JP2022541070A - 調節可能な発現系 - Google Patents

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Abstract

調節可能な遺伝子発現のための、スプライス調節剤結合配列を含むミニ遺伝子を含む組成物並びにその系及び使用方法が本明細書に提供される。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年７月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５８６４３－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが１０８，４９１バイトである。
調節可能な遺伝子発現のためのミニ遺伝子を含む組成物並びにその系及び使用方法が本明細書に開示される。
所望の遺伝子産物の発現を増加させるために標的細胞に遺伝物質（例えば、異種核酸）を送達する遺伝子治療法は、この治療目的をサポートし得る。ウイルスは、感染した宿主による免疫監視を回避しながら、特定の細胞型への核酸送達において高度に効率的になるように進化してきた。Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８０（１）：３５－４７。これらの特性により、ウイルスは、遺伝子治療の送達媒体又はベクターとして魅力的になる。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び単純ヘルペスウイルスを含むいくつかの種類のウイルスは、遺伝子治療用途での使用のために実験室で改変されている。Ｌｕｎｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｄｉｓｅａｓｅｓ，６（２）：４２。特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターは、（ｉ）筋線維及びニューロンを含む多様な非分裂及び分裂細胞タイプに感染（伝達）することができ；（ｉｉ）ウイルス構造遺伝子を欠いており、それによりウイルス感染に対する天然の宿主細胞応答、例えばインターフェロン媒介応答が排除され；（ｉｉｉ）野生型ウイルスがヒトの病理学に関連付けられたことはなく；（ｉｖ）宿主細胞ゲノムに組み込むことができる野生型ＡＡＶとは対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、一般に、エピソームとして存続するため、挿入型遺伝子変異又は癌遺伝子の活性化のリスクが制限され；（ｖ）他のベクター系とは対照的に、ＡＡＶベクターは、有意な免疫応答を誘発しないため（ｉｉを参照されたい）、例えば治療用異種核酸の長期発現を可能にする（それらの遺伝子産物が拒絶されない場合）ため、遺伝物質を効果的に送達し得る。Ｗｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１３（６）：４２１－３３；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．，４（２）：４３－６３。
ＡＡＶは、パルボウイルス科のメンバーである。ＡＡＶゲノムは、通常、およそ４．７キロベース（ｋｂ）と、非構造的Ｒｅｐ（複製）及び構造的Ｃａｐ（キャプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレームとを含む直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子で構成される。２つのシス作用性末端逆位反復（ＩＴＲ）配列がＡＡＶコード領域に隣接し、これらは、典型的には、およそ１４５ヌクレオチド長であり、ＤＮＡ複製の開始時にプライマーとして機能するヘアピン構造に折り畳むことができるパリンドローム配列を中断している。ＤＮＡ複製におけるそれらの役割に加えて、ＩＴＲ配列は、ウイルスの組み込み、宿主ゲノムからのレスキュー及び成熟ビリオンへのウイルス核酸のキャプシド形成に寄与することが示されている。Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９。
疾患を予防又は処置するための重要な科学的研究ツール又は薬物である多くのタンパク質が開発されてきた。ＡＡＶなどのウイルスベクターは、様々な細胞型を形質導入し、これらのタンパク質をコードする異種核酸を様々な標的組織型に送達する能力のために望ましいが、タンパク質の発現時、例えば薬効の喪失から重篤な毒性まで様々な副作用が発生する可能性がある治療用タンパク質の発現レベルを調節して、例えば治療用タンパク質の発現のタイミング若しくは位置及び／又は治療用タンパク質のレベルを調節して効力を増加させ、且つ／又は副作用を減少させるための戦略を開発することが望ましい。
したがって、本開示は、部分的に、目的のタンパク質の発現をオフ又はオンにするために、小分子を使用してタンパク質の発現を制御するのに有用なミニ遺伝子ヌクレオチド配列を提供する。本開示は、そのようなミニ遺伝子配列を含むベクター、組換えウイルス及び医薬組成物も提供し、遺伝子発現を調節する方法におけるそれらの使用を企図する。
第１の態様において、目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に連結されたミニ遺伝子を含む核酸分子が提供され、ここで、ミニ遺伝子は、第１のエクソン；第１のイントロン；第２のエクソン；第２のイントロン；及び第３のエクソンを含み、前記第２のエクソンは、スプライス調節剤結合配列を含み、スプライス調節剤の存在下では、前記第２のエクソンは、核酸のｍＲＮＡ産物に含まれ、及び前記スプライス調節剤の非存在下では、前記第２のエクソンは、核酸のｍＲＮＡ産物に含まれない。
実施形態において、第３のエクソンは、スプライス調節剤の不在下で産生された核酸のｍＲＮＡ産物においてインフレームであり、且つスプライス調節剤の存在下で産生された核酸のｍＲＮＡ産物においてインフレームではない終止コドンを含む。
実施形態において、第２のエクソンは、スプライス調節剤の存在下で産生された核酸のｍＲＮＡ産物においてインフレームである終止コドンを含む。
実施形態において、第１のエクソン及び第３のエクソンは、開始コドンを含まない。いくつかの実施形態において、第２のエクソンは、開始コドンを含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかの実施形態において、核酸は、ミニ遺伝子と導入遺伝子との間に配置されたプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含む。
実施形態において、前記プロテアーゼ切断部位は、哺乳動物プロテアーゼによって切断される。
実施形態において、哺乳動物プロテアーゼは、フューリン、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、カテプシンＢ、グランザイムＢ、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ジェネナーゼ（ｇｅｎｅｎａｓｅ）、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ又はエラスターゼ１である。
前述の態様及び実施形態のいずれかの実施形態において、プロテアーゼ切断部位は、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＲＸコンセンサスモチーフ、ＲＮＲＲ（配列番号３９）、Ｉ－Ｅ－Ｐ－Ｄ－Ｘコンセンサスモチーフ（配列番号３５）、Ｇｌｕ／Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ－Ｎ－Ｌ－Ｙ－Ｆ－Ｑ－Ｇ（配列番号４１）及び［ＡＧＳＶ］－ｘ（配列番号４２）からなる群から選択される切断モチーフを有するポリペプチドを含む。実施形態において、前記切断部位は、フューリンによって切断される。実施形態において、フューリンによって切断されるプロテアーゼ切断部位は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）；ＲＴＫＲ（配列番号４３）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号４５）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号４７）；ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号４９）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号５１）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号５３）；ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号５５）；又はＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号５７）である。実施形態において、フューリンによって切断されるプロテアーゼ切断部位は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）を含む。実施形態において、プロテアーゼ切断部位をコードする配列は、ＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣ（配列番号１９）を含む、例えばそれからなる。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、核酸は、ミニ遺伝子と導入遺伝子との間に配置された自己切断ペプチドをコードする配列を含み、任意選択により、自己切断ペプチドは、目的のタンパク質のＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸以内で切断する。実施形態において、自己切断ペプチドは、任意選択により、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド及びＦ２Ａペプチドから選択される２Ａペプチドであり、例えばＴ２Ａペプチドを含み、例えば、自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６１）を含み、任意選択により、自己切断ペプチドは、（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５９）を含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、スプライス調節剤結合配列は、第２のエクソンの３’末端に位置する。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、スプライス調節剤結合配列は、ＡＧＡを含み、例えばそれからなり、及びスプライス調節剤は、５－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－２－（６－（（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－４－イル）オキシ）ピリダジン－３－イル）フェノール（ＬＭＩ０７０）である。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、第２のエクソンは、
ＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号１）；
ＧＴＡＡＴＴＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡ（配列番号２）；
ＧＧＡＴＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡ（配列番号３）；
ＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号４）；
ＡＴＣＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡ（配列番号５）；
ＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＡＧＡＡＡＣＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡ（配列番号６）；
ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＡ（配列番号７）；
ＴＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＧＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＴＡＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号８）；
ＧＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号９）；
ＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号１０）；
Figure 2022541070000001
、及び
（ａ）～（ｋ）のいずれかのフラグメント又は変異体であって、それに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するフラグメント又は変異体
から選択される配列を含む、例えばそれからなる。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、第２のエクソンは、ＳＮＸ７のエクソンに由来する配列を含み、任意選択により、配列は、ＳＮＸ７の潜在的エクソンに由来する。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、第２のエクソンは、
Figure 2022541070000002
；
配列番号１６のフラグメント；又は
配列番号１６の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、第２のエクソンは、
Figure 2022541070000003
；
配列番号９８のフラグメント；又は
配列番号９８の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、第２のエクソンは、３ｎ－１ヌクレオチドからなり、ｎは、整数である。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、第１のエクソンは、
１つ以上、例えば３つのＧＡＡリピート（配列番号６９）（例えば、ＧＡＡＧＡＡＧＡＡ（配列番号６９）を含む）；
コザック配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号７０）を含むコザック配列）；又は
（ａ）及び（ｂ）の両方
を含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、第１のエクソンは、
ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＧＴＴＡＧＣＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧ（配列番号９６）；
配列番号９６のフラグメント；又は
配列番号９６の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、第１のイントロンは、
ＧＴＡＡＴＴＡＧＴＧＴＴＧＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＴＴＴＡＧＣＡＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＴＣＣＴＡＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧ（配列番号９７）；
配列番号９７のフラグメント；又は
配列番号９７の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
を含む、例えばそれからなる。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、ミニ遺伝子は、
単一の開始コドン、例えばＡＴＧ開始コドンを除く全てを除去するか又は変異させること；
第１のエクソン、第２のエクソン及び第３のエクソンの末端におけるもの以外の全ての潜在的スプライスドナー及びスプライスアクセプター配列を除去するか又は変異させること
を行うように改変されている。
実施形態において、ミニ遺伝子は、第１のエクソン内に配置された単一の開始コドンを有する。実施形態において、ミニ遺伝子は、第２のエクソン内に配置された単一の開始コドンを有する。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、ミニ遺伝子は、２０００未満、１９００未満、１８００未満、１７００未満、１６００未満、１５００未満、１４００未満、１３００未満、１２００未満、１１００未満又は１０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満のヌクレオチドを含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、ミニ遺伝子は、約２５００～約５００ヌクレオチド、例えば約２０００～約６００ヌクレオチド、例えば約１５００～約７００ヌクレオチド、例えば約１２００～約８００ヌクレオチド、約１１００～約９００ヌクレオチド、約８００～約５００ヌクレオチド、約８００～約６００ヌクレオチドを含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、ミニ遺伝子は、配列番号７１又は配列番号９４或いはそれに対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する配列又はその機能的フラグメントを含む、例えばそれからなる。
一態様において、（ａ）目的のタンパク質をコードする導入遺伝子と、（ｂ）配列番号７１又は配列番号９４或いはそれに対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する配列又はその機能的フラグメントを含む、例えばそれからなるミニ遺伝子とを含む核酸分子が本明細書に開示される。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、核酸分子は、フューリン切断部位をコードする配列であって、配列番号１９を含む配列と、自己切断ペプチドをコードする配列であって、配列番号２０を含む配列とをさらに含み、任意選択により、ミニ遺伝子は、フューリン切断部位をコードする配列の５’側（例えば、フューリン切断部位をコードする配列のすぐ５’側）に配置され、フューリン切断部位をコードする配列は、自己切断ペプチドをコードする配列の５’側（例えば、自己切断ペプチドをコードする配列のすぐ５’側）に配置され、及び自己切断ペプチドをコードする配列は、導入遺伝子の５’側（例えば、導入遺伝子のすぐ５’側）に配置される。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、核酸分子は、ミニ遺伝子及び導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、任意選択により、前記プロモーターは、ミニ遺伝子の５’側に配置される。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、プロモーターは、ＪｅＴプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＰＧＫプロモーター若しくはシナプシンプロモーター又はイントロンを含まない任意のプロモーターである。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、核酸分子は、転写後調節エレメントをさらに含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）は、Ｂ型肝炎（ＨＰＲＥ）、コウモリ（ＢＰＲＥ）、ジリス（ＧＳＰＲＥ）、ホッキョクジリス（ＡＳＰＲＥ）、アヒル（ＤＰＲＥ）、チンパンジー（ＣＰＲＥ）及びウーリーモンキー（ＷＭＰＲＥ）又はウッドチャック（ＷＰＲＥ）由来のＰＲＥを含み、任意選択により、前記転写後調節エレメントは、導入遺伝子の３’側に配置される。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、転写後調節エレメントは、配列番号７２、配列番号７３又は配列番号８８を含む。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、核酸分子は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含み、任意選択により、前記ポリＡは、導入遺伝子の３’側に配置される。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリＡ又はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ、ベータグロビンポリＡ、アルファグロビンポリＡ、オボアルブミンポリＡ、カッパ軽鎖ポリＡ及び合成ポリＡである。
前述の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、ポリＡは、配列番号２２を含む、例えばそれからなる。
別の態様において、先の態様及び実施形態のいずれか１つによる核酸を含むベクターが本明細書に開示される。実施形態において、ベクターは、ＤＮＡベクター、任意選択により環状ベクター、任意選択によりプラスミドである。実施形態において、ベクターは、二本鎖又は一本鎖であり、例えば二本鎖である。
実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である。実施形態において、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶベクター、任意選択により自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。実施形態において、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶベクター、任意選択により一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである。実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、１つ以上の末端逆位反復（ＩＴＲ）を含み、任意選択により、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、任意選択により、ＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲを含み、任意選択により、２つのＩＴＲは、配列番号１２及び配列番号２３を含む。
先の態様及び実施形態のいずれかを含む実施形態において、ベクターは、例えば、５’から３’まで、
任意選択により配列番号１２を含む末端分解部位の欠失を含むように任意選択により改変されているＩＴＲ、任意選択によりＡＡＶ２ ＩＴＲ；
プロモーター、任意選択により配列番号１３を含むか又はそれからなるＪｅＴプロモーター；
態様１～２８のいずれか１つに記載の核酸分子；
任意選択により配列番号２２を含むか又はそれからなるポリＡシグナル；及び
任意選択により配列番号２３を含むか又はそれからなるＩＴＲ、任意選択によりＡＡＶ２ ＩＴＲ
を含む。
一態様において、先の態様及び実施形態のいずれかの核酸又はベクターを含む組換えウイルスが本明細書で提供される。実施形態において、組換えウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、キメラＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ＤＮＡウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である。実施形態において、ウイルスは、ＡＡＶである。実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３６、ＡＡＶｒｈ３７、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓキャプシド血清型又はその変異体、例えば複数のＡＡＶ血清型からのキャプシドの組み合わせの１つ以上を含む。実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシド血清型又はその任意の変異体若しくは誘導体を含む。実施形態において、ウイルスは、例えば、それぞれ配列番号７４、配列番号７５及び配列番号７６によってコードされるか、又はそれぞれ配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む。実施形態において、ＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターを含む。実施形態において、ＡＡＶは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターを含む。
別の態様において、先の態様及び実施形態のいずれか１つの核酸分子、ベクター又は組換えウイルスを含む細胞が本明細書で提供される。実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。実施形態において、細胞は、ニューロン又は星状細胞である。
一態様において、任意の先の細胞の態様及び実施形態の細胞を含む細胞が本明細書で提供され、ここで、細胞がスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を含む場合、目的のタンパク質の発現レベルは、細胞が前記スプライス調節剤を含まない場合の目的のタンパク質の発現レベルよりも例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく、任意選択により、細胞が前記スプライス調節剤を含まない場合の発現レベルは、検出できない。
一態様において、任意の先の細胞の態様及び実施形態の細胞を含む細胞が本明細書で提供され、ここで、細胞がスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を含まない場合、目的のタンパク質の発現レベルは、細胞が前記スプライス調節剤を含む場合の目的のタンパク質の発現レベルよりも例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく、任意選択により、細胞が前記スプライス調節剤を含む場合の発現レベルは、検出できない。
一態様において、目的のタンパク質を条件付きで発現する方法が本明細書で提供され、前記方法は、任意の先の態様及び実施形態の核酸分子、ベクター又は組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば先の態様及び実施形態のいずれか１つの細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
前記スプライス調節剤の存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
前記スプライス調節剤の非存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、スプライス調節剤の存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい。
一態様において、目的のタンパク質を条件付きで発現する方法が本明細書で提供され、前記方法は、任意の先の態様及び実施形態の核酸分子、ベクター又は組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば先の態様及び実施形態のいずれか１つの細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
前記スプライス調節剤の非存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
前記スプライス調節剤の存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、スプライス調節剤の非存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい。
一態様において、前述の態様及び実施形態のいずれかの核酸分子、ベクター、組換えウイルス又は細胞を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
一態様において、遺伝子治療を必要とする対象を処置する方法が本明細書で提供され、前記方法は、先の態様及び実施形態のいずれかの核酸分子、ベクター、組換えウイルス、細胞又は医薬組成物を前記対象に投与することを含む。実施形態において、方法は、スプライス調節剤の非存在下での目的のタンパク質の発現レベルに対して、目的のタンパク質の発現において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍の増加又は減少を引き起こすのに有効な量のスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を対象に投与することをさらに含む。
一態様において、先の態様及び実施形態のいずれかの核酸分子、ベクター、組換えウイルス、細胞又は医薬組成物と、スプライス調節剤とを含むキットが本明細書で提供される。
一態様において、目的のタンパク質を条件付きで発現する方法における使用のための、先の態様及び実施形態のいずれかの核酸分子、ベクター、組換えウイルス、細胞又は医薬組成物が本明細書で提供され、前記方法は、態様１～２及び４～３６のいずれか１つの核酸分子、態様３７～４５のいずれか１つのベクター又は態様４６～５２のいずれか１つの組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば態様５３～５７のいずれか１つの細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
前記スプライス調節剤の存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
前記スプライス調節剤の非存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、スプライス調節剤の存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい。
一態様において、目的のタンパク質を条件付きで発現する方法における使用のための、先の態様及び実施形態のいずれか１つの核酸分子、ベクター、組換えウイルス、細胞又は医薬組成物が本明細書で提供され、前記方法は、態様１若しくは３～３６のいずれか１つの核酸分子、態様３７～４５のいずれか１つのベクター又は態様４６～５２のいずれか１つの組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば態様５３～５７のいずれか１つの細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
前記スプライス調節剤の非存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
前記スプライス調節剤の存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、スプライス調節剤の非存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい。
一態様において、遺伝子治療を必要とする対象を処置する方法における使用のための、先の態様及び実施形態のいずれかの核酸分子、ベクター、組換えウイルス、細胞又は医薬組成物が本明細書で提供される。
一態様において、先の態様及び実施形態のいずれかの核酸分子、ベクター、組換えウイルス、細胞若しくは医薬組成物又は態様６４～６６のいずれか１つに従う使用のための核酸、ベクター、組換えウイルス、細胞若しくは医薬組成物が本明細書で提供され、ここで、導入遺伝子は、ゲノム編集系のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ）、抗体若しくは抗体フラグメント又は治療用タンパク質（例えば、プログラニュリン、ＳＭＮ、ＭｅＣＰ２、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、ＣＬＮ４、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７、ＣＬＮ８から選択されるタンパク質）をコードする。
図１：図１Ａは、スプライス調節剤を介した「オンスイッチ」の概念を説明する。オンスイッチ系では、エクソンＣは、エクソンＢが除外されたとき、エクソンＡに位置する開始コドンによって開始されるコード配列とインフレームにある早期終止（停止）コドンを含む。ＬＭＩ０７０などのスプライス調節剤が含まれる場合、転写物にはフレームシフトエクソンＢが含まれるようになり、それにより、導入遺伝子の発現につながる中断のないオープンリーディングフレームが復元される。図１Ｂは、スプライス調節剤を介した「オフスイッチ」の概念を説明する。オフスイッチ系では、エクソンＡがエクソンＣにスプライシングされ、導入遺伝子の発現につながる。ＬＭＩ０７０などのスプライス調節剤が存在する場合、早期終止（停止）コドンを含むエクソンＢが含まれ、その結果、翻訳が終了する。 （上記の通り。） 図２：ＳＮＸ７ミニ遺伝子ベースのスイッチを有するＡＡＶベクターの設計。図２Ａは、染色体：ＧＲＣｈ３７：１：９９２０４２１６：９９２０４３５９：１（ＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号８０））にスプライス調節剤（ＬＭＩ０７０）エクソン標的結合部位、並びに染色体：ＧＲＣｈ３７：１：９９２０３７９３：９９２０３９４６：１（ＣＴＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＧＧＡＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＴＴＡＧＣＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＧ（配列番号９９））でエクソン８の下流にイントロン配列、及び染色体上ＧＲＣｈ３７：１：９９２２５６１０：９９２２５６８７：１（ＴＧＣＣＴＴＧＣＴＡＣＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＣＴＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＣＣＴＴＡＡ（配列番号１００））でエクソン９の上流に２１，２５１ヌクレオチドを含むＳＮＸ７遺伝子座の概略図を示す。図２Ｂは、エクソン８（エクソンＡと呼ばれる）、２７０ヌクレオチドのイントロン（ＡＢ）、３’末端にスプライス調節剤（例えば、ＬＭＩ０７０）結合部位を含むエクソン（エクソンＢと呼ばれる）、４０７ヌクレオチドのイントロンフラグメント（２１，２５１ｎｔから短縮；ＢＣ）及びエクソン９（エクソンＣと呼ばれる）を使用した、天然に存在しないＳＮＸ７ミニ遺伝子の構築を示す。ミニ遺伝子の性能を向上させるために、１）コザックコンセンサス配列及びＡＴＧコドン（ＧＣＣＡＣＣＡＴＧ）がエクソンＡの６５位に挿入され；２）ミニ遺伝子内の他の全てのＡＴＧ配列がＴＴＧに置換され；３）エクソンＡの２０位のＴＡをＡＧで置換して、ＧＡＡＧＡＡＧＡＡ配列（配列番号６９）を作製し；４）ＯＲＦでフレームシフト（ヌクレオチド数＝３ｎ－１）を作製するために、エクソンＢから１ｎｔが除去され；５）ＴをエクソンＣの４位に挿入して、ＯＲＦにフレームシフトを作製し、複数の終止コドンを得；６）エクソンＣの９位のＴＡＣは、早期終止コドンを作製するためにＴＡＡに変更され；７）エクソンＣの３４位のＣＡＧをＡＣＣに変更して、可能性のある潜在的スプライス部位を変異させ；８）エクソンＣの６０位のＣＴＣＴをＴＡＧＣに変更して、Ｎｈｅ Ｉ制限部位を作製し；及び９）エクソンＣの末端のＴＡＡは、連続ＯＲＦを作製するために除去されたなどのさらなる改変が行われた。図２Ｃは、ＳＮＸ７ミニ遺伝子オンスイッチを含むｓｃＡＡＶベクターの構築を示す。ｓｃＡＡＶは、ｔｒｓの欠失を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ、続いてＪｅＴプロモーター、続いてＳＮＸ７ミニ遺伝子（上記の図２Ｂを参照されたい）、続いてエクソンＣの末端に付加されたフューリン切断部位（ＲＮＲＲ（配列番号３９））のコード配列、続いてＴ２Ａペプチドのコード配列、続いて導入遺伝子配列（ここでは、最初のＡＴＧを含まないＥＧＦＰのコード配列）、続いてＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、続いてＡＡＶ２ ＩＴＲを組み合わせて作製された。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図３：ＳＮＸ７ミニ遺伝子ベースのオンスイッチ（図３Ａ）及びオフスイッチ（図３Ｂ）を使用したＧＦＰ発現の調節並びにスプライス調節剤の非存在下（「ＬＭＩ０７０なし」）及びスプライス調節剤の存在下（「プラスＬＭＩ０７０」）でのｍＲＮＡ発現産物を示す。図は、出現順にそれぞれ配列番号１０８～１１１を開示する。 （上記の通り。） 図４：ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＮＸ７スイッチによるＧＦＰ発現の調節。図４Ａは、様々な濃度のスプライス調節剤（ＬＭＩ０７０）で、ｐＳＮＸ７－ＧＦＰ（オンスイッチを含むベクター）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞でのＧＦＰ発現を示す。図４Ｂは、ＬＭＩ０７０濃度の関数としての平均蛍光強度によって測定されたＧＦＰ発現をプロットする。図４Ｃは、様々な濃度のスプライス調節剤でエクソンＢを含むか、又はエクソンＡからエクソンＣへの直接スプライシングを有するｍＲＮＡ転写物の定量化をプロットする。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図５：ラット皮質ニューロンにおけるＳＮＸ７スイッチによるＧＦＰ発現の調節。図５Ａは、様々な濃度のスプライス調節剤（ＬＭＩ０７０）で、ｐＳＮＸ７－ＧＦＰ（オンスイッチを含むベクター）でトランスフェクトされた初代ラットニューロンのＧＦＰ発現レベルを示す。図５Ｂは、ラット皮質ニューロンにおける様々な濃度のスプライス調節剤でエクソンＢを含むか、又はエクソンＡからエクソンＣへの直接スプライシングを有するｍＲＮＡ転写物の定量化をプロットする。 （上記の通り。） 図６：ＳＮＸ７オンスイッチの制御下にあるヒトプログラニュリン（ＰＲＧＮ）導入遺伝子を含むＡＡＶベクター。図６Ａは、１）ニューロン特異的プロモーター（ヒトシナプシンプロモーター）を含み、ＳＮＸ７オンスイッチミニ遺伝子を含むｓｓＡＡＶベクターの概略図を示す。図６Ｂは、ＳＮＸ７ベースのスイッチを含まないベクター（「Ｓｙｎ」）からのｈＰＲＧＮ発現レベルと比較した、スプライス調節剤の存在下又は非存在下での図６Ａに記載のベクター（Ｓｙｎ＿ＳＮＸ）でトランスフェクトされた初代ラットニューロンにおけるｈＰＲＧＮ発現を示す。図６Ｃは、スプライス調節剤の存在下及び非存在下での、エクソンＢを含むｍＲＮＡ及びエクソンＡからエクソンＣへの直接スプライシングを有するｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） 図７：図７Ａは、ＳＮＸ７スイッチ（バージョン１）を含むＡＡＶベクターの経時変化インビボ試験の研究計画を示す。ＳＮＸ７スイッチを有するシナプシンプロモーターの制御下にあるｈＰＧＲＮ発現カセットを含む一本鎖ＡＡＶ９は、Ｐ０新生仔マウスにおいてＩＣＶを注射された。４週間後、マウスに３０ｍｇ／ｋｇのＬＭＩ０７０の経口投与を行い、投与の２４時間後から開始する異なる時点でマウスを屠殺した。図７Ｂは、ＬＭＩ０７０の経口投与が、図７Ａに記載されたＡＡＶベクターを以前に投与されたマウスにおいて、時間依存的にマウス脳における導入遺伝子発現をオンにすることを実証する。グラフは、ＬＭＩ０７０送達後の示された時間後の脳におけるｈＰＧＲＮ発現のＴＲ－ＦＲＥＴ測定を示す。 （上記の通り。） 図８：図８Ａは、ＳＮＸ７スイッチ（バージョン１）を含むＡＡＶベクターの用量反応インビボ試験の研究計画を示す。ＳＮＸ７スイッチを有するシナプシンプロモーターの制御下にあるｈＰＧＲＮ発現カセットを含む一本鎖ＡＡＶ９は、Ｐ０新生仔マウスにおいてＩＣＶを注射された。４週間後、マウスに異なる用量のＬＭＩ０７０の経口投与を行い、投与の１２時間後から開始する異なる時点でマウスを屠殺した。図８Ｂは、ＬＭＩ０７０の経口投与が、図８Ａに記載されたＡＡＶベクターを以前に投与されたマウスにおいて、用量依存的にマウス脳における導入遺伝子発現をオンにすることを実証する。グラフは、示された用量のＬＭＩ０７０で、ＬＭＩ０７０送達後の示された時間後の脳におけるｈＰＧＲＮ発現のＴＲ－ＦＲＥＴ測定を示す。 （上記の通り。） ＳＮＸ７ミニ遺伝子の第１のバージョンと、ＬＭＩ０７０の不存在下でサイズが減少し、ペプチド発現が減少した改変ＳＮＸ７ミニ遺伝子（バージョン２）との比較を示す。図は、出現順にそれぞれ配列番号１０８及び１１２～１１３を開示する。 改変されたＳＮＸ７ミニ遺伝子（バージョン２）が、ＬＭＩ０７０に応答して、前のバージョンのＳＮＸ７ミニ遺伝子よりも感受性が高いことを示す。
