지고 및 플레이트 전극 사이에 놓여졌다. 상이한 전압의 두개의 펄스가 적용되었다 (HV-LV): HV: 1250 V/cm, 1 Hz, 100 μs; 1 펄스, 1000 ms 브레이크; LV: 180 V/cm, 1Hz, 400 ms, 1 펄스.
ELISpot
에세이
ELISpot 에세이가 실시예 I에서 기술된 방법에 따라 수행되었다. 실시예 II에서는 HLA-B*0702 제한된 3개의 특이적 hTERT 펩티드(p277, p351 및 p1123)의 풀 만이 사용되었다.
In
vivo
세포독성 에세이
In vivo 용해 에세이가 실시예 I에 기술된 절차에 따라 수행되었다. HLA-B*0702제한된 두 개의 특이적 hTERT 펩티드(p351 및 p1123) 만이 면역우성의 및 준우성의 펩티드로서 각각 실시예 II에서 사용되었다.
통계적 분석 및 데이터 처리
GraphPad Prism-5 소프트웨어가 데이터 처리, 분석, 그래프적 표현(representation)에 사용되었다. 데이터는 평균±표준편차 또는 중간값으로 표현되었다. ELISpot 에세이의 통계적 분석이 Mann Whitney 비 모수성(non parametric) 및/또는 Dunn's 다중 비교 테스트를 이용한 Kruskal-Wallis 분석법을 사용하여 수행되었다. 유의성은 p-value < 0.05에서 설정되었다.
결과(RESULTS)
INVAC
-1 플라스미드 DNA의
특징화
및 서열 분석
INVAC-1 플라스미드 DNA의 특징화 및 서열 분석은 실시예 I에서 기술하였다.
INVAC
-1
셔플된
유도체 구조물 (
pUTScram
및
pUTInv
)의
특징화
및 서열 분석
두 개의 INVAC-1 셔플된 유도체 유전자가 합성되었고 클로닝되었다 (도 20). 상기 구조물들은 실시예 I에서 기술된 INVAC-1 뉴클레오티드 서열 및 국제 특허 출원 WO 2007/014740에 기술된 야생형 hTERT 아미노산 서열을 기초로 하였다.
코돈 최적화가 포유류 세포의 높은 정도의 발현을 위해 수행되었다 (도 27). 스크램블된 및 역전된 Ubi-hTERT 셔플된 트랜스진이 HindIII 및 XbaI 처리 및 전기영동에 의해 성공적으로 pcDNA3.1(+) Invitrogen 발현 벡터에 결찰되었다(도 21). 인서트 및 접합점이 DNA 인서트를 플래킹하는 벡터 서열을 매칭하는 PEGFP-N5'및 BGH 프라이머를 사용하여 시퀀싱되었다. 시퀀싱 결과는 트랜스진이 올바르게 클로닝되었다는 것을 확인하였다 (도 28 및 29).
INVAC
-1
셔플된
유도체 단백질이 바르게
in vitro
발현되고,
프로테아좀
경로에 의해 분해된다.
웨스턴 블롯 에세이가 야생형 hTERT, INVAC-1, pUTScram 및 pUTInv 단백질의 전체적인 발현에 관한 정보를 제공하기 위하여, HEK293T 세포주 내로의 일시적 in vitro 형질감염의 18h 내지 96h 후에 수행되었다. 야생-형 hTERT 단백질의 밴드는 124.5 kDa에서 비개질된 hTERT의 사이즈에 상응하였다 (도 23A 및 23C, 도면의 왼쪽 부분). 실시예 I에서, 안정한 레벨로 발현되는 야생형 hTERT 단백질과는 반대로 시간에 따라 INVAC-1 단백질은 빠르게 분해되는 것으로 나타났다. 스크램블된 및 역전된 셔플된 단백질에 대한 특이적 밴드가 시간에 따라 검출되었다 (도 23A 및 23C, 도면의 우측부분). 둘 모두에 대해서, 상기 밴드는 전체 단백질의 예상된 사이즈(130.2 kDa)보다 더 작은 사이즈(<110 kDa)에서 관찰되었다. 스크램플된 및 역전된 단백질의 상기 형태는 분해된 산물에 상응한다. 실제로, 스크램블된 및 역전된 발현 비-분해된 산물은 웨스턴 블롯 분석 상에서 검출되지 않았다. 상기 구조물은 각각 1 내지 3개의 특이적 밴드를 가지는데 이는 생산 직후 상기 단백질의 빠른 분해를 의미한다. INVAC-1과 동일한, 시간에 따른 분해 패턴이 스프램블체 분해 산물에서 β-액틴 로딩 컨트롤로의 정상화 후에 보여졌다 (ImageJ 분석; 도 23B). 역전체 분해 산물은 다른 INVAC-1 유도체 단백질과 더 유사한 패턴을 가진다 (도 23C, 23D 및 도 3C: pUTDlONot, pUTDlOCog 및 pUTD23Tyn, 실시예 I 참조).
INVAC
-1
셔플된
유도체는 두드러진
세포질성
분포 및 핵인 배재 패턴을
가진다
INVAC-1 및 INVAC-1 유도체 (pUTDlONot, pUTDlOCog 및 pUTD23Tyn, 실시예 I 참조)에서 보이는 바와 같이, pUTScram 및 pUTInv에 의해 암호화된 스크램블된 및 역전된 셔플된 단백질은 핵인 배제 패턴으로 핵과 세포질의 사이에 분포되었다 (데이터 미제시).
INVAC
-1
셔플된
유도체는
효소적
활성을 갖지 않음.
TRAP 에세이가 수행되어 텔로머라제 음성 CrFK 세포주 내 Ubi-hTERT 셔플된 구조물의 텔로머라제 활성을 평가하였다. 텔로머라제 활성이 pTRIP-CMV-hTERT 플라스미드를 사용한 야생형 hTERT로 형질감염된 CrFK 세포 내 에서만 검출되었다.
도 24A에서 보여지는 바와 같이, 원 흡광도 데이터에 따르면 스크램블된 및 역전된 단백질의 텔로머라제 활성의 레벨이 비처치된 세포의 레벨과 거의 비슷하다는 것이 확인된다. 가열-불활성화된 샘플을 포함한 다양한 음성 컨트롤을 사용함에 의해 에세이의 특이성을 고려하여 충분히 분석된 결과를 보여주는 상대적 텔로머라제 활성 (RTA) 데이터 (도 24B)에 따르면, 상기 셔플된 단백질에서 어떤 텔로머라제 활성도 완전하게 결여되었다는 것이 확인된다.
셔플된
hTERT
구조물은
hTERT
특이적 CD8 T-세포 반응을 유도한다.
pUTScram 및 pUTInv 구조물은 INVAC-1 특징의 범위를 증가시키는 다중 hTERT 에피토프의 항원 제공을 유도하도록 디자인되었다. pUTScram, pUTInv 및 INVAC-1의 면역원성의 비교가 상이한 구조물로 ID 면역화되고 이어서 피구 전기천공법이 수행된 HLA-B7 마우스 내에서, 면역법 (프라임-부스트 방법)의 두 사이클 이후에 평가되었다. 동물들이 이차 백신접종/전기천공법 10일 후에 희생되었다. 마우스 비장이 수득되었고 및 유도된 CD8 T-세포 반응이 HLA-B7 MHC class I 제한된 hTERT 펩티드 (3개의 펩티드 p277, p351 및 p1123의 풀)를 사용한 IFN-γ ELISPOT 에세이를 통하여 모니터링되었다. hTERT 특이적 CD8 T-세포의 빈도에 대한 유의한 차이가 컨트롤 동물과 비교하여 INVAC-1, pUTScram (스크램블체) 및 pUTInv (역전체)로 백신화된 마우스 내에서 관찰되었다 (도 25).
상기 결과는 인조의 hTERT 셔플된 구조물인, pUTScram (스크램블체) 및 pUTInv (역전체)가 INVAC-1과 비교하여, 유효한 높은 레벨의 hTERT 특이적 CD8 T-세포 반응을 두번의 면역 사이클 이후에 유도할 수 있었다는 것을 보여준다. 실제로, INVAC-1에서 기술된 바와 같이, 프라임-부스트 백신접종법의 장점은 이전에 활성화된 특이적 T-세포를 선택적으로 부스팅시키고 에피토프 제시를 넓혀 신규의 특이적 TCRs를 포함한 이차적 hTERT 특이적 T-세포를 발생시키는데에 있다.
인조의
셔플된
hTERT
구조물인
pUTScram
및
pUTInv를
사용한 백신 접종은
in vivo
세포독성
hTERT
특이적 CD8 T-세포를 유도한다.
항종양 면역 반응과 관련된 면역세포들 중에서, 세포독성 CD8 T 림프구 (CTL) 및 Thl CD4 T-세포가 가장 강력한 이펙터 세포로 알려졌다(Vesely, Kershaw et al. 2011) (Braumuller, Wieder et al. 2013).
hTERT 특이적 CD8 T-세포의 세포독성 활성이 INVAC-1, pUTScram 및 pUTInv을 사용한 ID 백신접종/전기천공법 후에 in vivo 연구되었다. DNA 면역법에 의해 유도된 hTERT 특이적 CD8+ T-세포 반응의 세포용해성 강도를 in vivo 측정하기 위해서, in vivo 세포독성 에세이가 표적 세포로서 카복시플루오레신-디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)-라벨된, 펩티드-펄스된 비장 세포를 사용하여 수행되었다. 전술된 바와 같이 ID 경로를 통해 DNA 구조물 (또는 컨트롤로서 PBS)으 일회 백신접종을 받은 HLA-B7 형질전환된 마우스에 107 표적 세포가 정맥주사 되었다. 표적 세포는 독립적으로 3개의 상이한 농도의 CFSE로 라벨되고, HLA-B7 제한된 hTERT 펩티드(p351, 면역-우성 펩티드 또는 p1123, 준-우성 펩티드) 로 펄스되거나 또는 내부 컨트롤로서 비펄스된, 나이브 유사(congenic) 마우스의 비장 세포이었다. 15-18 시간 후, 면역화된 마우스의 비장이 수득되었고, 비장 세포 서스펜션이 유동 세포분석법에 의해 분석되었다. 특이적 용해의 비율이 백신된 마우스 대(versus) 컨트롤 무우스 내의, 비펄스된 CFSE 라벨된 세포에 대한 펄스된 세포의 비율을 비교함으로써 평가되었다.
결과는 상이한 구조물로 면역화된 모든 마우스가 hTERT 특이적 세포독성 T 림프구 (CTLs)를 단회 면역 후에 발달시켰음을 보여준다.
상기 세 그룹에서 예상된 바와 같이, 면역 우성 펩티드 p351에 대한 세포 독성이 준우성 펩티드 p1123에 대한 것보다 더 높았다 (도 26).
INVAC-1 및 pUTInv를 이용한 면역은 각각 37% 및 35%의, 텔로머라제 면역-우성 (p351) 에피토프-함유 표적 세포의 특이적 분해를 유발하였다 (도 26, black dots). 반면, pUTScram를 사용한 면역은 20%의 특이적 용해를 유발하였다. 5마리 중 두 마리의 INVAC-1 면역화된 마우스, 및 6마리 중 1마리의 pUTScam 면역화된 마우스가 준 우성 펩티드 p1123에 대하여 특이적 CTLs을 발전시켰다 (도 26, grey dots).
전술된 바와 같이, 다중 주사 사이클이 면역 우성 펩티드 및 준우성 펩티드 모두에 대하여 특이적 CTL 용해를 발전(development)시킬 수 있는 동물의 수를 증가시킬 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 실제로, 이전 결과(실시예 I 참조)에 따르면, 두 번째 면역이 준 우성 에피토프에 대한 면역 반응의 폭을 넓힌다는 것을 확인할 수 있다. 따라서, INVAC-1와 같이, 인조의 셔플된 hTERT 스크램블체 또는 역전체-매개 면역은 in vivo 세포 분해적 활성을 보이는 hTERT 특이적 CD8 T-세포를 발생시킬 수 있다.
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SEQUENCE LISTING
<110> INVECTYS
<120> A telomerase encoding DNA vaccine
<130> IP20162967FR
<160> 50
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 4018
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (59)..(3457)
<400> 1
caggcagcgc tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca cccccgcg 58
atg ccg cgc gct ccc cgc tgc cga gcc gtg cgc tcc ctg ctg cgc agc 106
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
cac tac cgc gag gtg ctg ccg ctg gcc acg ttc gtg cgg cgc ctg ggg 154
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg cag cgc ggg gac ccg gcg gct ttc cgc 202
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
gcg ctg gtg gcc cag tgc ctg gtg tgc gtg ccc tgg gac gca cgg ccg 250
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
ccc ccc gcc gcc ccc tcc ttc cgc cag gtg tcc tgc ctg aag gag ctg 298
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
gtg gcc cga gtg ctg cag agg ctg tgc gag cgc ggc gcg aag aac gtg 346
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
ctg gcc ttc ggc ttc gcg ctg ctg gac ggg gcc cgc ggg ggc ccc ccc 394
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
gag gcc ttc acc acc agc gtg cgc agc tac ctg ccc aac acg gtg acc 442
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
gac gca ctg cgg ggg agc ggg gcg tgg ggg ctg ctg ctg cgc cgc gtg 490
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
ggc gac gac gtg ctg gtt cac ctg ctg gca cgc tgc gcg ctc ttt gtg 538
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
ctg gtg gct ccc agc tgc gcc tac cag gtg tgc ggg ccg ccg ctg tac 586
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
cag ctc ggc gct gcc act cag gcc cgg ccc ccg cca cac gct agt gga 634
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
ccc cga agg cgt ctg gga tgc gaa cgg gcc tgg aac cat agc gtc agg 682
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
gag gcc ggg gtc ccc ctg ggc ctg cca gcc ccg ggt gcg agg agg cgc 730
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
ggg ggc agt gcc agc cga agt ctg ccg ttg ccc aag agg ccc agg cgt 778
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
ggc gct gcc cct gag ccg gag cgg acg ccc gtt ggg cag ggg tcc tgg 826
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
gcc cac ccg ggc agg acg cgt gga ccg agt gac cgt ggt ttc tgt gtg 874
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
gtg tca cct gcc aga ccc gcc gaa gaa gcc acc tct ttg gag ggt gcg 922
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
ctc tct ggc acg cgc cac tcc cac cca tcc gtg ggc cgc cag cac cac 970
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
gcg ggc ccc cca tcc aca tcg cgg cca cca cgt ccc tgg gac acg cct 1018
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
tgt ccc ccg gtg tac gcc gag acc aag cac ttc ctc tac tcc tca ggc 1066
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
gac aag gag cag ctg cgg ccc tcc ttc cta ctc agc tct ctg agg ccc 1114
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
agc ctg act ggc gct cgg agg ctc gtg gag acc atc ttt ctg ggt tcc 1162
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
agg ccc tgg atg cca ggg act ccc cgc agg ttg ccc cgc ctg ccc cag 1210
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
cgc tac tgg caa atg cgg ccc ctg ttt ctg gag ctg ctt ggg aac cac 1258
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
gcg cag tgc ccc tac ggg gtg ctc ctc aag acg cac tgc ccg ctg cga 1306
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
gct gcg gtc acc cca gca gcc ggt gtc tgt gcc cgg gag aag ccc cag 1354
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
ggc tct gtg gcg gcc ccc gag gag gag gac aca gac ccc cgt cgc ctg 1402
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
gtg cag ctg ctc cgc cag cac agc agc ccc tgg cag gtg tac ggc ttc 1450
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
gtg cgg gcc tgc ctg cgc cgg ctg gtg ccc cca ggc ctc tgg ggc tcc 1498
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
agg cac aac gaa cgc cgc ttc ctc agg aac acc aag aag ttc atc tcc 1546
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
ctg ggg aag cat gcc aag ctc tcg ctg cag gag ctg acg tgg aag atg 1594
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
agc gtg cgg gac tgc gct tgg ctg cgc agg agc cca ggg gtt ggc tgt 1642
Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
gtt ccg gcc gca gag cac cgt ctg cgt gag gag atc ctg gcc aag ttc 1690
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
ctg cac tgg ctg atg agt gtg tac gtc gtc gag ctg ctc agg tct ttc 1738
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
ttt tat gtc acg gag acc acg ttt caa aag aac agg ctc ttt ttc tac 1786
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
cgg aag agt gtc tgg agc aag ttg caa agc att gga atc aga cag cac 1834
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
ttg aag agg gtg cag ctg cgg gag ctg tcg gaa gca gag gtc agg cag 1882
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
cat cgg gaa gcc agg ccc gcc ctg ctg acg tcc aga ctc cgc ttc atc 1930
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
ccc aag cct gac ggg ctg cgg ccg att gtg aac atg gac tac gtc gtg 1978
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
gga gcc aga acg ttc cgc aga gaa aag agg gcc gag cgt ctc acc tcg 2026
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
agg gtg aag gca ctg ttc agc gtg ctc aac tac gag cgg gcg cgg cgc 2074
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
ccc ggc ctc ctg ggc gcc tct gtg ctg ggc ctg gac gat atc cac agg 2122
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
gcc tgg cgc acc ttc gtg ctg cgt gtg cgg gcc cag gac ccg ccg cct 2170
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
gag ctg tac ttt gtc aag gtg gat gtg acg ggc gcg tac gac acc atc 2218
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
ccc cag gac agg ctc acg gag gtc atc gcc agc atc atc aaa ccc cag 2266
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
aac acg tac tgc gtg cgt cgg tat gcc gtg gtc cag aag gcc gcc cat 2314
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
ggg cac gtc cgc aag gcc ttc aag agc cac gtc tct acc ttg aca gac 2362
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
ctc cag ccg tac atg cga cag ttc gtg gct cac ctg cag gag acc agc 2410
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
ccg ctg agg gat gcc gtc gtc atc gag cag agc tcc tcc ctg aat gag 2458
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
gcc agc agt ggc ctc ttc gac gtc ttc cta cgc ttc atg tgc cac cac 2506
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
gcc gtg cgc atc agg ggc aag tcc tac gtc cag tgc cag ggg atc ccg 2554
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
cag ggc tcc atc ctc tcc acg ctg ctc tgc agc ctg tgc tac ggc gac 2602
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
atg gag aac aag ctg ttt gcg ggg att cgg cgg gac ggg ctg ctc ctg 2650
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
cgt ttg gtg gat gat ttc ttg ttg gtg aca cct cac ctc acc cac gcg 2698
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
aaa acc ttc ctc agg acc ctg gtc cga ggt gtc cct gag tat ggc tgc 2746
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
gtg gtg aac ttg cgg aag aca gtg gtg aac ttc cct gta gaa gac gag 2794
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
gcc ctg ggt ggc acg gct ttt gtt cag atg ccg gcc cac ggc cta ttc 2842
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
ccc tgg tgc ggc ctg ctg ctg gat acc cgg acc ctg gag gtg cag agc 2890
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
gac tac tcc agc tat gcc cgg acc tcc atc aga gcc agt ctc acc ttc 2938
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
aac cgc ggc ttc aag gct ggg agg aac atg cgt cgc aaa ctc ttt ggg 2986
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
gtc ttg cgg ctg aag tgt cac agc ctg ttt ctg gat ttg cag gtg aac 3034
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
agc ctc cag acg gtg tgc acc aac atc tac aag atc ctc ctg ctg cag 3082
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
gcg tac agg ttt cac gca tgt gtg ctg cag ctc cca ttt cat cag 3127
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln
1010 1015 1020
caa gtt tgg aag aac ccc aca ttt ttc ctg cgc gtc atc tct gac 3172
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
1025 1030 1035
acg gcc tcc ctc tgc tac tcc atc ctg aaa gcc aag aac gca ggg 3217
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1040 1045 1050
atg tcg ctg ggg gcc aag ggc gcc gcc ggc cct ctg ccc tcc gag 3262
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
1055 1060 1065
gcc gtg cag tgg ctg tgc cac caa gca ttc ctg ctc aag ctg act 3307
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1070 1075 1080
cga cac cgt gtc acc tac gtg cca ctc ctg ggg tca ctc agg aca 3352
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
1085 1090 1095
gcc cag acg cag ctg agt cgg aag ctc ccg ggg acg acg ctg act 3397
Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1100 1105 1110
gcc ctg gag gcc gca gcc aac ccg gca ctg ccc tca gac ttc aag 3442
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1115 1120 1125
acc atc ctg gac tga tggccacccg cccacagcca ggccgagagc agacaccagc 3497
Thr Ile Leu Asp
1130
agccctgtca cgccgggctc tacgtcccag ggagggaggg gcggcccaca cccaggcccg 3557
caccgctggg agtctgaggc ctgagtgagt gtttggccga ggcctgcatg tccggctgaa 3617
ggctgagtgt ccggctgagg cctgagcgag tgtccagcca agggctgagt gtccagcaca 3677
cctgccgtct tcacttcccc acaggctggc gctcggctcc accccagggc cagcttttcc 3737
tcaccaggag cccggcttcc actccccaca taggaatagt ccatccccag attcgccatt 3797
gttcacccct cgccctgccc tcctttgcct tccaccccca ccatccaggt ggagaccctg 3857
agaaggaccc tgggagctct gggaatttgg agtgaccaaa ggtgtgccct gtacacaggc 3917
gaggaccctg cacctggatg ggggtccctg tgggtcaaat tggggggagg tgctgtggga 3977
gtaaaatact gaatatatga gtttttcagt tttgaaaaaa a 4018
<210> 2
<211> 1132
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln
1010 1015 1020
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
1025 1030 1035
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1040 1045 1050
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
1055 1060 1065
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1070 1075 1080
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
1085 1090 1095
Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1100 1105 1110
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1115 1120 1125
Thr Ile Leu Asp
1130
<210> 3
<211> 3246
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3246)
<400> 3
cgc gct ctg gtg gcc cag tgc ctg gtg tgc gtg ccc tgg gac gca cgg 48
Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg
1 5 10 15
cca ccc cct gcc gca ccc tca ttc cgc caa gtg tcc tgc ctg aag gag 96
Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu
20 25 30
ctg gtg gcc cga gtg ctg cag agg ctg tgc gag cgc ggc gcg aag aac 144
Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn
35 40 45
gtg ctg gcc ttc ggc ttc gcg ctg ctg gac ggg gct cgc gga ggc cca 192
Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro
50 55 60
ccc gag gcc ttc acc acc agc gtg cgc agc tac ctg ccc aac acg gtg 240
Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val
65 70 75 80
acc gac gca ctg cgg ggg agc ggg gcg tgg ggg ctg ctg ttg cgc cgc 288
Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg
85 90 95
gtg ggc gac gac gtg ctg gtt cac ctg ctg gca cgc tgc gcg ctc ttt 336
Val Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe
100 105 110
gtg ctg gtg gct ccc agc tgc gcc tac cag gtg tgc ggg ccg ccg ctg 384
Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu
115 120 125
tac cag ctc ggc gct gcc act cag gca cgg cct cca cct cac gct agt 432
Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser
130 135 140
gga ccc cga agg cgt ctg gga tgc gaa cgg gcc tgg aac cat agc gtc 480
Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val
145 150 155 160
agg gag gcc ggg gtc ccc ctg ggc ctg cca gcc ccg ggt gcg agg agg 528
Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg
165 170 175
cgc ggg ggc agt gcc agc cga agt ctg ccg ttg ccc aag agg ccc agg 576
Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg
180 185 190
cgt ggc gct gcc cct gag ccg gag cgg acg ccc gtt ggg cag ggg tcc 624
Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser
195 200 205
tgg gcc cac ccg ggc agg acg cgt gga ccg agt gac cgt ggt ttc tgt 672
Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys
210 215 220
gtg gtg tca cct gcc aga ccc gcc gaa gaa gcc acc tct ttg gag ggt 720
Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly
225 230 235 240
gcg ctc tct ggc acg cgc cac tcc cac cca tcc gtg ggc cgc cag cac 768
Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His
245 250 255
cac gcg ggc ccc cca tcc aca tcg cgg cca cca cgt ccc tgg gac acg 816
His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr
260 265 270
cct tgt ccc ccg gtg tac gcc gag acc aag cac ttc ctc tac tcc tca 864
Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser
275 280 285
ggc gac aag gag cag ctg cgg cca tcc ttc ctg ctg agc tct ctg agg 912
Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg
290 295 300
ccc agc ctg act ggc gct cgg agg ctc gtg gag acc atc ttt ctg ggt 960
Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly
305 310 315 320
tcc agg ccc tgg atg cca ggg act ccc cgc agg ttg ccc cgc ctg ccc 1008
Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro
325 330 335
cag cgc tac tgg caa atg cgg ccc ctg ttt ctg gag ctg ctt ggg aac 1056
Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn
340 345 350
cac gcg cag tgc ccc tac ggg gtg ctc ctc aag acg cac tgc ccg ctg 1104
His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu
355 360 365
cga gct gcg gtc acc cca gca gcc ggt gtc tgt gcc cgg gag aag ccc 1152
Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro
370 375 380
cag ggc tct gtg gcg gcc ccc gag gag gag gac aca gac ccc cgt cgc 1200
Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg
385 390 395 400
ctg gtg cag ctg ctc cgc cag cac agc agc ccc tgg cag gtg tac ggc 1248
Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly
405 410 415
ttc gtg cgg gcc tgc ctg cgc cgg ctg gtg ccc cca ggc ctc tgg ggc 1296
Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly
420 425 430
tcc agg cac aac gaa cgc cgc ttc ctc agg aac acc aag aag ttc atc 1344
Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile
435 440 445
tcc ctg ggg aag cat gcc aag ctc tcg ctg cag gag ctg acg tgg aag 1392
Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys
450 455 460
atg agc gtg cgg ggc tgc gct tgg ctg cgc agg agc cca ggg gtt ggc 1440
Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly
465 470 475 480
tgt gtt ccg gcc gca gag cac cgt ctg cgt gag gag atc ctg gcc aag 1488
Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys
485 490 495
ttc ctg cac tgg ctg atg agt gtg tac gtc gtc gag ctg ctc agg tca 1536
Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser
500 505 510
ttc ttt tac gtg acg gag acc acg ttt caa aag aac agg ctg ttt ttc 1584
Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe
515 520 525
tac cgg aag agt gtc tgg agc aag ttg caa agc att gga atc aga cag 1632
Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln
530 535 540
cac ttg aag agg gtg cag ctg cgg gag ctg tcg gaa gca gag gtc agg 1680
His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg
545 550 555 560
cag cat cgg gaa gcc agg ccc gcc ctg ctg acg tcc aga ctc cgc ttc 1728
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
565 570 575
atc ccc aag cct gac ggg ctg cgg ccg att gtg aac atg gac tac gtc 1776
Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val
580 585 590
gtg gga gcc aga acg ttc cgc aga gaa aag agg gcc gag cgt ctc acc 1824
Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr
595 600 605
tca cgg gtg aag gca ctg ttc agc gtg ctc aac tac gag cgg gct cgg 1872
Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg
610 615 620
cgc cct ggc ctc ctg ggc gcc tct gtg ctg ggc ctg gac gat atc cac 1920
Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His
625 630 635 640
agg gcc tgg cgc acc ttc gtg ctg cgt gtg cgg gcc cag gac ccg ccg 1968
Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro
645 650 655
cct gag ctg tac ttt gtc aag gtg gat gtg acg ggc gcg tac gac acc 2016
Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr
660 665 670
atc ccc cag gac agg ctc acg gag gtc atc gcc agc atc atc aaa ccc 2064
Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro
675 680 685
cag aac acg tac tgc gtg cgt cgg tat gcc gtg gtc cag aag gcc gcc 2112
Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala
690 695 700
cat ggg cac gtc cgc aag gcc ttc aag agc cac gtc tct acc ttg aca 2160
His Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr
705 710 715 720
gac ctc cag ccg tac atg cga cag ttc gtg gct cac ctg cag gag acc 2208
Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr
725 730 735
agc ccg ctg agg gat gcc gtc gtc atc gag cag agc tcc tcc ctg aat 2256
Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn
740 745 750
gag gcc agc agt ggc ctc ttc gac gtc ttc cta cgc ttc atg tgc cac 2304
Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His
755 760 765
cac gcc gtg cgc atc agg ggc aag tcc tac gtc cag tgc cag ggc atc 2352
His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile
770 775 780
ccg cag ggc tcc atc ctc tcc acg ctg ctc tgc agc ctg tgc tac ggc 2400
Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly
785 790 795 800
gac atg gag aac aag ctg ttt gcg ggg att cgg cgg gac ggg ctg ctc 2448
Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu
805 810 815
ctg cgt ttg ttc ttg ttg gtg aca cct cac ctc acc cac gcg aaa acc 2496
Leu Arg Leu Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala Lys Thr
820 825 830
ttc ctc agg acc ctg gtc cga ggt gtc cct gag tat ggc tgc gtg gtg 2544
Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val
835 840 845
aac ttg cgg aag aca gtg gtg aac ttc cct gta gaa gac gag gcc ctg 2592
Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala Leu
850 855 860
ggt ggc acg gct ttt gtt cag atg ccg gcc cac ggc cta ttc ccc tgg 2640
Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp
865 870 875 880
tgc ggc ctg ctg ctg gat acc cgg acc ctg gag gtg cag agc gac tac 2688
Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr
885 890 895
tcc agc tat gcc cgg acc tcc atc aga gcc agt ctc acc ttc aac cgc 2736
Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg
900 905 910
ggc ttc aag gct ggg agg aac atg cgt cgc aaa ctc ttt ggg gtc ttg 2784
Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu
915 920 925
cgg ctg aag tgt cac agc ctg ttt ctg gat ttg cag gtg aac agc ctc 2832
Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser Leu
930 935 940
cag acg gtg tgc acc aac atc tac aag atc ctc ctg ctg cag gcg tac 2880
Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala Tyr
945 950 955 960
agg ttt cac gca tgt gtg ctg cag ctc cca ttt cat cag caa gtt tgg 2928
Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val Trp
965 970 975
aag aac ccc aca ttt ttc ctg cgc gtc atc tct gac acg gcc tcc ctc 2976
Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala Ser Leu
980 985 990
tgc tac tcc atc ctg aaa gcc aag aac gca ggg atg tcg ctg ggg gcc 3024
Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu Gly Ala
995 1000 1005
aag ggc gcc gcc ggc cct ctg ccc tcc gag gcc gtg cag tgg ctg 3069
Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp Leu
1010 1015 1020