開示される組成物及び方法は、本開示の一部を形成する添付の図面に関連して行われる以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解され得る。
本明細書全体を通して、記載は、組成物及び組成物を使用する方法に言及する。本開示が、組成物に関連する特徴又は実施形態を開示又は主張する場合、そのような特徴又は実施形態は、組成物を使用する方法又は使用に等しく適用可能である。同様に、本開示が、組成物を使用する方法に関連する特徴又は実施形態を開示又は主張する場合、そのような特徴又は実施形態は、組成物に等しく適用可能である。値の範囲が表現される場合、それは、範囲内の任意の特定の値を使用する実施形態を含む。さらに、範囲に記載されている値への参照には、その範囲内の全ての各値が含まれる。全ての範囲は、その端点を含み、組み合わせることができる。値が近似値として表される場合、先行詞「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。特定の数値への参照には、文脈で明確に別段の指示がない限り、少なくともその特定の値が含まれる。「又は」の使用は、その使用の特定の文脈で別段の指示がない限り、「及び／又は」を意味する。本明細書で引用されている全ての参考文献は、任意の目的のために参照により組み込まれる。参考文献と本明細書とが矛盾する場合、本明細書が優先される。明確性のために、別個の実施形態に関連して本明細書に開示される、開示される組成物及び方法の特定の特徴も単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解されるべきである。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態に関連して開示される、開示される組成物及び方法の様々な特徴は、別個に又は任意の部分的組み合わせでも提供され得る。
定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈で明らかに別段の指示がない限り、複数形を含む。数値及び範囲の文脈で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者にとって本明細書に含まれる教示から明らかであるように、実施形態が意図した通りに機能し得るように、記載される値又は範囲に近似するか又はそれに近い値又は範囲を指す。いくつかの実施形態において、約は、数値のプラス又はマイナス１０％を意味する。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では互換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。それらは、１つ以上のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含み得る。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖又は複数鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド又はプリン及びピリミジン塩基又は他の天然、化学的若しくは生化学的に改変された、非天然の又は誘導体化されたヌクレオチド塩基、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、典型的には、少なくとも２つのアミノ酸又はアミノ酸変異体を含み、タンパク質又はペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸又は変異体を含む任意のペプチド又はタンパク質が含まれる。これらの用語には、例えば、とりわけ生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質などが含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド又はそれらの組み合わせが含まれる。
「配列同一性」及び「配列相同性」という用語は、本明細書では互換可能に使用され、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関連して使用されるとき、ポリペプチドのポリヌクレオチドの２つの配列を比較又はアラインする場合、同一であり、同じ相対位置にある塩基又はアミノ酸のパーセンテージを指す。配列同一性は、いくつかの異なる方法で決定することができる。例えば、配列は、様々な方法及びコンピュータープログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ－ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴなど）を使用してアラインされ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．，２１５：４０３－１０を参照されたい。
本明細書で論じられる核酸又はタンパク質に関して「単離された」という用語は、自然環境においてそれに関連して通常見出される１つ以上の成分から分離された核酸又はタンパク質を指す。分離は、より大きい核酸から（例えば、遺伝子又は染色体から）又は通常、核酸若しくはタンパク質と接触している他のタンパク質若しくは分子からの除去を含み得る。この用語は、完全な単離を包含するが、完全な単離であることを要しない。
本明細書で使用される場合、「異種核酸配列」を含む単離された核酸は、天然の状況において、単離された核酸の１つ以上の他の成分に作動可能に連結されていることが通常見出されない部分（すなわち異種核酸部分）を含む、単離された核酸を指す。例えば、異種核酸は、単離された核酸の他の成分（例えば、プロモーター）が天然に由来するか、又は単離された核酸の他の成分（例えば、プロモーター）が、細胞、細菌細胞、ウイルス又は生物において異種核酸と作動可能に連結されて天然に見出されない、細胞、細菌細胞、ウイルス又は生物に元々見られなかった核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、異種核酸は、導入遺伝子を含む。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」は、本来は核酸分子の１つ以上の成分と関連していない目的の分子（例えば、治療用タンパク質、レポータータンパク質又は治療用ＲＮＡ分子）をコードする核酸配列である。いくつかの実施形態において、異種核酸配列は、ヒトタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸配列は、ＲＮＡ配列、例えばｓｈＲＮＡをコードする。
特定のＲＮＡを「コード化」するＤＮＡ配列又はＤＮＡポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡに転写されることが可能なＤＮＡの配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、又はＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡ；「非コード」ＲＮＡ又は「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。ＤＮＡ配列又はＤＮＡポリヌクレオチド配列は、特定のポリペプチド又はタンパク質配列も「コード化」し得、例えば、ＤＮＡは、ポリペプチド又はタンパク質配列に翻訳され得るｍＲＮＡを直接コード化する。「タンパク質コード配列」又は特定のタンパク質又はポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビトロ又はインビボでｍＲＮＡに転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）ことができる核酸配列である。コード配列の境界は、５’末端（Ｎ末端）の開始コドン及び３’末端（Ｃ末端）の翻訳終止ナンセンスコドンによって決定され得る。コード配列には、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列及び合成核酸が含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置する。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」又は「プロモーター配列」という用語は、例えばＲＮＡポリメラーゼの結合を介した、例えば下流（３’方向）のコーディング又は非コーディング配列の、作動可能に連結されたコーディング又は非コーディング配列の転写を促進することができる（例えば、検出可能なレベルの転写を引き起こすことができ、且つ／又はプロモーターの非存在下で提供されるレベルを超えて検出可能なレベルの転写を増加させることができる）ＤＮＡ調節配列である。いくつかの実施形態において、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するための最小数の塩基又はエレメントを含む。いくつかの実施形態において、プロモーター配列は、転写開始部位並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインを含み得る。転写を開始するのに十分な配列に加えて、プロモーターは、転写の調節に関与する他の調節エレメントの配列（例えば、エンハンサー、コザック配列及びイントロン）も含み得る。誘導性プロモーター及び構成的プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるベクターを駆動し得る。いくつかの実施形態、例えば本明細書に開示されるウイルスベクターにおいて使用され得る当技術分野で公知のプロモーターの例には、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ｓｍＣＢＡプロモーター及び免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０又は他の組織特異的遺伝子に由来するプロモーター（例えば、ＲＬＢＰ１、ＲＰＥ、ＶＭＤ２）が含まれる。さらに、既知の調節エレメントを混合及び適合させることによって機能的プロモーターを作製するための標準的な技術が当技術分野で公知である。プロモーターのフラグメント、例えばバックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために少なくとも最小数の塩基又はエレメントを保持するものも使用され得る。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（すなわち任意の細胞型において且つ／又は任意の条件下で構成的に発現を駆動するプロモーター）であり得る。他の実施形態において、プロモーターは、特定の組織に関連して、例えばニューロン、心臓細胞などにおいて構成的に活性なプロモーターであり得る。他の実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーター（すなわちその活性が外部刺激、例えば特定の温度、化合物又はタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）であり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、プロモーターが見出される物理的状況に応じて、活性を駆動する又はしないことができる、空間的に制限されたプロモーターであり得る。空間的に制限されたプロモーターの非限定的な例には、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなどが含まれる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、プロモーターが見出される時間的状況に応じて発現を駆動する、時間的に制限されたプロモーターであり得る。例えば、時間的に制限されたプロモーターは、胚発生の特定の段階又は生物学的プロセスの特定の段階でのみ発現を駆動し得る。時間的に制限されたプロモーターの非限定的な例には、マウスの毛包サイクルプロモーターが含まれる。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、多細胞生物において、プロモーターが特定の細胞のサブセットにおいてのみ発現を駆動するように、組織特異的である。例えば、組織特異的プロモーターには、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。ニューロン特異的プロモーターは、例えば、末梢で、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接投与される場合又はインビトロ、エクスビボ若しくはインビボを含み神経細胞に送達される場合、非神経細胞での発現と比較して、ニューロンにおいて作動可能に連結された異種核酸、例えば目的のタンパク質又はペプチド又はｓｈＲＮＡをコードするものの発現を優先的に駆動又は調節するプロモーターを指す。
本明細書で互換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」及び「調節エレメント」という用語は、非コード配列（例えば、短いヘアピンＲＮＡ）又はコード配列（例えば、ＰＧＲＮ）の転写を提供及び／又は調節し、且つ／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指す。
「ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列」及び「ポリアデニル化配列」という用語は、転写終結及びＲＮＡ転写物の３’末端へのアデノシンホモポリマー鎖の付加のためのシグナルを提供する調節エレメントを指す。ポリアデニル化シグナルは、終結シグナル（例えば、ＡＡＵＡＡＡ配列又は他の非標準的配列）及び任意選択により隣接する補助エレメント（例えば、富ＧＵエレメント）及び／又は効率的な切断及びポリアデニル化に関連する他のエレメントを含み得る。ポリアデニル化配列は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡの３’末端に結合した一連のアデノシンを含み得る。特定のポリＡシグナル配列は、配列番号２２又は配列番号８９のポリ（Ａ）シグナルを含み得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ調節配列又は制御エレメントは、組織特異的調節配列である。
「転写後調節エレメント」（「ＰＲＥ」）という用語は、ｍＲＮＡに転写されると、ｍＲＮＡ転写物のレベルで遺伝子発現を調節する、１つ以上の調節エレメントを指す。そのような転写後調節エレメントの例には、マイクロＲＮＡ結合部位、ＲＮＡ結合タンパク質結合部位などをコードする配列が含まれ得る。本明細書に開示される核酸分子及びベクターと共に使用され得る転写後調節エレメントの例には、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、肝炎転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が含まれる。例示的なＰＲＥは、配列番号８８として開示されるＰＲＥも含み得る。ＰＲＥの例には、配列番号７２として開示されるＰＲＥ又は配列番号７３として開示されるＰＲＥも含まれ得る。
「イントロン」という用語は、核酸から発現されるポリペプチド転写物（例えば、目的のタンパク質）の１つ以上のアミノ酸をコードしない、例えばオープンリーディングフレーム内の核酸配列を指す。イントロン配列は、ＤＮＡからＲＮＡに転写され得る（すなわちプレｍＲＮＡに存在し得る）が、タンパク質が成熟ｍＲＮＡから発現される前に、例えばスプライシングによって除去され得る。
「エクソン」という用語は、核酸から発現される転写物（例えば、目的のタンパク質）の１つ以上のアミノ酸をコードする核酸配列、例えばオープンリーディングフレーム内の核酸配列を指す。エクソン配列は、ＤＮＡからＲＮＡに転写され得（すなわちプレｍＲＮＡに存在し得る）、またポリペプチドに翻訳される成熟ｍＲＮＡ（すなわちＲＮＡのプロセシングされた形態（例えば、スプライシング後））に存在し得る。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」で実行されるプロセスは、通常の生物学的環境の外で実施されるプロセス、例えば試験管、フラスコ、ペトリ皿、人工培地で実施される研究を指す。「インビボ」で実行されるプロセスは、生物又は細胞内で実施されるプロセス、例えば細胞培養物又はマウスで実施される研究を指す。「エクスビボ」で実施される研究は、外部環境の生物からの組織内又は組織上で行われ、例えば天然条件の変更を最小限とし、例えばインビボ実験で可能であり得るよりも制御された条件下で生物の細胞又は組織の操作を可能にする、研究を指す。
例えば、核酸、ポリペプチド、細胞又は生物に適用される、本明細書で使用される「天然に存在する」又は「未改変」という用語は、天然に見出されるものである。例えば、生物（ウイルスなど）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、その生物に存在するか又は生物の１つ以上の成分から単離されるかにかかわらず、天然に存在する。
いくつかの実施形態では、「ベクター」は、宿主細胞、例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの細胞、組織及び／又は生物への送達に適したより大きい核酸配列又は構造内の目的の核酸で発現することができる、目的の核酸（例えば、導入遺伝子）を含む、任意の遺伝的エレメント（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの混合物）である。例えば、ベクターは、挿入物（例えば、発現される遺伝子又はその遺伝子のオープンリーディングフレームをコードする導入遺伝子を含む異種核酸）及び１つ以上のさらなるエレメント、例えば本明細書に記載のミニ遺伝子及び／又は挿入物を送達又はその発現を制御するのに適したエレメントを含み得る。ベクターは、例えば、適切な制御エレメントと関連している場合、複製及び／又は発現が可能であり得、そしてそれは、細胞間で遺伝情報を伝達することが可能であり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、宿主細胞における発現に適したベクター、例えばＡＡＶベクターであり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、例えば、細胞又はバイオリアクターにおける、発現及び／又は複製に適したプラスミドであり得る。いくつかの実施形態において、標的細胞における異種核酸配列、例えば目的のタンパク質、ｓｈＲＮＡなどをコードする導入遺伝子の発現のために特異的に設計されたベクターは、発現ベクターと呼ばれ得、一般に導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。他の実施形態において、ベクター、例えば転写ベクターは、転写されることが可能であるが、翻訳されない可能性がある。それらは、標的細胞において複製され得るが、発現されない。転写ベクターを使用してその挿入物を増幅し得る。
「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、単独で又は宿主細胞によって若しくはインビトロ発現系で供給される発現のための他の要素と組み合わせて、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み得る。発現ベクターには、例えば、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド又はリポソームに含まれる）及び組換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
「プラスミド」という用語は、プラスミドが宿主細胞内で複製されるような無傷の「レプリコン」を含む非染色体（及び典型的には二本鎖）のＤＮＡ配列を指す。プラスミドは、環状核酸であり得る。プラスミドが単細胞生物内に配置されると、プラスミドのＤＮＡの結果として、その生物の特性が変化又は変換される。例えば、テトラサイクリン耐性（ＴｃＲ）の遺伝子を保有するプラスミドは、以前はテトラサイクリンに感受性だった細胞を、テトラサイクリンに耐性のある細胞に変換する。本明細書に開示されるウイルスベクターのいくつかの実施形態において有用な例示的なプラスミドには、配列番号９２が含まれる。
本明細書で使用される場合、「組換えウイルス」という用語は、導入遺伝子又は他の異種核酸を含む非野生型及び／又は人工的に産生された組換えウイルス（例えば、パルボウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスなど）を指す。組換えウイルスは、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）キャプシド内にパッケージングされた組換えウイルスゲノム（例えば、本明細書に記載のミニ遺伝子及び導入遺伝子を含む）を含み得る。特定の種類の組換えウイルスは、「組換えアデノ随伴ウイルス」又は「ｒＡＡＶ」であり得る。ウイルスキャプシドにパッケージングされた組換えウイルスゲノムは、ウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換えウイルスは、ウイルスベクターを含む（例えば、目的のミニ遺伝子及び導入遺伝子、例えば本明細書に記載されるものを含む）。ウイルスベクターの例には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はその変異体若しくは誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、「トランスフェクション」という用語は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されると細胞が「トランスフェクト」されるような、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用される。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｇｅｎｅ，１３：１９７を参照されたい。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。いくつかの実施形態において、「形質導入」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、外来ＤＮＡは、ウイルス又はウイルスベクターによって提供される。その結果、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されると、細胞は「形質転換」される。いくつかの実施形態において、「形質転換」という用語は、細菌細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用される。
本明細書で使用される場合、「細胞株」という用語は、インビトロでの連続的な又は長期の成長及び分裂が可能な細胞の集団を指す。特定の状況では、そのようなクローン集団の保存又は導入中に核型に自発的変化又は誘発された変化が発生し得る。したがって、言及される細胞株に由来する細胞は、祖先の細胞又は培養物と正確に同一ではない可能性があり、言及される細胞株は、そのような変異体を含む。
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、この用語は、転写調節配列と転写される配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサー配列は、例えばそれが適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、その配列に隣接しているか又は短いスペーサー配列によって分離されており、すなわち、それらは、シス作用性である。しかし、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、物理的に隣接している必要はなく、転写が増強されるコード配列に近接して配置されている必要もない。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」という用語は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８又はＡＡＶ－９ウイルスベクターを含むが、これらに限定されない、アデノ随伴ウイルス血清型に由来する１つ以上の核酸配列に由来するか又はそれを含むベクターを指す。ＡＡＶベクターは、例えば、機能的隣接末端逆位反復（「ＩＴＲ」）配列を保持しながら、全体又は一部、例えばｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が欠失した、１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子を有し得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、例えば１つ以上のＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、タンパク質シェル又はキャプシドにパッケージングされ得、これは、標的細胞の核へのベクター核酸の送達のための媒体を提供し得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列）を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列）を含むが、追加のウイルス核酸配列を含まない。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクター成分（例えば、ＩＴＲ）は、ｒＡＡＶキャプシドとは異なる血清型ウイルスに由来する（例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲを含み得、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージングされ得る）。これらのベクター構築物の実施形態は、例えば、国際公開第２０１９／０９４２５３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０５８７４４号明細書）に提供され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、「ｓｃＡＡＶ」は、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）である。ｓｃＡＡＶのベクターの少なくとも一部（例えば、コード領域の少なくとも一部）が分子内二本鎖ＤＮＡを形成するため、ｓｃＡＡＶは「自己相補的」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶはｓｃＡＡＶである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、天然に存在するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から操作されて、遺伝子治療における使用のためのｓｃＡＡＶを提供する。これらのベクター構築物の実施形態並びにそれらを調製及び精製する方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／０９４２５３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０５８７４４号明細書）に提供される。
いくつかの実施形態において、「ｓｓＡＡＶ」は一本鎖アデノ随伴ウイルス（ｓｓＡＡＶ）である。ｓｓＡＡＶのベクターの少なくとも一部（例えば、コード領域の少なくとも一部）が一本鎖ＤＮＡであるため、ｓｓＡＡＶは「一本鎖」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶはｓｓＡＡＶである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、天然に存在するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から操作されて、遺伝子治療における使用のためのｓｓＡＡＶを提供する。
本明細書で使用される場合、「ウイルス」又は「ビリオン」は、ウイルスベクターを例えば単独で又は１つ以上のウイルスキャプシドなどの１つ以上のさらなる成分と組み合わせて含むウイルス粒子を示す。例えば、ＡＡＶウイルスは、例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質コートに関連する直鎖状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含み得る。
いくつかの実施形態において、「ウイルス」、「ビリオン」、「ＡＡＶウイルス」、「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶベクター粒子」、「完全キャプシド」、「完全粒子」などの用語は、感染性の複製欠損ウイルス、例えば、例えば片側又は両側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接するウイルスベクターにおいて、目的の異種ヌクレオチド配列をキャプシド形成するＡＡＶタンパク質シェルを含むものを指す。ｒＡＡＶビリオンは、配列、例えばＡＡＶベクターを特定する１つ以上のプラスミドを単独で又は（例えば、同じ又は追加のプラスミド上の）ＡＡＶヘルパー機能及びアクセサリー機能（キャップ遺伝子など）をコードする核酸と組み合わせて含む、適切な宿主細胞において産生され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、その後の遺伝子送達のために、ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を感染性組換えビリオン粒子にパッケージングすることを提供するＡＡＶポリペプチドをコードすることができるようにされる。
「末端逆位反復」又は「ＩＴＲ」という用語は、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び／又は組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）において、Ｔ型パリンドローム構造を形成することができる一連のヌクレオチド配列を指す。Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ。組換えＡＡＶベクターでは、これらの配列は、ゲノムパッケージング及び第２鎖合成において機能的な役割を果たし得る。
「宿主細胞」という用語は、目的の外因性核酸、例えば１つ以上の微生物、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞を含む細胞を意味する。例えば、宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター及び／又は他のトランスファーＤＮＡを含み得る。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的又は意図的な変異のために、形態又はゲノム又は全ＤＮＡ補体が元の親と必ずしも完全に同一であるとは限らない。
「ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、ＡＡＶ遺伝子産物（例えば、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能するもの）を提供するために発現され得るＡＡＶ由来のコード配列を指す。例えば、ＡＡＶヘルパー機能には、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ及びｃａｐの両方が含まれ得る。Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；及びＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を有することが示されている。Ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を提供する。本明細書では、ＡＡＶヘルパー機能を使用して、ＡＡＶベクターから欠落しているトランスのＡＡＶ機能が補完され得る。
「ＡＡＶヘルパー構築物」という用語は、一般に、ＡＡＶベクターから欠失されたＡＡＶ機能を提供するタンパク質又は核酸を提供又はコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、例えば標的細胞又は組織への目的のヌクレオチド配列の送達のためのベクターを指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ複製のために欠落しているＡＡＶ機能を補完するためにＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の一過性発現を提供するために一般的に使用される。典型的には、ヘルパー構築物はＡＡＶ ＩＴＲを欠き、自身の複製もパッケージ化もできない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス又はビリオンの形態であり得る。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードする一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐｌＭ２９＋４５など、多くのＡＡＶヘルパー構築物が開示されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：２９３６－２９４５を参照されたい。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現産物をコードする他の多くのベクターが開示されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号明細書及び第６，３７６，２３７号明細書を参照されたい。これらのベクター構築物の実施形態並びにそれらを調製及び精製する方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／０９４２５３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０５８７４４号明細書）に提供される。
「ミニ遺伝子」は、用語が本明細書で使用される場合、複数のイントロン及びエクソン並びに少なくとも１つのスプライス調節剤結合部位を含む核酸配列を指す。実施形態において、異種核酸配列からの発現中のスプライス調節剤の存在又は不存在は、成熟ｍＲＮＡに存在するエクソンの数を調節する。ミニ遺伝子は、本明細書でより完全に説明される。
「スプライス調節剤」は、スプライス調節剤結合部位に結合し、プレｍＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載の核酸分子から産生されるプレｍＲＮＡ分子のスプライシングを調節する分子である。実施形態において、スプライス調節剤は、成熟ｍＲＮＡ分子におけるエクソンの包含を増加させる。他の実施形態において、スプライス調節剤は、成熟ｍＲＮＡ分子におけるエクソンの包含を減少させる。
「スプライス調節剤結合配列」は、スプライス調節剤によって認識される核酸の配列である。この用語は、プレｍＲＮＡに見られる配列と、プレｍＲＮＡが産生されたＤＮＡに見られる配列の両方を含むと理解されるべきである。例示的な実施形態において、スプライス調節剤は、本明細書に記載の化合物、例えばＬＭＩ０７０であり、スプライス調節剤結合部位は、配列ＡＧＡを含む。実施形態において、スプライス調節剤結合部位は、例えば、本明細書に記載のミニ遺伝子のエクソンの３’末端又はその近傍に配置される。
「プレｍＲＮＡ」は、例えばスプライシングなどのさらなるプロセシングを受けていない、（例えば、本明細書に記載の核酸分子の）ＤＮＡの転写によって作製されるＲＮＡの第１の形態である。したがって、プレｍＲＮＡは、イントロン及びエクソンの両方を含み得る。プレｍＲＮＡ分子は、例えば、スプライシングを通してさらに処理されて、「成熟ＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」を形成する。
本明細書に開示される核酸配列、ミニ遺伝子、ベクター及び方法は、ミニ遺伝子及び前記ミニ遺伝子を含む調節可能な発現系、導入遺伝子発現を制御するためのそのようなミニ遺伝子及び発現系と組み合わせたスプライス調節剤の使用、その他の使用及びそれらの組み合わせ、例えば（１）スプライス調節剤の存在下で導入遺伝子配列の発現を駆動し、スプライス調節剤の非存在下で導入遺伝子配列の発現を減少させるもの（オンスイッチ）、及び（２）スプライス調節剤の非存在下で導入遺伝子配列の発現を駆動し、スプライス調節剤の存在下で導入遺伝子配列の発現を減少させるもの（オフスイッチ）に関する。例えば、本明細書に開示される核酸配列、ベクター及び方法は、スプライス調節剤依存的にヒトＰＧＲＮ又は他の治療用タンパク質配列の発現を駆動し得る。