tgc cac caa gca ttc ctg ctc aag ctg act cga cac cgt gtc acc 3114
Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr
1025 1030 1035
tac gtg cca ctc ctg ggg tca ctc agg aca gcc cag acg cag ctg 3159
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu
1040 1045 1050
agt cgg aag ctc ccg ggg acg acg ctg act gcc ctg gag gcc gca 3204
Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala
1055 1060 1065
gcc aac ccg gca ctg ccc tca gac ttc aag acc atc ctg gac 3246
Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp
1070 1075 1080
<210> 4
<211> 1082
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg
1 5 10 15
Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu
20 25 30
Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn
35 40 45
Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro
50 55 60
Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val
65 70 75 80
Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg
85 90 95
Val Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe
100 105 110
Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu
115 120 125
Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser
130 135 140
Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val
145 150 155 160
Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg
180 185 190
Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser
195 200 205
Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys
210 215 220
Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly
225 230 235 240
Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His
245 250 255
His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr
260 265 270
Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser
275 280 285
Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg
290 295 300
Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly
305 310 315 320
Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro
325 330 335
Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn
340 345 350
His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu
355 360 365
Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro
370 375 380
Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg
385 390 395 400
Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly
405 410 415
Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly
420 425 430
Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile
435 440 445
Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys
450 455 460
Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly
465 470 475 480
Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys
485 490 495
Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser
500 505 510
Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe
515 520 525
Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln
530 535 540
His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg
545 550 555 560
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
565 570 575
Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val
580 585 590
Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr
595 600 605
Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg
610 615 620
Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His
625 630 635 640
Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro
645 650 655
Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr
660 665 670
Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro
675 680 685
Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala
690 695 700
His Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr
705 710 715 720
Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr
725 730 735
Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn
740 745 750
Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His
755 760 765
His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile
770 775 780
Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly
785 790 795 800
Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu
805 810 815
Leu Arg Leu Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala Lys Thr
820 825 830
Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val
835 840 845
Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala Leu
850 855 860
Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp
865 870 875 880
Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr
885 890 895
Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg
900 905 910
Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu
915 920 925
Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser Leu
930 935 940
Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala Tyr
945 950 955 960
Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val Trp
965 970 975
Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala Ser Leu
980 985 990
Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu Gly Ala
995 1000 1005
Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp Leu
1010 1015 1020
Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr
1025 1030 1035
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu
1040 1045 1050
Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala
1055 1060 1065
Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp
1070 1075 1080
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<211> 3297
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
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ctg gcc acc ttc gtg cgg cgc ctg gga ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg 48
Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val
1 5 10 15
cag cgc ggg gac cct gct gct ttc aga gct ctc gtc gcc cag tgt ctg 96
Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu
20 25 30
gtc tgc gtt cct tgg gac gca cgg ccc cca ccc gcc gcc ccc agt ttc 144
Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe
35 40 45
cgg cag gtg agt tgt ctc aaa gag ttg gtt gct cgg gtg ttg cag cgg 192
Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg
50 55 60
ctt tgt gaa agg gga gca aag aac gtc ctt gcc ttt ggc ttc gct ttg 240
Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu
65 70 75 80
ctc gat gga gca cgc gga ggc cct cct gag gca ttc act act agc gtc 288
Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val
85 90 95
cgg tcc tac ctg ccc aac aca gtg acc gac gct ctg aga ggt tca ggt 336
Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly
100 105 110
gcc tgg ggt ctg ctg ctg cgg agg gtg ggt gat gat gtt ctg gtt cac 384
Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His
115 120 125
ctc ctg gcc cgg tgt gcc ctg ttc gtg ctg gtg gct ccc tcc tgc gca 432
Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala
130 135 140
tac cag gtc tgc gga ccc cca ctt tat cag ctc ggc gct gct act cag 480
Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln
145 150 155 160
gcc cgc cca cca cca cac gcc tca ggt cca aga cgc cgg ctg ggc tgc 528
Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys
165 170 175
gaa cgg gca tgg aat cat agc gtg cgg gag gca ggt gtg cct ctc ggc 576
Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly
180 185 190
ctg cca gcc ccc gga gca agg aga cgc ggt gga tcc gcc agt cgc tca 624
Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser
195 200 205
ctc ccc ttg cct aag agg cca aga aga gga gcc gcc cct gaa ccc gag 672
Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu
210 215 220
aga aca cct gtc ggc cag ggc tcc tgg gct cac ccc gga agg acc agg 720
Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg
225 230 235 240
ggc cca agc gat agg ggc ttc tgt gtt gtg tca cca gcc agg cct gcc 768
Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala
245 250 255
gaa gag gct acc tcc ttg gaa gga gcc ctc agt ggc acc agg cat tct 816
Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser
260 265 270
cat cca tct gtg ggt agg cag cat cat gcc ggc ccc ccc tct aca agc 864
His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser
275 280 285
aga cct ccc aga cct tgg gac aca ccc tgc cca cca gtg tat gcc gag 912
Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu
290 295 300
acc aag cac ttt ttg tat tcc agt ggc gat aaa gag cag ctc cgg ccc 960
Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro
305 310 315 320
tct ttt ctg ctc tca agc ctc cgc ccc tct ctg acc gga gct cgc agg 1008
Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg
325 330 335
ctg gtg gag acc atc ttt ctg ggc tca aga cca tgg atg cca ggc acc 1056
Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr
340 345 350
ccc cgc aga ctg ccc agg ctc ccc cag cgg tac tgg cag atg cgc cct 1104
Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro
355 360 365
ctc ttt ctg gaa ctt ctg ggt aac cac gcc cag tgc cca tat ggc gtc 1152
Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val
370 375 380
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Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala
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gag gag gac act gac cct cgc cgc ctt gtc cag ttg ctc agg cag cat 1296
Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His
420 425 430
tca tca cca tgg cag gtg tac ggc ttc gtg agg gct tgc ctg cgg aga 1344
Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg
435 440 445
ctg gtc ccc ccc gga ttg tgg gga tct cgg cac aac gaa cgg cgc ttt 1392
Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe
450 455 460
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Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu
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agc ttg cag gag ctg aca tgg aag atg agc gtt aga gga tgc gca tgg 1488
Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp
485 490 495
ctc agg cgg tca cct gga gtt gga tgc gtt cca gca gca gag cac agg 1536
Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg
500 505 510
ctg cgc gaa gag att ctc gca aag ttc ctg cac tgg ctt atg agc gtc 1584
Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val
515 520 525
tac gtg gtc gaa ctg ctg cgg tct ttc ttc tac gtg aca gag acc act 1632
Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr
530 535 540
ttt cag aag aac aga ctg ttc ttc tac agg aag tcc gtc tgg agc aag 1680
Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys
545 550 555 560
ctc cag agt att ggt att aga cag cac ctt aag aga gtt cag ctt aga 1728
Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg
565 570 575
gag ctg tcc gaa gct gaa gtc cgc cag cac cgc gaa gct cgc ccc gcc 1776
Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala
580 585 590
ctc ctg acc tct cgg ctg cgg ttt att ccc aaa ccc gat ggc ctt aga 1824
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
595 600 605
cct atc gtg aat atg gat tac gtc gtg ggt gcc cgc act ttc aga agg 1872
Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg
610 615 620
gag aag cgc gcc gag aga ctg aca tct cgc gtg aag gca ctt ttt tct 1920
Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser
625 630 635 640
gtg ctt aat tat gaa aga gcc cgc aga cct ggt ctt ctc gga gcc agc 1968
Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser
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gtg ctc ggc ctg gat gat atc cat cgg gct tgg cgc acc ttt gtg ctt 2016
Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu
660 665 670
cgg gtg agg gca cag gat cct cct cct gag ctt tat ttt gtg aaa gtt 2064
Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val
675 680 685
gat gtt act ggt gct tac gat aca atc cct cag gac cgg ctc acc gag 2112
Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu
690 695 700
gtg atc gcc tct att atc aaa ccc cag aac acc tac tgc gtg aga agg 2160
Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg
705 710 715 720
tac gcc gtc gtt cag aaa gcc gca cac gga cac gtg cgc aaa gct ttc 2208
Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe
725 730 735
aaa tcc cac gtg tct acc ttg aca gac ctc cag cct tat atg cgg cag 2256
Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln
740 745 750
ttt gtc gca cac ctg cag gag act agc ccc ttg agg gac gct gtg gtc 2304
Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val
755 760 765
atc gaa cag tcc agc tct ctc aat gag gca tcc tca ggc ctg ttt gat 2352
Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp
770 775 780
gtg ttc ctg cgc ttt atg tgc cac cac gcc gtg cgg att agg ggc aag 2400
Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys
785 790 795 800
tct tac gtg cag tgc cag ggc atc cca cag ggt agc atc ctg agc aca 2448
Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr
805 810 815
ctg ctg tgt agc ctg tgc tat ggc gat atg gag aat aaa ttg ttc gcc 2496
Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala
820 825 830
ggt atc aga aga ttc ctg ctg gtt acc ccc cat ctg act cat gcc aaa 2544
Gly Ile Arg Arg Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala Lys
835 840 845
aca ttt ttg cgg act ctg gtt agg ggc gtg cca gag tat ggc tgt gtt 2592
Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val
850 855 860
gtg aat ttg cgg aaa act gtg gtt aat ttc cca gtg gag gac gaa gct 2640
Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala
865 870 875 880
ctc gga ggc aca gct ttt gtt cag atg cct gcc cac ggc ctg ttc cca 2688
Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro
885 890 895
tgg tgc gga ctg ctg ctc gat acc cgg acc ctc gag gtg cag tcc gat 2736
Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp
900 905 910
tat agt tcc tat gca aga aca tca att cgg gct agc ctg act ttc aac 2784
Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn
915 920 925
agg ggc ttc aag gcc ggc cgg aat atg aga agg aaa ctg ttc gga gtg 2832
Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val
930 935 940
ttg aga ctt aag tgt cat agt ctt ttt ttg gac ttg cag gtc aat tct 2880
Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser
945 950 955 960
ctc cag aca gtg tgt acc aac att tat aaa atc ctc ttg ctg cag gct 2928
Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala
965 970 975
tac aga ttc cat gcc tgc gtc ctg cag ctg cct ttc cac cag cag gtg 2976
Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val
980 985 990
tgg aaa aac cct acc ttc ttc ctg cgg gtg att agc gac acc gcc agt 3024
Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala Ser
995 1000 1005
ctt tgc tac tcc atc ttg aaa gca aaa aac gct ggc atg agc ttg 3069
Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu
1010 1015 1020
gga gct aag ggc gcc gct gga cct ctg ccc agt gaa gca gtc cag 3114
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln
1025 1030 1035
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Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg
1040 1045 1050
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Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr
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cag ctt tcc cgg aag ctt cca ggc act acc ctt acc gca ctc gaa 3249
Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu
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gca gcc gcc aac cct gcc ctg ccc tcc gac ttt aag act atc ctg 3294
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gac 3297
Asp
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<211> 1099
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe
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Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg
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Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu
65 70 75 80
Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val
85 90 95
Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly
100 105 110
Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His
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Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala
130 135 140
Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln
145 150 155 160
Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys
165 170 175
Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly
180 185 190
Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser
195 200 205
Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu
210 215 220
Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg
225 230 235 240
Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala
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Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser
260 265 270
His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser
275 280 285
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290 295 300
Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro
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Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg
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Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu
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435 440 445
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Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg
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Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
595 600 605
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Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser
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965 970 975
Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val
980 985 990
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ctc gat gga gca cgc gga ggc cct cct gag gca ttc act act agc gtc 288
Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val
85 90 95
cgg tcc tac ctg ccc aac aca gtg acc gac gct ctg aga ggt tca ggt 336
Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly
100 105 110
gcc tgg ggt ctg ctg ctg cgg agg gtg ggt gat gat gtt ctg gtt cac 384
Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His
115 120 125
ctc ctg gcc cgg tgt gcc ctg ttc gtg ctg gtg gct ccc tcc tgc gca 432
Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala
130 135 140
tac cag gtc tgc gga ccc cca ctt tat cag ctc ggc gct gct act cag 480
Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln
145 150 155 160
gcc cgc cca cca cca cac gcc tca ggt cca aga cgc cgg ctg ggc tgc 528
Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys
165 170 175
gaa cgg gca tgg aat cat agc gtg cgg gag gca ggt gtg cct ctc ggc 576
Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly
180 185 190
ctg cca gcc ccc gga gca agg aga cgc ggt gga tcc gcc agt cgc tca 624
Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser
195 200 205
ctc ccc ttg cct aag agg cca aga aga gga gcc gcc cct gaa ccc gag 672
Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu
210 215 220
aga aca cct gtc ggc cag ggc tcc tgg gct cac ccc gga agg acc agg 720
Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg
225 230 235 240
ggc cca agc gat agg ggc ttc tgt gtt gtg tca cca gcc agg cct gcc 768
Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala
245 250 255
gaa gag gct acc tcc ttg gaa gga gcc ctc agt ggc acc agg cat tct 816
Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser
260 265 270
cat cca tct gtg ggt agg cag cat cat gcc ggc ccc ccc tct aca agc 864
His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser
275 280 285
aga cct ccc aga cct tgg gac aca ccc tgc cca cca gtg tat gcc gag 912
Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu
290 295 300
acc aag cac ttt ttg tat tcc agt ggc gat aaa gag cag ctc cgg ccc 960
Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro
305 310 315 320
tct ttt ctg ctc tca agc ctc cgc ccc tct ctg acc gga gct cgc agg 1008
Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg
325 330 335
ctg gtg gag acc atc ttt ctg ggc tca aga cca tgg atg cca ggc acc 1056
Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr
340 345 350
ccc cgc aga ctg ccc agg ctc ccc cag cgg tac tgg cag atg cgc cct 1104
Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro
355 360 365
ctc ttt ctg gaa ctt ctg ggt aac cac gcc cag tgc cca tat ggc gtc 1152
Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val
370 375 380
ctg ctg aag acc cac tgt cct ctg agg gcc gcc gtg acc cca gcc gcc 1200
Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala
385 390 395 400
ggt gtg tgt gct aga gaa aaa ccc cag ggc tca gtg gct gca cct gaa 1248
Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu
405 410 415
gag gag gac act gac cct cgc cgc ctt gtc cag ttg ctc agg cag cat 1296
Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His
420 425 430
tca tca cca tgg cag gtg tac ggc ttc gtg agg gct tgc ctg cgg aga 1344
Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg
435 440 445
ctg gtc ccc ccc gga ttg tgg gga tct cgg cac aac gaa cgg cgc ttt 1392
Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe
450 455 460
ctg agg aat aca aag aag ttt atc tcc ctg ggc aag cat gca aag ctc 1440
Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu
465 470 475 480
agc ttg cag gag ctg aca tgg aag atg agc gtt aga gga tgc gca tgg 1488
Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp
485 490 495
ctc agg cgg tca cct gga gtt gga tgc gtt cca gca gca gag cac agg 1536
Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg
500 505 510
ctg cgc gaa gag att ctc gca aag ttc ctg cac tgg ctt atg agc gtc 1584
Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val
515 520 525
tac gtg gtc gaa ctg ctg cgg tct ttc ttc tac gtg aca gag acc act 1632
Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr
530 535 540
ttt cag aag aac aga ctg ttc ttc tac agg aag tcc gtc tgg agc aag 1680
Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys
545 550 555 560
ctc cag agt att ggt att aga cag cac ctt aag aga gtt cag ctt aga 1728
Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg
565 570 575
gag ctg tcc gaa gct gaa gtc cgc cag cac cgc gaa gct cgc ccc gcc 1776
Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala
580 585 590
ctc ctg acc tct cgg ctg cgg ttt att ccc aaa ccc gat ggc ctt aga 1824
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
595 600 605
cct atc gtg aat atg gat tac gtc gtg ggt gcc cgc act ttc aga agg 1872
Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg
610 615 620
gag aag cgc gcc gag aga ctg aca tct cgc gtg aag gca ctt ttt tct 1920
Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser
625 630 635 640
gtg ctt aat tat gaa aga gcc cgc aga cct ggt ctt ctc gga gcc agc 1968
Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser
645 650 655
gtg ctc ggc ctg gat gat atc cat cgg gct tgg cgc acc ttt gtg ctt 2016
Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu
660 665 670
cgg gtg agg gca cag gat cct cct cct gag ctt tat ttt gtg aaa gtt 2064
Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val
675 680 685
gat gtt act ggt gct tac gat aca atc cct cag gac cgg ctc acc gag 2112
Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu
690 695 700
gtg atc gcc tct att atc aaa ccc cag aac acc tac tgc gtg aga agg 2160
Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg
705 710 715 720
tac gcc gtc gtt cag aaa gcc gca cac gga cac gtg cgc aaa gct ttc 2208
Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe
725 730 735
aaa tcc cac gtg tct acc ttg aca gac ctc cag cct tat atg cgg cag 2256
Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln
740 745 750
ttt gtc gca cac ctg cag gag act agc ccc ttg agg gac gct gtg gtc 2304
Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val
755 760 765
atc gaa cag tcc agc tct ctc aat gag gca tcc tca ggc ctg ttt gat 2352
Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp
770 775 780
gtg ttc ctg cgc ttt atg tgc cac cac gcc gtg cgg att agg ggc aag 2400
Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys
785 790 795 800
tct tac gtg cag tgc cag ggc atc cca cag ggt agc atc ctg agc aca 2448
Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr
805 810 815
ctg ctg tgt agc ctg tgc tat ggc gat atg gag aat aaa ttg ttc gcc 2496
Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala
820 825 830
ggt atc aga aga gac ggt ttg ctc ctg agg ctg ctg act cat gcc aaa 2544
Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu Arg Leu Leu Thr His Ala Lys
835 840 845
aca ttt ttg cgg act ctg gtt agg ggc gtg cca gag tat ggc tgt gtt 2592
Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val
850 855 860
gtg aat ttg cgg aaa act gtg gtt aat ttc cca gtg gag gac gaa gct 2640
Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala
865 870 875 880
ctc gga ggc aca gct ttt gtt cag atg cct gcc cac ggc ctg ttc cca 2688
Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro
885 890 895
tgg tgc gga ctg ctg ctc gat acc cgg acc ctc gag gtg cag tcc gat 2736
Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp
900 905 910
tat agt tcc tat gca aga aca tca att cgg gct agc ctg act ttc aac 2784
Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn
915 920 925
agg ggc ttc aag gcc ggc cgg aat atg aga agg aaa ctg ttc gga gtg 2832
Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val
930 935 940
ttg aga ctt aag tgt cat agt ctt ttt ttg gac ttg cag gtc aat tct 2880
Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser
945 950 955 960
ctc cag aca gtg tgt acc aac att tat aaa atc ctc ttg ctg cag gct 2928
Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala
965 970 975
tac aga ttc cat gcc tgc gtc ctg cag ctg cct ttc cac cag cag gtg 2976
Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val
980 985 990
tgg aaa aac cct acc ttc ttc ctg cgg gtg att agc gac acc gcc agt 3024
Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala Ser
995 1000 1005
ctt tgc tac tcc atc ttg aaa gca aaa aac gct ggc atg agc ttg 3069
Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu
1010 1015 1020
gga gct aag ggc gcc gct gga cct ctg ccc agt gaa gca gtc cag 3114
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln
1025 1030 1035
tgg ctg tgt cat cag gct ttc ctc ctt aaa ctg aca cgc cac cgc 3159
Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg
1040 1045 1050
gtg act tac gtc cca ctc ctg ggc tcc ctg aga act gct cag acc 3204
Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr
1055 1060 1065
cag ctt tcc cgg aag ctt cca ggc act acc ctt acc gca ctc gaa 3249
Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu
1070 1075 1080
gca gcc gcc aac cct gcc ctg ccc tcc gac ttt aag act atc ctg 3294
Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu
1085 1090 1095
gac 3297
Asp
<210> 8
<211> 1099
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val
1 5 10 15
Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu
20 25 30
Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe
35 40 45
Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu
65 70 75 80
Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val
85 90 95
Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly
100 105 110
Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His
115 120 125
Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala
130 135 140
Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln
145 150 155 160
Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys
165 170 175
Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly
180 185 190
Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser
195 200 205
Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu
210 215 220
Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg
225 230 235 240
Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala
245 250 255
Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser
260 265 270
His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser
275 280 285
Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu
290 295 300
Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro
305 310 315 320
Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg
325 330 335
Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr
340 345 350
Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro
355 360 365
Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val
370 375 380
Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala
385 390 395 400
Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu
405 410 415
Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His
420 425 430
Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg
435 440 445
Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe
450 455 460
Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu
465 470 475 480
Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp
485 490 495
Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg
500 505 510
Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val
515 520 525
Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr
530 535 540
Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys
545 550 555 560
Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg
565 570 575
Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala
580 585 590
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
595 600 605
Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg
610 615 620
Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser
625 630 635 640
Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser
645 650 655
Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu
660 665 670
Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val
675 680 685
Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu
690 695 700
Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg
705 710 715 720
Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe
725 730 735
Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln
740 745 750
Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val
755 760 765
Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp
770 775 780
Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys
785 790 795 800
Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr
805 810 815
Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala
820 825 830
Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu Arg Leu Leu Thr His Ala Lys
835 840 845
Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val
850 855 860
Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala
865 870 875 880
Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro
885 890 895
Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp
900 905 910
Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn
915 920 925
Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val
930 935 940
Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser
945 950 955 960
Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala
965 970 975
Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val
980 985 990
Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala Ser
995 1000 1005
Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu
1010 1015 1020
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln
1025 1030 1035
Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg
1040 1045 1050
Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr
1055 1060 1065
Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu
1070 1075 1080
Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu
1085 1090 1095
Asp
<210> 9
<211> 3258
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3258)
<400> 9
ctg gcc acc ttc gtg cgg cgc ctg gga ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg 48
Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val
1 5 10 15
cag cgc ggg gac cct gct gct ttc aga gct ctc gtc gcc cag tgt ctg 96
Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu
20 25 30
gtc tgc gtt cct tgg gac gca cgg ccc cca ccc gcc gcc ccc agt ttc 144
Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe
35 40 45
cgg cag gtg agt tgt ctc aaa gag ttg gtt gct cgg gtg ttg cag cgg 192
Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg
50 55 60
ctt tgt gaa agg gga gca aag aac gtc ctt gcc ttt ggc ttc gct ttg 240
Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu
65 70 75 80
ctc gat gga gca cgc gga ggc cct cct gag gca ttc act act agc gtc 288
Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val
85 90 95
cgg tcc tac ctg ccc aac aca gtg acc gac gct ctg aga ggt tca ggt 336
Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly
100 105 110
gcc tgg ggt ctg ctg ctg cgg agg gtg ggt gat gat gtt ctg gtt cac 384
Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His
115 120 125
ctc ctg gcc cgg tgt gcc ctg ttc gtg ctg gtg gct ccc tcc tgc gca 432
Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala
130 135 140
tac cag gtc tgc gga ccc cca ctt tat cag ctc ggc gct gct act cag 480
Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln
145 150 155 160
gcc cgc cca cca cca cac gcc tca ggt cca aga cgc cgg ctg ggc tgc 528
Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys
165 170 175
gaa cgg gca tgg aat cat agc gtg cgg gag gca ggt gtg cct ctc ggc 576
Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly
180 185 190
ctg cca gcc ccc gga gca agg aga cgc ggt gga tcc gcc agt cgc tca 624
Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser
195 200 205
ctc ccc ttg cct aag agg cca aga aga gga gcc gcc cct gaa ccc gag 672
Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu
210 215 220
aga aca cct gtc ggc cag ggc tcc tgg gct cac ccc gga agg acc agg 720
Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg
225 230 235 240
ggc cca agc gat agg ggc ttc tgt gtt gtg tca cca gcc agg cct gcc 768
Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala
245 250 255
gaa gag gct acc tcc ttg gaa gga gcc ctc agt ggc acc agg cat tct 816
Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser
260 265 270
cat cca tct gtg ggt agg cag cat cat gcc ggc ccc ccc tct aca agc 864
His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser
275 280 285
aga cct ccc aga cct tgg gac aca ccc tgc cca cca gtg tat gcc gag 912
Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu
290 295 300
acc aag cac ttt ttg tat tcc agt ggc gat aaa gag cag ctc cgg ccc 960
Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro
305 310 315 320
tct ttt ctg ctc tca agc ctc cgc ccc tct ctg acc gga gct cgc agg 1008
Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg
325 330 335
ctg gtg gag acc atc ttt ctg ggc tca aga cca tgg atg cca ggc acc 1056
Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr
340 345 350
ccc cgc aga ctg ccc agg ctc ccc cag cgg tac tgg cag atg cgc cct 1104
Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro
355 360 365
ctc ttt ctg gaa ctt ctg ggt aac cac gcc cag tgc cca tat ggc gtc 1152
Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val
370 375 380
ctg ctg aag acc cac tgt cct ctg agg gcc gcc gtg acc cca gcc gcc 1200
Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala
385 390 395 400
ggt gtg tgt gct aga gaa aaa ccc cag ggc tca gtg gct gca cct gaa 1248
Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu
405 410 415
gag gag gac act gac cct cgc cgc ctt gtc cag ttg ctc agg cag cat 1296
Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His
420 425 430
tca tca cca tgg cag gtg tac ggc ttc gtg agg gct tgc ctg cgg aga 1344
Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg
435 440 445
ctg gtc ccc ccc gga ttg tgg gga tct cgg cac aac gaa cgg cgc ttt 1392
Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe
450 455 460
ctg agg aat aca aag aag ttt atc tcc ctg ggc aag cat gca aag ctc 1440
Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu
465 470 475 480
agc ttg cag gag ctg aca tgg aag atg agc gtt aga gga tgc gca tgg 1488
Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp
485 490 495
ctc agg cgg tca cct gga gtt gga tgc gtt cca gca gca gag cac agg 1536
Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg
500 505 510
ctg cgc gaa gag att ctc gca aag ttc ctg cac tgg ctt atg agc gtc 1584
Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val
515 520 525
tac gtg gtc gaa ctg ctg cgg tct ttc ttc tac gtg aca gag acc act 1632
Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr
530 535 540
ttt cag aag aac aga ctg ttc ttc tac agg aag tcc gtc tgg agc aag 1680
Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys
545 550 555 560
ctc cag agt att ggt att aga cag cac ctt aag aga gtt cag ctt aga 1728
Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg
565 570 575
gag ctg tcc gaa gct gaa gtc cgc cag cac cgc gaa gct cgc ccc gcc 1776
Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala
580 585 590
ctc ctg acc tct cgg ctg cgg ttt att ccc aaa ccc gat ggc ctt aga 1824
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
595 600 605
cct atc gtg aat atg gat tac gtc gtg ggt gcc cgc act ttc aga agg 1872
Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg
610 615 620
gag aag cgc gcc gag aga ctg aca tct cgc gtg aag gca ctt ttt tct 1920
Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser
625 630 635 640
gtg ctt aat tat gaa aga gcc cgc aga cct ggt ctt ctc gga gcc agc 1968
Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser
645 650 655
gtg ctc ggc ctg gat gat atc cat cgg gct tgg cgc acc ttt gtg ctt 2016
Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu
660 665 670
cgg gtg agg gca cag gat cct cct cct gag ctt tat ttt gtg aaa gtt 2064
Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val
675 680 685
gat gtt act ggt gct tac gat aca atc cct cag gac cgg ctc acc gag 2112
Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu
690 695 700
gtg atc gcc tct att atc aaa ccc cag aac acc tac tgc gtg aga agg 2160
Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg
705 710 715 720
tac gcc gtc gtt cag aaa gcc gca cac gga cac gtg cgc aaa gct ttc 2208
Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe
725 730 735
aaa tcc cac gtg tct acc ttg aca gac ctc cag cct tat atg cgg cag 2256
Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln
740 745 750
ttt gtc gca cac ctg cag gag act agc ccc ttg agg gac gct gtg gtc 2304
Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val
755 760 765
atc gaa cag tcc agc tct ctc aat gag gca tcc tca ggc ctg ttt gat 2352
Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp
770 775 780
gtg ttc ctg cgc ttt atg tgc cac cac gcc gtg cgg att agg ggc aag 2400
Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys
785 790 795 800
tct tac gtg cag tgc cag ggc atc cca cag ggt agc atc ctg agc aca 2448
Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr
805 810 815
ctg ctg tgt agc ctg tgc tat ggc gat atg gag aat aaa ttg ttc gcc 2496
Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala
820 825 830
ggt gcc aaa aca ttt ttg cgg act ctg gtt agg ggc gtg cca gag tat 2544
Gly Ala Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr
835 840 845
ggc tgt gtt gtg aat ttg cgg aaa act gtg gtt aat ttc cca gtg gag 2592
Gly Cys Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu
850 855 860
gac gaa gct ctc gga ggc aca gct ttt gtt cag atg cct gcc cac ggc 2640
Asp Glu Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly
865 870 875 880
ctg ttc cca tgg tgc gga ctg ctg ctc gat acc cgg acc ctc gag gtg 2688
Leu Phe Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val
885 890 895
cag tcc gat tat agt tcc tat gca aga aca tca att cgg gct agc ctg 2736
Gln Ser Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu
900 905 910
act ttc aac agg ggc ttc aag gcc ggc cgg aat atg aga agg aaa ctg 2784