核酸分子
１．例えば、本明細書に記載されるように、導入遺伝子がミニ遺伝子に作動可能に連結された、目的の分子（例えば、目的のタンパク質）をコードする導入遺伝子を含む核酸分子が本明細書に開示される。
ミニ遺伝子
本明細書に開示される核酸分子及び他の態様は、ミニ遺伝子を含む。本発明の例示的なミニ遺伝子は、図１Ａ（オンスイッチ）及び図１Ｂ（オフスイッチ）に示される。複数のイントロン及びエクソン並びに少なくとも１つのスプライス調節剤結合部位を含む核酸配列であるミニ遺伝子が本明細書に開示される。実施形態において、ミニ遺伝子は、導入遺伝子に作動可能に連結されている。本明細書に記載のミニ遺伝子は、１つ以上のスプライス調節剤と併せて使用され、ミニ遺伝子に関連する導入遺伝子からの目的の分子の発現を制御する（例えば、オン又はオフにする）。
一態様において、ミニ遺伝子は、第１のエクソン；第１のイントロン；第２のエクソン；第２のイントロン；及び第３のエクソンを含み、前記第２のエクソンは、スプライス調節剤結合配列を含み、スプライス調節剤の存在下では、前記第２のエクソンは、核酸のｍＲＮＡ産物に含まれ、及び前記スプライス調節剤の非存在下では、前記第２のエクソンは、核酸のｍＲＮＡ産物に含まれない。
一態様において、ミニ遺伝子の第３のエクソンは、スプライス調節剤の不在下で産生された核酸のｍＲＮＡ産物においてインフレームであり、且つスプライス調節剤の存在下で産生された核酸のｍＲＮＡ産物においてインフレームではない終止コドンを含む。したがって、スプライス調節剤の非存在下では、例えばインフレーム停止コドンを含むエクソンを含めることによる翻訳の早期終止のために、ミニ遺伝子の下流に配置された目的の分子（例えば、目的のタンパク質）をコードする配列の翻訳が減少する一方、スプライス調節剤の存在下では、停止コドンは、フレーム外にあり、目的の分子の翻訳が増加する。したがって、そのような態様は、スプライス調節剤の存在が目的の分子の発現を「オン」にする（例えば、増加させる）ため、本明細書では「オンスイッチ」ミニ遺伝子と呼ばれる。
他の実施形態において、第２のエクソンは、スプライス調節剤の存在下で産生された核酸のｍＲＮＡ産物においてインフレームである終止コドンを含む。したがって、スプライス調節剤の存在下では、終止コドンを含むエクソンが転写物に含まれ、ミニ遺伝子の下流に配置された目的の分子（例えば、目的のタンパク質）をコードする配列の翻訳が減少する一方、スプライス調節剤の不存在下では、停止コドンを含むエクソンはｍＲＮＡに存在せず、目的の分子の発現が増加する。したがって、そのような態様は、スプライス調節剤の存在が目的の分子の発現を「オフ」にする（例えば、減少させる）ため、本明細書では「オフスイッチ」ミニ遺伝子と呼ばれる。
理論に拘束されるものではないが、本明細書では、ベクターは、限定されたコード化能力を有し得る（すなわち、機能的であるために、それらのサイズは、限定され得る）ことが認識される。したがって、２０００未満、１９００未満、１８００未満、１７００未満、１６００未満、１５００未満、１４００未満、１３００未満、１２００未満、１１００未満、１０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満又は５００未満のヌクレオチドを含むミニ遺伝子が本明細書で企図される。約２５００～約５００ヌクレオチド、例えば約２０００～約６００ヌクレオチド、例えば約１５００～約７００ヌクレオチド、例えば約１２００～約８００ヌクレオチド、例えば約１１００～約９００ヌクレオチドを含むミニ遺伝子も本明細書で企図される。理論に拘束されるものではないが、そのような長さを有するミニ遺伝子は、導入遺伝子を含むベクターに含まれ得、得られるベクターは、例えば、宿主細胞において機能するのに適切なサイズである。実施形態において、ミニ遺伝子の配列は、ヒト起源のものであるか又はヒト起源の配列に由来する。スライス調節剤結合配列を含むと同定されたヒト起源の参照配列が、本明細書で企図される長さよりも長い場合、そのような配列は、例えば、イントロン又はエクソン配列を欠失させることなどによって短縮され得る。
実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、さらに改変され得る。このような変更は、ミニ遺伝子の１つ以上の性質を改善するように設計されている。例えば、ヒトゲノム配列に由来する配列は、ミニ遺伝子に含まれ得、さらに改変されて、１つ以上の開始コドン（例えば、ＡＴＧ配列）を変異させるか又は除去するか；全ての不要な潜在的スプライスアクセプター又はスプライスドナー配列を除去するか又は変異させるか；１つ以上、例えば２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＧＡＡリピート（配列番号１０１）を含む（例えば、ＧＡＡＧＡＡＧＡＡ：配列番号６９を含む）か；コザック配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ：配列番号７０のコザック配列）を含むか；又はそれらの改変の任意の組み合わせが行われ得る。
スプライス調節剤結合配列
本発明の態様は、スプライス調節剤結合配列を含む少なくとも１つのエクソンを含むミニ遺伝子を含む。一態様において、スプライス調節剤結合配列は、ミニ遺伝子のエクソンの’３末端又はその近傍に配置される。一態様において、スプライス調節剤結合配列は、ミニ遺伝子のエクソンの’３末端に配置される。一態様において、スプライス調節剤結合部位は、ヒトゲノムの配列に由来する。本明細書に記載の方法は、例えば、実施例において、スプライス調節剤によって認識されるスプライス調節剤結合部位を同定するために使用される。以下の表１は、エクソンの’３末端にスプライス調節剤結合部位（例えば、配列ＡＧＡ）を含むエクソンの例示的な配列を列挙する。そのようなスプライス調節剤結合配列は、ＬＭＩ０７０などの本明細書に記載のスプライス調節剤によって認識される。図２は、ＳＮＸ７に由来するミニ遺伝子の設計を示す。
Figure 2022541070000004
配列番号８０は、配列番号１を含むｓｎｘ７遺伝子座のエクソン８及び９の間に位置する、スプライス調節剤結合部位を含む潜在的エクソンの全長ゲノム配列（１４４ｎｔ）である。
Figure 2022541070000005
配列番号１６は、配列番号８０に由来し、ＯＲＦでフレームシフトを作製するように改変され、発現の漏れを避けるために開始コドンが除去されている。
Figure 2022541070000006
実施形態において、ミニ遺伝子は、配列番号１～配列番号１０又は配列番号８０のいずれか１つに由来するエクソン配列、例えば第２のエクソン配列を含む。実施形態において、ミニ遺伝子のエクソン、例えば第２のエクソンは、配列番号１～配列番号１０又は配列番号８０のいずれか１つを含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号１又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号１のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％を含む配列番号１のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号２又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号２のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％を含む配列番号２のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号３又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号３のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％を含む配列番号３のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号４又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号４のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％を含む配列番号４のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号５又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号５のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％を含む配列番号５のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号６又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号６のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％を含む配列番号６のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号７又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号７のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％を含む配列番号７のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号８又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号８のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％を含む配列番号８のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号９又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号９のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％を含む配列番号９のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号１０又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号１０のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％を含む配列番号１０のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号８０又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号８０のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％を含む配列番号８０のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のミニ遺伝子は、配列番号１６又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；或いは配列番号１６のヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％を含む配列番号１６のフラグメントを含むか又はそれからなるエクソン、例えば第２のエクソンを含む。実施形態において、第２のエクソンは、配列番号１６からなる。
いくつかの実施形態において、第２のエクソンは、３ｎ－１ヌクレオチドからなるように改変され、ｎは、任意の整数であり、その結果、ｍＲＮＡに第２のエクソンを含めると、第２のエクソンを含まないｍＲＮＡに対してフレームシフトが生じる。
スプライス調節剤
「スプライス調節剤」は、用語が本明細書で使用される場合、選択的スプライシングを媒介することができる化合物を指す。例示的な実施形態において、スプライス調節剤は、ｍＲＮＡ産物におけるエクソンの包含を調節する（例えば、増加させる）。例示的な実施形態において、スプライス調節剤は、スプライス調節剤結合配列（例えば、配列ＡＧＡ、例えば改変されたエクソンの３’末端の配列ＡＧＡ）に結合することにより、ｍＲＮＡ産物におけるエクソンの包含を調節する（例えば、増加させる）。
本発明の態様において、スプライス調節剤は、本明細書に記載の化合物である。第１のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（Ｉ）：
Figure 2022541070000007
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ａ’は、Ｃ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１、２又は３個の置換基で置換されたフェニルであり、ここで、２つのＣ１～Ｃ４アルキル基は、それらが結合している原子と組み合わさって５～６員環を形成し得、オキソ、オキシム及びヒドロキシ、ハロＣ１～Ｃ４アルキル、ジハロＣ１～Ｃ４アルキル、トリハロＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ－Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ハロＣ１～Ｃ４アルコキシ、ジハロＣ１～Ｃ４アルコキシ、トリハロＣ１～Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロゲン、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヘテロアリール、ヒドロキシで置換されたＣ１～Ｃ４アルキル及びアリール、アミノ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ１～Ｃ４アルキル－ヘテロアリール、－ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ４アルキル－ヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ－ヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルＮＨＣ（Ｏ）－ヘテロアリール、３～７員のシクロアルキル、５～７員のシクロアルケニル又はＳ、Ｏ及びＮから独立して選択される１又は２個のヘテロ原子を含む５、６又は９員の複素環で置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される０又は１個の置換基で置換され、ここで、ヘテロアリールは、５、６又は９個の環原子、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を有し、オキソ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキル－ＯＨ、トリハロＣ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－ＮＨ２、－ＮＯ２、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、４～７員の複素環Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されているか；又はＡ’は、１～３個の環窒素原子を有する６員のヘテロアリールであり、ここで、６員のヘテロアリールは、フェニル又は５若しくは６個の環原子、Ｎ、Ｏ及びＳから独立して選択される１若しくは２個の環ヘテロ原子を有するヘテロアリールで置換され、Ｃ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されているか；又はＡ’は、９～１０個の環原子及びＮ、Ｏ又はＳから独立して選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を有する二環式ヘテロアリールであり、ここで、二環式ヘテロアリールは、オキソ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換され；Ｂは、式：
Figure 2022541070000008
の基であり、式中、ｍ、ｎ及びｐは、０又は１から独立して選択され；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ５及びＲ６は、水素及びフッ素から独立して選択されるか；又はＲ及びＲ３は、組み合わさって、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される０又は１個のさらなる環ヘテロ原子を有する５又は６員の縮合複素環を形成し；Ｒ１及びＲ３は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ１及びＲ５は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ３及びＲ４は、それらが結合する炭素原子と組み合わさって、スピロ環状Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルを形成し；Ｘは、ＣＲＡ’ＲＢ’、ＮＲ７又は結合であり；Ｒ７は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであり；ＲＡ’及びＲＢ’は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、又はＲＡ’及びＲＢ’は、組み合わさって、２価のＣ２～Ｃ５アルキレン基を形成し；Ｚは、ＣＲ８又はＮであり；ＺがＮの場合、Ｘは結合であり；Ｒ８は、水素であるか、又はＲ６と組み合わさって二重結合を形成するか；又はＢは、式：
Figure 2022541070000009
の基であり、式中、Ｙは、Ｃ又はＯであり、ＹがＯの場合、Ｒ１１及びＲ１２はどちらも不存在であり；ｐ及びｑは、０、１及び２からなるグループから独立して選択され；Ｒ９及びＲ１３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され；Ｒ１０及びＲ１４は、水素、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ並びにＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ１１は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノであり；Ｒ１２は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであるか；又はＲ９及びＲ１１は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成するか；又はＲ１１及びＲ１２は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成する。
第２のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１のスプライス調節剤の態様による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａ’は、
Figure 2022541070000010
Figure 2022541070000011
Figure 2022541070000012
Figure 2022541070000013
Figure 2022541070000014
から選択される。
第３のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＩＩ）：
Figure 2022541070000015
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｙは、Ｎ又はＣ－Ｒａであり；Ｒａは、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであり；Ｒｂは、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロゲン、トリハロＣ１～Ｃ４アルキル又はトリハロＣ１～Ｃ４アルコキシであり；Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、トリハロＣ１～Ｃ４アルキル、トリハロＣ１～Ｃ４アルコキシ又はヘテロアリールであり；Ａは、１～３個の環窒素原子を有する６員のヘテロアリールであり、ここで、６員のヘテロアリールは、オキソ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されているか；又はＡは、Ｎ、Ｏ及びＳから独立して選択される１～３個の環ヘテロ原子を有する５員のヘテロアリールであり、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されているか；又はＡ及びＲｃは、それらが結合している原子と共に、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから独立して選択される０、１又は２個の置換基を有する６員のアリールを形成し；Ｂは、式：
Figure 2022541070000016
の基であり、式中、ｍ、ｎ及びｐは、０又は１から独立して選択され；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ５及びＲ６は、水素及びフッ素から独立して選択されるか；又はＲ及びＲ３は、組み合わさって、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される０又は１個のさらなる環ヘテロ原子を有する５又は６員の縮合複素環を形成し；Ｒ１及びＲ３は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ１及びＲ５は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ３及びＲ４は、それらが結合する炭素原子と組み合わさって、スピロ環状Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルを形成し；Ｘは、ＣＲＡ’ＲＢ’、ＮＲ７又は結合であり；Ｒ７は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであり；ＲＡ’及びＲＢ’は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、又はＲＡ’及びＲＢ’は、組み合わさって、２価のＣ２～Ｃ５アルキレン基を形成し；Ｚは、ＣＲ８又はＮであり；ＺがＮの場合、Ｘは結合であり；Ｒ８は、水素であるか、又はＲ６と組み合わさって二重結合を形成するか；又はＢは、式：
Figure 2022541070000017
の基であり、式中、ｐ及びｑは、０、１及び２からなるグループから独立して選択され；Ｒ９及びＲ１３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され；Ｒ１０及びＲ１４は、水素、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ並びにＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ１１は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノであり；Ｒ１２は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであるか；又はＲ９及びＲ１１は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成するか；又はＲ１１及びＲ１２は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成する。
第４のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３のスプライス調節剤の態様による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、１～３個の環窒素原子を有する６員のヘテロアリールであり、ここで、６員のヘテロアリールは、オキソ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されている。
第５のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３又は第４のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、
Figure 2022541070000018
から選択される。
第６のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３のスプライス調節剤の態様による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、Ｎ、Ｏ及びＳから独立して選択される１～３個の環ヘテロ原子を有する５員のヘテロアリールであり、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されている。
第７のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３又は第６のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、
Figure 2022541070000019
から選択される。
第８のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１～第７のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、式：
Figure 2022541070000020
の基であり、式中、ｍ、ｎ及びｐは、０又は１から独立して選択され；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ５及びＲ６は、水素であるか；又はＲ及びＲ３は、組み合わさって、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される０又は１個のさらなる環ヘテロ原子を有する５又は６員の縮合複素環を形成し；Ｒ１及びＲ３は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ１及びＲ５は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ３及びＲ４は、それらが結合する炭素原子と組み合わさって、スピロ環状Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルを形成し；Ｘは、ＣＲＡ’ＲＢ’、Ｏ、ＮＲ７又は結合であり；ＲＡ’及びＲＢ’は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、又はＲＡ’及びＲＢ’は、組み合わさって、２価のＣ２～Ｃ５アルキレン基を形成し；Ｚは、ＣＲ８又はＮであり；ＺがＮの場合、Ｘは結合であり；Ｒ８は、水素であるか、又はＲ６と組み合わさって二重結合を形成する。
第９のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１～第７のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、式：
Figure 2022541070000021
の基であり、式中、ｐ及びｑは、０、１及び２からなるグループから独立して選択され；Ｒ９及びＲ１３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され；Ｒ１０及びＲ１４は、水素、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ並びにＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ１１は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノであり；Ｒ１２は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであるか；又はＲ９及びＲ１１は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成するか；又はＲ１１及びＲ１２は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成する。
第１０のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＩＩＩ）：
Figure 2022541070000022
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｂは、水素又はヒドロキシであり；Ｒｃは、水素又はハロゲンであり；Ｒｄは、ハロゲンである。
第１１のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＩＶ）：
Figure 2022541070000023
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｂは、ヒドロキシル、メトキシ、トリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシである。
第１２のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（Ｖ）：
Figure 2022541070000024
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｂは、ヒドロキシル、メトキシ、トリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシであり；Ｒｅは、水素、ヒドロキシ又はメトキシである。
第１３のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３～第９又は第１１～第１２のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｙは、Ｎである。
第１４のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３～第９又は第１１～第１２のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｙは、ＣＨである。
第１５のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１～第８又は第１０～第１４のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、
Figure 2022541070000025
から選択され、式中、Ｚは、ＮＨ又はＮ（Ｍｅ）である。
第１６のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１～第８又は第１０～第１５のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、
Figure 2022541070000026
である。
第１７のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１～第７又は第９～第１４のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、
Figure 2022541070000027
から選択される。
第１８のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１～第７又は第９～第１４又は第１７のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、
Figure 2022541070000028
である。
第１９のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＶＩ）：
Figure 2022541070000029
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ａは、９又は１０個の環原子及び１又は２個の環Ｎ原子及び０又は１個のＯ原子を有する二環式ヘテロアリール又は複素環であり、ここで、二環式ヘテロアリール又は複素環は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｃ１～Ｃ４アルキル、アリール、オキソ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから独立して選択される０、１、２、３、４又は５個の置換基で置換され；Ｂは、式：
Figure 2022541070000030
の基であり、式中、ｍ、ｎ及びｐは、０又は１から独立して選択され；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ５及びＲ６は、水素及びフッ素から独立して選択されるか；又はＲ及びＲ３は、組み合わさって、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される０又は１個のさらなる環ヘテロ原子を有する５又は６員の縮合複素環を形成し；Ｒ１及びＲ３は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ１及びＲ５は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ３及びＲ４は、それらが結合する炭素原子と組み合わさって、スピロ環状Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルを形成し；Ｘは、ＣＲＡＲＢ、Ｏ、ＮＲ７又は結合であり；Ｒ７は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであり；ＲＡ及びＲＢは、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、又はＲＡ及びＲＢは、組み合わさって、２価のＣ２～Ｃ５アルキレン基を形成し；Ｚは、ＣＲ８又はＮであり；ＺがＮの場合、Ｘは結合であり；Ｒ８は、水素であるか、又はＲ６と組み合わさって二重結合を形成するか；又はＢは、式：
Figure 2022541070000031
の基であり、式中、ｐ及びｑは、０、１及び２からなるグループから独立して選択され；Ｒ９及びＲ１３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され；Ｒ１０及びＲ１４は、水素、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ並びにＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ１１は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノであり；Ｒ１２は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであるか；又はＲ９及びＲ１１は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成するか；又はＲ１１及びＲ１２は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成する。
第２０のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＶＩＩ）：
Figure 2022541070000032
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ａは、１０個の環原子及び１又は２個の環Ｎ原子を有する二環式ヘテロアリールであり、ここで、二環式ヘテロアリールは、オキソ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換され；Ｂは、式：
Figure 2022541070000033
の基であり、式中、ｍ、ｎ及びｐは、０又は１から独立して選択され；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ５及びＲ６は、水素及びフッ素から独立して選択されるか；又はＲ及びＲ３は、組み合わさって、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される０又は１個のさらなる環ヘテロ原子を有する５又は６員の縮合複素環を形成し；Ｒ１及びＲ３は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ１及びＲ５は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ３及びＲ４は、それらが結合する炭素原子と組み合わさって、スピロ環状Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルを形成し；Ｘは、ＣＲＡＲＢ、Ｏ、ＮＲ７又は結合であり；Ｒ７は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであり；ＲＡ及びＲＢは、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、又はＲＡ及びＲＢは、組み合わさって、２価のＣ２～Ｃ５アルキレン基を形成し；Ｚは、ＣＲ８又はＮであり；ＺがＮの場合、Ｘは結合であり；Ｒ８は、水素であるか、又はＲ６と組み合わさって二重結合を形成するか；又はＢは、式：
Figure 2022541070000034
の基であり、式中、ｐ及びｑは、０、１及び２からなるグループから独立して選択され；Ｒ９及びＲ１３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され；Ｒ１０及びＲ１４は、水素、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ並びにＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ１１は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノであり；Ｒ１２は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであるか；又はＲ９及びＲ１１は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成するか；又はＲ１１及びＲ１２は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成する。