Thr Phe Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu
915 920 925
ttc gga gtg ttg aga ctt aag tgt cat agt ctt ttt ttg gac ttg cag 2832
Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln
930 935 940
gtc aat tct ctc cag aca gtg tgt acc aac att tat aaa atc ctc ttg 2880
Val Asn Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu
945 950 955 960
ctg cag gct tac aga ttc cat gcc tgc gtc ctg cag ctg cct ttc cac 2928
Leu Gln Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His
965 970 975
cag cag gtg tgg aaa aac cct acc ttc ttc ctg cgg gtg att agc gac 2976
Gln Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
980 985 990
acc gcc agt ctt tgc tac tcc atc ttg aaa gca aaa aac gct ggc atg 3024
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met
995 1000 1005
agc ttg gga gct aag ggc gcc gct gga cct ctg ccc agt gaa gca 3069
Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala
1010 1015 1020
gtc cag tgg ctg tgt cat cag gct ttc ctc ctt aaa ctg aca cgc 3114
Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg
1025 1030 1035
cac cgc gtg act tac gtc cca ctc ctg ggc tcc ctg aga act gct 3159
His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala
1040 1045 1050
cag acc cag ctt tcc cgg aag ctt cca ggc act acc ctt acc gca 3204
Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala
1055 1060 1065
ctc gaa gca gcc gcc aac cct gcc ctg ccc tcc gac ttt aag act 3249
Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr
1070 1075 1080
atc ctg gac 3258
Ile Leu Asp
1085
<210> 10
<211> 1086
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val
1 5 10 15
Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu
20 25 30
Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe
35 40 45
Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu
65 70 75 80
Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val
85 90 95
Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly
100 105 110
Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His
115 120 125
Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala
130 135 140
Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln
145 150 155 160
Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys
165 170 175
Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly
180 185 190
Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser
195 200 205
Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu
210 215 220
Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg
225 230 235 240
Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala
245 250 255
Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser
260 265 270
His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser
275 280 285
Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu
290 295 300
Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro
305 310 315 320
Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg
325 330 335
Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr
340 345 350
Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro
355 360 365
Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val
370 375 380
Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala
385 390 395 400
Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu
405 410 415
Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His
420 425 430
Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg
435 440 445
Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe
450 455 460
Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu
465 470 475 480
Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp
485 490 495
Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg
500 505 510
Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val
515 520 525
Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr
530 535 540
Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys
545 550 555 560
Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg
565 570 575
Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala
580 585 590
Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg
595 600 605
Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg
610 615 620
Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser
625 630 635 640
Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser
645 650 655
Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu
660 665 670
Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val
675 680 685
Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu
690 695 700
Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg
705 710 715 720
Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe
725 730 735
Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln
740 745 750
Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val
755 760 765
Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp
770 775 780
Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys
785 790 795 800
Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr
805 810 815
Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala
820 825 830
Gly Ala Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr
835 840 845
Gly Cys Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu
850 855 860
Asp Glu Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly
865 870 875 880
Leu Phe Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val
885 890 895
Gln Ser Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu
900 905 910
Thr Phe Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu
915 920 925
Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln
930 935 940
Val Asn Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu
945 950 955 960
Leu Gln Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His
965 970 975
Gln Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
980 985 990
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met
995 1000 1005
Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala
1010 1015 1020
Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg
1025 1030 1035
His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala
1040 1045 1050
Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala
1055 1060 1065
Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr
1070 1075 1080
Ile Leu Asp
1085
<210> 11
<211> 7120
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> INVAC-1 plasmid expression vector
<220>
<221> CDS
<222> (3488)..(6961)
<400> 11
gctagcaccg ttggtttccg tagtgtagtg gttatcacgt tcgcctaaca cgcgaaaggt 60
ccccggttcg aaaccgggca ctacaaacca acaacgttaa aaaacaggtc ctccccatac 120
tctttcattg tacacaccgc aagctcgaca atcatcggat tgaagcattg tcgcacacat 180
cttccacaca ggatcagtac ctgctttcgc ttttaaccaa ggcttttctc caagggatat 240
ttatagtctc aaaacacaca attactttac agttagggtg agtttccttt tgtgctgttt 300
tttaaaataa taatttagta tttgtatctc ttatagaaat ccaagcctat catgtaaaat 360
gtagctagta ttaaaaagaa cagattatct gtcttttatc gcacattaag cctctatagt 420
tactaggaaa tattatatgc aaattaaccg gggcagggga gtagccgagc ttctcccaca 480
agtctgtgcg agggggccgg cgcgggccta gagatggcgg cgtcggatcg gccagcccgc 540
ctaatgagcg ggcttttttt tcttagggtg caaaaggaga gcctgtaagc gggcactctt 600
ccgtggtctg gtggataaat tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgggg ttcgagcccc 660
gtatccggcc gtccgccgtg atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac ccaggtgtgc 720
gacgtcagac aacgggggag tgctcctttt ggcttccttc ccctaccggt ctgcctcgcg 780
cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 840
tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc 900
gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta 960
actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc 1020
acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 1080
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 1140
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 1200
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 1260
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 1320
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 1380
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 1440
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 1500
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 1560
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 1620
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 1680
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 1740
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 1800
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 1860
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 1920
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 1980
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 2040
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc tgcaaaccac gttgtggtag aattggtaaa 2100
gagagtcgtg taaaatatcg agttcgcaca tcttgttgtc tgattattga tttttggcga 2160
aaccatttga tcatatgaca agatgtgtat ctaccttaac ttaatgattt tgataaaaat 2220
cattaggtac ccctgatcac tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg 2280
ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg 2340
aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc 2400
aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttacggggt 2460
cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 2520
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 2580
taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 2640
acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 2700
gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 2760
agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 2820
atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 2880
atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 2940
ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 3000
gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 3060
gacaccggga ccgatccagc ctccgcggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct 3120
acctgaggcc gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc 3180
tcctgaactg cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt 3240
ccggcgctcc cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg 3300
cttgctcaac tctagttctc tcgttaactt aatgagacag atagaaactg gtcttgtaga 3360
aacagagtag tcgcctgctt ttctgccagg tgctgacttc tctcccctgg gcttttttct 3420
ttttctcagg ttgaaaagaa gaagacgaag aagacgaaga agacaaaccg tcgtcgacaa 3480
gcttacc atg cag atc ttc gtg aag acc ctg acc ggc aag acc atc act 3529
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr
1 5 10
ctc gag gtg gag ccc agt gac acc atc gaa aat gtg aag gcc aag atc 3577
Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile
15 20 25 30
caa gat aaa gaa ggc atc cca ccc gac cag cag agg ctc atc ttt gct 3625
Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala
35 40 45
ggc aag cag ctg gaa gat ggc cgc act ctg tct gac tac aac atc cag 3673
Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln
50 55 60
aaa gag tcg acc ctg cac ctg gtc ctg cgt ctg aga ggc ggc cgc gct 3721
Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Arg Ala
65 70 75
ctg gtg gcc cag tgc ctg gtg tgc gtg ccc tgg gac gca cgg cca ccc 3769
Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro
80 85 90
cct gcc gca ccc tca ttc cgc caa gtg tcc tgc ctg aag gag ctg gtg 3817
Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val
95 100 105 110
gcc cga gtg ctg cag agg ctg tgc gag cgc ggc gcg aag aac gtg ctg 3865
Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu
115 120 125
gcc ttc ggc ttc gcg ctg ctg gac ggg gct cgc gga ggc cca ccc gag 3913
Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro Glu
130 135 140
gcc ttc acc acc agc gtg cgc agc tac ctg ccc aac acg gtg acc gac 3961
Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp
145 150 155
gca ctg cgg ggg agc ggg gcg tgg ggg ctg ctg ttg cgc cgc gtg ggc 4009
Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly
160 165 170
gac gac gtg ctg gtt cac ctg ctg gca cgc tgc gcg ctc ttt gtg ctg 4057
Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu
175 180 185 190
gtg gct ccc agc tgc gcc tac cag gtg tgc ggg ccg ccg ctg tac cag 4105
Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln
195 200 205
ctc ggc gct gcc act cag gca cgg cct cca cct cac gct agt gga ccc 4153
Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly Pro
210 215 220
cga agg cgt ctg gga tgc gaa cgg gcc tgg aac cat agc gtc agg gag 4201
Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg Glu
225 230 235
gcc ggg gtc ccc ctg ggc ctg cca gcc ccg ggt gcg agg agg cgc ggg 4249
Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly
240 245 250
ggc agt gcc agc cga agt ctg ccg ttg ccc aag agg ccc agg cgt ggc 4297
Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly
255 260 265 270
gct gcc cct gag ccg gag cgg acg ccc gtt ggg cag ggg tcc tgg gcc 4345
Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp Ala
275 280 285
cac ccg ggc agg acg cgt gga ccg agt gac cgt ggt ttc tgt gtg gtg 4393
His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val Val
290 295 300
tca cct gcc aga ccc gcc gaa gaa gcc acc tct ttg gag ggt gcg ctc 4441
Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala Leu
305 310 315
tct ggc acg cgc cac tcc cac cca tcc gtg ggc cgc cag cac cac gcg 4489
Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His Ala
320 325 330
ggc ccc cca tcc aca tcg cgg cca cca cgt ccc tgg gac acg cct tgt 4537
Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro Cys
335 340 345 350
ccc ccg gtg tac gcc gag acc aag cac ttc ctc tac tcc tca ggc gac 4585
Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp
355 360 365
aag gag cag ctg cgg cca tcc ttc ctg ctg agc tct ctg agg ccc agc 4633
Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser
370 375 380
ctg act ggc gct cgg agg ctc gtg gag acc atc ttt ctg ggt tcc agg 4681
Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg
385 390 395
ccc tgg atg cca ggg act ccc cgc agg ttg ccc cgc ctg ccc cag cgc 4729
Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg
400 405 410
tac tgg caa atg cgg ccc ctg ttt ctg gag ctg ctt ggg aac cac gcg 4777
Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala
415 420 425 430
cag tgc ccc tac ggg gtg ctc ctc aag acg cac tgc ccg ctg cga gct 4825
Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg Ala
435 440 445
gcg gtc acc cca gca gcc ggt gtc tgt gcc cgg gag aag ccc cag ggc 4873
Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln Gly
450 455 460
tct gtg gcg gcc ccc gag gag gag gac aca gac ccc cgt cgc ctg gtg 4921
Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu Val
465 470 475
cag ctg ctc cgc cag cac agc agc ccc tgg cag gtg tac ggc ttc gtg 4969
Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe Val
480 485 490
cgg gcc tgc ctg cgc cgg ctg gtg ccc cca ggc ctc tgg ggc tcc agg 5017
Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser Arg
495 500 505 510
cac aac gaa cgc cgc ttc ctc agg aac acc aag aag ttc atc tcc ctg 5065
His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser Leu
515 520 525
ggg aag cat gcc aag ctc tcg ctg cag gag ctg acg tgg aag atg agc 5113
Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met Ser
530 535 540
gtg cgg ggc tgc gct tgg ctg cgc agg agc cca ggg gtt ggc tgt gtt 5161
Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys Val
545 550 555
ccg gcc gca gag cac cgt ctg cgt gag gag atc ctg gcc aag ttc ctg 5209
Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu
560 565 570
cac tgg ctg atg agt gtg tac gtc gtc gag ctg ctc agg tca ttc ttt 5257
His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe
575 580 585 590
tac gtg acg gag acc acg ttt caa aag aac agg ctg ttt ttc tac cgg 5305
Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr Arg
595 600 605
aag agt gtc tgg agc aag ttg caa agc att gga atc aga cag cac ttg 5353
Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His Leu
610 615 620
aag agg gtg cag ctg cgg gag ctg tcg gaa gca gag gtc agg cag cat 5401
Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His
625 630 635
cgg gaa gcc agg ccc gcc ctg ctg acg tcc aga ctc cgc ttc atc ccc 5449
Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro
640 645 650
aag cct gac ggg ctg cgg ccg att gtg aac atg gac tac gtc gtg gga 5497
Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly
655 660 665 670
gcc aga acg ttc cgc aga gaa aag agg gcc gag cgt ctc acc tca cgg 5545
Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg
675 680 685
gtg aag gca ctg ttc agc gtg ctc aac tac gag cgg gct cgg cgc cct 5593
Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro
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Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala
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tgg cgc acc ttc gtg ctg cgt gtg cgg gcc cag gac ccg ccg cct gag 5689
Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu
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ctg tac ttt gtc aag gtg gat gtg acg ggc gcg tac gac acc atc ccc 5737
Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro
735 740 745 750
cag gac agg ctc acg gag gtc atc gcc agc atc atc aaa ccc cag aac 5785
Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln Asn
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acg tac tgc gtg cgt cgg tat gcc gtg gtc cag aag gcc gcc cat ggg 5833
Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His Gly
770 775 780
cac gtc cgc aag gcc ttc aag agc cac gtc tct acc ttg aca gac ctc 5881
His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp Leu
785 790 795
cag ccg tac atg cga cag ttc gtg gct cac ctg cag gag acc agc ccg 5929
Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser Pro
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Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu Ala
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agc agt ggc ctc ttc gac gtc ttc cta cgc ttc atg tgc cac cac gcc 6025
Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His Ala
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Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met
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Leu Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala Lys Thr Phe Leu
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Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val Asn Leu
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Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala Leu Gly Gly
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Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr Ser Ser
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Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg Gly Phe
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Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu
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Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln
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Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala Tyr
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Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val
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Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala
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Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser
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ctg ggg gcc aag ggc gcc gcc ggc cct ctg ccc tcc gag gcc gtg 6775
Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val
1085 1090 1095
cag tgg ctg tgc cac caa gca ttc ctg ctc aag ctg act cga cac 6820
Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His
1100 1105 1110
cgt gtc acc tac gtg cca ctc ctg ggg tca ctc agg aca gcc cag 6865
Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln
1115 1120 1125
acg cag ctg agt cgg aag ctc ccg ggg acg acg ctg act gcc ctg 6910
Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu
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gag gcc gca gcc aac ccg gca ctg ccc tca gac ttc aag acc atc 6955
Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile
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Leu Asp
tgaagcccct tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc attgcaatag 7071
tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata agggcggcc 7120
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<220>
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275 280 285
Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro
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Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro
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Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr
370 375 380
Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp
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435 440 445
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg
530 535 540
Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala
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595 600 605
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Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His Gly His Val
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Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn
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885 890 895
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Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val Asn Leu Arg Lys
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<223> pUTD10Not insert sequence
<220>
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<222> (1)..(3570)
<400> 13
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1 5 10 15
gtg gag cca agc gac act att gag aac gtc aaa gcc aag att cag gac 96
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aag gag ggc atc cca cca gac cag cag agg ctg att ttt gcc gga aag 144
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
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cag ctg gag gac gga cgc aca ctc agt gac tac aat atc cag aag gaa 192
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
agt act ctg cat ctg gtc ctt cgc ctg cgc ggc gga ctg gcc acc ttc 240
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Leu Ala Thr Phe
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gtg cgg cgc ctg gga ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg cag cgc ggg gac 288
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85 90 95
cct gct gct ttc aga gct ctc gtc gcc cag tgt ctg gtc tgc gtt cct 336
Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro
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tgg gac gca cgg ccc cca ccc gcc gcc ccc agt ttc cgg cag gtg agt 384
Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser
115 120 125
tgt ctc aaa gag ttg gtt gct cgg gtg ttg cag cgg ctt tgt gaa agg 432
Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg
130 135 140
gga gca aag aac gtc ctt gcc ttt ggc ttc gct ttg ctc gat gga gca 480
Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala
145 150 155 160
cgc gga ggc cct cct gag gca ttc act act agc gtc cgg tcc tac ctg 528
Arg Gly Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu
165 170 175
ccc aac aca gtg acc gac gct ctg aga ggt tca ggt gcc tgg ggt ctg 576
Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu
180 185 190
ctg ctg cgg agg gtg ggt gat gat gtt ctg gtt cac ctc ctg gcc cgg 624
Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg
195 200 205
tgt gcc ctg ttc gtg ctg gtg gct ccc tcc tgc gca tac cag gtc tgc 672
Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys
210 215 220
gga ccc cca ctt tat cag ctc ggc gct gct act cag gcc cgc cca cca 720
Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro
225 230 235 240
cca cac gcc tca ggt cca aga cgc cgg ctg ggc tgc gaa cgg gca tgg 768
Pro His Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp
245 250 255
aat cat agc gtg cgg gag gca ggt gtg cct ctc ggc ctg cca gcc ccc 816
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gga gca agg aga cgc ggt gga tcc gcc agt cgc tca ctc ccc ttg cct 864
Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro
275 280 285
aag agg cca aga aga gga gcc gcc cct gaa ccc gag aga aca cct gtc 912
Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val
290 295 300
ggc cag ggc tcc tgg gct cac ccc gga agg acc agg ggc cca agc gat 960
Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp
305 310 315 320
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Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr
325 330 335
tcc ttg gaa gga gcc ctc agt ggc acc agg cat tct cat cca tct gtg 1056
Ser Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val
340 345 350
ggt agg cag cat cat gcc ggc ccc ccc tct aca agc aga cct ccc aga 1104
Gly Arg Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg
355 360 365
cct tgg gac aca ccc tgc cca cca gtg tat gcc gag acc aag cac ttt 1152
Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe
370 375 380
ttg tat tcc agt ggc gat aaa gag cag ctc cgg ccc tct ttt ctg ctc 1200
Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu
385 390 395 400
tca agc ctc cgc ccc tct ctg acc gga gct cgc agg ctg gtg gag acc 1248
Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr
405 410 415
atc ttt ctg ggc tca aga cca tgg atg cca ggc acc ccc cgc aga ctg 1296
Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu
420 425 430
ccc agg ctc ccc cag cgg tac tgg cag atg cgc cct ctc ttt ctg gaa 1344
Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu
435 440 445
ctt ctg ggt aac cac gcc cag tgc cca tat ggc gtc ctg ctg aag acc 1392
Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr
450 455 460
cac tgt cct ctg agg gcc gcc gtg acc cca gcc gcc ggt gtg tgt gct 1440
His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala
465 470 475 480
aga gaa aaa ccc cag ggc tca gtg gct gca cct gaa gag gag gac act 1488
Arg Glu Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr
485 490 495
gac cct cgc cgc ctt gtc cag ttg ctc agg cag cat tca tca cca tgg 1536
Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp
500 505 510
cag gtg tac ggc ttc gtg agg gct tgc ctg cgg aga ctg gtc ccc ccc 1584
Gln Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro
515 520 525
gga ttg tgg gga tct cgg cac aac gaa cgg cgc ttt ctg agg aat aca 1632
Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr
530 535 540
aag aag ttt atc tcc ctg ggc aag cat gca aag ctc agc ttg cag gag 1680
Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu
545 550 555 560
ctg aca tgg aag atg agc gtt aga gga tgc gca tgg ctc agg cgg tca 1728
Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser
565 570 575
cct gga gtt gga tgc gtt cca gca gca gag cac agg ctg cgc gaa gag 1776
Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu
580 585 590
att ctc gca aag ttc ctg cac tgg ctt atg agc gtc tac gtg gtc gaa 1824
Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu
595 600 605
ctg ctg cgg tct ttc ttc tac gtg aca gag acc act ttt cag aag aac 1872
Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn
610 615 620
aga ctg ttc ttc tac agg aag tcc gtc tgg agc aag ctc cag agt att 1920
Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile
625 630 635 640
ggt att aga cag cac ctt aag aga gtt cag ctt aga gag ctg tcc gaa 1968
Gly Ile Arg Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu
645 650 655
gct gaa gtc cgc cag cac cgc gaa gct cgc ccc gcc ctc ctg acc tct 2016
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
660 665 670
cgg ctg cgg ttt att ccc aaa ccc gat ggc ctt aga cct atc gtg aat 2064
Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn
675 680 685
atg gat tac gtc gtg ggt gcc cgc act ttc aga agg gag aag cgc gcc 2112
Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala
690 695 700
gag aga ctg aca tct cgc gtg aag gca ctt ttt tct gtg ctt aat tat 2160
Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr
705 710 715 720
gaa aga gcc cgc aga cct ggt ctt ctc gga gcc agc gtg ctc ggc ctg 2208
Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
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gat gat atc cat cgg gct tgg cgc acc ttt gtg ctt cgg gtg agg gca 2256
Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala
740 745 750
cag gat cct cct cct gag ctt tat ttt gtg aaa gtt gat gtt act ggt 2304
Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly
755 760 765
gct tac gat aca atc cct cag gac cgg ctc acc gag gtg atc gcc tct 2352
Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser
770 775 780
att atc aaa ccc cag aac acc tac tgc gtg aga agg tac gcc gtc gtt 2400
Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val
785 790 795 800
cag aaa gcc gca cac gga cac gtg cgc aaa gct ttc aaa tcc cac gtg 2448
Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val
805 810 815
tct acc ttg aca gac ctc cag cct tat atg cgg cag ttt gtc gca cac 2496
Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His
820 825 830
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Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser
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agc tct ctc aat gag gca tcc tca ggc ctg ttt gat gtg ttc ctg cgc 2592
Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg
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ttt atg tgc cac cac gcc gtg cgg att agg ggc aag tct tac gtg cag 2640
Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln
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Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser
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ctg tgc tat ggc gat atg gag aat aaa ttg ttc gcc ggt atc aga aga 2736
Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg
900 905 910
ttc ctg ctg gtt acc ccc cat ctg act cat gcc aaa aca ttt ttg cgg 2784
Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala Lys Thr Phe Leu Arg
915 920 925
act ctg gtt agg ggc gtg cca gag tat ggc tgt gtt gtg aat ttg cgg 2832
Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val Asn Leu Arg
930 935 940
aaa act gtg gtt aat ttc cca gtg gag gac gaa gct ctc gga ggc aca 2880
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gct ttt gtt cag atg cct gcc cac ggc ctg ttc cca tgg tgc gga ctg 2928
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ctg ctc gat acc cgg acc ctc gag gtg cag tcc gat tat agt tcc tat 2976
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Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg Gly Phe Lys
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Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu
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Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala Tyr
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aga ttc cat gcc tgc gtc ctg cag ctg cct ttc cac cag cag gtg 3204
Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val
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cag tgg ctg tgt cat cag gct ttc ctc ctt aaa ctg aca cgc cac 3384
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260 265 270
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275 280 285
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Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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660 665 670
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755 760 765
Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser
770 775 780
Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser
835 840 845
Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg
850 855 860
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885 890 895
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1085 1090 1095
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1130 1135 1140
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Thr
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50 55 60
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Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Leu Ala Thr Phe
65 70 75 80
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85 90 95
cct gct gct ttc aga gct ctc gtc gcc cag tgt ctg gtc tgc gtt cct 336
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100 105 110
tgg gac gca cgg ccc cca ccc gcc gcc ccc agt ttc cgg cag gtg agt 384
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115 120 125
tgt ctc aaa gag ttg gtt gct cgg gtg ttg cag cgg ctt tgt gaa agg 432
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130 135 140
gga gca aag aac gtc ctt gcc ttt ggc ttc gct ttg ctc gat gga gca 480
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145 150 155 160
cgc gga ggc cct cct gag gca ttc act act agc gtc cgg tcc tac ctg 528
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165 170 175
ccc aac aca gtg acc gac gct ctg aga ggt tca ggt gcc tgg ggt ctg 576
Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu
180 185 190
ctg ctg cgg agg gtg ggt gat gat gtt ctg gtt cac ctc ctg gcc cgg 624
Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg
195 200 205
tgt gcc ctg ttc gtg ctg gtg gct ccc tcc tgc gca tac cag gtc tgc 672
Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys
210 215 220
gga ccc cca ctt tat cag ctc ggc gct gct act cag gcc cgc cca cca 720
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225 230 235 240
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245 250 255
aat cat agc gtg cgg gag gca ggt gtg cct ctc ggc ctg cca gcc ccc 816
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260 265 270
gga gca agg aga cgc ggt gga tcc gcc agt cgc tca ctc ccc ttg cct 864
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275 280 285
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290 295 300
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Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu
435 440 445
ctt ctg ggt aac cac gcc cag tgc cca tat ggc gtc ctg ctg aag acc 1392
Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr
450 455 460
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Arg Glu Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr
485 490 495
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Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp
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Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr
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Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu
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ctg aca tgg aag atg agc gtt aga gga tgc gca tgg ctc agg cgg tca 1728
Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser
565 570 575
cct gga gtt gga tgc gtt cca gca gca gag cac agg ctg cgc gaa gag 1776
Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu
580 585 590
att ctc gca aag ttc ctg cac tgg ctt atg agc gtc tac gtg gtc gaa 1824
Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu
595 600 605
ctg ctg cgg tct ttc ttc tac gtg aca gag acc act ttt cag aag aac 1872
Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn
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aga ctg ttc ttc tac agg aag tcc gtc tgg agc aag ctc cag agt att 1920
Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile
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gct gaa gtc cgc cag cac cgc gaa gct cgc ccc gcc ctc ctg acc tct 2016
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
660 665 670
cgg ctg cgg ttt att ccc aaa ccc gat ggc ctt aga cct atc gtg aat 2064
Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn
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atg gat tac gtc gtg ggt gcc cgc act ttc aga agg gag aag cgc gcc 2112
Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala
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Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr
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gaa aga gcc cgc aga cct ggt ctt ctc gga gcc agc gtg ctc ggc ctg 2208
Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
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Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala
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cag gat cct cct cct gag ctt tat ttt gtg aaa gtt gat gtt act ggt 2304
Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly
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gct tac gat aca atc cct cag gac cgg ctc acc gag gtg atc gcc tct 2352
Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser
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att atc aaa ccc cag aac acc tac tgc gtg aga agg tac gcc gtc gtt 2400
Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val
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Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln
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Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg
900 905 910
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aaa act gtg gtt aat ttc cca gtg gag gac gaa gct ctc gga ggc aca 2880
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gct ttt gtt cag atg cct gcc cac ggc ctg ttc cca tgg tgc gga ctg 2928
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ctg ctc gat acc cgg acc ctc gag gtg cag tcc gat tat agt tcc tat 2976
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245 250 255
aat cat agc gtg cgg gag gca ggt gtg cct ctc ggc ctg cca gcc ccc 816
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260 265 270
gga gca agg aga cgc ggt gga tcc gcc agt cgc tca ctc ccc ttg cct 864
Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro
275 280 285
aag agg cca aga aga gga gcc gcc cct gaa ccc gag aga aca cct gtc 912
Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val
290 295 300
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Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu
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Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu
435 440 445
ctt ctg ggt aac cac gcc cag tgc cca tat ggc gtc ctg ctg aag acc 1392
Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr
450 455 460
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aga gaa aaa ccc cag ggc tca gtg gct gca cct gaa gag gag gac act 1488
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr
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Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu
545 550 555 560
ctg aca tgg aag atg agc gtt aga gga tgc gca tgg ctc agg cgg tca 1728
Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser
565 570 575
cct gga gtt gga tgc gtt cca gca gca gag cac agg ctg cgc gaa gag 1776
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Gly Ile Arg Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu
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gct gaa gtc cgc cag cac cgc gaa gct cgc ccc gcc ctc ctg acc tct 2016
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
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cgg ctg cgg ttt att ccc aaa ccc gat ggc ctt aga cct atc gtg aat 2064
Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn
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atg gat tac gtc gtg ggt gcc cgc act ttc aga agg gag aag cgc gcc 2112