第２１のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９又は第２０のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、
Figure 2022541070000035
から選択され、式中、ｕ及びｖは、それぞれ独立して、０、１、２又は３であり；Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される。
第２２のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９～第２１のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、
Figure 2022541070000036
から選択され、式中、ｕ及びｖは、それぞれ独立して、０、１、２又は３であり；Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される。
別のスプライス調節剤の態様において、第１９～第２２のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩が提供され、ここで、Ａは、オルト位がヒドロキシル基で置換されている。
第２３のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９～第２２のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、
Figure 2022541070000037
から選択される。
第２４のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９～第２３のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、単一のＮ原子を有する。
第２５のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＶＩＩＩ）：
Figure 2022541070000038
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される。
第２６のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＩＸ）：
Figure 2022541070000039
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される。
第２７のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（Ｘ）：
Figure 2022541070000040
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される。
第２８のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＸＩ）：
Figure 2022541070000041
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される。
第２９のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＸＩＩ）：
Figure 2022541070000042
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される。
第３０のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＸＩＩＩ）：
Figure 2022541070000043
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される。
第３１のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＸＩＶ）：
Figure 2022541070000044
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロシクリルＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキルアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルキルヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシアリール、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロシクリル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシヘテロアリール並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される。
第３２のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９～第３１のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、式：
Figure 2022541070000045
の基であり、式中、ｍ、ｎ及びｐは、０又は１から独立して選択され；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ５及びＲ６は、水素であるか；又はＲ及びＲ３は、組み合わさって、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される０又は１個のさらなる環ヘテロ原子を有する５又は６員の縮合複素環を形成し；Ｒ１及びＲ３は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ１及びＲ５は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ３及びＲ４は、それらが結合する炭素原子と組み合わさって、スピロ環状Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルを形成し；Ｘは、ＣＲＡＲＢ、Ｏ、ＮＲ７又は結合であり；ＲＡ及びＲＢは、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、又はＲＡ及びＲＢは、組み合わさって、２価のＣ２～Ｃ５アルキレン基を形成し；Ｚは、ＣＲ８又はＮであり；ＺがＮの場合、Ｘは結合であり；Ｒ８は、水素であるか、又はＲ６と組み合わさって二重結合を形成する。
第３３のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９～第３２のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、式：
Figure 2022541070000046
の基であり、式中、ｐ及びｑは、０、１及び２からなるグループから独立して選択され；Ｒ９及びＲ１３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され；Ｒ１０及びＲ１４は、水素、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ並びにＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ１１は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノであり；Ｒ１２は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであるか；又はＲ９及びＲ１１は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成するか；又はＲ１１及びＲ１２は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成する。
第３４のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９～第３３のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、
Figure 2022541070000047
からなる群から選択され、式中、Ｘは、Ｏ又はＮ（Ｍｅ）又はＮＨであり；Ｒ１７は、水素又はメチルである。
第３５のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９～第３４のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、
Figure 2022541070000048
である。
第３６のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９～第３５のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｘは、－Ｏ－である。
第３７のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第１９～第３６のスプライス調節剤の態様のいずれか１つによる化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｘは、Ｎ（Ｍｅ）である。
第３８のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＸＶ）：
Figure 2022541070000049
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ａは、Ｃ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１、２又は３個の置換基で置換された２－ヒドロキシフェニルであり、ここで、２つのＣ１～Ｃ４アルキル基は、それらが結合している原子と組み合わさって５～６員環を形成し得、オキソ、オキシム及びヒドロキシ、ハロＣ１～Ｃ４アルキル、ジハロＣ１～Ｃ４アルキル、トリハロＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ－Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、ハロＣ１～Ｃ４アルコキシ、ジハロＣ１～Ｃ４アルコキシ、トリハロＣ１～Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロゲン、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヘテロアリール、ヒドロキシで置換されたＣ１～Ｃ４アルキル、アリール、アミノ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ１～Ｃ４アルキル－ヘテロアリール、－ＮＨＣ（Ｏ）－Ｃ１～Ｃ４アルキル－ヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルＣ（Ｏ）ＮＨ－ヘテロアリール、Ｃ１～Ｃ４アルキルＮＨＣ（Ｏ）－ヘテロアリール、３～７員のシクロアルキル、５～７員のシクロアルケニル又はＳ、Ｏ及びＮから独立して選択される１又は２個のヘテロ原子を含む５、６又は９員の複素環で置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから選択される０又は１個の置換基で置換され、ここで、ヘテロアリールは、５、６又は９個の環原子、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を有し、オキソ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキル－ＯＨ、トリハロＣ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－ＮＨ２、－ＮＯ２、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、４～７員の複素環Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されているか；又はＡは、３位がヒドロキシで任意選択により置換され、ヒドロキシ、シアノ、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ１－Ｃ５アルコキシ、から選択される０、１又は２個の置換基でさらに置換された、２－ナフチルであり、ここで、アルコキシは、非置換であるか又はヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）２Ｃ１～Ｃ４アルキル、アルキレン４～７員複素環、４～７員複素環並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ａは、１～３個の環窒素原子を有する６員のヘテロアリールであり、ここで、６員のヘテロアリールは、フェニル又は５若しくは６個の環原子、Ｎ、Ｏ及びＳから独立して選択される１若しくは２個の環ヘテロ原子を有するヘテロアリールで置換され、Ｃ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されているか；又はＡは、９～１０個の環原子及びＮ、Ｏ又はＳから独立して選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を有する二環式ヘテロアリールであり、ここで、二環式ヘテロアリールは、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されているか；又はＡは、１２又は１３個の環原子及びＮ、Ｏ又はＳから独立して選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を有する三環式ヘテロアリールであり、ここで、三環式ヘテロアリールは、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びヘテロアリールで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換され、ここで、前記ヘテロアリールは、５、６又は９個の環原子、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を有し、オキソ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキル－ＯＨ、トリハロＣ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－ＮＨ２、－ＮＯ２、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、４～７員の複素環Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換され；Ｂは、式：
Figure 2022541070000050
の基であり、式中、ｍ、ｎ及びｐは、０又は１から独立して選択され；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ５及びＲ６は、水素及びフッ素から独立して選択されるか；又はＲ及びＲ３は、組み合わさって、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される０又は１個のさらなる環ヘテロ原子を有する５又は６員の縮合複素環を形成し；Ｒ１及びＲ３は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ１及びＲ５は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ３及びＲ４は、それらが結合する炭素原子と組み合わさって、スピロ環状Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルを形成し；Ｘは、ＣＲＡＲＢ、Ｏ、ＮＲ７又は結合であり；Ｒ７は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであり；ＲＡ及びＲＢは、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、又はＲＡ及びＲＢは、組み合わさって、２価のＣ２～Ｃ５アルキレン基を形成し；Ｚは、ＣＲ８又はＮであり；ＺがＮの場合、Ｘは結合であり；Ｒ８は、水素であるか、又はＲ６と組み合わさって二重結合を形成するか；又はＢは、式：
Figure 2022541070000051
の基であり、式中、ｐ及びｑは、０、１及び２からなるグループから独立して選択され；Ｒ９及びＲ１３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され；Ｒ１０及びＲ１４は、水素、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ並びにＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ１１は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノであり；Ｒ１２は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであるか；又はＲ９及びＲ１１は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成するか；又はＲ１１及びＲ１２は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成する。
第３９のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３８のスプライス調節剤の態様による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、１～３個の環窒素原子を有する６員のヘテロアリールであり、ここで、６員のヘテロアリールは、フェニル又は５若しくは６個の環原子、Ｎ、Ｏ及びＳから独立して選択される１若しくは２個の環ヘテロ原子を有するヘテロアリールで置換され、Ｃ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されているか；又はＡは、９～１０個の環原子及びＮ、Ｏ又はＳから独立して選択される１、２又は３個の環ヘテロ原子を有する二環式ヘテロアリールであり、ここで、ヘテロアリールは、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルキニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ並びにヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、モノ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルコキシから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されている。
第４０のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３８のスプライス調節剤の態様による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、Ｃ１～Ｃ４アルキル、ハロＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、ヒドロキシ、シアノ、ハロゲン、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヘテロアリール並びにヒドロキシ又はアミノで置換されたＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１、２又は３個の置換基で置換された２－ヒドロキシフェニルであり、ここで、ヘテロアリールは、５又は６個の環原子、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１又は２個の環ヘテロ原子を有し、Ｃ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、４～７員複素環Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択される０、１又は２個の置換基で置換されている。
第４１のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３８のスプライス調節剤の態様による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは、３位がヒドロキシで任意選択により置換され、ヒドロキシ、シアノ、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、から選択される０、１又は２個の置換基でさらに置換された、２－ナフチルであり、ここで、アルコキシは、非置換であるか又はヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、アミノ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）２Ｃ１～Ｃ４アルキル、４～７員複素環並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換されている。
第４２のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３８～第４１のスプライス調節剤の態様による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、式：
Figure 2022541070000052
の基であり、式中、ｍ、ｎ及びｐは、０又は１から独立して選択され；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ５及びＲ６は、水素であるか；又はＲ及びＲ３は、組み合わさって、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される０又は１個のさらなる環ヘテロ原子を有する５又は６員の縮合複素環を形成し；Ｒ１及びＲ３は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ１及びＲ５は、組み合わさって、Ｃ１～Ｃ３アルキレン基を形成し；Ｒ３及びＲ４は、それらが結合する炭素原子と組み合わさって、スピロ環状Ｃ３～Ｃ６シクロアルキルを形成し；Ｘは、ＣＲＡＲＢ、Ｏ、ＮＲ７又は結合であり；ＲＡ及びＲＢは、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択されるか、又はＲＡ及びＲＢは、組み合わさって、２価のＣ２～Ｃ５アルキレン基を形成し；Ｚは、ＣＲ８又はＮであり；ＺがＮの場合、Ｘは結合であり；Ｒ８は、水素であるか、又はＲ６と組み合わさって二重結合を形成する。
第４３のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３８～第４１のスプライス調節剤の態様による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ｂは、式：
Figure 2022541070000053
の基であり、式中、ｐ及びｑは、０、１及び２からなるグループから独立して選択され；Ｒ９及びＲ１３は、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され；Ｒ１０及びＲ１４は、水素、アミノ、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ並びにＣ１～Ｃ４アルキルから独立して選択され、ここで、アルキルは、任意選択により、ヒドロキシ、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノで置換され；Ｒ１１は、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノ又はモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノであり；Ｒ１２は、水素又はＣ１～Ｃ４アルキルであるか；又はＲ９及びＲ１１は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成するか；又はＲ１１及びＲ１２は、組み合わさって、１～３個のＣ１～Ｃ４アルキル基で任意選択により置換された、４～７個の環原子を有する飽和アザ環を形成する。
第４４のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＸＶＩ）：
Figure 2022541070000054
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒ１５は水素、ヒドロキシル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシであり、ここで、アルコキシは、任意選択により、ヒドロキシ、メトキシ、アミノ、モノ及びジメチルアミノ又はモルホリンで置換されている。
第４５のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＸＶＩＩ）：
Figure 2022541070000055
による化合物又はその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒ１６は、１つの環窒素原子及びＮ、Ｏ又はＳから選択される０又は１個のさらなる環ヘテロ原子を有する５員のヘテロアリールであり、ここで、ヘテロアリールは、任意選択により、Ｃ１～Ｃ４アルキルで置換されている。
第４６のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３８～第４１、第４４及び第４５のスプライス調節剤の態様による化合物であり、ここで、Ｂは、
Figure 2022541070000056
からなる群から選択され、式中、Ｘは、Ｏ又はＮ（Ｍｅ）であり；Ｒ１７は、水素又はメチルである。
第４７のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３８～第４２、第４４～第４５のスプライス調節剤の態様による化合物であり、ここで、Ｘは、－Ｏ－である。
第４８のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第３８～第４２、第４４～第４５のスプライス調節剤の態様による化合物であり、ここで、Ｂは、
Figure 2022541070000057
である。
第４９のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、第４５～第４８のスプライス調節剤の態様による化合物であり、ここで、Ｒ１６は、
Figure 2022541070000058
である。
第５０のスプライス調節剤の態様において、スプライス調節剤は、式（ＸＶＩＩＩ）：
Figure 2022541070000059
による化合物又はその薬学的に許容される塩を提供し、式中、Ｘは、－Ｏ－又は
Figure 2022541070000060
であり；Ｒ’は、オキソ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルケニル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキル－ＯＨ、トリハロＣ１～Ｃ４アルキル、モノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノ、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－ＮＨ２、－ＮＯ２、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキルアミノ、ヒドロキシＣ１～Ｃ４アルキル、４～７員の複素環Ｃ１～Ｃ４アルキル、アミノＣ１～Ｃ４アルキル並びにモノ－及びジ－Ｃ１～Ｃ４アルキルアミノＣ１～Ｃ４アルキルから選択される０、１又は２個の基で任意選択により置換された、５員のヘテロアリールである。
特定の実施形態において、スプライス調節剤は、以下の構造
Figure 2022541070000061
を有する５－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－２－（６－（（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－４－イル）オキシ）ピリダジン－３－イル）フェノール（ＬＭＩ０７０；ブラナプラム）又はその薬学的に許容される塩である。
特定の実施形態において、スプライス調節剤は、スプライス調節剤２であり、ここで、化合物は、以下の構造
Figure 2022541070000062
を有する７－（６－（メチル（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－４－イル）アミノ）ピリダジン－３－イル）イソキノリン－６－オール又はその薬学的に許容される塩である。
さらなるスプライス調節剤及びそれらの調節剤によって結合されるスプライス調節剤結合配列は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００８３４９５号明細書、国際公開第２０１４／０２８４５９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１７５８９号パンフレット、国際公開第２０１４／１１６８４５号パンフレット、国際公開第２０１７／１００７２６号パンフレット、国際公開第２０１８／０９８４４６号パンフレット、国際公開第２０１８／２２６６２２号パンフレット、国際公開第２０１９／００５９９３号パンフレット、国際公開第２０１９／００５９８０号パンフレット及び国際公開第２０１９０２８４４０号パンフレットに記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に記載のスプライス調節剤及びスプライス調節剤結合配列は、本明細書に記載の方法、ミニ遺伝子並びに他の態様及び実施形態での使用が企図されている。
切断部位
一態様において、本発明の核酸分子は、切断部位をコードする１つ以上の配列を含み、これは、導入遺伝子によってコードされる配列（例えば、目的のタンパク質）からミニ遺伝子によってコードされる配列（例えば、全ての配列又は実質的に全ての配列）を切断する機能を果たす。一態様において、切断部位は、自己切断部位、プロテアーゼ切断部位又はそれらの任意の組み合わせのいずれかであり得る。切断部位は、目的のタンパク質からミニ遺伝子の１つ以上のエクソンによってコードされる配列を切断するのに十分なレベルで（組換え発現又は内因性発現のいずれかによって）目的の細胞において発現される、任意の部位特異的プロテアーゼによって切断されるように設計することができる。本発明の重要な態様において、プロテアーゼ切断部位は、目的のタンパク質の発現に関連する細胞コンパートメントに存在するように、天然に（又は細胞工学により）プロテアーゼに対応するように選択される。すなわち、プロテアーゼの細胞内輸送は、目的のタンパク質の細胞内輸送と重複するか、又は部分的に重複するはずである。例えば、目的のタンパク質が細胞表面にある場合、それを切断する酵素を細胞に外因的に加えることができる。
目的のタンパク質がエンドソーム／リソソーム系に存在するか又はそれを通過する場合、これらのコンパートメントに存在する酵素のプロテアーゼ切断部位を使用できる。そのようなプロテアーゼ／コンセンサスモチーフには、例えば、以下が含まれる。
フューリン：ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ１
フューリン：ＲＮＲＲ（配列番号３９）
ＰＣＳＫ１：ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ
ＰＣＳＫ５：ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ
ＰＣＳＫ６：ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ
ＰＣＳＫ７：ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ
カテプシンＢ：ＲＲＸ
グランザイムＢ：Ｉ－Ｅ－Ｐ－Ｄ－Ｘ（配列番号３５）
第ＸＡ因子：Ｉｌｅ－Ｇｌｕ／Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ
エンテロキナーゼ：Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号３６）
ジェネナーゼ：Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ（配列番号３７）
ソルターゼ：ＬＰＸＴＧ／Ａ
ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ：Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（配列番号３８）
トロンビン：Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４０）
ＴＥＶプロテアーゼ：Ｅ－Ｎ－Ｌ－Ｙ－Ｆ－Ｑ－Ｇ（配列番号４１）
エラスターゼ１［ＡＧＳＶ］－ｘ（配列番号４２）
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は、フューリン切断部位をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、表２０に列挙されているフューリン切断部位のいずれか１つをコードする配列を含む。実施形態において、フューリン切断部位は、配列番号３９である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、配列番号３９を含むか又はそれからなるフューリン切断部位をコードする配列を含み、例えば、切断部位をコードする配列は、配列番号１９を含むか又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；ＲＴＫＲ（配列番号４３）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号４５）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号４７）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号４９）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号５１）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号５３）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号５５）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；又はＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号５７）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列から選択されるフューリン切断部位をコードする配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）；ＲＴＫＲ（配列番号４３）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号４５）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号４７）；ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号４９）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号５１）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号５３）；ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号５５）；及びＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号５７）から選択されるフューリン切断部位をコードする配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）から選択されるフューリン切断部位をコードする配列又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、配列番号１９又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は、配列番号１９を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号４５）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列；又はＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号４７）又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列から選択されるフューリン切断部位をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、配列番号４６若しくは配列番号４８又はそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号４５）又はＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号４７）から選択されるフューリン切断部位をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は、配列番号４６又は配列番号４８を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧのフューリン切断部位をコードする配列（配列番号４５）を含む。
Figure 2022541070000063
いくつかの実施形態において、例えば本明細書に記載される、ミニ遺伝子及び導入遺伝子を含む核酸配列は、ペプチド切断部位（例えば、自己切断ペプチド又は細胞内プロテアーゼの基質）をコードする１つ以上の配列を含み得る。実施形態において、ペプチド切断部位をコードする配列は、ミニ遺伝子と導入遺伝子との間に配置される。自己切断ペプチド切断部位配列の例には、以下が含まれ、ここで、括弧内のＧＳＧ残基は、任意選択による。
Figure 2022541070000064