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Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr
705 710 715 720
gaa aga gcc cgc aga cct ggt ctt ctc gga gcc agc gtg ctc ggc ctg 2208
Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
725 730 735
gat gat atc cat cgg gct tgg cgc acc ttt gtg ctt cgg gtg agg gca 2256
Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala
740 745 750
cag gat cct cct cct gag ctt tat ttt gtg aaa gtt gat gtt act ggt 2304
Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly
755 760 765
gct tac gat aca atc cct cag gac cgg ctc acc gag gtg atc gcc tct 2352
Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser
770 775 780
att atc aaa ccc cag aac acc tac tgc gtg aga agg tac gcc gtc gtt 2400
Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val
785 790 795 800
cag aaa gcc gca cac gga cac gtg cgc aaa gct ttc aaa tcc cac gtg 2448
Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val
805 810 815
tct acc ttg aca gac ctc cag cct tat atg cgg cag ttt gtc gca cac 2496
Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His
820 825 830
ctg cag gag act agc ccc ttg agg gac gct gtg gtc atc gaa cag tcc 2544
Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser
835 840 845
agc tct ctc aat gag gca tcc tca ggc ctg ttt gat gtg ttc ctg cgc 2592
Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg
850 855 860
ttt atg tgc cac cac gcc gtg cgg att agg ggc aag tct tac gtg cag 2640
Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln
865 870 875 880
tgc cag ggc atc cca cag ggt agc atc ctg agc aca ctg ctg tgt agc 2688
Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser
885 890 895
ctg tgc tat ggc gat atg gag aat aaa ttg ttc gcc ggt gcc aaa aca 2736
Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ala Lys Thr
900 905 910
ttt ttg cgg act ctg gtt agg ggc gtg cca gag tat ggc tgt gtt gtg 2784
Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val
915 920 925
aat ttg cgg aaa act gtg gtt aat ttc cca gtg gag gac gaa gct ctc 2832
Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala Leu
930 935 940
gga ggc aca gct ttt gtt cag atg cct gcc cac ggc ctg ttc cca tgg 2880
Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp
945 950 955 960
tgc gga ctg ctg ctc gat acc cgg acc ctc gag gtg cag tcc gat tat 2928
Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr
965 970 975
agt tcc tat gca aga aca tca att cgg gct agc ctg act ttc aac agg 2976
Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg
980 985 990
ggc ttc aag gcc ggc cgg aat atg aga agg aaa ctg ttc gga gtg ttg 3024
Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu
995 1000 1005
aga ctt aag tgt cat agt ctt ttt ttg gac ttg cag gtc aat tct 3069
Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser
1010 1015 1020
ctc cag aca gtg tgt acc aac att tat aaa atc ctc ttg ctg cag 3114
Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
1025 1030 1035
gct tac aga ttc cat gcc tgc gtc ctg cag ctg cct ttc cac cag 3159
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln
1040 1045 1050
cag gtg tgg aaa aac cct acc ttc ttc ctg cgg gtg att agc gac 3204
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
1055 1060 1065
acc gcc agt ctt tgc tac tcc atc ttg aaa gca aaa aac gct ggc 3249
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1070 1075 1080
atg agc ttg gga gct aag ggc gcc gct gga cct ctg ccc agt gaa 3294
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
1085 1090 1095
gca gtc cag tgg ctg tgt cat cag gct ttc ctc ctt aaa ctg aca 3339
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1100 1105 1110
cgc cac cgc gtg act tac gtc cca ctc ctg ggc tcc ctg aga act 3384
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
1115 1120 1125
gct cag acc cag ctt tcc cgg aag ctt cca ggc act acc ctt acc 3429
Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1130 1135 1140
gca ctc gaa gca gcc gcc aac cct gcc ctg ccc tcc gac ttt aag 3474
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1145 1150 1155
act atc ctg gac ggc aag cca att cct aat cca ttg ctg ggc ctg 3519
Thr Ile Leu Asp Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1160 1165 1170
gac tca act tga 3531
Asp Ser Thr
1175
<210> 18
<211> 1176
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 18
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
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Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
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Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Leu Ala Thr Phe
65 70 75 80
Val Arg Arg Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp
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Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala
145 150 155 160
Arg Gly Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu
165 170 175
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180 185 190
Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg
195 200 205
Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys
210 215 220
Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro
225 230 235 240
Pro His Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp
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Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro
260 265 270
Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro
275 280 285
Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val
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Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp
305 310 315 320
Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr
325 330 335
Ser Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val
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Gly Arg Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg
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Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe
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Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu
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Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr
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420 425 430
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp
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Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser
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Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile
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Gly Ile Arg Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu
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Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala
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Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr
705 710 715 720
Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
725 730 735
Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala
740 745 750
Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly
755 760 765
Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser
770 775 780
Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val
785 790 795 800
Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val
805 810 815
Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His
820 825 830
Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser
835 840 845
Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg
850 855 860
Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln
865 870 875 880
Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser
885 890 895
Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ala Lys Thr
900 905 910
Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val
915 920 925
Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala Leu
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Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr
965 970 975
Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg
980 985 990
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Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1070 1075 1080
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
1085 1090 1095
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1100 1105 1110
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
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Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1130 1135 1140
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1145 1150 1155
Thr Ile Leu Asp Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1160 1165 1170
Asp Ser Thr
1175
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Asp Gly Leu Leu Leu Arg Leu
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Phe Leu Leu Val Thr Pro His
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Asp Gly Leu Leu Leu Arg Leu Val Asp Asp
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<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> restriction site
<400> 23
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<210> 24
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<223> primer
<400> 24
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<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 25
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<211> 23
<212> PRT
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Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu
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Val Thr Pro His Leu Thr His
20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 27
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<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 28
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<210> 29
<211> 10
<212> PRT
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<400> 29
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<212> PRT
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Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu
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<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu
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<211> 9
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Tyr Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val
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<211> 10
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<213> Homo sapiens
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Tyr Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu
1 5
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
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<400> 42
Gln Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu
1 5 10
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Gln Thr Val Cys Thr Ile Asn Ile Tyr Lys Ile
1 5 10
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 44
ggcaagtcct acgtccagtg 20
<210> 45
<211> 3591
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ubi-hTERT fusion optimized sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3591)
<400> 45
atg cag att ttc gtc aaa aca ttg aca gga aag acc atc aca ctg gaa 48
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
gtg gag cca agc gac act att gag aac gtc aaa gcc aag att cag gac 96
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
aag gag ggc atc cca cca gac cag cag agg ctg att ttt gcc gga aag 144
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
cag ctg gag gac gga cgc aca ctc agt gac tac aat atc cag aag gaa 192
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
agt act ctg cat ctg gtc ctt cgc ctg cgc ggc gga ctg gcc acc ttc 240
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Leu Ala Thr Phe
65 70 75 80
gtg cgg cgc ctg gga ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg cag cgc ggg gac 288
Val Arg Arg Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp
85 90 95
cct gct gct ttc aga gct ctc gtc gcc cag tgt ctg gtc tgc gtt cct 336
Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro
100 105 110
tgg gac gca cgg ccc cca ccc gcc gcc ccc agt ttc cgg cag gtg agt 384
Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser
115 120 125
tgt ctc aaa gag ttg gtt gct cgg gtg ttg cag cgg ctt tgt gaa agg 432
Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg
130 135 140
gga gca aag aac gtc ctt gcc ttt ggc ttc gct ttg ctc gat gga gca 480
Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala
145 150 155 160
cgc gga ggc cct cct gag gca ttc act act agc gtc cgg tcc tac ctg 528
Arg Gly Gly Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu
165 170 175
ccc aac aca gtg acc gac gct ctg aga ggt tca ggt gcc tgg ggt ctg 576
Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu
180 185 190
ctg ctg cgg agg gtg ggt gat gat gtt ctg gtt cac ctc ctg gcc cgg 624
Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg
195 200 205
tgt gcc ctg ttc gtg ctg gtg gct ccc tcc tgc gca tac cag gtc tgc 672
Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys
210 215 220
gga ccc cca ctt tat cag ctc ggc gct gct act cag gcc cgc cca cca 720
Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro
225 230 235 240
cca cac gcc tca ggt cca aga cgc cgg ctg ggc tgc gaa cgg gca tgg 768
Pro His Ala Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp
245 250 255
aat cat agc gtg cgg gag gca ggt gtg cct ctc ggc ctg cca gcc ccc 816
Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro
260 265 270
gga gca agg aga cgc ggt gga tcc gcc agt cgc tca ctc ccc ttg cct 864
Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro
275 280 285
aag agg cca aga aga gga gcc gcc cct gaa ccc gag aga aca cct gtc 912
Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val
290 295 300
ggc cag ggc tcc tgg gct cac ccc gga agg acc agg ggc cca agc gat 960
Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp
305 310 315 320
agg ggc ttc tgt gtt gtg tca cca gcc agg cct gcc gaa gag gct acc 1008
Arg Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr
325 330 335
tcc ttg gaa gga gcc ctc agt ggc acc agg cat tct cat cca tct gtg 1056
Ser Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val
340 345 350
ggt agg cag cat cat gcc ggc ccc ccc tct aca agc aga cct ccc aga 1104
Gly Arg Gln His His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg
355 360 365
cct tgg gac aca ccc tgc cca cca gtg tat gcc gag acc aag cac ttt 1152
Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe
370 375 380
ttg tat tcc agt ggc gat aaa gag cag ctc cgg ccc tct ttt ctg ctc 1200
Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu
385 390 395 400
tca agc ctc cgc ccc tct ctg acc gga gct cgc agg ctg gtg gag acc 1248
Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr
405 410 415
atc ttt ctg ggc tca aga cca tgg atg cca ggc acc ccc cgc aga ctg 1296
Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu
420 425 430
ccc agg ctc ccc cag cgg tac tgg cag atg cgc cct ctc ttt ctg gaa 1344
Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu
435 440 445
ctt ctg ggt aac cac gcc cag tgc cca tat ggc gtc ctg ctg aag acc 1392
Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr
450 455 460
cac tgt cct ctg agg gcc gcc gtg acc cca gcc gcc ggt gtg tgt gct 1440
His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala
465 470 475 480
aga gaa aaa ccc cag ggc tca gtg gct gca cct gaa gag gag gac act 1488
Arg Glu Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr
485 490 495
gac cct cgc cgc ctt gtc cag ttg ctc agg cag cat tca tca cca tgg 1536
Asp Pro Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp
500 505 510
cag gtg tac ggc ttc gtg agg gct tgc ctg cgg aga ctg gtc ccc ccc 1584
Gln Val Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro
515 520 525
gga ttg tgg gga tct cgg cac aac gaa cgg cgc ttt ctg agg aat aca 1632
Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr
530 535 540
aag aag ttt atc tcc ctg ggc aag cat gca aag ctc agc ttg cag gag 1680
Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu
545 550 555 560
ctg aca tgg aag atg agc gtt aga gga tgc gca tgg ctc agg cgg tca 1728
Leu Thr Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser
565 570 575
cct gga gtt gga tgc gtt cca gca gca gag cac agg ctg cgc gaa gag 1776
Pro Gly Val Gly Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu
580 585 590
att ctc gca aag ttc ctg cac tgg ctt atg agc gtc tac gtg gtc gaa 1824
Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu
595 600 605
ctg ctg cgg tct ttc ttc tac gtg aca gag acc act ttt cag aag aac 1872
Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn
610 615 620
aga ctg ttc ttc tac agg aag tcc gtc tgg agc aag ctc cag agt att 1920
Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile
625 630 635 640
ggt att aga cag cac ctt aag aga gtt cag ctt aga gag ctg tcc gaa 1968
Gly Ile Arg Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu
645 650 655
gct gaa gtc cgc cag cac cgc gaa gct cgc ccc gcc ctc ctg acc tct 2016
Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser
660 665 670
cgg ctg cgg ttt att ccc aaa ccc gat ggc ctt aga cct atc gtg aat 2064
Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn
675 680 685
atg gat tac gtc gtg ggt gcc cgc act ttc aga agg gag aag cgc gcc 2112
Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala
690 695 700
gag aga ctg aca tct cgc gtg aag gca ctt ttt tct gtg ctt aat tat 2160
Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr
705 710 715 720
gaa aga gcc cgc aga cct ggt ctt ctc gga gcc agc gtg ctc ggc ctg 2208
Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu
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gat gat atc cat cgg gct tgg cgc acc ttt gtg ctt cgg gtg agg gca 2256
Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala
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cag gat cct cct cct gag ctt tat ttt gtg aaa gtt gat gtt act ggt 2304
Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly
755 760 765
gct tac gat aca atc cct cag gac cgg ctc acc gag gtg atc gcc tct 2352
Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser
770 775 780
att atc aaa ccc cag aac acc tac tgc gtg aga agg tac gcc gtc gtt 2400
Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val
785 790 795 800
cag aaa gcc gca cac gga cac gtg cgc aaa gct ttc aaa tcc cac gtg 2448
Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val
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tct acc ttg aca gac ctc cag cct tat atg cgg cag ttt gtc gca cac 2496
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Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser
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ttt atg tgc cac cac gcc gtg cgg att agg ggc aag tct tac gtg cag 2640
Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln
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Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser
885 890 895
ctg tgc tat ggc gat atg gag aat aaa ttg ttc gcc ggt atc aga aga 2736
Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg
900 905 910
gac ggt ttg ctc ctg agg ctg ttc ctg ctg gtt acc ccc cat ctg act 2784
Asp Gly Leu Leu Leu Arg Leu Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr
915 920 925
cat gcc aaa aca ttt ttg cgg act ctg gtt agg ggc gtg cca gag tat 2832
His Ala Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr
930 935 940
ggc tgt gtt gtg aat ttg cgg aaa act gtg gtt aat ttc cca gtg gag 2880
Gly Cys Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu
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gac gaa gct ctc gga ggc aca gct ttt gtt cag atg cct gcc cac ggc 2928
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ctg ttc cca tgg tgc gga ctg ctg ctc gat acc cgg acc ctc gag gtg 2976
Leu Phe Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val
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Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp
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Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys
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65 70 75 80
tgc gtt cca gca gca gag cac agg ctg cgc gaa gag att ctc gca aag 288
Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys
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Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser
100 105 110
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Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe
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Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln
130 135 140
cac ctt aag aga gtt cag gga ggt ggt gga ggt gga ttc act act agc 480
His Leu Lys Arg Val Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe Thr Thr Ser
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Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln Gly
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Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe Val
260 265 270
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Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln
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Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val
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Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp
420 425 430
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Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys
435 440 445
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Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr
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Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala
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Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg
545 550 555 560
acc ctc gag gtg cag tcc gat tat agt tcc tat gca aga aca tca att 1728
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565 570 575
gga gga ggt ggt gga ggt tgg aat cat agc gtg cgg gag gca ggt gtg 1776
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Trp Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val
580 585 590
cct ctc ggc ctg cca gcc ccc gga gca agg aga cgc ggt gga tcc gcc 1824
Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala
595 600 605
agt cgc tca ctc ccc ttg cct aag agg cca aga aga gga gcc ggt gga 1872
Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Gly Gly
610 615 620
gga ggt ggt gga ctg gcc acc ttc gtg cgg cgc ctg gga ccc cag ggc 1920
Gly Gly Gly Gly Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly Pro Gln Gly
625 630 635 640
tgg cgg ctg gtg cag cgc ggg gac cct gct gct ttc aga gct ctc gtc 1968
Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val
645 650 655
gcc cag tgt ctg gtc tgc gtt cct tgg gac gca cgg ccc cca ccc gcc 2016
Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala
660 665 670
gcc ccc agt ttc cgg cag gtg agt tgt ctc aaa gag ttg gtt gct cgg 2064
Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg
675 680 685
gtg ttg cag cgg ctt tgt gaa agg gga gca aag aac gtc ctt gcc ttt 2112
Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe
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ggc ttc gct ttg ctc gat gga gca cgc gga gga ggt ggt gga ggt gga 2160
Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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aga gag ctg tcc gaa gct gaa gtc cgc cag cac cgc gaa gct cgc ccc 2208
Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro
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gcc ctc ctg acc tct cgg ctg cgg ttt att ccc aaa ccc gat ggc ctt 2256
Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu
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aga cct atc gtg aat atg gat tac gtc gtg ggt gcc cgc act ttc aga 2304
Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg
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agg gag aag cgc gcc gag aga ctg aca tct cgc gtg aag gca ctt ttt 2352
Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe
770 775 780
tct gtg ctt aat tat gaa aga gcc cgc aga cct ggt ctt ctc gga gcc 2400
Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala
785 790 795 800
agc gtg ctc ggc ctg gat gat atc cat cgg gct tgg cgc acc ttt gtg 2448
Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val
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ctt cgg gtg agg gca cag gat cct cct cct gag ctt tat ttt gtg aaa 2496
Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys
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gtt gat gtt act ggt gct tac gat aca atc cct cag gac cgg ctc acc 2544
Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr
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Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His Gly His Val Arg Lys Gly
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gga gga ggt ggt gga aac agg ggc ttc aag gcc ggc cgg aat atg aga 2688
Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg
885 890 895
agg aaa ctg ttc gga gtg ttg aga ctt aag tgt cat agt ctt ttt ttg 2736
Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu
900 905 910
gac ttg cag gtc aat tct ctc cag aca gtg tgt acc aac att tat aaa 2784
Asp Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys
915 920 925
atc ctc ttg ctg cag gct tac aga ttc cat gcc tgc gtc ctg cag ctg 2832
Ile Leu Leu Leu Gln Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu
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Ile Ser Asp Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn
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gct ggc atg agc ttg gga gct aag ggc gcc gct gga cct ctg ccc agt 2976
Ala Gly Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser
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cgc cac cgc gtg act tac gtc cca ctc ctg ggc tcc ctg aga act 3069
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580 585 590
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195 200 205
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Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg
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Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu
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Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val
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Ser Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val
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Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
465 470 475 480
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485 490 495
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Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu
500 505 510
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Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala
515 520 525
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Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile
530 535 540
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545 550 555 560
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Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp
565 570 575
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Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys
580 585 590
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Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala
595 600 605
gca cac gga cac gtg cgc aaa gga ggt gga ggt gga gga tgc gtt cca 1872
Ala His Gly His Val Arg Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Val Pro
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gca gca gag cac agg ctg cgc gaa gag att ctc gca aag ttc ctg cac 1920
Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu His
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660 665 670
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Arg Val Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu
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740 745 750
tgg gga tct cgg cac aac gaa cgg cgc ttt ctg agg aat aca aag aag 2304
Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys
755 760 765
ttt atc tcc ctg ggc aag cat gca aag ctc agc ttg cag gag ctg aca 2352
Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr
770 775 780
tgg aag atg agc gtt aga gga tgc gca tgg ctc agg cgg tca cct gga 2400
Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly
785 790 795 800
gtt gga gga ggt ggt gga ggt ccc tgc cca cca gtg tat gcc gag acc 2448
Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr
805 810 815
aag cac ttt ttg tat tcc agt ggc gat aaa gag cag ctc cgg ccc tct 2496
Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser
820 825 830
ttt ctg ctc tca agc ctc cgc ccc tct ctg acc gga gct cgc agg ctg 2544
Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu
835 840 845
gtg gag acc atc ttt ctg ggc tca aga cca tgg atg cca ggc acc ccc 2592
Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro
850 855 860
cgc aga ctg ccc agg ctc ccc cag cgg tac tgg cag atg cgc cct ctc 2640
Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu
865 870 875 880
ttt ctg gaa ctt ctg ggt aac cac gcc cag tgc cca tat ggc gtc ctg 2688
Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu
885 890 895
ctg aag acc cac tgt cct ctg agg gcc gcc gtg acc ggt gga gga ggt 2736
Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Gly Gly Gly Gly
900 905 910
ggt gga tcc tgg gct cac ccc gga agg acc agg ggc cca agc gat agg 2784
Gly Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg
915 920 925
ggc ttc tgt gtt gtg tca cca gcc agg cct gcc gaa gag gct acc tcc 2832
Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser
930 935 940
ttg gaa gga gcc ctc agt ggc acc agg gga ggt ggt gga ggt gga tgg 2880
Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Trp
945 950 955 960
aat cat agc gtg cgg gag gca ggt gtg cct ctc ggc ctg cca gcc ccc 2928
Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro
965 970 975
gga gca agg aga cgc ggt gga tcc gcc agt cgc tca ctc ccc ttg cct 2976
Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro
980 985 990
aag agg cca aga aga gga gcc ggt gga gga ggt ggt gga ttc act act 3024
Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe Thr Thr
995 1000 1005
agc gtc cgg tcc tac ctg ccc aac aca gtg acc gac gct ctg aga 3069
Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg
1010 1015 1020
ggt tca ggt gcc tgg ggt ctg ctg ctg cgg agg gtg ggt gat gat 3114
Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp
1025 1030 1035
gtt ctg gtt cac ctc ctg gcc cgg tgt gcc ctg ttc gtg ctg gtg 3159
Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu Val
1040 1045 1050
gct ccc tcc tgc gca tac cag gtc tgc gga ccc cca ctt tat cag 3204
Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln
1055 1060 1065
ctc ggc gct gct gga ggt gga ggt gga ggt ctg gcc acc ttc gtg 3249
Leu Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Thr Phe Val
1070 1075 1080
cgg cgc ctg gga ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg cag cgc ggg gac 3294
Arg Arg Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp
1085 1090 1095
cct gct gct ttc aga gct ctc gtc gcc cag tgt ctg gtc tgc gtt 3339
Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val
1100 1105 1110
cct tgg gac gca cgg ccc cca ccc gcc gcc ccc agt ttc cgg cag 3384
Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln
1115 1120 1125
gtg agt tgt ctc aaa gag ttg gtt gct cgg gtg ttg cag cgg ctt 3429
Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu
1130 1135 1140
tgt gaa agg gga gca aag aac gtc ctt gcc ttt ggc ttc gct ttg 3474
Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu
1145 1150 1155
ctc gat gga gca cgc gga gga ggt ggt gga gga ggt ggc aag cca 3519
Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Pro
1160 1165 1170
att cct aat cca ttg ctg ggc ctg gac tca act tga 3555
Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1175 1180
<210> 50
<211> 1184
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 50
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
85 90 95
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
100 105 110
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
115 120 125
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln
130 135 140
Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala
145 150 155 160
Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu
165 170 175
Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp
180 185 190
Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr
195 200 205
Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser
210 215 220
Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn
225 230 235 240
Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gln Pro Tyr Met
260 265 270
Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu Arg Asp Ala
275 280 285
Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg
305 310 315 320
Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu
325 330 335
Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp Met Glu Asn Lys Leu
340 345 350
Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu Arg Leu Phe Leu Leu
355 360 365
Val Thr Pro His Leu Thr His Ala Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val
370 375 380
Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val
385 390 395 400
Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val
405 410 415
Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp
420 425 430
Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr
435 440 445
Ser Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val
450 455 460
Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg
465 470 475 480
Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr
485 490 495
Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu
500 505 510
Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala
515 520 525
Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile
530 535 540
His Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro
545 550 555 560
Pro Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp
565 570 575
Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys
580 585 590
Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala
595 600 605
Ala His Gly His Val Arg Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Val Pro
610 615 620
Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu His
625 630 635 640
Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr
645 650 655
Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys
660 665 670
Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His Leu Lys
675 680 685
Arg Val Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu
690 695 700
Lys Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro
705 710 715 720
Arg Arg Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val
725 730 735
Tyr Gly Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Trp Lys Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly
785 790 795 800
Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr
805 810 815
Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser
820 825 830
Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu
835 840 845
Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro
850 855 860
Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu
865 870 875 880
Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu
885 890 895
Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Gly Gly Gly Gly
900 905 910
Gly Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg
915 920 925
Gly Phe Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser
930 935 940
Leu Glu Gly Ala Leu Ser Gly Thr Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Trp
945 950 955 960
Asn His Ser Val Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro
965 970 975
Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro
980 985 990
Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe Thr Thr
995 1000 1005
Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr Asp Ala Leu Arg
1010 1015 1020
Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp Asp
1025 1030 1035
Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu Val
1040 1045 1050
Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln
1055 1060 1065
Leu Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Thr Phe Val
1070 1075 1080
Arg Arg Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp
1085 1090 1095
Pro Ala Ala Phe Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val
1100 1105 1110
Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln
1115 1120 1125
Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu
1130 1135 1140
Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu
1145 1150 1155
Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Pro
1160 1165 1170
Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1175 1180
Claims (28)
- 텔로머라제 촉매 활성 및 핵인 국소화 시그널(nucleolar localization signal)이 결여된(devoid) 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT) 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 구조물로,
상기 hTERT 단백질은 아미노산 867-869 (VDD)의 결실에 의해 텔로머라제 촉매 활성이 결여되고, 상기 hTERT 단백질이 N-말단에서 유비퀴틴과 융합되는, 핵산 구조물. - 제1항에 있어서,
hTERT 단백질은 아미노산 867-869 (VDD) 업스트림 및/또는 다운스트림의 1 내지 12개의 아미노산의 추가적 결실에 의해 텔로머라제 촉매 활성이 결여되는, 핵산 구조물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
hTERT 단백질은 적어도 아미노산 1-23의 결실에 의해 핵인 국소화 시그널이 결여되는, 핵산 구조물. - 제3항에 있어서,
hTERT 단백질은 아미노산 1-47의 결실에 의해 핵인 국소화 시그널이 결여되는, 핵산 구조물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
DNA인, 핵산 구조물. - 제5항에 있어서,
DNA 플라스미드인, 핵산 구조물. - 제5항에 있어서,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 12를 암호화하는, 핵산 구조물. - 제7항에 있어서,
SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 3488 내지 6961을 포함하는, 핵산 구조물. - 제5항에 있어서,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 14, 16 또는 18을 암호화하는, 핵산 구조물. - 제9항에 있어서,
뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 13, 15, 또는 17을 포함하는, 핵산 구조물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
텔로머라제를 과발현하는 세포에 대한, 개체 내 면역 반응을 촉발시키는데 사용되는, 핵산 구조물. - 제11항에 있어서,
이상형성 세포, 종양 세포, 또는 온코바이러스에 감염된 세포에 대한, 개체 내 면역 반응을 촉발시키는데 사용되는, 핵산 구조물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
환자 내 종양을 예방 또는 치료하는데 사용되는 핵산 구조물. - 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT)에서 유래된 서열을 포함하는 핵산 구조물로, 상기 hTERT에서 유래된 서열이
i) hTERT의 모든 에피토프 또는 모든 에피토프의 적어도 80%를 암호화하고, 및 ii) 텔로머라제 촉매 활성 및 핵인 국소화 시그널이 결여된 단백질을 암호화하며,
상기 단백질은 아미노산 867-869 (VDD)의 결실에 의해 텔로머라제 촉매 활성이 결여되고, 상기 단백질이 N-말단에서 유비퀴틴과 융합되는, 핵산 구조물. - 제14항에 있어서,
SEQ ID NO: 61 내지 97로서 제시되는 모든 또는 적어도 80%의 면역원성 서열을 포함하는, 핵산 구조물. - 제14항에 있어서,
단편 SEQ ID NO:51 내지 SEQ ID NO:60을 포함하는 서열을 암호화하는, 핵산 구조물. - 제14항 또는 제15항에 있어서,
DNA인, 핵산 구조물. - 제17항에 있어서,
DNA 플라스미드인, 핵산 구조물. - 제14항 또는 제15항에 있어서,
SEQ ID NO: 48을 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산 구조물. - 제14항 또는 제15항에 있어서,
SEQ ID NO: 50을 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산 구조물. - 제14항 또는 제15항에 있어서,
텔로머라제를 과발현하는 세포에 대한 개체 내 면역 반응 촉발시키는데 사용되는, 핵산 구조물. - 제21항에 있어서,
이상형성 세포, 종양 세포, 또는 온코바이러스에 감염된 세포에 대한 개체 내 면역 반응 촉발시키는데 사용되는, 핵산 구조물. - 제14항 또는 제15항에 있어서,
환자 내 종양을 예방 또는 치료하는데 사용되는 핵산 구조물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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