いくつかの実施形態において、核酸分子は、フューリン切断部位などのプロテアーゼ切断部位をコードする配列及び自己切断ペプチド、例えば２Ａペプチド、例えばＴ２Ａペプチドをコードする配列を含む。実施形態において、核酸は、２Ａコード配列をコードする配列の５’側にフューリン切断部位をコードする配列を含む。実施形態において、フューリン切断部位は、配列番号３９を含むか又はそれからなり、Ｔ２Ａ配列は、配列番号５９又は配列番号６１を含むか又はそれからなる。実施形態において、フューリン切断部位をコードする配列は、配列番号１９であるか又はそれを含み、ペプチド切断部位をコードする配列は、配列番号２０又は配列番号６２であるか又はそれを含む。実施形態において、２Ａ配列をコードする配列は、切断時にミニ遺伝子の１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１アミノ酸未満、フューリン切断部位及び／又は２Ａペプチドが目的のタンパク質に残るように、導入遺伝子（例えば、目的のタンパク質をコードする配列）のすぐ５’側に配置される。
プロモーター
動物又はヒトの体の全ての細胞は、同じＤＮＡを含有するが、異なる組織の異なる細胞は、一方では共通の遺伝子のセットを発現し、他方では組織のタイプ及び発達の段階に応じて変化する遺伝子のセットを発現する。理論に拘束されるものではないが、イントロンを含まない任意のプロモーターを、本明細書に記載の様々な態様及び実施形態（例えば、核酸分子）で使用することができる。本明細書に記載の様々な態様及び実施形態で使用できる例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＪｅＴプロモーター、ＰＧＫプロモーター及びニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。実施形態において、プロモーターは、複数の細胞型において活性である。他の実施形態において、プロモーターは、１つの細胞型（例えば、細胞特異的）又は例えば中枢神経組織（例えば、脳組織）などの１つの組織の細胞型（例えば、組織特異的）において活性である。実施形態において、プロモーターはニューロン特異的である。本明細書に記載の様々な態様及び実施形態で使用できるニューロン特異的プロモーターの例には、作動可能に連結されたミニ遺伝子及び導入遺伝子の発現を駆動するためにベクター及び他の核酸で使用される単離又は合成ニューロン特異的プロモーター及びその機能的フラグメント、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に由来するプロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照されたい）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照されたい）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照されたい）；ｔｈｙ－１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ，５１：７－１９；Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（１０）：１１６１－１１６６を参照されたい）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照されたい）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１６：４３７；Ｓａｓａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１６：２７４；Ｂｏｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８：９９８９；及びＫａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ，６：５８３－５９４を参照されたい）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３４０２－３４０６を参照されたい）；Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：２２３－２２６を参照されたい）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：３６４８－３６５２を参照されたい）；エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．，１７：３７９３－３８０５を参照されたい）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋－カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ－アルファ（ＣａｍＫＩＭ）プロモーター（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１３２５０；及びＣａｓａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ，３１：３７を参照されたい）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子－ｐプロモーター（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１１：５２－６０を参照されたい）；などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、最小ヒトシナプシン１プロモーター（ＳＹＮ）の一部又は全部が使用される。Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（４）：３３７－４７；Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８（８）３４３１－５；Ｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３８２：１３３－４９；ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，５７６：７３－７８；Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３１１（１）：８９－９５。
いくつかの実施形態において、組織又は細胞特異的プロモーターは、非神経細胞におけるものと比較して、神経細胞又は組織において、作動可能に連結されたミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子のより高い発現を提供するように構成される。いくつかの実施形態において、神経特異的プロモーターは、非神経細胞におけるものと比較して、神経において、作動可能に連結されたミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子のより高い発現を提供するように構成される。神経細胞又は組織の例には、ニューロン及びシュワン細胞、グリア細胞、星状細胞などを含むものが含まれる。非神経細胞の例には、肝細胞、心筋細胞、赤血球、上皮細胞などが含まれるが、これらに限定されない。作動可能に連結されたミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子のより高いレベルの発現は、ミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子の転写から産生されるＲＮＡ転写物の数の増加を含み得る。いくつかの実施形態において、産生されたＲＮＡ転写物の数は、ＰＣＲによって測定され得る。いくつかの他の実施形態において、産生されたＲＮＡ転写物の数は、ＲＴ－ＰＣＲ、例えばｑＰＣＲによって測定され得る。いくつかの実施形態において、産生されたＲＮＡ転写物の数は、配列決定によって測定され得る。いくつかの実施形態において、産生されたＲＮＡ転写物の数は、単一分子蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定され得る。いくつかの実施形態において、産生されたＲＮＡ転写物の数は、ノーザンブロット分析によって測定され得る。ミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子が目的のタンパク質をコードする場合、作動可能に連結されたミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子のより高いレベルの発現は、代替的又は追加的に、産生されるタンパク質の量の増加を含み得る。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質の量は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定され得る。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質の量は、ウエスタンブロット分析によって測定され得る。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質の量は、免疫染色によって測定され得る。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質の量は、時間分解フェルスター共鳴エネルギー転移（ＴＲ－ＦＲＥＴ）によって測定され得る。いくつかの実施形態において、産生されるタンパク質の量は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定され得る。いくつかの実施形態において、発現のレベルは、これらの又は他の方法のうちの複数によって測定される。
態様及び実施形態において、プロモーターは、配列番号１３を含むＪｅＴプロモーターである。態様及び実施形態において、プロモーターは、配列番号８６を含むヒトシナプシンプロモーターである。
ポリＡシグナル配列
様々な実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター及び他の組成物は、１つ以上のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含み得る。ポリアデニル化シグナル配列は、補助配列エレメントが隣接する中央配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。理論よって拘束されるものではないが、配列は、転写物の末端をシグナルし、ポリアデニレートポリメラーゼによってホモポリマーＡ配列が３’末端に付加される部位として機能し得る。
ＳＶ４０ポリＡ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリＡ、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ、ベータグロビンポリＡ、アルファグロビンポリＡ、オボアルブミンポリＡ、カッパ軽鎖ポリＡ及び合成ポリＡを含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知のポリアデニル化シグナル配列が企図される。ポリＡシグナル配列は、本明細書に開示される核酸及び他の組成物において使用され得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子又は核酸配列中のポリＡ配列は、配列番号２２又はその機能的フラグメントからなる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子又は核酸配列は、配列番号２２又はその機能的フラグメントに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９８又は９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子又は核酸中のポリＡ配列は、配列番号２２又はその機能的フラグメントに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９８又は９９％の同一性の配列からなる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子又は核酸配列中のポリＡ配列は、配列番号８９又はその機能的フラグメントからなる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子又は核酸配列は、配列番号８９又はその機能的フラグメントに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９８又は９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子又は核酸中のポリＡ配列は、配列番号８９又はその機能的フラグメントに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９８又は９９％の同一性の配列からなる。
転写後調節エレメント
様々な実施形態において、本明細書に開示される核酸、導入遺伝子及び他の組成物は、１つ以上の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、例えば導入遺伝子の発現を増強又は他の方法で改善することができるものを含み得る。理論に拘束されるものではないが、ＰＲＥはｍＲＮＡの安定性及び３’末端形成を可能にすることによって発現を増強し得、且つ／又はスプライシングされていないｍＲＮＡの核細胞質への輸送を促進し得る。ＰＲＥは、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）又はマイクロＲＮＡの結合部位も含み得る。
例示的なＰＲＥには、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）、コウモリウイルス（ＢＰＲＥ）、ジリスウイルス（ＧＳＰＲＥ）、ホッキョクリスウイルス（ＡＳＰＲＥ）、アヒルウイルス（ＤＰＲＥ）、チンパンジーウイルス（ＣＰＲＥ）、ウーリーモンキーウイルス（ＷＭＰＲＥ）又はウッドチャックウイルス（ＷＰＲＥ）からのＰＲＥが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、核酸又は導入遺伝子は、ＰＲＥを含む。特定の実施形態において、ＰＲＥは、ＨＰＲＥを含む。
いくつかの実施形態において、合成ＰＲＥが使用される。合成ＰＲＥの例示的な配列には、ＨＰＲＥ－ＮＯＸ配列番号８８の配列又はそのフラグメントが含まれる。いくつかの実施形態において、ＰＲＥは、プロモーターエレメントの下流（又は３’）に配置され得る。
例示的なＰＲＥには、配列番号７２を含む、例えばそれからなるＰＲＥ又はそのフラグメントも含まれるが、これらに限定されない。例示的なＰＲＥには、配列番号７３を含む、例えばそれからなるＰＲＥ又はそのフラグメントも含まれるが、これらに限定されない。
Figure 2022541070000065
例示的なＰＲＥは、本明細書に記載のＰＲＥ、例えば配列番号８８、配列番号７２又は配列番号７３に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなるＰＲＥも含む。
いくつかの実施形態において、ＰＲＥは、導入遺伝子配列又はタンパク質コード配列の下流（又は３’）に配置され得る。いくつかの実施形態において、ＰＲＥは、ポリＡ配列の上流（又は５’）に配置され得る。いくつかの実施形態において、ＰＲＥは、導入遺伝子配列又はタンパク質コード配列の上流（又は５’）に配置され得る。
導入遺伝子
様々な実施形態において、本明細書に開示されるミニ遺伝子及び他の調節エレメントは、作動可能に連結された導入遺伝子の発現を調節するために使用され得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、抗体又は機能的結合フラグメント、受容体、酵素などのタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲなどにおける使用のためのｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡなどの治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、複数の導入遺伝子が使用され得る（例えば、核酸又はベクターは、治療上の利益を提供する複数のタンパク質又はＲＮＡをコードし得る）。細胞内のこれらの機能的ポリペプチド又は核酸のレベルを増加させる方法の例には、例えば、本明細書に開示される核酸又はベクター、例えばＡＡＶウイルスベクターにおける、目的のポリペプチドをコードする核酸配列のトランスフェクション又は形質導入が含まれる。
ｉ．タンパク質
様々な実施形態において、本明細書に開示されるミニ遺伝子及び他の調節エレメントは、ポリペプチドの発現を調節する（例えば、スプライス調節剤の存在下又は非存在下で、オン又はオフにする）ために使用され得る。理論に拘束されるものではないが、ポリペプチドのレベルの増加は、対象患者の組織において発現が減少又は欠落しているポリペプチドを提供することによって治療効果を提供し得る。理論に拘束されるものではないが、例えばスプライス調節剤の適用又は中止により、発現のタイミング又は位置を制御することは、それが望まれるときにのみ発現を確実にすることによってそのような治療用タンパク質の有効性及び／又は安全性を改善し得る。本明細書に記載のミニ遺伝子によって調節され得る例示的なポリペプチドには、スーパーオキシドジスムターゼ、芳香族酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）、Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮ）又はＭｅＣＰ２、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、ＣＬＮ４、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７及びＣＬＮ８から選択される治療用タンパク質又は脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）（任意選択によりＳＣＡ１～ＳＣＡ２９のいずれか）に関連するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、本明細書に開示されるミニ遺伝子及び他の調節エレメントは、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）の発現を調節するために使用され得る。理論に拘束されるものではないが、ニューロンにおける機能的ＰＲＧＮポリペプチドのレベルの増加は、例えば、ＦＴＤの処置において、治療効果を提供し得る。理論に拘束されるものではないが、ＰＧＲＮは、典型的には、遍在的に発現する８８ｋＤａの分泌糖タンパク質としてヒトで観察される。これは、ヒトグラニュリン遺伝子（ＧＲＮ）によってコードされる。プログラニュリンタンパク質をコードする例示的な核酸には、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅによって定義されるＮＧ＿００７８８６．１及びＮＭ＿００２０８７．３並びにＮＣＢＩ参照配列によって定義されるＮＣ＿００００１７．１１及びＮＣ＿００００１７．１０が含まれる。例示的なプログラニュリンポリペプチド配列には、ＮＰ＿００２０７８．１が含まれる。いくつかの実施形態において、プログラニュリンポリペプチドは、リンカー配列によって接続された希少な１２システイニルモチーフ（配列番号１０２）の高度に保存されたタンデムリピートからなる７つのグラニュリン様ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＧＲＮのペプチドフラグメント及びそれらをコードする核酸は、それらがＰＧＲＮの１つ以上の機能を保持する範囲で、ＰＧＲＮという用語に包含される。グラニュリン（ＧＲＮ）又はエピテリンを形成するためのＰＧＲＮの切断は、異なる機能を有するタンパク質を産生し得、本明細書で使用されるＰＧＲＮのフラグメントの意味の外にある。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター又は他の組成物は、ヒトタンパク質をコードする導入遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ＰＧＲＮをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ヒトプログラニュリン（ｈＰＧＲＮ）タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ｈＰＧＲＮタンパク質のコドン最適化バージョンをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、配列番号８７の配列又はその機能的フラグメント、例えばインタクトなＰＧＲＮによって提供される１つ以上の機能において検出可能な変化を提供することができるフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、配列番号８７に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％又は７０％の配列同一性（又はその間の任意のパーセンテージ）を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子によってコードされるｈＰＧＲＮは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、異種核酸配列によってコードされるｈＰＧＲＮは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％、７５％又は７０％の配列同一性を有する配列を含む。
Figure 2022541070000066
ｉｉ．ＲＮＡ
様々な実施形態において、本明細書に開示される単離された核酸、ベクター及び他の組成物は、タンパク質翻訳を必要とせずに神経組織特異的治療効果を提供する配列をコードする導入遺伝子配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるプロモーター、サイレンサー、調節エレメント及び他の核酸エレメントは、ニューロン組織又はＲＮＡのニューロン特異的発現を調節するために使用され得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、特定の治療機能を提供するリボ核酸をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ｓｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ｓｈＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ｔＲＮＡをコードする。
ｉｉｉ．抗体
様々な実施形態において、本明細書に開示されるプロモーター、サイレンサー及び他の調節エレメントは、神経組織又は抗体又はそのフラグメントのニューロン特異的発現を調節するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、抗体をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、抗体のフラグメント、例えば抗原結合能力を保持するものをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、抗体の軽鎖をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、抗体の重鎖をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ＶＨをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ＶＬをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ＶＨをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、Ｆａｂをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ｓｃＦｖをコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ニューロン特異的機能を有する酵素をコードする。
ｉｉｉ．複数の成分
様々な実施形態において、本明細書に開示されるプロモーター、サイレンサー及び他の調節エレメントは、神経組織又は複数の導入遺伝子のニューロン特異的発現を調節するために使用され得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ＲＮＡ及びポリペプチドの両方をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃＲＮＡ）をコードする。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター又は他の組成物は、ミニ遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）、ｈＰＧＲＮ、ＰＲＥ及びポリＡシグナル配列をコードする導入遺伝子配列（例えば、５’から３’の順で存在する）を含む。いくつかの実施形態において、核酸、ベクター又は他の組成物は、５’から３’まで、プロモーター、ミニ遺伝子、プロテアーゼ切断部位（例えば、フューリン切断部位）をコードする配列、自己切断ペプチド（例えば、Ｔ２Ａペプチド）をコードする配列、ｈＰＧＲＮをコードする導入遺伝子配列、ＰＲＥ及びポリＡシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸、ベクター又は他の組成物は、５’から３’まで、プロモーター、配列番号１６を含むミニ遺伝子（例えば、配列番号７１又は配列番号９４を含むか又はそれからなるミニ遺伝子）、配列番号１９を含むか又はそれからなるフューリン切断部位をコードする配列、配列番号２０を含むか又はそれからなる自己切断Ｔ２Ａペプチドをコードする配列、ＰＲＧＮ（例えば、配列番号８７）をコードする導入遺伝子、配列番号８８を含むＰＲＥ配列及びポリＡ配列（例えば、配列番号８９を含む又はそれからなるポリＡ）を含む。
前述の態様及び実施形態のいずれにおいても、企図される核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの改変されたバージョンであり得る。改変された核酸は、ポリヌクレオチド鎖の骨格、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）への改変により、天然に存在する核酸と区別され得る。改変された核酸は、４つの核酸塩基を改変した類似体も含み得る。いくつかの実施形態において、核酸は、ＰＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ＬＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、モルホリノである。いくつかの実施形態において、核酸は、一本鎖形態である。いくつかの実施形態において、核酸は、二本鎖形態である。いくつかの実施形態において、核酸は、直鎖状である。いくつかの実施形態において、核酸は、環状である。いくつかの実施形態において、核酸は、プラスミドである。
ウイルスベクター
本明細書で論じられる核酸（例えば、ミニ遺伝子、導入遺伝子、プロモーター、ＰＲＥ及びポリＡなどの他の核酸成分並びにそれらの組み合わせ）を含むベクターも本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、ベクターは、導入遺伝子を標的細胞に送達するために、且つ／又は標的細胞におけるその導入遺伝子の発現を増加させるために役立ち得る。様々な実施形態において、ベクターは、スプライス調節剤と組み合わせた使用により、タンパク質、抗体又は機能的結合フラグメント、酵素など、及び／又は核酸、例えばＣＲＩＳＰＲなどで使用するためのｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡなどの発現を調節するために使用され得る。
例えば、ベクターは、治療用タンパク質及び／又はＲＮＡをコードする導入遺伝子に連結された「オンスイッチ」ミニ遺伝子を含み得、スプライス調節剤の添加時、その導入遺伝子の発現を増加させる。他の実施形態において、ベクターは、治療用タンパク質及び／又はＲＮＡをコードする導入遺伝子に連結された「オフスイッチ」ミニ遺伝子を含み得、スプライス調節剤の添加時、その導入遺伝子の発現を減少させる。いくつかの実施形態において、ベクターは、挿入物（例えば、導入遺伝子配列の少なくとも１つのオープンリーディングフレーム）及び１つ以上のさらなるエレメントを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡ（又はそれらの混合物）配列を含み得る。ベクターは、遺伝情報を別の細胞に転送するのに役立ち得る。ベクターは、例えば、クローニングベクター又はプラスミドとして、クローニングに使用され得る。ベクターは、例えば、ヒト神経細胞における、細胞感染などの他の目的のために、発現、例えば治療用タンパク質及び／又はＲＮＡ発現を駆動するようにも特異的に設計され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸を含むベクターが企図される。ベクターは、ＤＮＡベクター、環状ベクター又はプラスミドであり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは二本鎖である。他の実施形態において、ベクターは一本鎖である。
いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、導入遺伝子配列を神経細胞又は組織に送達するために使用されるウイルスベクターである。ベクターに使用されるウイルスの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス及び他のハイブリッドウイルスが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である。
理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示されるウイルスベクターは、それらが感染する宿主細胞にそれらのゲノムを挿入して、その核酸配列を宿主に送達し得る。挿入されたウイルスゲノムは、エピソームであるか、又はランダムであるか又は標的化され得る部位で宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。一実施形態において、ベクターは、導入遺伝子配列を細胞に送達するために使用されるウイルスベクターである。ベクターに使用されるウイルスの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス及び他のハイブリッドウイルスが含まれるが、これらに限定されない。Ｗａｒｎｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７３７：１－２５。レンチウイルスは、有意な量のウイルスＤＮＡを宿主細胞に組み込むことができるレトロウイルスの属であり、遺伝子送達の効率的な方法となる。一方、アデノウイルスは、宿主細胞の染色体に組み込まれていない遺伝物質を導入するため、宿主細胞を破壊するリスクが減少する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である。
いくつかの実施形態において、導入遺伝子を含むベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であるか又はそれに由来する。いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）である。ｒＡＡＶゲノムは、ポリペプチド（ｈＰＧＲＮポリペプチドを含むが、これらに限定されない）をコードするか、又は変異タンパク質若しくはそれらの遺伝子の制御配列に向けられたｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス及び／又はｍｉＲＮＡをコードするミニ遺伝子及び導入遺伝子配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。ミニ遺伝子及び導入遺伝子配列は、作動可能に連結されており、１つ以上のプロテアーゼ切断部位をコードする配列又は１つ以上の自己切断ペプチドをコードする配列又はそれらの組み合わせによって連結され得る。実施形態において、ベクターは、本明細書に開示されるものなどの他の転写制御エレメント、例えば導入遺伝子配列の発現を駆動するために標的細胞において機能的であるプロモーター、エンハンサー、ＰＲＥ及び／又はポリＡ配列をさらに含む。導入遺伝子配列は、哺乳動物細胞で発現される場合にＲＮＡ転写物のプロセシングを容易にするイントロン配列も含み得る。
様々な実施形態において、ＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）である。本明細書で使用される場合、「自己相補的」とは、コード領域が、例えば、１つ以上の末端逆位反復（ＩＴＲ）において、分子内二本鎖テンプレートを形成するように設計されていることを意味する。理論に拘束されるものではないが、典型的なＡＡＶゲノムは一本鎖ＤＮＡテンプレートであるため、ＡＡＶゲノムの律速段階には第２鎖合成が関与することが多い。Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０（５）：３２２７－３４；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０（１）：５２０－３２。しかし、ｓｃＡＡＶゲノムの場合、感染すると、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく複製及び転写の準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、ｓｃＡＡＶベクターであり、より速い且つ／又は増加した発現を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、１つ以上（例えば、全て）のＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を欠いている。ＡＡＶベクターは、任意の適切なＡＡＶ血清型からの核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を（例えば、そのＩＴＲに）含み得る。適切なＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ－ＤＪ及びＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶｒｈ３７、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＡＡＶベクター、例えばｓｃＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からの核酸配列、例えばＡＡＶ２からのＩＴＲ配列を含み得る。ＡＡＶベクター、例えばｓｃＡＡＶベクターは、複数の血清型からの核酸も含み得る。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。例えば、ＡＡＶ１の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供され；ＡＡＶ２の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）で提供され；ＡＡＶ３の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９で提供され；ＡＡＶ４の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供され；ＡＡＶ５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＡＦ０８５７１６で提供され；ＡＡＶ－６の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２で提供され；ＡＡＶ７及びＡＡＶ８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され；ＡＡＶ９ゲノムはＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され；ＡＡＶ１０ゲノムはＷｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６で提供され；ＡＡＶ１１ゲノムはＭｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３で提供される。
いくつかの実施形態において、機能的末端逆位反復（ＩＴＲ）配列は、例えば、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングをサポートするために使用され得る。したがって、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、シスでウイルスの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）を提供する配列を含み得る。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列であり得るが、そうである必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製及びパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変更され得る。ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０及びＡＡＶ－１１を含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型からのものであり得る。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。例えば、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供され；ＡＡＶ－２の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）で提供され；ＡＡＶ－３の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９で提供され；ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供され；ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＡＦ０８５７１６で提供され；ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２で提供され；ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され；ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８で提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６で提供され；ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３で提供される。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ－２由来のＩＴＲを有するＡＡＶ－９ベクターである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＩＴＲ、例えば２つのＩＴＲを含み、１つは導入遺伝子（例えば、ｈＰＧＲＮをコードする）及び／又は上で論じた他の核酸エレメントの上流にあり、もう１つは下流にある。いくつかの実施形態において、例えばｓｃＡＡＶベクターにおいて、本明細書に開示される核酸は、プロモーター、ミニ遺伝子、導入遺伝子、転写後調節エレメント及び／又はポリＡに対して５’に配置された第１のＩＴＲ及び３’に配置された第２のＩＴＲを含み、例えば、ＩＴＲは、独立して、もう１つのエレメントの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０ヌクレオチド５’及び／又は３’側にある。ＩＴＲ配列は、野生型であり得るか、又は例えばそれが野生型ＩＴＲの１つ以上の機能を保持する限り、１つ以上の変異を含み得る。いくつかの実施形態において、野生型ＩＴＲは、末端分解部位の欠失を含むように改変され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶは、２つのＩＴＲ配列を含み得、ここで、両方は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＩＴＲ配列は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、２つのＩＴＲ配列は両方、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、「左」又は５’－ＩＴＲは、自己相補的ゲノムの産生を可能にする改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列であり、「右」又は３’－ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、「右」又は３’－ＩＴＲは、自己相補的ゲノムの産生を可能にする改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列であり、「左」又は５’－ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＩＴＲ配列は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、２つのＩＴＲ配列は両方、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、「左」又は５’－ＩＴＲは、自己相補的ゲノムの産生を可能にする改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「右」又は３’－ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、「右」又は３’－ＩＴＲは、自己相補的ゲノムの産生を可能にする改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「左」又は５’－ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。１つ以上のＩＴＲに使用され得る例示的な配列を本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、配列番号１２及び配列番号２３を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、配列番号８５及び配列番号９０を含む。国際公開第２０１９／０９４２５３号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０５８７４４号明細書）で提供されるＡＡＶ ＩＴＲの実施形態は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書で開示される任意のＡＡＶ ＩＴＲにも使用され得る。
様々な実施形態において、本明細書に開示されるベクターは、本明細書に開示されるｈＰＧＲＮをコードするミニ遺伝子及び核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、スプライス調節剤の添加は、標的細胞における機能的ＰＲＧＮポリペプチドの発現を増加させる。他の実施形態において、スプライス調節剤の添加は、標的細胞における機能的ＰＲＧＮポリペプチドの発現を減少させる。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ｈＰＧＲＮをコードする導入遺伝子を含むベクターは、ＡＡＶであるか又はＡＡＶに由来する。いくつかの実施形態において、ベクターはｒＡＡＶである。様々な実施形態において、本明細書に開示されるｈＰＧＲＮをコードする導入遺伝子を含むＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶベクターは、ｓｃＡＡＶである。ｒＡＡＶゲノムは、ｈＰＧＲＮをコードする導入遺伝子配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。導入遺伝子配列は、本明細書に開示されるものなどの転写制御エレメント、例えば導入遺伝子配列の発現を駆動するために標的細胞において機能的であるプロモーター、エンハンサー、ＰＲＥ及び／又はポリＡ配列に作動可能に連結され得る。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、１つ以上の（例えば、全ての）ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を欠いている。ＡＡＶベクターは、任意の適切なＡＡＶ血清型からの核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を（例えば、そのＩＴＲに）含み得る。適切なＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０及びＡＡＶ－１１が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＡＡＶベクター、例えばｓｃＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－２からの核酸配列、例えばＡＡＶ－２からのＩＴＲ配列を含み得る。ＡＡＶベクター、例えばｓｃＡＡＶベクターは、複数の血清型からの核酸も含み得る。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６；及びＭｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるｈＰＧＲＮをコードする導入遺伝子を含むウイルスベクターにおける機能的末端逆位反復（ＩＴＲ）配列は、例えば、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングをサポートするために使用され得る。したがって、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、シスでウイルスの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）を提供する配列を含み得る。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製及びパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変更され得る。ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０及びＡＡＶ－１１を含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型からのものであり得る。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２；それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６；及びＭｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３。一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ－２由来のＩＴＲを有するＡＡＶ－９ベクターである。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号９１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号１１の配列を含む。これらの実施形態のそれぞれにおいて、導入遺伝子配列は、例えば、本明細書に記載されるように、目的の代替分子をコードする配列で置き換えられ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクター又は核酸配列は、クローニングベクター又は発現ベクターを形成する。そのような実施形態において、ベクターは、ベクターの複製又は維持を容易にする他の成分を含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、クローン選択のための選択マーカーをさらに含む。いくつかの実施形態において、ベクター中の選択マーカーは、原核生物又は真核生物の抗生物質耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ベクター中の選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ベクター中の選択マーカーは、アンピシリン耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、ベクター中の選択マーカーは、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ベクター（例えば、プラスミド）は、配列番号９２の核酸配列を含む。
ＥＧＦＰをコードするミニ遺伝子及び導入遺伝子を含む例示的なＡＡＶベクター配列：
Figure 2022541070000067
表２及び表３は、核酸、ベクター及びミニ遺伝子の例示的な配列を示す。
Figure 2022541070000068
Figure 2022541070000069
Figure 2022541070000070
Figure 2022541070000071
Figure 2022541070000072
Figure 2022541070000073
Figure 2022541070000074
Figure 2022541070000075
Figure 2022541070000076
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Figure 2022541070000078
Figure 2022541070000079
Figure 2022541070000080
Figure 2022541070000081
Figure 2022541070000082
Figure 2022541070000083
Figure 2022541070000084
Figure 2022541070000085
Figure 2022541070000086
Figure 2022541070000087
様々な実施形態において、本明細書に開示されるミニ遺伝子又はベクターは、スプライス調節剤の存在又は非存在に応答して、機能的ポリペプチドのレベル、例えばｈＰＧＲＮのレベルを増加させるために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクターは、スプライス調節剤の非存在下での同じベクターの発現と比較して、スプライス調節剤の存在下で導入遺伝子配列のより高い発現を示す。いくつかの実施形態において、スプライス調節剤の存在下での目的の分子の発現のレベルは、スプライス調節剤の非存在下での目的の分子の発現レベルより大きく、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００倍大きい。いくつかの実施形態において、スプライス調節剤の非存在下での目的の分子の発現のレベルは、スプライス調節剤の存在下での目的の分子の発現レベルより大きく、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００倍大きい。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、導入遺伝子配列のＲＮＡ転写物の数の増加によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ＲＴ－ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ｑＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、配列決定によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ノーザンブロット分析によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、単一分子蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、産生された導入遺伝子によってコードされるタンパク質の量の増加によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ウエスタンブロット分析によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、免疫染色によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、上記に列挙された方法のうちの複数によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、第２のエクソンを含むｍＲＮＡの量によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、直接的な第１のエクソンから第３のエクソンのスプライスを含むｍＲＮＡの量によって測定される。オンスイッチミニ遺伝子又はオフスイッチミニ遺伝子のいずれかを組み込んだベクターから、スプライス調節剤の存在下又は非存在下で生成された、例示的なポリペプチドを図３に示す（それぞれの場合において、プロテアーゼ切断部位の切断及び／又は自己切断ペプチド配列の前）。
組換えウイルス
様々な実施形態において、本明細書で論じられる核酸及びベクターは、組換えウイルス粒子などの１つ以上のウイルス粒子中に存在し得る。組換えウイルスは、組換え手段によって生成されたウイルスである。様々な異なるウイルスタイプ、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ＡＡＶ、マウス白血病ウイルスなどが使用され得る。理論に拘束されるものではないが、レンチウイルスなどのレトロウイルスから送達されるベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込み及び娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を提供し得、また低い免疫原性を提供し得る。他の適切なレトロウイルスには、ガンマレトロウイルスが含まれる。例示的なガンマレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）及び骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）並びにそれら由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Ｔｏｂｉａｓ Ｍａｅｔｚｉｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１１ Ｊｕｎ；３（６）：６７７－７１３に記載される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、本明細書に開示される核酸又はベクターを含む組換えアデノウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、本明細書に開示される核酸又はベクターを含む組換えＡＡＶである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸又はベクターは、組換えウイルスの製造における使用のためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸又はベクターは、ｒＡＡＶの製造における使用のためのものである。したがって、様々な実施形態において、ウイルス組成物（ビリオンとも呼ばれる）、例えば上記で開示されるウイルスベクター又は核酸を含むｒＡＡＶウイルス組成物も本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、キメラＡＡＶ又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、アデノウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、レトロウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、レンチウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、ＤＮＡウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、単純ヘルペスウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、バキュロウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＡＡＶは、１つ以上のＡＡＶキャプシドタンパク質を含み得る。ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｆｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓを含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型からのものであり得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ中の１つ以上のキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ－９からのものである。理論に拘束されるものではないが、典型的にはＡＡＶにおいて、３つのキャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３が多量体化してキャプシドを形成する。キャプシドタンパク質のポリペプチド配列は当技術分野で公知であり、またＡＡＶのゲノムに由来し得る。これらは、本明細書に開示されるＡＡＶウイルス組成物における例示的なキャプシドとして使用することができる。例えば、ＡＡＶ－１の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供され；ＡＡＶ－２の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）で提供され；ＡＡＶ－３の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９で提供され；ＡＡＶ－４の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供され；ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＡＦ０８５７１６で提供され；ＡＡＶ－６の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２で提供され；ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され；ＡＡＶ－９ゲノムはＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムはＷｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６で提供され；ＡＡＶ－１１ゲノムはＭｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３で提供される。キャプシドタンパク質ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓは、Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３４：２０４－２０９及びＣｈａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：１１７２－１１７９に提供される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、１つ以上のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ若しくはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓキャプシド血清型又はその機能的変異体を含むＡＡＶである。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、複数のＡＡＶ血清型からのキャプシドの組み合わせを含むＡＡＶである。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＡＡＶ組成物は、ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージング及び宿主細胞染色体組み込みを指示する１つ以上のシス作用性配列を含み、ＩＴＲ内に含まれる。いくつかの実施形態において、これらの配列の１つ以上は、シスではなくトランスで、例えば宿主細胞でのウイルス製造プロセス中に別個のプラスミド上にも存在し得る。典型的には、３つのＡＡＶプロモーター（その相対的マップ位置でｐ５、ｐ１９及びｐ４０と名付けられている）は、野生型ウイルスのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。いくつかの実施形態において、これらのプロモーター及び／又はオープンリーディングフレームの１つ以上は、本明細書に開示されるＡＡＶベクター及び／又はＡＡＶビリオンにおいてシスで存在するか、又はＡＡＶウイルス製造プロセス中、例えばウイルスを産生する宿主細胞において、別個のプラスミド上に存在する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７及び２２２７）の特異的スプライシングと相まって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２及びｒｅｐ４０）の産生を生じ得る。ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製に最終的に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、典型的には、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するキャプシドタンパク質の産生に関与している。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に存在する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ．，１５８：９７－１２９で概説されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＡＡＶで使用されるＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３は、以下の配列によってコードされるか又はそれを含む。
ＶＰ１核酸（配列番号７４）：
Figure 2022541070000088
ＶＰ２核酸（配列番号７５）：
Figure 2022541070000089
ＶＰ３核酸（配列番号７６）：
Figure 2022541070000090
ＶＰ１タンパク質（配列番号７７）：
Figure 2022541070000091
ＶＰ２タンパク質（配列番号７８）：
Figure 2022541070000092
ＶＰ３タンパク質（配列番号７９）：
Figure 2022541070000093
一実施形態において、組換えウイルスは、ＡＡＶ９キャプシド血清型又はその任意の変異体若しくは誘導体を含むＡＡＶである。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、ｓｃＡＡＶである。
いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、特定の細胞型における機能的ポリペプチドのレベルを増加させるために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるウイルスは、異なる組織型における同じウイルスの発現と比較して、特定の組織型における導入遺伝子配列のより高い発現を示す。いくつかの実施形態において、ウイルスは、非神経組織、体液又は細胞における同じウイルスの発現と比較して、神経組織、体液又は細胞における導入遺伝子配列のより高い発現を示す。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるベクターは、スプライス調節剤の非存在下での同じベクターの発現と比較して、スプライス調節剤の存在下で導入遺伝子配列のより高い発現を示す。いくつかの実施形態において、スプライス調節剤の存在下での組換えウイルスからの目的の分子の発現のレベルは、スプライス調節剤の非存在下での組換えウイルスからの目的の分子の発現レベルより大きく、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００倍大きい。いくつかの実施形態において、スプライス調節剤の非存在下での組換えウイルスからの目的の分子の発現のレベルは、スプライス調節剤の存在下での組換えウイルスからの目的の分子の発現レベルより大きく、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００倍大きい。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、導入遺伝子配列のＲＮＡ転写物の数の増加によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ＲＴ－ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ｑＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、配列決定によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ノーザンブロット分析によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、単一分子蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、産生された導入遺伝子によってコードされるタンパク質の量の増加によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、ウエスタンブロット分析によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、免疫染色によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、上記に列挙された方法のうちの複数によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、第２のエクソンを含むｍＲＮＡの量によって測定される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子配列の発現の増加は、直接的な第１のエクソンから第３のエクソンのスプライスを含むｍＲＮＡの量によって測定される。オンスイッチミニ遺伝子又はオフスイッチミニ遺伝子のいずれかを組み込んだベクターから、スプライス調節剤の存在下又は非存在下で生成された、例示的なポリペプチドを図３に示す（それぞれの場合において、プロテアーゼ切断部位の切断及び／又は自己切断ペプチド配列の前）。プロテアーゼ切断部位及び／又は自己切断ペプチド配列を含むポリペプチドがあれば、配列は、目的のタンパク質が、ミニ遺伝子又は切断配列に由来する異種配列なしで（又は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０アミノ酸未満で）産生されるように切断されることが企図される。
様々な実施形態において、本開示の標的細胞は、任意の哺乳動物細胞型であり得る。本開示のいくつかの態様において、核酸及びベクターは、神経組織又は体液又は細胞における発現を調節する。いくつかの実施形態において、神経組織は脳である。いくつかの実施形態において、神経組織は脳の前頭葉である。いくつかの実施形態において、神経組織は脳の側頭葉である。いくつかの実施形態において、神経組織は中枢神経系である。いくつかの実施形態において、神経組織は脊髄である。いくつかの実施形態において、神経細胞はヒト神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞はニューロンである。いくつかの実施形態において、神経細胞は星状細胞である。いくつかの実施形態において、神経液は脳脊髄液である。いくつかの実施形態において、非神経組織は肝臓である。いくつかの実施形態において、非神経体液は血漿である。いくつかの実施形態において、非神経細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態において、非神経細胞は星状脂肪蓄積細胞である。いくつかの実施形態において、非神経細胞はクッパー細胞である。いくつかの実施形態において、非神経細胞は、肝臓内皮細胞である。いくつかの実施形態において、非神経体液は血漿である。いくつかの実施形態において、非神経体液は血清である。いくつかの実施形態において、非神経体液は血液である。
組換えウイルスの産生方法
様々な実施形態において、ニューロン特異的プロモーターを含む組換えウイルスを産生する方法も本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、核酸配列、例えばＡＡＶ又は他のウイルスゲノムをコードするプラスミドは、組換えウイルスを産生するために使用される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及び／又はＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む核酸配列、例えばプラスミドもＡＡＶ又は他のウイルスを調製する際に使用される。アデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む核酸配列、例えばプラスミドも本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ及び／又はアデノウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸は、同じ構造、例えば単一のプラスミドに存在し得るか、又はそれらは、別個の構造に存在し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のプラスミドは、ＡＡＶベクターをコードする核酸と共にコンピテント細胞にコトランスフェクトされ、細胞は、組換えウイルスを産生するために培養される。場合により、ＡＡＶウイルスゲノム並びにＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドは、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス又はヘルペスウイルス）による感染が許容される細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、トランスフェクション後、細胞内でＡＡＶキャプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子へと構築される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生するための技術は、当技術分野で公知であり、例えばエレクトロポレーションを含み得る。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶの産生は、単一の細胞（本明細書ではパッケージング細胞として示される）内に存在する以下の成分を含む：ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶベクターとは別の（すなわちその中にない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルス機能。疑似型化されたｒＡＡＶの生成は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに開示されている。様々な実施形態において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えベクターの送達を増強するように改変され得る。キャプシドタンパク質の改変は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号明細書（これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
様々な実施形態において、ウイルスベクター産生の一般原理を利用して、本明細書に開示されるベクター及びウイルス、例えばｒＡＡＶを産生し得る。Ｃａｒｔｅｒ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５３３－５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９。様々なアプローチがＲａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：２０７２；Ｈｅｎｎｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３２５１；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／米国特許第９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許第９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許第９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／米国特許第９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／仏国特許第９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４－１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：６０９－６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：１１２４－１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に開示される。前述の文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、特に、ｒＡＡＶ産生に関連する文献のセクションが重視される。
パッケージング細胞を産生する例示的な方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶベクターをコードするプラスミド（又は複数のプラスミド）、ｒＡＡＶベクターとは別個のＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーが、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの追加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）又は直接の平滑末端ライゲーションによるもの（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次に、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルス及び／又はヘルパーウイルスをコードするプラスミドに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に適していることである。適切な方法の他の例は、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用して、ｒＡＡＶベクター及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。
いくつかの実施形態において、組換えウイルスを産生する方法は、パッケージ化される核酸を提供することを含む。いくつかの実施形態において、核酸はプラスミドである。他の実施形態において、核酸は、第１のＡＡＶ末端反復と第２のＡＡＶ末端反復との間に挿入された導入遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ヒトプログラニュリン（ｈＰＧＲＮ）をコードする。いくつかの実施形態において、組換えウイルスを産生する方法は、１つ以上の追加の核酸を提供することを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のさらなる核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及び／又はＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の核酸は、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８又はＡＡＶ血清型９に由来するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の核酸は、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８又はＡＡＶ血清型９に由来するＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の核酸は、１つ以上のアデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、核酸は、コンピテント細胞又はパッケージング細胞にコトランスフェクトされる。コトランスフェクションの方法は当技術分野で公知であり、リポフェクタミン、エレクトロポレーション及びポリエチレンイミンによるトランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。コンピテント細胞又はパッケージング細胞は、浮遊細胞又は付着細胞で培養された非付着細胞であり得る。一実施形態において、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（同族の２９３株）などの任意の適切なパッケージング細胞株が使用され得る。一実施形態において、パッケージング細胞はヒト細胞である。一実施形態において、パッケージング細胞はＨＥＫ２９３細胞である。一実施形態において、パッケージング細胞は昆虫細胞である。一実施形態において、パッケージング細胞はＳｆ９細胞である。いくつかの実施形態において、方法は、トランスフェクトされた細胞を培養して組換えウイルスを産生することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、組換えウイルスを回収することを含む。組換えウイルスを回収する方法には、例えば、米国特許第６，１４３，５４８号明細書及び米国特許第９，４０８，９０４号明細書に開示される方法が含まれる。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、細胞培養培地に分泌され、培地から精製される。いくつかの実施形態において、パッケージング細胞は溶解され、内容物は組換えウイルスを回収するために精製される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ろ過又は遠心分離によってパッケージング細胞から回収される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、クロマトグラフィーによってパッケージング細胞から回収される。
様々な実施形態において、本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞が本明細書に開示される。本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞は、ヒト細胞であり得る。本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞は、昆虫細胞でもあり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの他の実施形態において、本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞は、Ｓｆ９細胞である。
いくつかの実施形態において、組換えウイルスを産生する方法は、昆虫細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に開示されるような核酸を含むバキュロウイルスで昆虫細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、第１のＡＡＶ末端反復と第２のＡＡＶ末端反復との間に挿入された導入遺伝子配列を含む核酸を含むバキュロウイルスで昆虫細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、１つ以上のさらなる核酸を含むバキュロウイルスで昆虫細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のさらなる核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及び／又はＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の核酸は、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８又はＡＡＶ血清型９に由来するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の核酸は、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８又はＡＡＶ血清型９．ｃに由来するＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の核酸は、１つ以上のアデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、昆虫細胞は、組換えウイルスを産生するのに適した条件下で培養される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、昆虫細胞から回収される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ろ過又は遠心分離によって昆虫細胞から回収される。いくつかの実施形態において、ウイルスは、クロマトグラフィーによって昆虫細胞から回収される。
医薬組成物
様々な実施形態において、医薬組成物が開示される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に開示される１つ以上の核酸、ベクター及び／又はウイルスを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
本開示による核酸、ベクター及び／又は組換えウイルス（例えば、ウイルス粒子）は、薬学的に有用な組成物を調製するために製剤化することができる。例示的な製剤には、例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第９，０５１，５４２号明細書及び米国特許第６，７０３，２３７号明細書に開示されているものが含まれる。本開示の組成物は、哺乳動物対象、例えばヒトへの投与のために製剤化することができる。いくつかの実施形態において、送達系は、筋肉内、皮内、粘膜、皮下、静脈内、髄腔内、注射可能なデポ型デバイス又は局所投与のために製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、送達系が溶液又は懸濁液として製剤化される場合、送達系は、許容される担体、例えば水性担体中にある。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが使用され得る。これらの組成物は、滅菌及び／又は滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージ化され得るか又は凍結乾燥され得る。いくつかの実施形態において、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。
いくつかの実施形態において、組成物、例えば医薬組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等など、生理的条件に近似させるための薬学的に許容される補助物質を含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は保存剤を含む。他のいくつかの実施形態において、医薬組成物は保存剤を含まない。
使用方法及び処置
理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載の核酸及び他の実施形態は、目的の分子（例えば、タンパク質）を条件付きで発現する方法において使用され、前記方法は、発現系、例えば本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載の組換えウイルスを含む細胞をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０と接触させることを含み、ａ）前記スプライス調節剤の存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及びｂ）前記スプライス調節剤の非存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、スプライス調節剤の存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい。
実施形態において、本明細書に記載の核酸及び他の実施形態は、目的のタンパク質を条件付きで発現する方法において使用され、前記方法は、発現系、例えば本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載のベクター又は本明細書に記載の組換えウイルスを含む細胞をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０と接触させることを含み、ａ）前記スプライス調節剤の非存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及びｂ）前記スプライス調節剤の存在下では、目的の前記タンパク質の発現は、スプライス調節剤の非存在下での目的の前記タンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい。
実施形態において、遺伝子治療を必要とする対象を処置する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の組換えウイルス又は本明細書に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。実施形態において、方法は、対象にスプライス調節剤を投与することをさらに含む。実施形態において、スプライス調節剤は、定期的に投与される（例えば、投与されない時間によって分離された時間）。実施形態において、方法は、スプライス調節剤の非存在下での目的のタンパク質の発現レベルに対して、目的のタンパク質の発現において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍の増加又は減少を引き起こすのに有効な量のスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を対象に投与することをさらに含む。
理論に拘束されるものではないが、プログラニュリンなどのニューロン特異的タンパク質をコードする遺伝子の変異は、神経変性疾患に関係し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター及びウイルスは、その喪失が神経変性疾患に関係している野生型遺伝子のニューロン特異的発現を増加させるために投与され得る。例えば、投与は、機能的プログラニュリンポリペプチドのレベルを増加させるために使用され得る。スプライス調節剤との共処理により、発現レベルを制御（調節）することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター及び／又はウイルスを投与することは、例えば、前頭側頭型認知症などの疾患を処置、予防、遅延、減速させるのに役立ち得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター及びウイルスは、導入遺伝子の発現を調節するためにスプライス調節剤と併せて使用される。
本明細書で使用される「前頭側頭型認知症」（ＦＴＤ）は、主に脳の前頭葉及び側頭葉（一般に人格、行動及び言語に関連する領域）に影響を与える多様なグループの障害の総称である。ＦＴＤは、典型的には、脳の前頭側頭型認知症領域の変性によって引き起こされる。前頭側頭型認知症では、これらの葉の一部が収縮する（萎縮）。兆候及び症状は、影響を受ける脳の部分によって異なり得る。前頭側頭型認知症の最も一般的な兆候及び症状は、行動及び人格の極端な変化を伴う。これらには、強まる不適切な行動、共感及び他の対人スキルの喪失、判断力及び抑制力の欠如、感情鈍麻、反復的な強迫行動、個人的衛生状態の低下、食生活の変化、主に過食、経口探索及び不可食物の飲食並びに思考又は行動の変化に対する認識の欠如が含まれる。ＦＴＤのより希少なサブタイプは、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症に関連するものと同様に、運動の問題を特徴とする。いくつかの遺伝子変異がＦＴＤ及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の両方を引き起こす可能性があるという発見以来、ＦＴＤ及びＡＬＳは神経変性経路を共有し、共通のスペクトルの一部であり得ることがますます認識されている。最近、プログラニュリン遺伝子（ＧＲＮ）の変異が、ＦＴＤの主な原因として特定されており、変異の大部分が機能的なｈＰＧＲＮポリペプチドの喪失につながっている。Ｂａｂｙｋｕｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｂｒａｉｎ，１４０（１２）：３０８１－３１０４；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９１６－１９；Ｃｒｕｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ，４４２：９２０－４ ；Ｇａｗｅｄａ－Ｗａｌｅｒｙｃｈ ｅｔ ａｌ，（２０１８）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，７２：１８６．ｅ９－１８６．ｅ１２；Ｇａｌｉｍｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，２２（７）：５７９－５８５；Ｗａｕｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，６７：８４－９４；及びＭｅｎｄｅｚ，（２０１８）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｄｉｓ．Ｔｒｅａｔ．，２６：１４：６５７－６６２。ＰＧＲＮの変異を検出するための方法には、例えば、国際公開第２００８／０１９１８７号パンフレットに開示されるものが含まれる。
様々な実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター及び／又はウイルスは、プログラニュリンをコードする遺伝子の１つ以上の変異によって引き起こされる障害を処置する方法において使用され得る。一実施形態において、「処置する」という用語は、本明細書に開示される核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物を含む組成物の有効用量又は有効複数用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。障害／疾患の発症前に用量が投与される場合、投与は予防的である。障害／疾患の発症後に用量が投与される場合、投与は治療的である。実施形態において、有効用量は、処置中の障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を検出可能に緩和（排除又は軽減）し、障害／疾患状態への進行を遅延させるか又は予防し、障害／疾患状態の進行を遅延させるか又は予防し、疾患の程度を軽減し、疾患の寛解（部分又は完全）をもたらし、且つ／又は生存期間を延長する用量である。この用語は、完全な処置（すなわち治癒）及び／又は予防を包含するが、それらを必要としない。いくつかの実施形態において、有効用量は、本明細書に開示されるウイルス１ミリリットルあたり１×１０１０～１×１０１５のベクターゲノム（ｖｇ／ｍｌ）を含む。いくつかの実施形態において、有効用量は、本明細書に開示されるウイルス１ミリリットルあたり１×１０６～１×１０１０のプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）を含む。いくつかの実施形態において、有効用量は、本明細書に開示されるウイルス１ミリリットルあたり１×１０６～１×１０９の形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）を含む。処置のために企図される病状の例は、本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態において、プログラニュリンをコードする遺伝子の変異は、欠失変異である。いくつかの実施形態において、プログラニュリンをコードする遺伝子の変異は、ヌル変異である。いくつかの実施形態において、プログラニュリンをコードする遺伝子の変異は、インデルである。いくつかの実施形態において、プログラニュリンをコードする遺伝子の変異は、機能喪失変異である。いくつかの実施形態において、プログラニュリンをコードする遺伝子の変異は、ノックアウト変異である。いくつかの実施形態において、プログラニュリンをコードする遺伝子の変異により、プログラニュリンタンパク質の発現及び／又は機能の喪失が生じる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター及び／又はウイルスによる処置を必要とする患者は、投与前にプログラニュリン変異についてスクリーニングすることによって同定される。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、対象から細胞又は組織のサンプルを取得し、サンプル中の１つ以上の遺伝子座を配列決定又は遺伝子型決定して、プログラニュリン変異の存在を確認することを含む。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、唾液、血液及び／又は皮膚細胞などの（ただし、これらに限定されない）サンプルからの遺伝物質に対して実施される。
いくつかの実施形態において、処置方法は、本明細書に開示される治療有効量の核酸を、それを必要とする対象に送達することを含む。いくつかの実施形態において、処置方法は、本明細書に開示される治療有効量のベクターを、それを必要とする対象に送達することを含む。いくつかの実施形態において、処置方法は、本明細書に開示される治療有効量の組換えウイルスを、それを必要とする対象に送達することを含む。いくつかの実施形態において、処置方法は、本明細書に開示される治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に送達することを含む。いくつかの実施形態において、障害は神経変性障害である。いくつかの実施形態において、障害は前頭側頭型認知症である。いくつかの実施形態では、障害はアルツハイマー病である。いくつかの実施形態では、障害はパーキンソン病である。いくつかの実施形態では、障害は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、プログラニュリンをコードする遺伝子における１つ以上の変異、例えばプログラニュリンタンパク質の発現及び／又は機能の喪失をもたらす変異によって引き起こされる障害を処置する際に使用される。いくつかの実施形態において、障害は神経変性障害である。いくつかの実施形態において、障害は前頭側頭型認知症である。いくつかの実施形態では、障害はアルツハイマー病である。いくつかの実施形態では、障害はパーキンソン病である。いくつかの実施形態では、障害は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、それを必要とする対象を処置するための薬剤の製造において使用される。実施形態において、対象は、プログラニュリンをコードする遺伝子の１つ以上の変異、例えばプログラニュリンタンパク質の発現及び／又は機能の喪失をもたらす変異によって引き起こされる障害に罹患している。
様々な実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、それを必要とする対象に、静脈内投与、直接脳投与（例えば、髄腔内、脳内及び／又は脳室内投与）、鼻腔内投与、耳内投与若しくは眼内経路投与又はそれらの任意の組み合わせによって送達され得る。いくつかの実施形態において、核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、髄腔内投与によって送達される。いくつかの実施形態において、核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、脳内又は脳室内投与経路によって送達される。いくつかの実施形態において、投与された核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、最終的に、直接又は別の組織若しくは体液（例えば、血液）への投与後の移動により、脳、脊髄、末梢神経系及び／又はＣＮＳに送達される。
理論に拘束されるものではないが、いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、ポリペプチド、例えばプログラニュリンをコードする遺伝子に、非機能性ポリペプチドを生じる変異を保有する細胞をレスキューし得る。いくつかの実施形態において、分子、例えばタンパク質又はリボ核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を発現する方法は、本明細書に開示される核酸、ウイルスベクター、ウイルス又は医薬組成物を細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞はニューロンである。いくつかの実施形態において、送達はインビトロで行われる。いくつかの実施形態において、送達はエクスビボで行われる。いくつかの実施形態において、送達は、全身投与による。いくつかの実施形態において、送達は局所的である。いくつかの実施形態において、送達は、標的組織への直接適用によるものである。いくつかの実施形態において、標的組織は脳である。いくつかの実施形態において、送達は、脳への注射による。いくつかの実施形態において、送達は、髄腔内投与による。理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示される方法は、リポフスチン沈着、星状細胞及びミクログリアの活性化及び／又はＰＧＲＮタンパク質に変異を有するヒト又はマウスの脳における炎症を低減し、したがってそれを必要とする対象に潜在的な利益を提供し得る。
様々な実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、ウイルス及び医薬組成物は、障害、例えばＦＴＤを処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸、ベクター、ウイルス及び／又は医薬組成物は、障害、例えばＦＴＤを処置するための薬剤の製造において使用され得る。いくつかの実施形態において、障害は、プログラニュリンをコードする遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる。いくつかの実施形態において、プログラニュリン遺伝子の変異により、プログラニュリンタンパク質の発現の喪失が生じる。いくつかの実施形態において、プログラニュリン遺伝子の変異により、プログラニュリンタンパク質の機能の喪失が生じる。いくつかの実施形態において、使用は、それを必要とする対象に、例えば本明細書に開示されるベクター、ウイルス及び／又は医薬組成物で、ｈＰＧＲＮをコードする治療有効量の核酸を送達することを含む。
本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の組換えウイルス、本明細書に記載の細胞又は本明細書に記載の医薬組成物と、スプライス調節剤とを含むキットも本明細書に提供される。
本開示は、限定的であると解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。本出願を通して引用された全ての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容並びに図面は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、例示と見なされるべきであり、上記に開示された開示の範囲を限定するものではない。
実施例１．ヒトゲノムからのスプライス調節剤結合部位の同定。
正常なヒト線維芽細胞株（ＨＤ１９９４）を活性型（ＬＭＩ０７０及びスプライス調節剤２）及び非活性型類似体（スプライス調節剤３）又はＤＭＳＯで２４時間処理した。以下の化合物用量は、ＮＳＣ３４及びＨＤ１９９４細胞株１の両方で使用された。
－ ＬＭＩ０７０は、（１００ｎＭ）の濃度及び（５ｕＭ）の高用量で試験された
－ スプライス調節剤２は、７５０ｎＭで試験された
－ スプライス調節剤３は、５ｕＭで試験された
ＤＭＳＯ処理対照は、両方の細胞株に含まれていた。グループごとに３つの生物学的複製があった。
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉ単離キットを使用して全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡサンプル調製キットｖ２を使用して調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００プラットフォームを使用して配列決定した。
各サンプルは、同じフローセルに属する４つの異なるレーンで、２×７６塩基対（ｂｐ）の長さで配列決定された。生成されたリードの品質は、配列決定の検査室から提供されたＦＡＳＴＱファイル（ＤＭ０００１２．ｔｘｔのデータリリースファイル）でＦａｓｔＱＣ（バージョン０．１０．１）を実行することによって評価された。Ｐｈｒｅｄスコアの１塩基あたりの平均品質が各サンプルについて計算された。リードは優れた品質である（全ての塩基位置で平均Ｐｈｒｅｄスコア＞２８）。Ｉｌｌｕｍｉｎａの化学で予想されるように、５’及び３’末端まで減少する同様の品質傾向が観察された。
合計８億４７００万の７６塩基対（ｂｐ）の対末端リードが、ＴｏｐＨａｔ（２．０．３）を使用して、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ゲノム（ｈｇ１９）、ヒトＲｅｆＳｅｑ（Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）転写物（リリース５９、２０１３年５月３日）にマッピングされた。
ヒトゲノム（ｈｇ１９）に対するＴｏｐＨａｔ（２．０．３）アラインメントは、１５の複製のそれぞれについて個別に計算された。エクソンを検出する能力を高めるために、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（２．１．１）による転写物の構築前に、５つの条件（ＤＭＳＯ、５ｕＭのＬＭＩ０７０、１００ｎＭのＬＭＩ０７０、７５０ｎＭのスプライス調節剤２、５ｕＭのスプライス調節剤３）のそれぞれにつき３つのアラインメントファイル（ｂａｍファイル）をプールした。転写物の構築後、転写物のｇｔｆファイルからエクソン座標が抽出された。代替染色体及び染色体Ｍのエクソンは除外され、鎖情報は無視された。それにより、２７３８６６の推定エクソンが得られた。ＲｅｆＳｅｑエクソン（リリース５９、２０１３年５月３日）と交差しないエクソンは、イベントでのアノテーションなしのスプライス候補と見なされる。その結果、１９４７４の候補が得られる。さらなる確信を得るために、重複エクソンは、全てのＲｅｆＳｅｑエクソンのフルセットに加えて、最初の１９４７４の候補にマージされ、２２９６６５の非重複エクソンが得られた。このエクソンのセットでは、各ＲｅｆＳｅｑ遺伝子内の全ての可能なエクソン－エクソン接合部が考慮された。接合部データベースは、Ｒ（２．１５．２）スクリプト及びｂｅｄｔｏｏｌｓ（２．１５．０）を使用して作成された。次に、各リード末端対の第１のメイトがデータベースに対してマッピングされた。少なくとも１つの接合部アラインメントによってサポートされるアノテーションなしのエクソンのみが保持された。これは、特にＲｅｆＳｅｑ遺伝子に結合していない候補を除外する。それにより、１０８９８の最終候補が残る。これらの候補の配列は、ｂｅｄｔｏｏｌｓを使用してｈｇ１９から抽出された。変動性を評価するために、複製ごとに個別のＣｕｆｆｌｉｎｋｓ構築が計算され、各候補がそのような構築で見られるか確認した。さらに、接合部データベースに対するアラインメントを使用して、新しいエクソンをスキップする接合部の数を決定した。この情報は、スプライスインの割合を推定するために使用された。さらに、１０８９８候補のリード範囲は、ＴｏｐＨａｔアラインメント（ｂａｍファイル）にｂｅｄｔｏｏｌｓを使用して各複製について決定され、５つの条件のそれぞれで集計された。元のｆａｓｔｑファイルはＳＴＡＲ（０２０２０１）で再処理され、ヒトゲノム（ｈｇ３８）に対してアラインされた。１０８９８の候補エクソンはＵＣＳＣゲノムブラウザツールを使用してｈｇ３８にリフトオーバーされた。７つの候補はリフトできなかった。ＳＴＡＲによって検出された接合部は、残りの１０８９１候補にマッピングされ、接合部数の代替源を提供する。検証用の最終１０候補（表１に記載）は、以下のように、ヒトＳＭＡ ＲＮＡ配列データセットで見られた１０８９８のアノテーションなし推定エクソンから選択された。１）スプライス調節剤３及びＤＭＳＯの全てのサンプルでＳＴＡＲ集計接合部数及びＴｏｐＨａｔエクソン範囲＝０（漏出性なし）；２）ＬＭＩ０７０及びスプライス調節剤２のＳＴＡＲ集計接合部数及びＴｏｐＨａｔエクソン範囲＞６０（動的領域）；３）エクソン長＜１００ｂｐ（実現可能性のため）；並びに３’末端ＡＧＡ／ＧＴＡＡＧ（スプライス調節剤結合部位の存在を確認するため）。
実施例２．ミニ遺伝子スイッチの構築。
設計概念を念頭に置き（図１Ａ及び１Ｂ）、特定のミニ遺伝子オンスイッチは、実施例１で特定されたＳＮＸ７遺伝子配列を使用して設計された。図２Ａは、染色体：ＧＲＣｈ３７：１：９９２０４２１６：９９２０４３５９：１
Figure 2022541070000094
にスプライス調節剤（ＬＭＩ０７０）エクソン標的結合部位、並びに染色体：ＧＲＣｈ３７：１：９９２０３７９３：９９２０３９４６：１
Figure 2022541070000095
でエクソン８の下流にイントロン配列、及び染色体上ＧＲＣｈ３７：１：９９２２５６１０：９９２２５６８７：１（ＴＧＣＣＴＴＧＣＴＡＣＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＣＴＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＣＣＴＴＡＡ（配列番号１００））でエクソン９の上流に２１，２５１ヌクレオチドを含む、実施例１で同定されたＳＮＸ７遺伝子座の概略図を示す。これらの配列を使用し、エクソン８（エクソンＡと呼ばれる）、エクソン８とスプライス調節剤結合部位（ＡＢ）を含む同定された潜在的エクソンとの間に位置する２７０ヌクレオチドのイントロン、その３’末端にスプライス調節剤（例えば、ＬＭＩ０７０）結合部位を含むエクソン（エクソンＢと呼ばれる）及び潜在的エクソンとエクソン９と間の４０７ヌクレオチドのイントロンフラグメント（２１，２５１ｎｔから短縮；ＢＣ）及びエクソン９（エクソンＣと呼ばれる）を使用して、天然に存在しないＳＮＸ７ミニ遺伝子が構築された（バージョン１）（図２）。ミニ遺伝子の性能を向上させるために、１）コザックコンセンサス配列及びＡＴＧコドン（ＧＣＣＡＣＣＡＴＧ）がエクソンＡの６５位に挿入され；２）ミニ遺伝子内の他の全てのＡＴＧ配列がＴＴＧに置換され；３）エクソンＡの２０位のＴＡをＡＧで置換して、ＧＡＡＧＡＡＧＡＡ配列（配列番号６９）を作製し；４）ＯＲＦでフレームシフト（ヌクレオチド数＝３ｎ－１）を作製するために、エクソンＢから１ｎｔが除去され；５）ＴをエクソンＣの４位に挿入して、ＯＲＦにフレームシフトを作製し、複数の終止コドンを得；６）エクソンＣの９位のＴＡＣは、早期終止コドンを作製するためにＴＡＡに変更され；７）エクソンＣの３４位のＣＡＧをＡＣＣに変更して、可能性のある潜在的スプライス部位を変異させ；８）エクソンＣの６０位のＣＴＣＴをＴＡＧＣに変更して、Ｎｈｅ Ｉ制限部位を作製し；及び９）エクソンＣの末端のＴＡＡは、連続ＯＲＦを作製するために除去されたなどのさらなる改変が行われた。次に、この配列を、分子伸長技術を使用してｓｃＡＡＶベクターに挿入した。ｓｃＡＡＶは、ｔｒｓの欠失を含むＡＡＶ２ ＩＴＲ、続いてＪｅＴプロモーター、続いてＳＮＸ７ミニ遺伝子（図２Ｂを参照されたい）、続いてエクソンＣの末端に付加されたフューリン切断部位（ＲＮＲＲ（配列番号３９））のコード配列、続いてＴ２Ａペプチドのコード配列、続いて導入遺伝子配列（ここでは、最初のＡＴＧを含まないＥＧＦＰのコード配列）、続いてＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、続いてＡＡＶ２ ＩＴＲを組み合わせて作製された（図２Ｃを参照されたい）。図３は、スプライス調節剤の存在下又は非存在下でのｓｃＡＡＶの予測ｍＲＮＡ産物を示す。
実施例３．ＨＥＫ２９３細胞におけるオンスイッチのインビトロ性能。
ＨＥＫ２９３細胞は、完全ＤＭＥＭ培地で維持され、トランスフェクションの前日に、１ウェルあたり１００，０００細胞の密度で２４ウェルプレートに播種された。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元のプロトコルに従って使用して、各ウェルに２ｕｇのｐＪＳＮＸ－ＧＦＰプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション培地は、４時間後に完全ＤＭＥＭに交換された。ＤＭＳＯ中のＬＭＩ０７０の最初の１ｍＭストックをＤＭＥＭで１／１，０００～１／５００，０００に希釈し、２４時間後に細胞に添加したときに２ｎｍ～１ｕＭの濃度を達成した。対照細胞は０．１％ＤＭＳＯを受けた。ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡を使用してトランスフェクションの４８時間後に評価された。対照ＤＭＳＯ処理細胞ではＧＦＰ発現は観察されなかった（図４Ａ）。ＧＦＰ発現の定量分析のために、細胞をトリプシン処理し、ＳＯＮＹ ＳＨ－８００フローサイトメーターを使用してＦＡＣＳで分析した。ＧＦＰ発現の相対測定には平均蛍光強度を使用した。対照ＤＭＳＯ処理細胞は検出可能なＧＦＰ発現を示さなかった一方、ＧＦＰ発現の用量依存的な増加がＬＭＩ０７０処理サンプルで観察された（図４Ｂ）。ＲＮＡスプライシング分析では、製造元のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ第１鎖スーパーミックスを使用して合成された。エクソンＢの包含は、エクソンＣに特異的なプライマーＧＣＧＧＴＴＧＣＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＴ（配列番号１０４）及びＣＴＣＴＴＧＣＴＡＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＴＴ（配列番号１０５）によって増幅された全導入遺伝子ｍＲＮＡと比較した、ＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣ（配列番号１０３）及びＧＣＧＧＴＴＧＣＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＴ（配列番号１０４）プライマー対によって増幅されたエクソンＢ－エクソンＣの量を、ｑＰＣＲを使用して評価した。１２５ｎＭのＬＭＩ０７０で処理した細胞にエクソンＢを含めると、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較して７５倍アップレギュレーションされることがわかった（図４Ｃ）。構成的にスプライシングされたＲＮＡ（すなわちエクソンＡ－エクソンＣ）の量は、ＧＴＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＣ（配列番号１０６）及びＣＣＡＣＴＴＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＴＧＴ（配列番号１０７）プライマー対を使用して測定された。１ｕＭ ＬＭＩ０７０処理細胞は、対照ＤＭＳＯ処理細胞と比較して６０倍低いエクソンＡ－エクソンＣスプライシングを示した。
実施例４．ラット皮質ニューロンにおけるＳＮＸ７スイッチによるＧＦＰ発現の調節。
初代ラットニューロンは、パパインで消化された解剖ラット胚皮質から調製され、２４ウェルポリ－Ｄ－リジンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の完全Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中、密度１５０，０００細胞／ウェルで７日間培養された。トランスフェクションの前日に、培地の半分を新鮮な培地と交換した。ＤＮＡ－リポソームカクテルを加える前に細胞をｏｐｔｉＭＥＭで３回洗浄したことを除き、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元のプロトコルに従って使用して、各ウェルに２ｕｇのｐＪＳＮＸ－ＧＦＰプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション培地は、４時間後に５０％の新鮮な完全Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含む条件培地と交換された。翌日、ＤＭＳＯ中のＬＭＩ０７０の１ｍＭストックをＤＭＥＭで１／１，０００～１／５００，０００に希釈し、細胞に添加したときに２ｎＭ～１ｕｍの濃度を達成した。対照細胞は０．１％ＤＭＳＯを受けた。ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡を使用してトランスフェクションの６日後に評価された。対照ＤＭＳＯ処理細胞ではＧＦＰ発現は観察されなかった（図４Ａ）。ＲＮＡスプライシング分析では、製造元のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ第１鎖スーパーミックスを使用して合成された。エクソンＢの包含は、エクソンＣに特異的なプライマーＧＣＧＧＴＴＧＣＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＴ（配列番号１０４）及びＣＴＣＴＴＧＣＴＡＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＴＴ（配列番号１０５）によって増幅された全導入遺伝子ｍＲＮＡと比較した、ＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣ（配列番号１０３）及びＧＣＧＧＴＴＧＣＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＴ（配列番号１０４）プライマー対によって増幅されたエクソンＢ－エクソンＣの量を、ｑＰＣＲを使用して評価した。３１ｎＭのＬＭＩ０７０で処理した細胞にエクソンＢを含めると、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較して１００倍を超えてアップレギュレーションされることがわかった（図４Ｂ）。構成的にスプライシングされたＲＮＡ（すなわちエクソンＡ－エクソンＣ）の量は、ＧＴＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＣ（配列番号１０６）及びＣＣＡＣＴＴＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＴＧＴ（配列番号１０７）プライマー対を使用して測定された。５００ｎＭ ＬＭＩ０７０処理細胞は、対照ＤＭＳＯ処理細胞と比較して３０倍低いエクソンＡ－エクソンＣスプライシングを示した。
実施例５．ＳＮＸ７スイッチによるラット皮質ニューロンにおけるヒトプログラニュリンの調節可能な発現。
初代ラットニューロンは、パパインで消化された解剖ラット胚皮質から調製され、２４ウェルポリ－Ｄ－リジンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の完全Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中、密度１５０，０００細胞／ウェルで７日間培養された。トランスフェクションの前日に、培地の半分を新鮮な培地と交換した。ＤＮＡ－リポソームカクテルを加える前に細胞をｏｐｔｉＭＥＭで３回洗浄したことを除き、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元のプロトコルに従って使用して、各ウェルに２ｕｇのｐＳｙｎ－ｓｎｘ７－ＰＧＲＮ（図６Ａ）又はｓｎｘ７ミニ遺伝子を含まない対照ｐＳｙｎ－ＰＧＲＮプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション培地は、４時間後に５０％の新鮮な完全Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含む条件培地と交換された。翌日、ＤＭＳＯ中のＬＭＩ０７０の１ｍＭストックをＤＭＥＭで１／１０，０００に希釈し、細胞に添加したときに１００ｎｍの濃度を達成した。対照細胞は０．０１％ＤＭＳＯを受けた。トランスフェクションの６日後にＴＲ－ＦＲＥＴアッセイを使用してｈＰＧＲＮ発現を測定した。ｐＳｙｎ－ｓｎｘ７－ＰＧＲＮをトランスフェクトした細胞では、ｈＰＧＲＮの発現は、ＤＭＳＯ処理対照と比較してＬＭＩ０７０によって３０倍を超えて誘導された（図６Ｂ）。ＲＮＡスプライシング分析では、製造元のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ第１鎖スーパーミックスを使用して合成された。エクソンＢの包含は、エクソンＣに特異的なプライマーＧＣＧＧＴＴＧＣＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＴ（配列番号１０４）及びＣＴＣＴＴＧＣＴＡＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＡＴＴ（配列番号１０５）によって増幅された全導入遺伝子ｍＲＮＡと比較した、ＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣ（配列番号１０３）及びＧＣＧＧＴＴＧＣＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＴ（配列番号１０４）プライマー対によって増幅されたエクソンＢ－エクソンＣ接合部の量を、ｑＰＣＲを使用して評価した。ＬＭＩ０７０で処理した細胞にエクソンＢを含めると、ｐＳｙｎ－ｓｎｘ７－ＰＧＲＮトランスフェクト細胞につきＤＭＳＯで処理した細胞と比較して、１５０倍を超えてアップレギュレーションされることがわかった（図６Ｃ）。構成的にスプライシングされたＲＮＡ（すなわちエクソンＡ－エクソンＣ）の量は、ＧＴＧＣＴＡＡＴＡＡＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＣ（配列番号１０６）及びＣＣＡＣＴＴＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＴＧＴ（配列番号１０７）プライマー対を使用して測定された。ＬＭＩ０７０処理細胞は、ＤＭＳＯ処理細胞と比較して、ｐＳｙｎ－ｓｎｘ７－ＰＧＲＮでトランスフェクトされた細胞において１０倍低いエクソンＡ－エクソンＣスプライシングを示した。
実施例６．ＬＭＩ０７０の不在下でサイズを縮小し、ペプチド発現を排除するためのミニ遺伝子の改変
ＳＮＸ７ミニ遺伝子は、全体のサイズを縮小し、ＬＭＩ０７０の非存在下でのペプチド発現を排除するためにさらに改変された。特に、３’プライス部位に隣接する領域が維持されている間、エクソンＡは１０９ｎｔから５３ｎｔに短縮され、得られたエクソンＡは配列番号９６の配列を有する。スプライス部位及び分岐点を維持しながら、第１のイントロンを１５０ｎｔから１２０ｎｔに短縮した。得られた第１のイントロンは、配列番号９７の配列を有する。ＳＮＸ７ミニ遺伝子の第１のバージョンのエクソンＡの開始コドンを含む領域が欠失され、新しいバージョンのＳＮＸ７ミニ遺伝子のエクソンＢのＴＣをＧＧに変更することによって開始コドンが構築された。得られたエクソンＢは、配列番号９８の配列を有する。開始コドンをエクソンＢに切り替えることにより、ＬＭＩ０７０の存在下でのみタンパク質発現が生じる。この配列は必須のシスエレメントを含むことが見出されたため、第２のイントロンは同一に保たれた。改変されたＳＮＸミニ遺伝子（バージョン２）の配列は、配列番号９４に示される。図９に、以前のバージョンのＳＮＸ７ミニ遺伝子（バージョン１）と比較した新しいバージョン（バージョン２）のミニ遺伝子の概略図を示す。
改変されたＳＮＸ７ミニ遺伝子（バージョン２）は、分子クローニング技術を使用してｓｃＡＡＶベクターに挿入された。改変されたＳＮＸ７ミニ遺伝子（バージョン２）を含むベクターの配列は、配列番号９５に示される。ＨＥＫ２９３細胞は、完全ＤＭＥＭ培地で維持され、トランスフェクションの前日に、１ウェルあたり１００，０００細胞の密度で２４ウェルプレートに播種された。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元のプロトコルに従って使用して、ＳＮＸ７スイッチバージョン１を含むプラスミドＤＮＡＤＬ１８０又はＳＮＸ７バージョン２を含むプラスミドＤＬ１８２、２ｕｇを各ウェルにトランスフェクトした。トランスフェクション培地は、４時間後に完全ＤＭＥＭに交換された。ＤＭＳＯ中のＬＭＩ０７０の最初の１ｍＭストックをＤＭＥＭで１／１，０００～１／５００，０００に希釈し、２４時間後に細胞に添加したときに１００ｎｍ～１ｕＭの濃度を達成した。対照細胞は０．１％ＤＭＳＯを受けた。ＧＦＰ発現は、蛍光顕微鏡を使用してトランスフェクションの４８時間後に評価された。図１０は、改変されたＳＮＸ７ミニ遺伝子（バージョン２）が前のバージョンよりも高感度であることを示す。
実施例７．ＬＭＩ０７０の経口投与は、時間依存的にマウス脳における導入遺伝子発現をオンにする
ＳＮＸ７スイッチ（バージョン１）を有するシナプシンプロモーターの制御下にあるｈＰＧＲＮをコードするｓｓＡＡＶ９ウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞で産生し、イオジキサノールで精製した。２ｕＬのＡＡＶベクターの２ｅ１０ｖｇは、Ｃ５７Ｂｌ／６新生仔マウスにおいてＰ０でＩＣＶを注射された。４週齢で、３０ｍｇ／ｋｇのＬＭＩ０７０又は溶媒対照を胃管で経口投与した。１グループあたり４～６匹のマウスを特定の時点で屠殺した（図７Ａ）。ＰＢＳで経心腔的灌流した後、左半球の後半分をＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブでホモジナイズした。ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイは、ＡＡＶベクターから発現したヒトＰＧＲＮの測定に使用された。結果は、ＬＭＩ０７０投与の２４時間後の脳におけるｈＰＧＲＮ発現の急速且つ一過性の誘導を示す。トランスジェニックタンパク質の発現は、ＬＭＩ０７０投与の４日後に未処理のレベルに戻った（図７Ｂ）。
実施例８．ＬＭＩ０７０は用量依存的にインビボで導入遺伝子発現をオンにする
ＳＮＸ７スイッチ（バージョン１）を有するシナプシンプロモーターの制御下にあるｈＰＧＲＮをコードするｓｓＡＡＶ９ウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞で産生し、イオジキサノールで精製した。２ｕＬのＡＡＶベクターの２ｅ１０ｖｇは、ＦＶＢ新生仔マウスにおいてＰ０でＩＣＶを注射された。４週齢で、３、１０又は３０ｍｇ／ｋｇのＬＭＩ０７０又は溶媒対照を胃管で経口投与した。１グループあたり６～７匹のマウスを特定の時点で屠殺した（図８Ａ）。ＰＢＳで経心腔的灌流した後、左半球の後半分をＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブでホモジナイズした。ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイは、ＡＡＶベクターから発現したヒトＰＧＲＮの測定に使用された。ヒト皮質のサンプルは、生理学的ＰＧＲＮレベル（約２００ｐｇ／ｍｇ）の対照として使用された。結果は、脳内のトランスジェニックｈＰＧＲＮの急速な（ＬＭＩ０７０投与の１２時間後）蓄積を示し、これは２４時間の時点で減少し始める。導入遺伝子の発現は、ＬＭＩ０７０投与に対する用量反応を示した。

Claims (71)

  1. 目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に連結されたミニ遺伝子を含む核酸分子であって、前記ミニ遺伝子は、
    ａ．第１のエクソン；
    ｂ．第１のイントロン；
    ｃ．第２のエクソン；
    ｄ．第２のイントロン；及び
    ｅ．第３のエクソン
    を含み、前記第２のエクソンは、スプライス調節剤結合配列を含み、スプライス調節剤の存在下では、前記第２のエクソンは、前記核酸のｍＲＮＡ産物に含まれ、及び前記スプライス調節剤の非存在下では、前記第２のエクソンは、前記核酸のｍＲＮＡ産物に含まれない、核酸分子。
  2. 前記第３のエクソンは、前記スプライス調節剤の不在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームであり、且つ前記スプライス調節剤の存在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームではない終止コドンを含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記第２のエクソンは、前記スプライス調節剤の存在下で産生された前記核酸の前記ｍＲＮＡ産物においてインフレームである終止コドンを含む、請求項１に記載の核酸分子。
  4. 前記第１のエクソン及び前記第３のエクソンは、開始コドンを含まず、前記第２のエクソンは、開始コドンを含む、請求項１に記載の核酸分子。
  5. 前記ミニ遺伝子と前記導入遺伝子との間に配置されたプロテアーゼ切断部位をコードする配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 前記プロテアーゼ切断部位は、哺乳動物プロテアーゼによって切断される、請求項５に記載の核酸分子。
  7. 前記哺乳動物プロテアーゼは、フューリン、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、カテプシンＢ、グランザイムＢ、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ジェネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ又はエラスターゼ１である、請求項６に記載の核酸分子。
  8. 前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＲＸコンセンサスモチーフ、ＲＮＲＲ（配列番号３９）、Ｉ－Ｅ－Ｐ－Ｄ－Ｘコンセンサスモチーフ（配列番号３５）、Ｇｌｕ／Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ、Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ－Ｎ－Ｌ－Ｙ－Ｆ－Ｑ－Ｇ（配列番号４１）及び［ＡＧＳＶ］－ｘ（配列番号４２）からなる群から選択される切断モチーフを有するポリペプチドを含む、請求項４～７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 前記切断部位は、フューリンによって切断される、請求項４～８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. フューリンによって切断される前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）；ＲＴＫＲ（配列番号４３）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号４５）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号４７）；ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号４９）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号５１）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号５３）；ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号５５）；又はＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号５７）である、請求項９に記載の核酸分子。
  11. フューリンによって切断される前記プロテアーゼ切断部位は、ＲＮＲＲ（配列番号３９）を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
  12. 前記プロテアーゼ切断部位をコードする前記配列は、ＣＧＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣ（配列番号１９）を含む、例えばそれからなる、請求項１１に記載の核酸分子。
  13. 前記ミニ遺伝子と前記導入遺伝子との間に配置された自己切断ペプチドをコードする配列を含み、任意選択により、前記自己切断ペプチドは、前記目的のタンパク質のＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸以内で切断する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  14. 前記自己切断ペプチドは、任意選択により、Ｔ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド及びＦ２Ａペプチドから選択される２Ａペプチドである、請求項１３に記載の核酸分子。
  15. 前記自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドを含む、請求項１３又は１４に記載の核酸分子。
  16. 前記自己切断ペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号６１）を含み、任意選択により、前記自己切断ペプチドは、（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５９）を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  17. 前記スプライス調節剤結合配列は、前記第２のエクソンの３’末端に位置する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  18. 前記スプライス調節剤結合配列は、ＡＧＡを含み、例えばそれからなり、及び前記スプライス調節剤は、５－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－２－（６－（（２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－４－イル）オキシ）ピリダジン－３－イル）フェノール（ＬＭＩ０７０）である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  19. 前記第２のエクソンは、
    ａ．ＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号１）；
    ｂ．ＧＴＡＡＴＴＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＡＡＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＡ（配列番号２）；
    ｃ．ＧＧＡＴＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡ（配列番号３）；
    ｄ．ＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号４）；
    ｅ．ＡＴＣＣＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡ（配列番号５）；
    ｆ．ＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＡＧＡＡＡＣＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡ（配列番号６）；
    ｇ．ＡＡＧＡＡＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＡ（配列番号７）；
    ｈ．ＴＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＧＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＴＡＧＧＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号８）；
    ｉ．ＧＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号９）；
    ｊ．ＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡ（配列番号１０）；
    ｋ．
    Figure 2022541070000096
    、及び
    ｌ．（ａ）～（ｋ）のいずれかのフラグメント又は変異体であって、それに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するフラグメント又は変異体
    から選択される配列を含む、例えばそれからなる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  20. 前記第２のエクソンは、ＳＮＸ７のエクソンに由来する配列を含み、任意選択により、前記配列は、ＳＮＸ７の潜在的エクソンに由来する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  21. 前記第２のエクソンは、
    ａ．
    Figure 2022541070000097
    ；
    ｂ．配列番号１６のフラグメント；又は
    ｃ．配列番号１６の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
    を含む、例えばそれからなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  22. 前記第２のエクソンは、
    ａ．
    Figure 2022541070000098
    ；
    ｂ．配列番号９８のフラグメント；又は
    ｃ．配列番号９８の変異配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の同一性を有するそのフラグメント
    を含む、例えばそれからなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  23. 前記第２のエクソンは、３ｎ－１ヌクレオチドからなり、ｎは、整数である、請求項１若しくは２又は４～２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  24. 前記第１のエクソンは、
    ａ．１つ以上、例えば３つのＧＡＡリピート（配列番号６９）（例えば、ＧＡＡＧＡＡＧＡＡ（配列番号６９）を含む）；
    ｂ．コザック配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ（配列番号７０）を含むコザック配列）；又は
    ｃ．（ａ）及び（ｂ）の両方
    を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  25. 前記ミニ遺伝子は、
    ａ．単一の開始コドン、例えばＡＴＧ開始コドンを除く全てを除去するか又は変異させること；
    ｂ．前記第１のエクソン、前記第２のエクソン及び前記第３のエクソンの末端におけるもの以外の全ての潜在的スプライスドナー及びスプライスアクセプター配列を除去するか又は変異させること
    を行うように改変されている、請求項１～２３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  26. 前記単一の開始コドンは、前記第１のエクソン内に配置される、請求項２５に記載の核酸分子。
  27. 前記単一の開始コドンは、前記第２のエクソン内に配置される、請求項２５に記載の核酸分子。
  28. 前記ミニ遺伝子は、２０００未満、１９００未満、１８００未満、１７００未満、１６００未満、１５００未満、１４００未満、１３００未満、１２００未満、１１００未満、１０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満又は５００未満のヌクレオチドを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  29. 前記ミニ遺伝子は、約２５００～約５００ヌクレオチド、例えば約２０００～約５００ヌクレオチド、例えば約１５００～約６００ヌクレオチド、例えば約１２００～約７００ヌクレオチド、例えば約１１００～約８００ヌクレオチド、例えば約８００～約５００ヌクレオチド、例えば８００～約６００ヌクレオチド、例えば約８００～約７００ヌクレオチドを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  30. 前記ミニ遺伝子は、配列番号７１又は配列番号９４或いはそれに対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する配列又はその機能的フラグメントを含む、例えばそれからなる、請求項１若しくは２又は４～２９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  31. （ａ）目的のタンパク質をコードする導入遺伝子と、（ｂ）配列番号７１又は配列番号９４或いはそれに対して少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有する配列又はその機能的フラグメントを含む、例えばそれからなるミニ遺伝子とを含む核酸分子。
  32. フューリン切断部位をコードする配列であって、配列番号１９を含む配列と、自己切断ペプチドをコードする配列であって、配列番号２０を含む配列とをさらに含み、任意選択により、前記ミニ遺伝子は、前記フューリン切断部位をコードする前記配列の５’側（例えば、前記フューリン切断部位をコードする前記配列のすぐ５’側）に配置され、前記フューリン切断部位をコードする前記配列は、前記自己切断ペプチドをコードする前記配列の５’側（例えば、前記自己切断ペプチドをコードする前記配列のすぐ５’側）に配置され、及び前記自己切断ペプチドをコードする前記配列は、前記導入遺伝子の５’側（例えば、前記導入遺伝子のすぐ５’側）に配置される、請求項３１に記載の核酸分子。
  33. 前記ミニ遺伝子及び導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、任意選択により、前記プロモーターは、前記ミニ遺伝子の５’側に配置される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  34. 前記プロモーターは、ＪｅＴプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＰＧＫプロモーター若しくはシナプシンプロモーター又はイントロンを含まない任意のプロモーターである、請求項３３に記載の核酸分子。
  35. 転写後調節エレメントをさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  36. 前記転写後調節エレメント（ＰＲＥ）は、Ｂ型肝炎（ＨＰＲＥ）、コウモリ（ＢＰＲＥ）、ジリス（ＧＳＰＲＥ）、ホッキョクジリス（ＡＳＰＲＥ）、アヒル（ＤＰＲＥ）、チンパンジー（ＣＰＲＥ）及びウーリーモンキー（ＷＭＰＲＥ）又はウッドチャック（ＷＰＲＥ）由来のＰＲＥを含み、任意選択により、前記転写後調節エレメントは、前記導入遺伝子の３’側に配置される、請求項３５に記載の核酸分子。
  37. 前記転写後調節エレメントは、配列番号７２、配列番号７３又は配列番号８８を含む、請求項３５に記載の核酸分子。
  38. 前記構築物は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含み、任意選択により、前記ポリＡは、前記導入遺伝子の３’側に配置される、請求項１～３７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  39. 前記ポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリＡ又はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ、ベータグロビンポリＡ、アルファグロビンポリＡ、オボアルブミンポリＡ、カッパ軽鎖ポリＡ及び合成ポリＡである、請求項３８に記載の核酸分子。
  40. 前記ポリＡは、配列番号２２を含む、例えばそれからなる、請求項３８又は３９に記載の核酸分子。
  41. 請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  42. ＤＮＡベクター、任意選択により環状ベクター、任意選択によりプラスミドである、請求項４１に記載のベクター。
  43. 二本鎖又は一本鎖である、請求項４１又は４２に記載のベクター。
  44. 二本鎖である、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のベクター。
  45. ウイルスベクターである、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のベクター。
  46. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である、請求項４５に記載のベクター。
  47. 前記ウイルスベクターは、組換えＡＡＶベクター、任意選択により自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、請求項４６に記載のベクター。
  48. 前記組換えＡＡＶベクターは、１つ以上の末端逆位反復（ＩＴＲ）を含み、任意選択により、前記ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり、任意選択により、前記ＡＡＶベクターは、２つのＩＴＲを含み、任意選択により、前記２つのＩＴＲは、配列番号１２及び配列番号２３を含む、請求項４７に記載のベクター。
  49. 例えば、５’から３’まで、
    ａ．任意選択により配列番号１２を含む末端分解部位の欠失を含むように任意選択により改変されているＩＴＲ、任意選択によりＡＡＶ２ ＩＴＲ；
    ｂ．プロモーター、任意選択により配列番号１３を含むか又はそれからなるＪｅＴプロモーター；
    ｃ．請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸分子；
    ｄ．任意選択により配列番号２２を含むか又はそれからなるポリＡシグナル；及び
    ｅ．任意選択により配列番号２３を含むか又はそれからなるＩＴＲ、任意選択によりＡＡＶ２ ＩＴＲ
    を含む、請求項４１～４８のいずれか一項に記載のベクター。
  50. 請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸又は請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクターを含む組換えウイルス。
  51. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、キメラＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ＤＮＡウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である、請求項５０に記載の組換えウイルス。
  52. ＡＡＶである、請求項５１に記載の組換えウイルス。
  53. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３６、ＡＡＶｒｈ３７、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓキャプシド血清型又はその変異体、例えば複数のＡＡＶ血清型からのキャプシドの組み合わせの１つ以上を含む、請求項５２に記載の組換えウイルス。
  54. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ９キャプシド血清型又はその任意の変異体若しくは誘導体を含む、請求項５２に記載の組換えウイルス。
  55. 例えば、それぞれ配列番号７４、配列番号７５及び配列番号７６によってコードされるか、又はそれぞれ配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む、請求項５４に記載の組換えウイルス。
  56. 前記ＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター又は一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターを含む、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
  57. 請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター又は請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む細胞。
  58. ヒト細胞である、請求項５７に記載の細胞。
  59. ニューロン又は星状細胞である、請求項５７又は５８に記載の細胞。
  60. 前記細胞がスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を含む場合、前記目的のタンパク質の発現レベルは、前記細胞が前記スプライス調節剤を含まない場合の前記目的のタンパク質の発現レベルよりも例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく、任意選択により、前記細胞が前記スプライス調節剤を含まない場合の前記発現レベルは、検出できない、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の細胞。
  61. 前記細胞がスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を含まない場合、前記目的のタンパク質の発現レベルは、前記細胞が前記スプライス調節剤を含む場合の前記目的のタンパク質の発現レベルよりも例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく、任意選択により、前記細胞が前記スプライス調節剤を含む場合の前記発現レベルは、検出できない、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の細胞。
  62. 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、請求項１若しくは２又は４～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター或いは請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
    ａ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
    ｂ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法。
  63. 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、請求項１若しくは３～３６のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター又は請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
    ａ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
    ｂ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法。
  64. 請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルス又は請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。
  65. 遺伝子治療を必要とする対象を処置する方法であって、請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルス、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞又は請求項６４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  66. スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して、前記目的のタンパク質の発現において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍の増加又は減少を引き起こすのに有効な量の前記スプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルス、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞又は請求項６４に記載の医薬組成物と、スプライス調節剤とを含むキット。
  68. 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、請求項１若しくは２又は４～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター或いは請求項５０～６２のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
    ａ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
    ｂ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法における使用のための、請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルス、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞又は請求項６０に記載の医薬組成物。
  69. 目的のタンパク質を条件付きで発現させる方法であって、請求項１若しくは３～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター又は請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む発現系（例えば、細胞、例えば請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞）をスプライス調節剤、例えばＬＭＩ０７０に接触させることを含み、
    ａ．前記スプライス調節剤の非存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して増加し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍大きく；及び
    ｂ．前記スプライス調節剤の存在下では、前記目的のタンパク質の発現は、前記スプライス調節剤の非存在下での前記目的のタンパク質の発現レベルに対して実質的に減少し、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍小さい、方法における使用のための、請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルス、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞又は請求項６４に記載の医薬組成物。
  70. 遺伝子治療を必要とする対象を処置する方法における使用のための、請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルス、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞又は請求項６４に記載の医薬組成物。
  71. 前記導入遺伝子は、ゲノム編集系のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ）、ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）、抗体若しくは抗体フラグメント又は治療用タンパク質（例えば、プログラニュリン、ＳＭＮ、ＭｅＣＰ２、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、ＣＬＮ４、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ７、ＣＬＮ８から選択されるタンパク質）をコードする、請求項１～４０のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４１～４９のいずれか一項に記載のベクター、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組換えウイルス、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の細胞、請求項６２若しくは６３又は６５若しくは６６のいずれか一項に記載の方法、請求項６４に記載の医薬組成物或いは請求項６４～６６のいずれか一項に記載の使用のための核酸、ベクター、組換えウイルス、細胞又は医薬組成物。
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